一种超声提取款冬花中总黄酮的方法 |
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| 申请号 | CN201410069765.0 | 申请日 | 2014-02-27 | 公开(公告)号 | CN103788048A | 公开(公告)日 | 2014-05-14 |
| 申请人 | 泰山医学院; | 发明人 | 秦坤; 刘彩红; 孟宪锋; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种超声提取款冬花中总黄 酮 的方法，包括以下步骤：（1）款冬花的处理，将款冬花在90℃的恒温干燥箱中烘12小时， 粉碎 ，过20目筛；（2）提取，将步骤（1）处理好的款冬花与 乙醇 溶液按液料比（mL/g）为20:1～30:1进行混合，乙醇溶液中乙醇的体积分数为30%～70%，超声功率为350W～500W，超声提取时间为30～45分钟，得到总黄酮提取液。通过响应面法对超声功率、 超 声波 提取时间、料液比进行优化，得到超声提取款冬花总黄酮的最佳的提取工艺，该工艺下总黄酮实际测定提取率为6.57%，此提取条件准确可靠，提取率较高，具有方便、简单、快速、安全等优点，为款冬花有效成分的提取和开发利用提供了相应的参考数据，具有实际使用价值。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种超声提取款冬花中总黄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种超声提取款冬花中总黄酮的方法技术领域背景技术[0002] 中药款冬花为菊科植物款冬(Tussilago farfara)的干燥花蕾，又名冬茬、九九花、西冬花等，始载于《神农本草经》，为常用中药材之一，主产于我国山西、陕西和甘肃等地。款冬花味辛、甘、性温，具有润肺止咳、化痰平喘之功效。研究表明,款冬花镇咳、祛痰、平喘等药理活性与其中含量较高的黄酮类成分有关。 [0003] 从文献调研发现，对款冬花的研究多集中于生理药理作用和化学成分方面，而对其活性成分黄酮类物质的提取及纯化工艺方面的报道较少。郑州大学的丁彩丽，对款冬花中黄酮类化合物的提取及纯化工艺进行的研究，比较了不同溶剂对款冬花黄酮提取率的影响，结果表明乙醇为性能良好的提取剂；研究了索氏提取法、回流提取法、超声辅助提取法、闪式提取法四种不同提取方法对款冬花总黄酮的提取效果；研究了乙醇浓度、提取时间、提4 取温度、提取次数对款冬花总黄酮回流提取工艺的影响，并结合L9(3)正交试验法，优化回流提取工艺；该回流提取工艺简单易行，为工业化生产提供依据。 [0004] 响应面分析法(Response Surface methodology，RSM)是优化工艺参数的一种有效统计方法，采用多元回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，分析因素间的交互作用，进而确定最优工艺参数。响应面分析法因其设计合理、试验次数少和试验时间短，已被逐渐关注并应用于工艺优化中。但是，各种提取方法中，对于超声提取工艺及其利用响应面法优化的研究较少。 发明内容[0005] 针对现有技术中有关响应面法优化超声提取款冬花中总黄酮的工艺及方法的研究的不足，本发明的目的是对款冬花中的黄酮类化合物进行系统研究，利用响应面法（RSM）优化款冬花总黄酮的超声提取工艺；研究款冬花中总黄酮提取率的影响因素，在单因素试验的基础上，选择超声功率、超声时间、液料比为自变量，总黄酮提取量为响应值，采用Box-Behnken中心组合试验设计和响应面(RSM)分析法建立影响因素的二次回归模型，通过对二次回归模型求解编码转换，研究各自变量交互作用及其对黄酮类化合物提取量的影响，提供一种工艺简单、提取率较高的超声提取方法，响应面法结果准确，分析方便，为款冬花中总黄酮的提取工艺优化提供了理论支持，为使款冬花更好的应用于医药、食品、化妆品等领域提供理论基础。 [0006] 为实现上述目的，本发明采用以下方案： [0007] 一种超声提取款冬花中总黄酮的方法，包括以下步骤： [0008] （1）款冬花的处理 [0009] 将款冬花在90℃的恒温干燥箱中烘12小时，粉碎，过20目筛； [0010] （2）提取 [0011] 将步骤（1）处理好的款冬花与乙醇溶液按液料比（mL/g）为20:1～30:1进行混合，乙醇溶液中乙醇的体积分数为70%，超声功率为350W～500W，超声提取时间为30～45分钟，得到总黄酮提取液。 [0012] 优选地，所述步骤（2）中，款冬花与乙醇溶液按液料比（mL/g）为25:1进行混合； [0013] 优选地，所述步骤（2）中，超声功率为420W； [0014] 优选地，所述步骤（2）中，超声提取时间为35分钟； [0015] 优选地，所述步骤（2）中，款冬花与乙醇溶液按液料比（mL/g）为27:1进行混合，提取功率426W，提取时间30min。 [0016] 本发明以款冬花为原料，应用超声波技术辅助提取黄酮类化合物，通过响应面法对超声功率、超声波提取时间、料液比进行优化，得到超声提取款冬花总黄酮的最佳的提取工艺，该工艺下总黄酮实际测定提取率为6.57%，预测结果和实验基本吻合。此提取条件准确可靠，并且提取率较高，克服了传统的总黄酮提取方法时间长、成本高、效率低的缺点，超声法提取款冬花中总黄酮具有方便、简单、快速、安全等优点，为款冬花有效成分的提取和开发利用提供了相应的参考数据，具有实际使用价值。附图说明 [0017] 图1为芦丁标准工作曲线图； [0018] 图2为超声功率对款冬花总黄酮提取率的影响； [0019] 图3为乙醇体积分数对款冬花总黄酮提取率的影响； [0020] 图4为超声提取时间对款冬花总黄酮提取率的影响； [0021] 图5为液料比对款冬花总黄酮提取率的影响； [0022] 图6为超声功率和超声时间对款冬花总黄酮提取率的影响响应面图； [0023] 图7为超声功率和超声时间对款冬花总黄酮提取率的影响等高线图； [0024] 图8为超声功率和液料比对款冬花总黄酮提取率的影响响应面图； [0025] 图9为超声功率和液料比对款冬花黄酮提取率的影响等高线图； [0026] 图10为超声时间和液料比对款冬花总黄酮提取率的影响响应面图； [0027] 图11超声时间和液料比对款冬花黄酮提取率的影响等高线图。 具体实施方式[0028] 下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。 [0029] 实施例1： [0030] （1）款冬花的处理 [0031] 将款冬花置于90℃恒温干燥箱内，烘干12小时，然后用药材粉碎机进行粉碎，过20目筛，备用； [0032] （2）提取 [0033] 将步骤（1）处理好的款冬花与乙醇溶液按液料比（mL/g）为27:1进行混合，乙醇溶液中乙醇的体积分数为70%，超声功率为426W，超声提取时间为30分钟，得到总黄酮提取液。 [0034] 下面通过单因素试验法和响应面法，以总黄酮提取率为指标，考察液料比、乙醇体积分数、超声功率和超声提取时间对款冬花中总黄酮提取率的影响，以选取优化的总黄酮提取工艺条件。 [0035] 1材料与仪器 [0036] 1.1材料 [0037] 款冬花：购自泰安市永春堂药店； [0038] 芦丁标准品：购自中国药品生物制品检定所，纯度≥98%； [0040] 1.2仪器 [0041] 超声波清洗仪：型号 KQ-800KDB，生产厂家 昆山舒美超声仪器有限公司； [0042] 恒温干燥箱：型号 DHG-9240，生产厂家 上海精宏实验设备有限公司； [0043] 紫外分光光度计：型号 752S，生产厂家 上海棱光技术有限公司。 [0044] 2方法与结果 [0045] 2.1芦丁标准曲线的绘制 [0046] 精密称取已在120℃干燥至恒重的芦丁标准品2.5mg，用70%乙醇溶解后移至10ml棕色容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，得浓度为0.250mg/ml的芦丁标准品溶液。 [0047] 精密吸取不同体积的芦丁标准品溶液，分别置于25ml，摇匀，放置6min，加入4%氢氧化钠溶液7.50ml，用70%乙醇定容到刻度，摇匀，制成浓度分别为0.020mg/ml、0.030mg/m、0.040mg/ml、0.050mg/ml、0.060mg/ml的芦丁标准品溶液，放置10min后在510nm波长处测定吸光度，以吸光度A为横坐标，浓度C为纵坐标作图，得图1，并进行线性回归，得回归方2 程：y=0.0742x+0.0040，R=0.9958。 [0048] 表1芦丁标准工作曲线测定结果 [0049] [0050] 2.2总黄酮提取率的测定 [0051] 准确量取步骤（2）所得到的总黄酮提取液1.00ml，置于10ml容量瓶中，加入70%乙醇4.00ml，然后精密加入5%亚硝酸钠溶液0.30ml，摇匀，放置5min，加入10%硝酸铝溶液0.40ml，摇匀，放置6min，加入4%氢氧化钠溶液3.00ml，用70%乙醇定容到刻度，摇匀，放置 10min后于510nm波长处测定吸光度；空白对照液以1ml70%乙醇代替1ml滤液之后同法配制，将所得到的吸光度值代入由标准曲线所得方程，得到步骤（2）提取液中总黄酮浓度，经过计算可得总黄酮提取率。 [0052] 总黄酮提取率=（总黄酮浓度×体积×稀释倍数）/原料质量。 [0053] 2.3单因素试验设计及结果 [0054] 超声提取的工艺条件确定采用单因素试验设计，分别确定超声功率、乙醇体积分数、提取时间、液料比等因素对总黄酮提取率的影响，以图示形式找出影响因素的影响趋势和数值范围。 [0055] 2.3.1超声功率对款冬花总黄酮提取率的影响 [0056] 称取本发明步骤（1）中处理得到的款冬花药材粉末1.00g,共3份，精密称定，分别置于50ml锥形瓶中，按液料比（mL/g）为25:1，加入体积分数为70%的乙醇溶液，密塞，温度保持45℃，分别在360W、420W、480W功率下超声提取30分钟后，离心，取上清液，用70%乙醇定容至50ml，得到不同超声功率条件下的总黄酮提取液，按照“2.2总黄酮提取率的测定”，计算不同超声功率条件下的总黄酮提取率，考察超声功率对总黄酮提取率的影响，结果见图2。 [0057] 通过图2可以看出，随着超声功率的提高，款冬花总黄酮的提取率升高，当功率升高到420W时，提取率得到最大值，再增大超声功率，黄酮的提取率反而下降，可能是由于提取出了多糖等物质，影响了款冬花总黄酮的提取率，所以选择360W，420W，480W作为响应面试验的较优水平。 [0058] 2.3.2乙醇体积分数对款冬花总黄酮提取率的影响 [0059] 称取本发明步骤（1）中处理得到的款冬花药材粉末1.00g,共5份，精密称定，分别置于50ml锥形瓶中，按液料比（mL/g）为25:1，加入体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，密塞，温度保持45℃，设定超声功率为420W，超声提取30分钟后，离心，取上清液，用70%乙醇定容至50ml，得到不同乙醇体积分数条件下的总黄酮提取液，并按照“2.2总黄酮提取率的测定”，计算不同乙醇体积分数条件下的总黄酮提取率，考察乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响，结果见图3。 [0060] 通过图3可以看出，随着乙醇体积分数的增大，款冬花黄酮提取率一直上升，到70%时所得到的提取率已经很高，当乙醇体积分数太大时，有些成分溶于乙醇，影响了提取率，因此确定70%为最优体积分数。 [0061] 2.3.3超声提取时间对款冬花总黄酮提取率的影响 [0062] 称取本发明步骤（1）中处理得到的款冬花药材粉末1.00g,共4份，精密称定，分别置于50ml锥形瓶中，按液料比（mL/g）为25:1，加入体积分数为70%的乙醇溶液，密塞，温度保持45℃，设定超声功率为420W，分别超声提取30分钟、35分钟、40分钟、45分钟后，离心，取上清液，用70%乙醇定容至50ml，得到不同超声提取时间条件下的总黄酮提取液，按照“2.2总黄酮提取率的测定”，计算不同超声提取时间条件下的总黄酮提取率，考察超声提取时间对总黄酮提取率的影响，结果见图4。 [0063] 通过图4可以看出，随着提取时间的延长，款冬花总黄酮提取率升高，当提取时间为35min时，达到最大值，继续增加提取时间，提取率不增反降，所以选择30min，35min，40min做为响应面试验的较优水平。 [0064] 2.3.4液料比对款冬花总黄酮提取率的影响 [0065] 称取本发明步骤（1）中处理得到的款冬花药材粉末1.00g,共3份，精密称定，分别置于50ml锥形瓶中，分别按液料比（mL/g）为20:1、25:1、30:1，加入体积分数70%的乙醇溶液，密塞，温度保持45℃，设定超声功率为420W，超声提取30分钟后，离心，取上清液，用70%乙醇定容至50ml，得到不同液料比条件下的总黄酮提取液，按照“2.2总黄酮提取率的测定”，计算不同液料比条件下的总黄酮提取率，考察液料比对总黄酮提取率的影响，结果见图5。 [0066] 通过图5可以看出，随着液料比的增加，款冬花总黄酮提取率升高，当提取液料比为25:1时，达到最大值，增加提取时间，款冬花黄酮提取率不增反降，所以选择20:1，25:1，30:1作为响应面试验的较优水平。 [0067] 2.4响应面法试验设计及结果 [0068] 2.4.1回归模型的建立及显著性检验 [0069] 根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，在单因素试验的基础上，选取对总黄酮提取率影响较大的单因素：超声功率、提取时间和液料比做如下优化实验，实验因素与水平见表2。 [0070] 表2因素分析水平表 [0071] [0073] （公式1） [0074] 式中Y代表系统的响应目标，β0，βi，βii分别是常数项、线性效应和二阶效应系数βij是交互作用效应,xi为各因素的水平编码值。该方程反映了响应值和因素之间的相关关系。将（公式1）式中各自变量xi求偏导数得到如下方程组 [0075] [0076] 求解方程组即可得曲面函数的驻点,即最优实验条件,以此确定款冬花总黄酮最佳超声提取工艺条件。 [0077] 表3为响应面分析方案及结果，试验号1～12是析因试验，试验号13～17是中心试验。17个试验点分为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在x1、x2、x3所构成的三维顶点；零点为区域的中心点，零点试验重复5次，用以估计试验误差。 [0078] 表3Box-Behnken实验设计方案、响应值及预测值 [0079] [0080] 2.4.2响应面方差分析 [0081] 根据所设计的方案进行实验，结果见表4，将实验数据利用Design-Expert软件进行多元回归拟合,得到以款冬花黄酮得率Y为目标函数的二次回归方程模型为: [0082] Y=64.05625+0.2792x1+0.17975x2+0.71050x-0.00054166x1x2-0.000316667x2x3-02 2 2 .00180x1x3-0.000299653x1+0.00125x2-0.010450x3。 [0083] 表4回归方程方差分析 [0084] [0085] [0086] 由表4回归方程方差分析可知，此方程模型的F拟合值为118.77，P值小于0.0001，响应回归模型达到了极显著水平；F失拟值为0.28，大于0.005，表明失拟项相对于绝对误差2 是不显著的，残差是由于随机误差引起的；相关系数R=0.9935，表明99.35%的数据可以用此方程来解释，变异系数CV很低，其值为1.21%，说明实验操作可信。因此可以用此方程来分析预测超声提取款冬花黄酮的工艺结果。 [0087] 响应面图是响应值Y对于试验因素x1、x2、x3所构成的在三维空间的曲面图以及在二维平面上的等高线图，其可以直观反应他们之间的交互作用对响应值的影响。将一个因素定在零水平，利用Design-Expert软件即可以作出两因素交互作用的响应面曲面图以及等高线图。 [0088] 图6为超声功率和超声时间对款冬花总黄酮提取率的影响响应面图，从图中看出，超声功率对黄酮提取率影响显著，曲面较陡；提取时间对黄酮提取率影响不太显著，曲面较为缓和。由图7超声功率和超声时间交互作用的等高线可知，沿着超声功率轴向等高线密集，而超声时间轴向等高线相对稀疏，说明超声功率对响应值峰值影响比超声时间大。 [0089] 图8是超声功率和液料比对款冬花总黄酮提取率的影响响应面图，由图可知，超声功率对黄酮提取率影响显著，曲面较陡，液料比对黄酮提取率影响不太显著，曲面较为缓和。由图9超声功率和液料比交互作用的等高线可知，沿着超声功率轴向等高线密集，而液料比轴向等高线相对稀疏，说明超声功率对响应值峰值影响比液料比大。等高线呈椭圆形，说明两因素的交互作用强，影响显著。 [0090] 图10为超声时间和液料比对款冬花总黄酮提取率的影响响应面图，从图中可以看出，液料比对黄酮提取率影响显著，曲面较陡，超声时间对黄酮提取率影响不太显著，曲面较为缓和。由图11液料比和超声时间交互作用的等高线可知，沿着液料比轴向等高线密集，而超声时间轴向等高线相对稀疏，说明超声功率对响应值峰值影响比超声时间大。 [0091] 通过对以上分析的比较可知，影响因素的显著性由高到底分别为：超声功率，液料比，超声时间。 [0092] 2.4.3结果验证 [0093] 根据所得回归模型，用Design-Expert软件对实验参数进行优化，得到款冬花总黄酮提取的最佳优化条件为：超声功率425.67W，超声时间30min，液料比26.960:1，在此最佳工艺条件下黄酮的提取率为6.63%，考虑到实际操作的可行性，将提取条件改为：超声功率420W，超声时间30min，液料比27:1，在此条件下进行三次验证试验，得到提取率的平均值为6.57%，与理论值相比，误差为0.905%，说明响应面方程可信，响应面法对款冬花黄酮超声提取工艺的优化切实可行。 [0094] Anjaneya S Ravipati等报道的款冬花总黄酮的醇提取率仅为4.17%，而本发明的总黄酮提取率为6.57%，远高于国外的报道的款冬花总黄酮的醇提取率，说明本发明通过响应面法优化得到的款冬花总黄酮醇提工艺提取效果较好。 |
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