[0001] 相关申请

[0002] 本申请要求2012年3月22日提交的美国临时专利申请第61/614,274号的权益和优先权，其全部内容通过引用的方式并入本文。

[0003] 发明背景

[0004] FLT3(FMS样酪氨酸激酶3，又称为Flk2)是III型受体酪氨酸激酶(RTK)家族的一员，在造血干细胞的增殖和分化中起重要的作用。在急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、肥大细胞增多症以及胃肠道间质瘤(GIST)中发现该受体的激活突变和过表达。除了激活突变以外，过表达野生型FLT3的自分泌或旁分泌配体刺激可导致恶性表型。

[0005] 用于FLT3的配体由骨髓基质细胞和其它细胞表达，且与其它生长因子协同加强以刺激干细胞、祖细胞、树突细胞和自然杀伤细胞的增殖。FLT3涉及造血功能障碍，其是包括骨髓增生障碍如血小板增多、原发性血小板增多症(ET)、特发性骨髓外化生(agnogenic myeloid metaplasia)、骨髓纤维化(MF)、髓样化生性骨髓纤维化(MMM)、慢性特发性骨髓纤维化(IMF)和真性红细胞增多症(PV)的前恶性障碍、细胞减少以及前恶性骨髓增生异常综合征。恶性血液病包括白血病、淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)、霍奇金病(也叫霍奇金淋巴瘤)和骨髓瘤例如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性中性粒细胞白血病(CNL)、急性未分化白血病(AUL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、幼淋巴细胞白血病(PML)、青少年骨髓单核细胞性白血病(JMML)、成人T细胞ALL、AML伴骨髓三系细胞异常增生(AML/TMDS)、混合谱系白血病(MLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生障碍(MPD)、多发性骨髓瘤(MM)和髓系肉瘤。成人和儿童时期白血病中都已记录有FLT3的异常表达，包括急性髓性白血病(AML)、AML伴骨髓三系细胞异常增生(AML/TMDS)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和骨髓增生异常综合征(MDS)。

[0006] FLT3受体还在大部分的树突细胞祖细胞中表达，并且刺激该受体引起这些祖细胞增殖并分化为树突细胞(DC)。由于树突细胞是T细胞介导的免疫应答包括自体反应性免疫应答的主要抑制剂，因此FLT3抑制是下调DC介导的炎性和自身免疫应答的机制。一项研究示出FLT3抑制剂CEP-701有效地降低多发性硬化小鼠模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中的髓鞘丢失。在患有朗格汉斯组织细胞增生症(Langerhans cell histocytosis)和系统性红斑狼疮的患者的血清中发现高水平的FLT3配体，这进一步表明那些自身免疫疾病中树突细胞祖细胞的调节异常中的FLT3信号传导(Rolland et al.,J.Immunol.,2005,174:3067-3071)。

[0007] 原癌基因受体酪氨酸激酶(RTK)MER(又称为MERTK、Nyk和Tyro 12)是MER/AXL/TYRO3受体激酶家族中的一员。在造血谱系内，MER在树突细胞、单核细胞/巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞、巨核细胞和血小板中表达。然而，MER不在正常淋巴细胞中表达。在T细胞ALL的研究中，证明MER的异位表达促进淋巴细胞性白血病和淋巴瘤的发展。E2A-PBX1+B-ALL中也已证明MER RNA表达。已知MER激活包括Akt和Erk 1/2的抗凋亡信号蛋白。此外，最近的微阵列研究鉴定出作为在血清剥夺的条件下促进HEK-293细胞成活的基因的MER配体gas6。儿科B细胞ALL中发现MER的异位表达。抑制MER阻止Erk 1/2的激活，通过促进细胞凋亡增加B-ALL细胞对体外细胞毒剂的敏感性，并延迟白血病小鼠模型中的疾病发病时间。另外，发现MER和哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路之间的串扰。最近MER作为ALL的新型治疗靶点受到重视(Linger et al.,Blood,2009,114(13):2678-87)。MER的异常表达和激活为白血病细胞提供生存优势。而且，MER抑制可增强白血病细胞对细胞毒剂的敏感性。

[0008] VEGFR3(血管内皮生长因子受体3，又称为FLT4、PCL)是血管内皮生长因子(VEGF)C和D的VEGFR 1、2、3家族的酪氨酸激酶受体，在淋巴内皮的淋巴管生成和维持中起重要作用。VEGF是参与血管新生(angiogenesis)和血管生成(vasculogenesis)调节的信号蛋白。还已知VEGF-C/VEGFR-3轴不仅能由淋巴内皮细胞表达，还能由各种人类肿瘤细胞表达。淋巴内皮细胞中VEGF-C/VEGFR-3轴的激活可通过增加肿瘤内及周围的淋巴血管的形成(淋巴生成)来促进转移。VEGF-C/VEGFR-3轴在白血病细胞增殖、存活以及对化疗的抗性中起着关键的作用。此外，发现激活的VEGF-C/VEGFR-3轴增强癌细胞移动性和侵袭能力，促进几种类型的实体瘤如胃癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、卡波西肉瘤、头部和颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌和间皮瘤中的癌细胞转移(Su  et  al .,
Br.J.Cancer.2007 96(4):541-5)。

[0009] Aurora-B(又称为丝氨酸/苏氨酸激酶12和ARK2)，Aurora家族A、B、C中的一种，是细胞内丝氨酸/苏氨酸激酶，已知其直接参与调节极性纺锤体微管的分裂，并且是有丝分裂期间出现胞质分裂的关键调节子。Aurora B的重要靶点是组蛋白H3，其是染色体浓缩的关键调节子。Aurora激酶与人类癌症进展有很密切的联系。在许多癌症如前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌和甲状腺癌中观察到Aurora A和B的过表达。还发现恶性血液细胞包括来自急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性髓细胞样白血病(CML)的那些异常表达Aurora A和B激酶(Ikezoe et al.,Blood,2006,108:563a)。

[0010] 蛋白激酶对于治疗一系列人类疾病的新型治疗剂例如格列卫(Gleevec)和特罗凯(Tarceva)是有吸引力的且已证明的靶点。由于FLT-3、MER、VEGFR和Aurora-B激酶与许多人类癌症特别是白血病和淋巴瘤的关联以及其在这些癌症细胞增殖中起到的作用，因此特别受到关注。

[0011] WO2011053861公开了对多种激酶包括但不限于FLT3(FMS样酪氨酸激酶)表现抑制活性的激酶抑制剂。

[0012] 因此，仍需要鉴别出对FLT3酶具有有效活性、对其它激酶有更高选择性并具有对治疗FLT3相关疾病有利的良好药代动力学特性(profile)的其它化合物。

[0013] 发明概述

[0014] 本发明提供了式I的化合物，以及其各自的立体异构体、异构体的混合物或药学上可接受的盐，

[0015]

[0016] 其中：

[0017] R1是可选地由R3取代的芳基、芳基烷基、C5-C6环烷基或C5-C6环烷基甲基；

[0018] R3独立地是氟、氯、溴、碘、C1-C6烷基或CF3；

[0019] X是F、Cl、Br、I、CH3或CF3；

[0020] Y是氯、溴、碘、C1-C3烷基或苯基；

[0021] R2是C3-C6环烷基或C4-C7杂环烷基，其中C3-C6环烷基在碳原子处可选地由1或2个R4取代，且其中C4-C7杂环烷基具有选自氮、氧、硫、砜或亚砜的1或2个杂原子，且其独立地在碳4 5
原子处由R取代或在氮原子处由R取代；

[0022] R4是羟基、羟基(C1-C6)烷基、氨基、氨基(C1-C6)烷基、NHC1-C3烷基、N(C1-C3烷基)2、C1-C3烷基或卤素；

[0023] R5是H、C1-C3烷基或C(O)C1-C3烷基，其中C1-C3烷基可选地由1-3个氟原子取代；

[0024] 或其药学上可接受的盐。

[0025] 式(I)的化合物有利于抑制一种或多种蛋白激酶和治疗由蛋白激酶介导的疾病和病症如癌症、自身免疫性疾病、感染、心血管疾病以及神经退行性疾病。式(I)的化合物有利于抑制蛋白激酶以治疗与FLT3有关的疾病。

[0026] 在一个方面，本发明提供包含式(I)的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。在某些实施方案中，将这些药物组合物配制成用于静脉内给药、皮下注射给药、吸入、口服给药、直肠给药、肠胃外给药、玻璃体内给药、肌内给药、鼻内给药、经皮给药、局部给药、眼部给药(optic administration)、眼内给药(ophthalmic administration)、口腔给药、气管内给药、支气管给药或舌下给药。在其它实施方案中，将这些药物组合物配制成作为片剂、丸剂、胶囊剂、液体剂、吸入剂、鼻腔喷雾溶液、栓剂、溶液剂、凝胶剂、乳剂、软膏剂，滴眼剂或滴耳剂。

[0027] 在一个方面，本发明提供了用于治疗细胞增殖疾病或病症例如癌症的方法，包括向需要这种治疗的个体施用治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、药物组合物或药剂，其中所述细胞增殖疾病或病症包括例如淋巴瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、卵巢癌、胰腺癌、神经元癌、肺癌、子宫癌或胃肠道癌。在一个方面，本发明提供用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐抑制癌细胞生长的方法。

[0028] 在另一个方面，本发明提供治疗蛋白激酶介导的疾病或病症的方法，包括向需要这种治疗的个体施用治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、药物组合物或药剂。该蛋白激酶包括但不限于FLT3(包括突变体形式如FLT3 D835Y)、MER、VEGF1和Aurora-B。

[0029] 在某些实施方案中，蛋白激酶介导的疾病或病症是炎性疾病或病症、呼吸疾病或自身免疫性疾病或病症，如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、支气管炎、皮炎、过敏性鼻炎、银屑病、硬皮病、荨麻疹、风湿性关节炎、多发性硬化、癌症、乳腺癌、HIV相关疾病或狼疮。

[0030] 在另一个方面，本发明提供抑制蛋白激酶的方法，包括向有需要的个体施用治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或药物组合物。该蛋白激酶包括但不限于FLT3、MER、VEGF1和Aurora-B以及突变体形式如FLT3-D835Y。

[0031] 在另一个方面，本发明提供通过对个体施用治疗有效量的式(I)的化合物或药学上可接受的盐治疗心血管疾病的方法。这种心血管疾病影响心脏或血管，其包括例如动脉粥样硬化，心律失常，心绞痛，心肌缺血，心肌梗死，心脏或血管动脉瘤，血管炎，中风，肢体、器官或组织的外周阻塞性动脉病，器官或组织局部缺血后的再灌注损伤，内毒素、手术或外伤性休克，高血压，心脏瓣膜病，心脏衰竭，血压异常，血管收缩，血管畸形或炎症。

[0032] 在另一个方面，本发明提供通过对个体施用治疗有效量的式(I)的化合物或药学上可接受的盐结合第二治疗剂治疗激酶介导的疾病或病症的方法。

[0033] 在使用本发明化合物的上述方法中，对包含细胞或组织的系统施用式(I)的化合物或药学上可接受的盐。在某些实施方案中，对人类或动物个体施用式(I)的化合物、其药学上可接受的盐、药物组合物或药剂。

[0034] 本发明还涉及包含这些化合物的组合物、制备这些化合物的方法、通过使用这些化合物抑制酶活性特别是FLT3及其突变体形式FLT3 D835Y激酶活性的方法以及治疗哺乳动物的疾病或疾病症状的方法，特别是其中抑制激酶活性可以影响疾病疗效(disease outcome)。

[0035] 发明详述

[0036] 本发明提供了一组4-苯氨基-吡啶并[4,3,-d]嘧啶-5-酮衍生物及其药学上可接受的盐，其有利于抑制一种或多种蛋白激酶和治疗由蛋白激酶介导的疾病和紊乱，例如细胞增殖性疾病。本发明还提供合成和施用4-苯氨基-吡啶并[4,3,-d]嘧啶-5-酮衍生物的方法。本发明提供包含至少一种该化合物及用于该化合物的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物制剂。本发明还提供在4-苯氨基-吡啶并[4,3,-d]嘧啶-5-酮衍生化合物的合成过程中产生的有用的中间体。

[0037] 本文公开的是用于抑制蛋白激酶的新类型的式(I)的化合物及其药学上可接受的盐、N-氧化物衍生物、前药衍生物、保护性衍生物、单独的异构体和异构体的衍生物，[0038]

[0039] 其中：

[0040] R1是可选地由R3取代的芳基、芳基烷基、C5-C6环烷基或C5-C6环烷基甲基；

[0041] R3独立地是氟、氯、溴、碘、C1-C6烷基或CF3；

[0042] X是F、Cl、Br、I、CH3或CF3；

[0043] Y是氯、溴、碘、C1-C3烷基或苯基；

[0044] R2是C3-C6环烷基或C4-C7杂环烷基，其中C3-C6环烷基在碳原子处可选地由1或2个R4取代，且其中C4-C7杂环烷基具有选自氮、氧、硫、砜或亚砜的1或2个杂原子，且其独立地在碳原子处由R4取代或在氮原子处由R5取代；

[0045] R4是羟基、羟基(C1-C6)烷基、氨基、氨基(C1-C6)烷基、NHC1-C3烷基、N(C1-C3烷基)2、C1-C3烷基或卤素；

[0046] R5是H、C1-C3烷基或C(O)C1-C3烷基，其中C1-C3烷基可选地由1-3个氟原子取代；

[0047] 或其药学上可接受的盐。

[0048] 在某些实施方案中，R1代表苯基、苄基、环苯基、环己基、环苯基甲基或环己基甲基；

[0049] 在某些实施方案中，R3代表氟、氯、CH3或异丙基。

[0050] 在某些实施方案中，R3代表H、甲基或F。

[0051] 在一个实施方案中，Y代表氯、溴、碘、甲基或苯基。在其他实施方案中，Y代表氯或溴。

[0052] 在某些实施方案中，R5代表甲基。在某些实施方案中，R2代表吡咯烷基或哌啶基。在某些实施方案中，R2代表N-甲基吡咯烷基或N-甲基哌啶基。

[0053] 在某些实施方案中，R6代表羟基、羟基(C1-C6)烷基、氨基、氨基(C1-C6)烷基、NHC1-C3烷基、N(C1-C3烷基)2、C1-C3烷基或卤素。在某些实施方案中，R6代表羟基、氨基或N-甲基氨基。

[0054] 术语“烷基”单独使用或作为较大部分如“芳基烷基”或“环烷基”的一部分使用时是指具有1至15个碳原子或1-8个碳原子的直链或支链烃基(除非另有说明)，并且包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基等。烷基可以是未取代的或被一个或多个合适的取代基取代。

[0055] 术语“环烷基”是指单环或多环烃环基团，并且包括例如环丙基、环庚基、环辛基、环癸基、环丁基、金刚烷基、蒎烷基、十氢萘基、降莰基(norbornyl)、环己基、环戊基等。环烷基可以是未取代的或被一个或多个合适的取代基取代。

[0056] 术语“杂”是指在环系中至少一个碳原子成员(member)被至少一个杂原子如氮、硫和氧取代。

[0057] 术语“杂环烷基”是指包含碳原子和氢原子以及至少一个杂原子(优选选自氮、硫、氧、砜或亚砜的1至4个杂原子)的非芳族单环或多环。杂环烷基在环基团中可以具有一个或多个碳-碳双键或碳-杂原子双键，只要环基团不因其存在而呈芳香性即可。

[0058] 杂环烷基的实例包括氮杂啶基(azetidinyl)、吖丙啶基(aziridinyl)、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、高哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、四氢呋喃基、四氢噻吩、四氢吡喃基、吡喃基等。杂环烷基可以是未取代的或被一个或多个合适的取代基取代。

[0059] 如本文所用，术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。

[0060] 如本文所用，术语“烷氧基”是指通过氧结合的上述烷基基团，其实例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、叔丁氧基等。此外，烷氧基也指聚醚，如-O-(CH2)2-O-CH3等。烷氧基可以是未取代的或被一个或多个合适的取代基取代。

[0061] 如本文所用，术语“芳基”是指未取代的或取代的芳族单环或多环基团，并且包括例如苯基和萘基。该术语“芳基”还包括与非芳族碳环或杂环稠合的苯环。术语“芳基”可以与“芳基环”、“芳香基团”和“芳环”互换使用。杂芳基团具有4至14个原子，其中的1至9个独立地选自氧、硫和氮。在5-8元芳族基团中，杂芳基具有1-3个杂原子。芳基或杂芳基可以是单环或双环芳香基团。典型的芳基和杂芳基包括例如苯基、喹啉基、吲唑基、吲哚基、二氢苯并二噁英基(dihydrobenzodioxinyl)、3-氯苯基、2,6-二溴苯基、吡啶基、嘧啶基、3-甲基吡啶基、苯并噻吩、2,4,6-三溴苯基、4-乙基苯丙噻吩基、呋喃基、3,4-二乙基呋喃基、萘基、4,7-二氯萘基、吡咯、吡唑、咪唑、噻唑等。芳基或杂芳基可以是未取代的或被一个或多个合适的取代基取代。

[0062] 如本文所用，术语“卤代烷基”是指被卤原子取代的具有一个或多个氢原子的任何烷基。卤代烷基的实例包括-CF3，-CFH2，-CF2H等。

[0063] 如本文所用，术语“羟基(hydroxyl)”或“羟基(hydroxy)”是指-OH。

[0064] 如本文所用，术语“氨基”是指-NH2。

[0065] 如本文所用，“羟烷基”是指烷基基团的任何羟基衍生物。术语“羟烷基”包括任何烷基基团，其中一个或多个氢原子被羟基取代。

[0066] 如本文所用，“取代基”是指与目标分子内的原子共价结合的分子部分。例如，环取代基可以是与作为环成员的原子(优选为碳原子或氮原子)共价结合的部分，如卤素、烷基、卤烷基或其他基团。芳族基团的取代基一般与环碳原子共价结合。术语“取代”是指用取代基取代分子结构中的氢原子，以使得不超过指定原子上的化合价，并由该取代获得化学上稳定的化合物(即，可被分离、表征并检测生物活性的化合物)。

[0067] 如上所述，某些基团可以是未取代的，或者在一个或多个可用的位置，通常为1、2、3、4或5位上，被一个或多个合适的基团(其可以是相同或不同)取代为除氢以外的一个或多个合适的基团。某些基团在取代时被1、2、3或4个独立选择的取代基取代。合适的取代基包括卤素、烷基、卤烷基、芳基、羟基、烷氧基、羟烷基、氨基等。

[0068] 如本文中所用，术语“激酶”是指一系列蛋白激酶，包括但不限于FLT3、MER、Aurora-B、VEGF1及其突变体形式如FLT3 D835Y。含有本文中描述的激酶的激酶试验可按其选择性商业上用于生化检测(profiling)激酶抑制剂。在某些实施方案中，激酶是哺乳动物类激酶如人类激酶。

[0069] 如本文所用，术语“皮肤病学病症”是指皮肤病症。这类皮肤病学病症包括但不限于，皮肤的增殖性或炎性病症，如特应性皮炎、大疱性病症、胶原病、接触性皮炎湿疹、川崎病、酒渣鼻、Sjogren-Larsso综合征和荨麻疹。

[0070] 如本文所用，术语“呼吸系统疾病”是指影响参与呼吸的器官如鼻、咽喉、喉咙、气管、支气管和肺的疾病。呼吸系统疾病包括但不限于，哮喘、成人呼吸窘迫综合征和过敏性(外源性)哮喘、非过敏性(内源性)哮喘、急性重度哮喘、慢性哮喘、临床哮喘、夜间哮喘、过敏原诱发的哮喘、阿司匹林敏感性哮喘、运动引发的哮喘、二氧化碳过度通气(isocapnic hyperventilation)、儿童发作哮喘、成人发作哮喘、咳嗽变异性哮喘、职业性哮喘、类固醇抵抗性哮喘、季节性哮喘、季节过敏性鼻炎、常年过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病包括慢性支气管炎或肺气肿、肺动脉高压、间质性肺纤维化和/或气道炎症和囊性纤维化，以及缺氧。

[0071] 如本文所用，术语“癌症”是指细胞的异常生长，这些细胞趋向于以不受控制的方式增殖，并且在某些情况下转移。癌症的类型包括但不限于，实体肿瘤，如膀胱、肠、脑、乳房、子宫内膜、心脏、肾、肺、淋巴组织(淋巴瘤)、卵巢、胰腺或其他内分泌器官(甲状腺)、前列腺，皮肤(黑色素瘤)的实体肿瘤或血液肿瘤(如白血病)。

[0072] 如本文所用，术语“炎性病症”是指以以下征状的一种或多种为特征的疾病或病症：疼痛(痛，来自有毒物质的产生和神经的刺激)、发热(灼热，来自血管舒张)、红肿(发红，来自血管扩张和血流量增加)、肿胀(肿瘤，来自过度流入或体液的限制流出)，以及功能丧失，其可能是部分或全部的、临时或永久的。炎症有许多形式，包括但不限于以下的一类或多类炎症：急性炎症、粘合性炎症、萎缩性炎症、卡他性炎症、慢性炎症、肝硬化性炎症、弥漫性炎症、弥散性炎症、渗出性炎症、纤维蛋白性炎症、纤维性炎症、局灶性炎症、肉芽肿性炎症、增生性炎症、肥厚性炎症、间质性炎症、转移性炎症、坏死性炎症、闭塞性炎症、实质性炎症、增生性(plastic)炎症、增生性(productive)炎症、增殖性炎症、伪膜性炎症、化脓性炎症、硬化性炎症、浆液纤维蛋白性(seroplastic)炎症、浆液性炎症、单纯性炎症、特异性炎症、亚急性炎症、化脓性炎症、毒性炎症、创伤性和/或溃疡性炎症。炎性病症还包括但不限于影响血管(多动脉炎、颞动脉炎)；关节(关节炎：晶体性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、反应性关节炎、类风湿性关节炎，莱特尔氏关节炎)；胃肠道；皮肤(皮炎)；或多个器官和组织(系统性红斑狼疮)的病症。

[0073] 如本文所用，术语“心血管疾病”指影响心脏或血管或同时影响两者的疾病，包括但不限于动脉粥样硬化，心律失常，心绞痛，心肌缺血，心肌梗死，心脏或血管动脉瘤，血管炎，中风，肢体、器官或组织的外周阻塞性动脉病，器官或组织局部缺血后的再灌注损伤，内毒素、手术或外伤性休克，高血压，心脏瓣膜病，心脏衰竭，血压异常，血管收缩，血管畸形或炎症。

[0074] 如本文所用，术语“抑制剂”是指抑制本文所述的一种或多种激酶的化合物。例如，术语“FLT3抑制剂”是指抑制FLT3受体或降低信号转导效果的化合物。

[0075] 如本文所用，术语“药学上可接受的”是指一种材料，如载体或稀释剂，其不消除本文所述的化合物的生物活性或性质。这样的材料被施用于个体而不会引起不希望的生物效应或不会以有害的方式与含有它的组合物中的任意组分反应。

[0076] 如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指对所施用的有机体不引起显著刺激，并且不会消除本文所述的化合物的生物学活性和性质的化合物的制剂。

[0077] 如本文所用，术语“药物组合物(pharmaceutical combination)”是指混合或结合一种以上活性成分而获得的产品。

[0078] 如本文所用，术语“药物组合物(pharmaceutical composition)”是指本文所述的化合物与其它化学组分，如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂的混合物。

[0079] 如本文所用，术语“前药”是指转化成体内活性或“母体”药物的药剂。

[0080] 如本文所用，术语“蛋白激酶介导的疾病”或“由不适当的蛋白激酶活性介导的紊乱或疾病或病症”是指通过本文所述的蛋白激酶介导或调节的任何疾病状态。这类疾病状态包括但不限于，哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、溃疡性结肠炎、克罗恩病、支气管炎、皮炎、过敏性鼻炎、银屑病、硬皮病、荨麻疹，大疱性疾病、胶原病、接触性皮炎湿疹、川崎病、红斑痤疮、Sjogren-Larsso综合征、类风湿关节炎、多发性硬化症、炎症性肠综合征、HIV、狼疮、淋巴瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、卵巢癌、胰腺癌、神经癌、肺癌、子宫癌、胃肠道肿瘤、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、骨质疏松症、骨质减少、骨软化症、骨纤维、佩吉特氏病、糖尿病、血管增殖性疾病、眼部疾病、心血管疾病、再狭窄、纤维化、动脉粥样硬化、心律失常、心绞痛、心肌缺血、心肌梗塞、心脏或血管动脉瘤、血管炎、中风、外周阻塞性动脉病、器官或组织缺血后的再灌注损伤、内毒素、手术或外伤性休克、高血压、心脏瓣膜病、心脏衰竭、血压异常、血管收缩、血管畸形、移植物排斥和感染性疾病，包括病毒和真菌感染。

[0081] 如本文所用，术语“激酶介导的疾病”或“激酶介导的疾病”或“由不适当的激酶活性介导的紊乱或疾病或病症”是指由激酶机制介导或调节的任何疾病状态。例如“FLT3介导的疾病”是指由FLT3机制介导或调节的任何疾病状态。这类FLT3介导的疾病状态包括但不限于，包括急性髓性白血病(AML)的白血病、急性淋巴样白血病(ALL)、炎性疾病、呼吸疾病、自身免疫性疾病、多发性硬化、其它骨髓增生障碍，与FLT3激酶水平增加异常有关的癌症或病症。

[0082] 如本文所用，术语“MER介导的疾病”或“由不适当的MER活性介导的紊乱或疾病或病症”是指由MER激酶机制介导或调节的任何疾病状态。这些疾病状态包括但不限于，AML、ALL、实体瘤、其它增生性病症或与MER激酶水平增加异常有关的病症。

[0083] 如本文所用，术语“VEGFR3介导的疾病”或“由不适当的VEGFR3活性介导的紊乱或疾病或病症”是指由VEGFR3激酶机制介导或调节的任何疾病状态。这些疾病状态包括但不限于，AML、ALL、实体瘤、其它增生性病症或与VEGFR3激酶水平增加异常有关的病症。

[0084] 如本文所用，术语“Aurora B介导的疾病”或“由不适当的Aurora B活性介导的紊乱或疾病或病症”是指由Aurora B激酶机制介导或调节的任何疾病状态。这些疾病状态包括但不限于，AML、ALL、实体瘤、其它增生性病症或与Aurora B激酶水平增加异常有关的病症。

[0085] 如本文所用，术语“治疗有效量”是指相比未接受这种量的化合物的相应个体，使疾病、紊乱或副作用的治疗、治愈、预防或缓解得到改善或降低疾病或紊乱的发展速率的化合物的量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。

[0086] 如本文所用，术语“治疗(treat)”中，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指减轻、消除或缓解疾病或病症症状，预防其它症状，改善或预防症状的潜在代谢病因，抑制疾病或病症，阻止疾病或病症的发展，减轻疾病或病症，使疾病或病症消退，减轻由疾病或病症引起的病症，或预防和/或治疗性终止疾病或病症的症状的方法。

[0087] 如本文所用，术语“溶剂化物”是指由溶质(本发明中为式(I)的化合物或其药学上可接受的盐)和溶剂形成的可变化学计量的复合物。用于本发明目的的这类溶剂不会影响溶质的生物活性。合适溶剂的非限制性实例包括水、丙酮、甲醇、乙醇和乙酸。优选使用的溶剂是药学上可接受的溶剂。合适的药学上可接受的溶剂的非限制性实例包括水、乙醇和乙酸。

[0088] 如本文所用，术语“个体”或“患者”包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于，人、黑猩猩、猿猴、牛、马、绵羊、山羊、猪、兔、狗、猫、大鼠、小鼠、豚鼠等。非哺乳动物的实例包括但不限于鸟，鱼等。

[0089] 如本文所用，本发明化合物的术语“给药(administration)”或“施用(administering)”指的是对需要治疗的个体提供本发明的化合物和/或其前药。

[0090] 如本文所用，术语“载体”是指促进本文所述的化合物进入细胞或组织的化合物或化学药剂。

[0091] 如本文所用，相对于制剂、组合物或成分而言的术语“可接受的”在本文使用时是指对被治疗的个体的基本健康没有持久的有害作用。

[0092] 如本文所用，术语“稀释剂”是指在施药前用于稀释本文所述的化合物的化学物质。稀释剂还可用于稳定本文所述的化合物。

[0093] 如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指所施用的本文所述化合物将所治疗的疾病或病症的一种或多种症状减轻到某种程度的充足量。其结果可能是降低或减轻病征、症状或疾病的病因，或生物系统的任何其它期望的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是为提供疾病症状的临床显著降低所需的包含本文所公开的化合物的组合物的量。适当的“有效”量在任何个别情况下可以使用如剂量递增(dose escalation)研究的技术来确定。仅以示例的方式举例，本发明的化合物的治疗有效量可以在例如约0.01mg/kg/天至约100mg/kg/天，或约0.1mk/kg/天至约10mg/kg/天的范围内。

[0094] 1、人类蛋白激酶

[0095] 蛋白激酶在调节多种细胞过程和保持对细胞功能的控制中起主要作用。蛋白激酶催化并调节磷酸化过程，通过该过程激酶将磷酸盐基团与蛋白或脂质靶点共价连接，来响应各种细胞外信号。这些刺激物实例包括激素、神经递质、生长和分化因子、细胞周期事件、环境压力和营养压力。细胞外刺激物可影响与细胞生长、转移、分化、激素分泌、转录因子激活、肌肉收缩、葡萄糖代谢、蛋白合成控制和细胞周期调控有关的一种或多种细胞应答。

[0096] 本发明的化合物通过激酶板(kinase panel)进行筛选，并且其抑制板上的至少一种激酶的活性。激酶的实例包括但不限于，FLT3、MER、Aurora-B、VEGF1和突变体形式如FLT3 D835Y激酶。正因如此，本发明的化合物和组合物有利于治疗疾病或紊乱，其中这些激酶对与这些激酶有关的疾病或紊乱的病理和/或症候有贡献。这些疾病或紊乱包括但不限于，胰腺癌、甲状腺乳头状癌、卵巢癌、人类腺样囊性癌、非小细胞肺癌、分泌性乳腺癌、先天性纤维肉瘤、先天性中胚层肾瘤、急性髓性白血病、银屑病、转移、与癌有关的疼痛和成神经细胞瘤、自身免疫性疾病、炎性疾病、骨疾病、代谢疾病、神经和神经退行性疾病、癌症、心血管疾病、呼吸疾病、过敏和哮喘、阿尔茨海默病和与激素有关的疾病、良性和恶性增殖性紊乱、免疫系统不恰当激活导致的疾病、神经系统不恰当激活导致的疾病、同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病、糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性导致的脉络膜新生血管、银屑病、关节炎、骨关节炎、类风湿关节炎、关节炎滑膜血管翳侵袭、多发性硬化、重症肌无力、糖尿病、糖尿病性血管病、早产儿视网膜病变、婴幼儿血管瘤、非小细胞肺、膀胱和头及颈癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃和胰腺癌、银屑病、纤维化、动脉粥样硬化、再狭窄、自身免疫性疾病、过敏、呼吸道疾病、哮喘、移植排斥、炎症、血栓形成、视网膜血管增殖、炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、骨移植、移植或骨髓移植排斥、狼疮、慢性胰炎、恶病质、感染性休克、纤维增殖性和分化性皮肤疾病或紊乱、中枢神经系统疾病、神经退行性疾病、阿尔茨海默病、帕金森病、与大脑或脊髓损伤后的神经损伤和轴突退化有关的疾病或紊乱、急慢性癌症、眼病、病毒感染、心脏病、肺或肺脏疾病或肾或肾脏疾病以及支气管炎。

[0097] 本文中所述的化合物是激酶活性的抑制剂，并对治疗与不适当的激酶活性相关的紊乱，特别是对治疗和预防由激酶介导的疾病状态具有治疗效果。因此，本发明提供了调节且特别是抑制其中激酶起作用的信号转导级联的方法。该方法一般包括对个体施用或使表达激酶的细胞接触有效量的本文所述的化合物、其前药或可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物和/或组合物，以调节或抑制信号转导级联。该方法也可用于调节且特别是抑制由激活特定激酶信号转导级联引发的下游过程或细胞反应。该方法也在体外环境或体内环境中作为治疗或预防以激酶依赖性信号转导级联激活为特征、由其引发或与其相关的疾病的治疗方法而实施。

[0098] 2、药物组合物

[0099] 对于本文所提供的化合物，包括式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物、N-氧化物、前药或异构体的治疗用途，将这些化合物以治疗有效量单独或作为药物组合物的一部分来施用。

[0100] 因此，本文提供的药物组合物，包括本文提供的至少一种化合物(包括至少一种式(I)的化合物、其药学上可接受的盐和/或溶剂化物)，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂或赋形剂。此外，这类化合物和组合物可以单独施用或与一种或多种附加治疗剂组合施用。

[0101] 这类化合物和组合物的给药方法包括但不限于，静脉给药、吸入、口服给药、直肠给药、肠胃外给药、玻璃体内给药、皮下给药、肌内给药、鼻内给药、经皮给药、局部给药、眼内给药、口腔给药、气管内给药、支气管给药、舌下给药或眼部给药。本文提供的化合物通过已知的药物剂型的方式施用，所述药物剂型包括用于口服给药的片剂、胶囊剂或酏剂，用于直肠给药的栓剂、用于肠胃外或肌内给药的无菌溶液或悬浮剂，用于局部给药的洗剂、凝胶剂、软膏剂或乳膏剂等。

[0102] 治疗有效量会根据尤其是适应症、疾病严重程度、个体的年龄和相对健康状况、所施用化合物的效力、给药方式和所需的治疗而有所变化。所需剂量也会根据给药模式，待治疗的具体病症和希望的效果而变化。

[0103] 药学上可接受的盐形式包括药学上可接受的酸性/阴离子或碱性/阳离子盐。药学上可接受的酸性/阴离子盐包括乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、乙二胺四乙酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、二盐酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、对羟乙酰氨基苯胂酸盐、己基间苯二酚盐、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐以及三乙基铵盐。药学上可接受的碱性/阳离子盐包括钠、钾、钙、镁、二乙醇胺、N-甲基-D-葡糖胺、L-赖氨酸、L-精氨酸、铵、乙醇胺、哌嗪和三乙醇胺盐。

[0104] 药学上可接受的酸加成盐是由式(I)的化合物的游离碱形式与合适的无机酸或有机酸反应而形成的，所述合适的无机酸或有机酸包括但不限于，氢溴酸、盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、琥珀酸、马来酸、甲酸、乙酸、丙酸、富马酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、苯甲酸、水杨酸、谷氨酸、天冬氨酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、萘磺酸例如2-萘磺酸，或己酸。式(I)的化合物的药学上可接受的酸加成盐可以包括或者可以是例如氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、乙酸盐、丙酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐、对甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、萘磺酸盐(例如2-萘磺酸盐)，或己酸盐。

[0105] 本发明的化合物的游离酸或游离碱形式可从相应的碱加成盐或酸加成盐形式分别制备。例如酸加成盐形式的本发明的化合物可通过用合适的碱(例如氢氧化铵溶液、氢氧化钠等)处理而转化成相应的游离碱形式。碱加成盐形式的本发明的化合物可通过用合适的酸(如盐酸等)处理而转化成相应的游离酸。

[0106] 本发明化合物的前药衍生物可通过本领域普通技术人员已知的方法来制备(例如，详细内容参见Saulnier et al.,(1994),Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,Vol.4,1985；其全部教导通过引用的方式并入本文)。

[0107] 本发明的化合物的保护性衍生物可通过本领域普通技术人员已知的手段来制备。适用于产生保护基和脱去保护基的技术的详细描述可见于T.W.Greene,“Protecting Groups in Organic Chemistry(有机化学中的保护基团),”3rd edition,John Wiley and Sons,Inc.,1999,其全部教导通过引用的方式并入本文。

[0108] 通过使化合物的外消旋混合物与光学活性拆分剂反应以形成一对非对映异构化合物，分离非对映体并回收旋光纯的对映体，可将本发明的化合物以其单独的立体异构体制备。对映体的拆分可以通过使用本发明的化合物的共价非对映体衍生物或者通过使用可离解的络合物(例如结晶的非对映体盐)来进行。非对映体具有不同的物理性质(例如熔点、沸点、溶解度、反应性等)，并且通过利用这些不相似性，可以容易地进行分离。非对映体可通过色谱法或者通过基于溶解度差异的分离/拆分技术来分离。然后通过不会导致外消旋化的任何实施手段回收旋光纯的对映异构体以及拆分剂。适用于从外消旋混合物中拆分化合物的立体异构体的技术的更详细描述见于Jean Jacques,Andre Collet and Samuel H.Wilen,"Enantiomers,Racemates and Resolutions(对映体、外消旋体和拆分),"John Wiley And Sons,Inc.,1981,其全部教导通过引用的方式并入本文。

[0109] 用于本发明的药物组合物的合适的药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂或赋形剂包括由例如克利酮(collidone)或虫胶(shellac)、阿拉伯胶、滑石、二氧化钛或糖制成的片剂(包衣片)，胶囊(明胶)，溶液(含水或水-乙醇溶液)，含有活性物质的糖浆，乳剂或可吸入粉末(各种糖如乳糖或葡萄糖，盐和这些赋形剂彼此的混合物)，和气雾剂(含或不含推进剂吸入溶液)。

[0110] 可以使用的赋形剂包括，例如水、药学上可接受的有机溶剂如石蜡(例如石油馏份)、植物油(例如花生油或芝麻油)、单官能或多官能醇(例如乙醇或甘油)，载体如天然矿物粉末(例如高岭土、粘土、滑石、白垩)，合成矿物粉末(例如高度分散的硅酸和硅酸盐)，糖(如蔗糖，乳糖及葡萄糖)，乳化剂(如木质素、亚硫酸盐废液、甲基纤维素、淀粉及聚乙烯吡咯烷酮)，以及润滑剂(如硬脂酸镁、滑石粉、硬脂酸及月桂基硫酸钠)。

[0111] 通过本文中和实施例中描述的方法制备式(I)的化合物。在某些实施方案中，式(I)的化合物按以下制备：(a)可选地将本发明的化合物转化成药学上可接受的盐；(c)可选地将本发明化合物的盐形式转化成非盐形式；(d)可选地将本发明化合物的非氧化形式转化为药学上可接受的N-氧化物；(e)可选地从异构体的混合物中拆分本发明化合物单独的异构体；(f)可选地将本发明的非衍生化合物转化为药学上可接受的前药衍生物；和(g)可选地将本发明化合物的前药衍生物转化为其非衍生形式。

[0112] 本文引用的所有专利、公布的申请和参考文献的教导的全部内容通过引用的方式并入本文中。实施例

[0113] 以下实施例示出了本发明的式(I)的化合物的制备方法，通过这些实施例对本发明进一步举例说明。实施例仅用于说明目的，并不意图也不应理解为以任何方式限制本发明。本领域技术人员将认识到，可以在不改变本发明的范围的情况下作出变化和修改。

[0114] 液相色谱-质谱(LC-MS)方法：

[0115] 1、使样品在室温下运行的具有Zorbax Eclipse XDB-C18(3.5μ)反向柱(4.6×50mm)的Agilent Technologies 6120 MSD系统中以1.5mL/分钟的流速过柱(run)。

[0116] 2、流动相使用溶剂A(水/0.1％甲酸)和溶剂B(乙腈/0.1％甲酸)：95％/5％至0％/100％(A/B)进行5分钟。

[0117] 3、使用电喷雾电离(ESI)记录质谱(m/z)。

[0118] 4、电离数据被舍入最接近的整数。

[0119] 本发明提供从化合物a开始制备式(I)的化合物的方法(反应式1)，其可按PCT公开号WO2011053861中描述的制备。

[0120]

[0121] 通过将化合物a与化合物b在酸性条件下反应制备化合物c(参见反应式1)。然后用N,N-二甲基甲酰胺二甲缩醛(DMF DMA)处理化合物c，接着在乙醇中用氨处理以生成化合物d。用N-卤代琥珀酰亚胺完成化合物e的制备。用无机氧化剂氧化化合物e，形成相应的砜。该2
砜化合物与各种胺RNH2在有机碱存在时进行偶联反应生成式(I)的化合物。下面描述了化合物(238)的详细合成反应条件。

[0122] 4-((4-(3-氟代苯氧基)苯基)氨基)-6-甲基-2-(甲硫基)嘧啶-5-羧酸乙酯(238c)：向40mL的反应瓶中装入a(1.85g,7.52mmol)和在10mL乙酸中的4-(3-氟代苯氧基)苯胺(1.65g,8.10mmol)。在100℃下搅拌2小时后，减压除去挥发物，得到棕色残余物。将残余物溶于亚甲基氯，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。用硫酸钠干燥分离的有机层，然后浓缩得到棕色残余物(239c)。将生成的粗产品用于下一步，而无需纯化。

[0123] 4-甲基-2-(甲硫基)-6-(4-苯氧基苯氨基)嘧啶-5-羧酸乙酯(222c)：通过实施例(238c)的方法由4-苯氧基苯胺制备(222c)。

[0124] 4-((4-(3-氟代苯氧基)苯基)氨基)-2-(甲硫基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮(238d)：将粗残余物(238c)溶于DMF(5mL)中。室温下向其中加入N,N-二甲基甲酰胺二甲缩醛(DMF/DMA,15mmol,1.93mL)。于130℃搅拌反应混合物16小时。减压除去挥发物得到棕色残余物。将该残余物溶于亚甲基氯，并用水洗涤。将分离的有机层浓缩以提供棕色油。在40mL的反应瓶中将得到的油性残余物溶于热乙醇中。向其中加入30％氢氧化铵(2mL)水溶液，然后将瓶盖紧，并于100℃搅拌4h。将反应冷却至室温形成固体沉淀。通过过滤收集生成的固体，用乙醇洗涤，生成1.58g桔色固体238d(三步为53％)。

[0125] 8-溴-4-((4-(3-氟代苯氧基)苯基)氨基)-2-(甲硫基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮(238e)：向40mL反应瓶加入在15mL DMF中的238d(1.00g,2.53mmol)。将混合物慢慢加热直至其变成清澈溶液，然后冷却至室温。向混合物中加入N-溴代琥珀酰亚胺(NBS,498mg,2.80mmol)，并于室温搅拌1h(小时)。减压除去溶剂得到桔色固体。通过过滤收集生成的固体，用乙腈洗涤得到1.04g(87％)的所需产物238e。

[0126] 8-溴-4-(4-(3-氟代苯氧基)苯氨基)-2-(1-甲基哌啶-4-基氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐(238)：向40mL反应瓶中装入在15mL DMF中的238e(0.90g,1.90mmol)。将清澈溶液冷却至-10℃。于-10℃向其中加入m-CPBA(1.48g,6.00mmol)。使反应温热至室温，然后于室温下额外搅拌30min(分钟)。向混合物中加入TEA(0.83mL,
6.00mmol)和1-甲基哌啶-4-胺(685mg,6.00mmol)，然后于室温搅拌1小时，通过LC-MS监控反应。减压除去溶剂得到浅棕色油性残余物。将残余物溶于亚甲基氯，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。用硫酸钠干燥分离的有机层，然后减压浓缩得到固体。将该固体溶于最小量的亚甲基氯中，并用过量的正己烷处理，产生淡黄色固体。通过过滤收集生成的固体，用正己烷冲洗，然后在空气中干燥，产生淡黄色固体。将固体溶于DCM和甲醇的混合物中。向该清澈溶液中加入在二氧六环(12.0mL)中的4N HCl，然后于室温搅拌6小时。减压除去溶剂得到所需产物(238，产率90％)。

[0127] 8-溴-2-(1-甲基哌啶-1-基氨基)-4-(4-苯氧基苯氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐(226)：通过(238)的方法由(226c)制备。MS(ESI)m/z 521[M+l]+,523[M+3]+.1H NMR(400M Hz,CDC13)δ(ppm)11.62(s,0.7H),11.42(s,0.3H),11.09(b,1H),7.70-7.79(m,2H),7.56(m,1H),7.32-7.39(m,2H),7.02-7.14(m,5H),5.79(d,J＝7.32Hz,0.7H),5.43(d,J＝7.04Hz,0.3H),3.88(m,0.3H),3.75(m,0.7H),2.90(m,2H),2.01-2.37(m,7H),1.66(m,2H).

[0128] 表1

[0129]

[0130]

[0131]

[0132]

[0133]

[0134] 表1示出式(I)的化合物的结构。式(I)的某些化合物命名如下：4-((4-(苄氧基)苯基)氨基)-8-溴-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮；8-溴-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)-4-((4-苯氧基苯基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮；8-溴-4-((4-(环戊氧基)苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮；8-溴-4-((4-(环己基甲氧基)苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮；8-溴-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)-4-((4-(对甲苯氧基)苯基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮；8-溴-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)-4-((4-苯氧基苯基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐；8-溴-4-((4-(环戊基甲氧基)苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮；8-溴-4-((4-(环己氧基)苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮；8-氯-4-((4-(环己氧基)苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮；8-溴-4-((4-(4-异丙基苯氧基)苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮；8-溴-
2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)-4-((4-(对甲苯氧基)苯基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐；8-溴-4-((4-(4-氟代苯氧基)苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐；8-溴-4-((4-(环己氧基)苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐；4-((4-(苄氧基)苯基)氨基)-8-溴-
2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮；8-溴-4-((4-(环戊基甲氧基)苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮；8-溴-4-((4-(4-异丙基苯氧基)苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐；8-溴-4-((4-(环戊氧基)苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐；8-溴-4-((4-(3-氟代苯氧基)苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐；8-溴-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)-4-((4-(邻甲苯氧基)苯基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐；8-溴-4-((4-(3-氟代苯氧基)苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮；8-溴-4-((4-(3-氟代苯氧基)苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮；8-溴-4-((4-(3,4-二氟苯氧基)苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐；8-溴-4-((4-(4-氯代苯氧基)苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐；8-溴-4-((4-(3,5-二氟苯氧基)苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐；8-溴-4-((4-(3-氟代苯氧基)-3-甲基苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐；8-溴-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)-4-((3-苯氧基苯基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐；8-溴-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)-4-((3-苯氧基苯基)氨基)吡啶并[4,
3-d]嘧啶-5(6H)-酮；8-溴-4-((3-氟-4-苯氧基苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐；8-溴-4-((3-甲基-4-苯氧基苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐；8-溴-4-((3-氟-4-(3-氟代苯氧基)苯基)氨基)-2-((l-甲基哌啶-4-基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐和8-溴-2-(甲基(l-甲基哌啶-4-基)氨基)-4-((4-苯氧基苯基)氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐、8-溴-2-(l-异丙基哌啶-4-基氨基)-4-(4-苯氧基苯氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮、8-溴-2-(l-乙基哌啶-4-基氨基)-4-(4-苯氧基苯氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮、8-溴-4-(4-苯氧基苯氨基)-2-(l-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮。

[0135] 生物试验

[0136] 1、激酶抑制试验

[0137] 对本发明的化合物进行试验以测定其抑制激酶的能力，该激酶包括但不限于FLT3和JAK2。

[0138] FLT3是III型受体酪氨酸激酶(RTK)家族的一员。用于FLT3的配体由骨髓基质细胞和其它细胞表达，且与其它生长因子协同加强以刺激干细胞、祖细胞、树突细胞和自然杀伤细胞的增殖。FLT3涉及造血功能障碍，其是包括骨髓增生障碍如AML和ALL的前恶性障碍。

[0139] JAK2涉及通过II型细胞因子受体家族成员(例如干扰素受体)、GM-CSF受体家族成员(IL-3R、IL-5R和GM-CSF-R)、gpl30受体家族成员(例如IL-6R)和单链受体成员(例如Epo-R、Tpo-R、GH-R、PRL-R)的信号传导。在白血病患者中已发现JAK2基因与TEL(ETV6)(TEL-JAK2)和PCM1基因的融合。此外，JAK2的突变已涉及真性红细胞增多症、特发性血小板增多症和其它骨髓增生障碍。该突变，即617位缬氨酸到苯丙氨酸的变化，致使造血细胞对生长因子如促红细胞生成素和血小板生成素更敏感。

[0140] 方法

[0141] 酶促FLT3和JAK2激酶活性的抑制

[0142] 首先，将本发明的化合物在100％DMSO(CALBIOCHEMTM)中稀释至10mM进行储存，并制成激酶缓冲溶液以使化合物浓度范围为1μM至10μM。将本发明的化合物的系列稀释液分配到96孔板(GREINER BIOSCIENCESTM)，每个孔6μL。将截短的人类FLT3野生型、突变体D835Y和JAK2(CARNA BIOSCIENCESTM)在激酶缓冲液中稀释，加入化合物溶液中，并于室温预培养30分钟。接着，将ATP(TEKNOVATM)和底物溶液(建议PerkinElmerTM制造的底物，例如用于FLT3野生型和突变体D835Y的UlightTM-TK肽，以及用于JAK2的UlightTM-JAK1
(PERKINELMERTM))加入(各12μL)含有化合物溶液和酶的孔中。将反应混合物培养1小时。培养后，加入用EDTA、水和兰斯(Lance)检测缓冲液(PERKINELMERTM)制备的终止溶液(各12μL)以终止磷酸化。加入终止溶液并振荡5分钟后，将含铕标记抗体(建议PerkinElmerTM制造的底物，例如用于FLT3和JAK2的PT66)、水和兰斯检测缓冲液的检测溶液(各12μL)加入至反应混合物中并再培养50分钟。底物磷酸化是加入检测溶液并培养50分钟后测得的665nm发射的函数。

[0143] 结果

[0144] 式(I)的化合物显示出有利的药理学性质。如本文所用，描述抑制活性(nM)效力的方式是如表2中所示的抑制活性在50％时的值(IC50)。将参比化合物AC220(Quizartinib,Ambit)、PKC412(Midostaurin,Novartis)和星孢素(泛激酶抑制剂)用于FLT3以判断式(I)化合物的抑制活性。将参比化合物、星孢素、泛激酶抑制剂独立地用于JAK2以判断式(I)化合物的选择性和抑制活性。

[0145] 例如，式(I)的化合物238，即8-溴-4-(4-(3-氟代苯氧基)苯氨基)-2-(1-甲基哌啶-4-基氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮盐酸盐，显示出对FLT3野生型和突变体D835Y的激酶活性的强抑制性，所述突变体D835Y为在AML患者中发现的FLT3激酶域中发生的最常见的突变体。其生化试验中的效力优于临床发展的FLT3抑制剂AC220和PKC412的效力。再者，其显示优于参比PKC412的对JAK2激酶的优良选择性。表2示出了式(I)的代表性化合物对FLT3和JAK2的IC50值。如表2中所示，参比化合物、星孢素和PKC-412是多能的，这表明对激酶没有选择性，而本发明的化合物显示出比参比化合物更好的效力和更好的选择性。此外，本发明化合物还示出比星号显示的并在现有技术WO2011053861和PCT/US2010/056583中描述的那些更好的选择性。如表2中所示，化合物*8和*136示出与PKC-412相似的多激酶抑制活性。众所周知PKC-412还是血管内皮生长因子受体(VEGFR)和表皮生长因子受体(EGFR)的拮抗剂。一起服用时，这些数据显示，与之前报道的化合物相比，本发明的化合物显著提高了选择性，以及与已知的FLT3抑制剂、AC220和PKC-412相比，显著提高了对FLT3野生型和D835Y突变体的抑制效力。

[0146] WO2011053861中描述的化合物*8和*136示出对各种测试的激酶包括JAK2的多重抑制活性。具体而言，它们显示口服给药10mg/kg后小鼠没有药物暴露，这表明它们没有在肠中被吸收或极快速地从身体消除。

[0147] 表2示出了式(I)的代表性化合物对FLT3和JAK2的生化抑制

[0148]化合物ID FLT3野生型 JAK2 FLT3-D835Y
PKC-412 15.4 116 24.2
星孢素 0.2 0.9 0.3
*8 0.2 12.7 1.0
*136 0.1 3.9 0.3
*203 0.2 391 18.5
246 0.1 260 1.7
221 0.1 290 0.4
241 1.6 1050 0.6
223 0.6 153 0.3
225 0.3 1521 1.6
226 1.2 281 0.2
228 0.1 129 0.6
233 0.1 173 0.3
240 1.2 599 1.3
238 1.4 845 0.4

[0149] *三种化合物编号8、136和203描述于WO2011053861和PCT/US2010/056583。

[0150] 所有数据以IC50值列出。

[0151] 2、细胞活力试验：FLT3-ITD-阳性细胞的抑制

[0152] 测试本发明的化合物对人类急性白血病细胞系(MV4-11)中FLT3-ITD(内部串联重复)抑制的影响。FLT3主要在未成熟的造血祖细胞以及成熟骨髓细胞中表达。其属于包括KIT、FMS和PDGFR的III型受体酪氨酸激酶(RTK)家族。其通过与FL结合被激活，导致激酶活性增加和包括STAT5、Ras和PI3激酶的下游信号通路的激活。

[0153] 近膜域中的FLT3-ITD突变是急性髓性白血病(AML)中最常观察到的分子缺陷。FLT3-ITD诱导配体非依赖型二聚作用、自身磷酸化和组成型激活，并能转化造血细胞。从临床上看，已知FLT3-ITD促进白细胞增多、增加原始细胞计数(blast count)、增加复发率、降低无病生存以及导致总生存率较差。因此，FLT3-ITD对于AML治疗是有吸引力的分子靶标。

[0154] 方法

[0155] 测试本发明化合物对MV4-11细胞的细胞活力影响。对于细胞活力试验，从美国典型培养物保藏中心(ATCC，马纳萨斯，VA)获得表达人类FLT3-ITD的MV4-11细胞。用含有10种小牛血清(BCS；HycloneTM)补充铁的洛斯维公园纪念研究所(RPMI)培养基(HyCloneTM)维持细胞系。将MV4-11细胞以2×104个细胞接种到96孔培养板中，然后加入连续(serially)稀释的化合物。在37℃的72小时孵育期后使用基于对来自活细胞的ATP定量的ATPLite lstep检测(Perkin-ElmerTM)测定细胞活性。还平行进行CellTiter Aqueous检测(PromegaTM)作为正交试验。IC50值用非线性回归计算，并定义为处理的相对于未处理的对照细胞的发光或吸收降低50所需要的浓度(PrismTM软件)。

[0156] 结果

[0157] 表3中示出式(I)的代表性化合物的IC50抑制数据。式(I)的化合物在IC50浓度表现出抑制小于10nM。具体而言，化合物237，8-溴-4-(4-(环戊氧基)苯氨基)-2-(1-甲基哌啶-4-基氨基)吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)酮盐酸盐，表现出其抑制水平比FLT3 ITD诱导的MV4-
11癌细胞系中的参比PKC-412显示的抑制水平较高。这种强抗肿瘤活性表明本发明的化合物比参比和现有技术(PCT申请号：PCT/US2010/056583)中描述的由星号表示的化合物203具有更好的治疗价值。

[0158] 表3式(I)的代表性化合物的FLT3-ITD诱导的癌细胞系的细胞活力

[0159]化合物ID MV4-11细胞(IC50) 化合物ID MV4-11细胞(IC50)
PKC-412 3.2    
*203 5.8 226 1.3
228 0.8 228 0.8

[0160]233 1.4 235 1.6
237 0.5 238 1.9
246 1.4 241 0.9
221 2.4 240 0.5

[0161] *编号化合物描述于WO2011053861和PCT/US2010/056583中。

[0162] 3、异种移植模型：临床前疗效模型

[0163] 为了测试本发明化合物是否示出足够的体内疗效，使用MV4-11癌细胞系在异种移植小鼠模型中进行测试。

[0164] 方法

[0165] 使用FLT3-ITD的MV4-11细胞系在异种移植小鼠模型中测试本发明的化合物。将所有雄性6周龄Balb/C裸鼠饲养于有玉米芯的塑料笼中(4-6只鼠/笼)，保持在12小时光/暗周期的无病原体设施(20-25℃,30-70％湿度)中。通过皮下注射MV4-11细胞悬浮液建立肿瘤模型。当平均肿瘤体积达大约400mm3(肿瘤植入约5周后)，将携带肿瘤的小鼠分为2组(每组9只小鼠)。开始进行每日30mg/kg化合物238的治疗，持续28天。使用媒介20％羟基-β-环糊精。每周测量两次肿瘤体积。适当情况下，通过以下公式计算每组的肿瘤退缩百分比(PTR)：

[0166] PTR＝100×(肿瘤体积开始-肿瘤体积最终)/(肿瘤体积开始)。

[0167] 结果

[0168] 表4中示出的式(I)的代表性化合物238显示仅在治疗4天后肿瘤退缩74.6％，并且在化合物治疗11天后肿瘤最终完全退缩。该结果表明代表性化合物对异种移植小鼠模型具有非常有效的抗肿瘤活性，这表明本发明的化合物对于失调/或过度活跃的FLT3诱导的疾病如AML和ALL是良好的治疗选择。

[0169] 表4

[0170] 肿瘤体积平均值(mm3)

[0171]

[0172]

[0173] 肿瘤退缩百分比(PTR％)

[0174]

[0175] 本文中列出的所有专利、专利申请和出版物的内容通过引用的方式并入本文中。

[0176] 尽管已在示例性实施例中具体示出和说明了本发明，但本领域技术人员应理解，在不背离由所附权利要求涵盖的本发明的范围的情况下可以在形式和细节上作出各种变化。