用于治疗乳腺癌的miRNA |
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| 申请号 | CN201680015113.6 | 申请日 | 2016-03-09 | 公开(公告)号 | CN107429251A | 公开(公告)日 | 2017-12-01 |
| 申请人 | 肯塔基大学研究基金会; | 发明人 | 郭培宣; 舒丹; 束弋; 李晖; 法尔兹因·哈克; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开的主题涉及基于RNA的组合物和 治疗 受试者中的 乳腺癌 的方法。更具体地，本发明公开的主题涉及包含多分支RNA纳米颗粒、乳腺癌靶向模 块 和有效量的乳腺癌治疗剂的RNA纳米结构和组合物。此外，目前公开的主题涉及使用RNA纳米颗粒组合物治疗患有乳腺癌或处于患乳腺癌 风 险中的受试者的乳腺癌的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种人工RNA纳米结构分子，包含：包含至少一种RNA寡核苷酸的多分支RNA连接基序，和与所述RNA连接基序偶联的乳腺癌靶向模块。 |
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| 说明书全文 | 用于治疗乳腺癌的miRNA[0001] 相关申请 [0003] 政府利益 [0004] 本发明是在由国立卫生研究院授予的EB019036、CA 151648和EB0037305以及由国防部授予的BC 140428下的政府支持下进行。政府对本发明具有一定的权利。 技术领域[0005] 本发明公开的主题涉及治疗受试者中乳腺癌的RNA纳米结构和方法。更具体地，本发明公开的主题涉及包含多分支RNA纳米颗粒、乳腺癌靶向模块和有效量的乳腺癌治疗剂 的RNA纳米结构和组合物。此外，目前公开的主题涉及使用RNA纳米颗粒组合物治疗患有乳 腺癌或处于患乳腺癌风险中的受试者的乳腺癌的方法。 背景技术[0006] 由于侵袭性增殖和转移和缺乏多样化的治疗选择，三阴性乳腺癌(TNBC)具有高死亡率。TNBC，代表I5至20％的乳腺癌，在年轻女性中更频繁地发生。非洲裔美国妇女和个体 携带这些BRCA1基因。目前，没有TNBC的治疗性治疗，并且可用的化学疗法与显著的毒性和 耐药性的发展相关。因此，TNBC患者的预后仍然很差。五年存活率小于74.5％，相比之下， HER2阳性乳腺癌的存活率为87％和ER阳性乳腺癌的存活率超过90％。因此，存在对TNBC靶 向治疗剂开发的迫切和未满足的需求。该介绍仅提供一般的背景信息，并且不旨在用于帮 助确定所要求保护的主题的范围。 发明内容[0007] 当前公开的主题满足一些或所有上述需要，这对于本领域的普通技术人员经过对本文档中提供的信息的研究之后将变得清晰明了。 [0008] 本发明内容描述了当前公开的主题的若干实施例，并且在许多情况下列出了这些实施例的变型和置换。本发明内容仅仅是众多和变化的实施例的示例。提及给定实施例的 一个或多个代表性特征同样是示例性的。这样的实施例通常可以具有或不具有所提及的特 征；同样，那些特征可以应用于本公开主题的其它实施例，无论是否在本发明内容中列出。 本发明内容没有列出或表明这些特征的所有可能的组合。 [0009] 本发明公开的主题涉及治疗受试者的乳腺癌的基于RNA的组合物和方法。更具体地，本发明公开的主题涉及包含多分支RNA纳米颗粒、乳腺癌靶向模块和有效量的乳腺癌治 疗剂的RNA纳米结构和组合物。此外，本发明公开的主题涉及使用RNA纳米颗粒组合物治疗 患有乳腺癌或处于患乳腺癌风险中的受试者的乳腺癌的方法。 [0010] 本发明公开的主题涉及人工RNA纳米结构分子。该分子包括包含至少一个RNA寡核苷酸的多分支RNA连接基序以及与RNA连接基序偶联的乳腺癌靶向模块。在一些实施方案 中，所述分子还包括与RNA连接基序偶联的至少一种生物活性剂。在一些实施方案中，RNA寡 核苷酸长度为至少3个核苷酸。在一些实施方案中，生物活性剂是治疗剂。在一些实施方案 中，RNA寡核苷酸包括在2’位置的至少一个化学修饰。化学修饰的非限制性实例包括2’-氟、 2’-氨基、2’-O-甲基。在一些实施方案中，多分支RNA连接基序是三分支RNA连接基序。在本公开的一些实施方案中，RNA分子形成二聚体、三聚体、六聚体和图案化的超结构。此外，在一些实施方案中，多分支RNA包含序列5’-UUG CCA UGU GUA UGU GGG AUC CCG CGG CCA UGG CGG CCG GGA G-3’(SEQ ID NO：5)。在一些实施方案中，多分支RNA包含序列5’-CCC ACA UAC UUU GUU GAU CCG CCU UAG UAA CGU GCU UUG AUG UCG AUU CGA CAG GAG GC-3’ (SEQ ID NO：6)。在一些实施方案中，多分支RNA包含序列5’-GATAAGCT CTC CCG GCC GCC ATG GCC GCG GGA T-3’(SEQ ID NO：7)。在一些实施方案中，多分支RNA包含序列5’-CTC CCG GCC GCC ATG GCC GCG GGA T-3’(SEQ ID NO：8)。在一些实施方案中，多分支RNA包含 序列5’-AUC CCG CGG CCA UGG CGG CCG GGA G-3’(SEQ ID NO：9)。在一些实施方案中，分子的直径为至少约40nm或更小。在一些实施方案中，分子的直径为至少约20nm或更小。在一 些实施方案中，分子的直径为至少约10nm或更小。在一些实施方案中，分子具有约-100mV至 约100mV范围的ζ电位。在一些实施方案中，分子具有约-50mv至约50mV的ζ电位。在一些实施方案中，三分支RNA连接基序的分支包括a3WJ RNA模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)或c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。在一些实施方案中，三分支RNA连接基序包括 a3WJ RNA模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)、和c3WJ RNA模块(SEQ ID NO： 3)。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1包含核苷酸序列5’-UUG CCA UGU GUA UGU GGG-3’。在一些实施方案中，SEQ ID NO：2包括核苷酸序列5’-CCC ACA UAC UUU GUU GAUCC-3’。在一些实施方案中，SEQ ID NO：3包含核苷酸序列5’-GGA UCA AUC AUG GCA A-3’。 [0011] 在一些实施方案中，乳腺癌靶向模块包括结合至少一种乳腺癌细胞表面标记物的配体。在一些实施方案中，配体结合至叶酸受体、表皮生长因子受体2(ErbB-2/HER2)、表皮 生长因子受体(EGFR)、HER2或其组合。在一些实施方案中，配体是适体。在一些实施方案中，配体是EGFR靶向适体。在一些实施方案中，适体结合至EGFR、PDGFR、叶酸受体或其组合。在一些实施方案中，适体具有序列5’-G CCU UAG UAA CGU GCU UUG AUG UCG AUU CGA CAG GAG GC-3’(SEQ ID NO：10)。在一些实施方案中，靶向模块是叶酸(folate)。叶酸的非限制性实例是氧化型叶酸(folic acid)、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸，二氢叶酸、四氢 叶酸或其他叶酸化合物。 [0012] 在一些实施方案中，本发明公开的主题提供生物活性剂是治疗剂。在一些实施方案中，生物活性剂是药物、荧光染料或化学品、或其组合。在一些实施方案中，生物活性剂是siRNA、miRNA、抗miRNA、核酶RNA、反义RNA。在一些实施方案中，生物活性剂针对乳腺癌标记物。在一些实施方案中，生物活性剂是siRNA序列或微RNA序列。在一些实施方案中，siRNA结合至癌基因的mRNA分子。非限制性癌基因包括RAS、cMET、HER2、MDM2、PIK3CA、AKT、CDK4或其组合。 [0013] 在一些实施方案中，生物活性剂是miRNA的抗miRNA分子，其干扰miRNA以复原癌症生长。miRNA的非限制性实例包括miR-9、miR-10b、miR-21、miR-17和miR-26。在一些实施方案中，RNA纳米结构分子引入肿瘤抑制性miRNA以拯救下调的肿瘤抑制性miRNA。miRNA的非 限制性实例包括let-7a、miR-10b、miR-25、miR-34a、miR-124、miR-145和miR-181b。在一些实施方案中，微RNA序列是抗miR-21序列。 [0014] 在一些实施方案中，miRNA序列的非限制性实例包含5’-GATAAGCT-3’(SEQ ID NO：11)、5’-AGCACTTT-3’或5’-ATTTGCAC-3’。在一些实施方案中，miRNA是LNA miRNA序列。LNA miRNA序列的非限制性实例是5’-G+A+T+A+A+G+C+T-3’、5’-+A+G+C+A+C+T+T+T-3’或5’-+A+T+T+T+G+C+A+C-3’。在一些实施方案中，RNA纳米结构抑制乳腺癌细胞增殖。 [0015] 在一些实施方案中还提供了包含治疗有效量的如以上和本文所公开的RNA纳米结构分子的核酸组合物。在一些实施方案中，该组合物还包括药学上可接受的载体。 [0016] 另外，在一些实施方案中，本发明公开的主题提供了纳米颗粒递送系统，其包含如上和本文公开的DNA纳米结构分子。在一些实施方案中，纳米颗粒递送系统进一步包括药学 上可接受的载体。 [0017] 在一些实施方案中，本发明公开的主题还提供了治疗患有或处于发展成乳腺癌风险的受试者的脑肿瘤的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的包含如上文和本文 公开的RNA纳米结构分子的组合物。在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载 体。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物或非哺乳脊椎动物。在一些实施方案中，受试者 是人。在一些实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。 附图说明 [0018] 本发明公开主题的特征在所附权利要求中具体阐述。将通过参考以下详细描述来获得对本公开主题的特征和优点的更好理解，所述详细描述阐述其中使用主题的原理的说 明性实施例及其附图。附图最初以彩色出版，通过引证整体并入本文(Dan Shu等人，(2015) ACS Nano，第9卷，第10期，9731-9740)。本申请的黑白图形对应于公布的彩色图形。 [0019] 图1A-1E是说明用于pRNA-3WJ纳米颗粒构建的系统的表征和引入的图形和图表。图1A是说明phi29 pRNA-3WJ芯的序列的图。图1B是显示使用3WJ作为支架臂延伸的RNA纳米 颗粒的3D模型图。图1C是显示图1B中的纳米颗粒的原子力显微镜(AFM)图像的图像。图1D是 显示通过动态光散射(DLS)测定的3WJ芯的尺寸的图。图1E是示出3WJ芯的ζ电位的图。 [0020] 图2A-2F显示3WJ-EGFRapt/抗miR-21纳米颗粒的设计和物理化学表征。图2A是显示具有三个功能模块的纳米颗粒的2D序列图：用于靶向递送的EGFR RNA适体、用于治疗的 抗miR-21 LNA和用于成像的Alexa-647染料。图2B是显示RNA纳米颗粒的逐步高效组装的天 然PAGE的图。图2C是示出显示流体动力学尺寸的DLS测量图。图2D是显示ζ电位的图。图2E是显示血清稳定性测定的图。图2F是显示从温度梯度凝胶电泳(DGGE，插入物)提取的表观Tm 的图。 [0021] 图3A-3E包括显示3WJ-EGFRapt/抗miR-21纳米颗粒在体外靶向和治疗效果评价的图和图像。图3A是显示有效结合并内化到MDA-MB-231细胞中的共焦图像。绿色：细胞质；蓝 色：细胞核和红色：RNA纳米颗粒。图3B是显示与MDA-MB-231细胞结合的流式细胞术测定图。 图3C是说明证明抗miR-21 LNA体外递送到MDA-MB-231细胞中的双荧光素酶测定的图。图3D 是显示qRT-PCR测定的图，其描述了miR-21敲低对治疗后PTEN和PDCD4的靶基因表达水平的 影响。RQ：相对定量。图3E是显示处理后MDA-MB-231细胞的细胞凋亡效应的半胱天冬酶 (caspase)-3测定图。 [0022] 图4A-4F是显示使用正交各向异性TNBC小鼠模型评价3WJ-EGFRapt/抗miR-21纳米颗粒的靶向和治疗效果的图和图表。图4A是显示在5次注射过程中肿瘤抑制的图像。终点荧 光指示肿瘤体积。图4B是显示5次注射过程中的肿瘤生长的曲线图。(*P<0.05，**P<0.01，误差条指示SEM)。图4C包括显示注射后8小时TNBC肿瘤中的特异性靶向和保留的荧光图像。图 4D包括显示通过显示结合和内化的荧光共聚焦显微镜的乳腺肿瘤冷冻切片(10μm厚)的组 织学测定的图像。蓝色：细胞核；红色：RNA纳米颗粒。图4E包括显示mRNA水平的实时PCR图，并且图4F包括显示在治疗后miR-21下调的蛋白质水平的western印迹的图，导致两个靶基 因PTEN和PDCD4的上调。Lamin A/C是内部对照。RQ：相对定量。图4G包括显示免疫组织化学 测定的图像，其显示了治疗后肿瘤细胞生长的抑制，使用Ki67作为肿瘤细胞增殖的指示剂， 以及半胱天冬酶-3作为肿瘤细胞凋亡的指示剂。 具体实施方式[0023] 在本文档中阐述了本发明公开的主题的一个或多个实施例的细节。在研究了本文献中提供的信息之后，本文档中描述的实施例以及其他实施例的修改对于本领域普通技术 人员将是显而易见的。本文件中提供的信息，特别是所描述的示例性实施例的具体细节，主 要是为了清楚理解而提供，并且不应从中理解不必要的限制。在某些情况下，本文公开的核 苷酸和多肽包括在公众可获得的数据库中，例如 和SWISSPROT。包括与这些 公开可用的数据库中的这些核苷酸和多肽相关的序列和其他信息明确地通过引证并入本 文。除非另有说明或显而易见，否则对这种公开可用的数据库的引证是指在本申请的提交 日期的数据库的最新版本。 [0024] 虽然本文使用的术语被认为便于本领域普通技术人员理解，定义以便于解释本发明公开的主题。 [0025] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与目前所公开的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在实践中或最近公开的主题测试中可 以使用与本文所述的那些类似或等同的任何方法、装置和材料，但现在还是要描述代表性 的方法、装置、和材料。 [0026] 根据长期专利法惯例，当在本申请(包括权利要求)中使用时，术语“一个”、“一种”和“该”是指“一个或多个”。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞，等等。 [0027] 除非另有说明，在说明书和权利要求书中使用的表示成分、性质例如反应条件等的量的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则本说明书和权利要求书中阐述的数值参数是近似值，其可以根据本发明所公开的主题所获得 的期望性质而变化。 [0028] 如本文所使用的，术语“约”当指质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的值或量时，意味着包括在一些实施方案中从特定值±20％的变化，在一些实施方案中±10％，在一些实施方案中为±5％，在一些实施方案中为±1％，在一些实施方案中为±0.5％，和在一 些实施方案中为±0.1％，因为这些变化适于执行所公开的方法。如本文所使用的，范围可 以表示为从“约”一个特定值，和/或至“约”另一个特定值。还应理解，存在本文公开的多个值，并且除了值本身之外，每个值还在本文中被公开为“约”该特定值。例如，如果公开值 “10”，则还公开“约10”。还应当理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。 [0029] 本发明公开的主题涉及人工RNA纳米结构分子。该分子包括包含至少一个RNA寡核苷酸的多分支RNA连接基序以及与RNA连接基序偶联的乳腺癌靶向模块。在一些实施方案 中，所述分子还包括与RNA连接基序偶联的至少一种生物活性剂。在一些实施方案中，RNA寡 核苷酸的长度为至少6个核苷酸。在一些实施方案中，生物活性剂是治疗剂。在一些实施方 案中，RNA寡核苷酸包括在2’位置的至少一个化学修饰。化学修饰的非限制性实例包括2’- 氟、2’-胺基和2’-O-甲基。 [0030] 术语“RNA”是指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖部分的2’位置具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、具有双链和单链区域的RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA、以及改变的RNA或模拟RNA，其通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变而与天然存在的RNA不同。这种改变可以包括添加非核苷酸材料，例如到siRNA的末端或内部，例如在 RNA的一个或多个核苷酸。本发明公开主题的RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷 酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以称为 类似物或天然存在的RNA的类似物。 [0031] 如本文所述，RNA纳米技术是指通过自下而上自组装构建的纳米级RNA架构的设计、制造和应用，其主要框架主要由RNA(14,17-29)组成。由于最近发现其高热力学稳定性，有利和独特的体内属性(US 2014/0179758，通过引证整体并入本文)，RNA纳米技术最近已 经作为重要领域出现。在本公开的一些实施方案中，如US 2014/0179758中所公开的，RNA分 子形成二聚体、三聚体、六聚体和图案化的超结构。这不同于通常用于递送抗miRNA(30)例 如脂质(31-33)、聚合物(34、35)和无机纳米材料(36)的常规纳米材料。对于基于RNA纳米技 术的颗粒、支架、靶向配体、治疗部分和调节物都可以由RNA核苷酸组成。另一个重要的区别是RNA纳米技术着重于RNA间相互作用(分子间)和四级(4D)结构，而关于RNA结构和功能的 经典研究着重于RNA内相互作用(在分子内)和二级(2D)/三级(3D)结构。多年来，几个挑战 阻止了RNA作为构建材料的广泛使用，例如对RNA酶降解的敏感性；全身注射后对解离的敏 感性；和毒性和不良免疫应答。这些挑战已经在很大程度上被克服：核糖的-OH基团上的2’-氟(2’-F)或2’-O-甲基(2’-OMe)修饰可以使RNA在血清(37)中是化学稳定的；某些天然存在的连接基序是热力学稳定的并且可以保持整个RNA纳米颗粒在超低浓度下完整(38-40)；最 后，RNA纳米颗粒的免疫原性是序列和形状依赖性的，并且是可调的以使RNA纳米颗粒刺激 炎症细胞因子的产生(41)，或使RNA纳米颗粒非免疫原性和无毒，甚至在重复静脉内施用 30mg/kg(42)。还预期RNA纳米技术将在外来体RNA用于治疗中起关键作用(43-47)。 [0032] 如本文所公开的，可以通过形状、大小和化学计量的精确控制来制造RNA纳米颗粒，如通过噬菌体phi29DNA包装马达的包装RNA(pRNA)所证明，其通过互锁环 (interlocking loop)的手牵手相互作用形成二聚体、三聚体和六聚体。在一些实施方案 中，三分支RNA连接基序的分支包括a3WJ RNA模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)或c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。在一些实施方案中，三分支RNA连接基序包含a3WJ RNA模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)、和c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1包含核苷酸序列5’-UUG CCA UGU GUA UGU GGG-3’。在一些实施方案中，SEQ ID NO：2包括核苷酸序列5’-CCC ACA UAC UUU GUU GAUCC-3’。在一些实施方案中，SEQ ID NO：3包含核苷酸序列5’-GGA UCA AUC AUG GCA A-3’。 [0033] 在一些实施方案中，多分支RNA连接基序是三分支RNA连接基序。在一些实施方案中，多分支RNA包含序列5’-UUG CCA UGU GUA UGU GGG AUC CCG CGG CCA UGG CGG CCG GGA G-3’(SEQ ID NO：5)。在一些实施方案中，多分支RNA包含序列5’-CCC ACA UAC UUU GUU GAU CCG CCU UAG UAA CGU GCU UUG AUG UCG AAU CGA CAG CAG GC-3’(SEQ ID NO： 6)。在一些实施方案中，多分支RNA包含序列5’-GATAAGCT CTC CCG GCC GCC ATG GCC GCG GGA T-3’(SEQ ID NO：7)。在一些实施方案中，多分支RNA包含序列5’-CTC CCG GCC GCC ATG GCC GCG GGA T-3’(SEQ ID NO：8)。在一些实施方案中，多分支RNA包含序列5’-AUC CCG CGG CCA UGG CGG CCG GGA G-3’(SEQ ID NO：9)。 [0034] 在一些实施方案中，分子的直径为至少约40nm或更小。直径为至少约35nm或更小，至少约30nm或更小，至少约25nm或更小，至少20nm或更小，至少15nm或更小，至少10nm或更 小，至少5nm以下。 [0035] 在一些实施方案中，分子具有约-150mV至约150mV范围的ζ电位。RNA分子具有范围为约-140mV至约140mV，约-130mV至约130mV，约-120mV至约120mV，约-110mV至约110mV的ζ 电位。在一些实施方案中，分子具有约-100mV至约100mV范围的ζ电位。RNA分子具有约-95mV至约95mV，约-90mV至约90mV，约-85mV至约85mV，约-80mV至约80mV，约-75mV至约75mV，约- 70至约70mV，约-65mV至约65mV，约-60mV至约60mV，约-55mV至约55mV，约-50mV至约50mV的ζ电位。该分子具有约-45mV至约45mV，约-40mV至约40mV，约-35mV至约35mV，约-35mV至约 30mV，约-35mV至约20mV，约-25mV至约15mV的ζ电位。 [0036] 在一些实施方案中，RNA纳米结构分子在约2至约13的pH范围内基本上稳定。RNA分子在pH约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13时基本上稳定。如本文所用，术语“基本上稳定的”可以指物理和/或化学稳定性。本领域普通技术人员将认识到，术语“基本上稳定”可以指相对于初始组合物(即，当最初制备组合物的特定批次时)在某些条件下组合物的稳定 性。在这方面，如本领域普通技术人员将认识到的，可以确定组合物的具体实施方案的稳定 性的一种方式如下：制备一批该组合物的实施方案，进行组合物样品(对照样品)的初始评 估，使组合物样品经受感兴趣的条件(例如，在特定条件下储存特定时间段)(测试样品)，对 测试样品进行评估，并将对照样品的评估与测试样品的评估进行比较。可以进行计算以确 定测试样品中存在的量是否为100％±20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、 12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的对照样品中的量。 [0037] 在一些实施方案中，乳腺癌靶向模块包括结合至至少一种乳腺癌细胞表面标记物的配体。在一些实施方案中，配体结合至叶酸受体、表皮生长因子受体2(ErbB-2/HER2)、表 皮生长因子受体(EGFR)、HER2或其组合。在一些实施方案中，配体是适体。如本文所用的术 语“适体”是指可以以高亲和力特异性结合至其靶标的寡核苷酸。在一些实施方案中，配体 是EGFR靶向适体。在一些实施方案中，适体具有序列5’-G CCU UAG UAA CGU GCU UUG AUG UCG AUU CGA CAG GAG GC-3’(SEQ ID NO：10)。在一些实施方案中，靶向模块是叶酸。 [0038] 本文所用的术语“叶酸”可以包括定义的B-维生素化合物类，包括但不限于5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、氧化型叶酸和其它叶酸化合物。由于叶酸是在高度增殖的细胞中DNA复制和甲基化期间所需的必需成分，许多癌细胞，例如脑、卵 巢、肺、乳腺、肾、子宫内膜、结肠和骨髓的那些，过表达FR以增加叶酸吸收。 [0039] 在一些实施方案中，本发明公开的主题提供生物活性剂是治疗剂。在一些实施方案中，生物活性剂是药物、荧光染料或化学品、或其组合。在一些实施方案中，生物活性剂包括成像模块。成像模块的非限制性实例是荧光染料，包括非限制性实例Alexa 647。在一些 实施方案中，生物活性剂是siRNA、miRNA、抗miRNA、核酶RNA、反义RNA。在一些实施方案中，生物活性剂针对乳腺癌标记物。在一些实施方案中，生物活性剂是siRNA序列或微RNA序列。 在一些实施方案中，微RNA序列是抗miR-21序列。在一些实施方案中，抗miR-21序列包含5’-GATAAGCT-3’(SEQ ID NO：11)。在一些实施方案中，RNA纳米结构抑制乳腺癌细胞增殖。 [0040] 术语“小干扰RNA”、“短干扰RNA”、“小发夹RNA”、“siRNA”和shRNA可互换使用，是指能够介导RNA干扰(RNAi)或基因沉默的任何核酸分子。参见例如，Bass，Nature 411：428-429,2001；Elbashir等，Nature 411：494-498,2001a；和PCT国际公开号WO 00/44895、WO 01/36646、WO 99/32619、WO 00/01846、WO 01/29058、WO 99/07409和WO 00/44914。在一个实施方案中，siRNA包括包含互补的有义和反义区的双链多核苷酸分子，其中反义区包含与 靶核酸分子(例如，编码BRCAA1的核酸分子)的区域互补的序列。在另一个实施方案中， siRNA包括具有自互补的有义和反义区的单链多核苷酸，其中反义区包含与靶核酸分子的 区域互补的序列。在另一个实施方案中，siRNA包括具有一个或多个环结构的单链多核苷酸 和包含自互补有义和反义区的茎，其中该反义区包含与靶核酸分子的区域互补的序列，并 且其中多核苷酸可以在体内或体外加工以产生能够介导RNAi的活性siRNA。如本文所使用 的，siRNA分子不需要限于仅含有RNA的那些分子，而是还包括化学修饰的核苷酸和非核苷 酸。 [0041] 在一些实施方案中，本发明公开的主题利用短的双链RNA分子引起细胞基因下调的能力，称为RNA干扰过程。如本文所用，“RNA干扰”(RNAi)是指由小干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。参见Fire等人，Nature 391:806-811，1998和美国专利 号6,506,559，其各自通过引证整体并入本文。转录后基因沉默的过程被认为是进化上保守 的细胞防御机制，其已经进化以防止外源基因的表达(Fire，Trends Genet 15:358-363， 1999)。 [0042] 在一些实施方案中，如本文所用的术语“微RNA(miRNA)”是长度为至少约6个核苷酸的单链或双链非编码RNA，其可通过降解其靶标mRNA或抑制他们的翻译(1,2)来调节转录 后水平的基因表达。miRNA在调节细胞周期、增殖、分化、代谢和凋亡中起重要作用。微RNA和各个微RNA结合序列的纲要可在miRNA登记处获得。(参见例如Griffiths-Jones等(2006) Nucl.Acids Res.34：D140-D144；US20140045709，通过引证以其整体并入本文)。在具体实 施方案中，本测定中使用的微RNA和微RNA结合序列与疾病或病症相关，其中微RNA的拮抗剂 或激动剂可用于预防或治疗疾病或病症。miRNA的失调已牵涉在几种癌症类型中的肿瘤起 始、进展和转移中(3-8)。miRNA具有巨大的癌症治疗潜力，特别是因为一个miRNA可以有效 和同时调节广泛的靶基因，因此可以解决癌症的异质性。天然存在的miRNA进一步显示降低 的免疫应答和低毒性。已经开发了用于敲低致癌miRNA的抗miRNA和用于上调内源miRNA的 miRNA的模拟物，作为实现肿瘤消退的治疗策略(6、9和10)。然而，主要的限制因素是将这些治疗模块特异性递送至受影响的细胞和组织的能力。纳米技术在这方面具有很大的前景， 并且已经研究了几种纳米平台，但是仍然缺乏抑制肿瘤进展的有效策略(11)。从制剂和递 送角度的主要挑战包括颗粒异质性、颗粒聚集、颗粒解离、不利的药代动力学(PK)和药效学 (PD)分布、不良毒性和免疫原性，以及克服肿瘤周围的生物屏障的困难(11、12)。此外，不稳定的热力学性质和缺乏控制释放机制已经减缓了他们的临床翻译(13)。希望受控的“活性” 靶向有效阻断癌症进展和预防转移，同时使不良副作用最小化(13)。肝脏和其他器官蓄积 导致低癌靶向和高副作用或毒性。在本公开中，使用RNA纳米技术方法来克服癌症纳米技术 中的一些上述挑战并递送抗miRNA以抑制肿瘤生长，使用三阴性乳腺癌(TNBC)作为模型系 统。到目前为止，没有可用于TNBC的靶向治疗，TNBC是由缺乏雌激素受体、孕酮受体和人表 皮生长因子受体2表达所限定的侵袭性乳腺癌亚型(15)。TNBC患者对化疗反应较差，并且易 于复发和早期转移性扩散，这导致不良预后和短期存活(16)。 [0043] 在一些实施方案中，本公开提供了miRNA(例如，抗miR-21)的抑制剂。本文还公开了包含此类抑制剂的组合物和使用此类抑制剂抑制miR-21的方法。任何miRNA抑制剂可以 单独使用，或与本领域已知的其他miRNA抑制剂一起使用。在一些实施方案中，miRNA抑制剂 包含反义分子。在一些实施方案中，反义分子可以是单链或双链序列。反义分子的实例包括 但不限于siRNA、三螺旋形成剂、核酶、RNAi、合成肽核酸(PNA)、抗原(agRNA)、LNA/DNA共聚物、小分子化合物和反义寡核苷酸。 [0044] 在一些实施方案中，微RNA序列的长度为至少6个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA分子或其等价物或其模拟物的长度为约3至约30个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA 长度为约12至约30个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA长度为约15至约28个核苷酸。在一 些实施方案中，miRNA长度为约19至约25个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA分子具有至少 约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和约30个核苷酸或更多。在一些实施方案中，miRNA分子的拮抗剂长度为约6至约30个核苷酸， 长度为约10至约30个核苷酸，长度为约12至约28个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA分子 的拮抗剂具有至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多的长度。 [0045] 在一些实施方案中，miRNA干扰致癌miRNA以复原癌生长。RNA纳米结构分子含有沉默致癌miRNA(包括但不限于miR-9、miR-10b、miR-21、miR-17和miR-26)的抗miRNA。在一些 实施方案中，miRNA拯救下调的癌抑制性miRNA，其中RNA纳米结构引入癌抑制性miRNA，包括 但不限于let-7a、miR-10b、miR-25、miR-34a、miR-124、miR-145和miR-181b。其它实例公开于US20140045709中，其通过引证以其整体并入本文。示例性miRNA序列如下所列： [0046] miR-9：5’-UCUUUGGUUA UCUAGCUGUA UG-3’ [0047] miR-10b：5’-UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG-3’ [0048] miR-26a：5’-UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3’ [0049] let-7a：5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’ [0050] miR-25：5’-AGGCGGAGACUUGGGCAAUUG-3’ [0051] miR-34a：5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’ [0052] miR-124：5’-CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU-3’ [0053] miR-145：5’-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3’ [0054] miR-181b：5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU-3’ [0055] 在一些实施方案中，微RNA包括锁定核酸(LNA)序列。在一些实施方案中，微RNA是LNA-抗miR21序列5’-+G+A+T+A+A+G+C+T CTC CCG GCC GCC ATG GCC GCG GGA T-3’(SEQ ID NO：7)(下划线序列是8-聚体抗miR21 LNA，并且“+”表示LNA序列)。在一些实施方案中，RNA纳米结构含有链LNA17_sph1：5’-+A+G+C+A+C+T+T+TCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGAT-3’ (“+””表示LNA序列)。在另一个实施方案中，RNA纳米结构含有LNA19a_sph 1：5’-+A+T+T+T+G+C+A+CCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGAT-3’链(“+”表示LNA序列)。 [0056] 本文使用的短语“乳腺癌标记物”是指乳腺癌中的一些或全部细胞所特有的基因或基因产物(例如，RNA分子或蛋白质)。具有诊断价值的乳腺癌标记物可以是在正常非癌细 胞中表达的基因或基因产物，但是其特征在于癌症的类型或分类，例如其在正常非癌细胞 中的表达相比，其过表达或低表达。具有预后价值的乳腺肿瘤标记物是基因或基因产物，其 中过表达或低表达赋予关于癌症的未来侵袭性和/或其在诊断时对治疗的反应的预测信 息。在癌症样品中，诊断和预后癌症标记物的表达模式允许分别准确地识别和确定疾病的 未来病程。乳腺癌生物标记物的非限制性实例描述于WO2010017515(通过引证整体并入本 文)中。 [0057] 在本公开的另一方面，在一些实施方案中，是核酸组合物，其包括治疗有效量的上述和本文公开的RNA纳米结构分子。在一些实施方案中，该组合物还包括药学上可接受的载 体。 [0058] 此外，在一些实施方案中，本发明公开的主题提供了纳米颗粒递送系统，其包含如上文和本文公开的DNA纳米结构分子。在一些实施方案中，纳米颗粒递送系统进一步包括药 学上可接受的载体。 [0059] 本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指与本发明的异二聚体探针一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体并且由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典中或其 它公认的药典列出用于动物、更特别是用于人类。这样的药物载体可以是液体，例如水和 油，包括石油、动物、植物(vegetable，蔬菜)或合成来源，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药物载体可以是盐水、阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。 当给予患者时，异二聚体探针和药学上可接受的载体可以是无菌的。当静脉内施用异二聚 体探针时，水是有用的载体。盐溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别 是用于可注射溶液。合适的药物载体还包括赋形剂，例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。所需的本发明组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。本发明的组合物可有利地采取溶液、乳液、持续释放制剂形式或适合使用 的任何其它形式。 [0060] 在一些实施方案中，本发明公开的主题还提供了治疗患有或处于发展成乳腺癌风险的受试者的脑肿瘤的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的包含如上文和本文 公开的RNA纳米结构分子的组合物。在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载 体。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物或非哺乳脊椎动物。在一些实施方案中，受试者 是人。 [0061] 乳腺癌是最常见的癌症之一，通常被认为是妇女癌症死亡的第二个原因。乳腺癌亚型在免疫组织化学基础上分类，例如正常、管腔A、管腔B、HER2+/ER-、三阴性、未分类。(US 20120214864，通过引证整体并入本文)。在三阴性乳腺癌细胞的情况下，癌症的生长不是由 雌激素或孕酮或由来自HER2蛋白的生长信号驱动。在一些实施方案中，乳腺癌是三阴性乳 腺癌。 [0062] 本文所用的术语“治疗有效量”是指对已经患有疾病、病症或障碍的患者施用的组合物的量，其足以治愈或至少部分阻止或在一定程度上缓解一种或更多种被治疗的疾病、 障碍或病症的症状。这些组合物的有效性取决于包括但不限于以下条件：疾病、障碍或病症 的严重性和病程、以前的治疗、患者的健康状况和对药物的反应，以及治疗医师的判断。仅 作为实例，治疗有效量可通过常规实验确定，包括但不限于剂量递增临床试验。 [0063] 任何特定患者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的障碍和障碍的严重程度；所使用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间；给药途径；所使用的具体化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所使用的具体化 合物组合或同时使用的药物以及医学领域中熟知的类似因素。例如，本领域技术人员熟知 的是，以低于实现所需治疗效果所需的水平开始化合物的剂量，并逐渐增加剂量，直至达到 所需的效果。如果需要，为了给药的目的，有效日剂量可以分成多个剂量。因此，单剂量组合物可含有这样的量或其约数以构成每日剂量。在任何禁忌症的情况下，剂量可以由个体医 生调整。剂量可以变化，并且可以每天一次或多次剂量施用，施用一天或几天。可以在文献 中找到针对给定类别的药物产品的适当剂量的指导。在另外的各个方面，制剂可以以“预防 有效量”施用；即，有效预防疾病或病症的量。 [0064] 根据本公开的方法向受试者施用有效量的组合物的合适方法包括但不限于全身施用、肠胃外施用(包括血管内、肌内、动脉内施用)、口服递送、口腔递送、皮下施用、吸入、气管内安装、手术植入、透皮递送、局部注射和超速注射/轰击。在适用的情况下，连续输注可增强靶位点处的药物积累(参见例如美国专利号6,180,082)。 [0065] 如本文所用，术语“受试者”是指药物组合物的给药靶标。本文公开的方法的主题可以是脊椎动物，例如哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。因此，本文公开的方法的主题可以是人或非人。因此，根据本发明公开的主题提供兽医治疗用途。因此，本发明公开的 主题提供对哺乳动物如人和非人灵长类动物以及由于濒危而重要的哺乳动物如西伯利亚 虎的施用；具有经济重要性，例如在农场饲养以供人类消费的动物；和/或对人类具有社会 重要性的动物，例如保持为宠物或动物园中的动物。这样的动物的实例包括但不限于：食肉 动物如猫和狗；猪类，包括乳猪(pig)、阉猪(hog)和野公猪(boar)；反刍动物和/或有蹄动物如牛(cattle)、公牛(oxem)、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼；兔，豚鼠和啮齿动物。还提供了鸟类的治疗，包括治疗那些种类的濒危和/或保存在动物园中的鸟类以及家禽，更特别 是驯养的家禽，即家禽，例如火鸡、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡等，因为它们对人类也具有经济重要性。因此，还提供了家畜的治疗，包括但不限于驯养的猪、反刍动物、有蹄类动物、马(包括赛马)、家禽等。该术语不表示特定的年龄或性别。 [0066] 在一些实施方案中，本公开提供了在患有或处于患乳腺癌的风险中的受试者中治疗乳腺癌的方法。所述组合物包括向受试者施用治疗有效量的包含RNA纳米结构分子的组 合物。RNA纳米结构包括多分支RNA连接基序、与RNA连接基序偶联的乳腺癌靶向模块。在一 些实施方案中，RNA分子还包括与RNA连接基序缀合的乳腺癌治疗剂。在一些实施方案中，组 合物还包括药学上可接受的载体。如上和贯穿本公开进一步讨论了RNA纳米结构分子，并在 下文进一步提供。 [0067] 在该方法的一些实施方案中，生物活性剂是治疗剂。RNA寡核苷酸在2’位置包括至少一个化学修饰。化学修饰的非限制性实例包括2’氟、2’胺基和2’O-甲基。在一些实施方案中，多分支RNA连接基序是三分支RNA连接基序。在该方法的一些实施方案中，RNA分子形成 二聚体、三聚体、六聚体和图案化的超结构。示例性多分支RNA序列包括5’-UUG CCA UGU GUA UGU GGG AUC CCG CGG CCA UGG CGG CCG GGA G-3’(SEQ ID NO：5)，5’-CCC ACA UAC UUU GUU GAU CCG CCU UAG UAA CGU GCU UUG AUG UCG AUU CGA CAG GAG GC-3’(SEQ ID NO：6)，5’-GATAAGCT CTC CCG GCC GCC ATG GCC GCG GGA T-3’(SEQ ID NO：7)，5’-CTC CCG GCC GCC ATG GCC GCG GGA T-3’(SEQ ID NO：8)和5’-AUC CCG CGG CCA UGG CGG CCG GGA G-3’(SEQ ID NO：9)。在一些实施方案中，分子的直径为至少约40nm或更小，该分子具有约-100mV至约100mV的ζ电位，并且在约2至约13的pH下基本稳定。在一些实施方案中，三 分支RNA连接基序的分支包括a3WJ RNA模块(SEQ ID NO：1)，b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2) 或c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。在一个实施方案中，三分支RNA连接基序包含a3WJ RNA模 块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)和c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。 [0068] 在该方法的一些实施方案中，乳腺癌靶向模块包括结合至至少一种乳腺癌细胞表面标记物的配体。在一些实施方案中，配体结合至叶酸受体、表皮生长因子受体2(ErbB2/ HER2)、表皮生长因子受体(EGFR)、HER2或其组合。在一些实施方案中，配体是适体。在一些实施方案中，适体结合至EGFR、PDGFR、叶酸受体或其组合。在一些实施方案中，适体具有序列5’-G CCU UAG UAA CGU GCU UUG AUG UCG AUU CGA CAG GAG GC-3’(SEQ ID NO：10)。在一些实施方案中，靶向模块是叶酸。叶酸的非限制性实例是氧化型叶酸、5-甲基四氢叶酸、 5-甲酰基四氢叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸或其他叶酸化合物。 [0069] 在一些实施方案中，乳腺癌靶向模块偶联至RNA纳米颗粒。靶向模块将纳米颗粒导向乳腺癌细胞，以增强与它们的结合，以增强内化，增强对细胞酶、DNA、RNA、蛋白质、脂质或碳水化合物的靶向。乳腺癌靶向模块的非限制性实例是抗体、抗体片段、多肽、细胞配体、适体、DNA、RNA、药物、增强靶向乳腺癌细胞的化合物、以及增强与乳腺癌细胞结合的其它基团或材料。 [0070] 在该方法的一些实施方案中，本发明公开的主题提供生物活性剂是治疗剂。在一些实施方案中，生物活性剂是药物、荧光染料或化学品，或其组合。在一些实施方案中，生物活性剂是siRNA、miRNA、抗miRNA、核酶RNA、反义RNA。在一些实施方案中，生物活性剂针对乳腺癌标记物。在一些实施方案中，生物活性剂是siRNA序列或微RNA序列。在一些实施方案 中，siRNA结合癌基因的mRNA分子。非限制性癌基因包括RAS、cMET、HER2、MDM2、PIK3CA、AKT、CDK4或其组合。 [0071] 在该方法的另外的实施方案中，生物活性剂是miRNA的抗miRNA分子以干扰miRNA复原癌症生长。miRNA的非限制性实例包括miR-9、miR-10b、miR-21、miR-17和miR-26。在一些实施方案中，RNA纳米结构分子引入肿瘤抑制性miRNA以拯救下调的肿瘤抑制性miRNA。 miRNA的非限制性实例包括let-7a、miR-10b、miR-25、miR-34a、miR-124、miR-145和miR- 181b。在该方法的一个实施方案中，微RNA序列是抗miR-21序列。在一些实施方案中，miRNA 序列的非限制性实例包括5’-GATAAGCT-3’、5’-AGCACTTT-3’或5’-ATTTGCAC-3’。在一些实施方案中，miRNA是LNA miRNA序列。LNA miRNA序列的非限制性实例是5’+G+A+T+A+A+G+C+ T-3’、5’-+A+G+C+A+C+T+T+T-3’或5’-+A+T+T+T+G+C+A+C-3’。在一些实施方案中，RNA纳米结构抑制乳腺癌细胞增殖。 [0072] 在一个实施方案中，使用衍生自噬菌体phi29包装RNA(pRNA)的三向结(3WJ)基序(图1)作为含有(a)RNA适体作为靶向配体的支架构建多功能RNA纳米颗粒；(b)治疗性抗 miRNA；和(c)荧光成像模块-Alexa 647。为了将治疗性抗miRNA精确地引导和内化到TNBC细 胞，使用表皮生长因子受体(EGFR)靶向RNA适体。EGFR在原发性TNBC肿瘤和转移性TNBC细胞 中高度扩增(>97％)(52，53)。作为治疗靶标，本公开着重于致癌miR-21，其在包括TNBC在内的实体癌症的变体中在整个肿瘤起始、进展、侵袭和转移中维持(54-58)。在裸鼠中建立原 位TNBC肿瘤，然后全身施用多功能RNA纳米颗粒以确定其靶向和治疗效果。 [0073] 本发明公开的主题通过以下具体但非限制性的实施例进一步说明。以下实施例可以包括代表在与本公开相关的开发和实验过程中的各个时间收集数据的汇编。 [0074] 实施例 [0075] 这项研究提供微RNA在调节癌细胞的基因表达和生命周期中发挥重要作用。特别地，miR-21(致癌miRNA)是参与多种癌症(包括三阴性乳腺癌(TNBC))中的肿瘤起始、进展、 侵袭和转移的主要参与者。然而，治疗性miRNA或抗miRNA在体内特异性地递送到癌细胞中， 没有对健康细胞的附带损伤仍然具有挑战性。本文报告了RNA纳米技术的特异性和有效的 递送抗miR-21阻断TNBC在原位小鼠模型中的生长的应用。15-nm治疗性RNA纳米颗粒包含作 为芯的58个核苷酸(nt)phi29pRNA-3WJ、与miR-21的种子区域互补的8-nt序列和39-nt抗表 皮生长因子受体(EGFR)适体，用于通过受体介导的内吞作用将RNA纳米颗粒内化到癌细胞 中。抗RNA酶和热力学稳定的RNA纳米颗粒在全身注射至小鼠后保持完整，并且注射后8小时 强烈结合至肿瘤，而健康器官中具有很少或没有积累，并且随后以低剂量抑制肿瘤生长。所 观察到的特异性癌症靶向和肿瘤消退是RNA纳米颗粒的几个关键属性的结果：不允许非特 异性通过带负电荷的细胞膜的阴离子电荷；使用增加RNA纳米颗粒归巢到癌细胞的RNA适体 的“活性”靶向；纳米尺寸和形状，其避免了肺巨噬细胞和肝库普弗细胞的快速肾清除和吞 噬；有利的生物分布曲线，在健康器官中几乎不积累，这使非特异性副作用最小化；和具有 延长的体内半衰期的有利的药代动力学曲线。结果证明基于RNA纳米技术的平台递送基于 miRNA的治疗剂用于癌症治疗的临床潜力。 [0076] 三功能pRNA-3WJ纳米颗粒的构建和表征 [0077] pRNA-3WJ纳米颗粒利用由三个短片段组成的模块化设计(图1A)。38当在PBS或TMS缓冲液中以相等的摩尔比混合各链时，复合物以高效率装配，如先前出版物中所示 。38,39,48,59pRNA-3WJ的每个分支可以具有功能模块，而不干扰芯支架的折叠和每个模块的功能，如通过显示均匀的三角形分支结构的原子力显微镜(AFM)图像所证明的(图1B-C)。在本 文中，pRNA-3WJ芯用作支架并构建了具有EGFR靶向RNA适体、治疗性抗miR-21和Alexa-647 作为成像模块的三功能RNA纳米颗粒3WJ-EGFRapt/抗miR-21(2A)。当四条链以化学计量比 混合时，RNA纳米颗粒以非常高的效率组装，如通过凝胶移位测定所示，其显示出复合物的 逐步组装(图2B)。 [0078] 动态光散射(DLS)测定显示3WJ-EGFRapt/抗miR-21纳米颗粒的平均流体动力学直径为14.8±2.6nm(图2C)，而pRNA-3WJ芯支架的平均流体动力学直径为4.2±1.1nm(图1D)。 注意到3WJ-EGFRapt/抗miR-21纳米颗粒在形状上不是球形的，并且预期与DLS测量有偏差， 因为报道的DLS大小对应于RNA纳米颗粒在溶液中的快速翻滚而导致的三维的平均值。 [0079] 确定颗粒表面电荷、ζ电位以评价溶液中RNA纳米颗粒的聚集倾向。RNA纳米颗粒确实是高度带负电荷的并且不在溶液中聚集，这反映在ζ电位测量中，其显示对于pRNA-3WJ芯 支架在-16.1±7.7mV处的单峰(图1E)和对于3WJ-EGFRapt/抗miR-21纳米颗粒在-17.0± 5.6mV下的单峰(图2D)。这种无聚集物理性质和阴离子性质对于体内递送应用特别有吸引 力，因为它使非特异性细胞进入和肺巨噬细胞和肝库普弗细胞的包埋最小化(11)。 [0080] 为了使3WJ-EGFRapt/抗miR-21纳米颗粒在体内化学上稳定，使用2’-F修饰的U和C核苷酸。将2’-F修饰的RNA纳米颗粒用50％胎牛血清(FBS)在37℃温育。在限定的时间点，收集样品并使用天然PAGE凝胶进行测定(图2E)。使用ImageJ软件定量完整RNA纳米颗粒的部 分，并绘图以确定约15小时的半衰期，其显著高于未修饰的RNA对应物的半衰期。38,602’-F核苷酸的存在不仅使RNA纳米颗粒抵抗RNA酶降解，而且还增强pRNA-3WJ的熔融温度，而不损 害芯和掺入模块的真实折叠和功能。37,38 [0081] 使2’-F修饰的3WJ-EGFRapt/抗miR-21纳米颗粒经受温度梯度凝胶电泳(TGGE)测定，通常用于测定由多个链组成的RNA纳米颗粒的热力学参数之一，表观熔融温度(Tm) 41,48,62,63 。 一条链用Alexa-647标记，用于测定随垂直于电流施加的温度梯度增加(从25℃→ 80℃)剩余的完整颗粒的分数(图2F，框内)。使用ImageJ软件定量组装的RNA的分数，并且用 非线性S拟合拟合熔融曲线以确定54±3℃的表观Tm(图2F)。结果表明，具有所有功能模块 的构建的RNA纳米颗粒是热稳定的，并且在体内超低浓度下保持结构完整。 [0082] 将pRNA-3WJ纳米颗粒结合并内化到TNBC细胞中 [0083] 将Alexa647标记的3WJ-EGFRapt/抗miR-21纳米颗粒用MDAMB-231细胞温育。然后将细胞用多聚甲醛固定，并用DAPI和Alexa 488鬼笔环肽分别对细胞核和细胞质染色。共聚 焦显微镜图像显示出通过EGFR介导的胞吞作用将pRNA-3WJ纳米颗粒非常有效地结合和内 化到癌细胞中，如通过荧光RNA纳米颗粒(图3A中的红色)和细胞质(图3A中的绿色)的优异 重叠所证明的。对于对照组(仅3WJ支架和3WJ-抗miR-21，无EGFR RNA适体)观察到非常低的 信号。使用荧光激活细胞分选(FACS)测定法进一步验证该结果(图3B)。将3WJ-EGFRapt/抗 miR-21纳米颗粒(和对照)用MDA-MB-231细胞温育、洗涤，然后通过FACS分析。与pRNA-3WJ支 架对照(16.3％结合)相比，对于具有RNA纳米颗粒的EGFR RNA适体，观察到强结合(76.7％) (图3B)。该结果表明，这些RNA纳米颗粒对TNBC细胞结合具有高特异性和亲和力。 [0084] 通过pRNA-3WJ纳米颗粒将抗miR-21递送至TNBC细胞 [0085] 接下来测试已知表达高水平miR-21的MDA-MB-231细胞中致癌miR-21的特异性敲低。作为抗miR-21试剂，使用与miR-21种子区域互补的8-聚体(5’-GATAAGCT-3’)锁定核酸 (LNA，构象限制性核苷酸类似物)。已经报道LNA以非常高的亲和力和特异性结合至其互补 miRNA，并且还对外切/内切核酸酶具有抗性。在结合到miRNA种子区域时，LNA将以剂量依赖 性方式触发miRNA抑制。 [0086] 为了测定miR-21抑制，开发了非常敏感的基于荧光素酶的miR-21报道系统。用报道质粒转染MDA-MB-231细胞，所述报道质粒在Renilla荧光素酶基因的3’-非翻译区(UTR) 区域含有miR-21靶向序列，并且共表达的萤火虫荧光素酶基因作为内部对照。在天然细胞 中，Renilla表达将被抑制，因为miR-21结合至其3’-UTR区域并阻止Renilla荧光素酶的翻 译。随着抗miRNA LNA被递送到癌细胞中，LNA序列将竞争性结合至用于结合Renilla荧光素 酶基因的3’-UTR区域的miR-21并阻断其翻译，从而导致Renilla荧光素酶的表达增加。结果 表明，如与不含EGFR适体的对照3WJ-抗miR-21纳米颗粒相比以剂量依赖性方式增加的 Renilla荧光素酶表达所指示(图3C)，3WJ-EGFR适体/抗miR-21在温育后有效地将抗miR- 21LNA序列递送到MDA-MB-231细胞中。通过用癌细胞温育的成功递送在基于RNAi的癌症治 疗学中是显著的进步，因为RNA治疗剂通常通过转染或微孔法递送。 [0087] miR-21的功能在其下游靶肿瘤抑制剂、PTEN和PDCD4基因上得到验证。55-57用MDA-MB-231细胞温育后，与不含EGFR适体的对照3WJ-抗miR-21相比，3WJ-EGFRapt/抗miR-21纳 米颗粒上调了通过qRT-PCR在mRNA水平测定的PTEN和PDCD4的表达(图3D)。 [0088] pRNA-3WJ纳米颗粒对TNBC细胞的生长和凋亡的影响 [0089] 半胱天冬酶-3(半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3)是一种早期细胞凋亡标记物，它的活化可用于评估细胞是否正在经历细胞凋亡。3WJ-EGFRapt/抗miR-21处理的MDA-MB- 231细胞裂解物显示与阳性对照喜树碱(CPT)相当的半胱天冬酶-3荧光底物(Ac-DEVD-AMC) 的最高荧光发射，并且与对照RNA(抗miR 21、3WJ-抗miR 21和3WJ-EGFRapt/Scramble)相 反。该结果表明3WJ-EGFRapt/抗miR-21纳米颗粒可激活半胱天冬酶-3途径并触发癌细胞凋 亡(图3E)。 [0090] 动物模型中通过RNA纳米颗粒的荧光成像评估的TNBC肿瘤的特异性靶向 [0091] 为了评估肿瘤靶向，将3WJ-EGFRapt/抗miR-21纳米颗粒通过尾静脉系统施用于原位TNBC肿瘤携带小鼠。8小时后取得的正常组织、器官和肿瘤的离体图像显示RNA纳米颗粒 特异性靶向并累积在肿瘤中，并且在健康器官和组织中观察到很少或没有积累(图4C)。在 肿瘤积累动力学方面，RNA纳米颗粒在注射后8小时达到它们的最高累积，并在其后保留在 肿瘤中持续延长的时间段以触发miRNA敲低。这种不同的肿瘤保留行为是由于RNA纳米颗粒 的纳米尺寸和形状，其有利于增强的渗透性和保留(EPR)效应。乳腺肿瘤切片的组织学特征 显示，“活性”靶向3WJ-EGFRapt/抗miR21纳米颗粒(由EGFR靶向RNA适体介导)强结合并内化 到癌细胞中，如通过RNA纳米颗粒(红色)与复染TNBC细胞的强缔合所示(图4D)。 [0092] RNA纳米颗粒用于体内靶向递送抗miRNA至TNBC细胞 [0093] 使用表达荧光素酶的MDA-MB-231细胞在裸鼠中开发原位TNBC肿瘤。在全身注射荧光素后，使用生物发光成像显示癌细胞以测量肿瘤大小并定量评估系统递送的3WJ- EGFRapt/抗miR-21纳米颗粒是否可下调miR-21，并在该过程中抑制肿瘤生长。对携带TNBC 肿瘤的小鼠每隔一天注射3WJ-EGFR apt/抗miR-21纳米颗粒5次，并测量发光信号以评估荧 光素酶活性。来自用3WJ-EGFRapt/抗miR-21RNA纳米颗粒处理的小鼠5次剂量(15天)后的终 点发光信号明显低于对照处理的小鼠(图4A)。这在肿瘤生长曲线中也是明显的，其显示与 载体对照相比，3WJ-EGFR apt/抗miR-21纳米颗粒对肿瘤生长持续抑制(图4B)。 [0094] 为了验证在分子水平的抗miR-21敲低，提取肿瘤组织并裂解。通过qRT-PCR测定在mRNA水平上定量PTEN和PDCD4的miR-21以及其下游靶mRNA，并且还通过蛋白质水平的 Western印迹测定检测PTEN和PDCD4的表达。数据显示，与对照组相比，3WJ-EGFRapt/抗miR- 21纳米颗粒处理的肿瘤降低了miR-21水平(图4E，左图)。与对照组相比，miR-21的敲低与治 疗组的mRNA(图4E，右图)和蛋白质水平(图4F)的增加的PTEN和PDCD4表达相关。此外，与对 照组相比，3WJ-EGFRapt/抗miR-21RNA纳米颗粒治疗减少了肿瘤组织中的细胞增殖，如通过 减少的Ki67染色所揭示(图4G，左图)，并诱导癌细胞凋亡，如通过增加的半胱天冬酶-3水平 所指示(图4G，右图)。 [0095] 结论 [0096] 由于发现RNAi作为关键的转录后基因调节机制，因此已经提出长期作为潜在的癌症治疗策略。然而，由于缺乏安全和有效的递送系统，包括siRNA、miRNA、抗miRNA和剪接转换寡核苷酸的治疗性小RNA在体内表现较差。由于它们的小尺寸(流体动力学直径通常< 5nm)，这些小的治疗性RNA显示非常短的半衰期，以有效地触发其靶标敲低42,74，因为它们被肾脏快速清除。这个缺点明显地阻碍了用于疾病治疗的基于RNAi的试剂的临床翻译。因此， 可使用癌细胞结合配体增加小RNA的大小以及引入癌症特异性靶向部分的有效RNAi递送系 统将显著增强这些小治疗性RNA的药代动力学和治疗效力。 [0097] 本文研究了使用用于在体内特异性靶向和递送抗miRNA至癌细胞的pRNA-3WJ芯构建RNA纳米颗粒。数据表明，在原位TNBC肿瘤携带小鼠中全身注射时，3WJ-EGFRapt/抗miR- 21纳米颗粒可以穿过肿瘤周围的异质生物屏障，特异性结合并内化至TNBC细胞中，敲低 miR-21，导致PTEN和PDCD4的上调，并有效抑制肿瘤生长。此外，体内生物分布研究表明RNA 纳米颗粒可以特异性靶向肿瘤，在健康的器官和组织中很少或没有积累，这是癌症治疗中 的重大成就。特异性癌症靶向是RNA纳米颗粒的物理化学性质的直接结果，例如均匀的大小 和结构；高度负电荷，其最小化聚集倾向和穿过带负电荷的细胞膜的非特异性进入；多价， 以在一个平台中实现联合治疗、靶向和检测；使用RNA适体通过受体介导的胞吞作用靶向递 送到癌细胞中；有利于生物分布特性的有利的尺寸；延长的体内半衰期(相比裸抗miRNA的 42 0.25-0.75小时，5-12小时)；和无毒和非免疫原性。RNA纳米颗粒是化学药物，不是生物实 体，这将有助于FDA批准过程。总之，数据表明pRNA-3WJ纳米颗粒具有作为靶向治疗递送系 统应用于临床应用以治疗体内癌症的潜力。由于在每个RNA模块上修饰的容易性和灵活性， 将来可以将不同药物、siRNA、miRNA或抗miRNA掺入RNA纳米颗粒中作为用于治疗不同疾病 的治疗功能。 [0098] 方法与实验 [0099] 2’-F修饰的pRNA-3WJ纳米颗粒的设计和构建 [0100] 使用自下而上的自组装方法构建多功能pRNA-3WJ纳米颗粒。383WJ-EGFRapt/抗miR-21由含有EGFR靶向RNA适体(EGFR apt)作为靶向配体、作为荧光成像模块的 647(Invitrogen、和作为治疗模块的抗miRNA-21LNA(抗miR-21)(Exiqon)四 个片段(图2A)组成。对照包括没有靶向配体的RNA纳米颗粒(表示为3WJ-抗miR-21)，无治疗 模块(表示为3WJ-EGFRapt)或无治疗和靶向模块(表示为3WJ)。 [0101] pRNA-3WJ的芯序列是(图1A)： [0102] a3WJ：5’-UUG CCA UGU GUA UGU GGG-3’(SEQ ID NO：1)； [0103] b3WJ：5’-CCC ACA UAC UUU GUU GAU CC-3’(SEQ ID NO：2)； [0104] c3WJ：5’-GGA UCA AUC AUG GCA A-3’(SEQ ID NO：3)。 [0105] 治疗性3WJ-EGFRapt/抗miR-21由四条链组成(图2A)。小写字母表示2’-F修饰的核苷酸： [0106] 链1：5’-GGA ucA Auc AuG GcA A(C6-NH)(Alexa 647)-3’(SEQ ID NO：4)； [0107] 链2：5’-uuG ccA uGu GuA uGu GGG Auc ccG cGG ccA uGG cGG ccG GGA G-3’(SEQ ID NO：5)； [0108] 链3：5’-ccc AcA uAc uuu Guu GAu ccG ccu uAG uAA cGu Gcu uuG AuG ucG 51 Auu cGA cAG GAG Gc-3’(SEQ ID NO：6)(下划线的序列是EGFR适体 )； [0109] 链4：5’-+G+A+T+A+A+G+C+T CTC CCG GCC GCC ATG GCC GCG GGA T-3’(SEQ ID NO：7)(下划线的序列是8-聚抗miR 21LNA)； [0110] 化学合成RNA片段(Trilink和Exiqon)，并且链1-3是在胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)核苷酸处修饰的2’-F，以使RNA纳米颗粒抵抗RNA酶降解。通过在退火缓冲液(10mM Tris，pH 7.5-8.0，50mM NaCl，1mM EDTA)中以等摩尔浓度混合四条链组装pRNA-3WJ纳米颗粒，并加 热至95℃持续5分钟，并在45分钟内缓慢冷却至4℃。在运行于1×TBE(89mM Tris-硼酸盐， 2mM EDTA)缓冲液中的天然10％PAGE上以及通过Typhoon FLA 7000(GE Healthcare)在Cy5 通道下成像来验证RNA纳米颗粒的逐步装配。 [0111] 组装的pRNA-3WJ纳米颗粒的表征 [0112] 通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定，然后通过Typhoon FLA 7000(GE Healthcare)成像来表征官能化3WJ纳米颗粒的组装。通过之前描述的原子力显微镜(AFM) 和动态光散射(DLS)评估组装的3WJ复合物的结构(38，76-78)。使用特别修改的云母表面 (APS云母)和使用Veeco MultiMode AFM NanoScope IV系统成像，以敲击模式操作产生RNA 图像(图1C)。DLS测量显示3WJ芯的大小(图1A)为4.2±1.1nm(图1D)，并且3WJ-EGFR apt/抗 miR-21纳米颗粒(图2A)的大小为14.8±2.6nm(图2C)。由于AFM图像的分辨率极限受4-10nm 的尖端大小影响，3WJ芯和3WJ-EGFR apt/抗miR-21纳米颗粒的大小太小，以致不能揭示细 节结构和形状。为了评价衍生自其中已经解决了晶体结构的3WJ核的RNA纳米颗粒的整体结 构，将58-60bp的dsRNA延伸到3WJ芯的三个臂(图1B)(49)。预期58-60bp在229bp的持续长度 (刚度)内，因此预期所得臂延伸的RNA纳米颗粒的AFM图像(图1C)提供关于源自热力学稳定 的3WJ的RNA纳米颗粒的全局结构的一些信息(79)。通过Zetasizer nano-ZS(Malvern Instrument，LTD)在25℃下分别测量预装配的3WJ(在DEPC H2O中为1.5μM)和3WJ-EGFRapt/ 抗miR-21(TBE缓冲液中为1.35μM)的表观流体动力学尺寸和ζ电位。数据来自三次独立测 量。 [0113] 温度梯度凝胶电泳(TGGE)测定 [0114] 使用TGGE系统(Biometra GmbH，德国)研究2’-F修饰的3WJ-EGFRapt/抗miR-21纳米颗粒的热力学稳定性。在装配复合物之前，用Alexa 647对一个片段(c3WJ)进行3’-端标 记。使3WJ-EGFRapt/抗miR-21纳米颗粒经受10％天然PAGE(2.5uL的1Μm RNA纳米颗粒/ 孔)，并使其在TBM缓冲液(89mM Tris，200mM硼酸和2.5mM MgCl2)中在环境温度下在恒定 100V下运行5分钟。在将RNA运行到凝胶基质中之后，将凝胶转移到TGGE装置中，并且将垂直 于电流的线性温度梯度设置在25至80℃。将凝胶在80V下运行90分钟，然后通过Typhoon FLA 7000(GE Healthcare)成像。通过ImageJ分析总RNA中的完整颗粒分数，并且使用非线 性S拟合该构建体的熔融曲线。将pRNA-3WJ纳米颗粒的表观Tm确定为50％的RNA纳米颗粒保 持组装时的温度。 [0115] 血清稳定性测定 [0116] 通过将RNA纳米颗粒用50％胎牛血清(FBS)在37℃下以2μM的最终浓度温育来研究3WJ-EGFRapt/抗miR-21纳米颗粒的化学稳定性。在每个时间点(0，0.5h，1h，2h，4h，8h，12h， 24h和36h)收集10uL样品，并用TBM运行缓冲液进行10％天然PAGE测定。将凝胶在120V下运 行120分钟，然后通过Typhoon FLA 7000(GE Healthcare)成像。通过ImageJ分析和定量总 RNA中完整纳米颗粒的分数。 [0117] 细胞培养 [0118] 在含10％FBS的DME/F-12(1:1)培养基中在含有5％CO2和潮湿气氛的37℃培养箱中生长并培养人类TNBC细胞系MDA-MB-231(美国典型培养物保藏中心，ATCC)和MDA-MB- 231-Luc(表达荧光素酶报告基因)。 [0119] 使用荧光激活细胞分选(FACS)的体外结合测定 [0120] 将MDA-MB-231细胞胰蛋白酶化并用空白DME/F-12(1:1)培养基冲洗。将100nM Alexa647标记的3WJ-EGFRapt/抗miR-21和不含EGFR适体的对照RNA纳米颗粒各自用2× 105MDA-MB-231细胞在37℃温育2小时。用PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，100mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH 7.4)洗涤后，将细胞重悬于PBS缓冲液中。使用流式细胞仪(Becton，Dickinson)(在University of Kentucky Markey Cancer Center Flow Cytometry and Cell Sorting core facility获得)进行FACS以观察RNA纳米颗粒的细胞结合效率。通过FlowJo 7.6.1软件分析数据。 [0121] 使用共焦显微镜成像的体外结合和内化测定 [0122] 使MDA-MB-231细胞在Lab-Tek II 8孔腔室载玻片(Nunc)上在DME/F-12(1:1)培养基中生长过夜。将100nM浓度的Alexa647标记的3WJ-EGFRapt/抗miR-21和对照3WJ、3WJ- EGFRapt和3WJ-抗miR-21各自用细胞在37℃温育2小时。用PBS洗涤后，通过4％多聚甲醛 (PFA)固定细胞并用PBS洗涤3次。将固定细胞的细胞骨架通过Alexa488 Phalloidin(Life Technologies)在室温下染色30分钟，然后用PBS冲洗3×10分钟。细胞固定有 金 抗褪色试剂。使用DAPI(Life Technologies)染色细胞核。然后通过FluoView FV1000-滤光 片共聚焦显微镜系统(Olympus)(在University of Kentucky Markey Cancer Center imaging core facility)测定用于纳米颗粒结合和细胞进入的细胞。 [0123] 双荧光素酶测定来分析pRNA-3WJ纳米颗粒对抗miR-21的递送 [0124] 使MDA-MB-231细胞在24孔板上在DME/F12(1:1)培养基中生长直到它们达到80％汇合。使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)，用150ng psi-Check 2质粒 (Promega)转染细胞，所述质粒在Renilla荧光素酶基因的3’-UTR区含有致癌miR-21结合序 列。转染后4小时，用完全DME/F-12(1:1)培养基替换培养基，并将细胞再温育2小时。然后分别将各种浓度的3WJ-EGFRapt/抗miR-21和对照RNA 3WJ-抗miR-21(0、10、50、250nM)在 opti-MEM中用细胞在37℃下温育2小时。在用RNA温育后，将完全DME/F-12(1:1)培养基加入 细胞中，并使用Duel-荧光素酶测定(Promega)，根据制造商的说明，在转染后24小时评估抗 miR-21效果。简言之，将细胞用PBS洗涤一次并用被动裂解缓冲液裂解。将细胞培养板在室 温下振荡15分钟。将20μL裂解物加入到96孔板中的50μL荧光素酶测定试剂(LAR II)中，并 测量对照萤火虫荧光素酶活性。加入50μL Stop&Glo试剂后，然后获得Renilla荧光素酶活 性的测量值。然后相对于萤火虫荧光素酶活性将Renilla荧光素酶活性标准化，以确定 Renilla和萤火虫荧光素酶活性的相对比例。进行至少三次独立实验。 [0125] 使用qRT-PCR测定RNA纳米颗粒对细胞培养物中TNBC细胞的影响 [0126] 将MDA-MB-231细胞用100nM的3WJ-EGFRapt/抗miR-21和对照RNA纳米颗粒分别温育。处理72小时后，收集细胞，并通过qRT-PCR在mRNA水平评估靶基因上调效果。使用Trizol RNA提取试剂根据制造商的说明(Life Technologies)处理总RNA的细胞。 [0127] 为了测定miR-21下调，根据制造商的说明书(Life Technologies)进行微RNA测定。简言之，使用10ng总RNA进行使用 微RNA逆转录试剂盒(Life Technologies)的逆转录。使用MiR-21特异性RT引物。使用Taqman测定法进行实时PCR。所有 反应使用Taqman Universal PCR Master Mix在20μl的终体积中进行，并一式三份进行测 定。用于人miR-21和U6(内源对照)的引物/探针组购自Life Technologies。在StepOneTM/ StepOnePlusTM系统(Applied Biosystems)上进行PCR。通过比较CT方法(ΔΔCT方法)分析 数据。 [0128] 为了测定miR-21的下游靶基因(PTEN和PDCD4)，根据制造商的说明书(Life Technologies)进行 基因表达测定。简言之，使用SuperScriptTM III First- Strand Synthesis System(Life Technologies)从具有各种RNA纳米颗粒处理的MDA-MB- 231细胞，从总RNA(1μg)合成第一cDNA链。使用Taqman测定法进行实时PCR。所有反应使用2 ×Taqman Fast Universal PCR Master Mix在20μl的终体积中进行，并一式三份进行测 定。用于人PTEN、PDCD4和18S(内源对照)的引物/探针组购自Life Technologies。在 StepOneTM/StepOnePlusTM系统(Applied Biosystem)上进行PCR。通过比较CT方法(ΔΔCT 方法)分析数据。 [0129] 细胞培养中的细胞凋亡研究 [0130] 为了测定RNA纳米颗粒处理后的细胞效果，将MDA-MB-231细胞在DME/F-12(1:1)培养基中在24孔板上生长，直到它们达到80％汇合。然后用100nM 3WJ-EGFRapt/抗miR-21处 理细胞。对照包括抗miR-21、3WJ-抗miR-21和3WJ-EGFRapt/Scramble。在用RNA温育24小时 后，根据制造商的说明书，通过半胱天冬酶-3测定试剂盒(BD Pharmingen)测量细胞半胱天 冬酶-3活性并比较。简言之，使用试剂盒提供的冷细胞裂解缓冲液制备诱导凋亡后的细胞 裂解物(1-10×106细胞/ml)，并在冰上温育30分钟。对于每个样品，将50μL细胞裂解物与在 HEPES缓冲液中的5μL重构的Ac-DEVD-AMC一起加入，并在37℃下温育1小时。在Fluorolog氟 光谱仪(Horiba Jobin Yvon)上使用380nm的激发波长和420-460nm的发射波长范围测量从 Ac-DEVD-AMC释放的AMC的量。喜树碱(CPT)用作阳性对照，在分析半胱天冬酶-3活性之前4 小时将其加入细胞培养基中。 [0131] 动物模型 [0132] 涉及动物的所有方案在肯塔基大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)的监督下进行。为了产生TNBC正交各向异性模型，4-8周龄的雌性无胸腺nu/nu小鼠购自Taconic实验 室。通过将重悬于PBS中的2×106MDA MB-231-Luc细胞直接注射到裸鼠的乳房脂肪垫中来 建立原位肿瘤异种移植物。当肿瘤显示出生长的迹象时，将小鼠用于测定治疗效果。当肿瘤 结节在注射后约15天达到100mm3的体积时，将小鼠用于肿瘤靶向研究。 [0133] 荧光成像检测RNA纳米粒子与原位TNBC异种移植物在体内的结合 [0134] 为了研究体内pRNA-3WJ纳米颗粒的递送，在尾静脉注射100μL20uMAlexa647标记的3WJ-EGFRapt/抗miR-21至原位TNBC肿瘤小鼠后进行荧光成像研究。PBS注射的小鼠用作 荧光阴性对照。通过吸入CO2，然后颈脱位，在注射后8小时处死小鼠，并且收集来自牺牲小 鼠的具有肿瘤的包括心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏的主要内脏并进行荧光成像以用于在640nm激发和在680nm发射的IVIS谱站(Caliper Life Sciences)评价生物分布曲线。将肿瘤在含 有处于PBS中的10％蔗糖的4％PFA中在4℃下进一步固定过夜，并包埋在 O.C.T化合物中(Sakura Finetek USA，Inc.)用于冷冻切片(10μm厚)。切片的样品通过具有 DAPI(Life Technologies)的 Gold Antifade Reagent安装过夜。使用 FluoView FV1000-滤光片共聚焦显微镜系统(Olympus)(在University of Kentucky Markey Cancer Center Imaging core facility获得)获得荧光图像。 [0135] 测定RNA纳米颗粒对动物模型中TNBC细胞消退的治疗效果 [0136] 当肿瘤大小达到约5mm直径时，将TNBC肿瘤携带小鼠随机分成两组(每组N＝12)。在5次注射(总RNA纳米颗粒剂量：5mg/kg；LNA剂量：0.26mg/kg)的过程中，每隔一天通过尾 静脉用RNA纳米颗粒3WJ-EGFRapt/抗miR-21注射一组。PBS处理的小鼠用作治疗对照。在注 射后每两天测量并监测肿瘤体积，直到15天。肿瘤体积计算为：(长×宽2)/2。在注射开始和 结束时，对小鼠进行生物发光全身成像以检测内源荧光素酶表达水平。将小鼠麻醉并腹膜 内注射150mg/kg D-荧光素(Biosynth International,Inc。)。通过IVIS Spectrum站 (Caliper Life Sciences)检测麻醉小鼠的生物发光。然后处死小鼠，提取肿瘤并称重，然 后进行生化和组织学分析。 [0137] 为了定量miR-21和随后的靶基因表达，将肿瘤组织在液氮中快速冷冻并使用研钵研磨。将研磨的肿瘤组织转移到干净的离心管中。加入Trizol RNA提取试剂(Life Technologies)以提取总RNA。然后，如上所述通过使用Taqman Assays的qRT-PCR(Life Technologies)定量miR-21和随后的靶基因(PTEN和PDCD4)表达。 [0138] 还在裂解缓冲液(含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物的2％SDS)(Calbiochem)中裂解肿瘤组织，以使用蛋白质印迹测定在蛋白质水平定量靶基因表达。通过BCA蛋白测定试 剂盒(Pierce)测量蛋白浓度。将等量的总蛋白经受SDS-PAGE凝胶电泳并从凝胶转移至膜。 在室温下用5％无脂肪乳将膜封闭1小时，并在一级抗体(PTEN，Cell Signaling，1:1000； PDCD4，Cell Signaling，1:1000；Lamin A/C，Santa Cruz，1:1000)中温育过夜。在室温下在HRP缀合的二级抗体中温育1小时后，用ECL系统(Pierce)检测蛋白条带，并暴露于膜放射自 显影。 [0139] 通过组织学分析肿瘤组织中的Ki67和半胱天冬酶-3活性来评价RNA纳米颗粒的治疗效果。通过用二甲苯温育(10分钟一次，3次)使对照和RNA纳米颗粒处理的组肿瘤切片脱 石蜡，并由100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇和70％乙醇至PBS溶液水合。然后将载玻片用3％H2O2温育20分钟以封闭内源性过氧化物酶。在抗原修复步骤中，将载玻片在10mM柠檬酸钠缓 冲液(pH6.0)中蒸30分钟。所有载玻片用5％山羊血清和亲和素/生物素封闭试剂盒(Vector labs)封闭。然后将载玻片与一级抗体(Ki67，Spring Bioscience，1:500；活性半胱天冬酶- 3，Millipore，1:100)在4℃温育过夜，然后将切片用缀合有HRP的山羊抗兔IgG室温下温育 60分钟。通过二氨基联苯胺(DAB)检测缀合的抗体。所有载玻片用苏木精复染，并且通过 Nikon显微镜获取图像。 [0140] 统计分析 [0141] 对于每个测试的样品的复制品，每个实验重复至少3次。除非另有说明，结果表示为平均值±标准偏差。使用学生t检验评估统计学差异，并且p<0.05被认为是显著。 [0142] 在本文中，提及了各种参考文献。所有这些参考文献通过引证并入本文，包括以下列出的参考文献： [0143] 参考文献 [0144] 1.Bartel,D.P.MicroRNAs:Genomics,Biogenesis,Mechanism,and Function.Cell 2004,116,281-297. 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