[0001] 本文中报道了包含抗原和抗体的复合物，其中该复合物的组分通过单键彼此共价连接。还报道了用于产生该共价复合物的方法及其用途。

[0002] 发明背景

[0003] 多肽治疗性应用的主要瓶颈是它们的溶解度、体内稳定性有限、血清半寿期短和从血流快速清除。

[0004] 报道了不同方案以解决这些缺点。然而，这些技术均未提供在不遭遇免疫原性风险或生物学活性潜在丧失的情况下能够调节药物代谢动力学(PK)的稳健和通用平台。

[0005] 一个改善治疗性多肽的PK/稳定性和生物物理特性的方法是使它们与使多肽稳定化、使其维持溶解状态并延长其半寿期的实体融合。这类实体的例子是人血清白蛋白或人免疫球蛋白Fc区。这种方法适用于由天然存在的氨基酸残基组成并且在不丧失其生物
学活性的情况下在其C端或N端耐受修饰的许多线形多肽。呈环状、U型、含有非天然氨基酸残基或额外修饰的多肽不能作为融合多肽重组产生。然而，这类多肽可能是治疗性应用所需的选择，因为在蛋白酶稳定性、活性和特异性方面而言，它们经常优于‘正规的’线形肽。

[0006] 一个改善治疗性多肽的PK/稳定性和生物物理特性的方法(其也可以适用于呈环状、U型或含有非天然结构物的那些多肽)是与聚合物化学或酶促缀合，例如通过PEG化或HES化(hesylation)。但是，这类修饰经常导致多肽的生物学活性显著降低并且在某些情况下可能是安全问题或毒性问题的原因。

[0007] 用于稳定治疗性多肽或调节其PK的大多数现有化学偶联技术的主要缺点是它们的复杂性。除了化学偶联步骤外，这些方法还在许多情况下产生多肽衍生物的混合物，所述多肽衍生物以不确定的化学计量和/或在不确定的位置与调节PK的实体连接。另外，目前使用的多肽修饰技术经常导致治疗性多肽的生物学活性剧烈降低或甚至完全丧失。此外，难以预测化学缀合物的药理学特性和/或可能的降解途径。

[0008] US 5,804,371报告了半抗原标记的肽及其在免疫检测方法中的用途。洋地黄毒苷标记的肽(缓激肽)及其对发炎组织中缓激肽的化学发光酶免疫测定法的适用性由
Decarie A.等人(Peptides 15(1994)511-518)报道。

[0009] 在WO 2004/065569中报道了多功能抗体。

[0010] 发明概述

[0011] 已经发现通过将半抗原化的化合物共价偶联至抗半抗原抗体，可以实现该化合物的稳定化和PK性能改善。

[0012] 如本文中报道的一个方面是一种含抗原和与所述抗原特异性结合的抗体的缀合物，其特征在于该抗原和该抗体的CDR2中的氨基酸残基之间的共价键，其中根据Kabat确定CDR2。

[0013] 已经发现一旦用包含用于该抗原和该抗体的CDR2中的氨基酸残基之间形成共价键的功能残基的通用接头衍生化，则任何抗原可以用于如本文中报道的缀合物和方法中。
官能团在通用接头中的位置具有下述优点：不必需再工程化在抗体的CDR2中的官能团的
合成及其位置。

[0014] 如本文中报道的一个方面是一种含半抗原化化合物和与所述半抗原化化合物的半抗原特异性结合的抗体(抗半抗原抗体)的缀合物，其特征在于该半抗原化化合物和该
抗体的CDR2中的氨基酸残基之间的共价键，其中根据Kabat确定CDR2。

[0015] 在全部方面的一个实施方案中，CDR2是重链CDR2。

[0016] 在全部方面的一个实施方案中，半抗原化化合物包含半抗原、任选的接头和有效载荷。

[0017] 在全部方面的一个实施方案中，共价键在半抗原化化合物的接头和抗体的CDR2中的氨基酸残基之间。

[0018] 在全部方面的一个实施方案中，共价键在半抗原化化合物中的官能团和抗体的CDR2中的氨基酸残基之间。

[0019] 在一个实施方案中，官能团处于半抗原化化合物的接头中。

[0020] 在如本文中报道的全部方面的一个实施方案中，共价键在抗体的重链CDR2中的半胱氨酸残基和抗原中的官能团或半抗原化化合物中的官能团之间。

[0021] 在一个实施方案中，根据Kabat的重链可变域编号法，抗体的重链CDR2中的半胱氨酸残基在第52位置、或第52a位置、或第52b位置、或第52c位置或第52d位置或第53位置处。

[0022] 在一个实施方案中，根据Kabat的重链可变域编号法，抗体的重链CDR2中的半胱氨酸残基在第52a位置、或第52b位置、或第52c位置或第53位置处。

[0023] 在一个实施方案中，根据Kabat的重链可变域编号法，抗体的重链CDR2中的半胱氨酸残基在第52b位置或在第53位置处。

[0024] 在全部方面的一个实施方案中，共价键是二硫键。

[0025] 在全部方面的一个实施方案中，该抗体是包含针对第一抗原或第一半抗原的第一结合特异性和针对第二抗原或第二半抗原的第二结合特异性的双特异性抗体，其中第一抗原/半抗原与第二抗原/半抗原不同。

[0026] 在一个实施方案中，该抗体包含针对第一半抗原的第一结合特异性和针对第二半抗原的第二结合特异性。

[0027] 在一个实施方案中，抗体包含针对半抗原的第一结合特异性和针对(非半抗原的)抗原的第二结合特异性。

[0028] 在一个实施方案中，该(非半抗原的)抗原是细胞表面抗原。在一个实施方案中，细胞表面抗原是肿瘤相关抗原。

[0029] 在一个实施方案中，双特异性抗体是全长抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体的一条重链包含穴突变(hole mutation)并且相应的另一条链包含隆突突变(knob
mutation)。

[0030] 在全部方面的一个实施方案中，有效载荷选自结合部分、标记部分和生物学活性部分。

[0031] 在全部方面的一个实施方案中，该抗体是全长抗体。

[0032] 在全部方面的一个实施方案中，该抗体是人源化或人抗体。

[0033] 在一个实施方案中，该抗体的恒定区是IgG1亚类或IgG4亚类。

[0034] 在一个实施方案中，抗体具有IgG1亚类的恒定区，其中根据Kabat的EU索引编号，所述恒定区在第234和235位置处具有丙氨酸并且在第329位置处具有甘氨酸。

[0035] 在一个实施方案中，抗体具有IgG4类的恒定区，其中根据Kabat的EU索引编号，所述恒定区具有在第228位置处的脯氨酸、在第235位置处的谷氨酸和在第329位置处的甘氨酸。

[0036] 在如本文中报道的全部方面的一个实施方案中，该抗体是抗体的片段。在一个实施方案中，片段是Fab或(Fab)2。

[0037] 在全部方面的一个实施方案中，缀合物确切地包含一个共价键/重链CDR2。

[0038] 在如本文中报道的全部方面的一个实施方案中，该抗原或半抗原化化合物包含反应基团，所述反应基团可以与抗体的CDR2中的半胱氨酸残基的巯基形成共价键。在一个实施方案中，反应基团是巯基、或马来酰亚胺或卤代乙酰基。

[0039] 在如本文中报道的全部方面的一个实施方案中，共价键是二硫键并且且它在不添加氧化还原活性剂的情况下形成。

[0040] 在全部方面的一个实施方案中，缀合物包含治疗部分或可检测部分。在一个实施方案中，治疗部分或可检测部分共价缀合至抗原或半抗原。

[0041] 在一个实施方案中，抗原或半抗原缀合至由5至60个氨基酸残基组成的多肽。在一个实施方案中，该多肽包含10至50个氨基酸残基。在一个实施方案中，该多肽包含12至40个氨基酸残基。在一个实施方案中，该多肽包含12至30个氨基酸残基。

[0042] 在一个实施方案中，抗原或半抗原缀合至可检测标记物。

[0043] 在一个实施方案中，抗原或半抗原缀合至多肽，或缀合至可检测标记物，或经接头缀合至有效载荷。在一个实施方案中，接头是非肽接头。

[0044] 如本文中报道的一个方面是在轻链和/或重链具有在CDR2中的半胱氨酸残基的抗体，其中根据Kabat确定CDR。

[0045] 在一个实施方案中，半胱氨酸残基处于重链CDR2中。

[0046] 在一个实施方案中，根据Kabat的重链可变域编号法，抗体的重链CDR2中的半胱氨酸残基在第52位置、或第52a位置、或第52b位置、或第52c位置或第52d位置或第53位置处。

[0047] 在一个实施方案中，根据Kabat的重链可变域编号法，抗体的重链CDR2中的半胱氨酸残基在第52a位置、或第52b位置、或第52c位置或第53位置处。

[0048] 在一个实施方案中，根据Kabat的重链可变域编号法，抗体的重链CDR2中的半胱氨酸残基在第52b位置或在第53位置处。

[0049] 在一个实施方案中，抗体确切地在一个重链可变域中第52b位置处或第53位置处具有半胱氨酸残基。

[0050] 在一个实施方案中，半抗原是生物素、或茶碱、或洋地黄毒苷、或碳硼烷或荧光素。

[0051] 在一个实施方案中，抗体是人源化抗体或人抗体。

[0052] 在一个实施方案中，抗体是全长抗体、或Fab、或scFv、或与Fc区缀合的scFv。

[0053] 在一个实施方案中，半胱氨酸与孤立的半胱氨酸残基或孤立的同型半胱氨酸残基形成二硫键。

[0054] 如本文中报道的一个方面是包含如本文中报道的缀合物和细胞毒性剂的免疫缀合物。

[0055] 如本文中报道的一个方面是包含如本文中报道的缀合物和和可药用载体的药物制剂。

[0056] 使用如本文中报道的缀合物作为药物。

[0057] 使用如本文中报道的缀合物治疗癌症。

[0058] 使用如本文中报道的缀合物治疗糖尿病。

[0059] 使用如本文中报道的缀合物治疗肥胖症。

[0060] 使用如本文中报道的缀合物治疗炎性疾病。

[0061] 使用如本文中报道的缀合物治疗代谢性疾病。

[0062] 使用如本文中报道的缀合物治疗病毒病。

[0063] 如本文中报道的一个方面是如本文中报道的缀合物在制造药物中的用途。

[0064] 如本文中报道的一个方面是如本文中报道的缀合物作为诊断剂的用途。

[0065] 如本文中报道的一个方面是如本文中报道的包含治疗性多肽的缀合物增加所述治疗性多肽的稳定性的用途。

[0066] 如本文中报道的一个方面是如本文中报道的包含治疗性多肽的缀合物增加所述治疗性多肽的活性的用途。

[0067] 如本文中报道的一个方面是如本文中报道的包含治疗性多肽的缀合物增加所述治疗性多肽的体内半寿期的用途。

[0068] 如本文中报道的一个方面是如本文中报道的缀合物在治疗疾病中的用途。

[0069] 如本文中报道的一个方面是治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的如本文中报道的缀合物。

[0070] 如本文中报道的一个方面是治疗个体中疾病的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的如本文中报道的缀合物。

[0071] 在一个实施方案中，该疾病是癌症。

[0072] 在一个实施方案中，该疾病是糖尿病。

[0073] 在一个实施方案中，该疾病是肥胖症。

[0074] 如本文中报道的一个方面是产生如本文中报道的缀合物的方法，所述方法包括组合包含第一反应基团的抗体和具有第二反应基团的抗原，其中携带第一反应基团的氨基酸残基的α碳原子与接头同其融合的抗原的原子相距约10至11埃。

[0075] 如本文中报道的一个方面是产生如本文中报道的缀合物的方法，所述方法包括步骤

[0076] -在溶液中将特异性结合至半抗原并且在CDR2中的一个氨基酸残基处包含反应基团的抗体与包含反应基团的半抗原化化合物组合，其中半抗原化化合物包含有效载荷，如由5至60个氨基酸组成的肽或可检测标记物，和

[0077] -从溶液回收缀合物。

[0078] 如本文中报道的一个方面是产生抗体的方法，所述抗体用于形成如本文中报道的缀合物，所述方法包括步骤

[0079] -培育包含编码该抗体的核酸的细胞，和

[0080] -从细胞或培养基回收抗体，

[0081] 其中在该抗体中，将重链CDR2中的残基突变成半胱氨酸，其中在抗体和其抗原或半抗原化化合物的非共价复合物的X射线结构中，抗体CDR2中的氨基酸残基的α-原子和与接头连接的半抗原的原子或二者间意在形成共价键的抗原原子之间具有10至11埃距
离。

[0082] 如本文中报道的一个方面是用于鉴定抗体CDR2中位置的方法，其中所述位置可以突变成用于抗体CDR2中的残基和结合的抗原或半抗原化化合物之间形成共价键的半胱
氨酸，所述方法包括步骤

[0083] -提供抗体和抗原或半抗原化化合物的非共价复合物的晶体结构，其中抗原或半抗原化化合物包含接头序列，和

[0084] -在抗体的CDR2中和在接头序列中鉴定在抗体CDR2中的氨基酸残基的α-原子和与接头融合的抗原中的原子之间具有10至11埃距离的氨基酸残基，

[0085] 其中，鉴定的位置是抗体CDR2中这样的位置，所述位置可以突变成用于抗体CDR2中的残基和结合的抗原或半抗原化化合物之间形成共价键的半胱氨酸。

[0086] 如本文中报道的一个方面是用于靶向递送半抗原化化合物至靶细胞的双特异性抗体，其中双特异性抗体包含与半抗原化化合物特异性结合的第一结合位点和与细胞的细胞表面标记物特异性结合的第二结合特异性。

[0087] 附图描述

[0088] 图1：用于肽的洋地黄毒苷化(与洋地黄毒苷缀合)的流程(图1A)。洋地黄毒苷化标记物(荧光团Dig-Cy5；图1B)的例子和洋地黄毒苷化多肽(PYY-衍生物(DIG-PYY)；
图1C)的例子。

[0089] 图2：单特异性二价抗洋地黄毒苷抗体和洋地黄毒苷-Cy5缀合物的复合物(图2A)以及单特异性二价抗洋地黄毒苷抗体和洋地黄毒苷-多肽缀合物的复合物(图2B)的
示意图。双特异性四价抗洋地黄毒苷抗体和洋地黄毒苷-多肽缀合物的复合物(图2C)的
示意图。

[0090] 图3:包含抗洋地黄毒苷抗体和与肽缀合的洋地黄毒苷(DIG-PYY)的复合物的大小排阻层析图(在280nm记录)，其显示具有确定大小的复合物的单峰。

[0091] 图4:A：抗洋地黄毒苷Fab(左)的结构模型，显示(圈定的)洋地黄毒苷在VH区和VL区的CDR形成的深口袋中被捕获。B：抗抗生物素Fab(右)的结构模型，显示(圈定
的)生物胞素酰胺(biocytinamid)在VH区和VL区的CDR形成的深口袋中被捕获。

[0092] 图5：引入和未引入VH53C突变的重组人源化抗生物素抗体的结合的比较。使用BIAcore T100或BIAcore3000仪通过表面等离子体共振(SPR)技术分析结合特性。a)人源
化抗生物素抗体。生物素酰化siRNA与人源化抗生物素抗体的结合，KD＝624pM；b)Cys53突变的人源化抗生物素抗体。生物素酰化siRNA的结合，KD＝643pM；siRNA浓度：0.14、
0.41、1.23、3.70、11.1、33.3和100nM；抗生物素抗体浓度：2nM；传感芯片CM3；抗体通过抗人IgG Fc抗体的结合

[0093]ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
人源化抗生物素抗体VH53C 2.2*107 0.01 6.4*10-10
人源化抗生物素抗体 2.0*107 0.01 6.2*10-10

[0094] 图6：在半抗原中以及在抗体中在适宜位置引入SH官能团允许抗体和半抗原彼此间形成共价键，产生缀合物。

[0095] 图7：SDS-PAGE自我荧光条带样式的示意图(在SDS-PAGE凝胶不进一步染色的情况下)：

[0096] A：如果在还原性或非还原性条件下在抗体和半抗原-荧光团缀合物之间均不形成共价键，则可以在游离半抗原-荧光团缀合物的分子量处检测到一条自我荧光条带。

[0097] B：如果在非还原性条件下在抗体和半抗原-荧光团缀合物之间形成共价键，则可以在抗体和半抗原-荧光团缀合物的合并分子量处检测到一条自我荧光条带。在还原条件下，切割抗体和半抗原-荧光团缀合物(半抗原化化合物)的缀合物中的二硫键并且可以在游离半抗原-荧光团缀合物的分子量处检测到一条自我荧光条带。

[0098] 图8：在氧化还原活性剂：氧化剂(谷胱甘肽二硫化物，GSSG)和还原剂(二硫赤藓糖醇，DTE)存在下结合半抗原的Cys突变的抗体与半抗原-Cys-荧光标记缀合物(半抗
原化化合物)形成缀合物：在SDS PAGE分析中通过荧光信号检测到确定位置处的抗体复合和后续的共价键合。非还原性(上图)和还原性(下图)SDS-PAGE分析如实施例11中所
述进行。在非还原条件下，抗体共价连接的半抗原可检测为适宜位置处更大尺寸的蛋白质结合信号。在还原后，这些信号脱离蛋白质并且在还原条件下作为小实体可见。

[0099] 左：荧光图像

[0100] 右：考马斯蓝染色

[0101] 系列1：具有52bC突变的抗洋地黄毒苷抗体

[0102] 系列2：在第52b位置处具有野生型残基的抗洋地黄毒苷抗体

[0103] (A)用3mM DTE和10mM GSSG共价偶联；

[0104] (B)用0.3mM DTE和1mM GSSG共价偶联；

[0105] (C)用0.03mM DTE和0.1mM GSSG共价偶联。

[0106] 图9：在仅氧化剂(谷胱甘肽二硫化物，GSSG)存在，但在还原剂不存在或在二者均不存在的情况下结合半抗原的Cys突变的抗体与半抗原-Cys-荧光标记缀合物形成缀合物：在SDS PAGE分析中通过荧光信号检测到确定位置处的抗体复合和后续的共价键合。非还原性(上图)和还原性(下图)SDS-PAGE分析如实施例12中所述进行。在非还原条件
下，抗体共价连接的半抗原可检测为适宜位置处更大尺寸的蛋白质结合信号。在还原后，这些信号脱离蛋白质并且在还原条件下作为小实体可见。

[0107] 左：荧光图像

[0108] 右：考马斯蓝染色

[0109] 系列1：具有52bC突变的抗洋地黄毒苷抗体

[0110] 系列2：在第52b位置处具有野生型残基的抗洋地黄毒苷抗体

[0111] (A)无添加物

[0112] (B)用1mM GSSG共价偶联；

[0113] (C)用0.1mM GSSG共价偶联。

[0114] 图10：Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)的结构

[0115] 图11：DIG-3-cme-eda-Cy5的结构

[0116] 图12：DIG-马来酰亚胺-Cy5的结构

[0117] 图13：DIG-eda-Cys-Cy5的结构

[0118] 图14：DIG-Ahx-Cys-Cy5的结构

[0119] 图15：DIG-Cys-MR121的结构

[0120] 图16：Ac-PYY(PEG3-Dig)的结构

[0121] 图17：Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)的结构

[0122] 图18：PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)的结构

[0123] 图19：Dy636-eda-Btn的结构

[0124] 图20：Dy636-Ser-Btn的结构

[0125] 图21：Dy636-Cys-Btn的结构

[0126] 图22：Cy5-Cys-Btn的结构

[0127] 图23：Cy5-Ser-Btn的结构

[0128] 图24：Ac-PYY(PEG2-Btn)的结构

[0129] 图25：Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Btn)的结构

[0130] 图26：Ac-PYY-PEG3-Ser-PEG2-Btn)的结构

[0131] 图27：Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Btn的结构

[0132] 图28：Ac-PYY(PEG3-Cys-4-Abu-5-Fluo)的结构

[0133] 图29：Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo)的结构

[0134] 图30：产生Ac-PYY(PEG2-Btn)的示意图

[0135] 图31：产生Ac-PYY(PEG3-Cys-β-Ala-Btn)的示意图

[0136] 图32：产生Ac-PYY(PEG3-Cys-4-Abu-Dig)的示意图

[0137] 图33：与生物胞素酰胺复合的鼠抗生物素抗体的X射线结构。棍图中显示与生物胞素酰胺相互作用的氨基酸残基。

[0138] 图34：与未复合的抗原/半抗原相比采用共价缀合物和非共价复合物的体内血液PK研究结果；显示生物素-Cy5非共价复合物(图34A)和共价(SS桥接)缀合物(图35B)的Cy5-介导荧光的相对剩余荧光强度(％，实心标记)，以及未复合的生物素-Ser-Cy5(星号)的相对剩余荧光强度；将时间点t＝0.08小时处的荧光信号设定为100％；另外，显
示小鼠血清样品中人IgG的相对剩余量(空心标记)；将t＝0.08小时处的IgG血清浓度
(mg/ml)设定为100％。

[0139] 图35：确定小鼠血清中洋地黄毒苷化PYY多肽的量的蛋白质印迹。

[0140] 图36：亲和力驱动的半抗原化化合物与抗半抗原抗体复合的分析。

[0141] 在SDS PAGE分析中由荧光信号指引在确定位置处的抗体复合和后续的共价键合，所述SDS PAGE分析如实施例19中所述实施。

[0142] 左：采用未还原样品(凝胶左侧)和还原样品(凝胶右侧)的荧光图像。

[0143] 右：考马斯蓝染色。

[0144] 1：人源化抗洋地黄毒苷抗体+生物素-Cys-Cy5

[0145] 2：人源化抗洋地黄毒苷抗体VH52bC+生物素-Cys-Cy5

[0146] 3：人源化抗生物素抗体+生物素-Cys-Cy5

[0147] 4：人源化抗生物素抗体VH53C+生物素-Cys-Cy5

[0148] 白色箭头标示过量(未偶联的)生物素-Cys-Cy5，当使用抗洋地黄毒苷抗体VH52bC时，所述过量的生物素-Cys-Cy5是显著更高，因为在这种情况下缀合反应不是亲和力驱动的。

[0149] 图37：Fab区内部为形成结合Dig的抗体所要求的半胱氨酸位置和二硫键样式，所述抗体在第52b位置处具有用于半抗原介导的位点定向共价有效载荷偶联的额外半胱氨酸。(A)VH域和CH1域中和VL域和CL域中为形成功能性Fab片段所要求的半胱氨酸和二
硫键样式。(B)VH域和CH1域中和VL域和CL域中为形成功能性Fab片段所要求的半胱氨
酸和二硫键样式，所述功能性Fab片段在第52b位置处具有用于半抗原介导的位点定向共
价有效载荷偶联的额外半胱氨酸。(C和D)VH52b变体的VH域内部形成不正确二硫键的潜
力，所述不正确二硫键将产生错误折叠的无功能抗体。(E)VH52b变体的Fv区内部将导致错误折叠的无功能抗体的潜在不正确域间二硫键的例子。

[0150] 图38：为形成结合Dig的二硫键稳定化的单链Fv所要求的半胱氨酸位置和二硫键样式，所述单链Fv在第52b位置处具有用于半抗原介导的位点定向共价有效载荷偶联的额外半胱氨酸。(A)VH域和VL域中为形成功能性scFv、dsscFv和52b突变型dsscFv所要
求的半胱氨酸。(B)必须形成以产生功能性scFv、dsscFv和52b突变型dsscFv的正确二硫
键样式。(C)形成将产生错误折叠的无功能scFv的不正确二硫键的潜力。(D)形成将产生
错误折叠的无功能dsscFv的不正确二硫键的潜力。(E)形成将产生错误折叠的无功能52b
突变型dsscFv的不正确二硫键的潜力。

[0151] 图39：作为共价偶联有效载荷的递送载具的LeY-Dig双特异性抗体衍生物的组成。

[0152] 图40：用于靶向递送共价偶联有效载荷的双特异性抗半抗原抗体衍生物的表达和纯化。

[0153] (A)对于蛋白质印迹分析，将细胞培养上清液进行SDS PAGE(NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶(1.0mm x 12孔)(Invitrogen；目录号NP0322)并且随后将蛋白质转移至
固定转移膜(Immobilon-P)(Millipore；目录号IPVH07850)，孔径0.45μm的PVDF。通过
1:1000稀释的在山羊中产生的抗人κ轻链-碱性磷酸酶抗体(亲和纯化，Sigma目录号
A3813)和1:1000稀释的在山羊中产生的抗人IgG(Fc特异的)-碱性磷酸酶抗体(Sigma目
录号A9544)检测抗体衍生物。施加底物BCIP/NBT-蓝液态底物(Sigma目录号B3804)用
于蛋白质印迹物显色。泳道1–分子量标记；泳道2和3-具有未修饰重链的对照抗体；泳
道4-具有延长的H链的LeY-Dig(52bC)双特异性抗体。

[0154] (B)SDS-PAGE分析(NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶[Invitrogen]和随后用考马斯亮兰染色展示蛋白质制备物的纯度并且显现与表观分子大小对应于其计算分子量的IgG相关的多肽链。泳道1–分子量标记；泳道2-具有延长H链的还原LeY-Dig(52bC)双特异
性抗体；泳道3-具有延长重链的非还原LeY-Dig(52bC)双特异性抗体；

[0155] (C)大小排阻层析(Superdex 200)展示在蛋白A纯化后LeY-Dig(52bC)双特异性抗体衍生物的蛋白质制备物的均一性及其中缺少聚集物。

[0156] 图41：Dig-Cy5非共价复合物和共价(二硫键桥接)缀合物的Cy5-介导荧光的相对剩余荧光强度(％)，以及未复合的Dig-Cy5的相对剩余荧光强度；将时间点t＝0.08
小时处的荧光信号设定为100％；另外，显示小鼠血清样品中人IgG的相对剩余量；将t＝
0.08小时处的IgG血清浓度(mg/ml)设定为100％。

[0157] 图42：类体内条件下由非侵入性眼成像法确定的非共价复合物和共价(二硫键桥接)缀合物的生物素-Cy5以及未复合的生物素-Cy5的Cy5-介导荧光的药物代谢动力
学；实心菱形：生物素-Cy5；实心正方形：生物素-Cy5+抗生物素抗体(复合物)；三角形：
Cy5-生物素-抗生物素抗体缀合物。

[0158] 图43：a)茶碱-Cys-Cy5的组成、结构和分子量；b)大小排阻层析展示结合茶碱的纯化抗体变体的纯度和均一性；峰#2显示纯化的产物，缺少峰#1表明这类制备物不含聚集物；c)如通过非还原性SDS PAGE(左侧泳道)和还原性(右侧泳道)SDS PAGE展示，在结合茶碱的抗体和茶碱-Cys-Cy5之间形成共价复合物；Cy5似乎在含有茶碱-Cys-Cy5和cys突
变抗体的样品中仅在非还原性条件下与H链偶联，这些共价缀合物在还原时解体(右侧泳
道)；泳道1：分子量标记；泳道2-4非还原性条件-泳道2：抗茶碱抗体(无cys-突变)+
茶碱-Cys-Cy5(复合物)；泳道3：抗茶碱抗体-cys_55+茶碱-Cys-Cy5(缀合物)；泳道4：
抗茶碱抗体-cys_54+茶碱-Cys-Cy5(缀合物)；泳道5-7还原性条件-泳道5：抗茶碱抗体
(无cys-突变)+茶碱-Cys-Cy5(复合物)；泳道6：抗茶碱抗体-cys_55+茶碱-Cys-Cy5(缀
合物)；泳道7：抗茶碱抗体-cys_54+茶碱-Cys-Cy5(缀合物)。

[0159] 图44：通过非还原性SDS PAGE和还原性SDS PAGE展示在结合生物素的抗体和生物素-Cys-Cy5之间共价复合物形成；偶联反应在37℃于鼠血清中进行1小时。Cy5似乎在
含有生物素-Cys-Cy5和cys突变抗体的样品中仅在非还原性条件下与H链偶联，这些共价
缀合物在还原时解体(右侧泳道)；泳道1：分子量标记；泳道2-3非还原性条件-泳道2：
抗生物素抗体(无cys突变)+生物素-Cys-Cy5(复合物)；泳道3：抗生物素抗体-cys+生
物素-Cys-Cy5(缀合物)；泳道4-5还原性条件-泳道5：抗生物素抗体(无cys突变)+生
物素-Cys-Cy5(复合物)；泳道6：抗生物素抗体-cys+生物素-Cys-Cy5(缀合物)

[0160] 图45：由非侵入性眼成像法确定的非共价复合物和共价(二硫键桥接)缀合物的生物素-Cy5以及未复合的生物素-Cy5的Cy5-介导荧光的体内药物代谢动力学；实心菱
形：生物素-Cy5，实心圆圈：在施用抗生物素抗体后24小时施用的生物素-Cy5(体内复合物形成)；实心正方形：在施用抗生物素抗体-cys后24小时施用的生物素-Cys-Cy5(体内
缀合物形成)。

[0161] 图46：测定了与生物胞素酰胺复合的鼠抗生物素抗体-Fab片段的蛋白结构：复合的半抗原紧邻于带负电荷的氨基酸簇存在；作为半抗原在其羧基处经衍生化用于有效载荷偶联的生物素以良好效力结合，因为在这个位置不存在电荷排斥作用(归因于缺少COOH基)；相反，游离(正常)生物素不能有效与抗体结合，因为其羧基紧邻于这个负电荷簇，并且因此被排斥。
具体实施方案

[0162] I.定义

[0163] 出于本文目的，“接纳体人类构架”是这样的构架，其包含从如下文定义的人免疫球蛋白构架或人共有序列构架衍生的轻链可变域(VL)构架或重链可变域(VH)构架的氨基酸序列。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人类构架可以包含其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小、或2或更小。在一些实施方案中，VL接纳体人类构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架
序列相同。

[0164] 术语“氨基酸”指天然存在(即可以由核酸直接或以前体形式编码)的或非天然存在的一组羧基α-氨基酸。各个天然存在的氨基酸由三个核苷酸(所谓密码子或
碱基三联体)组成的核酸编码。每种氨基酸由至少一个密码子编码。是称作“遗传密码
的简并性”。如本申请内部使用，术语“氨基酸”指天然存在的羧基α-氨基酸，包括丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。非天然存在氨基酸的例子包括但不限于Aad(α-氨基
己二酸)、Abu(氨基丁酸)、Ach(α-氨基环己烷-羧酸)、Acp(α-氨基环戊烷-羧酸)、
Acpc(1-氨基环丙烷-1-羧酸)、Aib(α-氨基异丁酸)、Aic(2-氨基茚满-2-羧酸；又称
作2-2-Aic)、1-1-Aic(1-氨基茚满-1-羧酸)、(2-氨基茚满-2-羧酸)、烯丙基甘氨酸
(AllylGly)、别异亮氨酸(allo-Ile)、Asu(α-氨基辛二酸、2-氨基辛二酸)、Bip(4-苯
基-苯丙氨酸-羧酸)、BnHP((2S,4R)-4-羟脯氨酸)、Cha(β-环丙基丙氨酸)、Cit(瓜
氨酸)、环己基甘氨酸(Chg)、环戊基丙氨酸、β-环己基丙氨酸、Dab(1,4-二氨基丁酸)、Dap(1,3-二氨基丙酸)、p(3,3-双苯基丙氨酸-羧酸)、3,3-双苯基丙氨酸、二-正丙基甘
氨酸(Dpg)、2-呋喃基丙氨酸、高环己基丙氨酸(HoCha)、高瓜氨酸(HoCit)、高环亮氨酸、高亮氨酸(HoLeu)、高精氨酸(HoArg)、高丝氨酸(HoSer)、羟脯氨酸、Lys(Ac)、(1)Nal(1-萘基丙氨酸)、(2)Nal(2-萘基丙氨酸)、4-MeO-Apc(1-氨基-4-(4-甲氧苯基)-环己烷-1-羧
酸)、正亮氨酸(Nle)、Nva(正缬氨酸)、Omathine、3-Pal(α-氨基-3-吡啶基丙氨酸-羧
酸)、4-Pal(α-氨基-4-吡啶基丙氨酸-羧酸)、3,4,5,F3-Phe(3,4,5-三氟苯丙氨酸)、
2,3,4,5,6,F5-Phe(2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸)、Pqa(4-氧代-6-(1-哌嗪基)-3(4H)-喹
唑啉-乙酸(CAS 889958-08-1))、吡啶基丙氨酸、喹啉基丙氨酸、肌氨酸(Sar)、噻唑基丙氨酸、噻吩基丙氨酸、Tic(α-氨基-1,2,3,4,-四氢异喹啉-3-羧酸)、Tic(OH)、Tle(叔丁基甘氨酸)和Tyr(Me)。

[0165] 术语“氨基酸序列变体”指具有某种程度上与天然序列多肽不同的氨基酸序列的多肽。通常，氨基酸序列变体将与天然序列多肽拥有至少约70％序列同一性。在一个实施方案中，该变体与天然序列多肽具有约80％或更大序列同一性。在一个实施方案中，该变体与天然序列多肽具有约90％或更大序列同一性。在一个实施方案中，该变体与天然序列多肽具有约95％或更大序列同一性。在一个实施方案中，该变体与天然序列多肽具有约98％或更大序列同一性。氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列内部的某些位置处拥有置换、缺失和/或插入。氨基酸由常规名称、单字母代码和三字母代码命名。

[0166] 术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖各种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性。

[0167] 术语“抗体片段”指除完整抗体之外包含完整抗体的一部分的分子，所述部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双体抗体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。

[0168] 术语“生物素”，简写为“BI”，指5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酸。生物素又称作维生素H或辅酶R。

[0169] 术语“双特异性抗体”指具有两种不同(抗原/半抗原)结合特异性的抗体。在一个实施方案中，如本文中报道的双特异性抗体是对两种不同抗原即半抗原和非半抗原性抗原特异的。

[0170] 术语“嵌合”抗体指一种抗体，其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种。

[0171] 抗体的“类”指由其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。存在五个主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。

[0172] 如本文所用，术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破211 131 125 90 186 188
坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At 、I 、I 、Y 、Re 、Re 、
153 212 32 212
Sm 、Bi 、P 、Pb 和Lu的放射性同位素)；化疗剂或化疗药物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、长春碱类生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仓、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、佐柔比星或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如溶核酶；抗生素；毒素如细菌源、真菌源、植物源或动物源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；和下文公开的多种抗肿瘤或抗癌剂。

[0173] 术语“洋地黄毒苷”，简写为“DIG”，指3-[(3S,5R,8R,9S,10S,12R,13S,14S,17R)-3,12,14-三羟基-10,13-二甲基-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,15,16,17-十四氢-环戊[a]-菲-17-基]-2H-呋喃-5-酮(CAS编号1672-46-4)。洋地黄毒苷(DIG)是一种仅存
于植物洋地黄(Digitalis purpurea)、东方毛地黄(Digitalis orientalis)和狭叶毛地黄(Digitalis lanata)(毛地黄)的花和叶中的类固醇(Polya,G.,Biochemical targets of plant bioactive compounds,CRC Press,New York(2003)第847页)。

[0174] 术语“效应子功能”指归因于抗体Fc区的那些生物学活性，这些活性随抗体类别变动。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)；和B细胞活化。

[0175] 术语试剂(例如，药物制剂)的“有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段有效实现所需治疗结果或预防结果的量。

[0176] 木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，各自具有单个抗原结合位点，和一个残余“Fc”片段，该片段的名称反映其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生了具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原的F(ab')2片段。

[0177] Fab片段还含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab'片段因在重链CH1结构域的羧基端处附加额外几个残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段不同。Fab'-SH在本文中是指这样的Fab'，其中恒定域的半胱氨酸残基携带至少一个游离巯基。F(ab')2抗体片段最初作为成对的Fab片段产生，所述成对的Fab片段在它们之间具有铰合半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。

[0178] “Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这个区域由紧密、非共价缔合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种格局中每个可变域的3个高变区相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总体上，这6个高变区向抗体赋予抗原结合特异性。然而，甚至单个可变域(或仅包含抗原特异的3个高变
区的半个Fv)具有识别并结合抗原的能力，虽然以比完整结合位点更低的亲和力进行。

[0179] 术语“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变异Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在
或可以不存在。除非本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据如
Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interes,第5版,Public
Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication
91-3242中所述的EU编号体系，也称作EU索引。

[0180] 术语“荧光素”，简写为“FLUO”，指6-羟-9-(2-羧苯基)-(3H)-呫吨-3-酮，备选地2-(6-羟-3-氧代-(3H)-呫吨-9-基)-苯甲酸。荧光素又称作二酚酞、C.I.45350、溶剂黄94，D&C黄第7号、angiofluor、日本黄201或皂黄。

[0181] 术语“构架”，简写为“FR”，指除高变区(HVR)残基之外的重链及轻链可变域氨基酸残基。可变域的FR通常由以下4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下序列出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-
FR4。

[0182] 术语“游离半胱氨酸氨基酸”指这样的半胱氨酸氨基酸残基，其已经被工程化入亲本抗体中，具有巯基官能团(SH)并且不配对为分子内二硫键。然而，游离半胱氨酸氨基酸可以作为分子内二硫键例如与谷胱甘肽配对。

[0183] 术语“全长抗体”指这样的抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链。天然IgG抗体是由二硫键结合的两条相同轻链和两条相同重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有
一个可变区(VH)，也称作可变重链域或重链可变域，随后是三个恒定域(CH1、CH2和CH3)。
类似地，从N端至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻链域或轻链可变域，随后一个恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列而划分成两种
类型之一，称作κ和λ。

[0184] “全长抗体”是包含VL域和VH域以及轻链恒定域(CL)和重链恒定域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域(例如，人天然序列恒定域)或其氨基酸序列
变体。全长抗体可以具有一种或多种“效应子功能”，所述效应子功能指归因于抗体Fc恒定区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子
包括C1q结合；补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体例如B细胞受体和BCR。

[0185] 术语“半抗原”指仅与大载体如蛋白质连接时才可以激发免疫应答的小分子。示例性半抗原是苯胺、邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸及对氨基苯甲酸、醌、组胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)、肼苯哒嗪、氟烷、铟-DTPA、荧光素、生物素、洋地黄毒苷、茶碱和二硝基酚。在一个实施方案中，半抗原是生物素或洋地黄毒苷或茶碱或碳硼烷。

[0186] 术语“与化合物缀合的半抗原”或“半抗原化化合物”指与又一个部分如多肽或标记物共价连接的半抗原。经常使用活化的半抗原衍生物作为形成这类缀合物的原料。在一个实施方案中，半抗原是洋地黄毒苷并且它经接头(在一个实施方案中通过其3-羟基)与该部分缀合。在一个实施方案中，接头包含a)一个或多个(在一个实施方案中3至6个)
亚甲基-羧基-甲基(-CH2-C(O)-)，和/或b)1至10个(在一个实施方案中1至5个)
氨基酸残基(在一个实施方案中，所述氨基酸残基选自甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸盐，β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸或赖氨酸)，和/或c)一种或多种(在一个实施方案中
一种或两种)具有结构式NH2-[(CH2)nO]xCH2-CH2-COOH的化合物，其中n是2或3并且x是
1至10，在一个实施方案中x是1至7。末尾单元产生(至少部分地)式-NH-[(CH2)nO]
xCH2-CH2-C(O)-的接头(部分)。这种化合物的一个例子例如是12-氨基-4,7,10-三氧杂
十二烷酸(产生TEG(三乙二醇)接头)。在一个实施方案中，接头还包含马来酰亚胺基。
接头具有稳定及增溶作用，原因在于它含有电荷或/并且可以形式氢桥。此外，它可以在空间上促进抗半抗原抗体与半抗原缀合的多肽结合。在一个实施方案中，接头位于多肽的氨基酸的侧链处(例如通过氨基或巯基与赖氨酸或半胱氨酸侧链缀合)。在一个实施方案中，接头位于多肽的氨基端处或羧基端处。接头在多肽上的位置一般选择在不影响多肽生物学活性的区域处。因此，接头的接合位置取决于多肽的性质和负责生物学活性的有关结构要素。可以在体外测定法中检验与半抗原连接的多肽的生物学活性。

[0187] 术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从中衍生的子代，而无论传代次数是多少。子代可以在核酸含量方面不与亲本细胞完全相同，但是可以含有突变。本文中包括突变子代，所述突变子代具有与最初转化的细胞中所筛选或选择的子代相同的功能或生物学活性。

[0188] “人抗体”是这样一种抗体，其拥有对应于人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或从利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源衍生。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

[0189] “人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少1个、并且一般2个可变域的基本上全部部分，其中全部或基本上全部HVR(例如，CDR)与非人抗体的那些对应并且全部或基本上全部FR区与人抗体的那些对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”例如，非人抗体，指已经历过人源化的抗体。

[0190] 如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域的下述每个区域，所述区域在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)，和/或含有抗原接触残基(“抗原触点”)。通常，抗体包含六个HVR；VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。

[0191] 本文中的HVR包括

[0192] (a) 出 现 在 第 26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和 96-101(H3) 氨 基 酸 残 基 处 的 高 变 环 (Chothia,C. 和 Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；

[0193] (b) 出 现 在 第 24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3) 氨 基 酸 残 基 处 的 CDR(Kabat,E.A.等 人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(目的免疫蛋白质的序列)，第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication
91-3242)；

[0194] (c) 出 现 在 第 27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)氨 基 酸 残 基 处 的 抗 原 触 点(MacCallum等 人 ,J.Mol.
Biol.262:732-745(1996))；和

[0195] (d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。

[0196] “个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

[0197] “分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的一种抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述，见，例如，Flatman,S.等人,J.Chrom.B 848(2007)79-87。

[0198] “分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括在细胞内所含的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。

[0199] 如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，即，组成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外(例如，含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现)，这类变体通常以微小的量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制
备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上同质的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生待根据本发明使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。

[0200] 如本文所用，术语“单特异性抗体”指具有一个或多个结合位点的抗体，所述位点的每一个具有相同的结合特异性，即，与相同的抗原或半抗原结合。

[0201] “裸抗体”指不与异源部分(例如，细胞毒部分)或放射标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。

[0202] 术语“包装物插页”用来指治疗产品的商业包装中习惯性包含的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或涉及此类治疗产品用途之警告的信息。

[0203] “亲本抗体”是一种抗体，所述抗体包含从中一个或多个氨基酸残基被一个或多个半胱氨酸残基替换的氨基酸序列。亲本抗体可以包含天然或野生型序列。相对于抗体的其他天然形式、野生型形式或修饰形式，亲本抗体可以具有预先存在的氨基酸序列修饰(如添加、缺失和/或置换)。亲本抗体与半抗原特异性结合。亲本抗体还可以额外地针对目的靶抗原，例如生物学上重要的多肽。还构思针对非多肽抗原的抗体。

[0204] 术语“有效载荷”指希望递送其活性(于)至细胞中和/或定位于细胞处的任何分子或分子组合。有效载荷包括但不限于标记物、细胞毒素(例如假单胞菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素等)、酶、生长因子、转录因子、药物、放射性核素、配体、抗体、脂质体、纳米粒子、病毒粒子、细胞因子等。

[0205] “化疗剂”是用于治疗癌症中的化学化合物。化疗剂的例子包括烷基化剂如塞替派(Thiotepa)和环磷酰胺( )；烷基磺酸酯类如白消安、英丙舒凡
和泊舒凡；氮丙啶类如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞
替派(uredopa)；环乙亚胺类和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜
胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟
甲蜜胺；氮芥类如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仓、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、罗莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素类如阿克拉霉素、放线菌素D、安曲霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、刺孢霉素、卡柔比星(carabicin)、去甲柔红霉素、嗜癌霉素、色霉素(chromomycinis)、更生霉素(dactinomycin)、佐柔比星、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、马塞罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他汀、佐柔比星；抗代谢药如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤和曲美沙特；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素类如卡芦睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨酮戊酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；elfornithine；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基肼；丙卡巴肼；
；丙亚胺；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷，例如紫杉醇( Bristol-Myers
Squibb Oncology,Princeton,NJ)和多西紫杉醇( Rh6ne-Poulenc
Rorer,Antony,法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；长春瑞滨；米托蒽醌；替尼泊苷；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-II；35拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨；和以上任意药物的可药用盐、酸或衍生物。该定义中还包括发挥对肿瘤调节或抑制激素作用的抗激素药如抗雌激素药，例如包括他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香酶的
4(5)-咪唑类、4-羟他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素药如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；
和以上任意药物的可药用盐、酸或衍生物。

[0206] “抗血管生成剂”指一定程度地阻断或干扰血管形成的化合物。抗血管生成剂可以例如是与参与促进血管生成的生长因子或生长因子受体结合的小分子或抗体。在一个实施方案中，抗血管生成因子是与血管内皮生长因子(VEGF)结合的抗体。

[0207] 术语“细胞因子”是用于一个细胞群体所释放的蛋白质的类属术语，所述蛋白质作为细胞间介质作用于另一种细胞。此类细胞因子的例子是淋巴因子类、单核因子类和常规的多肽激素。细胞因子当中包括生长激素如人生长激素、N-甲硫酰人生长激素和牛生长激素；副甲状腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素类如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；缪勒管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子类如NGF-β；血小生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子类(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细
胞-CSF(GCSF)；白介素(IL)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；和其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文所用，术语“细胞因子”包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物学活性等同物。

[0208] 术语“fMLP”指由N-甲酰甲硫氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸组成的三肽。在一个实施方案中，效应子部分是fMLP或其衍生物。

[0209] 术语“前体药物”指药学活性物质的前体或衍生物形式，其中与母体药物相比，所述前体或衍生物对肿瘤细胞具有较低的细胞毒性并且能够酶促地被活化或转变成更有活性的母体形式。参见，例如，Wilman,“Prodrugs in Cancer Chemotherapy(癌症化疗中的前体药物)”Biochemical Society Transactions,第14卷,615th Meeting Belfast(1986),第375-382页和Stella等 人,“Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug
Delivery(前体药物：定向药物递送的化学手段)”,Directed Drug Delivery,Borchardt等人(编著),第247-267页,Human Press(1985)。可以作为效应子部分使用的前体药物
包括但不限于含有磷酸酯的前体药物、含有硫代磷酸酯的前体药物、含有硫酸酯的前体药物、含有肽的前体药物、D-氨基酸修饰的前体药物、糖基化前体药物、含有β-内酰胺的前体药物，任选地含有置换的苯氧乙酰胺的前体药物或任选地置换的苯乙酰胺的前体药物、
5-氟胞嘧啶和其他5-氟尿苷前体药物，这些前体药物可以转变成细胞毒性更强的游离药
物。可以衍生成用于本发明中的前体药物形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于本文所述的那些化疗剂。

[0210] 术语“细胞毒部分”指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。211 131 125 90 186 188 153 212
细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At 、I 、I 、Y 、Re 、Re 、Sm 、Bi 、
32 212
P 、Pb 和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、长春碱类生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仓、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、佐柔比星或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如溶核酶；抗生素；毒素如细菌源、真菌源、植物源或动物源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；和本文公开的多种抗肿瘤或抗癌剂。

[0211] 相对于参考多肽序列，将“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为对齐序列并根据需要引入空位以实现最大序列同源性百分数并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。
为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例
如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。
本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.授权，并
且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区美国版权办公室，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,South San Francisco,加利福尼亚州
可公开获得或可以从源代码汇编。应当将ALIGN-2程序汇编在UNIX操作系统(包括数字
式UNIX V4.0D)上使用。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。

[0212] 在使用ALIGN-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A与、同或针对给定氨基酸序列B(这可以备选地描述为与、同或针对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％是：

[0213] 100乘以分数X/Y

[0214] 其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对结果中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将可以理解在氨基酸序列A
的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对
于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。

[0215] 术语“药物制剂”指一种制备物，所述制备物处于这种形式，从而允许其中所含的有效成分的生物学活性有效，并且不含有对将会施用该制剂的受试者造成不可接受毒性的额外组分。

[0216] “可药用载体”指药物制剂中除有效成分之外对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

[0217] “多肽”是由肽键连接的氨基酸组成的聚合物，无论是天然产生或合成产生。小于约20个氨基酸残基的多肽可以称作“肽”，而由两条或更多条多肽组成或包含超过100个氨基酸残基的一条多肽的分子可以称作“蛋白质”。多肽还可以包含非氨基酸组分，如糖基团、金属离子或羧酸酯。非氨基酸组分可以由在细胞中表达多肽的细胞添加并且可以随细胞类型变动。多肽在本文中根据它们的氨基酸主链结构或编码它们的核酸限定。添加物如糖基团通常不予指定，但然而可以存在。

[0218] 全部多肽序列根据普遍接受的习惯书写，因而α-N端氨基酸残基在左侧并且α-C端氨基酸残基在右侧。如本文所用，术语“N末端”指多肽中氨基酸的游离α-氨基，并且术语“C末端”指多肽中氨基酸的游离α-羧酸末端。N端以某个基团终止的多肽指在N
端氨基酸残基的α-氨基氮上携带基团的多肽。N端以某个基团终止的氨基酸指在α-氨
基氮上携带基团的氨基酸。

[0219] 除非另外指明，否则通过“D”前缀，例如，D-Ala或N-Me-D-Ile或以小写字母样式书写，例如a、i、1(D形式的Ala、Ile、Leu)，本说明书和所附权利要求书中描述的多肽中的氨基酸和氨酰基残基的α-碳的立体化学是天然构型或“L”构型。Cahn-Ingold-Prelog“R”和“S”命名用来规定在多肽的N末端处某些酰基取代基中的手性中心的立体化学。命名“R,S”意在指示两种对映异构形式的外消旋混合物。这种命名法遵循Cahn,R.S.等
人,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.5(1966)385-415中描述的命名法。

[0220] 术语“单链Fv”，简写为“scFv”，指包含抗体VH域和VL域的抗体片段，其中这些结构域存在于单条多肽链中。在一个实施方案中，Fv多肽还包含在VH域和VL域之间的多肽接头，所述多肽接头能够使scFv形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，见
Plueckthun,引自The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg
和Moore(编著),Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。

[0221] 术语“茶碱”，简写为“THEO”，指1,3-二甲基-7H-嘌呤-2,6-二酮。茶碱又称作二甲基黄嘌呤。

[0222] 术语“治疗”(和其语法变型如“医治”或“处理”)指意欲改变正在治疗的个体的天然过程的临床介入，并且可以为了预防或在临床病理学过程期间进行。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，本发明的抗体用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。

[0223] 术语“x-价”，例如“单价”或“二价”或“三价”或“四价”，指抗体分子中存在指定数目(即“x”个)的结合位点。就这一点而论，术语“二价”、“四价”和“六价”指抗体分子中分别存在2个结合位点、4个结合位点和6个结合位点。如本文中报道的双特异性抗体至少是“二价的”并且可以是“三价”或“多价的”(例如“四价”或“六价”)。在一个实施方案中，如本文中报道的双特异性抗体是二价、三价或四价的。在一个实施方案中，该双特异性抗体是二价的。在一个实施方案中，该双特异性抗体是三价的。在一个实施方案中，该双特异性抗体是四价的。

[0224] 在某些方面和实施方案中，如本文中报道的抗体具有两个或更多个结合位点并且是双特异的。即，这些抗体可以是双特异性的，甚至在存在多于两个结合位点的情况下(即该抗体是三价或多价的)也是如此。术语双特异性抗体例如包括，多价单链抗体、双体抗体和三体抗体(triabodies)，以及具有全长抗体的恒定域结构的抗体，其中通过一个或多个肽接头与其他抗原结合位点(例如，单链Fv、VH域和/或VL域、Fab或(Fab)2)连接。抗体可以是来自单一物种的全长抗体或经嵌合化或人源化。对于具有多于两个抗原结合位点的抗体，一些结合位点可以是相同的，只要该蛋白质具有针对两种不同抗原的结合位点。即，在第一结合位点对半抗原特异的情况下，第二结合位点对非半抗原性抗原特异，并且反之亦然。

[0225] 术语“可变区”指抗体重链或轻链的参与抗体结合其抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt,T.J.等人,Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，N.Y.(2007)第91页)。单个VH域或VL结构域可能足以赋予
抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL
结构域分离以分别筛选互补性VL结构域或VH域文库。参见，例如，Portolano,S.等人,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人,Nature 352(1991)624-628)。

[0226] 术语“载体”指能够增殖与之连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入宿主细胞的基因组中的载体，其中已经向所述细胞中引入所述载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。

[0227] II.如本文中报道的缀合物

[0228] 在一个方面，本发明基于如下研究结果：可以通过以下方式获得包含抗原和与该抗原特异性结合的抗体的共价缀合物：在抗原中恰当安置的官能团和抗体可变域中尤其抗体CDR2中包含官能团的氨基酸残基之间形成共价键，其中根据Kabat的重链可变域编号法确定CDR2。

[0229] 在某些实施方案中，该抗原是半抗原。在一个实施方案中，该半抗原是生物素、或洋地黄毒苷、或荧光素、或茶碱、或碳硼烷。

[0230] 在一个实施方案中，该抗原是半抗原化化合物。在一个实施方案中，该半抗原化化合物是包含半抗原、接头和有效载荷的缀合物。在一个实施方案中，该半抗原是生物素、或洋地黄毒苷、或荧光素、或茶碱、或碳硼烷。

[0231] 在某些实施方案中，该官能团可以含有缺电子双键或巯基。在一个实施方案中，该官能团是马来酰亚胺或半胱氨酸。

[0232] 在本发明的某些方面，提供与洋地黄毒苷特异性结合的抗体。

[0233] 在本发明的某些方面，提供与生物素特异性结合的抗体。

[0234] 在本发明的某些方面，提供与茶碱特异性结合的抗体。

[0235] 由于可以使用如本文中报道的缀合物作为人类中的治疗药，本文还提供上述针对洋地黄毒苷、生物素和茶碱的抗体的人源化变体。

[0236] 半抗原-多肽缀合物(半抗原化化合物)和抗半抗原抗体的共价缀合物可以向多肽赋予良好的生物物理特性和改进的PK特性。另外，在使用多肽双特异性抗体的情况下，该缀合物可以用来将多肽靶向至细胞，其中所述细胞展示被双特异性抗体的第二结合特异性识别的抗原。这类缀合物由一种抗半抗原结合特异性和一种(非半抗原性)抗原结合特
异性组成。抗体对半抗原-多肽缀合物的化学计量比取决于双特异性抗体的样式并且可以是1:1、1:2、2:1、2:2、2:4和4:2(抗体:半抗原-多肽)。

[0237] 想要的是多肽保留良好生物学活性，尽管与半抗原缀合以及与抗体缀合。还想要的是(在双特异性靶向模块的情况下)，双特异性抗体的细胞表面靶结合位点在共价缀合的半抗原化化合物存在下保留其结合特异性和亲和力。

[0238] 抗原(半抗原)中的反应基团在可以是任何反应基团，如例如马来酰亚胺，例如N-乙基马来酰亚胺(NEM)、碘乙酰胺、吡啶基二硫化物或其他反应性缀合配偶
物(参见例如Haugland,2003,Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes
and Research Chemicals,Molecular Probes,Inc.；Brinkley,1992,Bioconjugate
Chem.3:2；Garman,1997,Non-Radioactive Labeling:A Practical Approach,Academic Press,London；Means(1990)Bioconjugate Chem.1:2；Hermanson,G. 引 自Bioconjugate Techniques(1996)Academic Press,San Diego,第40-55页和第643-671页)。

[0239] 抗体上的反应基团限于可以选择性即位置特异性生成的那些。因此，它限于氨基酸残基半胱氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的侧链基团。

[0240] 为了在抗体和抗原/半抗原之间形成共价缀合物，不得不通过引入反应基团修饰两种化合物。一旦抗体结合抗原/半抗原，则使得两个反应基团紧邻，引起共价键形成。在一个实施方案中，这种修饰是在每种化合物中引入巯基功能。在一个实施方案中，该巯基化合物是半胱氨酸残基。

[0241] 待突变的位置必须同时满足两个要求：(i)偶联位置应当靠近结合区以利用抗原/半抗原安置效应以定向偶联，和(ii)突变位置和偶联位置必须以不影响抗原/半抗原结合本身的方式安置。找到合适位置的这些要求是事实上彼此‘矛盾’，因为要求(i)由接近于结合位点的位置最佳满足，同时要求(ii)最安全地由远离结合位点的位置实现。

[0242] 尽管这些实际上排他性的要求，仍鉴定到可以在不影响半抗原安置的情况下突变，然而同时允许定向共价偶联的位置。

[0243] 根据重链可变域的Kabat编号法，第一位置分别位于位置VH52b处或位置VH53处。如果抗体具有不含有居间残基(如52a、52c、52c和52d)的短VH CDR2，则该位置是
53(根据Kabat的抗体重链可变域编号方案和规则编号和对齐)。如果抗体具有包含残基
52a和52b并且还任选包含残基如52c和52d等的长VH CDR2，则该位置是52b(根据Kabat
的抗体重链可变域编号方案和规则编号和对齐)。

[0244] 根据Kabat编号法，第二位置是位于位置VH28处。

[0245] 例如，在抗洋地黄毒苷抗体结构中，半抗原结合于疏水性残基形成的深口袋中。在这项结晶学研究中使用荧光洋地黄毒苷-Cy5缀合物，其中荧光团以及洋地黄毒苷和Cy5之间的接头在结构中不可见，原因在于高度灵活性和所致的晶体中无序性。然而，接头和Cy5与指向重链的CDR2方向的洋地黄毒苷的O32连接。在洋地黄毒苷的O32与根据Kabat的位置52b中氨基酸残基的Cα之间的距离是约 。

[0246] 已经发现该位置是“通用”位置，即，该位置适用于任何(抗半抗原)抗体并且因此，不需要每次从零开始，不得不通过提供晶体结构和确定能够进行半抗原定向共价偶联的适宜位置，修饰新(抗半抗原)抗体。

[0247] 根据Kabat编号方案，突变VH52bC或VH53C分别可以出乎意料地用于每种所分析的结合半抗原的抗体。即使抗体及其结合袋的结构相当多样，仍已经显示VH52bC/VH53C突变可以用于抗原/半抗原与结合洋地黄毒苷、生物素、荧光素以及茶碱的抗体共价接合。因此，已经进一步发现在无需进一步结构设计或知晓具体抗体结构并且不干扰抗体可变域内在结合特性的情况下，将根据Kabat编号法的位置VH52b/VH53处的氨基酸残基(该残基位
于抗体重链的CDR2内部)变成半胱氨酸适用于其他(抗半抗原)抗体。

[0248] 如本文中报道的修饰的抗体保留其亲本(即野生型)抗体对应物的半抗原(抗原)结合能力。因此，该工程化抗体能够结合，在一个实施方案中，它能够与特异性结合半抗原(抗原)。

[0249] 术语“结合特异性”或“与…结合的抗体”指包含结合特异性的分子或可以与其他分子以特异性方式形成复合物的抗体。这种结合可以在体外测定法中如在等离子体共振测定法(BIAcore，GE-Healthcare Uppsala，瑞典)中检测到。复合物形成的亲和力由术语ka(化合物缔合以形成复合物的速率常数)、kD(解离常数，复合物解离)和KD(kD/ka)定义。
-8 -8 -13
结合或特异性结合意指约10 M或更小、在一个实施方案中约10 M至约10 M、在一个实施
-9 -13
方案中约10 M至约10 M的结合亲和力(KD)。因此，与半抗原结合以形成如本文中报道的
-8 -8 -13
复合物的抗体以约10 mol/l或更小、在一个实施方案中约10 mol/l至约10 mol/l、在一
-9 -13
个实施方案中以约10 mol/l至10 mol/l的结合亲和力(KD)与半抗原特异性结合。

[0250] 已经发现如果形成的键是二硫键，当不要求添加还原剂和/或氧化剂的情况下抗体与半抗原结合时，则在半胱氨酸修饰的抗体和半胱氨酸修饰的半抗原-多肽缀合物之间形成共价键，其中所述半胱氨酸修饰的半抗原-多肽缀合物在半抗原和多肽之间的接头中携带半胱氨酸残基。因此，当形成非共价复合物时，两种化合物之间的二硫键自发地形成。因此，一种用于形成如本文中报道的共价复合物的方法仅需要混合这两种化合物。形成二硫键的唯一先决条件是两种化合物彼此正确取向。

[0251] 如本文中报道的工程化抗体可以位点特异地和有效地与包含反应基团的半抗原偶联。

[0252] 将(根据Kabat编号方案)在位置VH52b和VH53处的氨基酸残基分别替换为Cys残基，产生了具有在抗洋地黄毒苷抗体-VH52bC的SEQ ID NO:20和28中、抗茶碱抗
体-VH53C的SEQ ID NO:84和92、抗生物素抗体-VH53C的SEQ ID NO:52和60中和抗荧光
素抗体-VH52bC的SEQ ID NO:10中列出的重链可变区序列的抗体衍生物。

[0253] 将(根据Kabat编号方案)在位置VH28处的重链可变域氨基酸残基替换为Cys残基，产生了具有分别在SEQ ID NO:116、124、132、140、148、156和164中列出的重链可变区序列的抗体衍生物。

[0254] 如本文中报道的一个方面是作为人源化抗体的抗洋地黄毒苷抗体。

[0255] 在如本文中报道的一个方面，提供一种抗洋地黄毒苷抗体，其包含至少1、2、3、4、5或6个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:09或25的氨基酸序列的重链CDR1、(b)包含SEQ ID NO:10或26的氨基酸序列的重链CDR2、(c)包含SEQ ID NO:11或27的氨基酸序
列的重链CDR3、(d)包含SEQ ID NO:13或29的氨基酸序列的轻链CDR1、(e)包含SEQ ID
NO:14或30的氨基酸序列的轻链CDR2和(f)包含SEQ ID NO:15或31的氨基酸序列的轻
链CDR3。

[0256] 如本文中报道的一个方面是作为人源化抗体的抗生物素抗体。

[0257] 在如本文中报道的一个方面，提供一种抗生物素抗体，其包含至少1、2、3、4、5或6个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:41或57的氨基酸序列的重链CDR1、(b)包含SEQID NO:42或58的氨基酸序列的重链CDR2、(c)包含SEQ ID NO:43或59的氨基酸序列的重
链CDR3、(d)包含SEQ ID NO:45或61的氨基酸序列的轻链CDR1、(e)包含SEQ ID NO:46或
62的氨基酸序列的轻链CDR2和(f)包含SEQ ID NO:47或64的氨基酸序列的轻链CDR3。

[0258] 如本文中报道的一个方面是一种抗荧光素抗体，其包含至少1、2、3、4、5或6个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:105或113的氨基酸序列的重链CDR1、(b)包含SEQ IDNO:106或114的氨基酸序列的重链CDR2、(c)包含SEQ ID NO:107或115的氨基酸序列
的重链CDR3、(d)包含SEQ ID NO:109或117的氨基酸序列的轻链CDR1、(e)包含SEQ ID
NO:110或118的氨基酸序列的轻链CDR2和(f)包含SEQ ID NO:111或119的氨基酸序列
的轻链CDR3。

[0259] 如本文中报道的一个方面是抗茶碱抗体。在一个实施方案中，该抗茶碱是人源化抗体。

[0260] 在一个实施方案中，提供一种抗茶碱抗体，其包含至少1、2、3、4、5或6个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:73或89的氨基酸序列的重链CDR1、(b)包含SEQ ID NO:74或90的氨基酸序列的重链CDR2、(c)包含SEQ ID NO:75或91的氨基酸序列的重链CDR3、(d)
包含SEQ ID NO:77或93的氨基酸序列的轻链CDR1、(e)包含SEQ ID NO:78或94的氨基
酸序列的轻链CDR2和(f)包含SEQ ID NO:79或95的氨基酸序列的轻链CDR3。

[0261] 如本文中报道的一个方面是一种抗洋地黄毒苷抗体，其包含了(a)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VH CDR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO:09或25的氨基酸序列的重链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:10或26的氨基酸序列的重链CDR2和(iii)
包含SEQ ID NO:11或27的氨基酸序列的重链CDR3；以及(b)包含至少1个、至少2个或
全部3个选自以下的VL CDR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO:13或29的氨基酸序列的
轻链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:14或30的氨基酸序列的轻链CDR2和(iii)包含SEQ ID
NO:15或31的氨基酸序列的轻链CDR3。

[0262] 如本文中报道的一个方面是一种抗生物素抗体，其包含了(a)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VH CDR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO:41或57的氨基
酸序列的重链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:42或58的氨基酸序列的重链CDR2和(iii)包
含SEQ ID NO:43或59的氨基酸序列的重链CDR3；以及(b)包含至少1个、至少2个或全
部3个选自以下的VL CDR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO:45或61的氨基酸序列的轻
链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:46或6242的氨基酸序列的轻链CDR2和(iii)包含SEQ ID
NO:47或63的氨基酸序列的轻链CDR3。

[0263] 如本文中报道的一个方面是一种抗荧光素抗体，其包含了(a)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VH CDR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO:105或113的氨基酸
序列的重链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:106或114的氨基酸序列的重链CDR2和(iii)包
含SEQ ID NO:107或115的氨基酸序列的重链CDR3；以及(b)包含至少1个、至少2个或全
部3个选自以下的VL CDR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO:109或117的氨基酸序列的
轻链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:110或118的氨基酸序列的轻链CDR2和(iii)包含SEQ
ID NO:111或119的氨基酸序列的轻链CDR3。

[0264] 如本文中报道的一个方面是一种抗茶碱抗体，其包含了(a)包含至少1个、至少2个或全部3个选自以下的VH CDR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO:73或89的氨基酸序列的重链CDR1、(ii)包含SEQ ID NO:74或90的氨基酸序列的重链CDR2和(iii)包含SEQ
ID NO:75或91的氨基酸序列的重链CDR3；以及(b)包含至少1个、至少2个或全部3个选
自以下的VL CDR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO:77或93的氨基酸序列的轻链CDR1、
(ii)包含SEQ ID NO:78或94的氨基酸序列的轻链CDR2和(iii)包含SEQ ID NO:79或
95的氨基酸序列的轻链CDR3。

[0265] 在前述任一方面和实施方案中，抗洋地黄毒苷抗体和/或抗生物素抗体和/或抗茶碱抗体是人源化的。

[0266] 在一个实施方案中，抗洋地黄毒苷抗体包含如前述任一方面和/或实施方案中的CDR，并且还包含人接纳体构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。

[0267] 在一个实施方案中，抗生物素抗体包含如前述任一方面和/或实施方案中的CDR，并且还包含人接纳体构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。

[0268] 在一个实施方案中，抗茶碱抗体包含如前述任一方面和/或实施方案中的CDR，并且还包含人接纳体构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。

[0269] 如本文中报道的另一个方面是包含与SEQ ID NO:04或12或20或28的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列的抗洋地黄毒苷抗体。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗洋地黄毒苷抗体保留与洋地黄毒苷结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:01或09或17或25中置换、插入和
/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失出现在CDR外部的
区域内(即，在FR中)。任选地，抗洋地黄毒苷抗体包含在SEQ ID NO:01或09或17或25
中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。

[0270] 如本文中报道的另一个方面是包含与SEQ ID NO:08或16或24或32的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)的抗洋地黄毒苷抗体。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗洋地黄毒苷抗体保留与洋地黄毒苷结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:08或16或24或32中置换、插入和/或
缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失出现在CDR外部的区域
内(即，在FR中)。任选地，抗洋地黄毒苷抗体包含在SEQ ID NO:08或16或24或32中的
VL序列，包括该序列的翻译后修饰。

[0271] 如本文中报道的另一个方面是包含与SEQ ID NO:36或44或52或60的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列的抗生物素抗体。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗生物素抗体保留与生物素结合的能力。
在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:36或44或52或60中置换、插入和/或缺失总计1
至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失出现在CDR外部的区域内(即，在FR中)。任选地，抗生物素抗体包含在SEQ ID NO:36或44或52或60中的VH序列，包括该序
列的翻译后修饰。

[0272] 如本文中报道的另一个方面是包含与SEQ ID NO:108或116的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列的抗荧光素抗体。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗荧光素抗体保留与荧光素结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:108或116中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基
酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失出现在CDR外部的区域内(即，在FR中)。任选地，抗荧光素抗体包含SEQ ID NO:108或116中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。

[0273] 如本文中报道的另一个方面是包含与SEQ ID NO:68或76或84或92的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列的抗茶碱抗体。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗茶碱抗体保留与茶碱结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:68或76或84或92中置换、插入和/或缺失总计1至10
个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失出现在CDR外部的区域内(即，在FR中)。
任选地，抗茶碱抗体包含在SEQ ID NO:68或76或84或92中的VH序列，包括该序列的翻
译后修饰。

[0274] 如本文中报道的另一个方面是一种抗洋地黄毒苷抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任一个方面和/或实施方案中的VH和如上文提供的任一个方面和/或实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO:04或12或20或28和SEQ ID
NO:08或16或24或32中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。

[0275] 如本文中报道的另一个方面是一种抗生物素抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任一个方面和/或实施方案中的VH和如上文提供的任一个方面和/或实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO:36或44或52或60和SEQ ID NO:40或
48或56或64中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。

[0276] 如本文中报道的另一个方面是一种抗荧光素抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任一个方面和/或实施方案中的VH和如上文提供的任一个方面和/或实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO:108或116和SEQ ID NO:112或120中
的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。

[0277] 如本文中报道的另一个方面是一种抗茶碱抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任一个方面和/或实施方案中的VH和如上文提供的任一个方面和/或实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO:68或76或84或92和SEQ ID NO:72或
80或88或96中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。

[0278] 被鉴定为修饰点的又一个位置是根据Kabat编号的第VH28位置。

[0279] 将根据Kabat的在位置VH28处的氨基酸替换为Cys，产生了具有作为抗洋地黄毒苷抗体-VH28C的SEQ ID NO:124和132、抗茶碱抗体-VH28C的SEQ ID NO:156和164、抗
生物素抗体-VH28C的SEQ ID NO:140和148和抗荧光素抗体-VH28C的SEQ ID NO:116列
出的重链可变区序列的抗体衍生物。

[0280] ESI-MS分析显示半抗原化治疗性肽的共价抗体缀合产生具有所定义的大小的缀合物，所述缀合物大于未复合的抗体或未复合的肽。

[0281] 表1：TIC表

[0282]

[0283]

[0284] 1)HC w N端焦谷氨酸

[0285] 2)HC w/o C端Lys

[0286] 3)在糖基化位点处因去糖基化所致的HC w N->D

[0287] 4)LC w N端焦谷氨酸

[0288] 抗体亲和力

[0289] 在某些实施方案中，如本文中报道的抗体本身或如本文中报道的复合物中的抗体-8 -8具有≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如约10 M或更小，例如从约10 M-13 -9 -13
至约10 M，例如，从约10 M至约10 M)的解离常数(Kd)。

[0290] 在一个实施方案中，通过放射标记的抗原结合测定法(RIA)测量Kd，所述测定法用目的抗体的Fab形式和其抗原如以下测定法所述那样进行。通过以下方式测量FAB对抗125
原的溶液结合亲和力：在未标记抗原的滴定系列存在下用最低浓度的( I)的标记抗原平
衡Fab，随后用抗Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原(参见，例如，Chen,Y.等人，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。为了建立用于测定法的条件，将 多孔板
(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/mL抗Fab捕获抗体(Cappel Labs)
包被过夜并随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(大约23℃)封闭2至5小时。
125
在不吸附性平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[ I]-抗原与目的Fab的连续稀释物
(例如，与Presta,L.G.等人,Cancer Res.57(1997)4593-4599中评估抗VEGF抗体Fab-12
一致)混合。随后将目的Fab温育过夜；然而，温育可以持续较长时间(例如，约65小时)
以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获平板以便在室温温育(例如，1小时)。随后移除溶液并将平板用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20(TWEEN- )洗涤8次。当平板已经
TM TM
干燥时，添加150μl/孔闪烁体(MICROSCINT-20 ；Packard)，并且将平板在TOPCOUNT γ计数器(Packard)上计数10分钟。选择产生小于或等于20％最大结合的每种Fab的浓度
用于竞争性结合测定法中。

[0291] 根据另一个实施方案，使用表面等离子体共振测定法，例如使用或 (BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃
采用固定抗原CM5芯片以约10个响应单位(RU)，测量Kd。简而言之，根据供应商说明书，以盐酸N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧
甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。抗原用10mM乙酸钠，pH 4.8稀释至
5μg/ml(约0.2μM)，随后以5μl/分钟的流速上样以实现偶联蛋白的大约10个响应单位
(RU)。在抗原上样后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以大TM
约25μl/分钟的流速注入含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20 )表面活性剂的PBS(PBST)
中的Fab 2倍连续稀释物(例如，0.78nM至500nM)。使用简单一对一Langmuir结合模型
( 评价软件3.2版)，通过同时拟合缔合和解离传感图(sensorgram)，计算
缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon比。参见，例如，Chen,Y.等人,J.Mol.Biol.293(1999)865-881。如果通过以上表面等离子体共振测定法显
6 -1 -1
示缔合速率超过10M s ，则可以使用荧光猝灭技术测定缔合速率，其中在如光谱仪(如配备止流阀(stop-flow)的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌型比色皿的8000-系
TM
列SLM-AMINCO 分光光度计(ThermoSpectronic))中所测量的增加浓度的抗原存在下，所
述荧光猝灭技术在25℃测量在PBS,pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射
强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)增加或减少。

[0292] 抗体片段

[0293] 在某些实施方案中，本文提供的或在如本文中报道的缀合物中的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段和下文描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134。
关于scFv片段的综述，见例如Plueckthun,A.,引自The Pharmacology of Monoclonal
Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore(编著),(Springer-Verlag,New York(1994),
第269-315页；还见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救
受体(salvage receptor)结合表位残基和具有增加的体内半寿期的Fab和F(ab')2片段
的讨论，见US 5,869,046。

[0294] 双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述两个抗原结合位点可 以是 二价 或双 特异 的。 见，例 如，EP 0404097；WO 1993/01161；Hudson,P.J. 等 人，Nat.Med.9(2003)129-134； 和 Holliger,P. 等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 90(1993)6444-6448。 三 体 抗 体 和 四 体 抗 体 还 在Hudson,P.J.等 人 ,Nat.Med.9(20039129-134)中描述。

[0295] 单一结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变域或全部或一部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单一结构域抗体是人单一结构域抗体
(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见，例如，US 6,248,516)。

[0296] 可以通过多种技术产生抗体片段，所述多种技术包括但不限于蛋白酶解消化完整抗体以及由重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。

[0297] 嵌合抗体和人源化抗体

[0298] 在某些实施方案中，本文提供的抗体或在如本文中报道的缀合物中的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在US 4,816,567；和Morrison,S.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855)中描述。在一个例子中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类如猴的可变区)和人类恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已经相对亲本抗体发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

[0299] 在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。一般地，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含其中HVR(例如，CDR)(或其部分)衍生自非人类抗体并且FR(或其部分)衍生自人抗体序列的一个或多个可变域。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基置换为来自非人类抗体(例如，从中衍生HVR残基的抗
体)的相应残基，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

[0300] 人源化抗体和制造它们的方法例如在Almagro，J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633 中 综 述，并 且 例 如 在 Riechmann,I. 等 人 ,Nature
332(1988)323-329；Queen,C.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri,S.V.等人,Methods
36(2005)25-34(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua,W.F.等人,Methods 36(2005)43-60(描述“FR改组”)；
和 Osbourn,J. 等 人 ,Methods 36(2005)61-68 以 及 Klimka,A. 等 人 ,Br.J.Cancer
83(2000)252-260(描述针对FR改组的“导向选择”方案)中进一步描述。

[0301] 可以用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳配合”方法选择的构架区(例如，见Sims,M.J.等人,J.Immunol.151(1993)2296-2308)；从特定亚组的
人抗体的轻链可变区或重链可变区的共有序列衍生的构架区(例如，见Carter,P.
等 人 ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289； 和 Presta,L.G. 等 人 ,J.
Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(例如，见
Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和从筛选FR文库衍生的构架区(例如，见Baca,M.等人,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok,M.J.等
人,J.Biol.Chem.271(1996)22611-22618)。

[0302] 人抗体

[0303] 在某些实施方案中，本文提供的抗体或在如本文中报道的缀合物中的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体总体上在van Dijk,M.A.和van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374 以 及 Lonberg,N.,Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459中描述。

[0304] 可以通过施用免疫原至转基因动物制备人抗体，其中所述转基因动物已经被修饰成响应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物一般含有替换内源免疫球蛋白基因座或在染色体外存在或随机整合入动物染色体的全部或部分人免疫球蛋白基因座。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,N.,Nat.Biotech.23(2005)1117-1125。例TM
如，还参见描述XENOMOUSE 技术的US 6,075,181和US 6,150,584；描述 技术
的US 5,770,429；描述K-M 技术的US 7,041,870和描述
技术的US 2007/0061900。可以进一步修饰来自这类动物产生的完整抗体的人可变区，例如，通过与不同的人类恒定区组合。

[0305] 也可以通过基于杂交瘤的方法产生人抗体。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系。(例如，参见Kozbor,D.,J.
Immunol.133(1984)3001-3005；Brodeur,B.R. 等 人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987),第51-63页；和
Boerner,P.等人,J.Immunol.147(1991)86-95)。在Li,J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 103(2006)3557-3562中也描述了借助人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体。额外的方
法包括例如在美国专利号7,189,826(其描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和
Ni,J.,Xiandai Mianyixue 26(2006)265-268(其描述人-人杂交瘤)中描述的那些方法。
在Vollmers,H.P.和Brandlein,S.,Histology和 Histopathology 20(2005)927-937和
Vollmers,H.P.和Brandlein,S.,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(2005)185-191中也描述了人杂交瘤技术(三体瘤技术)。

[0306] 也可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库选出的Fv克隆可变域序列产生人抗体。这类可变域序列随后可以与所需的人恒定域组合。下文描述用于从抗体文库选出人抗体的技术。

[0307] 文库衍生的抗体

[0308] 可以通过对组合文库筛选具有所需活性或多种活性的抗体，分离本发明的抗体或在如本文中报道的缀合物中的抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库并对这类文库筛选拥有所需结合特征的抗体的多种方法。这类方法例如在H.R.等人,Methods
in Molecular Biology 178(2001)1-37中综述并且例如在McCafferty,J.等人,Nature
348(1990)552-554；Clackson,T.等人,Nature 352(1991)624-628；Marks,J.D.等人,J.
Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks,J.D. 和 Bradbury,A.,Methods in Molecular
Biology 248(2003)161-175；Sidhu,S.S. 等 人,J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee,C.V. 等 人 ,J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
101(2004)12467-12472和Lee,C.V.等人,J.Immunol.Methods 284(2004)119-132中进一
步描述。

[0309] 在某些噬菌体展示法中，VH基因库和VL基因库分别由聚合酶链反应(PCR)克隆并且在噬菌体文库中随机重组，随后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合性噬菌体，
如Winter,G.等人,Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455中所述。噬菌体一般将抗体片
段展示为单链Fv(scFv)片段或展示为Fab片段。来自已免疫来源的文库提供针对免疫
原的高亲和力抗体，无需构建杂交瘤。备选地，可以(例如，从人)克隆天然库以便在不
作任何免疫的情况下，提供针对广泛类型非自身抗原和另外针对广泛类型自身抗原的抗
体的单一来源，如Griffiths,A.D.等人,EMBO J.12(1993)725-734所述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V-基因区段并使用含有随机序列的PCR引物以编码高度可变
的CDR3区并实现体外重排，合成地产生天然文库，如Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,J.
Mol.Biol.227(1992)381-388所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布例如包括：美
国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、
2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。

[0310] 将从人抗体文库分离的抗体或抗体片段视为本文中的人抗体或人抗体片段。

[0311] 抗体样式

[0312] 上文概述的抗体和抗体片段可以按多种方式组合以产生不同的抗体样式。

[0313] 例如，一个或多个scFv抗体片段可以与完整抗体的一条或多条多肽链的C端融合。scFv抗体片段可以尤其与每个重链C端或与每个轻链C端融合。

[0314] 例如，一个或多个Fab抗体片段可以与完整抗体的一条或多条多肽链的C端融合。Fab抗体片段可以尤其与每个重链C端或与每个轻链C端融合。

[0315] 例如，一个scFv和一个抗体Fab片段可以与抗体Fc区的N端融合。

[0316] 例如，一个scFv和一个抗体Fab片段可以与抗体Fc区的N端融合，且一个scFv或抗体Fab片段可以与抗体Fc区的相应另一条链的C端融合。

[0317] 多特异性抗体

[0318] 已经开发了类型广泛的重组抗体样式，例如由如IgG抗体样式与单链结构域融合的四价双特异性抗体(见例如Coloma,M.J.等人,Nature Biotech 15(1997)159-163；WO2001/077342；和Morrison,S.L.,Nature Biotech 25(2007)1233-1234)。

[0319] 另外，已经开发了其中不再留下抗体核心结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的几种其他样式，如双体、三体或四体抗体、微型抗体、能够结合两种或更多种抗原的几种单链形式(scFv、双scFv)(Holliger,P.等人,Nature Biotech 23(2005)1126-1136；Fischer,N.,Léger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14；Shen,J.等人,Journal of Immunological Methods 318(2007)65-74；Wu,C.等人,Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。

[0320] 全部这类样式均使用接头以使抗体核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)与其他结合蛋白(例如scFv)融合或以使例如两个Fab片段或scFv融合(Fischer,N.和
Léger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14)。应当牢记通过维持与天然存在抗体的高程度相似性，可能想要保留通过Fc受体结合介导的效应子功能，例如补体依赖的细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。

[0321] 在WO2007/024715中报道了作为工程化多价和多特异性结合蛋白的双重可变域免疫球蛋白。在US 6,897,044中报道了一种用于制备生物学上有活性的抗体二聚体的方
法。在US 7,129,330中报道了具有至少4个可变域的多价FV抗体构建体，所述可变域各
自通过肽接头连接。在US 2005/0079170中报道了结合抗原的二聚体和多聚体结构。在US
6,511,663中报道了包含彼此通过连接结构共价连接的3个或4个Fab片段的三价或四价
单特异性抗原结合蛋白，所述蛋白质不是天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中报道了可以在原核细胞和真核细胞中高效表达并且可用于治疗方法和诊断方法中的四价双特异性
抗体。在US 2005/0163782中报道了一种分离或偏好地合成二聚体的方法，其中所述二聚体通过源于不借助来自下述混合物的至少一个链间二硫键连接的二聚体中的至少一个链
间二硫键连接，所述混合物包含两种类型的多肽二聚体。在US 5,959,083中报道了双特异性四价受体。在WO 2001/077342中报道了具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程
化抗体。

[0322] 在WO 1997/001580中报道了结合抗原的多特异性和多价多肽。WO 1992/004053报道了同型缀合物，一般从与相同抗原决定簇结合并且通过合成性交联过程共价连接的
IgG类单克隆抗体制备。在WO1991/06305中报道了对抗原具有高亲合力的寡聚单克隆抗
体，其中分泌寡聚物(一般为IgG类)，所述寡聚物具有缔合在一起以形成四价或六价IgG
分子的两个或更多个免疫球蛋白单体。在US6,350,860中报道了来自绵羊的抗体和工程化抗体构建体，它们可以用来治疗其中干扰素γ活性致病的疾病。在US 2005/0100543中报道了可靶向构建体，它们是双特异性抗体的多价载体，即，可靶向构建体的每个分子可以充当两个或更多个双特异性抗体的载体。在WO 1995/009917中报道了基因修饰的双特异性
四价抗体。在WO 2007/109254中报道了由稳定化scFv组成或包含稳定化scFv的稳定化
结合分子。

[0323] 在某些实施方案中，本文提供的抗体或在如本文中报道的缀合物中的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，所述结合特异性之一针对半抗原并且另一种特异性针对任何其他(非半抗原性)抗原。双特异性抗体也可以用来将细胞毒性剂定位至细胞。可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段。

[0324] 用于产生多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(见Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature305(1983)537-540,WO
93/08829 和 Traunecker,A. 等 人 ,EMBO J.10(1991)3655-3659) 和“隆 突 入 穴
(knob-in-hole)”工程化(例如，见美国专利号5,731,168)。也可以通过以下方式产生多特异性抗体：工程化静电转向效应用于产生抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(例如，见美国专利号4,676,980，和Brennan,M.等人，Science
229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(例如，见Kostelny,S.A.等人，J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用“双体抗体(diabody)”技术以产生双特异性抗体片段(例如，见Holliger,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(例如，见Gruber,M.等人，J.Immunol.152(1994)5368-5374)；以及制备三特异性抗体，如在例如Tutt,A.等人，J.Immunol.147(1991)60-69)中所述那样。

[0325] 在一个实施方案中，通过“隆突进入穴(knob-into-hole)”技术改变双特异性抗体的重链的CH3域，所述技术以例如WO 96/027011、WO 98/050431、Ridgway
J.B. 等 人 ,Protein Eng.9(1996)617–621、Merchant,A.M. 等 人 ,Nat Biotechnol
16(1998)677-681中的几个例子详述。在这种方法中，改变两个CH3域的相互作用表面以
增加含有这两个CH3域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3域的一者可以是
“隆突”，而另一者是“穴”。二硫键的引入使异二聚体稳定化(Merchant,A.M等人,Nature Biotech 16(1998)677-681，Atwell,S.等人,J.Mol.Biol.270(1997)26–35)并增加产量。

[0326] 在全部方面的一个实施方案中，双特异性抗体特征在于

[0327] -一条重链的CH3域和另一条重链的CH3域各自在包含抗体CH3域之间的初始界面的界面处会合，

[0328] 其中改变所述界面以促进双特异性抗体的形成，其中所述改变特征在于

[0329] a)改变一条重链的CH3域，

[0330] 从而在双特异性抗体内部的、会合另一条重链的CH3域的初始界面的一条重链的CH3域的初始界面内部，将氨基酸残基替换为具有更大侧链体积的氨基酸残基，由此在一个重链的CH3域的界面内部产生突出部分，所述突出部分是在另一个重链的CH3域的界面内部的空穴中可放置的。

[0331] 和

[0332] b)改变另一条重链的CH3域，

[0333] 从而在双特异性抗体内部的、会合第一CH3域的初始界面的第二CH3域的初始界面内部，将氨基酸残基替换为具有更小侧链体积的氨基酸残基，因而在第二CH3域的界面内部产生空穴，所述空穴内部是在第一CH3域的界面内部的突出部分可放置的。

[0334] 因此，在一个实施方案中，如本文中报道的抗体特征在于

[0335] -全长抗体的第一重链的CH3域和全长抗体的第二重链的CH3域各自在包含抗体CH3域之间的初始界面中的改变的界面处会合，

[0336] 其中i)在第一重链的CH3域中

[0337] 将氨基酸残基替换为具有更大侧链体积的氨基酸残基，因而在一个重链的CH3域的界面内部产生突出部分，所述突出部分是在另一个重链的CH3域的界面内部的空穴中可放置的。

[0338] 并且其中ii)在第二重链的CH3域中

[0339] 将氨基酸残基替换为具有更小侧链体积的氨基酸残基，因而在第二CH3域的界面内部产生空穴，在所述空穴内部突出部分是在第一CH3域的界面内部可放置的。

[0340] 在一个实施方案中，具有更大侧链体积的氨基酸残基选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

[0341] 在一个实施方案中，具有更小侧链体积的氨基酸残基选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)。

[0342] 在一个实施方案中，通过以下方式进一步改变两个CH3域：引入半胱氨酸(C)作为每个CH3域的相应位置中的氨基酸，从而两个CH3域之间的二硫键可以形成。

[0343] 在一个实施方案中，双特异性抗体在“隆突链”的CH3域中包含T366W突变并且在“穴链”的CH3域中包含T366S、L368A、Y407V突变。也可以使用CH3域之间的额外链
间二硫键((Merchant,A.M等人,Nature Biotech 16(1998)677-681)，例如通过向“隆突
链”的CH3域引入Y349C突变并向“穴链”的CH3域引入E356C突变或S354C突变(根据
Kabat等人的EU索引编号,Sequences of Proteins of Immunological Interest(目
的免疫蛋白质的序列)，第5版，Public Health Service,National Institutes of
Health,Bethesda,MD(1991))。

[0344] 在一个实施方案中，双特异性抗体在两个CH3域之一中包含Y349C、T366W突变并且在两个CH3域的另一者中包含E356C、T366S、L368A、Y407V突变。在一个实施方案中，双特异性抗体在两个CH3域之一中包含Y349C、T366W突变并且在两个CH3域的另一者中包含S354C、T366S、L368A、Y407V突变(在一个CH3域中的额外Y349C突变和另一个CH3域中的额外E356C或S354C突变形成链间二硫键)(根据Kabat等人的EU索引编号，(Kabat,E.A.等
人,Sequences of Proteins of Immunological Interest(目的免疫蛋白质的序列)，第
5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)))。
可以备选地或额外地使用如EP 1870459A1所描述的其他的隆突入穴技术。因此，双特异性抗体的另一个例子是在“隆突链”的CH3域中的R409D、K370E突变和在“穴链”的CH3域中的D399K、E357K突变)(根据Kabat等人的EU索引编号；(Kabat,E.A.等人,Sequences of
Proteins of Immunological Interest(目的免疫蛋白质的序列)，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。

[0345] 在一个实施方案中，双特异性抗体包含在“隆突链”的CH3域中的T366W突变和在“穴链”的CH3域中的T366S、L368A、Y407V突变以及额外地在“隆突链”的CH3域中的R409D、K370E突变和在“穴链”的CH3域中的D399K、E357K突变。

[0346] 在一个实施方案中，双特异性抗体包含在两个CH3域之一中的Y349C、T366W突变和在两个CH3域的另一者中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变，或者双特异性抗体包含在两个CH3域之一中的Y349C、T366W突变和在两个CH3域的另一者中的S354C、T366S、
L368A、Y407V突变以及额外地在“隆突链”的CH3域中的R409D、K370E突变和在“穴链”的CH3域中的D399K、E357K突变。CH3域中的这类隆突突变和穴突变一般用于SEQ ID
NO:169、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:172(人IgG1亚类同种异型(高加
索人种和非洲裔美国人或突变体L234A/L235A和L234A/L235A/P329G)、SEQ ID NO:173、
SEQ ID NO:174或SEQ ID NO:175(人IgG4亚类或突变体S228P、L235E和S228P/L235E/
P329G)的人重链恒定区中(根据Kabat等人的EU索引编号，Sequences of Proteins of
Immunological Interest(目的免疫蛋白质的序列)，第5版，Public Health Service，
National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)。

[0347] 在一个实施方案中，双特异性抗体包含SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:171,或SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174,或SEQ ID NO:175的人重链恒定区，还包含CH3域中的这类“隆突”突变和“穴”突变(例如在两个CH3域之一中的Y349C、T366W突变和在两个CH3域的另一者中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变)(根
据Kabat等人的EU索引编号，Sequences of Proteins of Immunological Interest(目
的免疫蛋白质的序列)，第5版，Public Health Service,National Institutes of
Health,Bethesda,MD(1991)。

[0348] 本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“八抗体(Octopus antibody)”(见，例如US 2006/0025576)。

[0349] 本文的抗体或片段还包括“双重功能Fab(Dual Acting Fab)”或“DAF”，其包含与半抗原以及另一种不同抗原结合的抗原结合位点(例如参见，US 2008/0069820)。

[0350] 本文 中的 抗体 或 片段 也包 括在 WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO
2010/145792和WO 2010/145793中描述的多特异性抗体。

[0351] 在一个实施方案中，双特异性抗体的第一结合特异性针对半抗原并且第二结合特异性针对非半抗原性抗原。在一个实施方案中，非半抗原性抗原选自白细胞标记：CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD11a、b、c、CD13、CD14、CD18、CD19、CD22、CD23、CD27及其配体、CD28及其配体B7.1、B7.2、B7.3、CD29及其配体、CD30及其配体、CD40及其配体gp39、CD44、CD45和同工型、CD56、CD58、CD69、CD72、CTLA-4、LFA-1和TCR；组织相容性抗原：MHC I类或II类、Lewis Y抗原、SLex、SLey、SLea和SLeb；整联蛋白：VLA-1、VLA-2、VLA-3、VLA-4、VLA-5、VLA-6、αVβ3和 LFA-1、Mac-1和 pl50.95、αVβ1、gpIIbIIIa、αRβ3、α6β4、αVβ5、αVβ6和αV627；选凝素：L-选凝素、P-选凝素和E-选凝素及其反受体VCAM-1、ICAM-1、ICAM-2和LFA-3；白介素：IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14和IL-15；白介素受体，选自IL-1R、IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、IL-8R、IL-9R、IL-10R、IL-11R、IL-12R、IL-13R、IL-14R和IL-15R；趋化因子选自PF4、RANTES、MIP1α、MCP1、NAP-2、Groα、Groβ和IL-8；生长因子选自TNFα、TGFβ、TSH、VEGF/VPF、VEGFA、VEGFB、VEGF111、VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、PTHrP、EGF家族、PDGF家族、内皮素、纤维化蛋白(FSF-1)、人层粘连蛋和胃泌素释放肽(GRP)、PLGF、HGH、HGHR；生长因子受体选自TNFα、RGFβR、TSHR、VEGFR/VPFR、EGFR、PTHrPR、PDGFR家族、EPO-R、GCSF-R和其他造血受体；干扰素受体选自IFNCαR、IFNβR和IFNλR；Ig和其受体选自IgE、FcγRI和FcγRII；肿瘤抗原选自her2-neu、黏蛋白、CEA和内皮唾液酸蛋白(endosialin)；变应原选自屋尘螨抗原、lol p1(草)抗原和漆酚；病毒多肽选自CMV糖蛋白B、H和gCIII、HIV-1包膜糖蛋白、RSV包膜糖蛋白、HSV包膜糖蛋白、HPV包膜糖蛋白、肝炎家族表面抗原(Hepatitis family surface antigen)；毒素选自假单胞菌(pseudomonas)内毒素和骨桥蛋白(osteopontin)/尿桥蛋白(uropontin)、蛇毒液、蜘蛛毒液和蜂毒液、芋螺毒素；血液因子选自补体C3b、补体C4a、补体C4b-9、Rh因子、纤维蛋白原、纤维蛋白和髓鞘质相关的生长抑制剂；并且酶选自胆固醇酯转移多肽、膜结合型基质金属蛋白酶和谷氨酸脱羧酶(GAD)。

[0352] 抗体变体

[0353] 在某些实施方案中，构思了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能想要改善该抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过向编码抗体的核苷酸序列引入适宜修饰或通过肽合成制备该抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如，从抗体的氨基酸序列内部缺失残基和/或将残基插入所述氨基酸序列中和/或置换所述氨基酸序列中的残基。可以产生缺失、插入和置换的任意组合以实现最终构建体，只要所述最终构建体拥有想要的特征，例如抗原结合。

[0354] a)置换变体、插入变体和缺失变体

[0355] 在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目的位点包括HVR和FR。可以将氨基酸置换引入目的抗体中并且对产物筛选所需的活性，例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。

[0356] 表2.

[0357]

[0358]

[0359] 氨基酸可以根据常见的侧链特性分组：

[0360] (1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu；Ile；

[0361] (2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn；Gln；

[0362] (3)酸性：Asp、Glu；

[0363] (4)碱性：His、Lys、Arg；

[0364] ((5)影响链方向的残基：Gly、Pro；

[0365] (6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

[0366] 非保守性置换将使这些分类之一的成员交换为另一个分类的成员。

[0367] 一个置换变体类型涉及置换亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，为进一步研究所选择的产生的变体将相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力，降低的免疫原性)具有修饰(例如，改善)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，所述抗体可以例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术如本文所述的那些技术便利地产生。简而言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体在噬菌体上展示并筛选特定生物学活性(例如
结合亲和力)。

[0368] 可以在HVR中做出改变(例如，置换)，例如以改善抗体亲和力。这类改变可以在HVR“热点”(即，在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子所编码的残基(见，例如，Chowdhury,P.S.,Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)和/或SDR(a-CDR)中做出，同时对所产生的变体VH或VL测试结合亲和力。已经例如在Hoogenboom,H.R.等人，引自
Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37中描述了通过构建次级文库并从中重新
选择实现亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)的任一种，将多样性引入所选择用于成熟的可变基因中。随后产生次级文库。随后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR指导的方案，其中将几种HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机分组。
可以特别地鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描法诱变或建模。尤其经常靶向重链CDR3和轻链CDR3。

[0369] 在某些实施方案中，置换、插入或缺失可以在一个或多个HVR内部出现，只要这类改变不实质降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中做出不实质降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文中提供的保守性置换)。这类改变可以在HVR“热点”或SDR外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或者不予改变，或者含有不多于一个、两个或三个氨基酸置换。

[0370] 一种用于鉴定可以被靶向用于诱变的抗体残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描法诱变法”，如Cunningham,B.C.和Wells,J.A.,Science 244(1989)1081-1085所述。在这种方法中，将残基或靶残基组(例如，带电荷残基如arg、asp、his、lys和glu)鉴定并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对于初始置换显示功能敏感的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或额外地，测定抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以将这类接触残基和邻近残基作为置换候选物打靶或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的特性。

[0371] 氨基酸序列插入包括长度从1个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入性变体包括抗体的N末端或C末端
与酶(例如针对ADEPT的酶)或增加该抗体血清半寿期的多肽融合。

[0372] b)糖基化变体

[0373] 在某些实施方案中，改变本文提供的或包含于如本文所报道的缀合物中的抗体以增加或减少抗体发生糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列从而创造或移除一个或多个糖基化位点，便利地实现对抗体添加或删除糖基化位点。

[0374] 在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与之连接的糖。哺乳动物细胞产生的天然抗体一般包含分枝的双天线状低聚糖，所述低聚糖通常借助N连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright,A.和Morrison,S.L.,TIBTECH 15(1997)26-32。低聚糖可以包括各种糖，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与双天线状低聚糖结构的“茎”中GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以修饰本发明抗体中的低聚糖以产生某些特性改善的抗体变体。

[0375] 在一个实施方案中，提供具有糖结构的抗体变体，所述糖结构缺少与Fc区(直接或间接)连接的岩藻糖。例如，这类抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过以下方式确定岩藻糖的量：相对于如通过MALDI-TOF质谱法所测量的与Asn297连接的全部糖结构(例如复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，计
算糖链内部Asn297处岩藻糖的平均量，例如，如WO 2008/077546中所述。Asn297指位于Fc区内约第297位置处的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，Asn297也可以位于第
297位置的上游或下游±3个氨基酸附近，即，第294和300位置之间，原因在于抗体中的微小序列变异。这类岩藻糖化变体可以具有改善的ADCC功能。参见，例如，US 2003/0157108；
US 2004/0093621。与“去岩藻糖化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体相关的出版物的例子包括：
US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；
US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US
2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；
WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki,A.等人,J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；
Yamane-Ohnuki,N.等人,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖化抗体
的细胞系的例子包括在蛋白质岩藻糖化方面缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka,J.等人,Arch.
Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US2003/0157108；和WO 2004/056312，特别在实施例11处)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(例如，见
Yamane-Ohnuki,N.等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO 2003/085107)。

[0376] 还可以提供具双分低聚糖的抗体变体，例如，其中与抗体Fc区连接的双天线状低聚糖由GlcNAc对分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的例子例如在WO 2003/011878；美国专利号6,602,684；和US 2005/0123546中描述。也提供低聚糖中至少一个半乳糖残基与Fc区连接的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的CDC功能。这类抗体变体例如在WO 1997/30087；WO 1998/58964和WO1999/22764中描述。

[0377] c)Fc区变体

[0378] 在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，因而产生Fc区变体。该Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，所述人Fc区序列在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换)。

[0379] 在某些实施方案中，本发明构思了拥有一些但非全部效应子功能的抗体变体，这使所述抗体变体成为下述应用所希望的候选物，其中抗体的体内半寿期重要，而某些
效应子功能(如补体和ADCC)是不必要或有害的。可以实施体外和/或体内细胞毒性
测定法以证实CDC和/或ADCC活性降低/耗尽。例如，可以实施Fc受体(FcR)结合
测定法以确保抗体缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能
力。介导ADCC的原代细胞－NK细胞表达Fc(仅RIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII
和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.
Immunol.9(1991)457-492的第464页上的表3中。评估目的分子的ADCC活性的体外测
定法的非限制性例子在美国专利号5,500,362(参见，例如，Hellstrom,I.等人,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 82(1985)1499-1502)；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.
Med.166(1987)1351-1361))中描述。备选地，可以使用非放射性分析方法(见，例如，
TM
用于流式细胞术的ACTI 非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain
View,CA；和CytoTox 非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI)。用于此
类测定法的效应细胞括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或额外
地，可以在体内，例如，在动物模型中，如在Clynes,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
95(1998)652-656公开的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。也可以实施C1q结合
测定法以证实抗体不能结合C1q并因此缺少CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和
WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定
法(参见，例如，Gazzano-Santoro,H.等 人,J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；
Cragg,M.S.等人,Blood101(2003)1045-1052；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood
103(2004)2738-2743)。也可以使用本领域已知的方法确定FcRn结合和体内清除率/半寿
期(参见，例如，Petkova,S.B.等人，Int.Immunol.18(2006:1759-1769)。

[0380] 效应子功能减少的抗体包括置换一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329(美国专利号6,737,056)的那些。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、
270、297和327的两个或更多个位置处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换成
丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。

[0381] 描述了具有FcR结合改善或削弱的某些抗体变体。(见，例如，美国专利号6,737,056；WO2004/056312，和Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。

[0382] 在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸置换(例如，在Fc区的第298、333和/或334位置处的置换)(残基的EU编号)的Fc区。

[0383] 在一些实施方案中，在Fc区内做出改变，所述改变导致变更(即改善或削弱)的C1q结合和/或补体依赖细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551、WO99/51642和
Idusogie,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184中所述。

[0384] 在US2005/0014934A1(Hinton等人)中描述了半寿期增加和新生Fc受体(FcRn)结合改善的抗体，所述新生Fc受体负责转移母源IgG至胎儿(Guyer,R.L.等人,J.
Immunol.117(1976)587-593和Kim,J.K.等人,J.Immunol.24(1994)2429-2434)。这些抗
体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，其中所述置换改善Fc区与FcRn的结合。这类
Fc变体包括在一个或多个Fc区残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、
340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434处具有置换(例如，Fc区残基434的置换)的那些(美国专利号7,371,826)。

[0385] 关于Fc区 变体 的其他 例子，还参见Duncan,A.R. 和Winter,G.,Nature322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821和WO 94/29351。

[0386] d)半胱氨酸工程化抗体变体

[0387] 在某些实施方案中，可能希望产生半胱氨酸工程化的抗体，例如，“硫代MAb”，其中所述抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中，置换的残基出现在抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸置换这些残基，因而将反应性巯基安置在抗体的可及位点处并且可以用来使抗体缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸置换以下残基的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程化的抗体可以例如美国专利号7,521,541中所述那样产生。

[0388] e)抗体衍生物

[0389] 在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以含有本领域已知并轻易可获得的额外的非蛋白质部分。适于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三 烷、亚乙基/马来酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇和它们的混合物。聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的优点，原因在于其在水中的稳定性。这种聚合物可以具有任何分子量，并可以是分枝或不分枝的。与抗体连接的聚合物的数目可以变动，并且如果连接多于一种聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于以下考虑事项确定，包括但不限于待改善的抗体特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于所定义的疾病的疗法中等等。

[0390] 在另一个实施方案中，提供了抗体和非蛋白质部分的缀合物，其中所述非蛋白质部分可以通过暴露于辐射而选择性加热。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam,N.W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可以具有任何
波长，并包括但不限于这样的波长，所述波长不伤害普通细胞，但是使非蛋白质部分加热至杀伤临近于抗体-非蛋白质部分的细胞的温度。

[0391] 半抗原化化合物

[0392] 在如本文中报道的缀合物中的半抗原，如果它本身不是分子之一，可以缀合至治疗剂(药物)、细胞毒性剂(例如毒素如多柔比星或百日咳毒素)、荧光团如荧光染料如荧光素或罗丹明、用于成像性金属或放疗性金属的螯合剂、肽基或非肽基标记物或检测标签、或清除率调节剂如聚乙二醇的多种异构体、与第三组分结合的肽或者另一种碳水化合物或亲脂物质。这种缀合物命名为半抗原化化合物。这种缀合可以直接进行或借助间插接头进行。

[0393] a)治疗性部分

[0394] 半抗原-药物缀合物(ADC，半抗原化药物)的药物部分(D)可以是具有细胞毒作用或抑制细胞作用的任何化合物、部分或基团。药物部分包括：(i)可以充当微管蛋白抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA嵌入剂的化疗剂；(ii)可以以酶促方式发挥作用的蛋白质毒素；和(iii)放射性同位素。

[0395] 示例性药物部分包括但不限于美坦生类、澳瑞司他汀(auristatin)、多拉司他汀、单端孢霉烯族化合物、CC1065、刺孢霉素和其他烯二炔类抗生素、紫杉烷、蒽环类及其立体异构体、电子等排体、类似物或衍生物。

[0396] 蛋白质毒素包括白喉毒素A链、白喉毒素的无结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链(Vitetta等人(1987)
Science,238:1098)、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII
和PAP-5)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草
(sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族类化合物(WO 93/21232)。

[0397] 治疗性放射性同位素包括32P、33P、90Y、125I、131I、131In、153Sm、186Re、188Re、211At、212B、212
Pb和Lu的放射性同位素。

[0398] 放射性同位素或其他标记物可以按已知方式掺入(Fraker等人(1978)Biochem Biophys Res Commun.80:49-57；"Monoclonal Antibodies in
Immunoscintigraphy"Chatal,CRC Press 1989)。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄
基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是将放射性核素与复合物缀合的示例性螯合剂(WO
94/11026)。

[0399] b)标记物

[0400] 半抗原化化合物可以是半抗原化标记物。能够使用可以与半抗原共价连接的任何标记物部分(参见例如Singh等人(2002)Anal.Biochem.304:147-15；Harlow
E. 和 Lane,D.(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor
Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Lundblad R.L.(1991)Chemical Reagents for Protein Modification,第2版,CRC Press,Boca Raton,Fla.)。标记物可以发挥以下作用：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记物相互作用以调整第一或第二标记物提供的可检测信号，例如，以产生FRET(荧光共振能量转移)；(iii)通过电荷、疏水性、形状或其他物理参数影响迁移率例如电泳迁移率或细胞通透性，或(iv)提供捕获部分例如以调节离
子络合过程。

[0401] 包含如本文中报道的半抗原化标记物的缀合物可以用于诊断测定法中，例如，用于检测特定细胞、组织或血清中目的抗原的表达。对于诊断性应用，将使用其中第一结合特异性与靶结合并且第二结合特异性与半抗原化标记物结合的双特异性抗体。半抗原一般将用可检测部分标记。许多标记物是可用的，它们通常可以划分成以下类别：

[0402] (a)放射性同位素(放射性核素)，如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Gn、86Y、89Zr、99T 111 123 124 125 131 133 177 211 131
C、 In、I、 I、I、 I、Xe、 Lu、At或 Bi。放射性同位素标记的缀合物用于受体
靶向的成像实验中。使用Current Protocols in Immunology,第1和第2卷,Coligen
等人编著,Wiley-Interscience,New York,N.Y.,Pubs中所述的技术，抗原(半抗原)可
以用结合、螯合物或络合放射性同位素金属的配体试剂标记。可以络合金属离子的螯合
配体包括DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA和TETA(Macrocyclics,Dallas,Tex.)。放射性核素可以通过用如本文中报道的复合物复合进行靶向(Wu等人,Nature Biotechnology 23(9)
(2005)1137-1146)。采用放射性核素标记复合物的受体靶成像法可以通过检测和量化复
合物或相应的治疗抗体在肿瘤组织中的进行性积累而提供途径活化的标记(Albert等人
(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8:1207-1210)。

[0403] 合适作为成像实验用标记物的金属-螯合物复合物(US 2010/0111856；US5,342,606；US 5,428,155；US 5,316,757；US 5,480,990；US 5,462,725；US 5,428,139；
US 5,385,893；US 5,739,294；US 5,750,660；US 5,834,456；Hnatowich等人,J.Immunol.Methods 65(1983)147-157；Meares 等 人 ,Anal.Biochem.142(1984)68-78；Mirzadeh 等人,Bioconjugate Chem.1(1990)59-65；Meares等人,J.Cancer(1990),Suppl.10:21-26；
Izard 等 人 ,Bioconjugate Chem.3(1992)346-350；Nikula 等 人 ,Nucl.Med.
Biol.22(1995)387-90；Camera 等 人,Nucl.Med.Biol.20(1993)955-62；Kukis等 人 ,J.Nucl.Med.39(1998)2105-2110；Verel 等 人,J.Nucl.Med.44(2003)1663-1670；Camera 等人,J.Nucl.Med.21(1994)640-646；Ruegg等人,Cancer Res.50(1990)4221-4226；Verel
等 人 ,J.Nucl.Med.44(2003)1663-1670；Lee 等 人 ,Cancer Res.61(2001)4474-4482；
Mitchell 等 人 ,J.Nucl.Med.44(2003)1105-1112；Kobayashi 等 人 Bioconjugate
Chem.10(1999)103-111；Miederer 等 人 ,J.Nucl.Med.45(2004)129-137；DeNardo
等 人 ,Clinical Cancer Research 4(1998)2483-90；Blend 等 人 ,Cancer
Biotherapy&Radiopharmaceuticals 18(2003)355-363；Nikula 等 人 J.Nucl.
Med.40(1999)166-76；Kobayashi 等 人 ,J.Nucl.Med.39(1998)829-36；Mardirossian 等人,Nucl.Med.Biol.20(1993)65-74；Roselli等人,Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals,14(1999)209-20)。

[0404] (b)荧光标记物如稀土元素螯合物(铕螯合物)、荧光素型荧光标记物，包括FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明型荧光标记物，包括TAMRA；丹磺酰；丽丝胺；花箐；藻红蛋白；得克萨斯红；及其类似物。荧光标记物可以使用在例如CCurrent Protocols in Immunology,上文中公开的技术与抗原(半抗原)缀合。荧光染料和荧
光标记物试剂包括从Invitrogen/Molecular Probes(Eugene，Oregon，美国)和Pierce
Biotechnology,Inc(Rockford,Ill.)市售的那些。

[0405] 检测标记物如荧光染料和化学发光染料(Briggs等人(1997)“Synthesis ofFunctionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids(官能化荧光染料的合成和它们与胺和氨基酸的偶联)”,J.Chem.Soc.,Perkin-Trans.1(1997)
1051-1058)提供了可检测信号，并且通常适用于标记，特别具有以下特性：(i)标记的缀合物应当在低背景情况下产生极高信号，从而可以在无细胞和基于细胞的测定法中灵敏地检测到少量缀合物；和(ii)标记的缀合物应当是光稳定的，从而可以观察、监测并记录荧光信号，而没有明显的光漂白过程。对于涉及标记的缀合物与膜或细胞表面(尤其活细胞)的细胞表面结合的应用，标记物应当(iii)具有良好的水溶性以实现有效的缀合物浓度和检测灵敏度并且(iv)对活细胞无毒，从而不破坏细胞的正常代谢过程或造成过早细胞死亡。

[0406] (c)多种酶-底物标记物是可获得或公开的(参见，例如US 4,275,149)。酶通常催化生色底物的化学改变，其中可以使用多种技术测量所述化学改变。例如，酶可以催化底物中可以按分光光度形式测量的颜色变化。备选地，酶可以改变底物的荧光或化学发光。化学发光底物因化学反应被电子激发并且可以随后发射(例如使用化学发光计)可测量的光
或馈赠能量至荧光受体。酶标记物的例子包括萤光素酶(例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；US 4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于酶与多肽缀合的技术在O'Sullivan等人(1981)“Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay(制备用于酶免疫测定法中的酶缀合物的方法)”，引自Methods in Enzym.(J.Langone和IT Van Vunakis编著),AcademicPress,New York,73(1981)147-166
中描述。

[0407] 酶-底物组合的例子(US 4,275,149；US 4,318,980)例如包括：

[0408] (i)辣根过氧化物酶(HRP)和作为底物的过氧化氢酶，其中所述过氧化氢酶氧化染料前体(例如，邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；

[0409] (ii)碱性磷酸酶(AP)和作为生色底物的对硝基苯磷酸酯；和

[0410] (iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)和生色底物(例如，对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶。

[0411] 如本文中报道的标记缀合物可以用于任何已知的测定法中，如ELISA、竞争性结合分析、直接和间接夹心测定法和免疫沉淀测定(Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques(1987)第147-158页,CRC Press,Inc.)。

[0412] 如本文中报道的标记缀合物由生物医学成像和分子成像的多种方法和技术用作成像性生物标记和探针，如：(i)MRI(磁共振成像术)；(ii)MicroCT(计算机断层成
像)；(iii)SPECT(单光子发射计算机断层成像)；(iv)PET(正电子发射断层摄影术)
Tinianow,J. 等 人 ,Nuclear Medicine and Biology,37(3)(2010)289-297；Chen 等
人,Bioconjugate Chem.15(2004)41-49；US 2010/0111856；(v)生物发光法；(vi)荧光法；
和(vii)超声法。免疫闪烁照相术是一种成像方法，其中将放射性物质标记的缀合物施用至动物或人患者并且拍摄身体内缀合物存在的部位的画面(US 6,528,624)。成像性生物
标记物可以客观地测量并且作为正常生物学过程、发病过程或治疗性介入的药理学反应的指示物进行评价。生物标记物可以具有几个类型：0型标记物是疾病的自然历史标记物并且与已知的临床指标纵向相关，例如类风湿性关节炎中滑膜炎症的MRI评价；I型标记物根据作用机制捕获介入的效果，即便该机制可能与临床结局不相关；II型标记物充当替代终点，其中生物标记物的变化或来自生物标记物的信号预测出“确认”靶向反应的临床益处，如类风湿性关节炎中通过CT测量的骨侵蚀。成像性生物标记物因而可以提供关于以下方
面的药效动力学(PD)治疗信息：(i)靶蛋白的表达、(ii)治疗剂与靶蛋白的结合(即选择
性)、和(iii)清除率和半寿期药物代谢动力学数据。相对于基于标记物的生物标记物而
言，体内成像性生物标记物的优点包括：非侵入性治疗、可定量、全身评估、反复给药和评估(即多个时间点)和从临床前结果(小动物)至临床结果(人类)的潜在可转移效果。对
于一些应用，生物成像法取代了临床前研究中的动物实验或使其数目最小化。

[0413] 肽标记方法是熟知的。参见Haugland(2003)Molecular Probes Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals,Molecular Probes,Inc.；Brinkley(1992)Bioconjugate Chem.3:2；Garman,(1997)Non-Radioactive Labeling:A Practical
Approach,Academic Press,London；Means(1990)Bioconjugate Chem.1:2；Glazer 等
人 Chemical Modification of Proteins.Laboratory Techniques in Biochemistry
and Molecular Biology(T.S.Work 和 E.Work 编 著 )American Elsevier Publishing Co.,New York；Lundblad,R.L. 和 Noyes,C.M.(1984)Chemical Reagents for Protein Modification,第I卷和第II卷,CRC Press,New York；Pfleiderer,G.(1985)"Chemical
Modification of Proteins",Modern Methods in Protein Chemistry,H.Tschesche 编
著,Walter DeGruyter,Berlin and New York；以及Wong(1991)Chemistry of Protein
Conjugation and Cross-linking,CRC Press,Boca Raton,Fla.)；DeLeon-Rodriguez 等人,Chem.Eur.J.10(2004)1149-1155；Lewis等人,Bioconjugate Chem.12(2001)320-324；
Li 等 人 ,Bioconjugate Chem.13(2002)110-115；Mier 等 人 Bioconjugate
Chem.16(2005)240-237。

[0414] 抗体缀合物

[0415] 在如本文中报道的缀合物中的抗体，如果它本身不是分子之一，还可以缀合至治疗剂(药物)、细胞毒性剂(例如毒素如多柔比星或百日咳毒素)、荧光团如荧光染料如荧光素或罗丹明、用于成像性金属或放疗性金属的螯合剂、肽基或非肽基标记物或检测标签、或清除率调节剂如聚乙二醇的多种异构体、与第三组分结合的肽或者另一种碳水化合物或亲脂物质。

[0416] 免疫缀合物

[0417] 本发明也提供免疫缀合物，所述缀合物包含如本文中报道的抗体或如本文中报道的与一种或多种细胞毒性剂如化疗剂或化疗药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌源、真菌源、植物源或动物源的蛋白质毒素、酶活性毒素)或放射性同位素缀合的缀合物。

[0418] 在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括但不限于类美登素(maytansinoid)(参见US 5,208,020、US
5,416,064和EP 0425235B1)；澳瑞司他汀，如单甲基澳瑞司他汀药物部分DE和DF(MMAE
和MMAF)(参见US 5,635,483、US 5,780,588和US 7,498,298)；海兔毒素(dolastatin)；
刺孢霉素或其衍生物(参见US 5,712,374、US 5,714,586、US 5,739,116、US 5,767,285、US 5,770,701、US 5,770,710、US 5,773,001和5,877,296；Hinman,L.M.等人,Cancer
Res.53(1993)3336-3342；和Lode,H.N.等人,CancerRes.58(1998)2925-2928；蒽环类如柔红霉素或多柔比星(参见Kratz,F.等人,Curr.Med.Chem.13(2006)477-523；Jeffrey,S.
C. 等 人 ,Bioorg.Med.Chem.Lett.16(2006)358-362；Torgov,M.Y. 等 人 ,Bioconjug.Chem.16(2005)717-721；Nagy,A. 等 人 ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)829-834；
Dubowchik,G.M. 等 人 ,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12(2002)1529-1532；King,H.D. 等人,J.Med.Chem.45(2002)4336-4343；和美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷如多西紫杉醇、紫杉醇、拉罗他赛(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)和ortataxel；
单端孢霉烯族化合物；和CC1065。

[0419] 在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文所述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的无结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-5)、苦瓜(momordica charantia)抑制蛋白、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制蛋白、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族类化合物。

[0420] 在另一个实施方案中，免疫缀合物包含如本文所述的抗体或如本文中报道的与放射性原子缀合以形成放射缀合物的复合物。多种放射性同位素可用于产生放射缀合物。例211 131 125 90 186 188 153 212 32 212
子包括At 、I 、I 、Y 、Re 、Re 、Sm 、Bi 、P 、Pb 和Lu的放射性同位素。当放射
99m 123
缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁研究的放射性原子，例如TC 或I ，或核磁共振(NMR)成像的自旋标记物(也称作磁共振成像，MRI)，又如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

[0421] 可以使用多种双官能蛋白质偶联剂制备抗体和细胞毒性剂的缀合物，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环
己烷-1-羧化物(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酯的双官能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲
酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对-重
氮盐苯甲酰基)己二胺)、双-重氮盐衍生物(如双-(对-重氮盐苯甲酰基)-乙二胺)、二
异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
例如，可以如Vitetta,E.S.等人,Science 238(1987)1098-1104中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于
放射性核素与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是促进细胞毒性剂
在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含有二硫键的接头(Chari,R.V.等人,Cancer Res.52(1992)127-131；美国专利号5,208,020)。

[0422] 免疫缀合物或ADC在本文中明确地构思，但不限于采用交联剂试剂制备的这类缀合物，所述交联剂试剂包括但不限于可商业获得的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.，Rockford，伊利诺伊州，美国)。

[0423] 接头

[0424] 术语“接头”指可以用来将抗原(例如半抗原)与其他部分如可检测标记物或药物缀合(连接)的双官能或多官能部分。可以使用具有与药物、与抗原(半抗原)和与抗
半抗原抗体结合的反应性官能的接头便利地制备抗原(半抗原)缀合物。

[0425] 在一个实施方案中，接头具有反应位点，所述反应位点具有与抗半抗原抗体上存在的亲核基团反应的亲电基团。抗体上的例如半胱氨酸巯基与接头上的亲电基团反应并且与接头形成共价键。有用的亲电基团包括但不限于另一个巯基、马来酰亚胺和卤代乙酰胺基团。(参见例如在Klussman等人，Bioconjugate Chemistry 15(4)(2004)765-773的第766页的缀合方法)。

[0426] 巯基官能团的例子包括但不限于巯基、马来酰亚胺、α-卤代乙酰基、活化酯如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。

[0427] 接头可以包含将抗原(半抗原)与有效载荷连接的氨基酸残基。氨基酸残基可以形成二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。氨基酸残基包括天然存在的那些以及非天然存在的氨基酸类似物，如例如瓜氨酸或β-氨基酸，如例如β-丙氨酸，或ω-氨基酸如4-氨基-丁酸。

[0428] 在另一个实施方案中，接头具有反应性官能团，所述反应性官能团具有与抗原(半抗原)或抗体(抗半抗原抗体)上存在的亲电基团反应的亲核基团。有用的亲电基团
包括但不限于醛基和酮羰基。接头的亲核基团的杂原子可以与半抗原或抗体上的亲电基团反应并与抗原(半抗原)或抗体形成共价键。接头上有用的亲核基团包括但不限于酰肼、
肟、氨基、肼、硫代半卡巴腙、肼羧化物和芳酰肼。抗原(半抗原)上的亲电基团为接合至接头提供了便利位点。

[0429] 一般地，肽型接头可以通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可以例如根据肽化学领域熟知的液相合成方法制备(E.Schroder和
K.Lubke"The Peptides",第1卷(1965)76-136,Academic Press)。

[0430] 在另一个实施方案中，接头可以用调节溶解度或反应性的基团替换。例如，带电取-代基如磺酸盐(-SO3)或铵或聚合物如PEG，可以增加试剂的水溶解度并且促进接头试剂与抗原(半抗原)或药物部分的偶联反应，或根据所用的合成途经，促进偶联反应。

[0431] 明确构思了如本文中报道的包含药物或标记物的缀合物，但是不限于用以下接头试剂制备的复合物：BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)，并且包括双马来酰亚胺试剂：DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、BM(PEO)3和BM(PEO)4，它们从Pierce Biotechnology,Inc.可商业获得。双马来酰亚胺试剂允许例如巯基以依次或同时方式与含巯基的药物部分、标记物或接头中间体接合。除马来酰亚胺之外，与例如巯基反应的其他官能团还包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。

[0432] 示例性接头包括含有马来酰亚胺伸张物和对氨基苄基氨甲酰基(PAB)自毁性间隔团的缬氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽接头试剂和具有马来酰亚胺伸张物单元和对
氨基苄基自毁性间隔团的phe-lys(Mtr)二肽接头试剂。

[0433] 半胱氨酸巯基是亲核的，并且通过硫化物交换，能够与接头试剂和半抗原化化合物上的亲电基团反应以形成共价键，其中所述接头试剂和药物-接头中间体包括：(i)活性酯如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酰卤；(ii)烷基卤和苄基卤，如卤乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基；和(iv)二硫化物，包括吡啶基二硫化物。半抗原化化合物上的亲核基团包括但不限于能够与接头部分和接头试剂上的亲电基团反应以形成共价键的胺、巯基、羟基、酰肼、肟、肼、硫代半卡巴腙、肼羧化物和芳酰肼基。

[0434] III.核酸

[0435] 可以通过本领域已知的多种方法制备编码抗体的氨基酸序列变体的DNA，所述抗体如本文中报道或如包含于如本文所报道的缀合物中。这些方法包括但不限于通过位点定向(或寡核苷酸介导)诱变、PCR诱变和盒诱变较早制备的编码所述多肽的DNA来制备。
也可以通过限制性片段操作或通过采用合成性寡核苷酸的重叠延伸PCR，构建重组抗体的变体。诱变引物编码了半胱氨酸密码子替换。标准的诱变技术可以用来产生编码此类修饰的工程化抗体的DNA。一般指导可以在Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；和
Ausubel 等 人 ,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and
Wiley-Interscience，New York,N.Y.,1993中找到。

[0436] IV.表达和纯化

[0437] 可以例如使用重组方法和组合物产生抗体，如US 4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗体的分离核酸。这种核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在又一个实施方案中，提供一种或多种包含这种核酸的载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在这样一个实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用其转化)：
(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基
酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供一种产生如本文中报道的抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养如上文提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收该抗体。

[0438] 为了重组产生如本文中报道的抗体，将编码抗体的核酸(例如，如上文所述)分离并插入一种或多种载体中用于宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，轻易地分离这种核酸并将其测序。

[0439] 克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，尤其当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于细菌中表
达抗体片段和多肽，例如，参见US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523。(还参见Charlton,K.A.，引自Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(编著)，Humana Press,Totowa,NJ(2003)，第245-254页，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段)。在表达后，抗体可以从细菌细胞糊状物中以可溶性级分分离并且可以进一步纯化。

[0440] 除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等人,Nat.Biotech.24(2006)210-215。

[0441] 表达糖基化抗体的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用、尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的众多杆状病毒毒株。

[0442] 也可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的
TM
PLANTIBODIES 技术)。

[0443] 也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1系
(COS-7)；人胚肾系(如在例如Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述
的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(如在例如Mather,J.P.,Biol.
Reprod.23(1980)243-252中所述的TM4细胞那样)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞
(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺
细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562)；如在例如Mather,J.P.等
人,Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述的TRI细胞；MRC 5细胞；和FS4细
-
胞。其他可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其中包括DHFRCHO
细胞((Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细
胞系如Y0、NS0和Sp2/0。关于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，例如，
见 Yazaki,P. 和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology, 第 248 卷 ,Lo,B.K.C.( 编著),Humana Press,Totowa,NJ(2004),第255-268页。

[0444] V.用于诊断和检测的方法和组合物

[0445] 在某些实施方案中，如本文中报道的任一种抗体、尤其双特异性抗体和缀合物，可用于检测生物样品中一个或多个靶分子的存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量性或定性检测。在一个实施方案中，生物样品包含细胞或组织。

[0446] 在一个实施方案中，提供在诊断或检测方法中使用的如本文中报道的抗体或缀合物。在某些实施方案中，该方法包括：使生物样品与如本文中报道的抗体或缀合物在允许该抗体或缀合物与靶结合的条件下接触，并且检测该抗体或缀合物与靶之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。

[0447] 在某些实施方案中，提供标记的抗体或缀合物。标记物包括但不限于直接检测的标记物或部分(如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记物)，以及间接检测的部分(例如借助酶促反应或分子相互作用间接检测)，如酶或配体。示例性标记物包括
32 14 125 3 131
但不限于放射性同位素 P、C、I、H和 I、荧光团如稀土元素螯合物或荧光素及其衍
生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(US4,737,456)、萤光素、2,3-二氢二氮杂萘二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶偶联、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定自由基等。

[0448] VI.药物制剂

[0449] 通过以下方式制备冻干制剂或水溶液剂形式的如本文报道的抗体或缀合物的药物制剂：将具有所需纯度的这种抗体或缀合物与一种或多种任选的可药用载体混合
(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.(编著)(1980))。可药用载
体总体上在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基苄基二甲
基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多
肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成盐的反离子如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。
本文中的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白
(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuPH20( ,Baxter
International,Inc.)。在美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些
示例性sHASEGP和使用方法，包括rhuPH20。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。

[0450] 在US 6,267,958中描述了示例性冻干抗体制剂。水质抗体制剂包括在US6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些制剂，后一类制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。

[0451] 本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应症需要而含有多于一种有效成分，优选地含有这些有效成分，它们具有并未相互不利影响的互补活性。这种有效成分以有效用于预期目的的量适当地存在。

[0452] 有效成分可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统
(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或乳浊液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.(编著)(1980)中公开。

[0453] 可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有抗体或缀合物的固态疏水性聚合物半透性基质，所述基质处于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。

[0454] 待用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如通过借助无菌滤膜过滤轻易地实现无菌性。

[0455] VII.治疗方法和组合物

[0456] 本文中报道的任何抗体或缀合物可以用于治疗方法中。

[0457] 在一个方面，提供如本文中报道的抗体或缀合物用作药物。在其他方面，提供如本文中报道的抗体或缀合物用于治疗疾病。在某些实施方案中，提供如本文中报道的抗体或缀合物用于治疗方法中。在某些实施方案中，本发明提供如本文中报道的抗体或缀合物用于治疗个体的方法中，所述方法包括向该个体施用有效量的如本文中报道的抗体或缀合物。在这样一个实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如下文描述。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。

[0458] 在又一个方面，本发明提供如本文中报道的抗体或缀合物在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗疾病。在又一个实施方案中，该药物用于治疗疾病的方法中，所述方法包括向患有疾病的个体施用有效量的药物。在这样一个实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如下文描述。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。

[0459] 在又一个方面，本发明提供一种用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中，该方法包括向患有这种疾病的个体施用有效量的如本文中报道的抗体或缀合物。在这样一个实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的如下文描述的至少一种额外的治疗剂。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。

[0460] 在又一个方面，本发明提供了包含如本文中报道的任何抗体或缀合物的药物制剂，例如，用于前述任一种治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含如本文中报道的任何抗体或缀合物和可药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含如本文中报道的任何抗体或缀合物和至少一种额外的治疗剂，例如，如下文描述。

[0461] 如本文中报道的抗体和缀合物可以在疗法中单独或与其他制剂组合使用。例如，如本文中报道的抗体或缀合物可以与至少一种额外的治疗剂共施用。

[0462] 上文所示的这类联合疗法涵盖联合施用(其中在相同或独立的制剂中包含两种或更多种治疗剂，和独立施用，在这种情况下，本发明抗体的施用可以在施用额外的治疗剂和/或辅助剂之前、同时和/或之后进行。如本文中报道的抗体和缀合物也可以与放射疗
法组合使用。

[0463] 如本文中报道的抗体或缀合物(和任何额外的治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，所述的合适手段包括肠胃外、肺内和鼻内以及(如果需要局部治疗)病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是否为短暂或长期。本文中构思了多种给药方案，包括但不限于单次或在多个时间点多次施用、快速浓注(bolus)施用和脉冲输注。

[0464] 如本文中报道的抗体或缀合物以符合医学规范的方式配制、投予和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、送递药剂的部位、施用方法、施用计划和医疗执业者已知的其他因素。该抗体或缀合物不需要与目前用来预防或治疗所讨论病症的一种或多种药剂一起配制，但是任选地与它们一起配制。这类其他药剂的有效量取决于该制剂中存在的抗体或缀合物的量、疾病类型或疗法和上文讨论的其他因素。这些药物通常以与本文所述相同的剂量并且采用与本文所述相同的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。

[0465] 为了预防或治疗疾病，如本文中报道的抗体或缀合物的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他额外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体或缀合物的类型、疾病的严重性和过程，抗体或缀合物是否出于预防或治疗目的施用、先前疗法、患者的临床史和对抗体或缀合物的反应以及主治医师的决定。将抗体适当地按一次或经过一
系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/
kg-10mg/kg)抗体或缀合物可以是向患者施用的起始候选剂量，无论是否例如通过一个或多个单独施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个常见的每日剂量可能是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间范围内重复施用，取决于病状，治疗通常持续直至所需的疾病症状抑制作用出现。抗体或缀合物的一个示例性剂量处于约
0.05mg/kg至约10mg/kg范围内。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的一种或多种剂量(或其任意组合)。这类剂量可以断续地施用，例如，每周或每3周(例如，从而患者接受从约2个至约20个或例如约6个剂量的抗体)。可以施用较
高的初始负荷剂量，随后是一个或多个较低剂量。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进程。

[0466] 可以理解，可以使用本发明的免疫缀合物替代如本文中报道的抗体或缀合物，或如本文中报道的抗体或缀合物之外还使用本发明免疫缀合物来实施前述任一种制剂或治疗方法。

[0467] VIII.制造品

[0468] 在本发明的另一个方面，提供一种制造品，所述制造品含有上文描述的可用于治疗、预防和/或诊断病症的物质。该制造品包括容器和或在该容器上或与之结合的标签或包装物插页。合适的容器例如包括瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以自多种材料如玻璃或塑料形成。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小药瓶)。组合物中的至少一个活性物质是如本文中报道的抗体或复合物。标签或包装插页说明该组合物用于治疗选择的病状。另外，制造品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含如本文中报道的抗体或复合物；
和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他细胞毒性剂或治疗剂。在本发明的这个实施方案中制造品还可以包含指示组合物可以用来治疗特定疾病的包装物插
页。备选地或额外地，该制造品可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲液，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点看受欢迎的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。

[0469] 可以理解，替代如本文中报道的抗体或缀合物或除如本文中报道的抗体或缀合物之外，前述任一者制造品还可以包含本发明的免疫缀合物。

[0470] 本文提到的全部参考文献的公开内容因此通过引用的方式完整并入。

[0471] 提供以下实施例、附图和序列以辅助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求书中阐述。可以理解，可以对所述方法作出修改而不脱离本发明的精神。

[0472] 实施例

[0473] 实施例1

[0474] 分离和表征编码来自小鼠杂交瘤的具有κ轻链的IgG1类鼠抗洋地黄毒苷抗体和鼠抗生物素抗体的VH域和VL域的cDNA

[0475] 分别在WO 2011/003557和WO 2011/003780中描述了分离和表征编码抗洋地黄毒苷抗体VH域和VL域的cDNA、RNA制备、产生DNA片段、克隆该DNA片段至质粒中和测定DNA
序列和氨基酸序列。

[0476] 从杂交瘤克隆直接获得结合半抗原的鼠抗体的VH域和VL域的蛋白质序列和(DNA)序列信息。随后进行的实验步骤是(i)从产生抗体的杂交瘤细胞分离RNA，(ii)将
这种RNA转化至cDNA中、转移至携带VH和VL的PCR片段中，和(iii)将这些PCR片段整
合入用于大肠杆菌中增殖的质粒载体并测定它们的DNA序列(和推导的)蛋白质序列。

[0477] 来自杂交瘤细胞的RNA制备物：

[0478] 采用RNeasy-Kit(Qiagen)，从5x106个表达抗体的杂交瘤细胞制备RNA。简而言之，将沉淀的细胞在PBS中洗涤1次并沉淀并且随后重悬以便在500μl RLT-缓冲剂
(+β-ME)中裂解。如制造商的手册中所述，通过穿过Qiashredder(Qiagen)并且随后经历基质介导的纯化过程(ETOH，RNeasy柱)，使细胞彻底裂解。在最后的洗涤步骤后，将RNA从柱回收于50μl无RNA酶的水中。通过对1:20稀释的样品的A260和A280定量确定回收的
RNA的浓度。通过在甲酰胺-琼脂糖凝胶上的变性RNA凝胶电泳，分析所分离的RNA样品的
完整性(质量、降解程度)(参见Maniatis手册)。获得了代表完整18S和28S核糖体RNA
的独立条带并且这些条带的完好性(和大约2:1强度比)指示RNA制备物的良好质量。将
从杂交瘤分离的RNA冷冻并以等分试样贮存在-80℃。

[0479] 通过RACE PCR产生编码VH和VH的DNA片段、将这些DNA片段克隆至质粒中并测定它们的DNA序列和氨基酸序列

[0480] 通过采用如国际专利申请PCT/EP2011/074273中所述的技术，从RNA制备物中制备用于后续(RACE-)PCR反应的cDNA。随后，将编码VH和VL的PCR片段通过琼脂糖
凝胶提取法分离并随后通过标准分子生物学技术纯化。通过采用pCR bluntII topo试
剂盒(Invitrogen)，完全遵循制造商的说明书，将PWO生成的纯化PCR片段插入载体pCR
bluntII topo中。将Topo-连接反应转化至大肠杆菌Topo10-one-shot感受态细胞中。此
后，将含有载体的大肠杆菌克隆作为LB-卡那霉素琼脂平板上的菌落鉴定，所述载体具有含VL或VH的插入物。从这些菌落制备质粒并且通过用EcoRI限制酶切消化证实载体中所
需插入物的存在。因为载体主链含有在插入物每一侧分布的EcoRI限制性识别位点，所以通过具有EcoRI可释放的约800bp(对VL而言)或600bp(对VH而言)插入物定义携带插
入物的质粒。通过对VH和VL的多个克隆的自动化DNA测序，测定VL和VH的DNA序列和
推导的蛋白质序列。

[0481] 在SEQ ID NO:40中描述抗生物素抗体的鼠VL序列。在SEQ ID NO:36中描述抗生物素抗体的鼠VH序列。

[0482] 在SEQ ID NO:08中描述抗洋地黄毒苷抗体的鼠VL序列。在SEQ ID NO:04中描述抗洋地黄毒苷抗体的鼠VH序列。

[0483] 实施例2

[0484] 分离和表征编码来自小鼠杂交瘤的具有κ轻链的IgG1类鼠抗茶碱抗体的VH域和VL域的cDNA

[0485] 如实施例1中所概述那样获得抗茶碱抗体的序列。

[0486] 在SEQ ID NO:72中描述抗茶碱抗体的鼠VL序列。在SEQ ID NO:68中描述抗茶碱抗体的鼠VH序列。

[0487] 实施例3

[0488] 鼠抗洋地黄毒苷抗体和抗生物素抗体VH域和VL域的人源化

[0489] 已经在WO 2011/003557和WO 2011/003780中详细描述结合洋地黄毒苷的抗体的人源化变体的产生。结合生物素的鼠抗体muM33以相似的方式如下人源化：

[0490] 在WO 2011/003557和WO2011/003780中描述了产生和表征包含来自小鼠杂交瘤的具有κ轻链的IgG1类鼠抗生物素抗体的VH域和VL域的编码序列和氨基酸序列。基于这
种信息，相应的人源化抗生物素抗体(huM33)基于人种系构架IGHV1-69-02和IGKV1-27-01组合产生。对于VL，不必需在人IGKV1-27-01的构架和IGKJ2-01种系的人J元件中集成任
何回复突变。人源化VH基于人IGHV1-69-02种系和IGHJ4-01-3种系的人J元件。引入两
个回复突变至构架区1中第24位置处(A24S)和构架区3中第73位置处(K73T)。人源化
VH的氨基酸序列在SEQ ID NO:44中描述并且人源化VL的氨基酸序列在SEQ ID NO:48中
描述。

[0491] 实施例4

[0492] 鼠抗茶碱抗体的VH域和VL域的人源化

[0493] 结合茶碱的鼠抗体如下人源化：基于人种系构架IGHV4-31-02和IGKV2-30-01组合产生人源化抗茶碱抗体。人源化VH基于人IGHV4-31-02种系和IGHJ4-01-3种系的人J
元件。引入一个回复突变至构架区3中第71位置处(V71R)。人源化VL基于人IGHV2-30-01
种系和IGKJ2-01种系的人J元件。引入一个回复突变至构架区2中第46位置处(R46L)。
人源化VH的氨基酸序列在SEQ ID NO:76中描述并且人源化VL的氨基酸序列在SEQ ID
NO:80中描述。

[0494] 实施例5

[0495] 在洋地黄毒苷存在下鼠抗洋地黄毒苷Fv区的结合区和在生物素存在下鼠抗生物素Fv区的结合区的结晶和X射线结构测定

[0496] 结合洋地黄毒苷的抗体的Fab片段结构的测定已经在WO 2011/003557和WO 2011/003780 中 详 细 描 述，还 在 Metz,S. 等 人 ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
108(2011)8194-8199中发表(3RA7)。

[0497] 测定鼠抗生物素抗体的结构。因此，采用现有技术的熟知方法(木瓜蛋白酶消化法)，通过蛋白酶消化纯化的IgG并随后纯化，产生Fab片段。

[0498] 为了结晶，将20mM His-HCl，140mM NaCl，pH 6.0中的apo Fab片段(纯化的Fab)浓缩至13mg/ml。通过在蒸气扩散坐滴实验中将0.2μl蛋白质溶液与0.2μl储液混合，在21℃建立结晶液滴。晶体在5日内从0.1M Tris pH 8.5，0.01M氯化钴、20％聚乙烯吡咯烷酮K15显现并且在8日内长成至最终尺寸0.3mm x 0.06mm x 0.03mm。

[0499] 晶体收获，同时以15％丙三醇作为低温保护剂，并且随后在液氮中快速冷冻。衍射图用Pilatus 6M检测器在温度100K以Swiss光源的光束线X10SA采集并且用程序XDS(Kabsch,W.,J.Appl.Cryst.26(1993)795-800)处理，并以SCALA(从BRUKER AXS获得)
放大，产生达 分辨率的数据。这个Fab片段晶体属于单斜晶空间群P21，晶胞尺度
和β＝117.53°，并且每个结晶学非对称单元含有
4个Fab分子(参见表3)。

[0500] 通过分子置换以PDB项3PQP作为检索模型，使用来自CCP4软件套件的标准结晶学程序解析结构，以计算电子密度并修正X射线结构(CCP4,Collaborative Computational Project,Acta Crystallogr.D,760-763(1994))。将结构模型使用COOT重建成电子
密 度 (Emsley,P. 等 人 ,Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.60(2010)486-501)。
坐 标 用 REFMAC5(Murshudov,G.N. 等 人 ,Acta Crystallogr.D Biol.
Crystallogr.53(1997)240-55)并用autoBUSTER(Global Phasing Ltd.)修正。

[0501] 表3：单斜晶muM33Fab片段apo-晶体的数据集合和结构修正统计结果

[0502]1

[0503] 括号中的值指最高分辨率库(bins)。2

[0504] Rmerge＝Σ|I-|/ΣI，其中I是强度。3