功能化纳米管肿瘤上的靶向自组装

申请号 CN201280070820.7 申请日 2012-12-28 公开(公告)号 CN104334178A 公开(公告)日 2015-02-04
申请人 斯隆-凯特琳癌症研究院; 发明人 戴维·A·沙因贝格; 迈克尔·R·麦克德维特; 卡洛斯·H·维拉; J·贾斯廷·马尔维;
摘要 本文提供用于将分子原位递送至细胞的方法和用于经由原位递送 治疗 癌症的方法。所述方法包括使细胞 接触 或向细胞施用作为两个单独组分的包含靶向部分的吗啉代寡核苷酸,随后是包含与第一吗啉代寡核苷酸互补的第二吗啉代寡核苷酸的单壁 纳米管 构建体和连接至所述单壁纳米管构建体的治疗或诊断有效负载分子中的一种或两者。在单壁纳米管复合物在细胞处经由所述第一吗啉代和第二互补吗啉代寡核苷酸杂交而自组装后,所述有效负载分子被递送。还提供两组分自组装单壁纳米管系统和包含第二组分的单壁纳米管构建体。
权利要求

1.用于将分子原位递送至目的细胞的方法,所述方法包括:
使所述细胞与连接至对所述细胞是选择性的靶向部分的吗啉代寡核苷酸接触
使经由所述靶向部分连接至所述目的细胞的所述吗啉代寡核苷酸与可溶性单壁纳米管构建体接触,所述可溶性单壁纳米管构建体具有多个与所述连接靶向部分的吗啉代寡核苷酸互补的吗啉代寡核苷酸和独立地连接至所述单壁纳米管的多个分子(M*),所述分子包含可递送的有效负载;和
使所述吗啉代寡核苷酸与所述互补的吗啉代寡核苷酸杂交以在所述细胞处形成自组装的可溶性单壁纳米管复合物,其中在杂交后,所述有效负载分子被原位递送至所述细胞。
2.权利要求1所述的方法,其中在所述单壁纳米管复合物自组装后,位于所述靶向的细胞上的抗原被加帽并且所述原位递送步骤包括将所述复合物内化到所述细胞中。
3.权利要求1所述的方法,其中所述吗啉代寡核苷酸和所述互补的吗啉代寡核苷酸都是18-聚体寡核苷酸。
4.权利要求3所述的方法,其中所述吗啉代寡核苷酸具有在SEQ ID NO:1中所示的序列并且所述互补的吗啉代寡核苷酸具有在SEQ ID NO:2中所示的序列。
5.权利要求1所述的方法,其中所述靶向部分是单克隆抗体或其片段或小分子配体,其各自对于与实体或弥散性癌症相关的细胞是选择性的。
6.权利要求5所述的方法,其中所述单克隆抗体是抗-CD20、抗-CD33或抗-A33单克隆抗体或其单链可变片段(scFv)或片段抗原结合(Fab)片段。
7.权利要求5所述的方法,其中所述单克隆抗体是所述原位递送的有效负载分子。
8.权利要求5所述的方法,其中所述小分子配体是叶酸受体配体或Arg-Gly-Asp肽。
9.权利要求5所述的方法,其中所述癌症是淋巴瘤、白血病或结肠癌。
10.权利要求1所述的方法,其中所述有效负载分子是诊断分子或治疗分子中的一种或两者。
11.权利要求10所述的方法,其中所述分子是经由双功能螯合剂连接至所述单壁纳米管的放射性核素。
12.权利要求11所述的方法,其中所述双功能螯合剂是(4-异硫氰酸苄
基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。
13.权利要求10所述的方法,其中所述诊断分子是铟-111、-64、碘-124、碘-131、钇-86、钆造影剂、锰造影剂或荧光团。
14.权利要求10所述的方法,其中所述治疗分子是锕-225、砹-211、锝-99、镥-177、镓-68、钬-166、铋-212、铋-213、钇-90、铜-67、钐-117、钐-153、碘-123或碘-131。
15.用于诊断受试者中的癌症的方法,所述方法包括:
向所述受试者顺序地施用自组装的单壁纳米管复合物的第一组分及其第二组分,所述第一组分具有对与所述癌症相关的细胞具有选择性、缀合至吗啉代寡核苷酸的靶向部分,所述第二组分包含单壁纳米管构建体,所述单壁纳米管构建体具有多个互补的吗啉代寡核苷酸和独立地与其缀合的诊断有效负载分子;和
在所述复合物的所述第一和第二组分在所述癌症相关细胞处自组装后,检测所述受试者中的所述诊断有效负载分子,从而诊断所述癌症。
16.权利要求15所述的方法,其中所述第一组分吗啉代寡核苷酸具有在SEQ ID NO:1中所示的序列并且所述第二组分互补的吗啉代寡核苷酸具有在SEQ ID NO:2中所示的序列。
17.权利要求15所述的方法,其中所述靶向部分是单克隆抗体或其片段或小分子配体。
18.权利要求17所述的方法,其中所述单克隆抗体是抗-CD20、抗-CD33或抗-A33单克隆抗体或其单链可变片段(scFv)或片段抗原结合(Fab)片段。
19.权利要求17所述的方法,其中所述小分子配体是叶酸受体配体或Arg-Gly-Asp肽。
20.权利要求15所述的方法,其中所述诊断有效负载分子是铟-111、铜-64、碘-124、碘-131、钇-86、钆造影剂、锰造影剂或荧光团。
21.权利要求15所述的方法,其中所述诊断有效负载经由双功能螯合剂连接至所述单壁纳米管。
22.权利要求21所述的方法,其中所述双功能螯合剂是(4-异硫氰酸苄
基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。
23.权利要求15所述的方法,其中所述癌症是淋巴瘤、白血病或结肠癌。
24.治疗受试者中的癌症的方法,所述方法包括:
向所述受试者顺序地施用用独立地连接至吗啉代寡核苷酸的靶向部分以及一种或多种治疗有效负载分子功能化的自组装的单壁纳米管复合物的第一组分和第二组分;其中所述第一和第二组分在由所述靶向部分靶向的与所述癌症相关的细胞上自组装,从而将所述治疗有效负载递送至所述细胞以治疗所述癌症。
25.权利要求24所述的方法,其中在自组装后,位于所述癌症相关细胞上的抗原被加帽并且所述复合物被内化到所述细胞中。
26.权利要求24所述的方法,其中所述自组装的单壁纳米管复合物的第一组分包含缀合至所述靶向部分的第一吗啉代寡核苷酸。
27.权利要求26所述的方法,其中所述第一吗啉代寡核苷酸具有在SEQ ID NO:1中所示的序列。
28.权利要求24所述的方法,其中所述自组装的单壁纳米管复合物的第二组分包含具有与所述第一吗啉代寡核苷酸互补的序列的多个第二吗啉代寡核苷酸和独立地连接至所述可溶性单壁纳米管的多个所述有效负载分子。
29.权利要求28所述的方法,其中所述第二互补的寡核苷酸各自具有在SEQ ID NO:2中所示的序列。
30.权利要求24所述的方法,其中所述治疗有效负载是经由双功能螯合剂连接至所述单壁纳米管的放射性核素
31.权利要求30所述的方法,其中所述双功能螯合剂是(4-异硫氰酸 苄
基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。
32.权利要求30所述的方法,其中所述放射性核素是锕-225、砹-211、锝-99、镥-177、镓-68、钬-166、铋-212、铋-213、钇-90、铜-67、钐-117、钐–153、碘-123、碘-125或碘-131。
33.权利要求24所述的方法,其中所述靶向部分是单克隆抗体或其片段或小分子配体,其各自对与实体或弥散性癌症相关的细胞是选择性的。
34.权利要求33所述的方法,其中所述单克隆抗体是抗-CD20、抗-CD33或抗-A33单克隆抗体或其单链可变片段(scFv)或片段抗原结合(Fab)片段。
35.权利要求33所述的方法,其中所述单克隆抗体是所述治疗有效负载分子。
36.权利要求33所述的方法,其中所述小分子配体是叶酸受体配体或Arg-Gly-Asp肽。
37.权利要求24所述的方法,其中所述癌症是淋巴瘤、白血病或结肠癌。
38.自组装单壁纳米管系统,所述自组装单壁纳米管系统包括:
具有连接至单克隆抗体或其片段的吗啉代寡核苷酸的第一组分;和
具有多个互补的吗啉代寡核苷酸和各自独立地连接至所述单壁纳米管的多个诊断或治疗分子中的一种或两者的第二组分。
39.权利要求38所述的自组装单壁纳米管系统,其中所述诊断和治疗分子是经由双功能螯合剂连接至所述单壁纳米的放射性核素。
40.权利要求39所述的自组装单壁纳米管系统,其中所述双功能螯合剂是(4-异硫氰酸苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。
41.权利要求39所述的自组装单壁纳米管系统,其中所述放射性核素是锕-225、砹-211、铟-111、锝-99、镥-177、镓-68、钬-166、铋-212、铋–213、钇-86、钇–90、铜-64、铜–67、钐-117、钐–153、碘-123、碘-124、碘-125或碘–131。
42.权利要求38所述的自组装单壁纳米管系统,其中所述单克隆抗体 是所述治疗分子。
43.权利要求38所述的自组装单壁纳米管系统,其中所述单克隆抗体是抗-CD20、抗-CD33或抗-A33抗体或其单链可变片段(scFv)或片段抗原结合(Fab)片段。
44.单壁纳米管构建体,所述单壁纳米管构建体包括
共价连接至所述单壁纳米管的多个双功能螯合剂;
螯合至各个双功能螯合剂的放射性核素;和
缀合至所述单壁纳米管的多个吗啉代寡核苷酸。
45.权利要求44所述的单壁纳米管构建体,其中所述双功能螯合剂是(4-异硫氰酸苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸或二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。
46.权利要求44所述的单壁纳米管构建体,其中所述放射性核素是锕-225、砹-211、铟-111、锝-99、镥-177、镓-68、钬-166、铋-212、铋–213、钇-86、钇–90、铜-64、铜–67、钐-117、钐–153、碘-123、碘-124、碘-125或碘–131。

说明书全文

功能化纳米管肿瘤上的靶向自组装

[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 此国际申请要求在35U.S.C.§119(e)下的临时申请美国序号61/581,228的优先权的益处,所述申请整体通过引用结合于此。
[0003] 联邦出资说明
[0004] 本发明利用在由美国国立卫生研究院奖励的资助金PO1 CA33049、RO1 CA55349、R21 CA128406和GM07739和由美国能源部奖励的资助金DE-SC0002456下的政府支持形成。政府具有本发明中的某些权利。
[0005] 发明背景
[0006] 发明领域
[0007] 本发明总体上涉及纳米医药、癌症治疗和肿瘤靶向的领域。更具体地,本发明涉及被功能化以将分子原位递送至细胞,例如癌细胞的自组装单壁纳米管复合物。
[0008] 相关技术描述
[0009] 快速扩展的纳米医药领域已经开始在第一代改造药物纳米粒子方面取得临床成功(1-2)。纳米医药涉及目标在于利用材料的尺寸、形状和电荷来改善药物递送或效率的合成纳米量级粒子的用途。另外,一些纳米材料的内在性质导致独特的物化性质。碳纳米管生物医药研究中已看到更宽的应用(3),部分因为附加一组不同的配体的潜,包括小分子(4)、肽(5-6)、寡核苷酸(7)、放射性同位素(8)、单克隆抗体(9-10)和其他靶向部分。
[0010] 碳纳米管的药代动力学和药效学看起来高度依赖于用来使它们成为可分散和生物相容的化学方法(11-12)。功能化和分散赋予水性环境中的稳定性并减轻潜在的毒性作用(13)。共价功能化的单壁化碳纳米管的允许其用作药物载体的一个重要特征是它们经由纵向肾小球滤过的快速肾清除率,不管明显的大分子量(14-16)。这种清除现象已称为纤维状药理学并且直接与球状蛋白质的药代动力学分布对比。
[0011] 典型地,在恶性肿瘤的系统靶向中,药物递送载体如mAb或纳米粒子附加有细胞毒性效应物如“单步骤”过程中的化学治疗小分子或放射性同位素。然而,体内效应物分子,特别是那些未结合或过量的效应物分子延长的半衰期,将增大毒性。相反,试剂的短循环时间有问题,因为它减少其中在血流中维持足够浓度以驱使肿瘤渗透和细胞结合的时间。
[0012] 两步骤靶向或预先靶向将载体的所需、缓慢、无毒的肿瘤靶向过程与细胞毒性剂的必要快速清除率分开以实现所需的药代动力学目标(17)。在此方法中,首先施用长时间循环的肿瘤选择性试剂,如单克隆抗体,并允许足够的循环时间,典型地2-5天,以在肿瘤处积累并使血流干净。这随后是快速清除(即,半衰期为<10min)与初始试剂具有高亲和性相互作用的第二步骤试剂(装配有细胞毒性或诊断效应物)。这种相互作用可以涉及链霉亲和素-生物素(18)、双特异性抗体-半抗原(19)、寡核苷酸杂交(20),或,最近,共价‘点击(click)’化学(21)。第二试剂与初始试剂快速平衡,同时还使血流干净。这种方法允许提高的肿瘤中细胞毒性或成像剂与血液中那些的比例以及浓度对时间的相应‘曲线下面积’,以及在其他现场组织中。预先靶向方法在之前已被开发(22-24),但是不包括递送大的有效负载并快速清除,增强治疗指数的第二步骤试剂。
[0013] 由于在这样的策略中的第二步骤需要快速清除率,所以这种试剂几乎总是小分子如改性生物素,或者单独的短寡核苷酸。然而,小分子限制效力和敏感性,因为它们通常分别被治疗或成像剂单取代。作为第二步骤,高度多价效应物应允许信号扩增,如毒素或诊断核素、多功能性,以及改善的结合亲和性(25-26)。然而,作为第二步骤,这样的多价构建体经常太大而不允许避免毒性所必需的快速清除时间。因此,共价改性的单壁化碳纳米管可以提供作为高度多价且多功能同时保持其快速清除的独特优势。
[0014] 因此,本领域对于使用单壁纳米管构建体的诊断和/或治疗分子或化合物的多步骤递送的改进方法存在公认的需要。现有技术在缺少这样的自组装单壁纳米管系统方面是匮乏的,该自组装单壁纳米管系统经由两步细胞靶向方法有效递送诊断和/或治疗化合物同时在细胞靶向期间没有延长暴露于细胞毒性试剂。本发明满足本领域这种长期的需求和期望。
[0015] 发明概述
[0016] 本发明涉及一种将分子原位递送至目的细胞的方法。所述方法包括使所述细胞接触连接至对所述细胞具有选择性的靶向部分的吗啉代寡核苷酸并使经由所述靶向部分连接至目的细胞的所述吗啉代寡核苷酸接触可溶性单壁纳米管构建体,所述可溶性单壁纳米管构建体具有与所述连接靶向部分的吗啉代寡核苷酸互补的多个吗啉代寡核苷酸和独立地连接至所述SWNT的多个分子,所述分子包含可递送的有效负载。所述吗啉代寡核苷酸与所述互补的吗啉代寡核苷酸杂交以在所述细胞处形成自组装的可溶性的单壁纳米管复合物,其中在杂交后,所述有效负载分子被原位递送至所述细胞。
[0017] 本发明还涉及一种用于诊断受试者中的癌症的方法。所述方法包括向所述受试者顺序地施用自组装单壁纳米管复合物的第一组分及其第二组分,所述一组分具有靶向部分,所述靶向部分对于与癌症相关的细胞具有选择性并且缀合至吗啉代寡核苷酸,所述第二组分包含单壁纳米管构建体,所述单壁纳米管构建体具有多个互补的吗啉代寡核苷酸和独立地与其缀合的多个诊断有效负载分子。在所述复合物的第一和第二组分在所述癌症相关细胞处自组装后在所述受试者中检测所述诊断有效负载分子,从而诊断所述癌症。
[0018] 本发明还涉及一种治疗受试者中的癌症的方法。所述方法包括向所述受试者顺序地施用用独立地连接至吗啉代寡核苷酸的靶向部分和一种或多种治疗有效负载分子功能化的自组装的SWNT复合物的第一组分和第二组分。所述第一和第二组分在由所述靶向部分靶向的与所述癌症相关的细胞上自组装,从而将所述治疗有效负载递送至所述细胞以治疗所述癌症。
[0019] 本发明还涉及自组装单壁纳米管(SWNT)系统。所述自组装SWNT系统是具有两个组分的系统。第一组分具有连接至单克隆抗体的吗啉代寡核苷酸。第二组分具有多个互补的吗啉代寡核苷酸和各自独立地连接至所述SWNT的多个诊断或治疗分子中的一个或两者。
[0020] 本发明还仍然涉及单壁纳米管构建体。所述单壁纳米管构建体包含共价连接至单壁纳米管的多个双功能螯合剂、螯合至各个双功能螯合剂的放射性核素和缀合至所述单壁纳米管的多个吗啉代寡核苷酸。
[0021] 本发明的其他和进一步方面、特征和优点根据以下本发明目前优选的实施方案的描述将是明显。给出这些实施方案用于充分公开的目的。
[0022] 附图简述
[0023] 为了使其中将变得明显的本发明的上述特征、优点和目的,以及其他方面的事情达成并且可以详细理解,在附图中示出了以上简短概述的本发明的更具体描述和某些实施方案。这些附图形成本说明书的一部分。然而,应注意,附图举例说明本发明的优选实施方案并因此不认为是限制本发明的范围。
[0024] 图1A-1D示出了自组装SWNT-cMORF构建体的设计和HPLC表征。图1A-1B显示SWNT-NH2化学功能化以产生放射性和荧光标记的SWNT-cMORF缀合物的合成方案。图1C是追踪洗脱的材料随时间的谱的化合物3(SWNT-cMORF-NH2)的3D凝胶渗透HPLC色谱。仅单个峰是明显的并且该谱与用二芳基腙(bis-aryl hydrazone)基团改性的单壁化碳纳米管一致(肩部在λ=~354nm)并且通过600nm吸收降低,其是所有纳米管的品质。图1D是在mAb-MORF靶向的肿瘤细胞上的SWNT-cMORF自组装的图示(不成比例)。三形是肿瘤抗原;点是附加的细胞毒性或诊断部分。
[0025] 图2A-2E示出了SWNT-cMORF在体外并且在血清存在下与多个mAb-MORF杂交。图2A显示单独的SWNT-cMORF(右侧峰)、单独的抗-CD20-MORF(中间峰)和与抗-CD20-MORF混合的SWNT-cMORF(左侧峰)的尺寸排阻HPLC。此色谱证实当SWNT-cMORF和mAb-MORF组合时保留时间位移,表明形成了大的、多聚体的mAb-SWNT复合物。图2B显示当组合
111
SWNT-cMORF- In(DOTA)与抗-CD20-MORF并追踪与单独的SWNT-cMORF(实线)或当与所述抗体混合时的SWNT-cMORF(虚线)相关的放射标记时,获得类似结果。图2C显示在与
111
抗-A33-MORF抗体混合的SWNT-cMORF- In(DOTA)情况下观察到类似的峰位移模式,证实复合物形成与抗体身份无关。图2D显示当在100%血清存在下混合两个组分时仍然发生复合物形成(虚线)并且这可以在将过量的游离cMORF添加到混合物中时被阻断(实线)。
111
图2E显示仅在添加互补的mAb-MORF时SWNT-cMORF- In(DOTA)可以由蛋白质A小珠俘获。
杂交的效率不受血清影响,并且可以通过添加过量的游离cMORF阻断。
[0026] 图3A-3E示出了在用mAb-MORF预先靶向的肿瘤细胞上SWNT-cMORF的自组装是高度特异的和高度亲和的。图3A显示在HL60细胞上SWNT-cMORF-AF647的结合的流式细胞测定的量化。预处理利用HL60特异性抗-CD33-MORF,同种型对照抗-CD20-MORF,或特异性抗-CD33-MORF+用过量的游离cMORF阻断。数据表示为中值荧光的变化。图3B显示在DAUDI细胞上SWNT-cMORF-AF647的结合的流式细胞测定的量化。预处理利用DAUDI特异性抗-CD20-MORF,同种型对照抗-CD33-MORF,或特异性抗-CD20-MORF+用过量的游离cMORF阻断。图3C显示在LS174T细胞上SWNT-cMORF-AF647的结合的流式细胞测定的量化。预处理利用LS174T特异性抗-A33-MORF,同种型对照抗-CD33-MORF,或特异性抗-A33-MORF+用过量的游离cMORF阻断。图3D显示在未处理的(红色)、同种型对照预先靶向的(黑色)、特异性预先靶向的+cMORF阻断(蓝色)或特异性预先靶向的(绿色)细胞上利用SWNT-cMORF-AF647的细胞结合测定的代表性流式细胞术图示。图3E显示在抗-CD20预先靶向的Daudi细胞(方形)和抗-A33预先靶向的LS174T细胞(三角形)上SWNT-cMORF-AF6472
的结合曲线。使用用于具有可变Hill斜率(R =0.95,0.97)的一个位点的特异性结合的算法,使用GraphPad Prism来拟合曲线。
[0027] 图4A-4E证实SWNT-cMORF缀合物当在用mAb-MORF靶向的细胞上自组装时能够诱导抗原加帽和内化。图4A显示在37℃抗-A33(右)保持稳定地结合至LS174T细胞(右,DAPI核染色)达24小时(显示了4小时)以及它们关于细胞膜均匀地分布。图4B显示抗-A33-MORF缀合物(右)当结合至LS174T细胞(右)时表现出类似的表面稳定性。图4C显示用A33-MORF(中间)接着用SWNT-cMORF-AF647(右)预处理的细胞,允许在37℃自组装达4小时,证实结合的抗体的分布的显著变化,连同分散的点状染色的变化。对于30min和1h温育观察到类似的模式。图4D是用抗-A33-MORF接着用SWNT-cMORF-AF647处理的单个LS174T细胞的大功率视图并且示出了抗体的出现和指示囊泡摄取的纳米管阳性胞内点状染色。图4E显示用抗-A33-MORF(中间)并且接着用单独的cMORF-AF647(右)处理的细胞不展现A33关于细胞膜的分布的变化。抗-A33-MORF关于细胞质膜均匀分布,并且cMORF-AF647与靶向的mAb-MORF共定位
[0028] 图5A-5C示出了SWNT-cMORF可以在体内在预先靶向的肿瘤上选择性地自组装。图5A是收获自用同种型对照抗-CD33-MORF或肿瘤特异性抗-CD20-MORF处理的小鼠的Daudi-GFP细胞的流式细胞术分析。数据表示为与未处理的Daudi-GFP细胞相比的中值荧光的位移。显示了两个代表性小鼠。SWNT-cMORF选择性地结合至用特异性抗体预先靶向的小鼠中的肿瘤细胞,如通过相对于对照的20倍增加所证实的。图5B是图4A中的数据的代表性流式细胞术图示,显示未处理的细胞(前侧峰)、同种型mAb-MORF处理的细胞(中间
111
峰)和特异性mAb-MORF处理的细胞(后侧峰)。图5C显示在注射SWNT-cMORF- In(DOTA)后24小时,用特异性HuA33-MORF或同种型对照抗-CD33-MORF预先靶向的LS174T有肿瘤小鼠的组织血液比。相比于正常组织(肌肉显示为代表性正常组织),仅在用特异性抗体预先靶向的组织中SWNT-cMORF的肿瘤积累显著增加(p<0.05)。
[0029] 图6A-6C显示SWNT-cMORF-225Ac(DOTA)减轻放射性同位素毒性并且可以在弥散性淋巴瘤的多步骤疗法中用作有效试剂。图6A显示用不同剂量水平的225Ac标记的SWNT-cMORF-DOTA处理的无肿瘤小鼠的整体动物重量。另外的一组小鼠接受450nCi的游离225Ac作为对照。数据反映平均重量。所有组n=5。通过星号记录动物死亡。图6B显示由治疗组组织的在暴露于SWCNT-cMORF-225Ac(DOTA)后140天宰杀的存活小鼠的平均器官重量。图6C显示被注射以5mg/ml荧光素并在5分钟延迟后成像的之前植入有荧光素酶转染的Daudi淋巴瘤细胞的小鼠。发光等级对所有图像相同。小鼠用如之前所述的多步骤疗法治疗并在治疗后第0、3、6和15天成像。
[0030] 发明详述
[0031] 如本文使用的,术语"一个"或"一种"可以指一个或多个。如本文使用的,在权利要求书中,当联合词语"包括"使用时,词语"一个"或"一种"可以指一个或多于一个。如本文使用的,"另一个"或“其他”可以指相同或不同权利要求要素或其组分的至少第二个或更多个。
[0032] 如本文使用的,除非明确指示仅是指备选或备选是互斥的,术语“或”在权利要求书中是指“和/或”,尽管本公开内容支持仅是指备选和“和/或”的定义。
[0033] 如本文使用的,"另一个"或“其他”可以是指至少第二个或更多个的相同或不同的权利要求要素或其组分。"包括"是指"包含"。
[0034] 如本文使用的,术语“约”是指这样的数值,其包括例如整数、分数和百分数,无论是否明确指示。术语“约”通常是指本领域技术人员会认为与所列出的值相当(例如,具有相同功能或结果)的数值范围(例如,所列出的值的+/-5-10%)。在一些情况下,术语“约”可以包括舍入到最接近有效数字的数值。
[0035] 如本文使用的,术语“接触”是指使如本文所述的包含自组装单壁纳米管系统的两个组分之一或两者与细胞或包含其的抗原接触的任何合适方法。在体外或体外,这通过使细胞暴露于在合适介质中的组分而实现。对于体内应用,任何已知的施用方法是合适的。
[0036] 如本文使用的,术语“SWNT”是指这样的单壁纳米管(SWNT),其具有适合生物缀合的功能性下垂部分或手柄,如侧壁胺或羰基。
[0037] 如本文使用的,术语“MORF”和“cMORF”是指具有吗啉主链或吗啉代寡核苷酸的合成DNA类似物。cMORF寡核苷酸的序列与MORF寡核苷酸的序列互补。这样,术语“mAB-MORF”或“MORF-mAB”是指经由标准化学方法连接至单克隆抗体的吗啉代寡核苷酸。
[0038] 如本文使用的,“M*”是指可用作病理生理病症例如癌症的治疗剂或诊断剂的可螯合放射性金属或其他放射性核素或可螯合造影剂如非放射性核素。这样,“M*-DOTA”是指螯合至双功能螯合剂(4-异硫氰酸苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或二乙烯三胺五乙酸(DTPA)(其本身直接连接至SWNT)的放射性金属。
[0039] 如本文使用的,术语“SWNT-cMORF”是指具有多个吗啉代寡核苷酸的单壁纳米管,所述多个吗啉代寡核苷酸具有的序列与包含mAB-MORF寡核苷酸的MORF寡核苷酸互补。这样,术语“SWNT-(cMORF-(mAB-MORF))”是指其中cMORF寡核苷酸杂交至MORF寡核苷酸的自组装复合物。
[0040] 如本文使用的,SWNT-(M*DOTA)-(cMORF-(mAB-MORF))”是指这样的自组装的SWNT-(cMORF-(mAB-MORF))复合物,其中单壁纳米管还包含经由双功能螯合剂(4-异硫氰酸苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或二乙烯三胺五乙酸(DTPA)连接至SWNT的放射性金属或其他放射性核素或可螯合造影剂。
[0041] 如本文使用的,术语“受试者”是指如本文所述的SWNT自组装组分或SWNT构建体的任何接受者。
[0042] 在本发明的一个实施方案中,提供一种将分子原位递送至目的细胞的方法,所述方法包括使细胞接触连接至对所述细胞具有选择性的靶向部分的吗啉代寡核苷酸;使经由所述靶向部分连接至所述目的细胞的吗啉代寡核苷酸接触可溶性单壁纳米管构建体,所述可溶性单壁纳米管构建体具有与所述连接靶向部分的吗啉代寡核苷酸互补的多个吗啉代寡核苷酸和独立地连接至所述单壁纳米管的多个分子(M*),所述分子包含可递送的有效负载;和将所述吗啉代寡核苷酸杂交至所述互补的吗啉代寡核苷酸以在所述细胞处形成自组装的可溶性单壁纳米管复合物;其中在杂交后,所述有效负载分子被原位递送至所述细胞。在此实施方案的一个方面,原位递送步骤可以包括经由所述自组装的SWNT–mAB复合物给位于靶向的细胞上的抗原加帽;以及将所述复合物内化到所述细胞中。
[0043] 在此实施方案中,在单壁纳米管复合物自组装后,位于靶向的细胞上的抗原可以被加帽并且原位递送步骤可以包括将复合物内化到所述细胞中。而且,吗啉代寡核苷酸和互补的吗啉代寡核苷酸都可以是18-聚体寡核苷酸。特别地,吗啉代寡核苷酸可以具有在SEQ ID NO:1中所示的序列,并且互补的吗啉代寡核苷酸可以具有在SEQ ID NO:2中所示的序列。
[0044] 而且在此实施方案中,靶向部分可以是单克隆抗体或其片段或小分子配体,其各自对与实体或弥散性癌症相关的细胞具有选择性的。在一个方面,单克隆抗体可以是抗-CD20、抗-CD33或抗-A33单克隆抗体或其单链可变片段(scFv)或片段抗原结合(Fab)片段。在另一方面,单克隆抗体本身可以是原位递送的有效负载分子。在另一方面,小分子配体可以是叶酸受体配体或Arg-Gly-Asp肽。癌症的代表性实例是淋巴瘤、白血病或结肠癌。
[0045] 另外,有效负载分子可以是诊断分子或治疗分子中的一种或二者。所述分子可以是经由双功能螯合剂连接至SWNT的放射性核素。双功能螯合剂的代表性实例是(4-异硫氰酸苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。在一方面,诊断分子可以是铟-111、-64、碘-124、碘-131、钇-86、钆造影剂、锰造影剂或荧光团。在另一方面,治疗分子可以是锕-225、砹-211、锝-99、镥-177、镓-68、钬-166、铋-212、铋–213、钇–90、铜-67、钐-117、钐-153、碘-123、碘-125或碘-131。
[0046] 在本发明的另一个实施方案中,提供了一种用于诊断受试者中的癌症的方法,所述方法包括向受试者顺序地施用自组装的单壁纳米管复合物的第一组分及其第二组分,所述第一组分具有靶向部分,所述靶向部分对与癌症相关的细胞具有选择性的,缀合至吗啉代寡核苷酸,所述第二组分包含单壁纳米管构建体,所述单壁纳米管构建体具有多个互补的吗啉代寡核苷酸和独立地与其缀合的多个诊断有效负载分子;和在所述复合物的第一和第二组分在所述癌症相关细胞处自组装后检测所述受试者中的诊断有效负载分子,从而诊断癌症。
[0047] 在此实施方案中,第一组分吗啉代寡核苷酸可以具有在SEQ ID NO:1中所示的序列,并且第二组分互补的吗啉代寡核苷酸可以具有在SEQ ID NO:2中所示的序列。而且,靶向部分可以是单克隆抗体或其片段或小分子配体。单克隆抗体或其片段以及小分子配体的代表性实例如上所述。另外,诊断有效负载可以经由双功能螯合剂连接至单壁纳米管。另外,双功能螯合剂和癌症如上所述。此外,诊断有效负载分子可以是铟-111、铜-64、碘-124、碘-131、钇-86、钆造影剂、锰造影剂或荧光团。
[0048] 在本发明的另一个实施方案中,提供了一种治疗受试者中的癌症的方法,所述方法包括向受试者顺序地施用用独立地连接至吗啉代寡核苷酸的靶向部分和一种或多种治疗有效负载分子功能化的自组装的单壁纳米管复合物的第一组分和第二组分;其中第一和第二组分在由靶向部分靶向的与癌症相关的细胞上自组装,从而将治疗有效负载递送至所述细胞以治疗癌症。
[0049] 在一方面,自组装的SWNT复合物的第一组分可以包含缀合至靶向部分的第一吗啉代寡核苷酸。第一吗啉代寡核苷酸可以具有在SEQ ID NO:1中所示的序列。在另一方面,自组装的单壁纳米管复合物的第二组分可以包含具有与第一吗啉代寡核苷酸互补的序列的多个第二吗啉代寡核苷酸和独立地连接至可溶性单壁纳米管的多个有效负载分子。第二互补的吗啉代寡核苷酸可以具有在SEQ ID NO:2中所示的序列。
[0050] 在其所有实施方案和方面中,在复合物自组装后,位于癌症相关细胞上的抗原可以被加帽并且所述复合物可以被内化到细胞中。而且,所述治疗有效负载可以是经由双功能螯合剂连接至单壁纳米管的放射性核素。双功能螯合剂的代表性实例如上所述。治疗放射性核素可以是锕-225、砹-211、锝-99、镥-177、镓-68、钬-166、铋-212、铋–213、钇-90、铜-64、铜-67、钐-117、钐-153、碘-123、碘-125或碘-131。备选地,单克隆抗体可以是治疗有效负载分子。包括单克隆抗体或其片段和小分子配体在内的靶向部分以及癌症如上所述。
[0051] 在本发明的另一个实施方案中,提供了一种自组装单壁纳米管复合物,其包括具有连接至单克隆抗体或其片段的吗啉代寡核苷酸的第一组分;和具有多个互补的吗啉代寡核苷酸和各自独立地连接至单壁纳米管的多个诊断或治疗分子之一或二者。
[0052] 在此实施方案中,诊断和治疗分子可以是经由双功能螯合剂如DOTA或DTPA连接至单壁纳米管的放射性核素,如上所述。放射性核素的代表性实例是锕-225、砹-211、铟-111、锝-99、镥-177、镓-68、钬-166、铋-212、铋–213、钇-86、钇–90、铜-64、铜–67、钐-117、钐–153、碘-123、碘-124、碘-125或碘–131。另外,单克隆抗体可以是所述治疗分子。单克隆抗体或其片段的实例可以是抗-CD20、抗-CD33或抗-A33抗体或其单链可变片段(scFv)或片段抗原结合(Fab)片段。
[0053] 在本发明的另一个实施方案中,提供了一种单壁纳米管构建体,其包括共价连接至单壁纳米管的多个双功能螯合剂;螯合至每个双功能螯合剂的放射性核素;和缀合至单壁纳米管的多个吗啉代寡核苷酸。在此实施方案中,用于诊断或治疗分子或有效负载分子的双功能螯合剂和放射性核素如上所述。
[0054] 本文提供在用于将分子或有效负载递送至细胞的多步自组装方法中有用的单壁纳米管构建体、系统和方法。单壁化碳纳米管与吗啉代寡核苷酸序列的缀合(SWNT-cMORF)给它们提供以次纳摩尔亲和性并且在生理条件下与附带有互补的寡核苷酸的癌症选择性抗体(mAb-MORF)自组装的能力。自组装促进靶抗原复合物内化,这使得能够经由通常非内化的靶标将诊断和/或治疗剂递送到细胞中。
[0055] 一般地,自组装单壁纳米管(SWNT)系统包括两个组分。第一组分包含连接至靶向部分(如单克隆抗体或其片段或其他靶向肽或配体)的吗啉代寡核苷酸。优选地,靶向部分是单克隆抗体或其单链可变片段(scFv)或片段抗原结合(Fab)片段,并且第一组分具有结构mAb-MORF或MORF-mAb。备选地,靶向部分可以是小分子配体,如但不限于,Arg-Gly-Asp(RGD)肽或叶酸受体配体。靶向部分可以经由标准化学方法连接至吗啉代寡核苷酸。优选地,靶向部分将靶向与癌症相关的细胞。
[0056] 所述系统中的第二组分包含合成的、共价改性的SWNT,其带有多个副本的合成寡核苷酸类似物,例如,吗啉代寡核苷酸(cMORF)和荧光团和/或放射性同位素或其他核素。SWNT和吗啉代(morpholino)之间的连接(SWNT-cMORF)可用光谱量化,其中200nm的SWNT约5-15个吗啉代。SWNT-cMORF缀合物可以经由杂交至吗啉代寡核苷酸MORF以优异特异性和高亲和性在抗体靶向的癌细胞表面上自组装。
[0057] 吗啉代寡核苷酸及其补体可以是短寡核苷酸,如18-聚体寡核苷酸,例如,但不限于,在SEQ ID NOS:1和2中的互补序列,如实施例1中所示。与基于蛋白质的对相比,吗啉代寡核苷酸免疫原性更低(28)。这允许多次施用和潜在更复杂的多步骤自组装构建体、复合物和系统。
[0058] 多价自组装系统可以触发抗原加帽和mAb-MORF靶标的内化,即使是在其他表面稳定抗原中。这种内化可以是SWNT-cMORF与多个mAb-MORF靶标自组装(模拟表面受体的交联)的能力的结果。通过系统组分的自组装触发表面抗原内化的能力可以增强附加到SWNT的试剂的治疗效力。因此,自组装中的第二步也可以触发初始靶向试剂的内化,从而在靶向细胞内俘获细胞毒性试剂并改善治疗指数。
[0059] 这样,本发明的自组装构建体、系统和复合物在用于治疗病理生理状态,如实体或弥散性癌症中是有效的载体。代表性实体和弥散性癌症可以是但不限于结肠癌、淋巴瘤和白血病。治疗放射性核素可以使用SWNT-cMORF构建体递送至癌细胞。治疗放射性核素可以是但不限于锕-225、砹-211、锝-99、镥-177、镓-68、钬-166、铋-212、铋–213、钇–90、铜–67、钐-117、钐–153、碘-123、碘-125或碘–131。
[0060] 而且,所述自组装构建体、系统和复合物可用于在诊断测定中在体内在体外检测和诊断病理生理状态或病症。SWNT-cMORF可以包含连接至SWNT的造影剂、诊断放射性核素或荧光团。例如,诊断放射性核素可以是但不限于铟-111、铜-64、碘-124、碘-131或钇-86。其他非放射性核素诊断试剂可以是钆造影剂、锰造影剂或荧光团,如本领域已知的。预期基于超顺磁性的造影剂也可以用作本文提供的方法和组合物中的诊断试剂。
[0061] 给出以下实施例用于举例说明本发明的不同实施方案的目的而不意图以任何方式限制本发明。
[0062] 实施例1
[0063] 方法和材料
[0064] SWNT的改性
[0065] 高纯度(>90%)单壁化碳纳米管获自NanoLab Inc(Waltham,MA)。这些电弧放电制备的单壁化碳纳米管根据所描述的方案(33)反应以制备SWNT-NH2。SWNT-NH2产物通过施用并在20%乙腈:0.1M乙酸三乙胺中洗涤而在C18Seppak(Waters)上纯化。纯化的产物用50%乙腈:水洗脱。然后将此溶液冻干以得到深褐色SWNT-NH2固体,或直接稀释到碳酸氢盐缓冲液(0.1M Na HCO3,pH 9)中。向SWNT-NH2加入0.6mmol/g的PEG4/PFB(Solulink)长链交联剂。允许此反应在室温进行2小时。然后反应混合物在一次性台式10-DG尺寸排阻柱(Biorad)上纯化,其中带有SWNT-4FB-NH2产物的醛和胺洗脱到0.1M MES,0.15M NaCl,pH 5.5缓冲液中。
[0066] MORF和cMORF与纳米管和抗体的缀合
[0067] 吗啉代寡核苷酸(MORF,序列:TCTTCTACTTCACAACTA,SEQ ID NO:1)cMORF,序列:TAGTTGTGAAGTAGAAGA,SEQ ID NO:2)惯例合成(Gene Tools Inc.),并且在3’端上含有伯胺。该伯胺用醛或肼部分加帽用于分别缀合抗体或纳米管。MORF-NH2/cMORF-NH2在含有20%乙腈的0.1M碳酸氢钠缓冲液中与20倍过量的琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯(succinimidyl 4-formyl benzoate)(Thermo Scientific)或琥珀酰亚胺基肼基烟酰胺(succinimidyl hydrazinonicotinamide)(Thermo Scientific)反应。游离的衔接物通过凝胶过滤色谱在10-DG柱(Bio-Rad)上除去,并且吗啉代(morpholinos)纯化到0.1M MES,0.15M NaCl,pH 5.5的缓冲液中。
[0068] 在含有25%乙腈的0.1M MES,0.15M NaCl,pH5.5缓冲液中,cMORF-HyNic与SWNT-4FB-NH2以每克单壁碳纳米管0.2mmol的cMORF的比例混合。允许反应在37℃进行6小时,然后在振荡下在室温过夜。SWNT-cMORF-NH2产物通过用在0.1M TEAA中的25%乙腈在C18Seppak(Waters)上洗涤进行纯化。产物用50%乙腈:水洗脱然后冻干以获得固体产物。产物通过反相C18HPLC验证没有cMORF-HyNic。
[0069] 将单克隆抗体HuM195(Lintuzumab;Sloan-Kettering)/抗-CD33,Rituximab/抗-CD20(Genentech)和huA33/抗-A33(Ludwig Institute)稀释到0.1M磷酸钠,0.15M NaCl,pH 7.6的改性缓冲液中。向抗体溶液中缓慢加入10至15倍过量的琥珀酰亚胺基肼烟酰胺。抗体反应2小时接着在10-DG凝胶过滤柱上纯化。腙改性的mAbs(mAb-HyNic)洗脱到0.1MMES,0.15M NaCl,pH 5.5中。然后mAb-HyNic与醛改性的MORF-4FB以8个MORF/抗体的比率反应并在温和振荡下在室温反应至少12小时。剩余的游离MORF-4FB通过在100,000MWCO离心过滤装置(Amicon Ultra,Millipore)上纯化而除去,其中在PBS中至少洗涤三次。蛋白质通过DC蛋白质测定(Biorad)量化并且附着的吗啉代通过二芳基腙生色团(bis-aryl hydrazone chromophore)(λmax=354nm)利用光谱量化。mAb-MORF缀合物的纯度通过HPLC在Superdex 200柱上验证。
[0070] 放射标记
[0071] SWNT-cMORF-NH2溶解在0.1M碳酸氢钠的缓冲液中,该缓冲液之前用Chelex100树脂(Bio-Rad)处理以使缓冲液没有二价金属。向此溶液中添加比例为10mmol/g的胺反应性2-(4-异硫氰酸苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA-SCN,Macrocyclics)。将此反应在室温保持2小时,接着在10-DG凝胶过滤柱上纯化,该过滤柱之前用25mM DTPA处理以使基质不含金属。产物在无金属蒸馏H2O中洗脱并冻干以获得固体SWNT-cMORF-DOTA产物。此产物在50℃通过添加在含有20%乙腈的乙酸铵缓
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冲液(1M),pH 5中的放射性同位素用 InCl3(MDS Nordion)放射标记达0.5小时的时间。
标记混合物通过加入50mM DTPA猝灭并在10-DG凝胶过滤柱上纯化到PBS中。放射化学纯度通过即时薄层色谱法(使用的流动相为10mM EDTA和0.9%NaCL/10mM NaOH)测量(8)。
ITLC条使用System 400Imaging Scanner(Bioscan,Inc.)计数。放射化学纯度在5次重复标记反应中为>90%并且通过在HPLC上的放射性检测确认。
[0072] HPLC测定
[0073] 所有高效液相色谱法在配有内嵌的γ-RAM模式3放射性检测器(IN/US)的System Gold Bioessential 125/168二极管阵列检测仪器(Beckman Coulter)上进行。使用32Karat色谱法软件(Beckman Coulter)和Prism图形化和分析软件(Graphpad)二者进行分析。凝胶过滤色谱法在20mM乙酸钠,0.15M氯化钠,pH 6.5等度流动相中在Superdex200柱上进行。反相HPLC利用在0.1M TEAA中的20%乙腈至100%乙腈的梯度在Gemini C18柱(Phenomenex)上进行。对于抗体-纳米管杂交测定,样品在磷酸盐缓冲盐水中混合,除非另有说明,在注入到HPLC柱上之前,在150μL总体积中达5分钟。
[0074] 共焦显微镜
[0075] LS174T细胞以50,000个细胞/mL接种到组织培养物处理的、聚赖酸涂覆的、多孔分室载玻片(Nunc)上达24小时。这些载玻片在37℃用10nM的抗-A33-MORF、抗-A33或对照抗-CD19-MORF抗体中的一种处理4小时。然后洗掉未结合的抗体,并且细胞用单独的培养基、含有7.5μg/mL SWNT-cMORF-AF647缀合物的培养基或含有100nM荧光标记的cMORF-AF647的培养基处理。然后细胞在37℃温育达4小时。在规定的时间点(30min、1h、4h),将细胞用PBS洗涤并用4%中性缓冲的多聚甲醛固定。为了可视化抗-A33抗体,细胞用含有0.5%BSA和0.2%Triton-X的PBS缓冲液透性化(permeabilized),然后用Alexa Fluor 488标记的抗-人IgG(Invitrogen)的1:500稀释液染色。在染色后,洗涤细胞并安放在含有DAPI核染色剂(Invitrogen)的Prolong Gold介质中。SWNT-cMORF和cMORF可以通过连接的AF647荧光团直接可视化。在激光扫描共焦成像系统(Leica)上进行成像,其中设置在不同细胞处理条件的可视化上保持。
[0076] 细胞结合
[0077] Daudi B细胞淋巴瘤,LS174T结肠腺癌和HL60早幼粒细胞性白血病细胞系获自ATCC并在37℃在5%CO2中,在含有10%FBS的RPMI中培养。GFP转染的Daudi通过如之前所述(9)的逆转录病毒转染制备。在流式细胞术测定之前,将细胞悬浮在含有2%人血清作为封闭剂的冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)或(或当注明时)100%人血清中。悬浮培养物通过离心和重悬洗涤,同时使粘附细胞在含有EDTA的0.05%胰蛋白酶(Gibco)中胰蛋白酶化,接着洗涤。悬浮液中的细胞首先在冰上或在37℃与10nM的mAb-MORF结合1小时。在mAb-MORF处理后,细胞用结合缓冲液洗涤,然后与浓度范围达10μg/mL的SWNT-cMORF-AF647缀合物结合。细胞通过离心/重悬洗涤并在Accuri C6流式细胞仪(Accuri,Inc.)上读数。数据使用Flojo分析软件(TreeStar,Inc.)处理。
[0078] 体内结合研究
[0079] 所有小鼠都是雌性NCI nu/nu,4-6周龄,并且所有动物研究在实验动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准下进行。对于Daudi淋巴瘤模型,Daudi细胞在悬浮液中培养,接着用冷PBS洗涤并重悬在0.9%NaCl(Hospira,Inc.)中。然后给小鼠注射2千万个细胞/小鼠。在6小时后,小鼠接着用Daudi特异性抗-CD20利妥昔单抗(Rituximab)(抗-CD20-MORF)或同种型对照抗-CD33HuM195(抗-CD33-MORF)的3μg吗啉代缀合物处理。16小时后,小鼠接着腹膜内注射2μg的SWNT-cMORF-AF647。允许SWNT-cMORF-AF647循环和靶向达4小时,之后杀死小鼠并通过用冰冷PBS灌洗腹膜内腔收集淋巴瘤细胞。此细胞悬浮液用PBS洗涤,通过细胞粗滤器以除去碎片,并在Accuri C6流式细胞仪上运行。细胞悬浮液在FL1通道中控Daudi-GFP细胞,然后在FL4通道中测量SWNT-cMORF-AF647的荧光。数据在FloJo细胞术软件(TreeStar,Inc.)上分析。
[0080] 对于实体瘤研究,4-6周龄雌性NCI nu/nu小鼠皮下异种移植5百万个LS174T细胞到右侧腹中。细胞悬浮在Matrigel基质(BD)和冰冷的PBS的1:1混合物中。一旦肿3
瘤达到~150mm,在约7天,小鼠用腹膜内注射稀释在生理盐水中的20μg的肿瘤特异性抗-A33-MORF或同种型对照抗-CD33-MORF抗体处理。在用抗体处理后72小时,经由眼眶
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后静脉窦给小鼠静脉内注射12μg的SWNT-cMORF- In(DOTA)。利用汽化室(VetEquip)施用异氟烷麻醉。SWNT-cMORF-111In(DOTA)的典型特异性活性为~2-3Ci/g并且施用每只小鼠24-36μCi的总活性。在不同时间点,杀死小鼠,收获它们的器官并称重,并在Cobra IIγ计数器(Packard)上计数放射性。
[0081] 生物分布
[0082] SWNT-cMORF-DOTA如之前所述用99.7%放射化学纯度的111In标记。30只4-6周龄的BALB/c小鼠(NCI Labs)随机分成6组,每组5只小鼠。每只小鼠腹膜内注射在200uL无菌生理盐水中的3200nCi的SWNT-cMORF-111In(DOTA)。在1、4、8、12和24小时杀死小鼠。收集含有排泄的尿液和粪便的来自笼子的垫层用于量化。从杀死的小鼠收获肾、、肌肉、心脏、血液、肝、脾、肠和骨,并且如之前所述量化每种器官的%注射剂量。
[0083] 体内毒性学研究
[0084] SWNT-cMORF-DOTA用98.4%放射化学纯度的225Ac标记。45只4-6周龄的BALB/c小鼠(NCI Labs)。小鼠随机分成9组,每组5只小鼠,并接受如表1所示的单次注射。
[0085] 表1
[0086]
[0087] 在10小时从每个组完整地收集垫层以确定除去。每个组在140天内定期视觉评估并称重,同时将每只小鼠的肝、脾、骨髓和肾进行组织学分析。根据标准方案进行石蜡包埋的组织切片的苏木精和曙红(H&E)染色。由对治疗组不知情的MSKCC兽医学病理学家进行组织学评价。
[0088] 体内治疗研究
[0089] SWCNT-cMORF-DOTA用96%放射化学纯度的225Ac标记。吗啉代标记的利妥昔单抗(3.5MORF/抗体)如之前详述地制备。试剂的结合选择性在体外利用111In标记的SWCNT-cMORF-DOTA作为报道分子在用HL60细胞和吗啉代标记的Hum195(3.74MORF/抗体)的交叉控制下确认。给4-6周龄的CB17SC-F SCID小鼠(Taconic Labs)腹膜内注射在200uLPBS中的2千万个表达萤火虫荧光素酶的Daudi淋巴瘤细胞。在一周后,使用IVIS
200成像系统(Caliper Sciences)对小鼠成像以确认在将用于治疗实验的所有小鼠中的肿瘤生长。图像在腹膜内注射200μL的5mg/mL荧光素后5min进行。
[0090] 然后将小鼠随机分成10个治疗组(每个组5只小鼠),各自在0和24小时接受两次相继的注射:1)盐水和盐水对照;2)1.5μg利妥昔单抗-MORF和盐水对照;3) 盐 水 和 SWCNT-cMORF-DOTA(0nCi 225Ac)(3.57μg) 对 照;4)1.5ug HuM195-MORF和 SWCNT-cMORF-DOTA(333nCi225Ac,1.19μg) 对 照;5)1.5μg HuM195-MORF 和SWCNT-cMORF-DOTA(666nCi 225Ac,2.38μg) 对 照;6)1.5μg Hum195-MORF 和SWCNT-cMORF-DOTA(999nCi 225Ac,3.57μg) 对 照;7)1.5ug 利 妥 昔 单 抗 -MORF和 SWCNT-cMORF-DOTA(333nCi 225Ac,1.19μg);8)1.5μg 利 妥 昔 单 抗 -MORF 和SWCNT-cMORF-DOTA(666nCi 225Ac,2.38μg)。(9)1.5μg 利 妥 昔 单 抗 -MORF 和SWCNT-cMORF-DOTA(999nCi 225Ac,3.57μg);和10)1.5μg利妥昔单抗-MORF和MORF封闭的SWCNT-cMORF-DOTA(999nCi 225Ac)对照。在第3、6、9和15天对小鼠的荷瘤进行成像和光子量化。数据使用Igor Pro Living Image软件版本2.60(Wavemetrics.)进行分析。
[0091] 实施例2
[0092] SWNT的寡核苷酸修饰和放射标记
[0093] 本文中使用的胺功能化单壁碳纳米管(图1A,1)如所述地(27-28)经由甲亚胺叶立德(azomethine ylide)的共价环加成制备自高纯度电弧制得的单壁碳纳米管或HiPCO SWNT。此反应将亲水链连接至可以用伯胺封端的单壁碳纳米管侧壁以充当用于双功能放射性金属螯合物、荧光团和与修饰的抗体互补的吗啉代寡核苷酸(cMORF)的连接位点。如此制备的单壁碳纳米管构建体的长度范围可以为约100至约300nm长。通过DLS和TEM,制备的构建体的平均长度为350nm,直径约为1.2nm,每2.5埃12个碳原子
[0094] 为了将吗啉代连接至靶向抗体和碳纳米管,选择在两个实体之间产生光谱可量化的二芳基腙连接(bis-aryl hydrazone linkage)的化学方法(6,29)。单壁碳纳米管上的侧壁胺以亚化学计量比与芳族醛衔接物的活化酯反应以将大量醛引入到SWNT-NH2侧壁上。然后通过定量茚三测定(30)来分析产物2(图1A)的胺含量,其显示大约一半的胺保持未反应,(1.1反应的:1未反应的),和每316个碳约1个加成或每管约53个吗啉代加合物。结合的芳族醛通过与2-肼基吡啶反应以形成λmax=350nm的光谱可量化的生色团而量化。此反应确认,反应的胺已被转化为反应性醛连接基团,产率大约50%。
[0095] 惯例合成的吗啉代(其具有基于之前预先靶向文献(31)选择的序列,带有3’伯胺)(cMORF,序列:TAG-TTG-TGA-AGT-AGA-AGA;SEQ ID NO:2)与20倍过量的琥珀酰亚胺基肼基烟酰胺在pH 9反应并经由凝胶过滤色谱纯化以得到cMORF-HyNic产物。cMORF-HyNic在pH 5.5与醛功能化的单壁碳纳米管偶联以得到SWNT-cMORF缀合物3(图1A)。化合物3中剩余的胺然后用放射性金属螯合部分(4-异硫氰酸苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)加帽,以用于后续的利用放射性金属的标记(图1B,5),或与Alexa Fluor 647的活化的酯反应以引入荧光标记用于显微镜和细胞计数测定(图1B,4)。
吗啉代加成后螯合剂标记的密度用剩余的胺处置以得到每289个碳原子1个DOTA或每平均长度的管约58个加合物。
[0096] γ发射同位素111In用于生物分布和结合研究。单壁碳纳米管也用225Ac(一种发111
射α粒子的细胞毒性同位素)标记,用于治疗模型中。DOTA功能化材料5用 InCl3放
111
射标记。放射标记的产物6通常以~95%放射化学纯度制备。使用此合成方法,当用 In
225
标记时,制得高特异性活性(达25Ci/g)的SWNT-cMORF缀合物。当用不同量的 Ac标记SWNT-cMORF-DOTA,5时,实现达2Ci/g的特异性活性。这表示相比于类似分子量的单克隆抗体(10,32),SWNT-cMORF特异性活性的大于100倍的提高,并且证实利用高度多价单壁碳纳米管支架进行信号扩增的潜力。
[0097] 在反相和凝胶渗透系统二者中的构建体4、5和6的HPLC证实高纯的并且观察到的单个峰具有与连接有λmax=354nm的二芳基腙连接的单壁碳纳米管一致的光谱(图1C)。胺功能化的SWNT 1的拉曼光谱与高度改性的SWNT一致,证实在1360cm–1的无序带–1
的增加和在1580cm 的宽的主要的切向模式峰,如之前研究中的(8)。
[0098] 抗体经由类似于与对纳米管缀合实施的反应化学偶联至与所述纳米管上的序列互补的吗啉代寡核苷酸。制得四种不同的抗体-MORF缀合物,抗-CD33-MORF(林妥珠单抗(Lintuzumab),3.75MORF/Ab),抗-CD20-MORF(利妥昔单抗,3.5MORF/Ab),以及抗-CD和抗-A33-MORF(huA33)。所有三种抗体是人IgG1同种型并且广泛地用于人治疗。这种连接吗啉代寡核苷酸(morpholino oligo)至抗体的方法已被描述(29)并且通常导致3至6个吗啉代/抗体,与抗体类型无关。产物抗体-吗啉代缀合物(mAb-MORF)纯度>95%,如通过尺寸排阻HPLC测量的。图1D是在mAb-MORF靶向的肿瘤细胞上的SWNT-cMORF自组装的图示。
[0099] 实施例3
[0100] SWNT-cMORF在37°在体外且在血清存在下与多个不同的mAb-MORF杂交[0101] 抗体-MORF在SWNT-cMORF缀合物上的杂交可以通过HPLC监测(图2A-2D)。HPLC尺寸排阻柱(Superdex 200)中的SWNT-cMORF缀合物的等度、含水流动相洗脱作为后面的宽的带出现。尽管高的单壁碳纳米管分子量,但是延迟的洗脱可归因于SWNT的高度各向异性的几何结构,其已知在常见的凝胶过滤基质中显著延迟细长的大分子(9,33)。此峰具有与SWNT一致的光谱特征。单独的mAb-MORF缀合物具有的洗脱时间为约18分钟,其与基于蛋白质标准物的~150,000Da的分子量一致。
[0102] 当mAb-MORF(抗-CD20-MORF和抗-A33-MORF二者)用互补的SWNT-cMORF构建体温育时,预期若干抗体在纳米管表面上的杂交,这应产生高分子量复合物。与此一致的是,纳米管洗脱位移至高分子量带并在12分钟在空隙体积处洗脱。在所选柱中,分子量截止值为600kDa,表明多个抗体杂交至单壁碳纳米管而形成大的但仍然可溶的多聚体构建体。
[0103] 为了通过连接的标记特定地监测SWNT-cMORF的洗脱,用放射标记的111
SWNT-cMORF- In(DOTA)进行类似的实验(图1A,6),并用HPLC放射检测器监测同位素的洗脱。观察到相同的模式,因为放射标记的纳米管从后面的带位移到在柱空隙后洗脱的高分子量复合物。杂交模式对于与抗-CD20-MORF和抗-A33-MORF二者混合的SWNT-cMORF是相同的,证实这些复合物的组装独立于所使用的具体抗体。
[0104] 最后,进行相同的测定,只是两种组分在37℃在100%人血清中温育。同样,在放射标记的SWNT-cMORF洗脱的位移中可以看到杂交。在MORF/cMORF杂交上观察的现象的特定依赖性通过加入过量的游离cMORF阻断复合物组装的核苷酸杂交位点而证实。
[0105] 测定SWNT-cMORF缀合物和互补的mAb-MORF的杂交的另一方法是在加入mAb-MORF后用蛋白质A小珠俘获放射标记的SWNT-cMORF(图2E)。因为蛋白质A选择性地结合IgG,所以标记的SWNT-cMORF应该仅在退火至IgG时被固定在琼脂糖珠上。事实上,当放射标记的SWNT-cMORF缀合物单独用蛋白质A小珠温育时,仅1%的纳米管被小珠俘获。然而,当互补的mAb-MORF在之前被加入到SWNT-cMORF中时,~35%的纳米管被小珠俘获。这种与小珠的结合可以通过加入过量的cMORF以封闭抗体上的纳米管杂交位点而被完全阻断。这种杂交可以在37℃在100%血清存在下发生和保持。相比于结合缓冲液(具有1%BSA的PBS),在这些条件下获得几乎相同的结合,再次证实血清和温度对纳米管-抗体杂交具有很小至没有影响。
[0106] 实施例4
[0107] SWNT-cMORF可以高亲和性自组装在用特异性mAb-MORF构建体预先靶向的细胞上[0108] SWNT-cMORF在肿瘤细胞表面上自组装,所述肿瘤细胞表面由含有互补的寡核苷酸序列的mAb-MORF缀合物特异性结合。使用三种不同的癌细胞系,Daudi(B细胞淋巴瘤),HL60(早幼粒细胞性白血病)和LS174T(结肠腺瘤),其分别由抗-CD20(利妥昔单抗),抗-CD33(Hum195)和抗-A33单克隆抗体靶向。所有抗体是人IgG1同种型。细胞与特异性或同种型对照抗体-MORF温育,接着用荧光标记的SWNT-cMORF处理(图1A,4)。作为对照,用特异性mAb-MORF缀合物靶向的细胞在添加SWNT-cMORF之前用过量cMORF封闭。荧光标记的单壁碳纳米管的结合作为如流式细胞术测量的中值荧光强度的变化而被量化。
[0109] 单壁碳纳米管以优异的特异性在所有三种细胞类型上自组装(图3A-3D)。此外,当用过量cMORF封闭时结合显著消除并且几乎没有与用同种型对照mAb-MORF处理的细胞的结合。结合还在一系列条件上,在4℃、25℃和37℃的温度以及在100%人血清中测试。获得类似的结合,而与结合条件无关,证实细胞上的MORF/cMORF杂交可以在37℃在血清中发生。
[0110] 为了测试SWNT-cMORF和用mAb-MORF预先靶向的细胞之间的相互作用的亲和性,进行类似的结合研究(图3E)。在减去使用同种型对照抗-CD33-MORF计算的非特异性结合后,将中值荧光的变化作图为SWNT-cMORF浓度的函数。进行此分析,用抗-CD20-MORF靶向Daudi细胞并且用抗-CD33-MORF靶向LS174T。结果是特征性S形结合曲线,其中表观解离常数为0.3μg/mL。在SWNT-cMORF构建体的预期分子量为350-500kDa的情况下,该表观亲和性表示~0.6nM的解离常数。此亲和性对于两种不同细胞型是相同的,证实SWNT-cMORF对mAb-MORF的亲和性独立于所选的癌症靶标或靶向载体。
[0111] 实施例5
[0112] 在抗体靶向的肿瘤细胞上的SWNT-cMORF自组装导致靶抗原的加帽和自组装的复合物的内化
[0113] 在 证 实SWNT-cMORF 在 肿 瘤 细 胞 上 的 自 组 装 后,确 定 自 组 装 的SWNT-(cMORF-(mAB-MORF))复合物在细胞表面上的命运。进行一系列共焦显微镜研究以追踪在结合至LS174T细胞后的抗-A33抗体和抗-A33/单壁碳纳米管复合物。铺板的细胞用抗-A33或抗-A33-MORF处理,洗涤,并在培养基中在37℃温育达24小时。
[0114] 当细胞用单独的抗-A33抗体处理时,该抗体在细胞表面上稳定多至24小时(图4A)。在抗-A33抗体结合至此抗原后A33糖蛋白的稳定表面表达是此系统的已知性质(34)。
所述抗体沿着膜均匀地分布。同样,单独的抗-A33-MORF抗体缀合物在细胞表面上稳定并且保持均匀地分布(图4B)。没有同种型对照抗体(抗-CD19-MORF)的结合。然而,当将SWNT-cMORF添加到抗-A33-MORF预先靶向的细胞中,接着在37℃温育4小时时,我们观察到抗体在靶细胞中分布的显著变化(图4C)。在这些细胞中,观察到自组装的mAb-MORF/SWNT-cMORF复合物在细胞膜上成簇,导致指示抗原加帽的点状染色。SWNT-cMORF添加到用对照抗体(没有MORF的抗-A33,或同种型对照抗-CD19-MORF)靶向的细胞中不会导致染色图案的任何变化并且我们没有观察到SWNT-cMORF与对照抗体处理的细胞的任何结合。
[0115] 此外,在用mAb-MORF处理接着用SWNT-cMORF处理的细胞中,在细胞内部观察到抗体和纳米管阳性点状结构的出现(图4D)。这种现象在加入SWNT-cMORF构建体后30分钟是明显的,并且在测定的4小时内细胞内染色持续增加。这些图像表明抗-A33-MORF/SWNT-cMORF复合物在自组装为多聚体表面结构后的内吞摄取。因此,由于SWNT-cMORF构建体可以结合细胞表面上的多个抗体,所以这种交联显然地导致促进复合物的快速细胞内递送(理想但出乎意料的效果)。
[0116] 为了测试这种假设,抗-A33-MORF靶向的细胞用游离cMORF寡核苷酸处理,其不应结合多个抗体。当用抗-A33-MORF预处理的细胞随后用单独的荧光标记的cMORF处理时,cMORF的染色特征与该抗体完全共定位,并且表面结合的图形与单独的抗体没有改变(图4E)。这个结果有力地表明,取决于第二步的多价的加帽和内化。
[0117] 实施例6
[0118] SWNT-cMORF可以在体内在预先靶向的肿瘤上自组装
[0119] 已经证实SWNT-cMORF在体外可以在特定癌细胞上自组装,接下来在活的小鼠中评估这种活性。这初始在表达x/细胞水平的CD20的腹膜内(i.p.)Daudi淋巴瘤模型中进行。使用GFP转染的Daudi B细胞淋巴瘤Daudi-GFP)(9)以便能够通过体外流式细胞术量化靶细胞。小鼠腹膜内注射Daudi-GFP细胞,在24小时后,注射淋巴瘤特异性抗-CD20-MORF或抗-CD33-MORF同种型对照。然后将小鼠用荧光标记的SWNT-cMORF处理,并且6小时后,杀死小鼠,并收获淋巴瘤细胞。然后通过流式细胞术分析细胞悬浮液。Daudi-GFP细胞通过门控绿色阳性细胞追踪然后在FL4通道中测定SWNT-cMORF-Alexa Fluor 647的荧光。在FL4通道中观察到门控的Daudi细胞的中值荧光强度的20倍增加(图5A-5B)(相比于抗-CD20mAb-MORF处理的动物),确认在收获的细胞中的特异性结合。同种型对照抗体处理的细胞不显示结合或自组装。
[0120] 还证实了,此方法在各组分的肿瘤渗透将更困难的实体癌模型中全身施用的构建体是可行的。在这种情况下,选择实体瘤LS174T结肠腺瘤模型。在这种模型中抗-A33抗体肿瘤靶向经由I-124标记的抗-A33的电子发射断层术单独地测试。这证实,在注射后72小时,抗体在肿瘤中达到~10%ID/g并且在血流中降低至~4%ID/g(肿瘤血液比为~
2.5)。
[0121] 这些相对浓度对于在mAb-MORF后72小时施用SWNT-cMORF-(111In)DOTA的第二步111 111
骤是足够的。在用静脉内注射SWNT-cMORF-( In)DOTA处理后,SWNT-cMORF-( In)DOTA在血液、肿瘤和肌肉中的积累在4和24小时被量化。如在之前利用功能化的单壁碳纳米管构
111
建体的生物分布研究中一样,SWNT-cMORF-( In)DOTA快速地清除血流,在4小时和24小时的水平分别为1.4%ID/g和0.26%ID/g。在实验处理和同种型对照组之间的血液水平上没有显著差异。
[0122] 在24小时,SWNT-cMORF更好地保持在特异性靶向的动物的肿瘤中(图5C),并且相对于对照(1.7),靶向的肿瘤(3.2)的肿瘤血液比显著增加。此时的肿瘤血液比相比于在注射后72小时用直接标记的抗-A33抗体获得的肿瘤血液比相比稍微提高(3.2对2.5)。对照抗体处理的动物中的非特异性肿瘤积累归因于增强的渗透和截留作用,其已知在肿瘤中被动地积累碳纳米管(4)。还收获一组正常组织并且证实在任何脱靶位点中的两组之间没有显著的差异,确认这种增加的积累的肿瘤特异性。对于其他共价功能化的单壁碳纳米管构建体(8),也观察到在肾、肝和脾中的脱靶积累。
[0123] 实施例7
[0124] 使用SWNT-cMORF-DOTA作为用于225Ac的递送载体减轻放射性同位素毒性并提供淋巴瘤的有效治疗
[0125] 已证实靶向实体和弥散性恶性肿瘤二者的能力,我们目的在于证实SWNT-cMORF构建体将是人淋巴瘤的治疗模型中的有效载体。放射性免疫疗法的任何预先靶向的载体的关键性质在于第二试剂的快速清除率由于减少的细胞毒性效应物的循环时间所致而提供提高的治疗指数。之前进行了大量的研究,证实共价功能化的SWNT(即使是在添加18-聚体寡核苷酸后)也具有这种快速清除率(35)。利用本文描述的构建体进行的类似生物分布实验证实类似清除性质。生物分布作为总辐射和在注射后的1、4、8、12和24小时的百分比注射剂量进行评估(参见支持信息)。如预期的,大多数的总注射剂量(~77%ID)到24小时被排泄(大部分在尿液中)。大多数剩余的辐射位于肾(2.96%ID)。
[0126] 为了证实放射标记的SWNT的这种快速清除导致降低的毒性(当相比于类似地放射标记的单克隆抗体时),我们进行了这样的研究,其中将高剂量的225Ac标记的SWNT-cMORF缀合物施用于小鼠并且监测小鼠的重量或行为的变化,接着进行组织病理学分析。对于直接用225Ac标记的抗体,小鼠中的最大耐受剂量为单次注射中的400-500nCi,具有急性毒性和由于骨髓衰竭所致的死亡以及来自放射性同位素蜕变产物的长期肾毒性(36-37)。
[0127] 因此,为了证实相比于类似标记的抗体的毒性下降,施用的放射性的总量范围为0至2700nCi的225Ac。尽管我们在接受放射标记的SWNT-cMORF-225Ac(DOTA)的小鼠中观察到剂量依赖性重量减轻(图6A),但是几乎所有施用以SWNT-cMORF-225Ac(DOTA)的小鼠在整个140天实验中存活。在每个治疗组的五只小鼠中,来自2700nCi剂量水平的一只小鼠和来自2250nCi剂量水平的两只小鼠死亡。除了无225Ac组,在所有剂量的小鼠展现正常的理毛和摄食行为。因此相比于mAb,当使用纳米管载体时,最大耐受剂量至少高四倍。
[0128] 在肾、肝和脾(SWNT构建体的非特异性摄取的主要部位)中观察到适度的剂量依赖性重量减轻(图6B)。作为对比,450nCi的游离锕显示在4天的一律致死。发现未标记的纳米管-寡核苷酸缀合物没有可观察的毒性。在0、450和900nCi的剂量水平的小鼠在显微镜组织化学评价下不显示可辨识的器官损伤,而在1350至2700nCi的水平,器官在140天显示有限的剂量依赖性毒性,包括减少的骨髓和脾细胞结构以及更小的肾小球。
[0129] 在确定高特异活性SWNT-cMORF-225Ac可以被快速清除并且不产生多至1350nCi的明显毒性后,我们接着在播散的Daudi淋巴瘤模型中实施这些构建体作为治疗剂。给小鼠在腹膜腔中植入Daudi淋巴瘤细胞,接着在一周后进行多步疗法。研究包括10个组(每组5只小鼠),由3个治疗组和7个对照组组成。表2显示Daudi淋巴瘤的SWNT-cMORF-225Ac(DOTA)治疗的对照和实验组的结果。肿瘤成像研究证实在所有3个治疗组中的有效剂量依赖性治疗(图6C)。
[0130] 在 治 疗 组 8 和 9(666nCi SWNT-cMORF-225Ac(DOTA) 和 999nCi SWNT-cMORF-225Ac(DOTA)中存在荷瘤的完全消除。盐水对照和冷SWNT对照中的小鼠显示荷瘤的快速进展。单独用抗-CD20-MORF治疗的小鼠显示荷瘤的短暂减少,这归因于对已知是治疗性的抗-CD20抗体的瞬时响应。用若干剂量水平的同种型对照抗-CD33-MORF并且接着用SWNT-cMORF-225Ac(DOTA)治疗的小鼠显示很少或瞬时响应,这可归因于来自Ac-225的非特异性辐射。最后,为了证实治疗作用是由于自组装而不是治疗的每个组分的简单的相加效应所致,包括了抗-CD20-MORF接着SWNT-cMORF-225Ac(DOTA)(其已与过量的游离MORF混合以阻断杂交)的双对照。在这个组中,五只小鼠中的四只具有显著的肿瘤进展,而一只小鼠具有归因于ADCC和非特异性辐射的相加效应的治疗响应。
[0131] 表2
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