聚酰胺胺、其部分降解产物或其复合物-Math1基因纳米微粒以及在治疗耳聋的应用 |
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| 申请号 | CN201110005066.6 | 申请日 | 2011-01-04 | 公开(公告)号 | CN102586300A | 公开(公告)日 | 2012-07-18 |
| 申请人 | 中国人民解放军总医院; | 发明人 | 杨仕明; 吴南; 吴雁; 韩东; 郭维维; 赵立东; 翟所强; 高维强; 杨伟炎; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及了一种聚酰胺胺和/或聚酰胺胺复合物-Math1基因纳米微粒、其制备方法及其应用，该基因纳米微粒通过将聚酰胺胺或聚酰胺胺复合物与含Math1基因的质粒进行复凝聚而制备。该基因纳米微粒的粒径可控、尺寸均一、利于表面修饰、可提高Math1基因的表达和递送能 力 ，可以用于由于噪声、药物中毒等原因引起的毛细胞缺失而导致的感音神经性 耳 聋。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种聚酰胺胺-Math1基因纳米微粒，包括聚酰胺胺和图4所示的质粒，其粒径为 |
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| 说明书全文 | 聚酰胺胺、其部分降解产物或其复合物-Math1基因纳米微技术领域背景技术[0002] 近年来，以非病毒材料为基因载体的基因治疗研究引起了广泛的重视，其中用阳离子聚合物和基因复合形成纳米微粒来模拟类似病毒的结构作为基因载体就是一个重要方面。纳米微粒(nanoparticle，NP)基因载体是由高分子材料合成的一种固态胶体纳米级微粒载体，其能将DNA、RNA、PNA(肽核苷酸)、dsRNA(双链RNA)等基因治疗分子包裹在纳米微粒之中或吸附在纳米微粒表面，通过细胞胞吞使纳米微粒进入细胞内，经高分子材料的降解逐渐释放出基因治疗分子，从而发挥其基因治疗的效能。 [0003] 大量研究表明，在一定条件下，聚阳离子可与基因在水溶液中复合形成纳米微粒。同时，可以在聚阳离子链上引入具有特殊功能的基团(如半乳糖、转铁蛋白)，从而使聚阳离子/基因纳米微粒具有类似病毒的功能，如受体调节内化、进入细胞核等。聚阳离子作为基因载体在血浆的电解质环境中仍是稳定的纳米微粒，且在冷冻干燥储存过程中并不失活。 [0004] 聚酰胺胺(PAMAM)是一种代表性的人工合成树枝状聚合物，在生理pH值范围内，其表面氨基基团会携带正电荷，是常见的阳离子高分子聚合物。它具有独特的球形外形，以及高度分支的纳米级树枝状结构。该分子由三部分组成：中心核、内层重复的亚单元和外层的氨基端，它具有良好的流体力学性能，易于加工成型；同时它还具有低粘度、高水溶性、可混合性、高反应性等特点，相比之下，其它阳离子聚合物如壳聚糖等，其质子化需要较低的pH值，而且粘度较大，水溶性欠佳。在生物性能方面，聚酰胺胺具有无免疫性、毒性较低、可通过尿和粪便排出体外的优异性能。 [0005] 随着代数的增加，PAMAM树枝状聚合物末端的氨基基团增加。氨基基团在生理PH下，发生质子化，使PAMAM具有聚阳离子特征。带电荷易于与抗体、核酸和荧光基团通过静电作用形成稳定的复合物(Haensler and Szoka，1993；Bielinska et al.，1996；Wang et al.，2000)。研究表明，PAMAM可以介导核酸、质粒等进入细胞中，并获得目的基因表达。其机理是带正电荷的PAMAM/DNA复合物易于粘附于负电荷的细胞表面，利于其进入细胞内部并表达.(Dennig J and Duncan E，2002)。PAMAM对于细胞的转染效率和细胞毒性会随代数的增加而同时增加，该特性与被转染的靶细胞有关。 [0006] 耳蜗是人类感受外界声音刺激的唯一器官，同时也是一种高度分化的功能特化器官，其内部的毛细胞是感受声音振动的机械-电感受器，对维持听觉及平衡觉有重要作用。任何原因导致的内耳毛细胞的变性、坏死均可引起听觉和平衡功能障碍。传统观点认为鸟类及哺乳类动物的耳蜗毛细胞在胚胎期完成分化，且不能自发再生，一旦发生由于耳蜗毛细胞损失而导致的耳聋就很难自然恢复听力，必须通过人为的治疗才有可能恢复，而这一直是个世界性的难题。近年来有研究表明，耳毒性药物和噪声损伤哺乳动物内耳毛细胞后，毛细胞可以经诱导再生。许多生长因子在毛细胞再生中起重要作用，如转化生长因子(TGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)等等。 [0007] Math1(Mammalian atonal homolog 1)是一种碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)基因，其是果蝇Atoh1基因的小鼠同源基因。Math1基因全长1.18kb，含一个外显子，mRNA长1065bp，编码由354个氨基酸组成的蛋白，即转录因子Math1，分子量为38.2kDa。Math1基因是毛细胞分化成熟的必需基因，在毛细胞再生过程中有重要作用(Bermingham NA，Hassan BA，Price SD et al.，Math1：anessential gene for the generation of inner ear hair cells.Science，1999，284：1837-1841)。 [0008] 由于病毒载体的局限性，利用病毒载体在动物体内进行内耳毛细胞再生的研究无法应用于临床。纳米微粒作为一种新型基因载体，以其无免疫原性，低毒、装载容量大、制备容易且结构稳定、利于改造和修饰等优势，更有利于毛细胞再生的进一步研究及临床应用。 [0009] 目前，纳米微粒基因载体的内耳导入途径主要是鼓阶打孔和圆窗膜注射，通过直接注射和微渗透泵将该载体导入外淋巴液。这两种方式虽然有效，但都是侵袭性操作，破坏耳蜗鼓阶，存在诱发炎症、外淋巴漏、损坏听力的危险。由于圆窗膜具有半透膜的特性：分泌和吸收功能，而纳米微粒基因载体具有靶向性和通透性，作为一种新技术，有望实现圆窗膜跨膜导入。 [0010] 然而，至今未见PAMAM及其衍生物-Math1基因纳米微粒的制备以及用PAMAM-Math1基因纳米微粒转染体外培养细胞或在体转染耳蜗并且表达Math1基因的报导。 发明内容[0011] 本发明的目的在于提供一种PAMAM-Math1基因纳米微粒，实现基因的递送。 [0012] 根据本发明的一方面，该PAMAM-Math1基因纳米微粒包括PAMAM和如图4所示的质粒，其粒径为100-200nm，分散指数为0.10-0.25，zeta电位约为10-50mV，包封率为90-95％。该PAMAM-Math1基因纳米微粒的粒径可控、尺寸均一、利于表面修饰、可提高Math1基因的表达和递送能力。 [0013] 本发明的另一目的在于提供一种PAMAM部分降解产物-Math1基因纳米微粒，实现基因的递送。 [0014] 根据本发明的一方面，该PAMAM部分降解产物-Math1基因纳米微粒包括PAMAM部分降解产物和如图4所示的质粒，其粒径为100-200nm，分散指数为0.10-0.25，zeta电位约为10-50mV，包封率为90-95％，该PAMAM部分降解产物是通过热处理获得的，特别是，在50℃-100℃下将PAMAM在水溶液中加热，更特别是加热2-48小时。 [0015] 本发明的另一目的在于提供一种PAMAM复合物-Math1基因纳米微粒，实现基因的递送。 [0016] 根据本发明的一方面，该PAMAM复合物-Math1基因纳米微粒包括PAMAM复合物和如图4所示的质粒，其粒径为100-200nm，分散指数为0.10-0.25，zeta电位约为10-50mV，包封率为90-95％，该PAMAM复合物是由PAMAM或其部分降解产物与环糊精在水溶液中震荡混旋获得的。特别是，以质量比为1∶10到10∶1混合，更特别是混旋10s到30s。该PAMAM复合物-Math1基因纳米微粒的细胞毒性明显更低。 [0017] 本发明的又一目的在于提供本发明的PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物-Math1基因纳米微粒的制备方法。该方法简单易行，原料易得，无须使用有机溶剂和醛类作为交联剂，反应迅速，反应条件温和，重复性好，稳定性高，实用性强，具有广泛的应用性。 [0018] 根据本发明的一方面，所述PAMAM、PAMAM部分降解产物或其复合物-Math1基因纳米微粒是通过将上述聚合物之一与如图4所示的含Math1基因的质粒进行复凝聚而制备的。特别地，在室温下，将PAMAM、PAMAM部分降解产物或其复合物加入到PBS溶解的含Math1基因的质粒中，在静电作用下，聚合物分子包裹含Math1基因的质粒而生成纳米微粒混悬液。具体地，该方法包括下述步骤： [0019] (1)制备浓度为500-1500μg/ml的PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物的水溶液； [0020] (2)制备浓度为120-720μg/ml的含Math1基因的质粒的PBS溶液； [0021] (3)以N/P比(PAMAM氨基/质粒磷酸基)为30∶1到1∶10混合步骤(1)、(2)的溶液以进行复凝聚反应得到PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物-Math1基因纳米微粒混悬液。 [0022] 其中，PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物的分子量是500Da～1000000Da。 [0023] 其中，PAMAM的代数是1-10。 [0025] 其中，PAMAM复合物是由PAMAM或PAMAM部分降解产物与环糊精复合获得的，以降低细胞毒性，特别地，以质量比为1∶10到10∶1在水溶液中混旋获得。 [0026] 其中，含Math1基因的质粒是如图4所示的质粒。 [0027] 与现有技术相比，本发明制备的PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物-Math1纳米微粒至少具有以下特点： [0028] (1)选用的树状分子具有稳定、黏度低、水溶性好、无免疫原性、在生理pH范围内质子化、对生物活性物质的转运效率高等优点。 [0029] (2)制得微粒的粒径大小可以调节，尺寸较均一。 [0030] (3)制得微粒的表面带有正电荷，利于进行表面修饰。 [0031] (4)制得的PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物与含Math1基因的质粒通过静电作用复合制备纳米微粒，一方面能增加Math1基因的稳定性，使Math1基因最终被递送到细胞内，另一方面，增强与细胞膜的作用及保护Math1基因免遭核酸酶的降解破坏。 [0032] (5)制得的PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物-Math1基因纳米微粒，在进行体内或体外细胞转染时，具有更高的转染效率和更低的细胞毒性。 [0033] (6)通过调节各种成分的比例很容易实现对基因传递的控制。 [0034] 本发明的又一目的在于提供PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物-Math1基因纳米微粒在转染体外培养的HEK293细胞中的应用。 [0035] 本发明的又一目的在于提供PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物-Math1基因纳米微粒在转染离体培养的耳蜗组织中的应用。 [0036] 本发明的又一目的在于提供PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物-Math1基因纳米微粒在转染在体耳蜗中的应用。 [0037] 本发明的又一目的在于提供PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物-Math1基因纳米微粒在耳聋方面的应用，该纳米微粒可以用于由于噪声、药物中毒等原因引起的毛细胞缺失而导致的感音神经性耳聋。附图说明 [0038] 图1示出PAMAM-Math1纳米微粒的形成示意图； [0039] 图2示出PAMAM复合物-Math1纳米微粒的透射电镜图； [0040] 图3示出PAMAM复合物纳米颗粒的粒径分布； [0041] 图4示出质粒PRK5-Math1-EGFP的图谱； [0042] 图5示出Math1基因的核苷酸序列； [0044] 图7示出EGFP在转染有PAMAM复合物-Math1纳米颗粒的293T细胞中的表达； [0045] 图8示出耳后入路圆窗膜显微注射导入，a：耳后入路寻找听泡的解剖标志，黑箭头示面神经、蓝星示胸锁乳突肌；b：将胸锁乳突肌向上分离牵开，可见听泡后壁(蓝色箭头)及二腹肌后腹(蓝星)；c：二腹肌后腹(蓝星)向后分离后暴露听泡后上骨壁(黑箭头指示方向)；d：磨除此处听泡后上、面神经入听泡处后方骨壁；e：打开听泡后可见圆窗龛(黑箭头示)、镫骨动脉(蓝箭头示)；f：刺破圆窗膜显微注射(黑箭头示针头)；以及[0046] 图9示出表达了Math1-EGFP蛋白的内耳组织，1：内毛细胞区域；2：柱细胞区域；3：外毛细胞区域。 具体实施方式[0047] 下面通过实施例对本发明作详细阐述。 [0048] 除非特别指出，否则下面实例中的试剂药品材料均为市售可得，方法参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。 [0049] 实施例1：PRK5-Math1质粒的构建 [0050] 用Trizol法提取胚胎小鼠16天脑组织总RNA，反转录合成cDNA，利用PCR法合成含有E盒的Math1基因，且5’和3’末端加入ECOR1和BamH1酶切位点。将PCR扩增产物经ECOR1和BamH1酶切，纯化后与经ECOR1和BamH1酶切的PRK5质粒(Clontech公司)连接，构建PRK5-Math1质粒。其中的Math1基因具有图5所示序列。 [0051] 扩增引物如下： [0052] F：5’-GGAATTAAAATAGTTGGGGGACC-3’， [0053] R：5’-TGGACAGCTTCTTGTTGGCTT-3’， [0054] 扩增条件为：94℃ 5min；94℃ 1min；58℃ 40sec；72℃ 40sec；35个循环，72℃延伸5min。 [0055] 实施例2：PRK5-Math1-EGFP质粒的构建 [0056] 用Hpa1和Xbal1酶对含有EGFP基因的质粒pEGFP-C2(Invitrogen公司)和实施例1的PRK5-Math1质粒分别进行双酶切，纯化回收，经T4连接酶连接构建PRK5-Math1-EGFP质粒。 [0057] 实施例3：PRK5-Math1-EGFP的扩增和纯化 [0058] 取5μl质粒PRK5-Math1-EGFP，加入100μl感受态大肠杆菌DH5α细菌，混匀，冰浴30分钟，42℃热休克1分钟，冰浴2分钟，加入800μl LB培养基，37℃培养1小时。取100μl菌液涂布于含有氨苄青霉素的平板，37℃倒置培养16小时。挑取平板中的单菌落，接种于5ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃恒温振荡过夜，使细菌生长至对数晚期。按照质粒提取试剂盒(QIAGEN)说明书提取质粒。 [0059] 取质粒0.5～1μg，加入内切酶5U(不超过总反应体积1/10)，反应体积20μl，适温水浴2h，取少量样品进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。 [0060] 实施例4： [0061] 将 100μl 的 500μg/ml 的 PAMAM 溶 液 加 入 到 100μl 720μg/ml 的PRK5-Math1-EGFP质粒的PBS溶液中，迅速在旋涡混合器上混合30秒后，室温下继续孵育0.5小时得到PAMAM-PRK5-Math1-EGFP质粒的纳米混悬液。动态光散色测定其粒径为118.6nm，分散指数0.187；zeta电位分析仪测定其zeta电位为42±1.17(mV)。 [0062] 实施例5： [0063] 将50℃热处理24h而部分降解的100μl的500μg/ml的PAMAM溶液加到100μl720μg/ml的PRK5-Math1-EGFP质粒的PBS溶液中，迅速在旋涡混合器上混合30秒后，室温下继续孵育0.5小时得到PAMAM-PRK5-Math1-EGFP质粒的纳米混悬液。动态光散色测定其粒径为105.1nm，分散指数为0.206；zeta电位分析仪测定其zeta电位为39±1.12(mV)。 [0064] 实施例6： [0065] 将50℃热处理24h而部分降解的100μl的500μg/ml的PAMAM溶液加到50μl720μg/ml的PRK5-Math1-EGFP质粒的PBS溶液中，迅速在旋涡混合器上混合30秒后，室温下继续孵育0.5小时得到PAMAM-PRK5-Math1-EGFP质粒的纳米混悬液。动态光散色测定其粒径为104.2nm，分散指数为0.198；zeta电位分析仪测定其zeta电位为41.6±1.19(mV)。 [0066] 实施例7： [0067] 将100℃热处理24h而部分降解的100μl的500μg/ml的PAMAM溶液加到25μl720μg/ml的PRK5-Math1-EGFP质粒的PBS溶液中，迅速在旋涡混合器上混合30秒后，室温下继续孵育0.5小时得到PAMAM-PRK5-Math1-EGFP质粒的纳米混悬液。动态光散色测定其粒径为102.9nm，分散指数为0.202；zeta电位分析仪测定其zeta电位为42.9±1.23(mV)。 [0068] 实施例8： [0069] 将50℃热处理48h而部分降解的100μl的500μg/ml的PAMAM溶液加到100μl720μg/ml的PRK5-Math1-EGFP质粒的PBS溶液中，迅速在旋涡混合器上混合30秒后，室温下继续孵育0.5小时得到PAMAM-PRK5-Math1-EGFP质粒的纳米混悬液。动态光散色测定其粒径为101.5nm，分散指数为0.211；zeta电位分析仪测定其zeta电位为37±1.28(mV)。 [0070] 实施例9： [0071] 将β-环糊精加入到PAMAM溶液，其质量比为1∶10，混合10s。然后将100μl的500ug/ml PAMAM复合物加到100μl 720μg/ml的PRK5-Math1-EGFP质粒的PBS溶液中，迅速在旋涡混合器上混合30秒后，室温下继续孵育0.5小时得到PAMAM复合物-PRK5-Math1-EGFP质粒的纳米混悬液。动态光散色测定其粒径为129.2nm，分散指数为0.245；zeta电位分析仪测定其zeta电位为35±1.31(mV) [0072] 实施例10： [0073] 将β-环糊精加入到50℃热处理24h而部分降解的PAMAM溶液，其质量比为10∶1，混合10s。然后将100ul的500ug/ml PAMAM复合物加到100μl 720μg/ml的PRK5-Math1-EGFP质粒的PBS溶液中，迅速在旋涡混合器上混合30秒后，室温下继续孵育 0.5小时得到PAMAM复合物-PRK5-Math1-EGFP质粒的纳米混悬液动态光散色测定其粒径为 130.2nm，分散指数为0.247；zeta电位分析仪测定其zeta电位为39±1.19(mV)[0074] 实施例11：PAMAM复合物-PRK5-Math1-EGFP纳米微粒在体外培养HEK293细胞的转染及Math1蛋白的表达 [0075] 转染前一天将HEK 293T细胞接种于35mm培养皿，待细胞达80％融合时进行转染。转染时使用含10％FBS的DMEM培养基冲洗两遍，每皿加入37℃预热的2ml含10％FBS的DMEM培养基。将按上述实施例制备的纳米混悬液轻轻晃动以充分混匀(PAMAM复合物纳米浓度为4ng/μl)，然后向每培养皿加入300μl纳米溶液，轻轻晃动培养皿以充分混匀，于 37℃，5％CO2培养箱培养24-48小时。 [0076] 收集于36.5℃±0.5℃培养48小时的293T细胞(约107个)，用Trizol法提取RNA。加入30μl DEPC水溶解RNA，取2μl用紫外分光光度计测定RNA含量后，于-80℃的冰箱中冻存RNA。 [0077] PCR扩增 [0078] 模板变性：于65℃将上述步骤中制备的RNA加热5min以熔化二级结构，然后在冰上立即冷却。 [0079] 模板变性反应体系： [0080] [0081] 反转录反应体系： [0082] [0083] 充分混匀后进行下述反应：50℃反应60min，7℃反应5min，加入1μl的RNase H，于37℃反应20min。将获得的反转录产物作为模板进行下一步PCR扩增反应，或者于-20℃冻存。 [0084] PCR扩增反应体系： [0085] [0086] PCR反应程序：95℃预变性5min后进入循环，95℃变性45sec，58℃复性45sec，72℃延伸1min，共40个循环，然后72℃延伸5min，将获得的PCR产物进行下一步反应或者于-20℃冻存。 [0087] 1％琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR反应产物。 [0088] 如图6可见，Math1基因能够在HEK293细胞中进行翻译，产生Math1蛋白。 [0089] 进一步地，如图7可见，经过PAMAM复合物-PRK5-Math1-EGFP纳米颗粒转染的293T细胞能够表达Math1-EGFP基因，表明PAMAM复合物-PRK5-Math1-EGFP纳米颗粒能够把目的基因运送到活细胞中去并获得表达。 [0090] 实施例12：PAMAM复合物-Math1基因纳米微粒转染体外培养的S-D大鼠耳蜗组织[0091] 将出生后3天的S-D大鼠迅速浸过酒精，断头，取出听泡；将取下的耳蜗组织迅速放入4℃ Hank’s缓冲液中；分离耳蜗组织，去除螺旋韧带及血管纹；将基底膜分为基层、中层及顶层三段；24孔培养板上加入含10％FBS的DMEM；小心将基底膜组织平铺于培养板上；小心放置于37℃，5％CO2培养箱中；隔日换液； [0092] 培养6天后，基底膜组织贴壁良好，转染时用含10％FBS的DMEM洗两遍，每皿加入37℃预热的3ml含10％FBS的DMEM；将实施例制备的PAMAM复合物纳米溶液充分轻轻混匀(PAMAM复合物纳米浓度为4ng/μl)；每培养皿加入300μl纳米溶液轻轻晃动培养皿使充分混匀；37℃，5％CO2培养箱培养24-48小时观察结果。 [0093] 实施例13：PAMAM复合物-Math1基因纳米微粒经圆窗膜穿刺纤维注射转染在体的S-D大鼠耳蜗组织 [0094] 取健康的3周龄S-D大鼠，雌雄不限，体重120g～130g，耳廓反射灵敏，双耳鼓膜正常，无感染。使用动物用水合氯醛(北京)按4.5ml/kg体重对大鼠进行麻醉，于37℃保温袋保温。麻醉后，在严格无菌条件下，右侧耳经腹侧进路显露听泡，在手术显微镜下用电钻打开听泡，暴露耳蜗，在底周鼓阶以穿刺针打孔至外淋巴液流出。根据体外细胞转染水平的实验优化条件，制定活体转染最佳浓度；稀释液为人工外淋巴液；将5μl PAMAM复合物-PRK5-Math1-EGFP基因纳米微粒溶液经鼓阶打孔缓慢(约5分钟)注入，然后取一小块肌肉填塞封闭听泡打孔处，分层缝合切口。经鼓阶打孔纤维注射给药，给药方法简便易行、转染可靠、高效、对内耳骚扰比较小。 [0095] 实施例14：PAMAM复合物-PRK5-Math1-EGFP基因纳米微粒转染S-D大鼠内耳组织的免疫组化 [0096] PAMAM复合物-PRK5-Math1-EGFP基因纳米微粒转染7天后，对大鼠断头处理，然后迅速取出听泡，用4％的多聚甲醛固定1h，进行耳蜗基底膜铺片；免疫组化染色后于共聚焦荧光显微镜下观察结果，激发光488nm；表达Math1-EGFP的内外毛细胞为绿色荧光。如图9所示，内外毛细胞表达Math1-EGFP，显示绿色荧光，因此，PAMAM复合物-PRK5-Math1-EGFP基因纳米微粒可以有效的转染内耳包括内外毛细胞在内的不同细胞并表达，促进毛细胞再生，可以用于感音神经性耳聋的治疗。 [0097] 本发明不限于以上实施方式，本领域技术人员还可以做出多种改变和变形，在不脱离本发明精神的前提下，它们均在本发明的范围内。 |
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