[0001] 要求优先权

[0002] 本发明要求2008年10月31日提交的美国临时专利申请系列号61/110,121的权益，其通过全文提述并入本文。

[0003] 有关联邦赞助研究或开发的声明

[0004] 本发明是在利用由国家健康中心授予的资助号NHLBI U01-HL080731和T32-CA79443的政府支持下完成的。政府对本发明具有一定权利。

[0005] 本发明提供使用生物正交反电子需求Diels-Alder环加成反应(bioorthogonal inverse electron demand Diel s-Alder cycloaddition reaction)以供快速和特异性的共价递送“负载(payload)”至结合于生物靶标的配体的组合物和方法。

[0006] 发明背景

[0007] 用于在复杂生物环境下偶联物质的生物正交反应在生物学和医学中倍受关注。此类反应已成为多种应用包括蛋白质工程、免疫测定开发和细胞表面修饰中的关键组成部分。(Link JA等，2003，Curr Opin Biotechnol 14：603-609；Wang Q等，2003，J Am Chem Soc 12：3192-3193；Dimandis EP等，1991，Clin Chem 37：625-636；Baskin JM等，
2007，Proc NatlAcadSc.USA 104：16793-16797；Link JA等，2003，J Am Chem Soc 125：
11164-11165)。目前，已报道了一些类型的生物正交反应，最流行的为Staudinger连接和叠氮化物和炔之间的[3+2]环加成“点击(click)”反应。(Prescher JA等，2004，Nature
430(7002)：873-877；Rostovtsev VV等，2002，Angew Chem Int Ed 41(14)：2596-2599)。

[0008] 生物正交“点击”化学在化学生物学中广泛用于大量应用如基于活性的蛋白分析(activity based protein profiling)、蛋白交联、监视细胞增殖、生成新颖的酶抑制剂、监视新形成蛋白的合成、蛋白靶标的鉴定和研究聚糖加工。可能最吸引人的应用涉及使用这些生物正交化学在活系统如活细胞或甚至整个生物的存在下装配分子(Baskin等，2007，Proc Natl Acad Sci U S A，104，16793-7；Laughlin等，2008，Science，320，664-7；
Prescher和Bertozzi，2005，NatChem Biol，1，13-21；Neef和Schultz，2009，Angew Chem Int Ed Engl，48，1498-500；Ning等，2008，Angewandte Chemie-International Edition，
47，2253-2255)。上述这些应用需要化学作用无毒，并具有允许用微摩尔浓度的试剂在数分钟至数小时的时间范围内发生快速反应的动力学。

[0009] 为了满足这些标准，已报道了多种“不含铜的”点击化学，如张力引发的(strain-promoted)叠氮化物-炔环加成和Staudinger连接，以与培养中或体内系统如小鼠和斑马鱼(zebrafish)中的活细胞表面的叠氮化物反应(Prescher和Bertozzi，2005，Nat Chem Biol，1，13-21)。然而，迄今为止，在活系统中应用“点击”化学主要限于胞外靶标，且没有技术显示出可靠的特异性标记和成像胞内靶标的能力(Baskin和Bertozzi，2007，QSAR Comb.Sci.，26，1211-1219)。这可能有几个原因。除了要满足“点击”化学的稳定性、毒性和化学选择性要求之外，胞内活细胞标记需要可方便地穿过生物膜的试剂以及使得哪怕仅靠勉强穿过细胞膜的低浓度试剂也能快速标记的动力学。此外，具有实用性的胞内生物正交偶联方案会需要引入下述机制，即荧光标记在共价反应时荧光增加，以避免显像累积的但非反应性的成像探针(即背景)。这种“开启(turn-on)”会显著地增加信噪比，其与成像活细胞内的靶标特别相关，因为不可能严格地洗尽未反应的探针。

[0010] 前几年已引入了多种优秀的探针，其荧光在叠氮化物-炔环加成或staudinger连接偶联反应之后增加(Sivakumar等，2004，Org Lett，6，4603-6；Zhou and Fahrni，2004，J Am Chem Soc，126，8862-3；Hangauer和Bertozzi，2008，Angew Chem Int Ed Engl，47，2394-7；Lemieux等，2003，J Am Chem Soc，125，4708-9)。大多数这些策略或者需要紧密附于荧光团的反应基团从而需要合成新的荧光团框架，或者利用基于FRET的激活，其需要附加可充当能量转移剂的额外分子。此外，利用这些常用偶联方案的大多数探针迄今为止无法在活细胞中标记胞内靶标。

[0011] 生物正交的Diels-Alder反应与水性环境相容，并且具有二级速率常数，已知其在水性介质中与有机溶剂相比增强最多至几百倍。(Rideout DC等，1980，J Am Chem Soc102：7816-7817；Graziano G，2004，J Phys Org Chem17：100-101)。多种Diels-Alder反应是可逆的，因此，其可能并不适于进行生物标记。(Kwart等，1968，ChemRev 68：415-447)，然而，烯烃与四嗪的反电子需求Diels-Alder环加成导致不可逆的偶联，得到二氢哒嗪产物(图2)。在该反应过程中，在逆Diels-Alder步骤中释放双氮(Sauer J等，1965，Chem Ber998：1435-1445)。在该反应中，已研究了多种四嗪和亲二烯体包括环状和直链烯或炔。
选择适当的反应对象，允许在几个数量级之内调谐(tuning)偶联速率。(Balcar J等，
1983，Tet Lett 24：1481-1484；Thalhammer F等，1990，Tet Lett47：6851-6854)。亦参见US 2006/0269942、WO 2007/144200和US 2008/0181847。

[0012] 本发明提供基于生物正交反电子需求Diels-Alder环加成反应以供快速和特异性共价递送“负载”至结合于生物靶标的配体的方法和组合物。Diels-Alder反应连接该反应的两个组分，二烯和亲二烯体。二烯和亲二烯体各自在物理上连接于(例如通过接头)所述负载或结合于所述靶标的配体。该生物正交化学平台可在胞外或胞内，在体内或体外使用。

[0013] 因此，本文中所述的方法和组合物包括使用反电子需求Diels-Alder环加成化学以化学偶联二烯与亲二烯体。在一些实施方案中，所述二烯为含有两个相邻氮原子的芳香杂环系统。在一些实施方案中，所述二烯为取代的四嗪。在一些实施方案中，所述二烯为含有两个相邻氮原子的芳香杂环系统，其中生物缀合释放双氮。

[0014] 在一些实施方案中，所述亲二烯体是烯如乙烯、丙烯或其他直链烯。在一些实施方案中，所述亲二烯体为内炔(internal alkyne)、端炔(terminal alkyne)或环炔如环辛炔。在一些实施方案中，烯为具张力的烯(strained alkene)如降冰片烯和反式环辛烯。

[0015] 在一些实施方案中，本发明的特征为靶标特异性配体，如具有官能团(如胺、醇、羧酸或酯)的抗体，其可化学偶联于小有机分子如含有可用于偶联于抗体的反应性模块(如胺、醇、羧酸或琥珀酰亚胺酯)的反式环辛烯醇，以及可用于在Diels-Alder反应中与四嗪反应的亲二烯体如烯、羰基、亚硝基或亚胺。

[0016] 本文中还描述了标记和成像结合于活细胞的配体如小分子、抗体和其他生物分子的方法。这些方法包括使用涉及二烯如四嗪或其他具有至少两个位置彼此相邻的氮的芳香杂环系统与亲二烯体如具张力的烯、降冰片烯或反式环辛烯的反需求Diels-Alder化学。

[0017] 在一个方面，本发明包括用于将试剂(例如，如本文中所述的“负载”，例如，可检测试剂或治疗剂)递送至选定的生物靶标的组合物。所述组合物包括附于对所述生物靶标具有特异性的配体的第一组分；和附于所述试剂的第二组分，其中所述第一和第二组分各自选自二烯或亲二烯体，并为反电子需求Diels-Alder反应的反应物。因此，如果第一组分是二烯，则第二组分是亲二烯体，反之亦然。如本文中使用的术语“附于”包括化学链接，例如，通过反应性基团或接头，以及将所述二烯或亲二烯体掺入所述配体或试剂，例如，作为非天然氨基酸或核苷。

[0018] 在试剂为可检测试剂的实施方案中，所述可检测试剂可选自下组：有机小分子、无机化合物、纳米颗粒、酶或酶底物、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质以及造影剂。在一些实施方案中，所述可检测试剂连接于二烯，并在具张力的亲二烯体的存在下发生产生荧光的(fluorogenic)激活(即，其在缺乏所述亲二烯体时为非荧光性或弱荧光性的，并在亲二烯体存在下，当完成所述Diels-Alder反应时，变得具有更强的荧光)。

[0019] 在所述试剂为治疗剂的一些实施方案中，所述治疗剂可为例如小分子、酶抑制剂、受体蛋白抑制剂、小干扰RNA(siRNA)、细胞毒素、放射性离子或其他治疗剂。

[0020] 在另一个方面，本发明提供将可检测试剂递送至生物靶标的方法。所述方法包括将生物靶标与配体接触，其中所述配体连接于选自二烯或亲二烯体的第一组分以形成配体-靶标缀合物；将所述配体-靶标缀合物(且其中所述缀合物还连接于可检测试剂)与选自二烯或亲二烯体并参与与所述第一组分的反电子需求Diels-Alder反应的第二组分在使所述第一和第二组分进行反电子需求Diels-Alder反应的充足时间和条件下接触，由此将所述可检测试剂递送至所述靶标。在一些实施方案中，所述可检测试剂选自下组：有机小分子、无机化合物、纳米颗粒、酶或酶底物、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质和造影剂。

[0021] 在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测所述可检测试剂，例如，使用组织化学、荧光检测、化学发光检测、生物发光检测、磁共振成像、核磁共振成像、X射线成像、X射线计算机断层术、超声成像或光声成像。

[0022] 在一些实施方案中，所述生物靶标在活细胞或死细胞、组织切片或生物之中或之上。在一些实施方案中，所述生物靶标是在体外测定中的。

[0023] 在另一个方面，本发明的特征为用于将治疗剂递送至生物靶标的方法。所述方法包括将生物靶标与配体接触，其中所述配体连接于选自二烯或亲二烯体的第一组分以形成配体-靶标缀合物；将所述配体-靶标缀合物(且其中所述缀合物还连接于治疗剂)与选自二烯或亲二烯体并参与与第一组分的反电子需求Diels-Alder反应的第二组分在使所述第一和第二组分进行反电子需求Diels-Alder反应的充足时间和条件下接触，由此将所述治疗剂递送至所述靶标。在一些实施方案中，所述治疗剂为小分子、酶抑制剂、受体蛋白抑制剂、小干扰RNA(siRNA)、细胞毒素、放射性离子或其他治疗剂。

[0024] 在一些实施方案中，所述细胞毒素选自下组：紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素(colchicin)、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、类美坦木素(maytansinoids)、和它们的类似物或同源物。

[0025] 在一些实施方案中，所述放射性离子选自下组：碘125、碘131、锶89、磷、钯、铯、铱、磷酸根、钴、钇和镨。

[0026] 在一些实施方案中，所述治疗剂选自下组：抗代谢药、烷化剂、蒽环类、抗生素和抗有丝分裂剂。

[0027] 除非另行定义，本文中使用的所有技术和科学术语的含意与本发明所属的领域的一般技术人员所通常理解的含意相同。在本文中描述了用于本发明的方法和材料；也可使用其他本领域中已知的合适的方法和材料。所述材料、方法和实施例仅为说明性的，并不旨在限制。本文中提及的所有的公开出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他文献通过全文提述并入本文。在有抵触的情况下，以本说明书包括定义为准。

[0028] 本发明的其他特征和优点根据下述详述的描述和附图，以及根据权利要求书会是显而易见的。

[0029] 附图简述

[0030] 图1显示了其中亲二烯体连接于配体而二烯连接于负载的实施方案，以及其中二烯连接于配体而亲二烯体连接于负载的实施方案。

[0031] 图2显示了使用二烯(取代的四嗪)和亲二烯体(烯或炔)的反电子需求Diels-Alder反应。

[0032] 图3显示了反电子需求Diels-Alder环加成物(cycloadduct)、染料-四嗪缀合物和反式环辛烯醇和环加成产物。

[0033] 图4显示在对反式环辛烯醇的环加成之前和之后染料-四嗪缀合物的吸收和发射光谱。

[0034] 图5是反应之前和之后染料光物理性质的列表。

[0035] 图6A显示 的结构和反式环辛烯紫杉醇类似物的结构。

[0036] 图6B显示紫杉醇、反式环辛烯紫杉醇和DMSO对照在缺乏GTP下聚合微管蛋白的能力的比较。

[0037] 图6C显示在用四嗪-BODIPYFL处理的反式环辛烯紫杉醇存在下形成的并通过荧光显微术显影的微管束。

[0038] 发明详述

[0039] 本发明涉及用于将“负载”如治疗剂或可检测试剂递送至生物靶标的组合物和方法。这些方法包括应用使用生物正交化学的生物缀合如反电子需求Diels-Alder反应以递送负载如治疗或检测化合物，其使用特异性配体如抗体、小分子和其他生物分子。所述特异性配体(任选地通过接头)附于所述Diels-Alder对中的一个组分，而所述负载(也任选地通过接头)附于另一组分。举例而言，如果配体附于二烯，则负载附于亲二烯体；如果配体附于亲二烯体，则负载附于二烯。所述方法和组合物可用于例如体内和体外，胞外或胞内，以及测定中如不含细胞的测定中。

[0040] 靶标

[0041] 本文中所述的方法和组合物可用于将负载递送至任何针对其存在或可生成特异性配体的生物靶标。所述配体可共价地或非共价地结合于所述靶标。

[0042] 示例性的生物靶标包括生物聚合物，例如蛋白质、核酸或多糖；示例性蛋白质包括酶、受体、离子通道。其他例示性靶标包括小分子，例如脂质、磷脂、糖、肽、激素或神经递质。在一些实施方案中，所述靶标为组织或细胞类型特异性标记，例如，在选定组织或细胞类型上特异性表达的蛋白质。在一些实施方案中，所述靶标是受体，如质膜受体和核受体，但不限于此；更具体的实例包括配体门控离子通道、G-蛋白偶联受体和生长因子受体。在一个实施方案中，所述受体是表皮生长因子受体(EGFR)。

[0043] 配体

[0044] 配体可为特异性结合于选定靶标，并可通过任选地藉由接头加成二烯或亲二烯体来官能化的任何化合物，如小分子或生物分子(例如，抗体或其抗原结合片段)。

[0045] 抗体

[0046] 本文中使用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即抗原结合部分。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例包括F(ab)和F(ab′)2片段，其保留结合抗原的能力。此类片段可市购或使用本领域已知方法获得。举例而言，F(ab)2片段可通过用酶如胃蛋白酶处理抗体来生成，胃蛋白酶是一种通常产生一个F(ab)2片段和许多Fc部分的小肽的非特异性内肽酶。所得的F(ab)2片段由两个通过二硫键连接的Fab单元组成。Fc片段经彻底地降解，且可通过透析、凝胶过滤或离子交换层析从F(ab)2分离。F(ab)片段可使用木瓜蛋白酶生成，木瓜蛋白酶是一种特异性硫醇内肽酶，其在还原剂存在下将IgG分子消化为三个类似大小的片段：两个Fab片段和一个Fc片段。当着眼于Fc片段时，木瓜蛋白酶是优选的酶，因为其生成50,00道尔顿的Fc片段；为了分离F(ab)片段，可例如通过使用蛋白A/G的亲和纯化去除Fc片段。商业上可获得很多试剂盒以供生成F(ab)片段，包括ImmunoPure IgG1Fab和F(ab’)2Preparation Kit(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)。此外，可使用商业上可获得的服务以供生成抗原结合片段，例如Bio Express，West Lebanon，NH。

[0047] 所述抗体可为多克隆、单克隆、重组例如嵌合的、去免疫化(de-immunized)或人源化、完全人的、非人的例如鼠类的、或单链抗体。在一些实施方案中，所述抗体具有效应物功能，并可固定补体。在一些实施方案中，所述抗体具有降低的结合Fc受体的能力或没有结合Fc受体的能力。举例而言，所述抗体可为不支持结合于Fc受体的同种型或亚型、片段或其他突变体，例如，其具有经诱变或经缺失的Fc受体结合区。

[0048] 除了利用全抗体之外，本发明涵盖使用此类抗体的结合部分。此类结合部分包括Fab片段、F(ab’)2片段和Fv片段。这些抗体片段可通过常规方法如蛋白水解片段化方法如J.Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.98-118(N.Y. Academic Press 1983)中所述来制备。

[0049] 对于包括重复施用的应用例如人受试者的治疗处理，需要嵌合、人源化、去免疫化或完全人的抗体。

[0050] 所述抗体还可为单链抗体。单链抗体(scFV)可经工程改造(参见例如Colcher等，Ann.N.Y. Acad.Sci.880：263-80(1999)；以及Reiter，Clin.Cancer Res.2：
245-52(1996))。所述单链抗体可经二聚体化或多聚体化以生成对于相同靶蛋白不同表位具有特异性的多价抗体。在一些实施方案中，抗体是单价的，例如如Abbs等，Ther.Immunol.1(6)：325-31(1994)中所述，其通过提述并入本文。

[0051] 制备合适抗体的方法在本领域是已知的。参见，例如E.Harlow等编Antibodies：A Laboratory Manual(1988)。

[0052] 在一些实施方案中，所述抗体特异性结合于肿瘤抗原，或肿瘤存在的组织中存在的抗原。已知多种针对癌症相关抗原的抗体(Ross等，Am J Clin Pathol 119(4)：472-485，2003)。实例包括阿仑单抗(Alemtuzumab)(Campath)；达克珠单抗(Daclizumab)(赛尼哌(Zenapax))；利妥昔单抗(Rituximab)(Rituxan)；曲妥单抗(Trastuzumab)(Herceptin)；
吉姆单抗(Gemtuzumab)(Mylotarg)；替依莫单抗(Ibritumomab)(Zevalin)；依决洛单抗(Edrecolomab)(Panorex)；托西莫单抗(Tositumomab)(Bexxar)；CeaVac；依帕珠单抗(Epratuzumab)(LymphoCide)；米妥莫单抗(Mitumomab)；贝伐单抗(B evacizumab)(Avastin)；西妥昔单抗(Cetuximab)(C-225；Erbitux)；依决洛单抗(Edrecolomab)；
林 妥 珠 单 抗 (Lintuzumab)(Zamyl)；MDX-210；IGN-101；MDX-010；MAb，AME；ABX-EGF；
EMD 72000；Apolizumab；Labetuzumab；ior-t1；MDX-220；MRA；H-11scFv；Oregovomab；
huJ591MAb，BZL；Visilizumab；TriGem；TriAb；R3；MT-201；未 缀 合 的G-250；ACA-125；
Onyvax-105；CDP-860；BrevaRex MAb；AR54；IMC-1C11；GlioMAb-H；ING-1；抗LCG 单 抗；
MT-103；KSB-303；Therex；KW-2871；抗 HMI.24；抗PTHrP；2C4抗 体；SGN-30；TRAIL-RI MAb，CAT；H22xKi-4；ABX-MA1；Imuteran；和Monopharm-C。在其中所述配体对肿瘤抗原或癌组织具有特异性的实施方案中，负载可为治疗剂如细胞毒素、放射性试剂或其他可用于治疗癌症的治疗剂。

[0053] 小分子和生物分子

[0054] 小分子为低分子量有机化合物(低于2000道尔顿)。可用于本文中所述的组合物和方法的小分子以高亲和力结合于生物聚合物，如蛋白质、核酸或多糖，或其他生物靶标。有用的小分子能够用亲二烯体或二烯官能化。举例而言，小分子可为试剂如紫杉醇，其特异性结合于微管并能够用亲二烯体如反式环辛烯或其他烯官能化。其他的实例包括特异性结合于激素、细胞因子、趋化因子或其他信号传导分子的受体的小分子。

[0055] 生物分子为由活生物产生的有机分子，包括大的聚合物分子如蛋白质、多糖和核酸以及小分子如初级代谢物、次级代谢物和天然产物。具体的小分子实例包括但不限于，雌二醇、睾酮、胆固醇、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰胆碱。

[0056] 接头

[0057] 如本文中使用的术语“接头”指一组原子，例如0-500个原子，并可包含原子或基团如碳、氨基、烷基氨基、氧、硫、亚砜、磺酰基、羰基和亚胺，但不限于此。所述接头链还可包含饱和、不饱和或芳香环的一部分，包括多环和芳香杂环，其中所述芳香杂环是含有一至四个杂原子N、O或S的芳基。具体的实例包括但不限于不饱和的烷、聚乙二醇和右旋糖酐(dextran)聚合物。所述接头决不能干扰配体与靶标的结合，或Diels-Alder反应。

[0058] Diels-Alder对

[0059] 本文中所述的组合物和方法包括使用包括二烯和亲二烯体的Diels-Alder对(Diels-Alder pair)。二烯(例如取代的四嗪)与亲二烯体(例如烯或炔)的反电子需求Diels-Alder环加成反应产生不稳定的环加成物，其随后发生反-Diels-Alder环加成反应以生成作为副产物的二氮和所需的二氢吡嗪(与烯反应之后)或吡嗪(与炔反应之后)产物(图2)。可对二氢吡嗪产物进行另外的氧化步骤以生成相应的吡嗪。

[0060] 生物正交化学

[0061] 使用四嗪和具高度张力的亲二烯体如降冰片烯和反式环辛烯之间的反电子需求Diels-Alder环加成的生物缀合方法在文献中是已知的，然而使用的四嗪对于水性介质的稳定性有限。(Blackman等，2008，J Am Chem Soc，130，13518-9；Devaraj等，2009，Angew Chem Int Ed Engl，48，7013-6；Devaraj 等，2008，Bioconjug Chem，19，2297-9；Pipkorn等，2009，J Pept Sci，15，235-41)。为了提高所述四嗪的稳定性，采用了在水和血清中表现3 -1 -1
出优越稳定性并可与反式环辛烯在37℃以大约10M sec 的速率反应的新颖不对称四嗪(Devaraj等，2009，Angew Chem Int Ed Engl，48，7013-6)。这种极其快速的速率常数允许以低纳摩尔浓度的四嗪标记剂标记胞外靶标，该浓度足够低以允许对探针积聚进行实时成像。

[0062] 举例而言，可修饰所述生物正交反电子需求Diels-Alder反应以提供使用配体如小分子和其他生物分子在活细胞内用于进行快速、特异性共价标记和成像的直截了当的方法。尽管在将多种选择性化学应用于胞外活细胞标记方面有长足发展，迄今为止，还没有广泛适用于胞内标记的方法。举例而言，本文中描述了一系列“开启”的连接四嗪的荧光探针，其通过反电子需求Diels-Alder反应与具张力的亲二烯体如反式环辛烯快速反应。在环加成时，荧光强度急剧增加，在某些情况下增加～20倍。这种荧光“开启”显著降低背景信号。这些用于针对配体如抗体、小分子或其他经具张力的烯修饰的生物分子的用于活细胞成像的新探针可提供用于标记和成像结合于特异性靶标的配体的一般方法。举例而言，可将该生物正交反电子需求Diels-Alder反应应用于不对称四嗪和具张力的烯，其物理偶联于小分子，即反式环辛烯修饰的紫杉醇类似物，并可用于标记和成像结合于胞内管(tubule)的这种小分子。快速的反应速率，与荧光“开启”一同使其成为近乎理想的揭示活细胞内小分子的方法。

[0063] 在一些实施方案中，所述配体例如抗体、小分子或其他生物分子物理附于亲二烯体(图1)。在一些实施方案中，所述配体携带官能团如胺、醇、羧酸或酯，或配体上其他可发生允许附于亲二烯体的化学反应的原子基团。或者，或另外，所述亲二烯体或杂亲二烯体(heterodienophile)(其可为例如烯、炔、亚硝基、羰基或亚胺)具有反应性官能团以供附于配体。因此，配体和/或亲二烯体上的反应性官能团发生化学反应在两者之间形成连接。在一些实施方案中，例如，当所述配体是生物聚合物如核酸、肽或多肽的情况下，配体上的官能团可为非天然核苷或氨基酸，例如，如Xie和Schultz，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.7：775-782(2006)中所述的；举例而言，所述二烯或亲二烯体可作为侧链掺入非天然氨基酸。
本领域技术人员可方便地合成此类化合物。举例而言，苯丙氨酸或酪氨酸的侧链可用二烯例如四嗪取代；亲二烯体例如反式环辛烯或降冰片烯可取代苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或色氨酸的侧链。然后这些新的非天然氨基酸可与已知的非天然氨基酸类似地使用，例如，可在所述新的非天然氨基酸存在下温育细胞，并可产生包含已经掺入蛋白质一级结构的二烯或亲二烯体的蛋白质。

[0064] 在一些实施方案中，所述二烯可为取代的四嗪或其他具有至少两个氮彼此相邻并为反电子需求Diels-Alder反应中的高反应性参与物的芳香杂环系统。所述二烯连接于负载(其可为例如治疗剂、荧光染料或其他可检测试剂)(图2)。在这些实施方案中，所述二烯具有反应基团如胺、醇、羧酸或酯，或者可与负载上的反应性模块发生化学反应以在两者之间形成连接的其他基团。

[0065] 二烯

[0066] 可用于本公开的二烯包括但不限于含有两个相邻氮原子的芳香环系统，例如四嗪、哒嗪、取代或未取代的1，2-二嗪。其他1，2-二嗪可包括与第二缺乏π电子的芳香环结合的1，2-二嗪如吡啶并[3，4-d]哒嗪、哒嗪并[4，5-d]哒嗪(pyridazino[4，5-d]pyridazine)和1，2，4-三嗪。哒嗪也可与五元杂环稠合如咪唑并[4，5-d]哒嗪和1，2，3-三唑并[4，5-d]哒嗪。在一些优选实施方案中，所述二烯为本文中所述的不对称四嗪，例如3-(对苄基氨基)-1，2，4，5，-四嗪(1)。

[0067]

[0068] 亲二烯体

[0069] 可用于本方法和组合物的亲二烯体包括但不限于含碳亲二烯体如烯或炔，或含亚硝基、羰基或亚胺基团的化合物。在一些实施方案中，所述亲二烯体是具张力的亲二烯体。如本文中使用的“具张力的”亲二烯体具有偏离理想化的180度双面夹角的双面夹角。或者，不具张力的亲二烯体(例如苯乙烯)和/或富电子的亲电体(例如烯胺或乙烯基醚)也可与亚硝基化合物一同使用。如本文中所用的烯指具有一个或多个碳碳双键的烷基基团如乙烯、丙烯等。烯还包括环状的、环具张力的烯(ring-strained alkene)如反式环辛烯或降冰片烯，其携带诱导显著环张力的双键并因此具有高反应性。烯还可包括更加复杂的结构如吲哚和氮杂吲哚(azaindole)，富电子烯胺。也可使用含有羰基、亚硝基或亚胺基团的杂亲二烯体。在一些优选实施方案中，所述亲二烯体为反式环辛烯醇，例如(E)-环辛-4-烯醇。

[0070] 负载

[0071] 本文中所述的方法和组合物可用于将负载递送至生物靶标。所述负载可用于例如标记(例如，可检测试剂如荧光团)，或治疗目的(例如，细胞毒素或其他治疗剂)。

[0072] 治疗剂

[0073] 在一些实施方案中，所述负载是治疗剂如细胞毒素、放射性离子或其他治疗剂。细胞毒素或细胞毒性剂包括任何对细胞有害的试剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、类美坦木素(maytansinoids)例如美登醇(参见美国专利5,208,020号)、CC-1065(参见美国专利5,475,092、5,585,499、5,846,545号)和它们的类似物或同源物。放射性离子包括但不限于碘(例如碘125或碘131)、锶89、磷、钯、铯、铱、磷酸根、钴、钇90、钐153和镨。其他治疗剂包括但不限于抗代谢药(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化剂(例如氮芥、硫替哌(thioepa)苯丁酸氮芥、CC-1065、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(cis-dichlorodiamine platinum)(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如，柔红霉素(以前的道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(如，更生霉素(以前的放线菌素)、博来霉素、光神霉素、和氨茴霉素(AMC))以及抗有丝分裂剂(如，长春新碱、长春碱、紫杉醇和类美坦木素)。

[0074] 核酸，例如抑制性核酸，例如小干扰RNA、反义核酸、适体也可用作治疗剂。

[0075] 可检测试剂

[0076] 可检测物质的实例包括多种有机小分子、无机化合物、纳米颗粒、酶或酶底物、荧光物质、发光物质、生物发光物质、化学发光物质、放射性物质和造影剂。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的荧光物质的实例包括硼-二吡咯亚甲基(boron-dipyrromethene) 4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-苯并二茚-3-丙酸(4，4-difluoro-5，7-dimethyl-4-bora-3a，
4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid)( FL)、6-((4，4-二氟-1，3-二甲
基-5-(4-甲氧基苯基)-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-苯并二茚-2-丙酰)氨基)己酸(6-((4，
4-difluoro-1，3-dimethyl-5-(4-methoxyphenyl)-4-bora-3a，4a-diaza-s-indacen e-2-propionyl)amino)hexanoic acid)，琥珀酰亚胺酯( TRM-X)、Oregon
Green 88、6-(((4，4-二氟-5-(2-吡咯基)-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-苯并二茚-3-基)苯乙烯基氧)乙酰基)氨基己酸(6-(((4，4-difluoro-5-(2-pyrrolyl)-4-bora-3a，
4a-diaza-s-indacene-3-yl)styryloxy)acetyl)aminohexanoic acid)，琥珀酰亚胺酯( 650/665-X)、7-N，N-二乙醇胺基香豆素、VIVOTAG 680(一种胺反应性近红
外荧光染料，来自VisEn Medical)、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括萤光素酶、萤光素和水母素，而合适的放射性物质的实例包括18F、67Ga、81mKr、82Rb、111In、123I、
133Xe、201Tl、125I、35S、14C或3H、99mTc(例如作为高鍀酸盐(鍀酸盐(VII)，TcO4-))，直接或间接地，或其他可通过直接放射性发射计数(direct counting of radioemmission)或通过闪烁计数检测的放射性同位素。此外，可使用造影剂，例如用于MRI或NMR、用于X射线CT、拉曼成像、光学相干断层摄影术、吸收成像、超声成像或热成像的造影剂。还可使用示例性造影剂包括金(例如金纳米颗粒)、钆(例如，螯合的钆)、氧化铁(例如，超顺磁性氧化铁(SPIO)、单晶氧化铁纳米颗粒(MION)和超微超顺磁性氧化铁(USPIO))、锰螯合物(例如Mn-DPDP)、硫酸钡、碘化造影剂(碘海醇)、微气泡或全氟碳。

[0077] 在一些实施方案中，所述可检测试剂是经激活变为可检测的不可检测的前体。实例包括产荧光的(fluorogenic)四嗪-荧光团构建体(例如四嗪-BODIPY FL、四嗪-Oregon Green 488或四嗪-BODIPY TMR-X)或可用酶激活的产荧光剂(例如PROSENSE (VisEn Medical))。

[0078] 当化合物经酶例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或萤光素酶标记时，所述酶标记通过确定适当底物向产物的转化来检测。

[0079] 可利用这些组合物的体外测定法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、免疫荧光、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)和Western印迹分析。

[0080] 细胞穿透模块和试剂

[0081] 在一些实施方案中，所述组合物还包含细胞穿透模块或试剂，其增强所述组合物的胞内递送。举例而言，所述组合物可包含协助向胞内空间的递送的细胞穿透肽序列例如HIV来源的TAT肽、penetrain、transportan或hCT来源的细胞穿透肽，参见例如Caron等，(2001)Mol Ther.3(3)：310-8；Langel，Cell-Penetrating Peptides：Processes and Applications(CRC Press，Boca Raton FL 2002)；El-Andaloussi等，(2005)Curr Pharm Des.11(28)：3597-611；以及Deshayes等，(2005)Cell Mol Life Sci.62(16)：1839-49。所述组合物亦可配制为包含细胞穿透剂，例如脂质体，其增强所述组合物向胞内空间的递送。

[0082] 用途

[0083] 本文中描述的组合物和方法可用于多种不同的需要将物质(“负载”)递送至生物靶标的情形，例如递送可检测的物质以供检测靶标，或递送治疗剂。检测方法可包括体外成像和体内成像方法，例如免疫组织化学、生物发光成像(BLI)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层术(PET)、电子显微术、X射线计算机断层术、拉曼成像、光学相干断层术、吸收成像、热成像、荧光反射成像、荧光显微术、荧光分子断层成像、核磁共振成像、X射线成像、超声成像、光声成像、实验室测定或任何需要标记/染色/成像的情况。

[0084] 试举一例，本文中所述的Diels-Alder偶联反应可用于替代标准的亲和素(或链霉亲和素)/生物素偶联方法。许多组织类型可含有内源生物素，因此使用现有的标准的基于生物素的偶联方法，可能有必要用额外的步骤阻断内源生物素活性以消除不希望的非特异性背景染色。如果使用本文中所述的组合物，则该阻断步骤并非必要。

[0085] 该方法还用于电子显微术，其中荧光团-亲二烯体(或-二烯)组分由金纳米颗粒-亲二烯体(或-二烯)缀合物替代。

[0086] 本文中所述的Diels-Alder偶联组合物也可适用于任何其中采用亲和素(链霉亲和素)/生物素系统的原位杂交(ISH)或荧光原位杂交(FISH)实验方案以供在组织或细胞制备物中显影DNA或RNA，例如Tyramide Signal Amplification FISH(Tyramide信号扩增荧光原位杂交)。

[0087] 如本文中所述的Diels-Alder偶联反应还可在western印迹过程中用作二抗的替代物或替代标准的亲和素(或链霉亲和素)/生物素偶联方法。

[0088] 此外，本文中所述的组合物可用于将治疗剂递送至例如活动物中的细胞或组织。因此将治疗化合物附于Diels-Alder对的一方，并将靶向目标细胞或组织的配体附于另一方。举例而言，将识别肿瘤细胞的配体如抗体附于一方，而将另一方连接于包含细胞毒素如毒素或放射性物质的负载。

[0089] 这些组合物可具体用于配体在体内具有长半衰期的预靶向(pretargeting)策略。举例而言，单克隆抗体在血液中具有非常长的半衰期。该性质在抗体直接用成像剂或细胞毒素标记时导致不良的靶标对背景比例。参见例如Wu和Senter，Nat.Biotechnol.23：1137-1146(2005)。本文中所述的方法和组合物可回避这些问题。

[0090] 药物组合物和施用方法

[0091] 本文中所述的方法包括制造和使用药物组合物，其包含本文中所述的化合物作为活性成分。亦包括药物组合物本身。在一些实施方案中，所述组合物包含对肿瘤抗原或癌组织具有特异性的配体，且负载为治疗剂如细胞毒素、放射性试剂或其他可用于治疗癌症的治疗剂。

[0092] 药物组合物通常包含药学上可接受的载体。如本文中使用的表述“药学上可接受的载体”包括适合药物施用的盐水、溶剂、分散介质、包被、抗细菌和抗真菌剂、等张和延迟吸收剂等。补充性的活性化合物也可掺入该组合物中。

[0093] 通常将药物组合物配制为适合其计划的施用途径。施用途径的实例包括胃肠外例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮(局部)、经粘膜和直肠施用。

[0094] 配制合适的药物组合物的方法在本领域是已知的，参见例如Drugs andthe Pharmaceutical Sciences：a Series of Textbooks and Monographs(Dekker，NY)系列中的书籍。举例而言，用于胃肠外、皮内或皮下施用的溶液或悬液可包含下述组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调整张度的试剂如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱如盐酸或氢氧化钠调整pH。胃肠外制备物可封装于玻璃或塑料制的安瓿、一次性注射器或多计量小瓶。

[0095] 适于注射用途的药物组合物可包括无菌水溶液(当水溶性时)或分散液和无菌粉末以供当场配制无菌注射用溶液或分散液。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑TM菌水、Cremophor EL (BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须为无菌的，并应为使其具有易于注射性的(流动)程度的流体。其在制造和储藏条件下应为稳定的，且其保存必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。所述载体可为溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，和它们的合适的混合物。可例如通过使用包被如卵磷脂，通过在分散液的情况下维持所需的颗粒大小，和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。微生物作用的防止可通过多种抗细菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选在组合物中包含等张剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。注射用组合物的延长吸收可通过将延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶包含于组合物来实现。

[0096] 无菌注射用溶液可通过将活性化合物以所需量与上述列举的一种成分或成分的组合掺入适当的溶剂，并视需要接着进行过滤灭菌来制备。一般而言，分散液是通过将活性化合物掺入无菌媒介物来制备的，所述媒介物含有基底(basic)分散介质和来自上述列举的所需的其他成分。对于用于制备无菌注射用溶液的无菌粉末，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其得到活性成分的粉末加上来自之前过滤灭菌的溶液的任何其他所需成分。

[0097] 经口组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载体。就经口治疗施用而言，可将活性化合物与赋形剂一同掺入，并以片剂、锭剂或胶囊例如明胶胶囊的形式使用。经口组合物还可使用流体载体来制备用于作为漱口剂使用。可包含药学上相容的结合剂，和/或佐剂材料作为组合物一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有任何下述成分，或类似性质的化合物：结合剂如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖，崩解剂如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或矫味剂(flavoring agent)如胡椒薄荷(peppermint)、水杨酸甲酯或橙味矫味剂。

[0098] 对于吸入施用，所述化合物可以气溶胶喷雾的形式从含有合适推进剂例如气体如二氧化碳的加压容器或分配器，或雾化器进行递送。此类方法包括美国专利6,468,798号中所述的那些。

[0099] 如本文中所述的治疗化合物的全身施用(systemic administration)也可通过经粘膜或经皮的手段。对于经粘膜或经皮施用，将适用于待渗透屏障的渗透剂用于配制物中。此类渗透剂在本领域一般是已知的，并包括例如用于经粘膜施用的去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可通过使用鼻喷雾或栓剂来实现。对于经皮施用，将活性化合物配制为如本领域一般已知的软膏剂(ointment)、油膏剂(salve)、凝胶或乳膏(cream)。

[0100] 药物组合物还可制备为栓剂(例如，用常规的栓剂基底如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠剂的形式以供直肠递送。

[0101] 也可使用脂质体(例如，如美国专利6,472,375号中所述)和微囊。还可使用可生物降解的可靶向的微粒递送系统(例如，如美国专利6,471,996号中所述)。

[0102] 在一个实施方案中，将所述治疗化合物与会保护所述治疗化合物避免从身体快速清除的载体一同制备，如控制释放配制物，包括植入物和微囊化递送系统。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚正酯和聚乳酸。此类配制物可使用标准技术制备，或例如从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc市购获得。脂质体悬液(包括具有针对细胞抗原的单克隆抗体、靶向选定细胞的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员已知方法制备，例如，如美国专利4,522,811号中所述。

[0103] 药物组合物可与施用说明一同包含于容器、包装或分配器中。实施例

[0104] 本发明进一步在下述实施例中进行描述，其并不限制权利要求书中所述发明的范围。

[0105] 除非指明，所有化学品均购自Sigma Aldrich，并以收到时的原样使用。降冰片烯，乙酸(1S，2S，4S)-双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基酯购自ChemBridge。所有溶剂为试剂级或更高级，并不经进一步纯化而使用。分析性HPLC和LC/MS在配置有2996二极管阵列检测器、Micromass ZQ4000ESI-MS模块和流速为0.3mL/分钟的Grace-Vydac RPC18柱(218TP5210型)的Waters 2695HPLC上进行。制备型HPLC在配置有335型二极管阵列检测器、701型分级收集器和流速为21mL/分钟的Varian RPC18柱(A6002250X212型)的Varian ProStar210型仪器上进行。

[0106] 对于所有HPLC运行，溶剂A包含含0.1％TFA的水，而溶剂B包含含10％水和0.1％TFA的乙腈。所有的UV/可见光光谱和动力学实验记录于Agilent 8453二极管阵列UV/可见光分光光度计。根据所有动力学实验的假一级速率常数使用Agilent UV/可见光Chemstation软件包Rev.A.10.01计算。荧光测量结果使用Varian Cary Eclipse荧光
1 13
分光光度计获得。H(400MHz)和 CNMR(100MHz)光谱是在Bruker Advance-400NMR分光计上在环境温度在D2O中用3-(三甲基硅烷基)-2，2，3，3-D4-丙酸钠盐(TSP)作为内标来收集的。高分辨率电喷射离子化(ESI)质谱是在麻省理工学院Department of Chemistry Instrumentation Facility的Bruker Daltonics APEXIV 4.7Tesla傅里叶变换质谱仪(FT-ICR-MS)上获得的。

[0107] 实施例1.3-(对苄基氨基)-四嗪-VT680缀合物(3)

[0108] 下述实施例描述3-(对苄基氨基)-四嗪-VT680缀合物合成的示例性方法。

[0109]

[0110] 步骤1.3-(对苄基氨基)-1，2，4，5-四嗪的合成

[0111]

[0112] 向4-(氨基甲基)苄腈盐酸盐(25mmol，4.21g)、甲脒乙酸盐(100mmol，10.41g)和硫(25mmol，801mg)的完全掺和的混合物添加无水肼(7.84mL，250mmol)。在添加肼之后，反应混合物变为释出气体的稠的、清澈的浆液。在剧烈搅拌20小时之后，将现为黄色的浆液添加至乙酸(50mL)，并经过玻璃料(glass frit)过滤。

[0113] 然后将15ml水中的亚硝酸钠(125mmol，8.63g)添加至乙酸溶液，在冰/水浴中冷却超过15分钟(注意：亚硝酸钠的添加生成大量的有毒氮氧化物气体，而应在良好通风的通风橱中进行)。在亚硝酸钠的添加过程中，溶液颜色变为亮粉色。将在通过在60℃和5torr旋转蒸发去除乙酸之后剩余的残余物接着用乙腈洗涤(3x20mL)并过滤。

[0114] 在通过旋转蒸发去除乙腈之后，将剩余的粘稠粉色油状物(oil)(～20g)溶解于250mL的缓冲液A，并分5部分通过加载于70g Varian Mega Bond Elute RPC18快速层析柱(chromatography cartridge)并用含25％MeOH的缓冲液洗脱来部分纯化。将所得的粉色级分合并、浓缩并通过制备型HPLC在30分钟期间用0至25％缓冲液B的梯度纯化，在去除溶剂之后获得1(0.92g，20％)，为粉色结晶固体。1的纯度通过分析性HLPC来验证。
1
H NMR(400MHz，D2O)：δ10.41(1H，s)，8.52(2H，d，J＝8.4Hz)，7.73(2H，d，J＝8.4Hz)，
13
4.34(2H，s). CNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ169.23，160.49，140.57，135.05，132.74，131.91，+ +
45.69.LRMS-ESI[M+H] m/z对于[C9H10N5]计算值为188.0931，观测值为188.0。

[0115] 步骤2.3-(对苄基氨基)-四嗪-VT680缀合物(3)的合成

[0116]

[0117] 向1(15.0mg，0.08mmol)在2.5mL的0.1M PBS，pH 8.3中的溶液添加VT680NHS酯(12.4mg，0.01mmol)。允许深蓝色的溶液在暗处搅拌过夜。在30分钟期间使用0至25％缓冲液B的梯度对反应溶液进行制备型HPLC之后获得了纯3(5.2mg)。产品纯度是通过分析性LC/MS评价的。3的合成通过低分辨率ESI质谱确证。3预期的分子量根据1的分子量和生产商提供的VT680的NHS酯(VivoTag 680为(苯并)吲哚盐来源的远红外(far red)荧光染料的胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯)为1238的分子量对于[M+H]+计算为大约1309。实验观察到的3的分子量对于[M+H]+为1309.7。

[0118] 实施例2：其他3-(对苄基氨基)-四嗪-荧光团缀合物的合成

[0119] 四嗪荧光团缀合物合成的一般步骤

[0120] 向3-(4-苄基氨基)-1，2，4，5-四嗪(10μmol)在无水DMF(0.5mL)中的溶液添加合适荧光团的琥珀酰亚胺酯(2.5μmol)和三乙胺(10μmol)。将所得的溶液在暗处振荡过夜。然后将粗反应混合物通过制备型反相HPLC使用0至100％缓冲液B的梯度进行纯化。缀合物的身份和纯度分别通过电喷射质谱法和分析性HPLC加以确证。通过该步骤分别使用BODIPY-FL、BODIPY TMR-X、Oregon Green 488、BODIPY 650-665和7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸的琥珀酰亚胺酯制备了下述缀合物：四嗪-BODIPY FL、四嗪-BODIPY TMR-X、四嗪-Oregon Green 488、四嗪-BODIPY 650-665和四嗪-香豆素。

[0121] 实施例3：5-(4-(1，2，4，5-四嗪-3-基)苄基氨基)-5-氧代戊酸

[0122] 下述实施例描述了合成5-(4-(1，2，4，5-四嗪-3-基)苄基氨基)-5-氧代戊酸的示例性方法。

[0123]

[0124] 向3-(对苄基氨基)-1，2，4，5-四嗪(9.4mg，0.05mmol)在无水DMF(1.5mL)中的溶液添加戊二酸酐(22.8mg，0.2mmol)和三乙胺(7μL，0.05mmol)。将所得的溶液搅拌3小时。将粗产物通过制备型反相HPLC在30分钟期间使用0至100％缓冲液B的梯度进行纯化。在去除溶剂之后，分离了纯的5-(4-(1，2，4，5-四嗪-3-基)苄基氨基)-5-氧代1
戊酸(9.9mg，66％)，为粉色固体。H NMR(400MHz，CD3OD)：δ10.31(1H，s)，8.55(2H，d，J＝6.8Hz)，7.55(2H，d，J＝6.8Hz)，4.50(2H，s)，2.37-2.33(4H，m)，1.93(2H，pentet，J＝+ +
5.8Hz)。LRMS-ESI[M+H]m/z对于[C14H16N5O3]计算值为302.12，观测值为302.2。

[0125] 实施例4：(4-(1，2，4，5-四嗪-3-基)苯基)甲醇

[0126] 下述实施例描述了合成(4-(1，2，4，5-四嗪-3-基)苯基)甲醇的示例性方法。

[0127]

[0128] 向4-(羟甲基)-苯甲酰亚胺酸乙酯盐酸盐(4-(hydroxymethyl)-benzenecarboximidic acid，ethyl ester，hydrochloride)(1mmol，216mg)和甲脒乙酸盐(5mmol，521mg)的混合物添加无水肼(20mmol，630uL)，搅拌所得的粘稠油状物。1小时之后，添加乙酸(3mL)，接着添加为精细分开的粉末的亚硝酸钠(690mg，10mmol)。将现为亮粉色的溶液搅拌15分钟，然后用15mL水稀释。将水性粗反应物接着用二氯甲烷提取(4x 10mL)。将有机提取物用MgSO4干燥。在去除溶剂之后，通过快速层析(硅胶)首先用100％二氯甲烷，然后用含1％甲醇的二氯甲烷洗涤纯化了粗制粉色产物，得到(4-(1，2，4，5-四嗪-3-基)苯基)甲+ +
醇(40mg，21％)，为亮粉色固体。LRMS-ESI[M+H]对于C9H9N4O计算值为189.08，观测值为
188.8。

[0129] 实施例5：2-(6-甲基-1，2，4，5-四嗪-3-基)乙醇

[0130] 下述实施例描述了合成2-(6-甲基-1，2，4，5-四嗪-3-基)乙醇的示例性方法。

[0131]

[0132] 向3-羟基丙酰亚胺酸乙酯盐酸盐(2mmol，307mg)和乙脒盐酸盐(10mmol，945mg)的混合物在氩气气氛下添加水合肼(2mL)。在室温搅拌2小时之后，用水(25mL)稀释该混合物并添加亚硝酸钠(25mmol，1.72g)。向该溶液在冰浴上逐滴添加2％HCl水溶液直至现为粉色的溶液达到pH为3。用二氯甲烷提取水溶液(5x 50mL)，用硫酸镁干燥，通过旋转蒸发去除溶剂，并在真空下干燥以获得产物2-(6-甲基-1，2，4，5-四嗪-3-基)乙醇(140mg，+ +37％)，为粉色油状物。LRMS-ESI[M+H]对于C5H9N4O计算值为141.08，观测值为140.7。

[0133] 实施例6：2-(1，2，4，5-四嗪-3-基)乙醇

[0134] 下述实施例描述了合成2-(-1，2，4，5-四嗪-3-基)乙醇的示例性方法。

[0135]

[0136] 向3-羟基丙酰亚胺酸乙酯盐酸盐(1mmol，153mg)和甲脒乙酸盐(5mmol，521mg)的混合物在氩气气氛下添加水合肼(1mL)。在室温搅拌2小时之后，用水(10mL)稀释该混合物，并添加亚硝酸钠(12.5mmol，0.86g)。向该溶液在冰浴上逐滴添加2％HCl水溶液直至现为粉色的溶液达到pH为3。用二氯甲烷提取该水溶液(5x 25mL)，用硫酸镁干燥，通过旋转蒸发去除溶剂，然后在真空下干燥以获得产物2-(1，2，4，5-四嗪-3-基)乙醇(28mg，+ +22％)，为粉色油状物。LRMS-ESI[M+H]对于C4H7N4O计算值为127.06，观测值为126.7。

[0137] 实施例7：5-(6-甲基-1，2，4，5-四嗪-3-基)戊烷-1-胺盐酸盐

[0138] 下述实施例描述了合成5-(6-甲基-1，2，4，5-四嗪-3-基)戊烷-1-胺盐酸盐的示例性方法。

[0139]

[0140] 向6-氨基己酰亚胺酸乙酯二盐酸盐(2mmol，462mg)和乙脒盐酸盐(10mmol，945mg)的混合物在氩气气氛下添加水合肼(2mL)。在室温搅拌2小时之后，用水(25mL)稀释该混合物并添加亚硝酸钠(25mmol，1.72g)。向该溶液在冰浴上逐滴添加2％HCl水溶液直至粉色溶液达到pH为3。然后通过在冰浴上逐滴添加10％NaOH水溶液将水溶液碱化至pH 12。用二氯甲烷提取碱性溶液(4x 25mL)，用硫酸镁干燥，并通过旋转蒸发去除溶剂。通过使用0至25％缓冲液B(缓冲液A为含0.1％TFA的水，而缓冲液B为含10％水和0.1％TFA的乙腈)的梯度的制备型HPLC得到该四嗪的三氟乙酸盐。然后将该物质加载于反相C18柱，用0.1％HCl水溶液洗涤，并用甲醇和0.1％HCl水溶液的1∶1混合物洗脱以获得纯的5-(6-甲基-1，2，4，5-四嗪-3-基)戊烷-1-胺盐酸盐(100mg，23％)，为粉色固体。
+ +
LRMS-ESI[M+H]对于C8H16N5计算值为182.14，观测值为182.0。

[0141] 实施例8：5-(1，2，4，5-四嗪-3-基)戊烷-1-胺盐酸盐

[0142] 下述实施例描述了合成5-(1，2，4，5-四嗪-3-基)戊烷-1-胺盐酸盐的示例性方[0143]

[0144] 向6-氨基己酰亚胺酸乙酯二盐酸盐(2mmol，462mg)和甲脒乙酸盐(10mmol，1.04g)的混合物在氩气气氛下添加水合肼(2mL)。在室温搅拌2小时之后，用水(25mL)稀释该混合物并添加亚硝酸钠(25mmol，1.72g)。向该溶液在冰浴上逐滴添加2％HCl水溶液直至粉色溶液达到pH为3。通过旋转蒸发去除溶剂，并用甲醇洗涤残余物(2x 25mL)。在过滤之后，将剩余固体溶解于水(25mL)并用固体Na2CO3饱和。用二氯甲烷提取该溶液(4x
25mL)。向该粉色有机溶液添加250uL TFA并通过旋转蒸发去除溶剂。通过使用100％缓冲液A(缓冲液A为含0.1％TFA的水)的等度的制备型HPLC得到该四嗪的三氟乙酸盐。然后将该物质加载于反相C18柱，用0.1％HCl水溶液洗涤，并用甲醇和0.1％HCl水溶液的
1∶1混合物洗脱以获得纯的5-(1，2，4，5-四嗪-3-基)戊烷-1-胺盐酸盐(55mg，13.5％)，+
为粉色固体。LRMS-ESI[M+H]对于C7H14N5+计算值为168.12，观测值为167.8。

[0145] 实施例9：2-(6-(吡啶-2-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)乙醇

[0146] 下述实施例描述了合成2-(6-(吡啶-2-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)乙醇的示例性方法。

[0147]

[0148] 向3-羟基丙酰亚胺酸乙酯盐酸盐(1mmol，153mg)和2-吡啶甲腈(5mmol，520mg)的混合物添加水合肼(1mL)。在90℃搅拌1小时之后，冷却混合物，用水(10mL)稀释，过滤，并向滤过物边搅拌边添加亚硝酸钠(10mmol，0.69g)。向该粉色溶液在冰浴上逐滴添加2％HCl水溶液直至溶液达到pH为3。通过旋转蒸发干燥溶液，用甲醇洗涤残余物(2x 10mL)，过滤，并通过旋转蒸发干燥滤过物。通过硅胶上的柱层析用含1.5％甲醇的二氯甲烷洗脱获得纯的2-(6-(吡啶-2-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)乙醇(44mg，22％)，为粉色固体。+ +
LRMS-ESI[M+H]对于C9H10N5O计算值为204.09，观测值为203.9。

[0149] 实施例10：2-(6-(嘧啶-2-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)乙醇

[0150] 下述实施例描述了合成2-(6-(嘧啶-2-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)乙醇的示例性方法。

[0151]

[0152] 向3-羟基丙酰亚胺酸乙酯盐酸(1mmol，153mg)和2-嘧啶甲腈(5mmol，525mg)的混合物添加水合肼(1mL)。在90℃搅拌1小时之后，冷却混合物，用水(10mL)稀释，过滤，并向滤过物边搅拌边添加亚硝酸钠(10mmol，0.69g)。向该粉色溶液在冰浴上逐滴添加2％HCl水溶液直至该溶液达到pH为3。通过旋转蒸发干燥溶液，用甲醇洗涤残余物(2x 10mL)，过滤，并通过旋转蒸发干燥滤过物。通过硅胶上的柱层析用含1.5％甲醇的二氯甲烷洗脱获得纯的2-(6-(嘧啶-2-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)乙醇(26mg，12.7％)，为粉色固体。+ +
LRMS-ESI[M+H]对于C8H9N6O计算值为205.08，观测值为204.9。

[0153] 实施例11：4-(1，2，4，5-四嗪-3-基)苯胺

[0154] 下述实施例描述了合成4-(1，2，4，5-四嗪-3-基)苯胺的示例性方法。

[0155]

[0156] 向4-氨基苯甲脒二盐酸盐(1mmol，208mg)和甲脒乙酸盐(4mmol，416mg)在乙腈中(25mL)的混合物添加无水肼(10mmol，315uL)。将该溶液加热回流1小时，冷却，并通过旋转蒸发去除溶剂。将残余物用水(25mL)重悬，并与固体四氯-1，4-苯醌(2mmol，492mg)一同搅拌1小时。在通过过滤从粉色溶液去除固体之后，将反应物通过旋转蒸发浓缩，并通过使用0-40％缓冲液B(缓冲液A为含0.1％TFA的水，而缓冲液B为含10％水和0.1％TFA的乙腈)的梯度的制备型HPLC纯化获得纯的4-(1，2，4，5-四嗪-3-基)苯胺(33mg，+ +19％)，为粉色固体。LRMS-ESI[M+H]对于C8H8N5计算值为174.08，观测值为173.9。

[0157] 实施例12：1，2，4，5-四嗪-3，6-二胺

[0158] 1，2，4，5-四嗪-3，6-二胺是根据JACS 1954，76，427中所述的方法制备的。

[0159]

[0160] 实施例 13：碳酸(E)- 环辛 -4-烯基 2，5-二氧代吡咯烷-1- 基酯((E)-cyclooct-4-enyl 2，5-dioxopyrrolidin-1-yl carbonate)的合成

[0161] 部分A.(E)-环辛-4-烯醇的合成。

[0162]

[0163] (E)-环辛-4-烯醇是从(Z)-环辛-4-烯醇使用之前报道的实验方案(Royzen，M.等J.Am.Chem.Soc.2008，130，3760-3761)的修饰方法来合成的。简言之，将1克环辛烯醇(2)和1.1g苯甲酸甲酯敏感剂(sentisizer)添加至500mL石英反应容器(Southern New England Ultraviolet Company)中的250mL溶剂(9∶1乙醚∶己烷)。未尝试对溶液进行脱气。将容器在Rayonet RPR-100UV反应器(Southern New England Ultraviolet Company)中在持续搅拌下用254nm光进行照射。以30分钟间隔，中止照射，并使整个溶液经过填充有浸渍了硝酸银(10％)的二氧化硅(可市购自Aldrich)的柱。然后将穿过的溶液转移回所述石英烧瓶中，并继续进行照射。在6小时后停止照射，并将二氧化硅添加至氢氧化铵溶液并搅拌5分钟，之后添加乙醚并继续另行搅拌5分钟。在搅拌之后倾去乙醚相，用水洗涤，用硫酸镁干燥，并蒸发获得反式环辛烯醇(40％)，如前所报道为异构体的混合物。将(多种)异构体通过柱层析(1∶1乙酸乙酯∶己烷)分离并通过质子NMR使用之前报道的质子NMR谱加以验证(Royzen，M.等J.Am.Chem.Soc.2008，130，3760-3761)。将主要异构体(更具极性的异构体)用于合成碳酸(E)-环辛-4-烯基2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯。

[0164] 部分B.碳酸(E)-环辛-4-烯基2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯的合成。

[0165]

[0166] 碳酸(E)-环辛-4-烯基2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯。将50mg的(E)-环辛-4-烯醇(主要异构体)和0.2mL三乙胺添加至3mL无水乙腈。向该溶液缓慢添加250mg碳酸N，N-二琥珀酰亚胺酯。将该反应混合物在室温搅拌直至薄层层析揭示反应完成(大约48小时)。通过旋转蒸发去除乙腈，并将剩余的残余物悬于乙脒，用0.1M HCl继以盐水洗涤，并用硫酸镁干燥。蒸发乙醚并通过柱层析(1∶1乙酸乙酯∶己烷)纯化所得的油状物，获得1
80mg(75％得率)的标题化合物。H NMR(400MHz CDCl3)：δ5.65-5.54(m，1H)，5.5-5.4(m，
1H)，4.5-4.4(m，1H)，2.88-2.78(s，4H)，2.45-2.3(m，2H)，2.2-1.5(m，8H)。

[0167] 实施例14：(E)-9-氧杂双环[6.1.0]壬-4-烯的合成

[0168] 下述实施例描述了合成(E)-9-氧杂双环[6.1.0]壬-4-烯的示例性方法。

[0169]

[0170] 向500mL石英反应容器中的9∶1乙醚/己烷溶液(250mL)添加(Z)-9-氧杂双环[6.1.0]壬-4-烯(1.0g)和苯甲酸甲酯(1.1g)敏感剂。未尝试对溶液进行脱气。将容器在Rayonet RPR-100UV反应器(Southern New England Ultraviolet Company)中在持续搅拌下用254nm光进行照射。以30分钟间隔，中止照射，并使整个溶液经过填充有浸渍了硝酸银(10％)的二氧化硅的柱。然后将穿过的溶液转移回所述石英烧瓶中，并继续进行照射。在6小时后停止照射，并将二氧化硅添加至氢氧化铵溶液并搅拌5分钟，之后添加乙醚并继续另行搅拌5分钟。在搅拌之后倾去乙醚相，用水洗涤，用硫酸镁干燥，并蒸发获得1
(E)-9-氧杂双环[6.1.0]壬-4-烯(0.4g，40％得率)。HNMR(400MHz CDCl3)：δ5.8-5.7(m，
1H)，5.4-5.2(m，1H)，2.9-2.7(m，2H)2.5-2.0(m，8H)。

[0171] 实施例15：产荧光的四嗪-荧光团环加成反应

[0172] 缀合于带高电荷的基于羰花青的近IR发射荧光团的四嗪可用于胞外标记。为了探索该方法对胞内标记的有用性，将苄基氨基四嗪缀合于发射可见光的硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)染料的琥珀酰亚胺酯。BODIPY染料不带电荷并具有亲脂性，由于这些原因其被用于胞内应用(Cole等，2000，J Microsc，197，239-49；Farinas和Verkman，1999，J Biol Chem，274，7603-6；Miller等，2006，Nat Protoc，1，824-7；Takahashi等，2002，Diabetes，51Suppl 1，S25-8；Viht等，2003，Bioorg Med Chem Lett，13，3035-9)。令人意想不到地，四嗪BODIPY缀合物与母体琥珀酰亚胺酯相比强烈地减少了荧光。在与具张力的亲二烯体如反式环辛烯醇或降冰片烯反应之后，该荧光重新“打开”(本文中称作“产荧光激活”的过程)。

[0173] 为了探索该方法用于其他染料的普遍性，将苄基氨基四嗪与可市购的7-N、N-二 乙 基 氨 基 香 豆 素、BODIPY FL、BODIPY TMR-X、Oregon Green 488和 BODIPY650-665(Invitrogen，对于这些四嗪产品的结构，参见图4)的琥珀酰亚胺酯反应。图4显示了与环辛烯醇环加成之前和之后染料-四嗪缀合物的发射谱。如图3所示，四嗪BODIPY FL(1)与环辛烯醇(2)通过反电子需求Diels-Alder环加成快速反应形成异构性二氢吡嗪产物(3)。收集了多种四嗪探针的发射谱(黑线)及相应的二氢吡嗪产物的发射谱(蓝色虚线)(图4)。嵌入图比较了手提UV灯激发下四嗪探针(左侧小杯)与其相应的二氢吡嗪产物(右侧小杯)的可见的荧光发射。图5列出了染料在反应之前和之后的光物理性质。
所有的测量是在PBS中和pH 7.4(四嗪-荧光团浓度为1μM)进行的。应注意，在添加反式环辛烯醇(10μM)之后荧光团吸收谱并无显著变化。用荧光素(水中，pH 10)和罗丹明
6G(EtOH中)作为标样以三次重复获得了量子产率的测量结果。四嗪对荧光团的淬灭具有波长依赖性。发射绿色和红色的四嗪染料在环加成之后显示荧光增强。

[0174] 对于所有在可见光谱(400-600nm)发射的染料，与四嗪的缀合导致荧光淬灭，其在与亲二烯体反应之后恢复。这种淬灭可为从经激发的荧光团至缺电子的四嗪受体的光诱导电子转移(PET)的结果。周知四嗪为缺电子类型的杂环，因此其在反电子需求环加成中是有用的。这种PET淬灭使人想起周知的用缺电子硝化化合物淬灭荧光团(Goodpaster和McGuffin，2001，Anal Chem，73，2004-11；Kim等，2004，JAm ChemSoc，126，452-3)。特别应注意这些产荧光化合物可从商业上可获得的母核形成，且四嗪似为足够强的淬灭剂，使其无需直接(intimate)连接于所述荧光团，并甚至当由脂族间隔物分开时仍可实现淬灭作用。

[0175] 实施例16：跟踪并成像小分子

[0176] 反式环辛烯紫杉醇类似物的合成

[0177] 尽管产荧光探针的使用可具有多种应用，一种可立即受益于产荧光探针的用途为检测活细胞内的小分子。为了测试我们的产荧光四嗪是否会与成像胞内分子靶标相关，我们选择了亲二烯体修饰的紫杉醇 作为测试系统。选择 是因为其重大的临床影响，作为参考的庞大在先研究，以及因为其得到充分研究的稳定微管的能力，提供了限定明确的胞内结构以供成像(Evangelio等，1998，Cell Motil Cytoskeleton，39，73-90；
Guy等，1996，Chem Biol，3，1021-31；Manfredi等，1982，J Cell Biol，94，688-96；Nicolaou等，1994，Angew.Chem.Int.Ed.，33，15-44；Rowinsky 等，1990，J.Natl.Cancer Inst.，82，
1247-1259；Souto等，1995，Angew.Chem.Int.Ed.，34，2710-2712)。反式环辛烯紫杉醇衍生物(图6a)是通过将碳酸反式环辛烯琥珀酰亚胺酯与7-β-丙氨酰紫杉醇通过经报道的方法偶联来合成的(Guy等，1996，Chem Biol，3，1021-31)。将亲二烯体引入C7位置，因为在先的结构活性关系研究指出，C7位处的修饰并不显著地影响紫杉醇的生物活性(Chen等，1994，Bioorg.Med.Chem.Lett.，4，2223-2228；Guy 等，1996，Chem Biol，3，1021-31；
Mellado等，1984，Biochem Biophys Res Commun，124，329-36；Souto等，1995，Angew.Chem.Int.Ed.，34，2710-2712)。

[0178] 简言之，将7-β-丙氨酰紫杉醇溶解于无水乙腈，并在室温与碳酸(E)-环辛-4-烯基2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯反应过夜。在反应之后，通过旋转蒸发去除乙腈，1
并通过柱层析分离产物(17mg)。HNMR(400MHz CDCl3)：δ8.14-8.06(d，2H)，7.8-7.7(d，
2H)，7.66-7.56(t，1H)，7.54-7.3(m，10H)7.1-7.0(d，1H)，6.3-6.1(m，2H)，5.85-5.75(d，
1H)，5.7-5.6(d，1H)，5.6-5.4(m，3H)，5-4.85(d，1H)，4.85-4.75(m，1H)，4.4-4.25(m，2H)，
4.25-4.1(d 1H)，3.95-3.85(d，1H)，3.65-3.55(d，1H)，1-3(m 38H)。LRMS-ESI[M+H]+计算值为1077.5，观测值为1077.7；[M+Na]+计算值为1099.4，观测值为1099.6。

[0179] 所述反式环辛烯紫杉醇快速与我们的四嗪探针反应形成异构的二氢吡嗪产物，其可通过常规手段如LC-MS检测。

[0180] 在微管蛋白聚合测定中测试反式环辛烯紫杉醇类似物

[0181] 为了测试反式环辛烯紫杉醇类似物的活性，我们测试了 周知的在缺乏GTP情况下聚合微管蛋白的能力(Shelanski等，1973，Proc Natl Acad Sci U S A，70，765-8；Schiff和Horwitz，1981，Biochemistry，20，3247-52)。在将微管蛋白单体暴露于反式环辛烯紫杉醇和DMSO对照之后，使用在350nm的吸光度测量(图6B)以确定微管蛋白聚合的程度。天然 和反式环辛烯紫杉醇与DMSO对照相比均诱导聚合。经紫杉醇反式环辛烯诱导的微管束可通过之后用四嗪荧光团探针如四嗪BODIPY FL的染色来显影，得到可通过荧光显微术成像的具有亮荧光的微管结构(图6c)。

[0182] 在PtK2大鼠肾细胞中测试反式环辛烯紫杉醇类似物

[0183] 对于活细胞研究，将PtK2大鼠肾细胞在含有1μM反式环辛烯紫杉醇的细胞培养基中在37℃温育1小时。在用培养基洗涤三次之后，将细胞在室温暴露于含有1μM四嗪-BODIPY FL的培养基20分钟。然后洗涤细胞，并将其在共焦显微镜上成像。在用1μM反式环辛烯紫杉醇继以1μM四嗪-BODIPYFL处理之后，对PTK2大鼠袋鼠(kangaroo)细胞的共焦显微术显示微管结构被清晰地染色。在仅用1μM反式环辛烯-紫杉醇继以1μM四嗪-VT680的处理之后对PTK2细胞的共焦显微术显示反映微管网络的胞内结构。已知 结合细胞的微管网络，且有几篇关于可用于成像微管网络的荧光性紫杉醇衍生物的报道(Evangelio等，1998，Cell Motil Cytoskeleton，39，73-90；Guy等，1996，ChemBiol，3，1021-31；Souto等，1995，Angew.Chem.Int.Ed.，34，2710-2712)。除了微管结构之外，核周区域也被染色。这种染色是由于胞内膜如内质网和高尔基体对紫杉醇类似物的非特异性摄取。仅使用四嗪-BODIPY FL或与未经修饰的紫杉醇一起的对照实验获得了最小限的荧光背景，并说明几乎没有非特异性或背景性开启，而图像是来自特异性四嗪反式环辛烯反应。此外，经反式环辛烯继以高度带电荷的非膜渗透性四嗪探针如磺酸化的Vivo-Tag 680四嗪处理的细胞显示极少染色，以及微管结构的缺乏，给出了四嗪-BODIPY FL能够穿透细胞膜并标记位于细胞之内的反式环辛烯的进一步证据(Devaraj等，2009，Angew ChemIht Ed Engl，48，7013-6；Devaraj等，2008，Bioconjug Chem，19，2297-9)。

[0184] 实施例17：其他与降冰片烯(乙酸(1S，2S，4S)-双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基酯)类似的可生物缀合的反式环辛烯衍生物的合成

[0185] 环氧化物如反式环辛烯产物中的环氧化物可与亲核体如胺和硫醇反应，并用于将反式环辛烯附于其他生物分子。

[0186]

[0187] 通过标准步骤，可将烷基-硫醇(3-巯基丙酸、2-(4-巯基苯基)乙酸等)或其他含有其他官能团的亲核体如羧酸(但不限于此)通过亲核攻击偶联于(E)-9-氧杂双环[6.1.0]壬-4-烯，并随后通过(E)-9-氧杂双环[6.1.0]壬-4-烯的环氧官能团的开环以得到相应的经羧酸官能化的反式环辛烯，其中羧酸官能团通过化学稳定的硫醚键连接于所述环辛烯。这些合成方法使用标准方法以生成羧酸(或其他官能基团)通过化学稳定的接头连接于反式辛烯的新化合物。该路线亦在反式辛烯上生成了第二个醇(OH基团)，其可通过使得化合物更具极性而帮助促进水溶性。

[0188] 例如，(E)-2-(4-(8-羟基环辛-4-烯基硫代)苯基)乙酸(如上述实验方案中下面的反应途径所示)是通过将2-(4-巯基苯基)乙酸(21.0mg，0.125mmol)与(E)-9-氧杂双环[6.1.0]壬-4-烯(15.5mg，0.125mmol)在乙腈(100μL)和水(200μL)的混合物中用20mol％ZnCl2作为催化剂进行反应来制备的。在搅拌该两相混合物1小时之后，通过在+真空下去除溶剂来分离产物。LRMS-ESI[M+H]+对于C16H21O3S计算值为293.12，观测值为
293.1。

[0189] 实施例18：氨基醇的制备

[0190]

[0191] 该亲核攻击适用于通过对(E)-9-氧杂双环[6.1.0]壬-4-烯的环氧化物用氨(或伯胺和仲胺)进行亲核攻击来制备经胺修饰的反式环辛烯。

[0192] 实施例19：蛋白质标记

[0193] 将蛋白质如辣根过氧化物酶(HRP)(但不限于此)用亲二烯体或四嗪偶联组分的琥珀酰亚胺酯标记。将水性缓冲液中的HRP用5-(4-(1，2，4，5-四嗪-3-基)苄基氨基)-5-氧代戊酸的琥珀酰亚胺酯(通过用碳酸二琥珀酰亚胺酯在吡啶存在下处理5-(4-(1，2，4，5-四嗪-3-基)苄基氨基)-5-氧代戊酸来制备)处理以形成经四嗪修饰的HRP(HRP-四嗪)。

[0194] 实施例20：抗体标记

[0195] 将抗体如曲妥单抗(但不限于此)用亲二烯体或四嗪偶联组分的琥珀酰亚胺酯标记。将水性缓冲液中的曲妥单抗用30摩尔过量的(乙酸(1S，2S，4S)-双环
[2.2.1]庚-5-烯-2-基酯)的琥珀酰亚胺酯(通过将(乙酸(1S，2S，4S)-双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基酯)在乙腈中用1.1当量的碳酸二琥珀酰亚胺酯和1当量的吡啶处理来制备)处理以性成经(乙酸(1S，2S，4S)-双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基酯)修饰的曲妥单抗(mAb-降冰片烯)。

[0196] 实施例21：使用抗-EGFR抗体的预靶向方法

[0197] 将抗-EGFR抗体(西妥昔单抗)用反式环辛烯碳酸琥珀酰亚胺酯标记，并用于下述的预靶向实验。

[0198] 用反式环辛烯标记抗体

[0199] 购买西妥昔单抗(ImClone 2mg/mL)，并将其与缓冲为pH 8.5的0.1MNaHCO3进行溶剂交换至终浓度为7mg/mL。向200uL的该储液添加10uL的DMF。将碳酸(E)-环辛-4-烯基2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯溶于无水DMF以制备40mM的储液。对于缀合，将DMF中适当过量的胺反应性反式环辛烯等分至抗体溶液，涡旋振荡，并在4℃反应过夜。在报道的实验中，1、3、5和6的最终反式环辛烯加载对应于使用相对于抗体2、10、30和100当量的碳酸琥珀酰亚胺酯。在过夜反应之后，抗体通过使用5％DMSO PBS离心过滤来纯化，浓缩至2mg/mL并在4℃储藏于PBS中。

[0200] 用荧光琥珀酰亚胺酯进行的抗体标记

[0201] 将抗体(1mg/mL)在0.1M NaHCO3(pH 8.5)中的溶液与2当量荧光性琥珀酰亚胺酯(VT680、AF555或Dylight 488)温育2小时。在温育之后，通过离心过滤使用30000道尔顿分子量截取值过滤器(Amicon)离心过滤来纯化，并储藏于PBS中。每个抗体的荧光染料数是通过分光光度法分析来确定的，并确定为对于所有使用的染料琥珀酰亚胺酯为每个抗体大约1个。

[0202] 动力学测量

[0203] 通过将表面浸于0.1mg/mL抗体在PBS中的溶液3小时将经反式环辛烯修饰的抗体物理吸收于聚苯乙烯。在用PBS洗涤多次之后，将表面在37℃暴露于PBS中的750nM四嗪VT680。在5分钟之后，去除四嗪溶液，并将表面用PBS洗涤3次。在荧光平板读数器(Tecan Safire 2)上测量由于VT680染料产生的荧光，并针对背景荧光进行修正。再次将表面暴露于四嗪溶液，并在10、15、30和60分钟重复整个方法。将荧光测量值针对时间作图，拟合至一级指数生长曲线，并确定假一级速率常数。使用两种不同浓度的四嗪(375nM和1000nM)重复整个实验，并将来自所有三个实验的假一级速率常数针对浓度作图，拟合至直线；该线-1 -1的斜率为6000±200M sec ，并将其报道为四嗪VT680和结合于抗体的反式环辛烯之间的反应的二级速率常数。

[0204] 细胞培养

[0205] 由于其中等水平的EGFR过表达，对于所有实验选择人肺腺癌上皮细胞系A549。将该细胞系维持在补充了10％胎牛血清和5％青霉素/链霉素的标准ATCC配制的F-12K培养基中。为了便于显微术和对胞内形态进行显像，使用第三代慢病毒载体系统进行了细胞系的EGFP标记。对293T细胞使用Lipofectamine 2000在亚汇集(subconfluent)的10-cm皿中用已克隆入EGFP的载体pCCLsin.PPT.hPGK(10ug)，以及pMDLg/p包装(7ug)和VSV-G被膜编码pMD.G(5ug)质粒进行转染。这些质粒是从MGH Center for Cancer Research的Rafaella Sordella和San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy的Luigi Naldini获得的。在48小时之后收集病毒上清，用0.45微米注射过滤器过滤，并储藏在-80℃。将A549细胞系在24孔板的亚汇集孔中在含10％胎牛血清的1mL F-12K培养基中使用300uL病毒进行感染。该实验方案得到了超过80％的感染率(通过使用荧光显微术的肉眼评价确定)。使用经修饰的5-激光Becton-Dickinson FACSDiVa用标准技术去除EGFP阴性细胞。

[0206] 共焦显微术

[0207] 使细胞在可分离(break away)的玻璃腔室玻片(chamber slide)上生长，并在施用任一成像剂之后洗涤六次。使用多通道直立式激光扫描共焦显微镜(FV1000；Olympus)以60X水浸物镜来成像活细胞。图像收集和用激光在488nm(EGFP)、543nm(AF555)和633nm(VT680)的荧光团激发是成系列进行的以免通道之间的相互影响。数据是用Fluoview软件(版本4.3；Olympus)获得的，并将图像层叠(image stack)用ImageJ软件(版本1.41，Bethesda MD)进行加工和分析。

[0208] 抗体用AF555的直接标记是在红色通道监视的。抗体在细胞表面和由于EGFR内化而在细胞之内均为清晰可见的(Vincenzi等，Rev.Oncol.Hematol.68：93-106(2008)；Patel等，Anticancer Res.27：3355-3366(2007)。共价结合的四嗪-VT680可清楚地在近红外(NIR)通道显影。红色与近红外通道的合并揭示了AF555和VT680信号优异的共定位(colocalization)，而几乎没有背景荧光。这个结果表明四嗪的反应是极具选择性的。如预期，该反应主要发生在EGFR浓度最高的细胞表面。亦观察到较少量的细胞内化的，囊泡相关的NIR荧光。该荧光可能是用四嗪-VT680处理之后EGFR内化的结果(Vincenzi等，见上，2008，和Patelt等，见上，2007)。用未标记的西妥昔单抗和四嗪-VT680或者反式环辛烯-西妥昔单抗和未标记的VT680的对照实验未得到NIR荧光。

[0209] 接着，观察了无去除探针的洗涤步骤的标记。避免此种步骤的需要与无法进行严格和多重洗涤步骤的应用相关，如胞内标记、其中必须最小限度处理细胞的实验(使用罕见细胞或高度特化的细胞)和体内标记。将四嗪-VT680标记的浓度降至50nm以使得能够实时观察共价修饰。图像是在对四嗪-VT680与在100％FBS中的生活癌细胞上经预靶向的反式环辛烯的环加成的连续成像过程中取得的。当四嗪-VT680在细胞表面上反应并浓缩时，其首次变得可见；在此之后，随着四嗪标记的西妥昔单抗的内化，可在细胞内看见散点(punctuate spot)。

[0210] 在改善信号背景比(signal-to-background)的尝试中，增加了反应性反式环辛烯在靶向的抗体上的加载密度。每个抗体更多数量的反应位点会导致标记之后每个抗体更多的荧光团，因此导致信号扩增。为了使反式环辛烯加载有变化，我们将西妥昔单抗暴露于不同摩尔过量的胺反应性反式环辛烯。用四嗪-VT680修饰该缀合物，并将所得的荧光染料吸光度用于估计每个抗体的反应性反式环辛烯单元数。以此方式，制备了携带一个、三个、五个和六个四嗪-VT680反应性反式环辛烯模块的西妥昔单抗。由于靛青染料较大的大小，对于更高的加载，反应性反式环辛烯模块数可能低于抗体上反式环辛烯模块的实际数。这些反式环辛烯-西妥昔单抗缀合物以优异的稳定性结合于表达EGFR的A549细胞。

[0211] 流式细胞术

[0212] 为了说明该扩增对活细胞成像的实际效果，使用流式细胞术来获取对用四嗪进行荧光标记的活细胞更定量的理解。将汇集的A549细胞使用0.05％胰蛋白酶/0.53mM EDTA5
悬浮，通过离心用含有2％FBS的PBS(PBS+)洗涤，并将2.5x10个细胞添加至微量离心管。然后以100uL PBS+中的10ug/ml浓度添加具有下述修饰的西妥昔单抗抗体：无(对照)、每个抗体1个反式环辛烯、每个抗体3个反式环辛烯、每个抗体5个反式环辛烯、每个抗体6个反式环辛烯。环加成是用四嗪-VT680(500nm)在37℃在100％FBS中进行的。在室温温育15或30分钟之后，用PBS+洗涤样品。对于稳定性研究，用Dylight 488荧光团(Pierce，每个抗体约1个)标记反式环辛烯抗体，并将细胞重悬于100uLPBS+并在37℃温育15、30或60分钟，然后添加1ml PBS+并通过离心洗涤2次。对于点击研究，将经标记的细胞重悬于含有500nM四嗪-VT680的100uL FBS中，并在37℃温育30分钟，然后添加1ml PBS+并通过离心洗涤2次。VT680和DyeLight-488荧光是使用LSRII流式细胞器(Becton Dickinson)评价的，并使用FlowJo软件分析。

[0213] 可方便地显像用具有高反式环辛烯加载的反式环辛烯缀合西妥昔单抗构建体预靶向的细胞，且其信号随着抗体上亲二烯体的量的减少而减弱。通过在抗体上加载增加量的小分子以扩增信号的能力提供了用于为体内预靶向方案增加信号背景比的策略。

[0214] 因此，这提供了高度敏感的技术以供以四嗪对具高张力的反式环辛烯的环加成为基础共价标记活的癌细胞。

[0215] 实施例22：使用抗HER2/neu抗体的预靶向方法

[0216] 为了说明四嗪-亲二烯体反应用于活细胞标记的用途，使用经FDA批准的单克隆抗体曲妥单抗(Herceptin)，其结合于Her2/neu生长因子受体(Lewis等，Cancer Immunol.Immun.37，255-263(1993))。使用标准偶联条件用降冰片烯和四甲基罗丹明同时标记曲妥单抗。

[0217] 一般材料和方法

[0218] 除非指明，所有化学品购自Sigma Aldrich，并以收到时的原样使用。降冰片烯，乙酸(1S，2S，4S)-双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基酯购自ChemBridge。所有溶剂为试剂级或更高，并不经进一步纯化而使用。分析性HPLC和LC/MS是在配置有2996二极管阵列检测器、Micromass ZQ4000ESI-MS模块和流速为0.3mL/分钟的Grace-Vydac RPC18柱(218TP5210型)的Waters 2695HPLC上进行的。制备型HPLC是在配置有335型二极管阵列检测器、701型分级收集器和流速为21mL/分钟的Varian RPC18柱(A6002250X212型)的Varian ProStar 210型仪器上进行的。对于所有HPLC运行，溶剂A由含0.1％TFA的水组成，而溶剂B由含10％水和0.1％TFA的乙腈组成。所有的UV/可见光光谱和动力学实验记录于Agilent 8453二极管阵列UV/可见光分光光度计。根据所有动力学实验的假一级速率常数使用Agilent UV/可见光Chemstation软件包Rev.A.10.01计算。荧光测量是使用Varian
1 13
Cary Eclipse荧光分光光度计获得的。H(400MHz)和 C NMR(100MHz)光谱是在Bruker Advance-400NMR分光计上在环境温度在D2O中用3-(三甲基硅烷基)-2，2，3，3-D4-丙酸钠盐(TSP)作为内标来收集的。高分辨率电喷射离子化(ESI)质谱是在Bruker Daltonics APEXIV 4.7Tesla傅里叶变换质谱仪(FT-ICR-MS)上获得的。

[0219] 抗体标记

[0220] 将降冰片烯羧酸(乙酸(1S，2S，4S)-双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基酯)与1.1当量的碳酸二琥珀酰亚胺酯在乙腈中使用1当量的吡啶作为碱搅拌3小时。在反应之后，通过旋转蒸发去除溶剂和碱，并回收带有N-羟基琥珀酰亚胺副产物的粗制降冰片烯琥珀酰亚胺酯。将0.1M碳酸氢钠缓冲液(pH 8.2)中的市购的人源化抗-HER2/neu抗体曲妥单抗(Genentech，San Francisco，CA)在室温与5摩尔过量的5-(和6-)羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯(Invitrogen)和30摩尔过量的粗制降冰片烯琥珀酰亚胺酯温育3小时。然后分离抗体，并通过离心纯化洗涤，并储藏于PBS缓冲液中。以相同方式修饰对照抗体，但是排除降冰片烯NHS。

[0221] 细胞标记和成像

[0222] 将SKBR-3人乳腺癌细胞系维持于完全McCoy培养基中。将细胞在37℃用200nM修饰的曲妥单抗温育30分钟，然后在Hanks平衡盐溶液(HBSS)中用10％胎牛血清洗涤两次。四嗪标记是通过将细胞在37℃在含有50μM四嗪-VT680的10％FBS/HBSS中温育30分钟来进行的。然后将细胞用10％FBS/HBSS洗涤两次并通过荧光显微术成像。

[0223] 在洗涤之后，将细胞使用罗丹明和NIR荧光通道成像。观察到共定位的显著标记。用含有罗丹明但非降冰片烯的对照抗体温育的细胞在暴露于3之后未显示NIR标记。这些实验说明在活细胞和血清存在下四嗪成像剂对经降冰片烯修饰的抗体的特异性。即使是使用微摩尔浓度的标记剂，更重要的是，即使在血清的存在下，该反应也是快速的。这些发现明显表明该化学作用适用于体外实验，并对于多种样式下的体内成像也是有用的策略。

[0224] 实施例23：纳米颗粒标记

[0225] 将含有氨基官能团的纳米颗粒用亲二烯体或四嗪偶联组分的琥珀酰亚胺酯标记。将经胺修饰的交联的氧化铁(CLIO-NH2)纳米颗粒用亲二烯体组分的琥珀酰亚胺酯来官能化，即在水性缓冲液中用(乙酸(1S，2S，4S)-双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基酯)的琥珀酰亚胺酯来处理CLIO-NH2，然后通过离心过滤或大小排阻层析来纯化。

[0226] 实施例24：免疫组织化学(IHC)染色

[0227] 本文中所述的组合物可用于免疫组织化学方法。

[0228] 实施例A：

[0229] 用水中的0.3％H2O2处理组织切片30分钟以淬灭内源过氧化物酶活性。用PBS洗涤切片5分钟，去除缓冲液，并另行重复洗涤2次。然后将组织切片在PBS缓冲液中与未标记的一抗温育30分钟。未结合的和非特异性结合的抗体通过用PBS洗涤3次每次5分钟来去除。在洗涤之后，将组织切片在PBS中与4％阻断血清温育30分钟，所用的血清来自二抗所制备自的物种。倾出稀释的血清溶液，并将组织切片用PBS洗涤3次，每次5分钟。然后将组织切片与经亲二烯体修饰的二抗(mAb-降冰片烯)(通过与上述用曲妥单抗作为抗体的方法类似的方法制备)一起温育。在用PBS洗涤3次，每次5分钟之后，将组织切片在PBS缓冲液中与HRP-四嗪(如上述实施例中所述制备)温育30分钟以将二抗通过反电子需求Diels-Alder偶联反应缀合于HRP-四嗪。然后将组织切片洗涤3次，每次5分钟以去除未缀合的HRP-四嗪。将组织切片用稀释的H2O2(通常0.5至10μM)和适当的产色过氧化物酶底物如二氨基联苯胺(DAB)或3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)(但不限于此)来温育，直至获得所需的染色强度。该方法止于用水洗涤并封固组织切片。

[0230] 实施例B：

[0231] 用水中的0.3％H2O2处理该组织切片30分钟以淬灭内源过氧化物酶活性。用PBS洗涤切片5分钟，去除缓冲液，并另行重复洗涤2次。然后将组织切片在PBS缓冲液中与经降冰片烯或反式环辛烯标记的一抗(如上述实施例中所述制备)温育30分钟。未结合的和非特异性结合的抗体通过用PBS洗涤3次每次5分钟来去除。在洗涤之后，将组织切片在PBS缓冲液中与HRP-四嗪(如上述实施例中所述制备)温育30分钟以将一抗通过反电子需求Diels-Alder偶联反应缀合于HRP-四嗪。然后将组织切片洗涤3次，每次5分钟以去除未缀合的HRP-四嗪。将组织切片与稀释的H2O2(通常0.5至10μM)和适当的产色过氧化物酶底物如二氨基联苯胺(DAB)或3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)(但不限于此)温育，直至获得所需的染色强度。该方法止于用水洗涤并封固组织切片。

[0232] 实施例25：免疫荧光染色

[0233] 本文中所述的组合物可用于免疫荧光染色方法。

[0234] 实施例A：

[0235] 将组织切片首先在PBS缓冲液中用经降冰片烯或反式环辛烯标记的一抗(如上述实施例中所述制备)温育30分钟。未结合的和非特异性结合的抗体通过用PBS洗涤3次每次5分钟来去除。在洗涤之后，将组织切片在PBS中用四嗪-荧光团缀合物(如四嗪-VT680(如之前实施例中所述制备)，但不限于此)温育30分钟以将荧光团共价偶联于一抗。然后将组织切片洗涤3次每次5分钟以去除未缀合的四嗪-VT680。该方法止于用水洗涤并封固组织切片。

[0236] 实施例B：

[0237] 将组织切片首先在PBS中与未标记的一抗温育30分钟。未结合的和非特异性结合的抗体通过用PBS洗涤3次每次5分钟来去除。在洗涤之后，将组织切片在PBS中用4％阻断血清温育30分钟，所用的血清来自二抗所制备自的物种。倾出稀释的血清溶液，并将组织切片用PBS洗涤3次，每次5分钟。然后将组织切片与经亲二烯体修饰的二抗(mAb-降冰片烯)(通过与上述用曲妥单抗作为抗体的方法类似的方法制备)温育30分钟。在用PBS洗涤3次，每次5分钟之后，将组织切片用PBS缓冲液中的四嗪-荧光团缀合物(如四嗪-VT680(如之前实施例中所述制备)，但不限于此)温育30分钟以将荧光团共价偶合于一抗。然后将组织切片洗涤3次每次5分钟以去除未缀合的四嗪-VT680。该方法止于用水洗涤并封固组织切片。

[0238] 实施例C：

[0239] 将经降冰片烯或反式环辛烯标记的一抗(如上述实施例中所述制备)在PBS缓冲液中与四嗪-荧光团缀合物(如四嗪-VT680(如之前实施例中所述制备)，但不限于此)温育30分钟以将荧光团共价偶合于一抗。若需要，可通过离心过滤来纯化该溶液。否则，将粗制的经荧光标记的一抗溶液与组织切片在PBS中温育30分钟。在温育之后，通过用PBS洗涤3次每次5分钟来去除未结合的、非特异性结合的抗体，和任何剩余的四嗪-荧光团。

[0240] 实施例26：酪胺(tyramide)信号扩增(TSA)免疫荧光

[0241] 本文中所述的组合物可用于TSA免疫荧光方法。

[0242] 实施例A：

[0243] 用水中的0.3％H2O2处理组织切片30分钟以淬灭内源过氧化物酶活性。用PBS洗涤切片5分钟，去除缓冲液，并另行重复洗涤2次。然后将组织切片在PBS缓冲液中与未标记的一抗温育30分钟。未结合的和非特异性结合的抗体通过用PBS洗涤3次每次5分钟来去除。在洗涤之后，将组织切片在PBS中与4％阻断血清温育30分钟，所用的血清来自二抗所制备自的物种。倾出稀释的血清溶液，并将组织切片用PBS洗涤3次，每次5分钟。然后将组织切片与经亲二烯体修饰的二抗(mAb-降冰片烯)(通过与上述用曲妥单抗作为抗体的方法类似的方法制备)温育。在用PBS洗涤3次每次5分钟之后，将组织切片在PBS缓冲液中与HRP-四嗪(如上述实施例中所述制备)温育30分钟以将二抗通过反电子需求Diels-Alder偶联反应缀合于HRP-四嗪。然后将组织切片洗涤3次每次5分钟以去除未缀合的HRP-四嗪。将组织切片用稀释的H2O2(通常0.5至10μM)和适当的酪胺缀合荧光团底物如荧光素酪胺、四甲基罗丹明酪胺或Cy5酪胺(但不限于此)来温育。在温育所需时间之后，该方法止于通过用水或PBS洗涤3次每次5分钟来去除任何过量的荧光团-酪胺，并封固组织切片。

[0244] 该方法还用于电子显微术，其中用金纳米颗粒-酪胺缀合物替代荧光团-酪胺组分。

[0245] 实施例B：

[0246] 用水中的0.3％H2O2处理组织切片30分钟以淬灭内源过氧化物酶活性。用PBS洗涤切片5分钟，去除缓冲液，并另行重复洗涤2次。然后将组织切片在PBS缓冲液中与经降冰片烯或反式环辛烯标记的一抗(如上述实施例中所述制备)温育30分钟。将未结合的和非特异性结合的抗体通过用PBS洗涤3次每次5分钟来去除。在洗涤之后，将组织切片在PBS中与HRP-四嗪(如上述实施例中所述制备)温育30分钟以将一抗通过反电子需求Diels-Alder偶联反应缀合于HRP-四嗪。然后将组织切片洗涤3次每次5分钟以去除未缀合的HRP-四嗪。将组织切片用稀释的H2O2(通常0.5至10μM)和适当的酪胺缀合荧光团底物如荧光素酪胺、四甲基罗丹明酪胺或Cy5酪胺(但不限于此)来温育。在温育所需时间之后，该方法止于通过用水或PBS洗涤3次每次5分钟来去除任何过量的荧光团-酪胺，并封固组织切片。

[0247] 该方法还可用于电子显微术，其中用金纳米颗粒-酪胺缀合物替代荧光团-酪胺组分。

[0248] 实施例C：

[0249] 用水中的0.3％H2O2处理组织切片30分钟以淬灭内源过氧化物酶活性。用PBS洗涤切片5分钟，去除缓冲液，并另行重复洗涤2次。然后将组织切片在PBS中与未标记的一抗温育30分钟。未结合的和非特异性结合的抗体通过用PBS洗涤3次每次5分钟来去除。在洗涤之后，将组织切片在PBS中用4％阻断血清温育30分钟，所用的血清来自二抗所制备自的物种。倾出稀释的血清溶液，并将组织切片用PBS洗涤3次，每次5分钟。然后将组织切片用经HRP修饰的二抗温育30分钟。然后将组织切片洗涤3次，每次5分钟以去除未结合的和非特异性结合的HRP二抗。将组织切片用稀释的H2O2(通常0.5至10μM)和四嗪-酪胺或亲二烯体-酪胺构建体(通过将适当的N-羟基琥珀酰亚胺酯修饰的四嗪或亲二烯体与酪胺偶联来制备)如5-(4-(1，2，4，5-四嗪-3-基)苄基氨基)-5-氧代戊酸-酪胺来温育。这导致四嗪官能团通过酪胺与组织切片中的表面蛋白进行交联而在组织切片上紧邻着HRP抗体构建体沉积。然后用荧光团-亲二烯体缀合物(通过将(乙酸(1S，2S，4S)-双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基酯的N-羟基琥珀酰亚胺酯)或任何反式环辛烯类似物与所需的经胺修饰的荧光团如荧光素、四甲基罗丹明或Cy5(但不限于此)反应来制备)来处理组织切片。在温育所需时间之后，该方法止于通过用水或PBS洗涤3次每次5分钟来去除任何过量的荧光团-亲二烯体，并封固组织切片。

[0250] 该方法还用于电子显微术，其中用金纳米颗粒-酪胺缀合物替代荧光团-酪胺组分。

[0251] 实施例27：Western印迹

[0252] 实施例A：

[0253] 简言之，在将蛋白质样品在SDS-PAGE凝胶上运行然后将蛋白质通过标准方法转移至膜之后，将膜用阻断缓冲液温育30分钟。然后将适当稀释的之前经反式环辛烯修饰的一抗(如实施例20中所述制备)添加至溶液，该一抗能够结合于膜上的它的特异性蛋白。在该溶液中温育膜直至获得充分水平的抗体结合。在用PBS或水洗涤膜三次去除未结合的抗体之后，将四嗪-荧光团缀合物(如实施例1和2中所述制备)(经历反电子需求Diels-Alder环加成至反式环辛烯修饰的一抗)与膜温育适当时间。在用PBS或水洗涤三次之后，可通过标准荧光方法在膜上显影荧光标记的蛋白质。

[0254] 实施例B：

[0255] 简言之，在将蛋白质样品在SDS-PAGE凝胶上运行然后将蛋白质通过标准方法转移至膜之后，将膜用阻断缓冲液温育30分钟以阻断膜上的非特异性位点。然后将适当稀释的之前经反式环辛烯修饰的一抗(如实施例20中所述制备)添加至溶液，该一抗能够结合于膜上的特异性蛋白。在该溶液中温育膜直至获得充分水平的抗体结合。在用PBS或水洗涤膜三次(每次5-15分钟)去除未结合的抗体之后，将四嗪-HRP缀合物(如实施例19中所述制备)(经历反电子需求Diels-Alder环加成至反式环辛烯修饰的一抗)与膜温育适当时间。在用PBS或水洗涤三次(每次5-15分钟)之后，用H2O2(通常0.5至10μM)和适当的酪胺缀合的荧光团底物如荧光素酪胺、四甲基罗丹明酪胺或Cy5酪胺(但不限于此)温育膜。在温育所需时间之后，将膜用PBS或水洗涤3次(每次5-15分钟)以去除未偶联的荧光团-酪胺，并通过标准荧光方法对膜成像。或者，如不进行用H2O2(通常0.5至
10μM)和适当的酪胺缀合的荧光团的温育，可将荧光团替代为化学发光底物如鲁米诺，但不限于此。在将H2O2/鲁米诺溶液添加至膜之后1-5分钟内，可不经洗涤而通过将膜暴露于X射线片或用适当的数字照相系统对膜成像。

[0256] 其他实施方案

[0257] 应理解的是，尽管已就其详细说明描述了本发明，前述说明旨在阐述而非限制本发明的范围，该范围由所附权利要求的范围所限定。其他方面、优点和修饰属于所附权利要求的范围。