素、蛋白质、肽、肽模拟物、多核苷酸、RNAi、寡糖、具有多功能或结合特异性的明确组成的改 天然或合成聚合物、纳米粒、量子点(quantum 进的稳定束缚结构 dot)、有机或无机化合物，等等。本文所公开的方 |
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| 申请号 | CN200680019839.3 | 申请日 | 2006-03-29 | 公开(公告)号 | CN101583376B | 公开(公告)日 | 2017-03-01 |
| 申请人 | IBC药品公司; | 发明人 | H·C·钱; D·M·戈登伯格; W·J·麦布赖德; E·A·罗西; | ||||
| 摘要 | 法和组合物提供以简单易纯化方式获得任何二本 发明 涉及针对稳定束缚结构(stably 元化合物(与任何 单体 化合物相连接)或者任何tethered structure)的方法和组合物，所述稳 三元化合物。定束缚结构具有明确的组成及多功能性和/或结合特异性。具体的实施方案涉及包含第一单体的同型二聚体和第二单体的稳定束缚结构，其中第一单体包含与第一前体连接的二聚化和停靠结构域(dimerization and docking domain)，第二单体包含与第二前体连接的锚定结构域。第一前体和第二前体实际上可以是任何分子或结构，例如 抗体 、抗体 片段 、抗体类似物或模拟物、适体、结合肽、结合蛋白的片段、 蛋白质 或其它分子的已知配体、酶、可检测标记或标签、 治疗 药、毒素、药物、细胞因子、白介素、干扰素、 放射性 同位 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种包含稳定束缚结构的组合物，所述结构包含： |
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| 说明书全文 | 具有多功能或结合特异性的明确组成的改进的稳定束缚结构[0001] 发明背景 [0002] 具有多功能或结合特异性的基于抗体的药物的现有生产技术，存在很多局限性。对于通过重组工程生产的药物来说，这些局限可包括生产成本高，表达收率低，在血清中不 稳定，在溶液中不稳定而导致有聚集体或离解亚基形成，因存在多种产物形式并含有污染 副产物而导致不确定的批组成，由于位阻因素或构型改变而导致的功能活性或结合亲和 力/亲合力降低，等等。对于用不同化学交联方法生产的药物来说，两个主要的局限是生产 成本高与纯化产物异质性。 [0003] 近年来，对于能结合不止一个抗原决定簇(也称为表位)的抗体或其它结合部分，人们的兴趣不断增加。一般来说，天然存在的抗体和单克隆抗体有识别同一表位的两个抗 原结合位点。相比之下，双功能或双特异性抗体(在下文中仅使用双特异性抗体这一术语) 是经合成或基因工程改造的可结合两个不同表位的结构。因此，同一分子构建体中存在能 结合两个不同抗原决定簇的能力。 [0004] 双特异性抗体可用于许多生物医学应用。例如，具有肿瘤细胞表面抗原结合位点和T细胞表面受体结合位点的双特异性抗体，能导致特定肿瘤细胞被T细胞溶解。识别胶质 瘤和T细胞CD3表位的双特异性抗体，已成功地用于治疗人类患者的脑肿瘤(Nitta等， Lancet.1990；355：368-371)。 [0005] 已知有多种生产双特异性抗体的方法。构建和利用双特异性及多特异性抗体的方法，公开于例如美国专利申请公布号20050002945(2004年11月2日申请)，所述文献的全部 内容通过引用结合到本文中。双特异性抗体可通过四源杂交瘤(quadroma)方法生产，该方 法包括使两个不同杂交瘤融合，每个杂交瘤都产生一种识别不同抗原性位点的单克隆抗体 (Milstein和Cuello.Nature.1983；305：537-540)。该融合杂交瘤能合成两个不同重链和两 个不同轻链，它们能随机结合产生具有10种不同抗体结构的异质群体，其中只有一个(占全 部抗体分子的1/8)是双特异性的，因而必须进一步纯化以与其它形式分开，即使这是可行 的但也是不经济的。此外，在细胞遗传学上融合杂交瘤经常不如亲代杂交瘤稳定，导致生产 细胞系在传代时有很多问题。 [0006] 另一个生产双特异性抗体的方法利用杂双官能交联剂，用化学键束缚两个不同单克隆抗体，致使所得的杂交缀合物能结合两个不同靶标(Staerz等，Nature.1985；314：628- 631；Perez等，Nature.1985；316：354-356)。用此方法产生的双特异性抗体基本上是两个 IgG分子的异源缀合物，它缓慢扩散到组织中并迅速从循环中清除。双特异性抗体也可通过 如下方法制备：将两个亲本单克隆抗体各自还原成相应的半个分子，然后混合并氧化得到 杂合体结构，从而生产双特异性抗体(Staerz和Bevan.Proc Natl Acad Sci USA.1986；83： 1453-1457)。一个替代方法是利用合适接头，使两个或三个单独纯化的Fab′片段发生化学 交联。例如，欧洲专利申请0453082公开了应用三-马来酰亚胺化合物来制备双特异性或三 特异性抗体样结构。美国专利第6,511,663号提供了一种通过连接结构使三个或四个Fab片 段彼此共价连接来制备三价和四价单特异性抗原结合蛋白的方法。由于所有这些化学方法 都有生产成本高、生产过程繁复、纯化步骤过多、收率低(＜20％)及产物异质性等缺点，因 此不适于商业开发。 [0007] 其它方法包括：通过逆转录病毒衍生的穿梭载体，将带有不同选择标记的基因转移到相应亲本杂交瘤中并随后使之融合，以提高杂合杂交瘤的生产效率(DeMonte等，Proc Natl Acad Sci USA.1990，87：2941-2945)；或者用含有不同抗体的重链和轻链基因的表达 质粒转染杂交瘤细胞系。这些方法也面临上述不可避免的纯化问题。 [0008] 美国专利第5,582,996号公开了产生重组双特异性抗体的方法，该重组双特异性抗体由来自相同或不同抗体的Fab片段组成，这些Fab片段通过插入该抗体重链恒定区的互 补相互作用结构域而缔合。互补相互作用结构域选自交互的亮氨酸拉链或一对肽区段，其 中一个含有一系列带正电荷的氨基酸残基，而另一个含有一系列带负电荷的氨基酸残基。 该方法的一个局限性是，含有融合的互补相互作用结构域的各个Fab亚基表现出对其靶抗 原的亲和力急剧下降，除非两个亚基结合在一起。 [0009] 通过重组DNA技术产生的抗体的离散VH区和VL区会彼此配对，形成具有结合能力的二聚体(重组Fv片段)(美国专利第4,642,334号)。然而，这样非共价缔合的分子在生理条件 下不够稳定以致没有实际用途。关联VH区和VL区能通过具有合适长度(通常由多于12个氨基 酸残基组成)和合适组成的肽接头连接起来，形成具有结合活性的单链FV(scFv)。scFv的生 产方法公开于美国专利第4,946,778号和美国专利第5,132,405号。将肽接头长度减少到少 于12个氨基酸残基，可以避免同一链的VH区和VL区配对，而迫使VH区和VL区与其它链的互补 区配对，形成功能性多聚体。由3-12个氨基酸残基接头连接的VH区和VL区多肽链主要形成二 聚体(称为双链抗体(diabodies))。0-2个氨基酸残基接头主要形成三聚体(称为三链抗体 (triabodies))和四聚体(称为四链抗体(tetrabodies))，但是除了接头长度外，寡聚化的 确切形式看来还取决于V区的组成和取向(VH-接头-VL或VL-接头-VH)。 [0010] 用5个氨基酸残基或更短的肽接头，可得到多价单特异性双链抗体、三链抗体和四链抗体。利用双顺反子(dicistronic)表达载体也制备了双特异性双链抗体，该双特异性双 链抗体是两个不同scFv的异源二聚体，其中每个scFv由一个抗体的VH区经短肽接头与另一 抗体的VL区连接而成；所述双顺反子表达载体中的一个顺反子含有由VH1-接头-VL2构成的重 组基因构建体，而另一个顺反子含有由VH2-接头-VL1构成的第二重组基因构建体(Holliger 等，Proc Natl Acad SciUSA.1993；90：6444-6448；Atwell等，Mol Immunol.1996；33：1301- 1302；Holliger等，Nature Biotechnol.1997；15：632-631；Helfrich等，Int.J Cancer.1998；76：232-239；Kipriyanov等，Int J Cancer.1998；77：763-772；Holliger等， Cancer Res.1999；59：2909-2916)。 [0011] 最近，也报道了具有双特异性的四价串联双链抗体(称为串联双链抗体(tandab))(Cochlovius等，Cancer Res.2000；60：4336-4341)。该双特异性串联双链抗体是两个相同 多肽的二聚体，每个多肽含有两个不同抗体的四个可变区(VH1、VL1、VH2、VL2)，这四个可变区 按一定方向连接，以便一旦自缔合就形成各自针对两个不同特异性的两个潜在结合位点。 [0012] 迄今为止，尚未构建得到表达双特异性或三特异性三链抗体的载体。然而，含有胶原凝集素颈区(collectin neck region)的多肽三聚化已有报道(Hoppe等，FEBS Letters.1994；344：191-195)。美国专利第6,190,886号公开了用含有胶原凝集素颈区的融 合蛋白生产同源三聚体或异源三聚体。 [0013] 美国专利第5,844,094号、美国专利第5,837,242号和WO98/44001中公开了通过改变接头长度，制备基于scFv的多价和多特异性药物的方法。美国专利第5,989,830号和美国 专利第6,239,259号公开了通过构建两条多肽链，制备基于scFv的多价和多特异性药物的 方法，其中一条多肽链含有来自至少两个抗体的VH区，另一条多肽链含有相应的VL区。用现 有技术产生基于scFv的多价和多特异性药物的常见问题是：表达水平低，产品形式不均一， 在溶液中不稳定导致聚集，在血清中不稳定以及亲和力降低。 [0014] 美国专利第6,809,185号公开了通过重组方法产生的双特异性或三特异性抗体，该抗体中Fab的CH1和CL链的C端各自与来自相同或不同单克隆抗体的scFv融合。这项“三链 体(Tribody)”技术的主要缺点包括附加的scFv结合亲和性降低，产品形式不均一，在溶液 中不稳定导致聚集。 [0015] 因此，本领域仍然需要多所述特异性或功能性的多价结构的制备方法，特别是双特异性抗体的制备方法，这类多价结构的组成确定，纯度均一，亲和性未改变，并且生产收 率高而无需大量的纯化步骤。此外，这类结构物必须在血清中足够稳定，以便在体内应用。 需要易于构建和/或以相对纯的形式获得的多特异性或功能性的稳定多价结构。 [0016] 发明概述 [0017] 本发明提供定量产生稳定束缚结构的平台技术，所述结构具有多功能或结合特异性。在优选的实施方案中，通过两个不同肽序列间特定的相互作用，将这类稳定束缚结构制 备成任何两个组分(在本文中称为A和B)的独特二元复合物，这两个肽序列中的一个称为二 聚化和停靠结构域(dimerization and docking domain，DDD)，另一个称为锚定结构域 (anchoring domain，AD)。在更优选的实施方案中，DDD序列(见图1中的DDD1和DDD2)来自依 赖cAMP的蛋白激酶(PKA)调节(R)亚基，而AD序列(见图2中的AD1和AD2)来自不同A-激酶锚 定蛋白(AKAP)中存在的特定区域，其介导与PKA的R亚基的缔合。然而，技术人员将会知道， 其它二聚化和停靠结构域及锚定结构域是已知的，任何这样的已知结构域可在本文要求保 护的主题范围之内使用。其它示例性的4-螺旋束类型DDD结构域可得自p53、DCoH(肝细胞核 因子1α(TCF1))的蝶呤4α甲醇胺脱水酶/二聚化辅因子)和HNF-1(肝细胞核因子1)。尽管 S100蛋白也表现4螺旋-束DDD序列，但是这些蛋白质都具有生物活性，例如使其无法实用的 致癌性。具有潜在用途的其它AD序列可参见专利申请顺序号US2003/0232420A1，所述文献 的全部内容通过引用结合到本文中。 [0018] 在最优选的实施方案中，二元复合物中的一个组分A是通过重组工程或者经间隔基团进行化学缀合，将DDD序列与A的前体(称为A)连接而产生的，结果产生A/DDD结构(在下 文中称为a)。因为a中的DDD序列影响二聚体的自发形成，所以A由a2组成。二元复合物中的 另一组分B是通过重组工程或者经间隔基团进行化学缀合，将AD序列与B的前体(称为B)连 接而产生的，结果产生B/AD结构(在下文中称为b)。二聚体结构包含在a2中，这一事实产生 停靠位点，用于结合b中所含的AD序列，导致a2与b迅速缔合，形成由a2b组成的二元复合物。 在不同实施方案中，这样的结合事件还因后续反应而进一步稳定化，所述后续反应共价保 护了该装配的两个组分，例如通过二硫桥，所述反应非常有效地发生，因为起始结合相互作 用使活性硫醇基定向，以便进行位点特异性连接。 [0019] 为了将半胱氨酸残基放置在DDD和AD序列(如DDD2和AD2所示)的战略位置上，a2与b间可通过二硫桥而发生共价结合相互作用，由此形成稳定束缚结构，这使得体内应用更可 行。稳定束缚结构也保留了两个前体A和B的全部功能特性。本发明人无法得知任何现有技 术具有这样独特特征组合的双特异性组合物。以上公开的设计在自然界是模块状的，因为 所选的两个前体中的每个都可与DDD或AD连接并随后组合。这两个前体也可相同(A＝B)或 不同(A≠)。当A＝B时，所得a2b复合物由稳定束缚装配的3个亚基组成，在下文中称为a3。适 合作为前体的材料包括蛋白质、肽、肽模拟物、多核苷酸、RNAi、寡糖、天然或合成聚合物、纳 米粒、量子点(quantum dot)以及有机或无机化合物。可能应用的前体的其它非限制性实例 见下表6-10。 [0020] 除了使用二硫键以防组成性亚基解离之外，也可使用能增强a2b结构的总体稳定性的其它方法。例如，可选择市售的或研究中使用的各种交联剂或方法，用于这些目的。可 能有用的试剂是戊二醛，它已广泛用于探究非共价缔合的多聚体蛋白质的结构，即通过使 组成性亚基交联，形成稳定的缀合物(Silva等，Food TechnolBiotechnol.2004；42：51- 56)。两种涉及蛋白质亚基氧化交联的化学方法也令人感兴趣。一个方法是近端标记技术 (proximity labelingtechnique)，采用六组氨酸标记的蛋白质(Fancy等，Chem Biol.1996；3：551-559)或N端甘氨酸-甘氨酸-组氨酸标记的蛋白质(Brown等， Biochemistry.1998；37：4397-4406)。这些标记与Ni(II)紧密结合，当用过酸氧化时，生成 Ni(III)，Ni(III)能介导各种氧化反应，包括蛋白质-蛋白质交联。称为PICUP(未修饰蛋白 2+ 质的光诱导交联)的另一技术采用[Ru(II)(bipy)3] 、过硫酸铵和可见光，以诱导蛋白质- 蛋白质交联(Fancy和Kodadek.Proc Natl Acad Sci USA.1999；96：6020-6024)。然而，如下 所述，用于化学交联肽、多肽、蛋白质或其它各种大分子的多种方法是本领域已知的，任何 这样的已知方法都可用于使a2b结构共价稳定。 [0021] 可以用要求保护的方法和组合物开发各种产物。例如，考虑了至少6类基于蛋白质或基于肽的产物，其由稳定束缚装配的基因工程结构组成： [0022] 1类：双特异性三价a2b复合物，由两个来自同一单克隆抗体(mAb)的Fab或scFv片段以及一个来自不同mAb的Fab或scFv片段组成(参见例如表6)； [0023] 2A类：多功能性a2b复合物，由两个来自同一mAb的Fab或scFv片段以及一个非免疫球蛋白或肽组成(参见例如表7A)； [0024] 2B类：多功能性a2b复合物，由两个相同的非免疫球蛋白或肽以及一个来自mAb的Fab或scFv片段组成(参见例如表7B)； [0025] 3类：多功能性a2b复合物，由三个非免疫球蛋白或肽组成，这三个中有两个是相同的(参见例如表8)； [0026] 4类：三价a3复合物，由三个来自同一mAb的Fab或scFv片段组成(参见例如表9)； [0027] 5类：三价a3复合物，由三个相同的非免疫球蛋白或肽组成(参见例如表10)。 [0028] 技术人员将会知道，尽管以上讨论涉及Fab或scFv片段，但是在下文中详细讨论的其它类型的抗体和/或抗体片段也可被替代。一般来讲，1类产物可用于需要双特异性抗体 的各种用途。例如，同时与活化血小板和组织纤溶酶原激活物(tPA)反应的双特异性抗体不 仅能通过抑制血小板聚集而防止进一步形成血凝块，而且能通过将内源tPA募集到血小板 表面而溶解现有的血凝块(Neblock等，Bioconjugate Chem.1991，3：126-31)。 [0029] 一般而言，2A类和2B类产物可用于需要靶特异性递送或结合非免疫球蛋白的各种用途。例如，由针对内化肿瘤相关抗原(例如CD74)及与其连接的毒素(例如核糖核酸酶)的 双价抗体结合结构组成的稳定束缚a2b复合物，对选择性递送毒素以破坏目标肿瘤细胞来 说是很重要的。 [0030] 一般而言，3类产物可用于更需要两种不同非免疫球蛋白组合、而非单个非免疫球蛋白的各种用途。例如，由IL-4R受体的可溶性组分(sIL-4R)以及IL-13受体的可溶性组分 (sIL-13R)组成的稳定束缚a2b复合物，将是治疗哮喘或变态反应的潜在治疗药。 [0031] 一般而言，4类和5类产物可用于更需要三价复合物、而非其单价类似物的各种用途。例如，与单价类似物(ReoPro，Centocor)或双价类似物相比，由三个抗GPIIb/IIIa Fab 片段组成的稳定束缚a3复合物结合结构，在预防血凝块形成中应该更有效，因为后者具有 更高结合亲合力。在治疗类风湿性关节炎和某些其它自身免疫性疾病(AID)中，对于抑制 TNF方面来说，由TNFα-R的可溶性组分的三个拷贝组成的稳定束缚a3复合物比Enbrel (Amgen)更有效。 [0032] 要求保护的方法和组合物也包括缀合物，所述缀合物由一种或多种效应物或载体及与其连接的a2b或a3形式的稳定束缚结构组成。效应物或载体可与a2b或a3复合物非共价 或共价连接，例如通过化学交联。根据所需用途，效应物可选自诊断试剂、治疗药、化疗药、 放射性同位素、放射性核素、显像剂(imaging agent)、抗血管生成药、细胞因子、趋化因子、 生长因子、药物、前体药物、酶、结合分子、细胞表面受体的配体、螯合剂、免疫调节剂、寡核 苷酸、激素、光检测标记、染料、肽、毒素、造影剂(contrast agent)、顺磁标记、超声标记、促凋亡剂(pro-apoptotic agent)、脂质体、纳米粒或其组合。此外，缀合物可含有不止一种效 应物(效应物可以相同或不同)或不止一种载体(载体可以相同或不同)。效应物和载体也可 存在于同一缀合物中。当效应物是螯合剂时，所得缀合物通常还与金属络合，所述金属可以 是放射性或非放射性的。含有载体的缀合物还可与诊断或治疗功能试剂联合用于所需用 途。 [0033] 在某些实施方案中，效应物或载体可以在给予患者a2b复合物之后给予，例如在如下讨论的预靶向(pre-targeting)策略中。可先将a2b复合物给予患者，让其定位于例如患 病组织，例如肿瘤。随后添加效应物或载体，让其与定位的a2b复合物结合。尽管效应物或载 体与有毒部分(例如放射性核素)缀合，但是这种预靶向方法减少了患者对毒性的全身暴 露，让毒性剂按更大比例递送到靶组织。在这样的实施方案中，A亚基可含有例如肿瘤相关 抗原的结合位点，而B亚基可含有效应物或载体的结合位点或者含有与效应物或载体缀合 的半抗原的结合位点。 [0034] 本文所公开的方法和组合物能使任何两个结构与DDD/AD偶联系统定点共价或非共价缔合。DDD结构特征的X类4-螺旋束二聚化基序(Newlon等，EMBO J.2001；20：1651- 1662；Newlon等，Nature Struct Biol.1999；3：222-227)存在于其它类型的蛋白质中，例如 S100蛋白(例如S100B和钙周期蛋白)和转录因子的肝细胞核因子(HNF)家族(例如HNF-1α和 HNF-1β)。参与信号转导或转录活化的超过300种蛋白质也含有65-70个氨基酸的模块，称为 不育α基序(SAM)结构域，其具有在二聚化界面上存在的X类4-螺旋束的变化。对于S100B，该 X类4-螺旋束能使各二聚体以微摩尔亲和力与来自c端调节结构域(残基367-388)的两个 p53肽结合(Rustandi等，Biochemistry.1998；37：1951-1960)。同样，HNF-1α的N端二聚化结 构域(HNF-pl)显示出通过HNF-pl二聚体与DCoH二聚体(HNF-1的二聚化辅因子)缔合(Rose 等，Nature Struct Biol.2000；7：744-748)。在替代实施方案中，这些天然存在的系统也可 用于要求保护的方法和组合物，以提供具有多功能或结合特异性的稳定的多聚体结构。其 它结合事件例如酶与其底物/抑制剂(例如角质酶和膦酸酯)间的结合事件(Hodneland等， Proc Natl Acd Sci USA.2002；99：5048-5052)也可用于产生两个缔合组分(“停靠”步骤)， 其随后经共价稳定化(“锁定”步骤)。 [0035] 在不同实施方案中，可将题述组合物给予疾病患者，用于治疗和/或诊断目的。技术人员将会知道，可用多功能性、双价、三价、多特异性或双特异性复合物诊断和/或治疗的 任何疾病，都可用题述组合物治疗。示例性的疾病包括但不限于癌症、增生、神经变性性疾 病、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、脉管炎、病毒感染、真菌感染、细菌感染、糖尿病 性视网膜病、黄斑变性、自身免疫性疾病、炎性肠病、节段性回肠炎(Crohn’s disease)、溃 疡性结肠炎、类风湿性关节炎、结节病、哮喘、水肿、肺动脉高压、青少年糖尿病、银屑病、系 统性红斑狼疮、斯耶格伦综合征(Sj gren’s syndrome)、多发性硬化、重症肌无力、脓毒 病、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、遗传性出血性毛细血管扩张(Osler-Webber Syndrome)、心肌血管生成、斑块新血管形成、再狭窄、血管创伤后新内膜形成、毛细管扩张、 血友病性关节、血管纤维瘤、慢性炎症相关的纤维化、肺纤维化、深部静脉血栓形成或伤口 肉芽形成。 [0036] 在具体实施方案中，本文所公开的方法和组合物可用于治疗自身免疫性疾病(例如急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜)、皮肌炎、小舞蹈病 (Sydenham’s chorea)、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺性综合征、 大疱性类天疱疮、青少年糖尿病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonleinpurpura)、链球菌感染 后的肾炎(post-streptococcalnephritis)、结节性红斑、无脉病(Takayasu’s arteritis)、艾迪生病(Addison’s disease)、类风湿性关节炎、多发性硬化、结节病、溃疡 性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、关节强硬性脊椎炎、肺出血肾炎综合征 (Goodpasture′s syndrome)、闭塞性血栓性脉管炎(thromboangitisubiterans)、斯耶格伦 综合征(Sjogren’s syndrome)、原发性胆汁性肝硬化、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常性天 疱疮、韦格纳肉芽肿病(Wegener’s，anulomatosis)、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、 巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球性肾炎、银屑病或纤维性肺泡炎。 [0037] 在某些实施方案中，稳定束缚结构可用于癌症的治疗性治疗。可以预料，可以靶向任何类型的肿瘤和任何类型的肿瘤抗原。可以靶向的示例性肿瘤类型包括急性成淋巴细胞 性白血病、急性髓细胞性白血病、胆囊癌、乳癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细 胞性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈部癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、肺癌、甲状腺髓质癌、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’s lymphoma))、多发性骨 髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、胶质瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和膀胱癌。 [0038] 可以靶向的肿瘤相关抗原包括但不限于碳酸酐酶IX、A3、A33抗体特异性抗原、BrE3-抗原、CD1、CD1a、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA-DR、NCA95、NCA90、HCG及其亚基、CEA(CEACAM-5)、CEACAM-6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM、Ba733、HER2/neu、低氧诱导因子(HIF)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、PAM-4-抗原、PSA、 PSMA、RS5、S100、TAG-72、p53、生腱蛋白、IL-6、IL-8、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、胎盘生长因子(PlGF)、17-1A-抗原、血管 生成标记(例如ED-B纤连蛋白)、癌基因标记、癌基因产物和其它肿瘤相关抗原。目前对肿瘤 相关抗原的报道包括Mizukami等(2005，Nature Med.11：992-97)；Hatfield等(2005， CurT.Cancer Drug Targets 5：229-48)；Vallbohmer等(2005，J.Clin.Oncol.23：3536- 44)；和Ren等(2005，Ann.Surg.242：55-63)，所述各文献通过引用结合到本文中。 [0039] 其它实施方案涉及治疗患者的淋巴瘤、白血病或自身免疫病的方法，即通过给予患者一种或多种剂量的稳定束缚结构，其中第二前体的结合位点与淋巴细胞抗原结合，第 一前体的结合位点与相同或不同的淋巴细胞抗原结合。一个或多个结合位点可与选自以下 的抗原的一个或多个独特表位结合：CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、 CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、CD138、CD154、B7、MUC1、Ia、Ii、HM1.24、HLA-DR、生腱蛋白、VEGF、PlGF、ED-B纤连蛋白、癌基因、癌基因产物、NCA 66a-d、坏死抗原、IL-2、T101、TAG、IL-6、MIF、TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2 (DR5)。可通过胃肠外给予组合物，剂量例如为每剂20-1500毫克蛋白、每剂20-500毫克蛋 白、每剂20-100毫克蛋白、或每剂20-1500毫克蛋白。 [0040] 在又一些实施方案中，稳定束缚结构可用于治疗例如细菌、病毒或真菌等病原生物感染的患者。可治疗的示例性真菌包括小孢子菌属(Microsporum)、发癣菌属 (Trichophyton)、表皮癣菌属(Epidermophyton)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、 新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、荚膜组织 胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)或白色念珠 菌(Candida albican)。示例性的病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、 狂犬病毒、流感病毒、人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病 毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小病毒样病毒(parvo-like virus)、猿猴病毒 40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、水痘带状疱疹病毒、登革热病毒、风疹病毒、麻疹 病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、Epstein-Barr病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、疱疹性 口腔炎病毒、辛德比斯病毒(Sindbis virus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒或蓝舌病毒。 示例性的细菌包括炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、酿脓葡萄球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑 膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌(Pneumococcusspp.)、流感嗜血杆 菌B(Hemophilis influenzaeB)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、莱姆病螺旋体 (Lyme disease spirochetes)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、麻风分枝杆菌 (Mycobacteriumleprae)、流产布鲁氏杆菌(Brucella abortus)、结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)或支原体(Mycoplasma)。这些稳定束缚结构可包含例如针 对病原体上一个或多个抗原决定簇的结合位点，并且可以与针对病原体的治疗药缀合或连 接，所述治疗药例如抗病毒药、抗生素或抗真菌药。或者，稳定束缚缀合物可包含针对病原 体抗原的第一结合位点和针对半抗原或载体的第二结合位点，所述半抗原或载体与一种或 多种治疗药连接。 [0041] 所采用的针对感染性生物体的、并缀合或掺入或定向结合所述稳定束缚结构的治疗药，包括但不限于阿昔洛韦、阿苯达唑、金刚烷胺、阿米卡星、阿莫西林、两性霉素B、氨苄 西林、氨曲南、阿奇霉素、杆菌肽、复方新诺明(bactrim)、巴特芬(Batrafen) 、联苯苄唑、 羧苄西林、卡泊芬净、头孢克洛、头孢唑林、头孢菌素类(cephalosporins)、头孢吡肟、头孢 曲松、头孢噻肟、氯霉素、西多福韦、盐酸环丙沙星制剂(Cipro) 、克拉霉素、克拉维酸、克 霉唑、氯唑西林、多西环素、益康唑、erythrocycline、红霉素、甲硝唑、氟康唑、氟胞嘧啶、膦甲酸、呋喃唑酮、更昔洛韦、庆大霉素、亚胺培南、异烟肼、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、林可霉素、利奈唑胺、美罗培南、咪康唑、米诺环素、萘替芬、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥 因、制霉菌素、奥塞米韦、苯唑西林、巴龙霉素、青霉素、喷他脒、哌拉西林-三唑巴坦、利福布汀、利福平、金刚乙胺、链霉素、磺胺甲 唑、柳氮磺吡啶、四环素、噻康唑、妥布霉素、托西 拉酯、托萘酯、甲氧苄啶-磺胺甲 唑、伐昔洛韦、万古霉素、zanamir和zithromycin。 [0042] 尽管并非限制性的，在不同实施方案中，掺入到稳定束缚结构中的前体可包含一种或多种蛋白质，例如细菌毒素、植物毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA 酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞 菌外毒素、假单胞菌内毒素、豹蛙酶(Rap)、Rap(N69Q)、PE38、dgA、DT390、PLC、tPA、细胞因 子、生长因子、可溶性受体组分、表面活性蛋白D、IL-4、sIL-4R、sIL-13R、VEGF121、TPO、EPO、溶血栓剂、酶、荧光蛋白、sTNFα-R、avimer、scFv、dsFv或纳米抗体(nanobody)。 [0043] 在其它实施方案中，抗血管生成药可形成前体的一部分或全部，或者可与稳定束缚结构连接。使用的示例性抗血管生成药包括血管生长抑素、baculostatin、人血管能抑素 (canstatin)、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体或肽、抗胎盘生长因子抗体或肽、抗Flk-1抗体、抗 Flt-1抗体或肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制 剂、干扰素、白介素12、IP-10、Gro-β、血小板应答蛋白(thrombospondin)、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、carboxiamidotriazole、CM101、马立马司他、戊聚糖多聚硫酸酯 (pentosan polysulphate)、促血管生成素2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素 片段、利诺胺、沙利度胺、己酮可可碱、染料木碱、TNP-470、内皮生长抑素、紫杉醇、accutin、血管生长抑素、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素。 [0044] 在又一些实施方案中，一种或多种例如以下的治疗药可与稳定束缚结构缀合或者掺入到其中：aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、氮杂胞苷、博来霉素、硼替佐米(bortezomib)、 苔藓抑素-1、白消安、加利车霉素、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉曲滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他 赛、放线菌素D、葡糖苷酸道诺霉素、柔红霉素、地塞米松、己烯雌酚、多柔比星、二氢吡咯多 柔比星(2P-DOX)、氰基吗啉代多柔比星、葡糖苷酸多柔比星、葡糖苷酸表柔比星、炔雌醇、雌 莫司汀、依托泊苷、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基- FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、吉西他滨、己酸羟孕酮、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羟孕酮 (medroprogesterone acetate)、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、 米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、泼尼松、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、 PSI-341、司莫司汀、链佐星、他莫昔芬、紫杉烷类、泰素、丙酸睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、乌拉莫司汀、velcade、长春碱、长春瑞滨、长春新碱、蓖麻毒蛋 白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、onconase、rapLRl、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗 病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、反义寡核苷酸、 干扰RNA或其组合。 [0045] 在其它实施方案中，第一前体可与患病组织相关抗原或其它靶标结合，而第二前体可设计成与可寻靶构建体(targetableconstruct)结合，用于递送一种或多种效应物。给 予稳定束缚结构并定位于疾病相关细胞或组织之后，可以添加可寻靶构建体，以结合定位 的稳定束缚结构。任选可给予清除剂，以便从环境循环中清除未定位的稳定束缚结构，然后 再给予可寻靶构建体。这些方法是本领域已知的，详见美国专利第4,624,846号、WO 92/ 19273和Sharkey等，Int.J.Cancer 51：266(1992)。示例性的可寻靶构建体具有以下结构： X-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Y)-NH2，其中该化合物在X或Y上包含硬酸阳离子螯 合剂，在剩余X或Y上包含软酸阳离子螯合剂；并且其中该化合物还包含至少一种诊断性或 治疗性阳离子，和/或一种或多种螯合的或化学结合的治疗药、诊断试剂或酶。诊断试剂可 以是例如Gd(III)、Eu(III)、Dy(III)、Pr(III)、Pa(IV)、Mn(II)、Cr(III)、Co(III)、Fe (III)、Cu(II)、Ni(II)、Ti(III)、V(IV)离子或基团。第二个示例性的构建体可以是下式：X- Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Y)-NH2，其中该化合物在X或Y上包含硬酸阳离子螯合 剂或软酸螯合剂，而在剩余X或Y上没有；并且其中该化合物还包含至少一个诊断性或治疗 性阳离子，和/或一种或多种螯合的或化学结合的治疗药、诊断试剂或酶。 [0046] 不同实施方案可涉及用于诱导患病细胞凋亡的稳定束缚结构及其使用方法。详情可参见美国专利申请公布号20050079184，所述专利申请的全部内容都通过引用结合到本 文中。这类结构可包含具有针对选自以下抗原的结合亲和性的第一和/或第二前体：CD2、 CD3、CD8、CD10、CD21、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD48、CD52、CD55、CD59、CD70、CD74、CD80、CD86、CD138、CD147、HLA-DR、CEA、CSAp、CA-125、TAG-72、EFGR、HER2、HER3、HER4、IGF-1R、c-Met、PDGFR、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、TNFR1、TNFR2、NGFR、Fas(CD95)、DR3、DR4、DR5、DR6、VEGF、PIGF、ED-B纤连蛋白、生腱蛋白、PSMA、PSA、碳酸酐酶IX和IL-6。在更具体的实施方案中，用于诱导细胞凋亡的稳定束缚结构可包含单克隆抗体、Fab片段、嵌 合抗体、人源化抗体或人抗体或片段。在优选的实施方案中，稳定束缚结构可包含以下抗体 的组合：抗CD74 X抗CD20、抗CD74X抗CD22、抗CD22X抗CD20、抗CD20X抗HLA-DR、抗CD19X抗 CD20、抗CD20X抗CD80、抗CD2X抗CD25、抗CD8X抗CD25和抗CD2X抗CD147。在更优选的实施方 案中，嵌合抗体、人源化抗体或人抗体或抗体片段可来自LL2(抗CD22)、LL1(抗CD74)或A20 (抗CD20)的可变区。 [0047] 不同实施方案可涉及治疗炎性和免疫失调疾病、感染性疾病、病理性血管生成或癌症的方法。在本申请中，稳定束缚结构与选自以下的两个不同靶标结合：(A)先天免疫系 统的促炎效应物，(B)凝血因子，(C)补体因子和补体调节蛋白，和(D)与炎性或免疫失调障 碍或与病理性血管生成或癌症特异性相关的靶标，其中后一靶标不是(A)、(B)或(C)。至少 一个靶标是(A)、(B)或(C)。合适的靶标组合参见美国临时申请第60/634,076(2004年12月8 日申请，发明名称为“Methods and Compositions for Immunotherapy and Detection ofInflammatory and Immune-Dysregulatory Disease，Infectious Disease，Pathologic Angiogenesis and Cancer”)，所述临时申请的内容通过引用全部结合到本文中。 [0048] 结合分子可结合的先天免疫系统的促炎效应物，可以是促炎效应物细胞因子、促炎效应物趋化因子或促炎效应物受体。合适的促炎效应物细胞因子包括MIF、HMGB-1(高迁 移率族框蛋白1(high mobility group box protein 1))、TNF-a、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-8、IL-12、IL-15和IL-18。促炎效应物趋化因子的实例包括CCL19、CCL21、IL-8、MCP-1、 RANTES、MIP-1A、MIP-1B、ENA-78、MCP-1、IP-10、GROB和嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)。 促炎效应物受体包括IL-4R(白介素-4受体)、IL-6R(白介素-6受体)、IL-13R(白介素-13受 体)、IL-15R(白介素-15受体)和IL-18R(白介素-18受体)。 [0049] 结合分子也可与至少一种凝血因子(尤其是组织因子(TF)或凝血酶)发生特异性反应。在其它实施方案中，结合分子与至少一种补体因子或补体调节蛋白特异性反应。在优 选的实施方案种，补体因子选自C3、C5、C3a、C3b和C5a。当结合分子与补体调节蛋白特异性 反应时，补体调节蛋白优选选自CD46、CD55、CD59和mCRP。 [0051] 图1显示两个示例性DDD序列。DDD1中加下划线的序列(SEQ ID NO：1)对应于人PKA的RIIα中存在的前44个氨基端残基。DDD2(SEQ ID NO：2)在N端有两个氨基酸与DDD1不同。 [0052] 图2显示两个示例性AD序列。AD1中加下划线的序列(SEQ ID NO：3)对应于AKAP-is，它是据报道Kd为0.4nM的优化RII-选择性肽。也显示了AD2(SEQ ID NO：4)。 [0053] 图3显示RII的DDD与AKAP的AD之间相互作用的结构模型。 [0054] 图4显示N-DDD2-Fab-hMN-14(A)以及由DDD2介导的二聚化而形成的推定的a2结构(B)的示意图。 [0055] 图5显示N-DDD2-VH-hMN-14-pdHL2质粒表达载体的设计。 [0056] 图6显示C-DDD2-Fab-hMN-14(A)以及由DDD2介导的二聚化而形成的推定的a2结构(B)的示意图。 [0057] 图7显示C-DDD2-VH-hMN-14-pdHL2质粒表达载体的设计。 [0058] 图8显示h679-Fab-AD2(A)及其推定的结构(B)的示意图。 [0059] 图9显示h679-VH-AD2-pdHL2质粒表达载体的设计。 [0060] 图10显示用IMP-291-Affigel纯化的h679-Fab-AD2的SE-HPLC分析。 [0061] 图11显示h679-Fab-AD2ds(A)通过还原而活化成h679-Fab-AD2(B)的示意图。 [0063] 图13显示当用5mM TCEP还原时，纯化的N-DDD2-Fab-hMN-14中存在的a4型解离成a2型，5mM TCEP也将二聚体轻链转化成单体轻链。 [0064] 图14显示当还原时，N-DDD2-Fab-hMN-14的a4型(A)转化成a2型(B)的示意图。 [0065] 图15显示用CBind L(蛋白L纤维素)纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14中占优势存在a4型。SE-HPLC描记图也揭示了存在a2型，以及以单体形式和二聚体形式存在的游离轻链 [0066] 图16显示当用5mMTCEP还原时，纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14中存在的a4型解离成a2型。 [0067] 图17显示(A)在还原条件下当N-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2混合时所形成的非共价a2b复合物和(B)通过二硫桥形成的共价TF1结构的示意图。 [0068] 图18显示包括产生TF1的步骤的SE-HPLC分析。图A显示在添加TCEP之前含有N-DDD2-Fab-hMN-14和h679-Fab-AD2的反应混合物。图B显示在添加5mM TCEP之后，形成非共 价a2b复合物。图C显示用10％DMSO处理后经二硫键连接的产物。图D显示经IMP-291-亲和色 谱和制备型SE-HPLC后TF1的纯度。 [0069] 图19显示在BIAcore分析所采用的条件下，仅共价TF1结构能同时结合HSG(作为IMP-239固定在传感器芯片上)和WI2(针对hMN-14的抗id)。N-DDD1-Fab-hMN-14与h679- Fab-AD1之间所形成的非共价a2b复合物未能捕获WI2，虽然已与偶联HSG的传感器芯片结合。 [0070] 图20显示TF1含有hMN-14的两个功能性结合位点，因为它能结合WI2的两个Fab分子。 [0071] 图21显示在组分A和B的DDD和AD序列中战略性放置半胱氨酸残基的作用，以影响稳定结构(N-DDD2+AD2)的形成，该结构在BIAcore分析所采用的条件下能同时结合HSG(作 为IMP-239固定在传感器芯片上)和WI2(针对hMN-14的抗id)。在DDD与AD特异性结合后，当 组分A不能与组分B形成二硫键时，所得a2b复合物在BIAcore分析所采用的条件下不够稳 定，不能保持结合在一起。a2与b解离是明显的，因为复合物(N-DDD1+AD2)不能捕获WI2。 [0072] 图22显示IMP-291亲和纯化之前(A)和之后(B)的SE-HPLC分析。将过量N-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2混合，以保证在IMP-291亲和色谱后，没有游离h679-Fab-AD2与 稳定束缚复合物一起纯化出来。 [0073] 图23显示TF2的示意图。 [0074] 图24显示包括产生TF2的步骤的SE-HPLC分析。图A显示在添加TCEP之前含有C-DDD2-Fab-hMN-14和h679-Fab-AD2的反应混合物。图B显示在添加5mM TCEP之后形成非共价 a2b复合物。 [0075] 图25显示对TF2的IMP-291亲和纯化的SE-HPLC分析。图A显示上样到IMP-291-affigel之前的TF2。图B显示未结合流分。图C显示结合流分，仅包含TF2。 [0076] 图26显示TF2的(A)非还原性和(B)还原性SDS-PAGE分析。 [0077] 图27显示TF2的MALDI-TOF质谱分析。 [0078] 图28显示通过BIAcore分析，TF2与HSG(固定在传感器芯片上)和WI2的结合。 [0079] 图29显示TF2含有hMN-14的两个功能性结合位点，因为它能结合WI2的两个Fab分子。 [0080] 图30显示比较TF1、TF2和hMN-14IgG对CEA的亲合力的竞争性ELISA结果。 [0081] 图31显示在7天为一个周期，监测TF2在合并人血清中的稳定性结果。在浓度或双特异性结合活性方面都没有观察到可检测变化。 [0082] 图32显示注射99mTc-IMP-245的、用TF2预靶向的裸鼠体内造影。给雌性无胸腺裸鼠皮下(s.c.)注射1×107LS-174T肿瘤细胞/小鼠。一周后，平均肿瘤大小为0.105±0.068cm3。 给20只为一组的第一组小鼠每只注射80μg125I-TF2(500pmol，2μCi)，在给予TF2后16小时给 予99mTc-IMP-245(40μCi，92ng，50pmol)(图像中上面一排)。第二组小鼠仅给予99mTc-IMP- 245，没有TF2(图像中下面一排)。注射99mTc-IMP-245后1、4和24小时的图像显示出强的肿瘤 特异性信号，TF2定位于肿瘤(上面一排)。不同于肿瘤，在1小时时仅膀胱具有强烈信号，表 明从尿液中排出。在不存在TF2时仅观察到非特异性分布(下面一排)。数据表明，TF2对体内 应用来说是高度稳定的，能提供良好的肿瘤造影。 [0083] 发明详述 [0084] 在某些实施方案中，提供了新的a2b形式的稳定束缚二元复合物及其制备方法。一般而言，二元复合物是由非共价连接的同型二聚体结构(称为A或a2)与第二结构(称为B或 b)经位点特异性缔合而形成。所得a2b结构可经A与B间非共价、或优选共价相互作用(例如 二硫键)而稳定。A是由两个相同亚基构成，其中每个亚基都由前体与肽序列连接而组成，称 为二聚化和停靠结构域(DDD)，在优选实施方案中DDD来自依赖cAMP的蛋白激酶(PKA)。亚基 中所含的DDD结构域自发缔合形成稳定的同型二聚体，而这样的缔合又对肽序列产生具有 高亲和性的结合位点，称为锚定结构域(AD)，该AD在例如各种A-激酶锚定蛋白(AKAP)中存 在，而且在B中含有。因此，B由前体与AD连接而组成。 [0085] 通过AD肽与(DDD)2结合位点的相互作用，很容易地进行二元复合物的装配。DDD肽可插入到几乎任何多肽序列中或束缚到任何前体中，只要这样的衍生不干扰其二聚化、以 及与AD肽结合的能力。同样，AD肽可插入到几乎任何多肽序列中或束缚到任何前体中，只要 这样的衍生不干扰其与同型二聚体DDD结合位点的结合。该模块方法是高度通用的，可用于 将几乎任何A与任何B结合形成二元装配物，该二元装配物含有来自A的前体的两个亚基 (a2)和来自B的前体的一个亚基(b)。当A和B的前体都含抗体结构域，该结构域可与第二抗 体结构域缔合产生抗原结合位点(例如Fab或scFv)，则所得a2b复合物是双特异性和三价 的。在某些实施方案中，二元复合物可通过例如化学缀合而与效应物(例如配体或药物)连 接，与载体(例如葡聚糖或纳米粒)连接，或同时与效应物和载体连接，通过这样的修饰而具 有额外用途。 [0086] 因为二元复合物的稳定性基本取决于A中所含的DDD对B中所含的AD的结合亲和性，经平衡尺寸排阻HPLC分析估计，对于两种原型a2b结构来说，其亲和性不大于8nM(描述 于实施例5)，这两种原型是C端融合AD1构建体(h679-Fab-AD1，参见实施例3)至C端或N端融 合DDD1构建体(C-DDD1-Fab-hMN-14或N-DDD1-Fab-hMN-14，都参见实施例4)而形成，共价连 接a2b复合物中所含的A和B，将会防止各个亚基的不合要求的缔合，因而方便体内应用。为 了使二元复合物稳定，可将半胱氨酸残基引入DDD和AD序列的战略位置上，使DDD与AD间能 形成二硫键。可采用其它方法或策略，通过使a2和b交联而形成稳定复合物。例如，采用戊二 醛或PICUP方法，组成性亚基可以低特异性方式、以低效率，彼此共价连接。也可使用其它已 知的共价交联方法。 [0087] 定义 [0088] 在下面的描述中，使用各种术语，提供以下定义以便于理解本文所公开的内容。尚未明确定义的术语按其通常含义来使用。 [0089] 本文所用的术语未用数词具体限定时既包括单数形式也包括复数形式。 [0090] 本文所用的术语“和”和“或”可用于指与(conjunctive)或析取(disjunctive)。也就是说，这两个术语应当理解为等同于“和/或”，除非另有说明。 [0091] 二聚化和停靠结构域(dimerization and docking domain，DDD)是指允许含有DDD序列的两个同型单体自发形成二聚体的肽序列。所得同型二聚体在DDD序列内含有锚定 结构域的停靠位点。尽管示例性的DDD序列可得自依赖cAMP的蛋白激酶，但也可使用其它已 知DDD序列。 [0092] 锚定结构域(anchoring domain，AD)是对二聚化DDD序列具有结合亲和性的肽序列。尽管示例性AD序列可得自任何A-激酶锚定蛋白(AKAP)，但也可使用其它已知AD序列。 [0093] 术语前体按其物质的通常含义来使用，自该物质能形成更稳定而确定的产物或终产物。 [0094] 本文所用的结合分子、结合部分或靶向分子是可特异性结合靶分子、细胞、复合物和/或组织的任何分子。结合分子可包括但不限于抗体或其片段、类似物或模拟物、avimer、 适体或靶向肽。 [0095] 本文所述的抗体是指全长(即天然存在的或经标准免疫球蛋白基因片段重组方法而形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或免疫活性(即特异性结合)部分或免疫球蛋白 分子类似物，例如抗体片段。 [0096] 抗体片段是抗体部分，例如F(ab)2、F(ab′)2、Fab、Fv、sFv等。无论其结构如何，抗体片段所结合的抗原与完整抗体所识别的抗原相同。术语“抗体片段”也包括任何合成或基因工程蛋白质，其作用类似于抗体，是通过结合特异性抗原而形成复合物。例如，抗体片段包 括由可变区组成的分离的片段(例如由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段)、重组单链多肽 分子(其中轻链和重链可变区由肽接头连接(“scFv蛋白”))以及最小识别单元(由模拟超变 区的氨基酸残基组成)。 [0097] 效应物是产生所选结果的原子、分子或化合物。效应物可包括治疗药和/或诊断试剂。 [0098] 治疗药是可用于治疗疾病的原子、分子或化合物。治疗药的实例包括抗体、抗体片段、肽、药物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、螯合剂、硼化合物、光敏剂、染料和放射性同位素。所采用的其它示例性治疗药和方法公开于美 国专利公布号20050002945、20040018557、20030148409和20050014207，所述各专利通过引 用结合到本文中。 [0099] 诊断试剂是可用于诊断疾病的原子、分子或化合物。有用的诊断试剂包括但不限于放射性同位素、染料(例如带有生物素-链霉抗生物素复合物)、造影剂、荧光化合物或分 子以及用于磁共振成像(MRI)的增强剂(例如顺磁离子)。 [0100] 免疫缀合物是结合分子(例如抗体组分)与原子、分子或高级结构(例如与载体、治疗药或诊断试剂)的缀合物。 [0101] 裸抗体是未与任何其它药物或试剂缀合的抗体。 [0102] 载体是能与治疗药或诊断试剂缔合、以便将这些药物或试剂递送到靶细胞的原子、分子或高级结构。载体可包含脂质(例如能形成高级结构的两亲性脂质)、多糖(例如葡 聚糖)、肽、蛋白质或其它高级结构，例如胶束(micelle)、脂质体或纳米粒。 [0103] 本文所用的术语抗体融合蛋白是重组产生的抗原结合分子，其中具有相同或不同特异性的两个以上相同或不同scFv或抗体片段连接在一起。融合蛋白的价表示融合蛋白对 单个抗原或表位具有多少结合臂或位点；即单价、双价、三价或多价。抗体融合蛋白的多价 表明它在结合抗原时可利用多重相互作用，因此增加了结合抗原的亲合力。特异性表示抗 体融合蛋白能结合多少抗原或表位；即单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。使用这些 定义，天然抗体(例如IgG)是双价的，因为具有两个结合臂，但却是单特异性的，因为能结合 一个表位。单特异性的多价融合蛋白具有不止一个表位结合位点，但只结合一个这样的表 位，例如双链抗体具有能与同一抗原反应的两个结合位点。融合蛋白可包含单个抗体组分、 不同抗体组分的多价或多特异性组合、或者同一抗体组分的多个拷贝。融合蛋白还可包含 抗体或抗体片段以及治疗药。适用于这样的融合蛋白的治疗药的实例包括免疫调节剂(“抗 体-免疫调节剂融合蛋白”)和毒素(“抗体-毒素融合蛋白”)。一个优选的毒素包括核糖核酸 酶(RNA酶)，优选重组RNA酶。 [0104] 多特异性抗体是能同时结合不同结构的至少两个靶标(例如两种不同抗原、同一抗原的两个不同表位、或半抗原和/或抗原或表位)的抗体。 [0105] 多价抗体是能同时结合相同或不同结构的至少两个靶标的抗体。 [0106] 多特异性的多价抗体是具有不同特异性的不止一个结合位点的构建体。 [0107] 双特异性抗体是能同时结合不同结构的两个靶标的抗体。特别令人感兴趣的双特异性抗体和双特异性抗体片段具有至少一个臂(该臂能特异性结合例如B细胞、T细胞、骨髓 细胞、浆细胞和肥大细胞抗原或表位)以及至少一个其它臂(该臂能特异性结合携带治疗药 或诊断试剂的可寻靶缀合物)。 [0108] 本文所用的功能性蛋白质是具有生物活性的蛋白质。 [0109] 如果所给予的剂量具有生理上的意义时，就可以说是以“治疗有效量”给予抗体或免疫缀合物制剂或本文所述的组合物。当受体哺乳动物的生理状态因一种药物或试剂的存 在而导致可检测的变化时，该药物或试剂就具有生理上的意义。具体地讲，当抗体制剂的存 在产生了抗肿瘤反应或减轻自身免疫性疾病状态的体征和症状时，该制剂就具有生理上的 意义。生理意义的效果也可以是诱导受体哺乳动物的体液和/或细胞免疫应答，导致生长抑 制或靶细胞死亡。 [0110] 如果给予的组合物是受体患者可耐受的，就可以说该组合物是“药学上可接受的载体”。无菌磷酸缓冲盐溶液就是药学上可接受的载体的一个实例。其它合适载体是本领域 技术人员众所周知的。参见例如REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第19版(Mack Publishing Co.1995)和Goodman and Gilman的THEPHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS(Goodman等编著.Macmillan Publishing Co.，New York，1980和2001出版)。 [0111] 产生模块亚基的稳定束缚装配的方法 [0112] 本文所公开的方法和组合物提供产生模块亚基的稳定束缚装配的平台技术。一个实施方案涉及由两个确定组分(A和B)形成的稳定束缚二元复合物，这两个组分优选分别制 备。然而，在替代实施方案中，A和B可一起制备，例如通过用同时编码A和B的载体、或者用分 别编码A和B的两个不同载体转染单细胞系。当A和B都是Fab片段时，优选分别制备，否则，如 果同时制备的话，将会因轻链颠倒(scrambling)而产生不同产物。 [0113] 在某些实施方案中，由两个相同亚基(a2)组成的A与由一个亚基(b)组成的B结合，形成a2b构型的装配。A与B的缔合是位点特异性的，而且是自发的，因为A和B中分别构建的 DDD与AD序列间具有强烈的结合相互作用。A和B都可以是任何实体，连接DDD的A的前体可与 连接AD的B的前体不同或相同。在后一种情况下，所得a2b复合物(称为a3)由三个亚基组成， 每个亚基都含有相同前体，但都连接DDD和AD。 [0114] 要求保护的方法和组合物的模块特性允许将任何A与任何B组合。对可连接A和B或者掺入其中的前体类型基本上没有限制，只要它们不妨碍DDD二聚化或DDD与AD的结合。当 经重组工程而构建时，可在不同宿主细胞中独立制备(或者在如上所述的同一宿主细胞中 制备)、纯化并贮存A和B。然而，在装配之前，并非绝对需要对A和B进行纯化。在合适条件下， 可将含有A和B的细胞提取物或培养物直接混合，从而形成二元复合物，然后在氧化后通过 二硫键而稳定该复合物，再进行纯化。在某些应用中，最好在纯化之后、与A混合之前，将B与 效应物或载体缀合。或者，最好在纯化之后、与B混合之前，将A与效应物或载体缀合。最好在 混合之前，还用效应物或载体修饰A和B。另外，在某些应用中，最好将a2b复合物与效应物或 载体缀合。当在同一宿主细胞中制备A和B时，它们可自发装配成a2b复合物。 [0115] 优选的实施方案利用依赖cAMP的蛋白激酶(PKA)调节亚基与天然存在的A-激酶锚定蛋白(AKAP)锚定结构域之间的特定的蛋白质/蛋白质相互作用。PKA于1968年首次报道 (参见Walsh等，J.Biol.Chem.243：3763-65(1968.))。在二十世纪七十年代中期才阐明全酶 结构，是由两个催化亚基组成，这两个亚基通过调节(R)亚基二聚体维持无活性形式(参见 Corbin等，J.Biol.Chem.248：1813-21(1973))。发现两类R亚基(RI和RII)，各自具有α和β同 种型。已经分离出R亚基，是稳定二聚体，而且已经知道二聚化结构域是由前44个氨基端残 基组成(参见Hausken等，J.Biol.Chem.271：29016-22(1996))。作为广谱丝氨酸/苏氨酸激 酶的PKA的信号转导特异性，是通过全酶经停靠蛋白(称为A-激酶锚定蛋白(AKAP))区室化 而得到的(Scott等，J.Biol.Chem.265：21561-66(1990))。 [0116] AKAP(微管相关蛋白-2)首先于1984年完成表征(Lohmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.81：6723-27(1984))。迄今为止，已经鉴定出了超过50种结构不 同的AKAP，其物种范围从酵母到人类(参见Wong等，Nat Rev Mol Cell Biol.12：959-70 (2004))。AKAP的PKA锚定结构域是14-18个残基的两亲性螺旋(参见Carr等， J.Biol.Chem.266：14188-92(1991))。PKA锚定结构域的氨基酸序列在AKAP中是相当多变 的，对RII二聚体的结合亲和性范围为2-90nM，而对RI二聚体的结合亲和性低约100倍(参见 Alto等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100：4445-50(2003))。锚定结构域与RII二聚体上由RII 的氨基端前23个残基所形成的疏水表面相结合(Colledge等，Trends Cell Biol.6：216-21 (1999))。因此，RII二聚化结构域和AKAP结合结构域全都位于相同的44个氨基酸序列中。此 外，AKAP只与RII二聚体结合，而不与单体结合。这种相互作用的结构模型见图3。 [0117] 通过DDD和AD序列相互作用而形成的a2b或a3复合物可以经共价键稳定，以允许体内应用。可通过将半胱氨酸残基同时引入DDD和AD序列的战略位置上而达到这一目的(如 DDD2和AD2所示)，以便在a2与b间形成二硫键。或者，也可采用其它已知类型的共价交联。 [0118] 当通过重组工程产生二元复合物的两个组分(A和B)时，可在同一宿主细胞内合成它们，或更优选在两个不同的宿主细胞系内合成。指导A合成的表达载体含有目标多肽(A) 的DNA序列，该序列与PKA R-亚基的DDD(例如DDD1或DDD2)编码序列融合，其由RIα、RIβ、RII α、RIIβ或任何天然或合成的功能类似物的前30个或更多氨基酸组成。DDD可以直接与A的氨 基端或羧基端偶联，或者优选通过间隔区(其含有氨基酸残基的合适长度或组成)与A的氨 基端或羧基端偶联。或者，可将DDD放在融合蛋白内部，只要不影响DDD的结合活性和多肽融 合配偶体的所需活性。合成后，A/DDD融合蛋白将会与DDD1专一地形成稳定的同型二聚体 (a2)或者与DDD2主要形成稳定同型四聚体(a4)。 [0119] 指导B合成的第二表达盒可以是与指导A合成的相同载体，或者优选是在依赖性载体中；该表达盒含有目标多肽(B)的DNA序列，该序列与锚定结构域(AD)(例如AD1或AD2)编 码序列融合，AD可来源于任何AKAP蛋白或者公开于以下文献的天然或合成类似物：US 2003/0232420A1，所述专利文献通过引用结合到本文中。AD可以直接与B的氨基端或羧基端 偶联，或者优选通过间隔区(其含有氨基酸残基的合适长度或组成)与B的氨基端或羧基端 偶联。在二硫化物还原剂存在下，将B/AD2融合蛋白(b)与A/DDD2融合蛋白(主要是a4)混合， 产生由a2b组成的二元复合物，随后因添加二甲基亚砜(DMSO)而形成二硫键，使该复合物稳 定。 [0120] 亚基的模块特性允许任何DDD2-多肽二聚体与任何AD2-多肽组合。各种a4/a2和b模块亚基的贮液可以纯化产物形式或未纯化的细胞培养物上清液形式分别保存，随后视需要 进行混合，以得到各种a2b结构。 [0121] 又一个实施方案是，使用合适缀合化学方法，使效应物(例如药物或螯合剂)或载体(例如葡聚糖或纳米粒)与A或B(在其纯化后)连接。或者，可以对a2b结构(在其形成和纯 化后)进行这样的修饰，或者对A和B(在混合前)进行这样的修饰。 [0122] 来自重组抗体结合结构域的模块亚基的稳定束缚装配 [0123] 本文所公开的方法和组合物可用于提供基于重组抗体的多价结合结构，该结构可以是单特异性或双特异性的。例如，DDD2序列可以与单链FV融合，得到a4/b2形式的单特异性 结合结构。更通常的是，DDD序列可以与抗体可变区融合，其可与互补抗体可变区缔合，形成 抗原结合位点。例如，DDD1或DDD2序列可与含有VH区和CH1区的抗体序列融合(Fd/DDD)，或 可与VL区和CL区融合(L/DDD)。Fd/DDD或L/DDD再可分别与互补L或Fd缔合，形成Fab/DDD，然 后形成Fab/DDD1二聚体或Fab/DDD2四聚体和/或二聚体。 [0124] 同样，类似于AD2，AD序列可与单链Fv融合，或更常见的是与含有VH区和CH1区的抗体序列融合(Fd/AD2)，当与关联L-链配对时，其形成Fab/AD2。或者，类似于AD2，AD序列可与 含有VL区和CL区的抗体序列融合，当与关联Fd链配对时，其形成Fab/AD2。将Fab/DDD2四聚 体/二聚体与Fab/AD2混合，然后经还原和氧化，产生三价结合结构的稳定束缚装配，该结构 可以是单特异性的(a3)或双特异性的(a2b)。 [0125] 结合结构的VH区和VL区可来自“人源化”单克隆抗体或来自人抗体。或者，VH和/或VL区可包含来自从组合免疫球蛋白文库中分离得到的人抗体片段序列。参见例如Barbas 等，Methods：Acompanion to Methods in Enzymology 2：119(1991)和Winter等， Ann.Rev.Immunol.12：433(1994)。可从例如STRATAGENE克隆系统(LaJolla，Calif.)得到克 隆载体和表达载体，用于产生人免疫球蛋白噬菌体文库。 [0126] 人抗体VH或VL序列可来自小鼠产生的人单克隆抗体。这类抗体得自转基因小鼠，该类小鼠已经“工程改造”而在响应抗原攻击时产生特定人抗体。在该技术中，将人重链和轻 链基因座元件引入源自胚胎干细胞系的小鼠品系中，该类胚胎干细胞系含有定向破坏的内 源重链和轻链基因座。转基因小鼠可合成对人抗原具有特异性的人抗体，而且小鼠可用于 产生分泌人抗体的杂交瘤。从转基因小鼠得到人抗体的方法参见Green等，Nature Genet.7：13(1994)，Lonberg等，Nature 368：856(1994)和Taylor等，Int.Immun.6：579 (1994)。 [0127] 含有抗体片段的重组融合蛋白的通用制备方法 [0128] 可以通过本领域众所周知的技术，得到编码能识别特定表位的抗体片段的核酸序列。例如，可使用分泌具有所需特异性的抗体的杂交瘤，得到抗体编码DNA，可用PCR或传统 cDNA克隆技术等已知技术来制备这样的DNA。或者，可以构建Fab′表达文库或抗体噬菌体展 示文库，以筛选具有所需特异性的抗体片段。 [0129] 然后，可将编码抗体片段的核酸与编码DDD或AD的核酸直接连接，或通过编码肽间隔区的序列间接连接。产生编码这类融合蛋白的核酸序列的方法是本领域众所周知的，而 且在以下实施例中有进一步讨论。 [0130] 在另一个实施方案中，可将额外氨基酸残基添加在由A/DDD或B/AD组成的模块亚基的N端或C端，其中准确的融合位点取决于DDD或AD是否与N端或C端(或内部位置)连接。额 外氨基酸残基可包括肽标记、信号肽、细胞因子、酶(例如前体药物活化酶)、激素、毒素、肽 药物、膜相互作用肽或其它功能性蛋白。 [0131] 用所需宿主细胞制备重组蛋白的方法是本领域众所周知的。为了便于纯化，稳定束缚结构可含有合适肽标记，例如FLAG序列或多聚组氨酸序列，以便用相应的亲和柱进行 纯化。 [0132] 适于表达稳定束缚结构组成性亚基的示例性表达系统是pdHL2载体，该载体具有可扩增的鼠dhfr基因，允许通过甲氨蝶呤处理而进行选择和扩增。参见Gillies等， J.Immunol.Methods 125：191(1989)。pdHL2载体提供两个基因的依赖型表达，其由两个金 属硫蛋白(metallothionine)启动子和IgH增强子独立控制。 [0133] 用于稳定束缚结构组成性亚基表达的合适宿主细胞或细胞系是本领域技术人员已知的。采用人宿主细胞，使得任何表达的分子可经人糖基化模式而修饰。然而，对于本文 所公开的方法来说，这并非表示人宿主细胞是必需的或优选的。 [0134] 正如所说明的，可通过电穿孔，用线状pdHL2载体转染鼠骨髓瘤细胞系(例如Sp2/0)，该载体编码稳定束缚结构的组成性亚基。将细胞在含0.05-0.1μM甲氨蝶呤的培养基中 培养，转染后48小时进行选择。再通过逐步增加甲氨蝶呤的浓度至5μM，扩增所选克隆。 [0135] 稳定束缚结构的缀合物 [0136] 可将额外部分与如上所述的稳定束缚结构缀合。例如，药物、毒素、放射性化合物、酶、激素、细胞毒性蛋白、螯合物、细胞因子和其它功能性试剂，均可与稳定束缚结构的一个 或多个模块亚基缀合。可通过例如共价连接亚基侧链上含有氨基、羧基、巯基或羟基的氨基 酸残基，来进行缀合。各种常规接头可用于该目的，例如二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、双(羟 基琥珀酰亚胺)酯、碳二亚胺、马来酰亚胺-羟基琥珀酰亚胺酯、戊二醛等。药物或试剂与稳 定束缚结构的缀合优选不显著影响未修饰结构中所含的各亚基的活性。在形成稳定束缚结 构之前，a2或b都可用于化学缀合。a2和b也都可在混合之前缀合。也可在形成稳定束缚a2b结 构之后进行缀合。另外，细胞毒剂可先与聚合物载体偶联，然后再与稳定束缚结构缀合。对 于该方法，参见Ryser等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：3867-3870，1978，U.S.4,699,784和 U.S.4,046,722，所述文献通过引用结合到本文中。 [0137] 可通过用于将抗体与以下载体连接的已知方法来制备本文所述的缀合物：脂质、碳水化合物、蛋白质、放射性核素或其它原子和分子。例如，本文所述的稳定束缚结构可与 本文所述的一种或多种载体(例如脂质、聚合物、脂质体、胶束或纳米粒)连接，形成缀合物， 再将其通过共价、非共价或其它方式与治疗药或诊断试剂结合。或者，本文所述的任何稳定 束缚结构可以直接与本文所述的一种或多种治疗药或诊断试剂缀合。 [0138] 例如，稳定束缚结构可以用131I进行放射性标记并与脂质缀合，使得所得缀合物形成脂质体。该脂质体可掺入到一种或多种治疗药(例如药物，例如FUdR-dO)或诊断试剂中。 或者，除了载体之外，稳定束缚结构还可与131I(例如在酪氨酸残基上)和药物(例如在赖氨 酸残基的ε氨基上)缀合，然后将载体与额外治疗药或诊断试剂结合。治疗药和诊断试剂可 与稳定束缚结构的一个或多个亚基共价缔合。 [0139] 脂质体和胶束的形成是本领域已知的。参见例如Wrobel和Collins，Biochimica et Biophysica Acta(1995)，1235：296-304；Lundberg等，J.Pharm.Pharmacol.(1999)，51： 1099-1105；Lundberg等，Int.J.Pharm.(2000)，205：101-108；Lundberg，J.Pharm.Sci. (1994)，83：72-75；Xu等，Molec.Cancer Ther.(2002)，1：337-346；Torchilin等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.，U.S.A.(2003)，100：6039-6044；U.S.5,565,215；U.S.6,379,698；和 U.S.2003/0082154。 [0140] 也已描述了由聚合物、二氧化硅或金属制成的纳米粒或纳米囊，用于药物递送或造影。参见例如West等，Applications ofNanotechnology to Biotechnology(2000)，11： 215-217；U.S.5,620,708；U.S.5,702,727；和U.S.6,530,944。已经描述了将抗体或结合分 子与脂质体缀合，形成靶向载体，用于治疗药或诊断试剂。参见例如Bendas，Biodrugs (2001)，15：215-224；Xu等，Mol.Cancer Ther(2002)，1：337-346；Torchilin等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.(2003)，100：6039-6044；Bally等，J.Liposome Res.(1998)，8：299- 335；Lundberg，Int.J.Pharm.(1994)，109：73-81；Lundberg，J.Pharm.Pharmacol.(1997)， 49：16-21；Lundberg，Anti-cancer Drug Design(1998)，13：453-461。另见U.S.6,306,393、 美国专利申请顺序号10/350,096、美国专利申请顺序号09/590,284和美国专利申请顺序号 60/138,284(1999年6月9日申请)。所有这些参考文献都通过引用结合到本文中。 [0141] 可方便地使用各种诊断试剂和治疗药，以形成稳定束缚结构的缀合物，或者可将各种诊断试剂和治疗药与半抗原连接，该半抗原可与稳定束缚结构上的识别位点结合。诊 断试剂可包括放射性同位素、MRI增强剂或超声成像的造影剂以及荧光化合物。许多合适造 影剂是本领域已知的，它们与蛋白质或肽的连接方法也是已知的(参见例如美国专利5, 021,236和4,472,509，这两篇文献都通过引用结合到本文中)。某些连接方法包括使用金属 螯合物(例如有机螯合剂，例如DTPA)与蛋白质或肽连接(美国专利4,472,509)。 [0142] 为了将放射性金属或顺磁离子加载到稳定束缚结构上，可能需要先将其与载体反应，使已经结合在载体上的多拷贝螯合基团与放射性金属或顺磁离子结合。这样的载体可 以是具有侧基的聚赖氨酸、多糖或者经衍生的或可衍生的聚合物，其侧基上可结合螯合基 团，例如1，2-乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双缩氨 基硫脲、聚肟等，已知可用于该目的。用标准化学方法，将含有螯合物的载体与稳定束缚结 构偶联，其方式是尽量减少聚集和损失免疫反应性。 [0143] 可用于制备所述缀合物的其它更常用的方法和试剂公开于U.S.4,824,659，所述专利通过引用全部结合到本文中。特别有用的金属-螯合物组合包括2-苄基-DTPA及其一甲 基和环己基类似物，与诊断用同位素一起使用，其通常的能量范围为60-4,000keV。某些有 用的诊断用核素可包括18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94Tc、94mTc、99mTc或111In。 与非放射性金属(例如锰、铁和钆)络合的相同螯合物可用于MRI，当单独与本文所述的稳定 束缚结构和载体一起使用时。大环螯合物(例如NOTA、DOTA和TETA)可与各种金属和放射性 金属一起使用，尤其是镓、钇和铜的放射性核素。通过针对目标金属来定制环的大小，可以 非常稳定地制备这样的金属-螯合复合物。可使用其它环-型螯合物，例如用于络合223Ra的 大环聚醚。 [0144] 治疗药包括例如化疗药物，例如长春花属生物碱、蒽环类、epidophyllotoxin、紫杉烷类、抗代谢物、烷化剂、抗生素、Cox-2抑制剂、抗有丝分裂药、抗血管生成药和促凋亡 剂、尤其是多柔比星、甲氨蝶呤、泰素、CPT-11、喜树生物碱类(camptothecans)以及其它这 些类型和其它类型的抗癌药等。其它癌症化疗药物包括氮芥类、磺酸烷基酯类、亚硝基脲 类、三氮烯类、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配位络合物、激素等。合适的化疗药 参见REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第19版(MackPublishing Co.1995)，和 Goodman and Gilman的THEPHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS，第7版(MacMillan Publishing Co.1985)，以及这些出版物的修订版。其它合适的化疗药例如实验性药物是本 领域技术人员已知的，可采用本领域已知方法与本文所述的稳定束缚结构缀合。 [0145] 另一类治疗药由以下放射性核素组成：发射α-粒子的放射性核素(例如212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra、225Ac)、发射β-粒子的放射性核素(例如32P、33P、47Sc、67Cu、67Ga、89Sr、90y、111Ag、125I、131I、142Pr、153S 、161Tb、166Ho、166Dy、177Lu、186Re、188Re、189Re)，或发射俄歇电子的放射性核素(例如111In、125I、67Ga、191Os、193mPt、195Pt、195mHg)。可采用所述方法，将稳定束缚结构用一种或多种上述放射性核素标记，用于诊断试剂。 [0146] 含有可检测标记(例如荧光分子)或细胞毒剂(例如放射性碘)的合适肽，可与稳定束缚结构共价、非共价或其它方式缔合。例如，通过将光敏剂或染料掺入到稳定束缚结构 上，可得到治疗上有用的缀合物。已经使用荧光组合物(例如荧光染料)和对可见光敏感的 其它发色团或染料(例如卟啉)来检测和治疗病变，即用合适的光照射病变部位。在治疗中， 这被称为光辐射、光疗或光动力疗法。参见Jori等(编著)，PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHERDISEASES(Libreria Progetto 1985)；van den Bergh，Chem.Britain (1986)，22：430。此外，已将单克隆抗体与光敏染料偶联，用于进行光疗。参见Mew等， J.Immunol.(1983)，130：1473；同上，Cancer Res.(1985)，45：4380；Oseroff等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)，83：8744；作者同上(idem.)，Photochem.Photobiol. (1987)，46：83；Hasan等，Prog.Clin.Biol.Res.(1989)，288：471；Tatsuta等，Lasers Surg.Med.(1989)，9：422；Pelegrin等，Cancer(1991)，67：2529。也包括内窥镜或腹腔镜应 用。检测和治疗的内窥镜方法参见U.S.4,932,412、U.S.5,525,338、U.S.5,716,595、U.S.5, 736,119、U.S.5,922,302、U.S.6,096,289和U.S.6,387,350，所述专利通过引用全部结合到 本文中。 [0147] 治疗药 [0148] 药物组合物 [0149] 在某些实施方案中，可将稳定束缚结构和/或一种或多种其它治疗药给予患者，例如癌症患者。这样的药物可以药物组合物的形式给予。一般来说，需要制备基本上不含对人 或动物有害的杂质的组合物。本领域技术人员应当知道，可通过包括口服或胃肠外(例如静 脉内)在内的不同途径将药物组合物给予患者。 [0150] 在某些实施方案中，必须给予患者有效量的治疗药。“有效量”是药物产生所需效果的用量。有效量取决于例如药物的功效和所需效果。例如，治疗增生性疾病(例如黄斑变 性或子宫内膜异位症)可能需要较少量的抗血管生成药，相比之下，癌症治疗则需要更大用 量，以减少或消除实体瘤，或者防止或减少其转移。可用本领域众所周知的方法，确定具体 药物的有效量，用于特定目的。 [0151] 化疗药 [0152] 在某些实施方案中，可给予化疗药。所用的抗癌化疗药包括但不限于5-氟尿嘧啶、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、环磷酰胺、放线菌素D、柔红霉 素、多柔比星、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、法尼基(farnesyl)-蛋白转移酶抑制 剂、吉西他滨、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、甲氨蝶呤、丝裂霉素、诺维本、硝基脲、普卡霉素 (plicomycin)、丙卡巴肼、雷洛昔芬、他莫昔芬、泰素、temazolomide(DTIC含水形式)、反铂、 长春碱和甲氨蝶呤、长春新碱或上述药物的任何类似物或衍生变异体。所采用的针对感染 性生物体的化疗药包括但不限于阿昔洛韦、阿苯达唑、金刚烷胺、阿米卡星、阿莫西林、两性 霉素B、氨苄西林、氨曲南、阿奇霉素、杆菌肽、复方新诺明、巴特芬 、联苯苄唑、羧苄西林、 卡泊芬净、头孢克洛、头孢唑林、头孢菌素类、头孢吡肟、头孢曲松、头孢噻肟、氯霉素、西多 福韦、Cipro 盐酸环丙沙星制剂、克拉霉素、克拉维酸、克霉唑、氯唑西林、多西环素、益康 唑、erythrocycline、红霉素、甲硝唑、氟康唑、氟胞嘧啶、膦甲酸、呋喃唑酮、更昔洛韦、庆大霉素、亚胺培南、异烟肼、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、林可霉素、利奈唑胺、美罗培南、咪康唑、米诺环素、萘替芬、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥因、制霉菌素、奥塞米韦、苯唑西 林、巴龙霉素、青霉素、喷他脒、哌拉西林-三唑巴坦、利福布汀、利福平、金刚乙胺、链霉素、磺胺甲 唑、柳氮磺吡啶、四环素、噻康唑、妥布霉素、托西拉酯、托萘酯、甲氧苄啶-磺胺甲 唑、伐昔洛韦、万古霉素、zanamir和zithromycin。 [0153] 化疗药及其给药方法、剂量等是本领域技术人员众所周知的(参见例如“Physicians Desk Reference”，Goodman and Gilman的“The Pharmacological Basis of Therapeutics”和“Remington′sPharmaceutical Sciences”，所述文献的相关部分通过引 用结合到本文中)。剂量上的某些变动取决于所治疗患者的情况。负责给药的人员在任何情 况下都要为每个患者确定合适剂量。 [0154] 激素 [0155] 皮质类固醇激素可提高其它化学治疗药的有效性，因此，它们经常用于联合治疗。泼尼松和地塞米松是皮质类固醇激素药的实例。己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕 酮等孕酮类药，已经用于子宫内膜癌和乳癌。己烯雌酚和炔雌醇等雌激素药，已经用于前列 腺癌等癌症。他莫昔芬等抗雌激素药已经用于乳癌等癌症。丙酸睾酮和氟甲睾酮等雄激素 药也已用于治疗乳癌。 [0156] 血管生成抑制剂 [0157] 在某些实施方案中，可采用例如以下的抗血管生成药：血管生长抑素、baculostatin、人血管能抑素(canstatin)、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体、抗PlGF肽和抗体、 抗血管生长因子抗体、抗Flk-1抗体、抗Fit-1抗体和肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶 原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素-12、IP-10、Gro-β、血小板应答蛋 白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、carboxiamidotriazole、CM101、马立马司他、戊聚 糖多聚硫酸酯、促血管生成素-2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺 胺、沙利度胺、己酮可可碱、染料木碱、TNP-470、内皮生长抑素、紫杉醇、accutin、血管生长 抑素、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素。 [0158] 免疫调节剂 [0159] 本文所用的术语“免疫调节剂”包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素和造血因子，例如白介素、集落刺激因子、干扰素(例如干扰素-α、-β和-γ)和称为“S1因子”的干细胞生长因子。合适的免疫调节剂部分的实例包括IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干 扰素-γ、TNF-α等。 [0160] 术语“细胞因子”是由一个细胞群体释放、并作为细胞间介质而作用于另一细胞的蛋白质或肽的通称。本文更广泛采用的细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子、生长因子 和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素，例如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛 生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，例 如滤泡刺激激素(FSH)、甲状腺刺激激素(TSH)和黄体激素(LH)；肝生长因子；前列腺素、成 纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳激素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；米 勒管抑制物(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素 (activin)；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，例如NGF-β； 血小板-生长因子；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红 细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素，例如干扰素-α、β和γ； 集落刺激因子(CSF)，例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细 胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、kit-配体或FLT-3、血管生长抑素、血小板应答蛋白、内皮生长抑素、肿 瘤坏死因子和LT。本文所用的术语细胞因子包括天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质 以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。 [0161] 趋化因子通常作为化学引诱物起作用，以将免疫效应细胞募集到趋化因子表达的位点上。趋化因子包括但不限于RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10。技术人员将会知道，已知某些细胞因子也具有化学引诱效果，并且也可归类于该术语趋化因子之内。同样，术语 免疫调节剂和细胞因子在其各自成员中是重叠的。 [0162] 放射性同位素治疗和放免治疗 [0163] 在某些实施方案中，肽和/或蛋白质可用于放射性核素治疗或放免治疗方法(参见例如Govindan等，2005，Technology in CancerResearch&Treatment，4：375-91；Sharkey和 Goldenberg，2005，J.Nucl.Med.46：115S-127S；Goldenberg等(J Clin Oncol 2006；24： 823-834)，“Antibody Pre-targeting Advances Cancer Radioimmunodetection andRadioimmunotherapy”，所述各文献通过引用结合到本文中)。在具体的实施方案中，稳 定束缚结构可直接用放射性同位素标记，然后给予患者。在替代实施方案中，可以如上所述 的预靶向方法，采用带有放射性标记的半抗原性肽或配体给予放射性同位素，并在给予双 特异性稳定束缚结构(其定位于患病组织表达增加的位点上)之后注射。 [0164] 用于治疗患病组织的放射性同位素包括但不限于111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、 189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、93Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au和211Pb。治疗性放射性核素优选衰变能范围为20-6,000keV，对于俄歇发射体的优选 范围为60-200keV，对于β发射体为100-2,500keV，而对于α发射体为4,000-6,000keV。有用 的β粒子发射放射性核素的最大衰变能优选为20-5,000keV，更优选100-4,000keV，最优选 500-2,500keV。还优选基本衰变俄歇发射粒子的放射性核素。例如，Co-58、Ga-67、Br-80m、 Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。有用的β粒子发射放射性核素的衰变能优选＜1,000keV，更优选＜100keV，最优选＜70keV。还优选基本 衰变α粒子的放射性核素。这样的放射性核素包括但不限于：Dy-152、At-211、Bi-212、Ra- 223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。有用的α粒子发射放射性核素的衰变能优选为2,000-10,000keV，更优选3,000-8,000keV，最优选4,000-7, 000keV。 [0165] 例如，67Cu因其半衰期为61.5小时和充足供应β粒子和γ射线，被认为是用于放免治疗的更有希望的放射性同位素，可采用螯合剂对溴乙酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸(TETA) 将67Cu与蛋白质或肽缀合在一起。或者，使用二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，可将发射高能β粒 子的90Y与肽、抗体、融合蛋白或其片段缀合在一起。 [0166] 额外的潜在放射性同位素包括13C、13N 15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、169Yb等。 [0167] 在另一个实施方案中，可使用辐射敏化剂。添加辐射敏化剂可导致功效增强。辐射敏化剂参见D.M.Goldenberg(主编)，CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES， CRCPress(1995)，所述文献通过引用全部结合到本文中。 [0168] 通常以类似方式影响具有加载硼附加物的载体、用于热中子活化治疗的稳定束缚结构。然而，有利的是可以等待下去，直到非靶向免疫缀合物清除后再进行中子辐射。使用 能结合配体的抗体可加速清除。参见美国专利第4,624,846号对该通用原理的描述。例如， 硼附加物例如碳硼烷，可以与抗体连接。可以用垂悬侧链上的羧基官能团，制备碳硼烷，正 如本领域众所周知的。可通过碳硼烷的羧基活化并与载体上的胺缩合，使碳硼烷与载体(例 如氨基葡聚糖)连接起来。然后将中间缀合物与抗体缀合。给予缀合物之后，通过热中子辐 射活化硼附加物并转化成放射性原子，其通过α-发射衰变，产生高毒性、短射程效果。 [0169] 药盒 [0170] 各种实施方案可涉及含有适于治疗或诊断患者患病组织的组分的药盒。示例性的药盒可含有至少一种稳定束缚结构。如果含有给药组分的组合物并非配制成经消化道(例 如口服)给予，则可包括能够通过某些其它途径递送药盒组分的装置。一类装置(例如用于 胃肠外给药)是注射器，用于将组合物注射到患者体内。也可使用吸入装置。 [0171] 可将药盒组分包装在一起，或分开包装在两个以上单独容器中。在某些实施方案中，容器可以是含有适于重配的无菌冻干组合物制剂的小瓶(管)。药盒也可含有适于重配 和/或其它试剂稀释的一种或多种缓冲剂。可使用的其它容器包括但不限于袋、盘、盒、管 等。可将药盒组分无菌包装并保存在容器内。可包括的另一部分是给药盒使用人员的使用 说明书。 [0172] 配制和给药 [0173] 还可配制稳定束缚结构(包括其缀合物)，以得到包含一种或多种药学上合适的赋形剂、一种或多种额外成分或它们的某些组合的组合物。这可通过已知方法来完成：即制备 药学上有用的剂量，其中活性成分(即稳定束缚结构或缀合物)与混合物中的一种或多种药 学上合适的赋形剂混合在一起。无菌磷酸缓冲盐溶液就是药学上合适的赋形剂的一个实 例。其它合适赋形剂是本领域技术人员众所周知的。参见例如Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMSAND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5版(Lea & Febiger 1990)，和Gennaro(主 编)，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990) 及其修订版。 [0174] 给予本文所述的组合物的优选途径是胃肠外注射。在胃肠外给药中，组合物可与药学上可接受的赋形剂一起配制成单位剂量注射用形式，例如溶液剂、混悬剂或乳剂。这类 赋形剂是固有无毒、无治疗性的。这类赋形剂的实例是盐水、林格液、葡萄糖溶液和Hank液。 也可使用非水赋形剂例如固定油和油酸乙酯。优选的赋形剂是5％葡萄糖盐水。赋形剂可含 有少量添加剂，例如增加等渗性和化学稳定性的物质，包括缓冲剂和防腐剂。也包括其它给 药方法(包括口服给药)。 [0175] 所配制的包含稳定束缚结构的组合物可用于静脉内给药，通过例如快速注射或连续输注。注射用组合物可呈单位剂型，例如装在安瓿中，或者装在多剂量容器中并添加防腐 剂。组合物也可采用在油或含水溶媒中的混悬剂、溶液剂或乳剂的形式，并且可含有配方剂 (formulatory agent)，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，组合物可呈粉剂形式，用于 在使用前用合适溶媒(例如无菌无热原水)配制。 [0176] 组合物可以溶液剂形式给予。溶液剂的pH应该在pH5-9.5范围内，优选在pH6.5-7.5范围内。其制剂应该在具有合适药学上可接受的缓冲剂的溶液中，所述缓冲剂例如磷酸 盐、三(羟甲基)氨基甲烷-HCl或柠檬酸盐等。缓冲剂浓度应当在1-100mM范围内。所配制的 溶液也可含盐，例如氯化钠或氯化钾，浓度为50-150mM。也可包含有效量的稳定剂，例如甘 油、白蛋白、球蛋白、去垢剂、明胶、鱼精蛋白或鱼精蛋白的盐。所配制的组合物的系统给药 通常为每2-3天一次，或每周一次，如果采用抗体人源化形式作为稳定束缚结构的模板的 话。或者，可采用每日给药。通常给药是通过肌内注射或血管内输注。 [0177] 可通过哺乳动物皮下或其它胃肠外途径给予组合物。此外，可通过连续输注或者单次或多次快速推注方式给药。可用于抗体或免疫缀合物的方法适用于本文所述的组合 物。一般而言，给予免疫缀合物、融合蛋白或裸抗体的人用剂量将取决于以下因素：患者年 龄、体重、身高、性别、基本身体状况和先前的医疗史。通常最好给予受体的活性成分剂量的 范围约为1mg/kg-20mg/kg(单次静脉内输注)，尽管视情况而定，也可给予更低或更高剂量。 按照需要，该剂量可重复，例如每周一次、共4-10周，优选每周一次、共8周，更优选每周一 次、共4周。也可给予更少次数，例如每两周一次、共数月。可通过不同的胃肠外途径给药，并 适当调整剂量和时间表。 [0178] 用于控制免疫缀合物或抗体的作用持续时间的药学方法，适用于所配制的本文所述的组合物。可通过使用生物相容的聚合物以络合或吸收免疫缀合物或裸抗体，达到控释 制剂，所述聚合物例如乙烯醋酸乙烯共聚物基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酐共聚物基 质。参见Sherwood等，Bio/Technology(1992)，10：1446。免疫缀合物或抗体从这类基质中释 放的速率取决于免疫缀合物或抗体的分子量、免疫缀合物的数量、基质内的抗体和分散颗 粒的大小。参见Saltzman等，Biophys.J(1989)，55：163；Sherwood等，出处同上。其它固体剂 型参见Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMSAND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5版(Lea & Febiger 1990)，和Gennaro(主编)，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版 (Mack Publishing Company 1990)及其修订版。 [0179] 为了治疗目的，将组合物以治疗有效量给予哺乳动物。适于本文所公开的治疗和诊断方法的患者通常是人患者，尽管也包括非人类动物患者。 [0180] 本文所公开的稳定束缚结构在治疗自身免疫病的方法中是特别有用的，公开于待审的美国专利申请顺序号09/590,284(2000年6月9日申请，发明名称为“Immunotherapy of Autoimmune Disordersusing Antibodies that Target B-Cells”，所述文献通过引用全 部结合到本文中。含有所述结合结构的组合物优选经静脉内或肌内给予，剂量为20- 5000mg。也可经鼻内或其它非胃肠外途径给予。也可通过微球体、脂质体或放置在特定组织 (包括血液)中的其它微粒(microparticulate)给药系统给予组合物。 [0181] 可通过气溶胶给予组合物，以达到肺局部给予。可使用含水气溶胶或非水(例如氟代烃抛射剂)混悬剂。超声喷雾器优选用于制备气溶胶，以尽量减少暴露组合物中的稳定束 缚结构，从而降低剪切力，该剪切力能导致降解和活性损失。 [0182] 一般而言，给药剂量将取决于诸如以下的因素：患者年龄、体重、身高、性别、基本身体状况和先前的医疗史。优选将稳定束缚结构的饱和剂量给予患者。 [0183] 通常最好给予受体剂量的范围约为50-500毫克的稳定束缚结构，尽管视情况而定，也可给予更低或更高剂量。剂量实例包括20-1500毫克蛋白/剂，20-500毫克蛋白/剂， 20-100毫克蛋白/剂，20-1000毫克蛋白/剂，100-1500毫克蛋白/剂。在组合物包含放射性核 素的实施方案中，剂量可用毫居里(millicurries)度量。就90Y而论，剂量可介于15-40mCi、 10-30mCi、20-30mCi或10-20mCi之间。 [0184] 与放射性核素连接的稳定束缚结构对微生物治疗特别有效。当已测定到稳定束缚结构定位在患者体内的一个或多个感染部位之后，注射更高剂量的标记组合物，通常为 20mCi-150mCi/剂(对于131I)，5mCi-30mCi/剂(对于90Y)，或5mCi-20mCi/剂(对于186Re)，都以 70kg患者体重计。注射可以是静脉内、动脉内、淋巴管内、鞘内或腔内(即胃肠外)并可重复。 对于某些治疗来说，最好给予多次、分次剂量，从而提供更高的微生物毒性剂量，而对正常 组织的辐射方面通常不引起比例增加。 [0185] 可在给予组合物之前、期间或之后，给予未与稳定束缚结构化学连接的如下药物：化疗药、抗微生物药、细胞因子、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激 因子(GM-CSF)、红细胞生成素、血小板生成素等。或者，这些药物可与稳定束缚结构连接。 [0186] a2b形式的稳定束缚结构是特别合适的预靶向剂。示例性结构由两个scFv或Fab亚基(a2)和一个scFv或Fab亚基(b)组成，其中a2双价结合靶组织或细胞，而b结合半抗原。对于 治疗方法，先将这种双特异性三价结构给予患者，任选再给予清除剂，最后给予诊断试剂或 治疗药，所述诊断试剂中半抗原与功能性试剂(例如可检测标记)结合。技术人员将会知道， 使用稳定束缚结构，也可采用双特异性抗体的其它已知方法。这些诊断和治疗方法可用于 几乎任何情况下，其中已经使用基于抗体的药剂进行诊断或治疗。 [0187] 治疗和诊断用途：不包括预靶向的应用 [0188] 稳定束缚结构(包括其缀合物)适用于采用抗体或免疫缀合物的各种治疗和诊断用途，不需要预靶向。例如，三价结构可作为“裸”构建体用于治疗，即在所述结构未与额外 功能性试剂缀合的实施方案中，以与使用裸抗体相同的方式进行治疗。或者，稳定束缚结构 可用一种或多种功能性试剂衍生，以便用于诊断或治疗用途。额外试剂可与如上所述的稳 定束缚结构共价连接。 [0189] 也包括使用放射性和非放射性诊断试剂，所述试剂与稳定束缚结构连接。合适的非放射性诊断试剂是那些用于磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)或超声的试剂。MRI 试剂包括例如非放射性金属(例如例如锰、铁和钆)，它们可与合适的螯合物(例如2-苄基- DTPA及其一甲基和环己基类似物)络合。参见美国专利申请顺序号09/921,290(2001年10月 10日申请)，所述专利通过引用全部结合到本文中。 [0190] 稳定束缚结构可由用于诊断造影的放射性同位素进行标记。合适的放射性同位素可包括能量范围为60-4,000keV的同位素，或更具体地讲，包括18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、 67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、45Ti、111In、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、177Lu、32P、188Re等或其组合。参见例如美国专利申请，发明名称为“Labeling Targeting Agents with Gallium-68”-发明人为G.L Griffiths和WJ.McBride，以及美国临时申请第60/342,104号， 其中公开了正电子发射体，例如18F、68Ga、94mTc等，用于造影目的；所述文献通过引用全部结 合到本文中)。可以通过例如单光子发射计算机断层扫描(SPECT)或正电子发射断层扫描 (PET)进行检测。其应用也可用于手术中诊断，以鉴定隐蔽的肿瘤。 [0191] 在另一实施方案中，稳定束缚结构可以用一种或多种放射性同位素进行标记，用32 32 47 67 于杀伤肿瘤或其它快速分裂的细胞，所述同位素包括β-发射体(例如 P、P、Sc、Cu、 67Ga、89Sr、90Y、111Ag、135I、111I、142Pr、153Sm、111Tb、166Ho、166Dy、177Lu、186Re、188Re、189Re)，俄歇电子发射体(例如111In、125I、67Ga、111Os、193mPt、195mPt、195mHg)，α-发射体(例如212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra、225Ac)或其组合。 [0192] 稳定束缚结构可用于MRI，即通过与一种或多种造影增强剂连接，所述增强剂可包括选自以下金属的络合物：铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕 (III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)。同样，稳定束缚结构可用于超声成像，即通过与目前市场上销售的一种或多种造影增强剂连接。美 国专利第6,331,175号描述了MRI技术以及与MRI增强剂缀合的抗体制剂，所述专利通过引 用全部结合到本文中。 [0193] 功能性蛋白质(例如毒素)可以几种方式存在于稳定束缚结构中。例如，功能性蛋白质可作为二元复合物组分的前体，即通过与DDD2或AD2融合，然后将其与靶向实体(分别 由例如Fab/AD2或Fab/DDD2组成)结合。或者，功能性蛋白质可以与靶向结构融合，作为A的 前体，而且所得A任选与合适的B配对。可用于该目的的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋 白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋 白、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。(参见例如Pastan.等，Cell(1986)，47： 641，以及Goldenberg，CA-A Cancer Journal forClinicians(1994)，44：43。适用于本文的 额外毒素是本领域技术人员已知的，公开于U.S.6,077,499，所述专利通过引用全部结合到 本文中。其它功能性目标蛋白包括各种细胞因子、溶血栓剂、酶和荧光蛋白质。 [0194] 也提供治疗患者肿瘤的方法，即通过给予患者如上所述的“裸”稳定束缚结合结构，其中至少一个抗原结合位点与选自以下的抗原结合：碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、A3、A33抗 体特异性抗原、Ba 733、BrE3-抗原、CA125、癌胚抗原(CEACAM5)、CEACAM6、CD1、CD1a、CD3、 CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD138、结肠特异性抗原-p(CSAp)、EGFR、EGP-1、EGP-2、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、HER2/neu、HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素、Ia、IL-2、IL-6、IL-8、胰岛素样生长因子、KC4-抗原、KS- 1、KS1-4、Le(y)、巨噬细胞-抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、坏死抗原、p53结合抗原、PAM-4抗体、胎盘生长因子、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、 RS5、S100、T101、TAC、TAG-72、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、生腱蛋 白、TRAIL受体、ED-B纤连蛋白、VEGF、17-1A-抗原、血管生成标记、癌基因标记或癌基因产 物。针对TRAIL受体(例如TRAIL-R1和TRAIL-R2)的抗体是本领域众所周知的。(参见例如 Georgakis等，Br.J.Haematol.2005，130：501-510；Mori等，FEBS Lett.2005，579：5379- 84)。这类抗体或片段可单独使用或与抗TAA抗体联用，用于癌症治疗。 [0195] 瘤性疾病可选自癌症、肉瘤、胶质瘤、淋巴瘤、白血病和黑素瘤。可靶向的示例性肿瘤类型包括急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、胆囊癌、乳癌、宫颈癌、慢性淋 巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈部癌、 霍奇金淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓质癌(medullarythyroid)、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺 癌、胶质瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和膀胱癌。 [0196] 也提供治疗患者的B细胞恶性肿瘤或B细胞免疫病或自身免疫病的方法，即通过给予患者一个或多个剂量的含有如上所述的稳定束缚结合结构和药学上可接受的载体的治 疗性组合物，所述稳定束缚结合结构中各抗原结合位点与CD19、CD20、CD22或IL-17的不同 表位结合。可经胃肠外给予治疗性组合物，剂量为20-1500毫克蛋白/剂，或20-500毫克蛋 白/剂，或20-100毫克蛋白/剂。患者可重复接受胃肠外给予的20-100毫克蛋白/剂，或重复 接受胃肠外给予的20-1500毫克蛋白/剂。在这些方法中，结合结构部分可用放射性同位素 32 33 47 67 67 90 111 111 125 131 142 153 116 166 166 标记，例如 P、P、Sc、Cu、Ga、Y、 Ag、 In、 I、 I、 Pr、 Sm、 Tb、 Dy、 Ho、 177Lu、186Re、188Re、189Re、212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra和225Ac或其组合。 [0197] 也提供检测或诊断患者的B细胞恶性肿瘤或B细胞免疫病或自身免疫病的方法，即通过给予患者含有稳定束缚结合结构、药学上可接受的载体和放射性核素的诊断用组合 物，所述稳定束缚结合结构中各抗原结合位点与CD19、CD20、CD22或IL-17的不同表位结合； 所述放射性核素选自18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、111In、 123I、124I、125I、131I、154-158Gd、177Lu、32P、45Ti和188Re或其组合。如上所述的SPECT或PET可进行检测。其应用也可用于手术中诊断，以鉴定隐蔽的肿瘤。 [0198] 也提供检测或诊断患者的B细胞恶性肿瘤或B细胞免疫病或自身免疫病的方法，即通过给予患者含有稳定束缚结合结构、药学上可接受的载体和一种或多种造影增强剂的诊 断用组合物，所述稳定束缚结合结构中各抗原结合位点与CD19、CD20、CD22或IL-17的不同 表位结合；所述造影增强剂用于磁共振成像(MRI)。造影增强剂可选自上述造影增强剂。 [0199] 也提供诊断和/或治疗患者的非瘤性疾病或障碍的方法，即通过给予患病的患者稳定束缚结合结构，其中连接可检测标记或治疗药；并且一种或多种抗原结合位点对疾病 的标记物具有特异性。疾病或障碍可由真菌或病毒所引起，所述真菌例如小孢子菌属 (Microsporum)、发癣菌属(Trichophyton)、表皮癣菌属(Epidermophyton)、申克孢子丝菌 (Sporothrix schenckii)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、粗球孢子菌 (Coccidioides immitis)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、皮炎芽生菌 (Blastomycesdermatitidis)和白色念珠菌(Candida albican)；所述病毒例如人免疫缺陷 病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、仙 台病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小病毒样病毒、猿猴病毒 40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、水痘带状疱疹病毒、登革热病毒、风疹病毒、麻疹 病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、Epstein-Barr病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、疱疹性 口腔炎病毒、辛德比斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒和蓝舌病毒。 [0200] 疾病或障碍可由细菌所引起，所述细菌例如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、酿脓葡萄球菌(Streptococcuspyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、 淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌(Pneumococcus spp.)、流感嗜血杆菌B(Hemophilis influenzaeB)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、莱姆病螺旋体(Lyme diseasespirochetes)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、麻风分枝杆菌 (Mycobacterium leprae)、流产布鲁氏杆菌(Brucella abortus)和结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)或支原体(Mycoplasma)。疾病或障碍可由寄生虫所引起， 例如疟疾。 [0201] 疾病或障碍可以是自身免疫性疾病，例如急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、小舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风 湿热、多腺性综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨-舍二氏紫癜、链球菌感染后的肾炎、结节 性红斑、无脉病、艾迪生病、类风湿性关节炎、多发性硬化、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红 斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、关节强硬性脊椎炎、肺出血肾炎综合征、闭塞性血栓性脉管 炎、斯耶格伦综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动 性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、韦格纳肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性侧 索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球性肾炎、银屑病和纤维性 肺泡炎。 [0202] 疾病或障碍可以是心肌梗塞、缺血性心脏病、或动脉粥样硬化斑块、或移植排斥、或阿尔茨海默病，或者是由特应性组织所引起的。疾病或障碍可以是因活化粒细胞、单核细 胞、淋巴样细胞或巨噬细胞在炎症部位增多所引起的炎症，并且炎症是由感染性因子所引 起。 [0203] 另外，使用稳定束缚结构，可以靶向表达特定受体或过量表达受体的细胞，所述稳定束缚结构中A或B组分含有所述受体的配体，所述受体指导该结构与带有受体的细胞结 合。治疗药或诊断试剂可以与该结构的一个或多个亚基融合或缀合，以利于诊断和治疗方 法。 [0204] 治疗和诊断用途：包括预靶向的应用 [0205] 预靶向是一种多步骤方法，起初是为解决直接靶向抗体在血中缓慢清除而开发的，后者对正常组织(特别是骨髓)具有不想要的毒性。有了预靶向，就可将放射性核素或其 它治疗药与小的化合物连接，这样在数分钟内即可从血中清除掉。首先给予除能识别靶抗 原之外、还能识别小的放射性标记化合物的预靶向剂，稍后当预靶向剂从血中充分清除时， 再给予放射性标记化合物。 [0206] 已经开发了预靶向方法，以增加检测试剂或治疗药的靶：背景的比率。预靶向和生物素/抗生物素蛋白方法的实例参见例如Goodwin等，美国专利第4,863,713号；Goodwin等， J.Nucl.Med.29：226，1988；Hnatowich等，J.Nucl.Med.28：1294，1987；Oehr等， J.Nucl.Med.29：728，1988；Klibanov等，J.Nucl.Med.29：1951，1988；Sinitsyn等， J.Nucl.Med.30：66，1989；Kalofonos等，J.Nucl.Med.31：1791，1990；Schechter等， Int.J.Cancer 48：167，1991；Paganelli等，Cancer Res.51：5960，1991；Paganelli等， Nucl.Med.Commun.12：211，1991；美国专利第5,256,395号；Stickney等，Cancer Res.51： 6650，1991；Yuan等，Cancer Res.51：3119，1991；美国专利第6,077,499号；美国专利申请顺 序号09/597,580；美国专利申请顺序号10/361,026；美国专利申请顺序号09/337,756；美国 专利申请顺序号09/823,746；美国专利申请顺序号10/116,116；美国专利申请顺序号09/ 382,186；美国专利申请顺序号10/150,654；美国专利第6,090,381号；美国专利第6,472, 511号；美国专利申请顺序号10/114,315；美国临时申请第60/386,411；美国临时申请第60/ 345,641号；美国临时申请第60/3328,835号；美国临时申请第60/426,379；美国专利申请顺 序号09/823,746；美国专利申请顺序号09/337,756；美国临时申请第60/342,103号；和美国 专利第6,962,702号，所有这些文献都通过引用结合到本文中。 [0207] 在一个具体的非限制性实例中，基于稳定束缚结构的预靶向剂含有两个相同肿瘤抗原结合位点(其对CEA具有特异性)和第三个结合位点(其对半抗原、组胺-琥珀酰-甘氨酸 (HSG)具有特异性)。在替代实施方案中，可以用相同或不同半抗原靶向不同肿瘤相关抗原。 [0208] 对于预靶向的应用，可寻靶试剂(taretable agent)可以是脂质体，其带有与脂质体脂质膜外表面共价连接的双价HSG-肽。脂质体可以充满气体。 [0209] 如下提供治疗或诊断患者的疾病或障碍的预靶向方法：(1)给予患者如上所述的双特异性三价结合结构，其中两个二聚体抗原结合位点指向对疾病具有特异性的一个或多 个标记物，而其它抗原结合位点涉及含有双价半抗原的可寻靶构建体；(2)任选给予患者清 除用组合物，让该组合物从循环中清除结合结构；和(3)给予患者含有双价半抗原的可寻靶 构建体，其中可寻靶构建体还含有一种或多种螯合或化学结合的治疗药或诊断试剂。疾病 或障碍如上所述。 [0210] 如下还提供抗体依赖型酶前体药物治疗(ADEPT)方法：(1)给予患有肿瘤的患者上述结合结构，其中该结构含有能够活化前体药物的共价连接的酶，(2)任选给予患者清除用 组合物，让该组合物从循环中清除结合结构，和(3)将前体药物给予患者。 [0211] 其它用途 [0212] 一般而言，稳定束缚结构可替代基于抗体的药物，所述药物已经显示有用于治疗癌症或非癌症疾病的功效。众所周知，放射性同位素、药物和毒素可与抗体或抗体片段缀 合，这些抗体或抗体片段能特异性结合癌细胞产生的或与癌细胞相关的标记物，而且这类 抗体缀合物可用于将放射性同位素、药物或毒素靶向肿瘤部位，以增强其疗效并减少副作 用。有关这些药物和方法实例的综述参见Wawrzynczak和Thorpe(载于Introduction to the Cellular and MolecularBiology of Cancer，L.M.Franks和N.M.Teich主编，第18章， 第378-410页，Oxford University Press.Oxford，1986)，载于 Immunoconjugates.Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer (C.W.Vogel主编，3-300，Oxford University Press，N.Y.，1987)和载于Dillman，R.O.(CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology 1：357，CRC Press，Inc.，1984)。另见Pastan 等，Cell(1986)，47：641；Vitetta等，Science(1987)，238：1098-1104；和Brady等， Int.J.Rad.Oncol.Biol.Phys.(1987)，13：1535-1544。 [0213] 在某些实施方案中，多价稳定束缚结构可用于正常或患病组织和器官的治疗和/或造影，例如采用参见以下文献的方法：美国专利号6,126,916、6,077,499、6,010,680、5, 776,095、5,776,094、5,776,093、5,772,981、5,753,206、5,746,996、5,697,902、5,328, 679、5,128,119、5,101,827和4,735,210，所述各专利通过引用结合到本文中。另外的方法 参见美国专利申请顺序号09/337,756(1999年6月申请)和美国专利申请顺序号09/823,746 (2001年4月3日申请)。通过直接标记稳定束缚结构或通过预靶向造影方法，可以进行这样 的造影，参见Goldenberg等，“Antibody Pretargeting Advances CancerRadioimmunodetection and Radiotherapy”(待发表，J.Clin.Oncol.)，另见美国专 利公布号20050002945、20040018557、20030148409和20050014207，所述各文献通过引用结 合到本文中。 [0214] 在以下美国专利中已经公开了免疫缀合物在癌症和其它形式疗法中的用途：4,331,647、4,348,376、4,361,544、4,468,457、4,444,744、4,460,459、4,460,561、4,624, 846、4,818,709、4,046,722、4,671,958、4,046,784、5,332,567、5,443,953、5,541,297、5, 601,825、5,635,603、5,637,288、5,677,427、5,686,578、5,698,178、5,789,554、5,922, 302、6,187,287和6,319,500。这些方法也可用于本文所公开的方法，即通过用本发明的稳 定束缚结构替代先前方法中的基因工程抗体。 [0215] 在某些实施方案中，本文公开并要求保护的稳定束缚结构可用于放射性核素治疗或放免治疗方法(参见例如Govindan等，2005，Technology in Cancer Research & Treatment，4：375-91；Sharkey和Goldenberg，2005，J.Nucl.Med.46：115S-127S； Goldenberg等(待发表，J.Clin.Oncol.)，“Antibody Pretargeting Advances CancerRadioimmunodetection and Radioimmunotherapy”，所述各文献通过引用结合到本 文中)。 [0216] 在另一个实施方案中，可将辐射敏化剂与裸的或缀合的稳定束缚结构、抗体或抗体片段联用。例如，可将辐射敏化剂与放射性标记的稳定束缚结构联用。与单用放射性标记 的稳定束缚结构进行治疗相比，添加辐射敏化剂可导致功效增强。辐射敏化剂参见 D.M.Goldenberg(主编)，CANCER THERAPY WITHRADIOLABELED ANTIBODIES，CRC Press (1995)，所述文献通过引用全部结合到本文中。 [0217] 用于任何要求保护的方法的稳定束缚结构可与抗微生物药结合或一起给予。 [0218] 用于任何要求保护的方法的稳定束缚结构可与细胞因子和免疫调节剂结合或一起给予。这些细胞因子和免疫调节剂至少包括干扰素-α、-β和-γ以及集落刺激因子。 [0219] 本文所公开的方法也可用稳定束缚结构刺激患者的免疫应答。在一个实施方案中，稳定束缚结构可包含抗独特型抗体的抗原结合位点(ABS)。这类稳定束缚结构可模拟肿 瘤相关抗原表位，以增强机体的免疫应答。 [0220] 稳定束缚结构可用于目前使用抗体的许多免疫学方法。这些方法包括使用抗独特型抗体和与抗体缀合的表位，以增强免疫系统。参见美国专利5,798,100、6,090,381和6, 132,718。抗独特型抗体也用作针对癌症和感染性疾病的疫苗。参见美国专利6,440,416和 6,472,511。此外，多特异性三聚体结合结构可结合多药转运蛋白并征服细胞和病原体的多 重药物抗性表型。这些方法中的抗体可用本文所公开的稳定束缚结构来替代。 [0221] 不同实施方案涉及治疗自身免疫病症状的方法。在该方法中，将稳定束缚结构给予自身免疫病患者，所述结构在给药前可与药学上可接受的载体混合。该方法中的稳定束 缚结构应含有对B细胞或T细胞的抗原表位具有结合特异性的至少一个ABS。B细胞抗原可以 是CD22，而表位可以是CD22等的表位A、表位B、表位C、表位D和表位E。B细胞相关抗原也可以 是另一细胞抗原，例如CD19、CD20、HLA-DR和CD74。T细胞抗原可包括CD25。在某些实施方案 中，可选择用于治疗自身免疫性疾病的稳定束缚结构，以结合IL-17。 [0222] ABS可含有近似人类的灵长类、鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类来源的序列。例如，ABS可以来源于人源化LL2(抗CD22)、人源化LL1(抗CD74)或A20(抗CD20)单克 隆抗体。 [0223] 可经胃肠外给予20-2000mg/剂。可重复给药，直至达到症状减轻的程度。 [0224] 可以用要求保护的方法治疗的患者包括任何动物，包括人类。优选的动物是哺乳动物，例如人、灵长类、马、犬和猫。 [0225] 稳定束缚结构可用于治疗对系统化学治疗具有抗性或难治性的疾病。这些疾病包括各种病毒感染、真菌感染、细菌感染和原生动物感染、特别是寄生虫感染。病毒感染包括 以下病毒所引起的感染：流感病毒、疱疹病毒、Epstein-Barr病毒和巨细胞病毒、狂犬病毒 (弹状病毒科(Rhabdoviridae))、乳头瘤病毒和乳多空病毒，所有这些感染都难以用系统抗 生素/细胞毒剂治疗。采用多价结合结构可提供对靶病毒的更高亲合力，导致显著增加的治 疗指数。采用具有放射性同位素(并且包括热中子可活化的硼附加物)标记的稳定束缚结构 的缀合物进行靶向放免治疗，为抗病毒治疗提供了新方法。 [0226] 可用本发明所述方法治疗的原生动物包括例如疟原虫(尤其是恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)，疟疾寄生虫)、鼠弓形体(Toxoplasma gondii，弓形体病感染因 子)、利什曼原虫(Leishmaniae，利什曼病感染因子)和Escherichia histolytica。在疟疾 不同时相中，使用稳定束缚结构可显著增强对疟疾的检测和治疗。能结合子孢子抗原的单 克隆抗体(mAb)是已知的。然而，因为子孢子抗原并非血内寄生虫(blood stage parasite) 所共有，所以使用针对子孢子抗原的这类mAb来寻靶，仅局限在相对短时间内，在此时间内 子孢子游离于循环中，这只是在刚注射后和在宿主肝细胞内发育之前。因此，优选使用靶向 原生动物(例如恶性疟原虫)的不止一种寄生时相的mAb混合物，可以用具有多特异性的一 种或多种稳定束缚结构来达到该目的。使用缀合物可为造影(例如用99mTc)或治疗(例如 用211At或其它抗疟药，例如乙胺嘧啶)提供更多优势。 [0227] 弓形体病也对系统化学治疗具有抗性。尚不清楚，能特异性结合鼠弓形体的mAb或天然宿主抗体是否在针对弓形体病的免疫应答中起作用，但是在疟原虫的情况下，合适的 靶向稳定束缚结构是递送治疗药的有效载体。 [0228] 血吸虫病是广泛流行的蠕虫感染，它是由某些淡水螺所携带的自由泳动的尾蚴而引发的疾病。与疟疾的情况类似，在感染过程中也存在不同时相的尾蚴。可以将能结合多个 时相的尾蚴、任选结合在一种或多种尾蚴的表位上、优选呈多特异性组成形式的稳定束缚 结构，与造影剂或治疗药缀合，用于有效寻靶并增加疗效。 [0229] 可以制备与一种或多种形式的克氏锥虫(Trypanosomacruzi)，恰加斯病(Chagas′disease)的病原体)结合的稳定束缚结构，用于检测和治疗该类微生物感染。与不同时相锥 虫的细胞表面糖蛋白或其它表面抗原反应的稳定束缚结构，适用于将造影剂和治疗药靶向 体内寄生虫浸润部位。 [0230] 用合适药物治疗的另一非常难治的传染性生物体就是麻风杆菌(麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae))。可以制备能特异性结合麻风分枝杆菌表面多个表位的稳定束 缚结构，单独或联合用于将造影剂和/或抗生素/细胞毒剂靶向该杆菌。 [0231] 用化疗药相当难治的肠道寄生虫感染(例如类圆线虫病(Strongyloidosis)和旋毛虫病(Trichinosis))，是稳定束缚结构的合适靶标。通过能特异性结合寄生虫的一个、或 优选多个表位的合适稳定束缚结构或缀合物，可以进行对它们的诊断和治疗。 [0232] 可以使用、或者可以容易地产生这样的抗体：所述抗体能特异性结合引起大部分人类感染的大多数微生物和寄生虫。它们许多先前已经用于体外诊断目的，可以掺入到稳 定束缚结构中作为抗体缀合物组分，以将诊断试剂和治疗药靶向感染部位。人和哺乳动物 的微生物病原体和无脊椎动物寄生虫是具有复杂生命周期的生物，在其不同时相表达多种 抗原。因此，当制备能识别不同形式上的抗原决定簇的稳定束缚结构(连接有合适的治疗 药)、并以混合物或多特异性缀合物形式联用时，最好进行靶向治疗。同样的原理也适用于 使用包含用于测定感染部位的稳定束缚结构的试剂，即通过连接造影剂(例如放射性核素) 和/或MRI增强剂。 [0233] 其它实施方案涉及手术中鉴定患病组织的方法，即通过给予有效量的稳定束缚结构和可寻靶构建体，其中该稳定束缚结构包含能特异性结合靶组织的至少一个抗原结合位 点以及能特异性结合可寻靶构建体的至少一个其它抗原结合位点；并且所述至少一个抗原 结合位点能结合靶细胞、组织或病原体上的互补结合部分，或者能结合由这些靶细胞、组织 或病原体产生的或与它们缔合的分子上的互补结合部分。 [0234] 又一些实施方案涉及用于内窥镜检查患者的患病组织的方法，即通过给予有效量的稳定束缚结构并给予可寻靶构建体。稳定束缚结构包含能特异性结合靶组织的至少一个 抗原结合位点以及能特异性结合可寻靶构建体的至少一个抗原结合位点；并且其中至少一 个抗原结合位点显示出能特异性结合靶细胞、组织或病原体上的互补结合部分，或者能结 合由这些靶细胞、组织或病原体产生的或与它们缔合的分子上的互补结合部分。 [0235] 检测用途的一个替代方法是无线的胶囊内窥镜(capsuleendoscopy)，采用可咽下的胶囊照相机/检测器(capsulecamera/detector)，这样的照相机/检测器是市售的，来自 例如GivenImaging(Norcross GA)。某些实施方案涉及用内窥镜鉴定患者患病组织的方法， 即通过给予有效量的稳定束缚结构并给予可寻靶构建体。在该实施方案中，稳定束缚结构 包含能特异性结合靶组织的至少一个抗原结合位点以及能特异性结合可寻靶构建体的至 少一个抗原结合位点；并且其中至少一个抗原结合位点显示出能特异性结合靶细胞、组织 或病原体上的互补结合部分，或者能结合由这些靶细胞、组织或病原体产生的或与它们缔 合的分子上的互补结合部分。 [0236] 替代实施方案涉及血管内鉴定患者患病组织的方法，即通过给予有效量的稳定束缚结构和可寻靶构建体。稳定束缚结构包含至少一个ABS，所述ABS能特异性结合靶细胞、组 织或病原体上的互补结合部分，或者能特异性结合由这些靶细胞、组织或病原体产生的或 与它们缔合的分子上的互补结合部分；并且还包含至少一个ABS，所述ABS能特异性结合可 寻靶构建体。靶组织可以是正常组织，例如甲状腺、肝、心、卵巢、胸腺、甲状旁腺、子宫内膜、骨髓、淋巴结或脾脏。 [0237] 某些实施方案涉及实施要求保护的方法的药盒。药盒可包含可寻靶构建体。可寻靶构建体可用适于上述可寻靶构建体的任何试剂进行标记。此外，可寻靶构建体也可不标 记，但是药盒可包含标记用试剂，以标记可寻靶构建体。如果有的话，标记用试剂可含有标 记和交联剂。药盒也可含有稳定束缚结构，其包含对可寻靶构建体具有特异性的至少一个 ABS和对可寻靶组织具有特异性的至少一个ABS。药盒可任选含有清除用组合物，以从循环 中除去稳定束缚结构。 [0238] 稳定束缚结构的靶标 [0239] 涉及稳定束缚结构的靶标的额外公开内容公开于临时美国专利申请顺序号60/634,076，“Methods and Compositions forImmunotherapy and Detection of Inflammatory and Immune-dysregulatory Disease，Infectious Disease，Pathologic Angiogenesis andCancer”，Goldenberg等(2004年12月9日申请)，所述文献的全部内容都 通过引用结合到本文中。 [0240] 在某些实施方案中，本文要求保护的稳定束缚结构与两种不同靶标特异性反应。不同靶标可包括但不限于先天免疫系统的促炎效应物、凝固因子、补体因子和补体调节蛋 白，与炎性障碍或免疫失调障碍、与传染性病原体或与病理性血管生成或癌症特异性相关 的靶标，其中这后一类靶标不是免疫系统的促炎效应物或凝固因子。因此，在某些实施方案 中，稳定束缚结构含有至少一个结合特异性(其与患病细胞、病理性血管生成或癌症，或传 染性疾病相关)以及至少一个特异性[其针对免疫系统组分(例如B细胞、T细胞、嗜中性粒细 胞、单核细胞和巨噬细胞和树突细胞的受体或抗原)，或凝固调节剂(例如凝血酶或组织因 子)，或促炎细胞因子(例如IL-1、IL-6、IL-10、HMGB-1和MIF)]。 [0241] 当稳定束缚结构包含单个抗体的组合时，不包括这样的组合：所述组合中的一个组分靶向B细胞抗原，而另一组分靶向T细胞、浆细胞、巨噬细胞或炎性细胞因子，因为这样 的组合能引起免疫系统功能障碍。 [0242] 稳定束缚结构可以是裸露的，也可以与诊断造影剂(例如同位素、放射性造影剂)缀合，或者与治疗药缀合，所述治疗药包括放射性核素、硼化合物、免疫调节剂、肽、激素、激 素拮抗剂、酶、寡核苷酸、酶抑制剂、光敏治疗药、细胞毒剂、血管生成抑制剂及其组合。稳定 束缚结构与靶标结合，可以下调或以其它方式影响免疫细胞功能，但是稳定束缚结构也可 结合其它靶标而不直接影响免疫细胞功能。例如，抗粒细胞抗体，例如针对CD66或CEACAM6 (例如NCA90或NCA95)，可用于靶向受感染组织中的粒细胞，而且也可用于靶向表达CEACAM6 的癌症。 [0243] 在一个实施方案中，治疗药是寡核苷酸。例如，寡核苷酸可以是反义寡核苷酸或双链干扰RNA(RNAi)分子。寡核苷酸可针对癌基因，例如bcl-2或p53。抑制bcl-2表达的反义分 子参见美国专利第5,734,033号。可将其缀合，或形成稳定束缚结构的治疗药部分。或者，寡 核苷酸可与稳定束缚结构同时给予或序贯给予。 [0244] 在另一个实施方案中，治疗药是硼附加物，并且当治疗药定位后，治疗需要用热或超热中子辐射。治疗药也可以是光敏治疗药，尤其是发色团或染料。 [0245] 在一个优选的实施方案中，治疗药是细胞毒剂，例如药物或毒素。也优选选自以下的药物：氮芥类、氮丙啶衍生物、磺酸烷基酯类、亚硝基脲类、吉西他滨、三氮烯类、叶酸类似 物、蒽环类、紫杉烷类、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶、酶抑制剂、表鬼臼毒素、铂配位络合物、长春花属生物碱、取代脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素 拮抗剂、内皮生长抑素、泰素、SN-38、喜树碱、多柔比星及其类似物、抗代谢物、烷化剂、抗有丝分裂药、抗血管生成药、细胞凋亡剂、甲氨蝶呤、CPT-11及其组合。 [0246] 在另一优选实施方案中，治疗药是来自动物、植物和微生物来源的毒素。优选的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、α毒素、皂草毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄 球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单 胞菌内毒素。 [0247] 治疗药可以是免疫调节剂，例如细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、干细胞生长因子、红细胞生成素、血小板生成素及其组 合。所述淋巴毒素是肿瘤坏死因子(TNF)。造血因子可以是白介素(IL)，集落刺激因子可以 是粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF))，干扰素可以 是干扰素-α、β或γ，干细胞生长因子可以是S1因子。或者，免疫调节剂可包括IL-1、IL-2、 IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17、IL-18、IL-21、干扰素-γ、TNF-α或其组合。 [0248] 优选的治疗用放射性核素包括β、α和俄歇发射体，其keV范围为80-500 keV。示例性的治疗用放射性同位素包括32P、33P、47Sc、125I、131I、86Y、90Y、186Re、188Re、189Re、64Cu、67Cu、 67 111 111 142 153 161 166 166 177 198 211 212 212 213 223 Ga、 In、 Ag、 Pr、 Sm、 Tb、 Dy、 Ho、 Lu、 Au、 At、 Pb、 Bi、 Bi、 Ra和 225Ac及其组合。示例性的光敏治疗药选自生色团和染料。 [0249] 还优选的治疗药是选自以下的酶：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-甾体异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天 冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱 氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。 [0250] 治疗用肽的各种实例是本领域已知的，任何这类已知药物都可使用。示例性的治疗用肽包括但不限于激素、生长因子、细胞因子、趋化因子、结合肽、封闭肽(blocking peptide)、毒素、血管生成因子、抗血管生成因子、抗生素、抗癌肽、抗病毒肽、药用肽、酶、激动剂、拮抗剂、造血因子例如红细胞生成素和许多其它临床用化合物。 [0251] 稳定束缚结构可与至少一个促炎效应物细胞因子、促炎效应物趋化因子或促炎效应物受体特异性结合。稳定束缚结构可结合的促炎效应物细胞因子包括但不限于MIF、 HMGB-1、TNF-α(肿瘤坏死因子α)、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17和IL- 18。促炎效应物趋化因子包括但不限于CCL19、CCL21、IL-8、MCP-1(单核细胞趋化蛋白1)、 RANTES、MIP-1A(巨噬细胞炎性蛋白1A)、MIP-1B(巨噬细胞炎性蛋白1B)、ENA-78(上皮嗜中 性粒细胞活化肽78)、IP-10、GROB(GROβ)和嗜酸性粒细胞趋化因子。促炎效应物受体包括但 不限于IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R和IL-18R。稳定束缚结构也可与至少一个凝固 因子(例如组织因子或凝血酶)特异性反应。淋巴因子/细胞因子与免疫细胞上它们的受体 反应，导致活化，而抗体则可通过中和这些淋巴因子/细胞因子而阻断活化。或者，抗体可以 与淋巴因子/细胞因子受体反应而阻断活化。 [0252] 稳定束缚结构特异性结合的不同靶标可以是相同或不同类型的效应物和凝固因子。例如，稳定束缚结构特异性结合的两种或多种不同靶标可以选自同类效应物或凝固因 子，例如两种或多种不同促炎效应物细胞因子、两种或多种不同促炎效应物趋化因子、两种 或多种不同促炎效应物受体、或两种或多种凝固因子。或者，两种或多种不同靶标可以选自 不同类型的效应物和凝固因子。例如，一种靶标可以是先天免疫系统的促炎效应物，另一种 靶标可以是凝固因子。或者，稳定束缚结构可以与诸如以下的两种不同类型的促炎效应物 特异性反应：至少一种促炎效应物细胞因子和至少一种促炎效应物趋化因子、至少一种促 炎效应物细胞因子和至少一种促炎效应物受体、或者至少一种促炎效应物趋化因子和至少 一种促炎效应物受体。也可有这种情况：稳定束缚结构特异性反应的两种不同靶标是先天 免疫系统同一促炎效应物的不止一个表位，或同一凝固因子的不止一个表位。 [0253] 因此，“两个不同靶标”可指两种不同抗原或同一抗原的两个不同表位。多种抗体可针对同一抗原而使用，因此增加价位。例如，当靶向MIF或HMGB-1时，尤其是用于治疗脓毒 病、某些癌症和动脉粥样硬化斑块时，结合靶标的两个相同表位的两个抗体可以掺入到稳 定束缚结构中，所述结构带有另一抗体，其具有针对不同抗原的一个或多个结合臂，所述抗 原例如II类HLA恒定链抗原，例如CD74。可以选择抗体，以结合两种不同抗原，例如针对MIF 和CD74的抗体；针对HMGB-1和CD74的抗体。 [0254] 当促炎效应物受体被靶向时，在一个优选的实施方案中，真实靶标可以是促炎效应物受体的胞外区。在一个替代实施方案中，稳定束缚结构可包含至少一个能与促炎效应 物受体反应的分子。该分子可以是所述促炎效应物受体的天然拮抗剂，或者该拮抗剂的片 段或突变体，并且能与受体发生特异性相互作用。在一个优选的实施方案中，天然拮抗剂是 天然IL-1受体拮抗剂，或该拮抗剂的片段或突变体。 [0255] 在一个实施方案中，靶标可以是适应性免疫系统的抗原或受体。在其它实施方案中，稳定束缚结构的靶标可存在于先天免疫系统的细胞上，所述细胞例如粒细胞、单核细 胞、巨噬细胞、树突细胞和NK细胞。其它靶标包括血小板和内皮细胞。而另一组靶标选自 C5a、LPS、IFNγ和B7。再一组合适的靶标包括CD2、CD4、CD14、CD18、CD11a、CD20、CD22、CD23、CD25、CD29、CD38、CD40L、CD52、CD64、CD83、CD147和CD154。CD是免疫细胞上的靶标，可将其阻断以阻止免疫细胞反应。CD83是特别有用的活化树突细胞标记(Cao等，Biochem J， Aug.23，2004(Epub ahead of print)；Zinser等，J.Exp Med.200(3)：345-51(2004))。 [0256] 某些靶标特别令人感兴趣，例如MIF、HMGB-1、TNF-α、补体因子和补体调节蛋白以及凝固因子。MIF是先天免疫系统的关键性细胞因子，在炎症反应控制中起到重要作用。原 先是作为抑制巨噬细胞随机迁移的T淋巴细胞衍生因子而予以描述，称为巨噬细胞迁移抑 制因子(MIF)的蛋白质，在大约30多年以来一直是谜一样的细胞因子。近年来，发现MIF是脑 垂体腺前叶的产物，生物活性的重组MIF蛋白的克隆和表达，得出了它在体内关键性生物学 作用的定义。MIF具有独特性质，是由巨噬细胞和T淋巴细胞在受到糖皮质激素刺激后释放 的。一旦释放，MIF在体外能克服糖皮质激素对TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8产生的抑制效应 (这些TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8是由LPS刺激的单核细胞产生的)并在体内抑制甾体对致死 性内毒素血症的保护效应。MIF在体外也拮抗T细胞增殖的糖皮质激素抑制，即通过恢复产 生IL-2和IFN-γ。MIF是第一种已鉴定的可反调节(counter-regulate)糖皮质激素抑制效 应的介质，因而在炎症和免疫的宿主控制中起到关键性作用。MIF在治疗癌症、病理性血管 生成和脓毒病或脓毒性休克中特别有用。 [0257] HMGB-1是DNA结合核和胞质溶胶蛋白，它是在IL-1β、TNF或LPS活化后由单核细胞和巨噬细胞释放的一种促炎细胞因子。通过其B框结构域，它诱导DC的表型成熟。它也可引 起促炎细胞因子IL-1α、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α和RANTES的分泌增加。由坏死细胞释放的 HMGB-1可以是组织或细胞损伤的信号，这样的信号当被DC感受到之后，能诱导和/或增强免 疫反应。Palumbo等报道了HMBG1诱导成血管细胞(mesoangioblast)迁移和增殖(J CellBiol，164：441-449(2004))。 [0258] HMGB-1是内毒素诱导的致死率的晚期介质，它相对于TNF和IL-1β表现出显著延迟动力学。已经证明，靶向特定早期炎性介质(例如单独的TNF和IL-1β)的实验性治疗药在临 床上是有效的，但稳定束缚结构可提高反应，即通过同时靶向早期和晚期炎性介质。 [0259] 靶向HMBG-1的稳定束缚结构在治疗关节炎、尤其是胶原诱发的关节炎中特别有用。包含HMBG-1的稳定束缚结构也可用于治疗脓毒病和/或脓毒性休克。Yang等，PNAS USA 101：296-301(2004)；Kokkola等，Arthritis Rheum，48：2052-8(2003)；Czura等，J InfectDis，187 Suppl 2：S391-6(2003)；Treutiger等，J Intern Med，254：375-85(2003)。 [0260] TNF-α是参与全身炎症和急性期反应的一种重要细胞因子。TNF-α由受刺激的单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞释放。巨噬细胞、T细胞和B淋巴细胞、粒细胞、平滑肌细胞、嗜 酸性粒细胞、软骨细胞、成骨细胞、肥大细胞、神经胶质细胞和角质细胞在受到刺激后也产 生TNF-α。在损伤过程中，例如感染过程中，其释放受到白介素-1和细菌内毒素等其它几种 介质的刺激。它在不同器官系统中具有许多作用，通常与白介素-1和-6在一起。TNF-α的作 用之一是抑制食欲；因此用于治疗恶病质的稳定束缚结构优选靶向TNF-α。它也刺激肝脏急 性期反应，导致C-反应蛋白和多种其它介质的增加。当治疗脓毒病或脓毒性休克时，它也是 有用的靶标。 [0261] 补体系统是复杂级联，包括血清糖蛋白的蛋白水解(通常由细胞受体激活)。“补体级联”是组成型而非特异性的，但它必须被活化，才能起作用。补体激活导致单向顺序的酶 促和生化反应。在该级联中，特定补体蛋白C5形成两个高度活化的炎性副产物C5a和C5b，它 们共同激活白细胞。这反过来又产生大量其它炎性副产物，包括有害的细胞因子、炎性酶和 细胞粘附分子。总而言之，这些副产物可导致在许多炎性疾病中可见的组织破坏。该级联最 终引起对炎症反应、吞噬细胞趋化性和调理作用和细胞溶解的诱导。 [0262] 补体系统可通过两个不同途径而活化，即经典途径和替代途径。大多数补体组分是有编号的(例如C1、C2、C3等)，但有些则称为“因子”。某些组分必需经酶促切割以活化其 功能；其它的则简单结合以形成具有活性的复合物。经典途径的活性组分包括C1q、C1r、 C1s、C2a、C2b、C3a、C3b、C4a和C4b。替代途径的活性组分包括C3a、C3b、因子B、因子Ba、因子Bb、因子D和备解素。各途径的最后阶段相同，都包括将组分装配到膜攻击复合体(membrane attack complex)。膜攻击复合体的活性组分包括C5a、C5b、C6、C7、C8和C9n。 [0263] 尽管稳定束缚结构可以靶向补体系统这些组分中的任一种，但是优选某些补体组分。C3a、C4a和C5a使肥大细胞释放趋化因子(例如组胺和5-羟色胺，这些因子攻击吞噬细 胞)、抗体和补体等。这些构成一组优选靶标。另一组优选的靶标包括C3b、C4b和C5b，它们增 强对外源细胞的吞噬作用。另一组优选的靶标是这两组的前体组分，即C3、C4和C5。C5b、C6、 C7、C8和C9诱导外源细胞溶解(膜攻击复合体)并构成又一组优选的靶标。 [0264] 补体C5a，同C3a一样，也是一种过敏毒素。它介导炎症，是诱导嗜中性粒细胞释放抗微生物蛋白酶和氧自由基的化学引诱物。因此，C5a及其前体C5是特别优选的靶标。通过 靶向C5，不仅C5a受影响，而且C5b也受影响，这引起膜攻击复合体的装配。因此，C5是另一优 选靶标。C3b及其前体C3也是优选靶标，因为经典和替代补体途径依赖于C3b。三种蛋白质影 响该因子水平：C1抑制剂、蛋白H和因子I，它们也是本发明的优选靶标。补体调节蛋白(例如 CD46、CD55和CD59)可以是稳定束缚结构所结合的靶标。 [0265] 凝固因子也是优选靶标，尤其是组织因子(TF)和凝血酶。TF也称为组织促凝血酶原激酶、CD142、凝固因子III或因子III。TF是膜内在受体糖蛋白，是细胞因子受体超家族成 员。TF的配体结合胞外域由两个结构模块组成，其特征与TF的分类一致，都是2型细胞因子 受体的成员。TF参与凝血蛋白酶级联，引发外源性和内源性凝血级联，即通过形成TF胞外域 与循环凝血因子、丝氨酸蛋白酶因子VII或因子VIIa之间的高亲和性复合物。这些酶促活性 复合物再激活因子IX和因子X，导致凝血酶的产生和血凝块的形成。 [0266] TF由包括单核细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞在内的不同细胞类型表达，并由IL-1、TNF-α或细菌脂多糖诱导。蛋白激酶C参与内皮细胞TF表达的细胞因子活化。内毒素和细 胞因子诱导TF是引发革兰氏阴性脓毒病患者中可见的弥散性血管内凝血的重要机制。TF也 表现出参与不同的非止血功能，包括炎症、癌症、脑功能、免疫应答和肿瘤相关血管生成。因 此，按照本发明，靶向TF的稳定束缚结构不仅在治疗凝血病中有用，而且在治疗脓毒病、癌 症、病理性血管生成和其它免疫和炎症失调疾病中也有用。认为凝血途径与细胞因子网络 间具有复杂的相互作用，因为几种细胞因子影响各种细胞内TF表达的能力以及配体对受体 的结合作用。已经报道了配体结合(因子VIIa)，以给出胞内钙信号，因此表明TF是真受体。 [0267] 凝血酶是凝固因子II(凝血酶原)的活化形式；它将血纤蛋白原转化成血纤蛋白。凝血酶对巨噬细胞来说是潜在的化学吸引素，可改变它们的细胞因子和花生四烯酸代谢物 的产量。它在伴有脓毒病的凝血病中特别重要。大量研究已经证明，无论在脓毒病患者体内 还是在将LPS给予动物模型之后，都有凝血系统的活化。尽管有三十多年的研究，但是对LPS 诱发肝脏毒性的机制仍然知之甚少。目前已经清楚，它们涉及细胞和体液介质间复杂而连 续的相互作用。在相同时间周期内，革兰氏阴性系统脓毒病及其后遗症(sequallae)已成为 重要的健康问题，采用针对LPS或不同炎性介质的单克隆抗体的努力，在治疗上都是失败 的。靶向凝血酶和至少一个其它靶标的稳定束缚结构正是致力于脓毒病治疗上的临床失 败。 [0268] 在其它实施方案中，稳定束缚结构结合I类MHC、II类MHC或辅助分子，例如CD40、CD54、CD80或CD86。稳定束缚结构也可结合T细胞活化细胞因子，或结合细胞因子介质，例如 NF-KB。 [0269] 在某些实施方案中，两个不同靶标中的一个可以是癌细胞受体或癌症相关抗原，尤其是选自以下的一个：B-细胞谱系抗原(CD19、CD20、CD21、CD22、CD23等)、VEGFR、EGFR、癌胚抗原(CEA)、胎盘生长因子(PLGF)、生腱蛋白、EER-2/neu、EGP-1、EGP-2、CD25、CD30、CD33、CD38、CD40、CD45、CD52、CD74、CD80、CD138、NCA66、CEACAM6(癌胚抗原相关性细胞粘附分子 6)、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、IL-6、甲胎蛋白(AFP)、A3、CA125、结肠特异性抗原-p (CSAp)、叶酸受体、HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、Ia、EL-2、胰岛素样生长因子(ILGF) 和ILGF量体、KS-1、Le(y)、MAGE、坏死抗原、PAM-4、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、Prl、前列腺特 异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、S100、T101、TAC、TAG72、TRAIL受体和碳酸酐 酶IX。 [0270] 脓毒病和免疫失调以及其它免疫性疾病相关的靶标包括MIF、IL-1、IL-6、IL-8、CD74、CD83和C5aR。已经发现针对C5aR的抗体和抑制剂能提高患有脓毒病的啮齿动物的生 存率(Huber-Lang等，FASEB J 2002；16：1567-1574；Riedemann等，J Clin Invest 2002； 110：101-108)，并提高患有脓毒性休克和成人呼吸窘迫综合征的猴子的生存率(Hangen等， J Surg Res 1989；46：195-199；Stevens等，J ClinInvest 1986；77：1812-1816)。因此，对 于脓毒病，两个不同靶标之一优选是感染相关靶标，例如LPS/C5a。其它优选靶标包括HMGB- 1、TF、CD14、VEGF和IL-6，它们各自与败血症或脓毒性休克相关。优选稳定束缚结构是那些 靶向两个或更多以下靶标的结构：HMGB-1、TF和MIF，例如MIF/TF和HMGB-1/TF。 [0271] 在另一些实施方案中，两个不同靶标之一可以是移植物抗宿主病或移植排斥相关靶标，例如MIF(Lo等，Bone MarrowTransplant，30(6)：375-80(2002))。这两个不同靶标之 一也可以是以下疾病相关靶标：急性呼吸窘迫综合征相关靶标，例如IL-8(Bouros等，PMC Pulm Med，4(1)：6(2004)，动脉粥样硬化或再狭窄相关靶标，例如MIF (Chen等， Arterioscler Thromh Vasc Biol，24(4)：709-14(2004)，哮喘相关靶标，例如IL-18(Hata 等，Int Immunol，Oct.11，2004 Epubahead of print)，肉芽肿性疾病相关靶标，例如TNF-α (Ulbricht等，Arthritis Rheum，50(8)：2717-8(2004)，神经病相关靶标，例如氨甲酰化EPO (红细胞生成素)(Leist等，Science 305(5681)：164-5(2004)或恶病质相关靶标，例如IL-6 和TNF-α。 [0272] 其它靶标包括C5a、LPS、IFN-γ、B7；CD2、CD4、CD14、CD18、CD11a、CD11b、CD11c、CD14、CD18、CD27、CD29、CD38、CD40L、CD52、CD64、CD83、CD147、CD154。可以通过针对CD18、CD11b或CD11c的抗体，在某种程度上抑制某些微生物抗原(包括LPS)对单核细胞的活化，因 此涉及β2-整联蛋白(Cuzzola等，J Immunol2000；164：5871-5876；Medvedev等，J Immunol 1998；160：4535-4542)。已经知道CD83在巨细胞动脉炎(GCA)中起作用，这是一种影响中动 脉到大动脉(主要是主动脉弓颅外分枝及其主动脉本身)的全身性脉管炎，导致血管狭窄并 随后造成组织缺血以及失明、中风和主动脉弓综合征的严重并发症(Weyand和Goronzy，N Engl J Med 2003；349：160-169；Hunder和Valente，载于：Inflammatory Diseases of BloodVessels.G.S.Hoffman和C.M.Weyand主编，Marcel Dekker，New York，2002；255- 265)。发现抗CD83的抗体在人GCA的SCID小鼠模型中能消除脉管炎(Ma-Krupa等，J Exp Med 2004；199：173-183)，向这些研究人员表明，树突细胞(当激活时表达CD83)在GCA中是重要 的抗原加工细胞。在这些研究中，他们使用小鼠抗CD83Mab(IgG1克隆HB15e，来自Research Diagnostics)。CD154是TNF家族成员，在CD4-阳性T淋巴细胞表面表达，已经报道了针对 CD154的人源化单克隆抗体在活动性系统性红斑狼疮(SLE)患者中产生明显的临床益处 (Grammar等，J Clin Invest 2003；112：1506-1520)。也表明该抗体可用于其它自身免疫性 疾病(Kelsoe，J Clin Invest 2003；112：1480-1482)。实际上，也报道了该抗体在难治性免 疫血小板减少性紫癜患者中是有效的(Kuwana等，Blood 2004；103：1229-1236)。 [0273] 在类风湿性关节炎中，重组白介素-1受体拮抗剂IL-1Ra即阿那白滞素(anakinra)(Kineret )已经显示出活性(Cohen等，AnnRheum Dis 2004；63：1062-8；Cohen，Rheum Dis Clin North Am 2004；30：365-80)。在治疗这些患者(至今需要同时用甲氨蝶呤治疗) 方面的一个改进，就是将阿那白滞素与一种或多种抗促炎效应物细胞因子或抗促炎效应物 趋化因子(如上表所示)结合起来使实。实际上，在类风湿性关节炎的抗体治疗的综述中， Taylor(Curr Opin Pharmacol2003；3：323-328)指出，除了TNF之外，还可使用针对以下细 胞因子的其它抗体：IL-1、IL-6、IL-8、IL-15、IL-17和IL-18。 [0274] 某些更优选靶标的组合包括下文所述的组合。这是优选组合的实例，但并非是穷尽性的。 [0275] [0276] [0277] [0278] 稳定束缚结构可以是含有至少两种分离的抗体和/或受体或它们的配体的混合物，其结合不同靶标。在一个优选的实施方案中，靶标选自先天免疫系统的促炎效应物、凝 固因子、补体因子和补体调节蛋白，以及与炎性障碍或免疫失调障碍、与病理性血管生成或 癌症或传染性疾病特异性相关的靶标。 [0279] 稳定束缚结构可结合受体或结合其靶分子，例如对于LPS，IL-1、IL-10、IL-6、MIF、HMGB1、TNF、IFN、组织因子、凝血酶、CD14、CD27和CD134。它们许多在血液中同时以受体和可 溶性形式存在。稳定束缚结构的结合导致从血中快速清除，然后由稳定束缚结构的第二组 分靶向另一细胞(例如巨噬细胞)，用于通过细胞、尤其是溶酶体进行转运和降解。这在第二 靶向组分是针对由巨噬细胞和树突细胞表达的内化抗原(例如CD74)时，特别有效。这与 Hansen在美国专利6,458,933中公开的内容一致，但是集中在炎性细胞因子和其它免疫调 节分子和受体(对于免疫失调疾病)和癌症抗原(对于这些癌症的免疫治疗)。 [0280] 用于治疗癌症的优选稳定束缚结构包含针对CD55和任何以上癌症抗原的抗体、针对CD46和任何以上癌症抗原的抗体、针对CD59和任何以上癌症抗原的抗体、针对MIF和任何 以上癌症抗原的抗体、针对NF-κB和任何以上癌症抗原的抗体，以及针对IL-6和任何以上癌 症抗原(并非IL-6)的抗体。 [0281] 稳定束缚结构可以与一种或多种第二治疗药联用。这第二治疗药可以是影响先天免疫系统组分的药物。或者，它可影响适应性免疫系统的组分。第二治疗药也可以是影响凝 血、癌症或自身免疫性疾病的组分，例如细胞毒性药物。 [0282] 可以用药盒形式提供带有诊断试剂或治疗药的稳定束缚结构，用于人或哺乳动物治疗和诊断用途，所述结构在药学上可接受的注射用溶媒中，所述溶媒优选生理pH和浓度 的磷酸缓冲盐溶液(PBS)。优选的制剂是无菌的，尤其是人用制剂。这类药盒的任选组分包 括稳定剂、缓冲剂、标记用试剂、放射性同位素、顺磁化合物、用于提高清除率的第二抗体， 以及常规注射器、柱、小瓶(管)等。 [0283] 噬菌体展示 [0284] 在某些替代实施方案中，可用本领域众所周知的噬菌体展示技术，来确定用于构建DDD和/或AD结构域的结合肽。例如，可以通过针对DDD二聚体的噬菌体展示淘选，鉴定能 结合DDD结构域、并因此可替代天然存在的AD序列的肽，并选择具有高结合亲和性的噬菌 体。可以通过针对所选靶标的噬菌体展示淘选，来检测其它类型的结合肽，所述肽对特定靶 分子具有选择性或特异性。 [0285] 用于产生多样化肽群体的各种噬菌体展示方法和技术是本领域众所周知的。例如，美国专利第5,223,409、5,622,699和6,068,829号(所述各专利通过引用结合到本文中) 公开了制备噬菌体文库的方法。噬菌体展示技术包括对噬菌体进行遗传操作，使得小肽可 以表达在其表面(Smith和Scott，1985，Science 228：1315-1317；Smith和Scott，1993， Meth.Enzymol.21：228-257)。 [0286] 最近十几年来，在噬菌体展示肽文库的构建和用该肽文库分离肽配体的筛选方法的开发方面已有很大进展。例如，使用肽文库可以表征许多蛋白质内的相互作用位点和受 体-配体结合基序，所述蛋白质例如参与炎症反应的抗体或介导细胞粘附的整联蛋白。该方 法也已用于鉴定新的肽配体，这可导致对肽模拟药物或造影剂的开发(Arap等，1998a， Science 279：377-380)。除了肽之外，更大的蛋白质结构域(例如单链抗体)也可展示在噬 菌体颗粒表面(Arap等，1998a)。 [0287] 可以通过淘选，来分离对给定靶分子具有选择性的靶向氨基酸序列(Pasqualini和Ruoslahti，1996，Nature 380：364-366；Pasqualini，1999，The Quart.J.Nucl.Med.43： 159-162)。简而言之，将含有推定靶向肽的噬菌体文库暴露给靶分子，收集含有结合噬菌体 的样品。可将靶分子连接在例如96孔板的微量滴定孔底部。可以洗脱与靶标连接的噬菌体， 然后通过在宿主菌中培养而扩增。 [0288] 在某些实施方案中，可以在几轮淘选之间在宿主菌中使噬菌体增殖。细菌不被噬菌体裂解，而是分泌多拷贝噬菌体，这些噬菌体展示特定插入物。如有必要，可再次将扩增 的噬菌体暴露给靶分子，并收集起来用于进一步多轮淘选。可以进行多轮淘选，直至得到选 择性或特异性结合物群体。可以对噬菌体基因组中靶向肽插入物的相应DNA进行测序，从而 确定肽的氨基酸序列。然后可通过标准蛋白质化学技术产生经鉴定的靶向肽作为合成肽 (Arap等，198a Smith等，1985)。 [0289] 适体 [0290] 在某些实施方案中，构建体形成的前体可包括适体。构建和测定适体结合特性的方法是本领域众所周知的。例如，这类技术参见美国专利第5,582,981、5,595,877和5,637, 459号，所述各专利通过引用结合到本文中。 [0291] 可用合成、重组和纯化等任何已知方法制备适体，适体可以单用或与对相同靶标具有特异性的其它配体联用。一般而言，最少需要约3个核苷酸、优选至少5个核苷酸以达到 特异性结合。可以使用序列短于10个碱基的适体，尽管优选10、20、30或40个核苷酸的适体。 [0292] 适体需含有赋予结合特异性的序列，但也可以用侧翼区来延伸或其它衍生方式来延伸。在优选的实施方案中，适体的结合序列可以邻接引物-结合序列，以便用PCR或其它扩 增技术来扩增适体。在另一个实施方案中，侧翼序列可包含这样的特定序列：该序列优先识 别或结合一个部分，使适体更牢固地固定在基质上。 [0293] 可以经分离、测序和/或扩增或合成，使适体成为常规DNA或RNA分子。或者，目标适体可包含经修饰的寡聚体。适体中通常存在的任何羟基都可被膦酸酯基团取代，磷酸酯基 被标准保护基保护起来，或者被活化以便与其它核苷酸额外连接，或者可以与固体支持物 缀合。一种或多种磷酸二酯键可以被其它连接基团置换，例如P(O)O被以下基团置换：P(O) S、P(O)NR2、P(O)R、P(O)OR′、CO或CNR2，其中R是H或烷基(1-20C)，而R′是烷基(1-20C)；另外，该基团可通过O或S与相邻核苷酸连接。寡聚体中并非所有连接都要相同。 [0294] 能结合特定目标靶的适体的制备和筛选方法是众所周知的，例如美国专利第5,475,096号和美国专利第5,270,163号，所述各专利通过引用结合到本文中。技术通常包括 从候选适体混合物中进行选择并逐步重复结合，将结合的适体与未结合适体分离开来并扩 增。因为在混合物中，对应于最高亲和力适体来说只有少量序列(可能仅有一分子适体)存 在，通常最好是设定划分标准，使得在分离期间，保留混合物中有效量的适体(约5-50％)。 每轮都浓缩了对靶标具有高亲和性的适体。可重复3-6轮选择和扩增循环，以产生能以高亲 和力和高特异性结合靶标的适体。 [0295] Avimers [0296] 在某些实施方案中，本文所述的前体、组分和/或复合物可包含一种或多种avimer序列。Avimer是一类结合蛋白，在对不同靶分子的亲和力和特异性方面有点类似于抗体。通 过体外外显子改组和噬菌体展示，从人胞外受体结构域中开发得到Avimer。(Silverman等， 2005，Nat.Biotechnol.23：1493-94；Silverman等，2006，Nat.Biotechnol.24：220)。所得多 结构域蛋白包含多个独立结合结构域，与单一表位结合蛋白相比，多结构域蛋白表现出改 进的亲和力(在某些情况下低于毫微摩尔级)和特异性。(出处同上)。在不同实施方案中， avimer可与例如AD和/或DDD序列连接，用于本文要求保护的方法和组合物。有关avimer的 构建和使用方法的更多细节公开于例如美国专利申请公布号20040175756、20050048512、 20050053973、20050089932和20050221384，所述各文献的实施例部分通过引用结合到本文 中。 [0297] 蛋白质和肽 [0298] 在本文要求保护的方法和组合物的范围内，可以使用各种多肽或蛋白质。在某些实施方案中，蛋白质可包含抗体或含有抗原结合位点的抗体片段。在其它实施方案中，蛋白 质或肽可以是效应物分子，例如酶、激素、细胞因子、结合蛋白或毒素。 [0299] 本文所用的蛋白质、多肽或肽通常是指但不限于大于约200个氨基酸到自基因翻译出的全长序列的蛋白质；大于约100个氨基酸的多肽；和/或约3至约100个氨基酸的肽。为 了方便起见，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文可互换使用。因此，术语“蛋白质或肽”包括氨基酸序列，所述序列包含天然蛋白质中存在的20种常见氨基酸中的至少一种，或至少 一个修饰的或稀有氨基酸。 [0300] 本文所用的“氨基酸残基”是指本领域已知的任何天然存在的氨基酸、任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模拟物。在某些实施方案中，蛋白质或肽残基是连续的，没有任何非氨 基酸间插在氨基酸残基序列中。在其它实施方案中，序列可包含一个或多个非氨基酸部分。 在具体实施方案中，蛋白质或肽残基序列可以间插一个或多个非氨基酸部分。 [0301] 因此，术语“蛋白质或肽”包括这样的氨基酸序列：其包含天然蛋白质中存在的20种常见氨基酸中的至少一种，或至少一个修饰或稀有氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、 3-氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基-丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸 (piperidinicacid)、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二 酸、2，4-二氨基丁酸、锁链素、2，2′-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别-羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、N-甲基甘 氨酸、肌氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟 氨酸。或者，除了天然存在的L-氨基酸之外，蛋白质或肽还可包含一种或多种D-氨基酸。产 生掺入D-氨基酸的肽的方法公开于例如美国专利申请公布号20050025709，McBride等 (2004年6月14日申请)。 [0302] 可采用本领域技术人员已知的任何方法制备蛋白质或肽，所述方法包括通过标准分子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽，从天然来源分离出蛋白质或肽，或者化学合成蛋白 质或肽。先前已经公开了对应于不同基因的核苷酸和蛋白质、多肽和肽序列，本领域普通技 术人员知道，可以在计算机数据库中找到它们。一个这样的数据库就是国立生物技术信息 中心(National Center forBiotechnology Information)的Genbank和GenPept数据库。采 用本文所公开的技术或本领域普通技术人员已知技术，可以扩增和/或表达已知基因的编 码区。或者，各种市售的蛋白质、多肽和肽制剂是本领域技术人员已知的。 [0303] 肽模拟物 [0304] 多肽制备的另一实施方案是采用肽模拟物。模拟物是含肽分子，其模拟蛋白质二级结构组件。参见例如Johnson等，“PeptideTurn Mimetics″载于BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY，Pezzuto等主编，Chapman and Hall，New York(1993)，所述文献通过引用结合到 本文中。使用肽模拟物的基本原理是，蛋白质肽主链的存在，主要能适应氨基酸侧链，以便 于分子的相互作用，例如抗体与抗原的相互作用。肽模拟物预期允许类似于天然分子的分 子相互作用。可以采用这些原理来改造第二代分子，所述分子具有本文所公开的结合肽的 许多天然特性，但也具有改变或改进的特性，例如通过胃或肠的吸收增加和/或提高了体内 稳定性或活性。 [0305] 融合蛋白 [0306] 不同实施方案可涉及融合蛋白。这些分子通常具有肽的全部或重要部分，其在N-端或C-端与第二多肽或蛋白质的全部或部分连接。例如，融合可用来自其它物种的前导序 列，以便在异源宿主中进行蛋白质的重组表达。另一可用的融合包括加入免疫活性区，例如 抗体表位。而另一有用的融合形式可包括连接用于纯化的部分，例如FLAG表位(Prickett 等，1989，Biotechniques 7：580-589；Castrucci等，1992，J Virol 66：4647-4653)。融合蛋白的另一用途涉及本文要求保护的束缚复合物的组分构建，例如提供与第一单体连接的 DDD序列和与第二单体连接的AD序列。 [0307] 融合蛋白的制备方法是本领域技术人员众所周知的。按照以下实施例所述，这些蛋白质可通过如下方式制备：例如通过使用双官能交联剂的化学连接，通过从头合成完整 融合蛋白，或者通过将编码第一蛋白质或肽的DNA序列与编码第二肽或蛋白质的DNA序列连 接在一起，再进行完整融合蛋白的表达。 [0308] 合成肽 [0309] 按照常规技术，可以合成完整或部分蛋白质或肽，可以是在溶液中或在固体支持物上合成。各种自动合成仪是市售的，可按照已知方案来使用。参见例如Stewart和Young， (1984，Solid PhasePeptide Synthesis，第2版，Pierce Chemical Co.)；Tam等(1983， J.Am.Chem.Soc，105：6442)；Merrifield(1986，Science，232：341-347)；和Barany和 Merrifield(1979，The Peptides，Gross and Meienhofer主编，Academic Press，New York，第1-284页)。按照这些方法，可以容易地合成通常约6至约35-50个氨基酸的短肽序 列。或者，可以采用重组DNA技术，其中将编码目标肽的核苷酸序列插入表达载体中，转化或 转染到合适宿主细胞内并在适于表达的条件下进行培养。 [0310] 给予肽 [0311] 要求保护的方法和/或组合物的不同实施方案涉及给予患者的一种或多种基于肽的稳定束缚结构。可通过本领域已知的任何途径给予，包括但不限于口服、鼻腔、口腔含化 剂、吸入、直肠、阴道、局部、正位(orthotopic)、皮内、皮下、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内或静脉内注射。 [0312] 口服给予患者的未修饰的肽可在消化道中降解，根据序列和结构可表现出穿过肠道内衬的吸收差。然而，肽的化学修饰方法是众所周知的，所述方法使肽对内源性蛋白酶降 解的敏感性更低或者更容易通过消化道吸收(参见例如Blondelle等，1995，Biophys.J.69： 604-11；Ecker和Crooke，1995，Biotechnology 13：351-69；Goodman和Ro，1995，BURGER′S MEDICINAL CHEMISTRY AND DRUGDISCOVERY，第I卷，Wollf编著，John Wiley&Sons；Goodman 和Shao，1996，Pure&Appl.Chem.68：1303-08)。也已描述了肽类似物文库的制备方法，所述 肽例如含有D-氨基酸的肽；由模拟肽结构的有机分子组成的肽模拟物；或类肽(peptoid)， 例如插烯型类肽(vinylogouspeptoid)；该方法可用于构建适于口服给予患者的基于肽的 稳定束缚结构。 [0313] 在某些实施方案中，标准肽键连接可以被一种或多种替代连接基团置换，所述基团例如CH2-NH、CH2-S、CH2-CH2、CH＝CH、CO-CH2、CHOH-CH2等。肽模拟物的制备方法是众所周 知的(例如Hruby，1982，Life Sci 31：189-99；Holladay等，1983，Tetrahedron Lett.24： 4401-04；Jennings-White等，1982，Tetrahedroin Lett.23：2533；Almquiest等，1980， J.Med.Chem.23：1392-98；Hudson等，1979，Int.J.Pept.Res.14：177-185；Spatola等，1986，Life Sci 38：1243-49；美国专利号5,169,862、5,539,085、5,576,423、5,051,448、5,559, 103，所述各文献通过引用结合到本文中)。与其肽类似物相比，肽模拟物表现出稳定性提高 和/或体内吸收增加。 [0314] 或者，可经口服给予肽，使用N端和/或C端封端(capping)以防止外肽酶活性。例如，C-端可以用酰胺肽封端，而N-端可以通过肽的乙酰化封端。也可将肽环化以阻断外肽 酶，例如通过形成环酰胺、二硫化物、醚、硫化物等。 [0315] 也可通过用D-氨基酸替代天然存在的L-氨基酸，而使肽稳定化，尤其是在已知内肽酶起作用的位置上发生取代。内肽酶结合和切割序列是本领域已知的，已经描述了掺入 D-氨基酸的肽的制备和使用方法(例如美国专利申请公布号20050025709，McBride等，2004 年6月14日申请，所述文献通过引用结合到本文中)。在某些实施方案中，肽和/或蛋白质可 以通过与蛋白酶抑制剂和/或肽酶抑制剂共同配制，经口服给予。 [0316] 口服给予治疗用肽的其它方法公开于Mehta(“Oraldelivery and Recombinant production of peptide hormones”，June 2004，BioPharm International)。可以肠溶衣 的固体剂型给予肽和赋形剂，所述赋形剂调节肠道蛋白水解活性并增加肽穿过肠壁而转 运。用该技术，完整肽的相对生物利用度范围为给药剂量的1％-10％。使用含有胆酸钠和蛋 白酶抑制剂的肠溶衣微胶囊剂，已经成功将胰岛素给予狗(Ziv等，1994，J.Bone Miner.Res.18(增刊2)：792-94。用酰基肉毒碱作为渗透增强剂和肠溶衣，已经完成了口服 给予肽(Eudragit L30D-55，Rohm Pharma Polymers，参见Mehta，2004)。用于口服给予肽的 赋形剂通常包括一种或多种肠道蛋白酶抑制剂/肽酶抑制剂以及去垢剂或其它试剂，以提 高肽的溶解度或吸收，它们可以包装在肠溶衣胶囊或片剂中(Mehta，2004)。胶囊中可以包 含有机酸，一旦胶囊在肠道中溶解时，这些有机酸就可酸化肠道并抑制肠道蛋白酶活性 (Mehta，2004)。口服给予肽的另一替代方法包括与基于缀合聚乙二醇(PEG)的两亲寡聚体 缀合，该两亲寡聚体增加吸收和对酶促降解的抗性(Soltero和Ekwuribe，2001， Pharm.Technol.6：110)。 [0317] 在又一些实施方案中，可以通过与某些蛋白质(例如IgG1的Fc区)缀合而修饰肽，用于口服或吸入给药(参见实施例3-7)。肽-Fc缀合物的制备和使用方法公开于例如Low等 (2005，Hum.Reprod.20：1805-13)和Dumont等(2005，J.Aerosol.Med.18：294-303)，所述各 文献通过引用结合到本文中。Low等(2005)公开了采用在CHO细胞中的重组表达，将FSH的α 和β亚基与IgG1 Fc区(单链或异型二聚体形式)缀合。Fc缀合的肽通过新生Fc受体介导的转 运系统吸收到肺或肠道上皮细胞中。与天然肽相比，Fc缀合的肽表现出稳定性提高，体内吸 收增加。还观察到异型二聚体缀合物要比单链形式的活性高。 [0318] 交联剂 [0319] 在某些实施方案中，可以使用本领域已知的各种交联剂，使蛋白质、肽或其它大分子共价交联，所述交联剂例如同型-双官能交联剂、杂双官能交联剂和/或光活化交联剂。这 类试剂的非限制性实例包括双亚氨酸酯(bisimidates)；1，5-二氟-2，4-(二硝基苯)；辛二 酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯；酒石酸二琥珀酰亚胺酯；二甲基-3，3′-二硫-双亚氨丙酸酯 (bispropionimidate)；N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯；4-(溴氨基乙基)-2-硝 基苯叠氮；和4-叠氮基乙二醛。在一个示例性的实施方案中，碳二亚胺交联剂，例如DCCD或 EDC，可用于将酸性残基与氨基或其它基团交联。这些试剂可以改性以连接不同类型的标 记，例如荧光标记。 [0320] 双官能交联剂已经广泛用于各种目的。携带两个相同官能团的同型双官能试剂已经证明能高效诱导相同或不同大分子或大分子的亚基间的交联，并将多肽配体与其特异性 结合位点连接。杂双官能试剂含有两个不同官能团。通过利用两个不同官能团的不同反应 性，可以有选择性地、按顺序控制交联。按官能团的特异性，可将双官能交联剂分为例如氨 基、巯基、胍基、吲哚基、羧基特异性基团。其中，针对游离氨基的试剂尤其常用，因为它们是 市售的，容易合成并且它们可用于温和反应条件。大部分杂双官能交联剂都含有伯氨基反 应基团和巯基反应基团。 [0321] 在另一实例中，已经描述了杂双官能交联剂及其使用方法(美国专利5,889,155)。交联剂将亲核酰肼残基与亲电子马来酰亚胺残基连接起来，在一个实例中让醛与游离巯基 偶联。这些交联剂可以改性以交联不同官能团。 [0322] 抗体 [0323] 不同实施方案可涉及靶标的抗体配体。本文所用的术语“抗体”是指具有抗原结合区的抗体样分子，包括抗体片段，例如Fab′、Fab、F(ab′)2、单域抗体(DAB)、Fv、scFv(单链 FV)等。各种基于抗体的构建体和片段的制备和使用技术是本领域众所周知的。抗体的制备 和表征方法也是本领域众所周知的(参见例如Harlowe和Lane，1988，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory)。所用的抗体也可以是市售的，得自 各种已知来源。例如，各种抗体分泌的杂交瘤系可得自美国典型培养物保藏中心 (AmericanType Culture Collection，ATCC，Manassas，VA)。 [0324] 抗体片段的制备 [0325] 要求保护的方法和/或组合物的某些实施方案可涉及抗体片段。这类抗体片段可用常规方法由胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗原而获得。例如，抗体片段可通过将抗体 用胃蛋白酶酶促切割而得到，以提供5S片段(称为F(ab′)2)。该片段还可用巯基还原剂切 割，并且任选将封闭基团用于来自二硫键分解得到的巯基，以产生3.5SFab′单价片段。或 者，用胃蛋白酶的酶促切割产生两个单价Fab片段和Fc片段。抗体片段的示例性制备方法公 开于美国专利第4,036,945号；美国专利第4,331,647号；Nisonoff等，1960， Arch.Biochem.Biophys.，89：230；Porter，1959，Biochem.J.，73：119；Edelman等，1967， METHODS IN ENZYMOLOGY，第422页(Academic Press)和Coligan等(编著)，1991，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，(JohnWiley & Sons)。 [0326] 也可采用切割抗体的其它方法，例如分离重链以形成单价轻链-重链片段、进一步切割片段或其它酶促、化学或遗传技术，只要片段能结合被完整抗体识别的抗原。例如，FV 片段包括VH和VL链的缔合。该缔合可以是非共价的，参见Inbar等，1972，Proc.Nat′ l.Acad.Sci.USA，69：2659。或者，可变链可以由分子间二硫键连接或由化学试剂(例如戊二 醛)交联。参见Sandhu，1992，Crit.Rev.Biotech.，12：437。 [0327] 优选的Fv片段包含由肽接头连接的VH链和VL链。通过构建包含DNA序列的结构基因，制备这些单链抗原结合蛋白(sFv)，所述DNA序列编码VH区和VL区，这两区由寡核苷酸接 头序列连接。将结构基因插入到表达载体中，随后导入宿主细胞例如大肠杆菌内。重组宿主 细胞合成单一多肽链，其具有接头肽连接两个V区。sFv的制备方法是本领域众所周知的。参 见Whitlow等，1991，Methods：ACompanion to Metnods in Enzymology 2：97；Bird等， 1988，Science，242：423；美国专利第4,946,778号；Pack等，1993，Bio/Technology，11：1271和Sandhu，1992，Crit.Rev.Biotech.，12：437。 [0328] 另一形式的抗体片段是编码单个互补决定区(CDR)的肽。通过构建目标抗体CDR的编码基因可以得到CDR肽(“最小识别单元”)。通过例如聚合酶链式反应制备这类基因，再由 产生抗体的细胞的RNA合成可变区。参见Larrick等，1991，Methods：ACompanion to Methods in Enzymology 2：106；Ritter等(编著)，1995，MONOCLONAL ANTIBODIES： PRODUCTION，ENGINEERINGAND CLINICAL APPLICATION，第166-179页(Cambridge UniversityPress)；Birch等(编著)，1995，MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND APPLICATIONS，第137-185页(Wiley-Liss，Inc.)。 [0329] 嵌合抗体和人源化抗体 [0330] 嵌合抗体是其中人抗体可变区已经被例如小鼠抗体的可变区取代的重组蛋白，所述重组蛋白包含小鼠抗体的互补决定区(CDR)。当给予患者时，嵌合抗体表现出免疫原性降 低，稳定性增加。嵌合抗体的构建方法是本领域众所周知的(例如Leung等，1994，Hybridoma 13：469)。 [0331] 可以使嵌合单克隆抗体人源化，即通过将来自小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区的小鼠CDR转移到人抗体相应可变区。嵌合单克隆抗体中的小鼠构架区(FR)也用人FR序列 取代。为了保护人源化单克隆的稳定性和抗原特异性，一种或多种人FR残基可以用小鼠相 应残基取代。人源化单克隆抗体可用于患者的治疗性治疗。通过选择性修饰CDR序列也可提 高人源化抗体对靶标的亲和性(WO0029584A1)。产生人源化单克隆抗体的技术是本领域众 所周知的。(参见例如Jones等，1986，Nature，321：522；Riechmann等，Nature，1988，332： 323；Verhoeyen等，1988，Science，239：1534；Carter等，1992，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA， 89：4285；Sandhu，Crit.Rev.Biotech.，1992，12：437；Tempest等，1991，Biotechnology 9： 266；Singer等，J.Immun.，1993，150：2844)。 [0332] 其它实施方案可涉及非人类灵长类抗体。在狒狒中产生治疗上有用的抗体的通用技术可参见例如Goldenberg等，WO91/11465(1991)和Losman等，Int.J.Cancer 46：310 (1990)。 [0333] 在另一个实施方案中，抗体可以是人单克隆抗体。这类抗体得自转基因小鼠，已对这些小鼠进行改造，以在响应抗原性攻击时产生特定人抗体。在该技术中，将人重链和轻链 基因座元件导入源自胚胎干细胞系的小鼠品系中，该类胚胎干细胞系含有定向破坏的内源 重链和轻链基因座。转基因小鼠可合成对人抗原具有特异性的人抗体，而且小鼠可用于产 生分泌人抗体的杂交瘤。从转基因小鼠获得人抗体的方法参见Green等，Nature Genet.7： 13(1994)，Lonberg等，Nature 368：856(1994)和Taylor等，Int.Immun.6：579(1994)。 [0334] 人抗体 [0335] 用组合方法或经人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物来产生完整人抗体的方法是本领域已知的(例如Mancini等，2004，NewMicrobiol.27：315-28；Conrad和Scheller， 2005，Comb.Chem.HighThroughput Screen.8：117-26；Brekke和Loset，2003， Curr.Opin.Phamacol.3：544-50；所述各文献通过引用结合到本文中)。与嵌合抗体或人源 化抗体相比，这样的完整人抗体有望表现出更少的副作用并且象内源性人抗体一样在体内 起作用。在某些实施方案中，要求保护的方法和过程可使用通过这类技术而产生的人抗体。 [0336] 在一个替代方案中，如上所述的噬菌体展示技术可用于产生人抗体(例如Dantas-Barbosa等，2005，Genet.Mol.Res.4：126-40，所述文献通过引用结合到本文中)。人抗体可 以由正常人或表现出特定疾病状态例如癌症的病人来产生(Dantas-Barbosa等，2005)。由 患病个体来构建人抗体的优点是：对于针对疾病相关抗原的抗体，循环抗体库 (repertoire)可以优先。 [0337] 在该方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等(2005)构建了来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。一般来说，总RNA得自循环血淋巴细胞(出处同上)。 从μ、γ和κ链抗体库克隆重组Fab库，并将其插入噬菌体展示文库(出处同上)。采用针对重 链和轻链免疫球蛋白序列的特定引物，将RNA转化为cDNA并用于制备Fab cDNA文库(Marks 等，1991，J.Mol.Biol.222：581-97，所述文献通过引用结合到本文中)。按照以下文献所述 方法构建文库：Andris-Widhopf等(2000，载于：Phage Display Laboratory Manual， Barbas等(主编)，第1版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY 第9.1-9.22页，所述文献通过引用结合到本文中)。最终Fab片段用限制性内切核酸酶消化， 插入到噬菌体基因组中，制备噬菌体展示文库。这样的文库可以用如上所述的标准噬菌体 展示方法来筛选。技术人员将会知道该技术仅仅是示例性的，任何通过噬菌体展示来制备 和筛选人抗体或抗体片段的已知方法都可使用。 [0338] 在另一替代方案中，使用如上所述的标准免疫方案，经基因工程改造以产生人抗体的转基因动物可用于产生针对几乎任何免疫原性靶标的抗体。这类系统的非限制性实例 是来自Abgenix(Fremont，CA)的XenoMouse (例如Green等，1999，J.Immunol.Methods 231：11-23，所述文献通过引用结合到本文中)。在XenoMouse 和类似动物中，小鼠抗体基 因已经被钝化并被功能性人抗体基因取代，而小鼠免疫系统的其余部分仍保留完整。 [0339] 用种系配置的YAC(酵母人工染色体)转化XenoMouse ，所述YAC含有部分人IgH和Igκ基因座，包含大部分可变区序列，辅助基因和调节序列。人可变区库可用于产生能产生 抗体的B细胞，所述细胞可用已知技术加工成杂交瘤。用靶抗原免疫的XenoMouse 将由正 常免疫应答产生人抗体，可以收获这类抗体和/或通过如上所述的标准技术来制备。 XenoMouse 的各种品系都是可得的，它们每个都能产生不同类别的抗体。这类人抗体可 以通过化学交联或其它已知方法与其它分子偶联。转基因产生的人抗体已经显示出具有治 疗潜力，同时又保留正常人抗体的药代动力学特性(Green等，1999)。技术人员将会知道，要 求保护的组合物和方法不限于使用XenoMouse 系统，也可使用经基因工程改造以产生人 抗体的任何转基因动物。 [0340] 用于克隆、基因转移和表达的载体 [0341] 在某些实施方案中，可以使用表达载体来表达肽或蛋白质，例如融合蛋白，然后再对其进行纯化和使用。表达需要的合适信号是由载体提供的，包括各种调节元件，例如来自 病毒或哺乳动物来源的增强子/启动子，它们驱动目标基因在宿主细胞中表达。也已知道设 计用于优化信使RNA在宿主细胞中的稳定性和可翻译性的元件。 [0342] 调节元件 [0343] 术语“ 表达构建体”或“表达载体”是指包括含有基因产物编码核酸的任何类型的遗传构建体，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录。在优选的实施方案中，编码基因产 物的核酸处于启动子的转录控制之下。“启动子”是指由这样的DNA序列：所述DNA序列是由 细胞合成机器识别的、或导入合成机器中的，所述DNA序列是启动基因的特异性转录所必需 的。术语“处于转录控制之下”是指启动子相对于核酸来说处于正确位置和方向，以控制RNA 聚合酶启动和基因表达。 [0344] 用于控制目标核酸序列表达的特定启动子并不认为是重要的，只要它能指导核酸在中靶细胞中的表达。因此当靶向人体细胞时，优选将核酸编码区放置在启动子附近并处 于启动子控制之下，使其能在人体细胞中表达。一般来说，这类启动子可包括人或病毒启动 子。 [0345] 在不同实施方案中，人巨细胞病毒(CMV)即时早期基因启动子、SV40早期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列、大鼠胰岛素启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，都可用 于得到目标编码序列的高水平表达。也包括使用本领域熟知的其它病毒启动子或哺乳动物 细胞启动子或噬菌体启动子，以达到目标编码序列的表达，只要表达水平足以满足预定目 的。 [0346] 当使用cDNA插入序列时，通常包含聚腺苷酸化信号，以引起基因转录物的适当聚腺苷酸化。对于本发明的成功实施来说，并不认为聚腺苷酸化信号的特性是关键性的，任何 这类序列都可使用，例如人生长激素和SV40聚腺苷酸化信号。也考虑到表达构建体元件是 终止子。这些元件可起到增加信使水平并减少从构建体到其它序列的阅读的作用。 [0347] 选择标记 [0348] 在某些实施方案中，可通过在表达构建体中包含标记，在体外或体内鉴定含有核酸构建体的细胞。这类标记赋予细胞可鉴定的变化，便于容易鉴定含有表达构建体的细胞。 通常包含的药物选择标记目的在于克隆和转化子的选择。例如，赋予以下药物抗性的基因 是有用的选择标记：新霉素、嘌罗霉素、潮霉素、DHFR、GPT、零霉素(zeocin)和组氨醇。或者，可以使用酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。也可使用免疫学 标记。并不认为所用的选择标记是重要的，只要它能与编码基因产物的核酸同时表达。选择 标记的其它实例是本领域技术人员众所周知的。 [0349] 所引用的所有参考文献，包括专利和专利申请，全都通过引用结合到本文中。 [0350] 实施例 [0351] 提供以下实施例，用于说明而非限制要求保护的本发明。 [0352] 由3个Fab亚基组成的非共价a2b复合物的制备方法 [0353] 实施例1.产生模块Fab亚基的通用策略 [0354] 产生了融合蛋白形式的Fab模块，其中含有DDD或AD序列。对每种Fab融合蛋白都开发了独立的转基因细胞系。模块一旦产生后，如有必要可以纯化模块，或者保留在细胞培养 上清液中。任何(Fab-DDD)2模块在产生出来之后，都可与任何Fab-AD模块结合产生双特异 性三价Fab(bsTF)。 [0355] 质粒载体pdHL2已用于产生各种抗体和基于抗体的构建体。参见Gillies等，J Immunol Methods(1989)，125：191-202；Losman等，Cancer(Phila)(1997)，80：2660-6。双顺 反子哺乳动物表达载体指导IgG重链和轻链的合成。对于许多不同IgG-pdHL2构建体来说， 载体序列大部分都相同，仅在可变区(VH和VL)序列中存在差异。采用本领域技术人员已知的 分子生物学工具，可将这些IgG表达载体转化成Fab-DDD或Fab-AD表达载体。为了产生Fab- DDD表达载体，将重链的铰链、CH2和CH3区的编码序列，用编码铰链的前4个残基、14个残基 的Gly-Ser接头和人RIIα前44个残基的序列取代(称为DDD1，图1)。为了产生Fab-AD表达载 体，将IgG的铰链、CH2和CH3区的序列，用编码铰链的前4个残基、15个残基的Gly-Ser接头和 17残基合成AD(称为AKAP-IS的序列取代(称为AD1，图2)，所述序列用生物信息学和肽阵列 技术来产生，并表现出以很高的亲和力与RIIα二聚体结合(0.4nM)。参见Alto等， Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.(2003)，100：4445-50。 [0356] 设计了两个穿梭载体，以便将如上所述的IgG-pdHL2载体转化成Fab-DDD1或Fab-AD1表达载体。 [0357] CH1的制备 [0358] 通过PCR扩增CH1区，用pdHL2质粒载体作为模板。PCR左引物由CH1区上游(5′)和SacII限制性内切核酸酶位点组成，它是CH1编码序列的5′。右引物由编码铰链的前4个残基 的序列(PKSC)、接着是GGGGS以及包含Bam HI限制位点的最后两个密码子(GS)组成。 [0359] CH1左引物的5′ [0360] 5’GAACCTCGCGGACAGTTAAG-3’(SEQ ID NO：5) [0361] CH1+G4S-Bam右 [0362] 5’GGATCCTCCGCCGCCGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGG-3’(SEQ ID NO：6) [0363] 将410bp PCR扩增产物克隆到pGemT PCR克隆载体(Promega，Inc.)中，筛选以T7(5′)方向插入的克隆。 [0364] (G4S)2DDD1的构建 [0365] 由Sigma Genosys(Haverhill，UK)合成双链体寡核苷酸(称为(G4S)2DDD1)以编码DDD1的氨基酸序列，DDD1之前是接头肽的11个残基，其中包含BamHI限制位点的前两个密码 子。终止密码子和EagI限制位点附加在3′端。所编码的多肽序列如下所示。 GSGGGGSGGGGSHIQPPGLTELLQGYTVEVLRQQPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：7) [0366] 合成了两个寡核苷酸(称为RIIA1-44上链和RIIA1-44下链)，在其3′端有30碱基对的重叠(Sigma Genosys)，结合以包含174bpDDD1序列的中间154碱基对。将寡核苷酸退火， 用Taq聚合酶进行引物延伸反应。 [0367] RIIA1-44上链 [0368] 5’GTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCAGGGCTACACGGTGGAGGTGCTGCGACAG-3’(SEQ ID NO：8) [0369] RIIA1-44下链 [0370] 5’GCGCGAGCTTCTCTCAGGCGGGTGAAGTACTCCACTGCGAATTCGACGAGGTCAGGCGGCTGCTGTCGCAGCACCTCCACCGTGTAGCCCTG-3’(SEQ ID NO：9) [0371] 引物延伸后，通过PCR扩增双链体，使用以下引物： [0372] G4S Bam-左 [0373] 5’-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3’(SEQ ID NO：10) [0374] 1-44 stop Eag右 [0375] 5’-CGGCCGTCAAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCG-3’(SEQ ID NO：11) [0376] 将该扩增产物克隆到pGemT中，筛选以T7(5′)方向插入的克隆。 [0377] (G4S)2-AD1的构建 [0378] 合成了双链体寡核苷酸(称为(G4S)2-AD1)(Sigma Genosys)以编码AD1的氨基酸序列，AD1之前是接头肽的11个残基，其中包含BamHI限制位点的前两个密码子。终止密码子 和EagI限制位点附加在3′端。所编码的多肽序列如下所示。 [0379] GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：12) [0380] 合成两个互补重叠寡核苷酸(称为AKAP-IS上链和AKAP-IS下链)。 [0381] AKAP-IS上链 [0382] 5’GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCTGACGGCCG-3’(SEQ IDNO：13) [0383] AKAP-IS下链 [0384] 5’CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCTGCCACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCGGATCC-3’(SEQ ID NO：14) [0385] 通过PCR扩增双链体，使用以下引物： [0386] G4S Bam-左 [0387] 5’-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3’(SEQ ID NO：15) [0388] AKAP-IS stop Eag右 [0389] 5’-CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATG-3’(SEQ ID NO：16) [0390] 将该扩增产物克隆到pGemT载体中，筛选以T7(5′)方向插入的克隆。 [0391] 将DDD1与CH1连接 [0392] 用BamHI和NotI限制酶从pGemT上切下编码DDD1序列的190bp片段，与CH1-pGemT上的相同位点连接，产生穿梭载体CH1-DDD1-pGemT。 [0393] 将AD1与CH1连接 [0394] 用BamHI和NotI限制酶从pGemT上切下含有AD1序列的110bp片段，与CH1-pGemT上的相同位点连接，产生穿梭载体CH1-AD1-pGemT。 [0395] 将CH1-DDD1或CH1-AD1克隆到基于pdHL2的载体中 [0396] 使用该模块设计，将CH1-DDD1或CH1-AD1掺入到pdHL2载体的任何IgG构建体中。完整重链恒定区用以上一个构建体取代，即通过从pdHL2上除去SacII/EagI限制片段(CH1- CH3)并将其用CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/EagI片段取代，所述CH1-DDD1或CH1-AD1的 SacII/EagI片段是从相应pGemT穿梭载体上切割下来的。 [0397] N端DDD结构域 [0398] DDD或AD的位置不限于CH1的羧基端。构建体经改造，其中DDD1序列连接在VH区的氨基端。 [0399] 实施例2：表达载体 [0400] h679-Fd-AD1-pdHL2的构建 [0401] h679-Fd-AD1-pdHL2是一种产生h679 Fab的表达载体，其中AD1通过由14个氨基酸残基组成的柔性Gly/Ser肽间隔区与FdCH1区羧基端连接。通过用CH1-AD1片段取代SacII/ EagI片段，将含有h679可变区的基于pdHL2的载体转化成h679-Fd-AD1-pdHL2，所述CH1-AD1 是用SacII和EagI从CH1-AD1-SV3穿梭载体上切割下来的。 [0402] C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2的构建 [0403] C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是一种产生稳定二聚体的表达载体，其包含两个拷贝的融合蛋白C-DDD1-Fab-hMN-14，其中DDD1在CH1的羧基端通过柔性肽间隔区与hMN-14Fab连 接。通过用SacII和EagI限制性内切核酸酶消化以除去CH1-CH3区并插入CH1-DDD1片段，将 已用于产生hMN-14IgG的质粒载体hMN14(I)-pdHL2，转化成C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2，所述 CH1-DDD1片段是用SacII和EagI从CH1-DDD1-SV3穿梭载体上切割下来的。N-DDD1-Fd-hMN- 14-pdHL2的构建 [0404] N-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是一种产生稳定二聚体的表达载体，其包含两个拷贝的融合蛋白N-DDD1-Fab-hMN-14，其中DDD1在VH的氨基端通过柔性肽间隔区与hMN-14Fab连 接。 [0405] 如下所示进行表达载体的改造。通过PCR扩增DDD1区，用如下所示的两个引物。 [0406] DDD1-Nco左 [0407] 5’CCATGGGCAGCCACATCCAGATCCCGCC-3’(SEQ ID NO：17) [0408] DDD1-G4SBam右 [0409] 5’GGATCCGCCACCTCCAGATCCTCCGCCGCCAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCGGGTG-3’(SEQ ID NO：18) [0410] 作为PCR的结果，将NcoI限制位点和含有BamHI限制位点的部分接头(G4S)2的编码序列分别附加在5′和3′端。将170bp PCR扩增产物克隆到pGemT载体中，筛选以T7(5′)方向 插入的克隆。用NcoI和SalI限制酶从pGemT载体上切下194bp插入片段并克隆到SV3穿梭载 体中，所述载体已用同样的酶消化而制备，产生中间载体DDD1-SV3。 [0411] 通过PCR，使用如下所示的寡核苷酸引物，扩增hMN-14Fd序列。 [0412] hMN-14VH左G4S Bam [0413] 5’-GGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGAGGTCCAACTGGTGGAGAGCGG-3’(SEQ IDNO：19) [0414] CH1-C stop Eag [0415] 5’-CGGCCGTCAGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTC-3’(SEQ ID NO：20) [0416] 作为PCR的结果，将BamHI限制位点和部分接头(G4S)的编码序列附加在扩增产物的5′端。将终止密码子和EagI限制位点附加在3′端。将1043bp扩增产物克隆到pGemT中。用 BamHI和EagI限制酶从pGemT上切下hMN-14-Fd插入片段并与DDD1-S V3载体连接，所述载体 已用同样的酶消化制备，产生构建体N-DDD1-hMN-14Fd-SV3。 [0417] 用XhoI和EagI限制酶切割N-DDD1-hMN-14Fd序列，将1.28kb插入片段与载体片段连接，所述载体片段是用同样的酶消化C-hMN-14-pdHL2而制备的。最终的表达载体是N- DDD1-Fd-hMN-14-pDHL2。 [0418] 实施例3.h679-Fab-AD1的制备和纯化 [0419] 用Sal I限制性内切核酸酶消化，使h679-Fd-AD1-pdHL2载体线性化，然后通过电穿孔转染到Sp/EEE骨髓瘤细胞中。该双顺反子表达载体指导h679κ轻链和h679 Fd-AD1的合 成和分泌，它们结合形成h679 Fab-AD1。电穿孔后，将细胞接种在96孔组织培养板上，用 0.05μM甲氨蝶呤(MTX)选择转染子克隆。通过ELISA，使用包被BSA-IMP-260(HSG)缀合物的 微量滴定板，筛选克隆的蛋白质表达，并用HRP-缀合的山羊抗人Fab进行检测。通过测定注 射稀释培养基样品所得的起始斜率，将用HSG(IMP-239)传感器芯片的BIAcore分析用于测 定生产率。最高产量的克隆的起始生产率约为30mg/L。经一步IMP-291亲和色谱，总共从4.5 升滚瓶培养物中纯化出230mg h679-Fab-AD1。通过超滤将培养基浓缩约10倍，然后上样到 IMP-291-affigel柱上。用PBS洗涤柱子到基线，用1M咪唑、1mM EDTA、0.1M NaAc(pH4.5)洗 脱出h679-Fab-AD1。对洗出液进行SE-HPLC分析显示，保留时间为9.63min的单个尖峰与 50kDa蛋白质一致。经还原型SDS-PAGE分析证明，仅有两个条带代表h679-AD1的多肽组分。 [0420] 实施例4.N-DDD1-Fab-hMN-14和C-DDD1-Fab-hMN-14的制备和纯化 [0421] 通过电穿孔，将C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2和N-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2载体转染到Sp2/0衍生的骨髓瘤细胞中。C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是双顺反子表达载体，指导hMN-14κ 轻链和hMN-14Fd-DDD1的合成和分泌，它们结合形成C-DDD1-hMN-14Fab。N-DDD1-hMN-14- pdHL2是双顺反子表达载体，指导hMN-14κ轻链和N-DDD1-Fd-hMN-14的合成和分泌，它们结 合形成N-DDD1-Fab-hMN-14。每种融合蛋白通过DDD1结构域相互作用形成稳定的同型二聚 体。 [0422] 电穿孔后，将细胞接种在96孔组织培养板上，用0.05μM甲氨蝶呤(MTX)选择转染子克隆。通过ELISA，使用包被WI2(针对hMN-14的大鼠抗id单克隆抗体)的微量滴定板，筛选克 隆的蛋白质表达，并用HRP-缀合的山羊抗人Fab进行检测。C-DDD1-Fab-hMN14Fab和N-DDD1- Fab-hMN14Fab克隆最高产量的克隆的起始生产率分别为60mg/L和6mg/L。 [0423] 用AD1-Affigel对N-DDD1-hMN-14和C-DDD1-hMN-14进行亲和纯化。 [0424] DDD/AD相互作用用于亲和纯化含有DDD1的构建体。AD1-C是经合成制备的肽，由AD1序列和羧基端半胱氨酸残基组成(参见实施例6)，用于在巯基与氯乙酸酐反应之后将肽 与Affigel偶联。含有DDD的a2结构在中性pH时与AD1-C-Affigel树脂特异性结合，而在低pH (例如pH2.5)时可被洗脱。 [0425] 经一步AD1-C亲和色谱，总共从1.2升滚瓶培养物中纯化出81mg C-DDD1-Fab-hMN-14。通过超滤将培养基浓缩约10倍，然后上样到AD1-C-affigel柱上。用PBS洗涤柱子到基 线，用0.1M甘氨酸(pH2.5)洗脱出C-DDD1-Fab-hMN-14。对洗出液进行SE-HPLC分析显示，保 留时间为8.7min的单个蛋白质峰与107kDa蛋白质一致。经还原型SDS-PAGE也证实了其纯 度，表明在分子大小上仅有两个条带预期代表C-DDD1-Fab-hMN-14的两种多肽组分。 [0426] 经如上所述的一步AD1-C亲和色谱，总共从1.2升滚瓶培养物中纯化出10mgN-DDD1-hMN-14。对洗出液进行SE-HPLC分析显示，保留时间为8.77min的单个蛋白质峰类似于 C-DDD1-Fab-hMN-14，与107kDa蛋白质一致。还原型SDS-PAGE显示仅两个条带代表N-DDD1- Fab-hMN-14的多肽组成。 [0427] 通过SE-HPLC分析，测定样品中C-DDD1-Fab-hMN-14的结合活性，其中将试验品与不同数量的WI2混合。将WI2 Fab与C-DDD1-Fab-hMN-14按照0.75∶1的摩尔比混合，制备样 品，显示3个峰，代表未结合C-DDD1-Fab-hMN 14(8.71min)、与一个WI2 Fab结合的C-DDD1- Fab-hMN-14(7.95min)和与两个WI2 Fab结合的C-DDD1-Fab-hMN 14(7.37min)。当分析含有 WI2 Fab和C-DDD1-Fab-hMN-14的摩尔比为4的样品时，仅见一个峰(7.36分钟)。这些结果证 明hMN14-Fab-DDD1是二聚体，具有两个活性结合位点。当该实验用N-DDD1-Fab-hMN-14重复 时，得到非常类似的结果。 [0428] 竞争性ELISA证明C-DDD1-Fab-hMN-14和N-DDD1-Fab-hMN-14与CEA结合的亲合力类似于hMN-14IgG，显著大于单价hMN-14Fab。ELISA板用含有CEA表位(A3B3)的融合蛋白包 被，hMN-14对该表位具有特异性。 [0429] 实施例5.a2b复合物的形成 [0430] 对含有等摩尔量的C-DDD1-Fab-hMN-14(作为a2)和h679-Fab-AD1(作为b)的混合物进行SE-HPLC分析，首次提供了a2b复合物形成的证据。当分析这种样品时，可见单个峰 (保留时间8.40分钟)，这与新蛋白的形成是一致的，大于单独的h679-Fab-AD1(9.55min)或 C-DDD1-Fab-hMN-14(8.73min)。当hMN-14F(ab′)2与h679-Fab-AD1或C-DDD1-Fab-hMN-14与 679-Fab-NEM混合时，没有观察到高磁场位移(ufpfield shift)，证明相互作用是通过DDD1 和AD1结构域特异性介导的。用h679-Fab-AD1和N-DDD1-Fab-hMN-14得到非常类似的结果。 [0431] BIAcore用于进一步证明和表征DD1与AD1融合蛋白间特异性相互作用。该实验进行如下：首先让h679-Fab-AD1或679-Fab-NEM与高密度的偶联HSG的(IMP239)传感器芯片表 面结合，然后再注射C-DDD1-Fab-hMN-14或hMN-14 F(ab′)2。不出所料，仅h679-Fab-AD1和 C-DDD1-Fab-hMN-14的组合，在响应单元中产生进一步增加(当注射后者时)。用N-DDD1- Fab-hMN-14和h679-Fab-AD1得到类似结果。 [0432] 进行平衡SE-HPLC实验，确定相应融合蛋白中存在的AD1与DDD1间特异性相互作用的结合亲和性。h679-Fab-AD1与C-DDD1-Fab-hMN-14、N-DDD1-hMN-14和重组人RIIα市售样 品结合的解离常数(Kd)分别为15nM、8nM和30nM。 [0433] 其它相关方法 [0434] 实施例6.Di-AD1的产生 [0435] 在本实施例中，经合成制备具有如下所示氨基酸序列的小多肽(AD1-C)。 [0436] NH2-KQIEYLAKQIVDNAIQQAKGC-COOH(SEQ ID NO：29) [0437] 在AD1-C中，AD1氨基酸序列(加下划线部分)邻接N-端赖氨酸残基和羧基端KGC三肽。为了增加溶解度而引入两个赖氨酸(K)残基，为了增加柔性而将甘氨酸(G)残基插入在C 端半胱氨酸之前。用DMSO处理后，AD1-C氧化成为二聚体，称为Di-AD1，用RP-HPLC纯化。Di- AD1的示意结构如下所示(＝表示二硫桥) [0438] NH2-KQIEYLAKQIVDNAIQQAKGC＝CGKAQQIANDVIQKALYEIQK-NH2(SEQ IDNO：21) [0439] Di-AD1或AD1-C中存在大量官能团，可用于进一步修饰。例如，Di-AD1和AD1-C分别含有8个和4个伯氨基，可用于偶联药物、毒素、蛋白质或其它效应物。此外，Di-AD1和AD1- C分别具有2个和1个酪氨酸残基，可用于放射性碘化。最终，AD1-C含有游离半胱氨酸残基， 也可用于偶联效应物或形成含有效应物的Di-AD1类似物。 [0440] 实施例7.新的预靶向方法 [0441] 本发明的方法适用于新的预靶向方法。以下提供了预靶向系统的实例，它们采用亲和力增强系统(Le Doussal等，J Nucl Med(1989)，30：1358-66)而无须半抗原结合抗体。 C-DDD1-Fab-hMN-14或N-Fab-DDD2-hMN-14的二聚体(按照实施例4而制备)可用于预靶向肿 瘤。先将107kDa蛋白经静脉内给予患者，让其与肿瘤上的CEA结合，同时从血和正常组织中 清除掉。稍后，经静脉内给予二价肽，例如携带治疗用放射性同位素(例如90Y)或诊断用放射 性同位素(例如111In)的Di-AD1的DOTA缀合物。小肽(～5000Da)，在从血和正常组织中快速 清除的同时，定位在肿瘤上，因为它含有预期与C-DDD1-Fab-hMN-14特异性相互作用的两个 AD序列，所述C-DDD1-Fab-hMN-14已由肿瘤保留。 [0442] 经SE-HPLC证明C-DDD1-Fab-hMN-14与Di-AD1在体外交联。当C-DDD1-Fab-hMN-14与Di-AD1混合时，蛋白质峰从8.67min变为7.95min，表明形成了交联结构。当hMN-14F (ab′)2与Di-AD1混合时则没有这样的变化，证明交联是由DDD1与AD1间的相互作用所介导。 为了证实峰的改变事实上是因为C-DDD1-Fab-hMN-14的特异性交联，用DTT还原复合物以切 割Di-AD1的二硫键，导致峰又变回8.67min。 [0443] 实施例8.DDD或AD融合蛋白的亲和纯化 [0444] 通过产生DDD或AD蛋白，可开发通用亲和纯化系统，其具有更低亲和力停靠。与RIIα相比，由RIα二聚体形成的DDD与AKAP-IS(AD1)的亲和力要低500倍(225nM)。因此，可以产 生由前44个氨基酸残基形成的RIα二聚体，并与树脂偶联以制备具有吸引力的亲和基质，用 于任何含有AD1的融合蛋白的纯化。 [0445] 自然界存在许多更低亲和力(0.1μM)AKAP锚定结构域。必要时，可引入高度可预测的氨基酸取代，进一步降低结合亲和性。可以通过合成或生物学方法产生低亲和力AD，并与 树脂偶联，用于任何DDD1融合蛋白的亲和纯化。 [0446] 制备稳定束缚结构的相关方法 [0447] 实施例9.产生由三个Fab片段组成的二硫化物稳定化结构的载体N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2 [0448] N-DDD2-hMN-14-pdHL2是一种产生N-DDD2-Fab-hMN-14的表达载体，具有DDD2的二聚化和停靠结构域序列，其中DDD2附加在Fd的氨基端(图4A)。DDD2通过15个氨基酸残基 Gly/Ser肽接头与VH区偶联。DDD2在二聚化和停靠序列之前具有一个半胱氨酸残基，这与 DDD1相同。所分泌的融合蛋白由两个相同拷贝的hMN-14Fab通过DDD2结构域的非共价相互 作用连接在一起(图4B)。 [0449] 如下所述对表达载体进行改造。合成制备两个重叠互补寡核苷酸(DDD2上链(DDD2 Top)和DDD2下链(DDD2 Bottom))，其包含DDD2的残基1-13。将寡核苷酸退火，用T4多核苷酸 激酶(PNK)磷酸化，导致在5′和3′端产生突出端(overhang)，这适于分别用限制性内切核酸 酶NcoI和PstI进行DNA消化后的连接。 [0450] DDD2上链 [0451] 5’CATGTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA-3’(SEQID NO：22) [0452] DDD2下链 [0453] 5’GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCA-3’(SEQ ID NO：23) [0454] 将双链体DNA与载体片段DDD1-hMN14 Fd-SV3连接起来(后者是用NcoI和PstI消化而制备的)，产生中间构建体DDD2-hMN14 Fd-SV3。用XhoI和EagI限制性内切核酸酶，从中间 构建体上切下含有DDD2-hMN14 Fd编码序列的1.28kb插入片段，与用相同的酶消化而制备 的hMN14-pdHL2载体DNA连接在一起。最终的表达载体是N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2(图5)。 [0455] C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2 [0456] C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2是一种产生C-DDD2-Fab-hMN-14的表达载体，具有DDD2的二聚化和停靠结构域序列，其中DDD2通过14个氨基酸残基Gly/Ser肽接头附加在Fd的羧 基端(图6A)。所分泌的融合蛋白由两个相同拷贝的hMN-14Fab通过DDD2结构域的非共价相 互作用连接在一起(图6B)。 [0457] 如下所述对表达载体进行改造。合成制备两个重叠互补寡核苷酸，其包含部分接头肽的编码序列(GGGGSGGGCG)和DDD2残基1-13。将寡核苷酸退火，用T4 PNK磷酸化，导致在 5′和3′端产生突出端，这适于分别用限制性内切核酸酶BamHI和PstI进行DNA消化后的连 接。 [0458] G4S-DDD2上链 [0459] 5’GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA-3’(SEQ ID NO：24) [0460] G4S-DDD2下链 [0461] 5’GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCAACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3’(SEQ ID NO：25) [0462] 将双链体DNA与穿梭载体CH1-DDD1-pGemT连接起来(后者是用BamHI和PstI消化而制备的)，产生穿梭载体CH1-DDD2-pGemT。用SacII和EagI从CH1-DDD2-pGemT上切下507bp片 段，与用SacII和EagI消化而制备的IgG表达载体hMN14(I)-pdHL2连接在一起。最终的表达 构建体是C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2(图7)。h679-Fd-AD2-pdHL2 [0463] 设计了h679-Fab-AD2作为B与N-DDD2-Fab-hMN-14或C-DDD2-Fab-hMN-14配对。h679-Fd-AD2-pdHL2是一种产生h679-Fab-AD2的表达载体，具有AD2锚定结构域序列，其中 AD2通过14个氨基酸残基Gly/Ser肽接头附加在CH1区的羧基端(图8)。AD2具有两个半胱氨 酸残基，其中一个在AD1锚定结构域序列之前，而另一个在AD1锚定结构域序列之后。 [0464] 如下所述对表达载体进行改造。合成制备两个重叠互补寡核苷酸(AD2上链和AD2下链)，其包含AD2的编码序列和部分接头序列。将寡核苷酸退火，用T4 PNK磷酸化，导致在 5′和3′端产生突出端，这适于分别用限制性内切核酸酶BamHI和SpeI进行DNA消化后的连 接。 [0465] AD2上链 [0466] 5’GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGATGTGGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAG CAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCGGCTGCTGAA-3’(SEQ ID NO：26) [0467] AD2下链 [0468] 5’TTCAGCAGCCGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCCACATCCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3’(SEQ ID NO：27) [0469] 将双链体DNA与穿梭载体CH1-AD1-pGemT连接起来(后者是用BamHI和SpeI消化而制备的)，产生穿梭载体CH1-AD2-pGemT。用SacII和EagI从穿梭质粒上切下含有CH1和AD2编 码序列的429碱基对片段，与用相同酶消化而制备的h679-pdHL2载体连接在一起。最终的表 达载体是h679-Fd-AD2-pdHL2(图9)。 [0470] 实施例10.h679-Fab-AD2的产生 [0471] 通过电穿孔，将h679-Fd-AD2-pdHL2载体转染到Sp/EEE骨髓瘤细胞中。该双顺反子表达载体指导h679κ轻链和h679 Fd-AD2的合成和分泌，两者结合形成h679-Fab-AD2。在AD 两端的半胱氨酸残基提供两个潜在的反应性巯基。电穿孔后，将细胞接种在96孔组织培养 板上，用0.05μM甲氨蝶呤(MTX)选择转染子克隆。通过ELISA，使用包被BSA-IMP-260(HSG)缀 合物的微量滴定板，筛选克隆的蛋白质表达，并用山羊抗人Fab-HRP进行检测。通过测定注 射稀释培养基样品所得的起始斜率，将用HSG(IMP-239)传感器芯片的BIAcore分析用于测 定生产率。最高产量的克隆的起始生产率约50mg/L。经一步IMP-291亲和色谱，总共从2.9升 滚瓶培养物中纯化出160mg h679-Fab-AD2。通过超滤将培养基浓缩约10倍，然后上样到 IMP-291-affigel柱上。用PBS洗涤柱子到基线，用1M咪唑、1mM EDTA、0.1M NaAc(pH4.5)洗 脱出h679-AD2。SE-HPLC分析显示，保留时间约为10min的单尖峰与50kDa蛋白质一致(图 10)。当该物质与hMN14-Fab-DDD1混合时，仅1/3具有反应性，因为在SE-HPLC图谱上明显可 见由二元复合物产生的一个新峰。然而，用TCEP还原h679-Fab-AD2，可得到100％活性。这表 明(1)AD2的两个半胱氨酸残基间可形成分子内二硫键(图11A)，阻止了与DDD的结合但也保 护了巯基不与其他物质反应；和(2)还原反应可打断该分子内二硫桥，产生带有两个游离巯 基的DDD-反应性锚定结构域(图11B)。 [0472] 通过电穿孔，将N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2载体转染到Sp/EEE骨髓瘤细胞中。该双顺反子表达载体指导hMN-14κ轻链和N-DDD2-hMN-14Fd的合成和分泌，二者结合形成N- DDD2-hMN14Fab。通过DDD2可以预期经二聚化形成A2结构，产生由每个DDD2中的半胱氨酸残 基提供的两个潜在的反应性巯基。电穿孔后，将细胞接种到96孔组织培养板中，用0.05μM甲 氨蝶呤(MTX)筛选转染子克隆。 [0473] 通过ELISA，使用包被WI2(hMN-14抗Id)的微量滴定板，筛选克隆的蛋白质表达，并用山羊抗人Fab-HRP进行检测。最高产量的克隆的起始生产率约10mg/L。通过蛋白L亲和色 谱，总共从1.8升滚瓶培养物中纯化出16mg N-DDD2-hMN-14。通过超滤将培养基浓缩约10 倍，然后上样到蛋白L亲和色谱柱上。用PBS洗涤柱子到基线，用1mM EDTA、0.1M NaAc (pH2.5)洗脱出N-DDD2-hMN14，然后立即用Tris-HCl中和。SE-HPLC分析显示4个蛋白质峰 (图12)，其中2个随后被鉴定为N-DDD2-Fab-hMN-14的a4形式(7.9min)和a2形式(8.8min)，另 两个分别是κ链的二聚体和单体。该混合物显示出对h679-Fab-AD1几乎没有结合活性，除非 加入巯基还原剂(例如TCEP)，将大部分的a4形式转变为a2形式(图13)。这些数据表明(1)通 过DDD2中存在的半胱氨酸连接两个a2结构而形成a4，从而阻止与AD的缔合但也保护了巯基 不与其它物质反应(图14A)；和(2)还原反应可打断该分子内二硫桥，产生带有两个游离巯 基的AD-反应性DDD二聚体的a2结构(图14B)。注意这一副产物(a4)由四个活性Fab亚基组成。 即使在高TCEP浓度和长反应时间时，约15％的总N-DDD2-Fab-hMN-14仍在还原后保持A4形 式(图13)。这表明，除了二硫桥外，还有其它机制例如结构域交换(domain swapping)也可 导致a4形式的形成。 [0474] 实施例12.C-DDD2-Fab-hMN-14的制备 [0475] 通过电穿孔，将C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2载体转染到Sp/EEE骨髓瘤细胞中。该双顺反子表达载体指导hMN-14κ轻链和C-DDD2-Fd-hMN-14的合成和分泌，二者结合形成C- DDD2-Fab-hMN14。象N-DDD2-Fab-hMN-14一样，通过DDD2可以预期经二聚化形成a2结构，产 生由每个DDD2中的半胱氨酸残基提供的两个潜在的反应性巯基。电穿孔后，将细胞接种到 96孔组织培养板中，用0.05μM甲氨蝶呤(MTX)筛选转染子克隆。 [0476] 通过ELISA，使用包被WI2(hMN-14抗Id)的微量滴定板，筛选克隆的蛋白质表达，并用山羊抗人Fab-HRP进行检测。最高产量的克隆的起始生产率约为100mg/L，这比N-DDD2- Fab-hMN-14高出10倍。按照实施例3所述，通过蛋白L亲和色谱，总共从1.8升滚瓶培养物中 纯化出200mg C-DDD2-hMN-14。蛋白L-纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14的SE-HPLC分布图(图15) 类似于N-DDD2-Fab-hMN-14。4个蛋白质峰中有两个经鉴定为C-DDD2-Fab-hMN-14的a4形式 (8.40min)和a2形式(9.26min)，另两个分别是κ链的二聚体和单体。该混合物显示出对 h679-AD1几乎没有结合活性，除非加入巯基还原剂(例如TCEP)，将大部分的a4形式转变为a2 形式(图16)，然后紧密结合h679-AD1。这些数据表明，C-DDD2-Fab-hMN-14是N-DDD2-hMN-14 的功能性等同物。 [0477] 实施例13.TF1的产生 [0478] 设计了h679-Fab-AD2作为B组分与a2组分例如N-DDD2-hMN-Fab-14或C-DDD2-hMN-14配对，它们一旦结合将易缔合在一起形成a2b结构(图17A)，其还可经诱导而通过二硫键 共价结合(图17B)。因为N-DDD2-和AD2-构建体的表征证明，各自的还原作用是达到完全 DDD/AD相互作用所需要的，所以过程还包括还原步骤。首先，用固定化TCEP作为还原剂，以 节省除去还原剂所需要的时间。在室温下还原1小时后，离心除去TCEP-琼脂糖，将DMSO加入 到反应液中，终浓度达10％。BIAcore分析证明是共价连接a2b复合物(下文称为TF1)存在的 第一个证据。 [0479] 在小规模反应中使用固定化TCEP确定了可行性之后，如下所述对TF1进行大规模生产。首先按照大致的化学计量浓度将N-DDD2-Fab-hMN-14(蛋白L-纯化的)与h679-Fab- AD2(IMP-291-纯化的)在含1mM EDTA的PBS(pH7.4)中混合。加入TCEP之前，SE-HPLC未显示 出a2b形成的任何证据(图18A)。而是具有代表a4(7.97min；200kDa)、a2(8.91min；100kDa)和 b(10.01min；50kDa)的峰。加入5mM TCEP快速导致a2b复合物的形成，与150kDa蛋白一致的、 在8.43min的新峰证明了这一点(图18B)。该实验中显然有过量的B，因为h679-Fab-AD2 (9.72min)所产生的峰仍是明显的，但是对于a2或a4则未见明显的峰。还原反应1小时后，针 对几次更换的PBS进行透析过夜，除去TCEP。所得溶液加入10％DMSO并在室温下保存过夜。 [0480] 当用SE-HPLC分析时(图18C)，代表a2b的峰明显变尖，保留时间稍微降低了0.1min，变为8.31min(图18C)，根据我们先前的发现，这表示结合亲和性提高了。该复合物 通过IMP-291亲和色谱进一步纯化以除去κ链杂质。不出所料，过量h679-AD2一起被纯化出 来，然后用制备型SE-HPLC除去(图18D)。 [0481] 图19清楚地证明TF1是高度稳定的复合物。当测定TF1与HSG(IMP-239)传感器芯片结合时，在样品注射结束之后所观察的响应未见明显降低，相比之下，当在类似条件下测定 含有等摩尔混合物的C-DDD1-Fab-hMN-14和h679-Fab-AD1的溶液时，在样品注射期间和刚 注射完后，所观察到的响应单元的增加伴随着可检测的下降，表明开始形成的a2b结构不稳 定。此外，尽管随后注射WI2，在针对TF1的响应单元中引起大幅度的增加，但是对于C-DDD1/ AD1混合物来说没有明显增加。 [0482] 因WI2与固定在传感器芯片上的TF1结合而导致的响应单元的额外增加，对应于两个完整的功能性结合位点，其各自是由N-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚基引起的。TF1与WI2的 两个Fab片段的结合能力证实了这一点，如图20所示。在含有h679-AD2和N-DDD1-hMN 14的 混合物被还原和氧化成为TF1后，当用BIAcore分析时，WI2几乎没有额外结合(图21)，表明 二硫键稳定的a2b复合物(例如TF1)仅通过DDD2与AD2的相互作用而形成。 [0483] 对该过程进行了两个改进，以减少过程的时间和效率。首先，用a4/a2结构混合物中存在的稍微过量摩尔数的N-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2反应，使得没有游离的h679- Fab-AD2存在，而未束缚在h679-Fab-AD2的任何a4/a2结构以及轻链，都用IMP-291亲和色谱 除去。第二，疏水作用色谱(HIC)代替透析或渗滤，在还原反应后用于除去TCEP，这不仅缩短 过程时间，而且增加了潜在病毒的去除步骤。N-DDD2-Fab-hMN-14与679-Fab-AD2混合，用 5mMTCEP在室温下还原1小时。溶液加入0.75M硫酸铵，然后上样到丁基FF HIC柱上。用含 0.75M硫酸铵、5mM EDTA的PBS洗柱，以除去TCEP。用PBS从HIC柱上洗脱还原蛋白，加入10％ DMSO。在室温下孵育过夜后，用IMP-291亲和色谱分离出高度纯化的TF1(图22)。无需额外的 纯化步骤，例如凝胶过滤。 [0484] 实施例14.TF2的产生 [0485] 成功产生TF1之后，将C-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2反应，也得到一种类似物，称为TF2(图23)。与TF1相比，TF2有两个潜在优势。首先，C-DDD2-Fab-hMN-14的产量比N- DDD2-Fab-hMN-14高出10倍。第二，与带有N端DDD结构域的融合蛋白相比，带有C端DDD结构 域的融合蛋白表现出明显更强的CEA-结合亲合力。这可能归功于结构域的排列，其中因为 位阻影响，N-DDD变异体的结合可能会降低。 [0486] 如下所述，经中试生产一批TF2，收率＞90％。将蛋白L-纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)与h679-Fab-AD2(60mg)按照1.4∶1的摩尔比混合。总蛋白浓度为1.5mg/ml含有1mM EDTA的PBS。后续步骤包括TCEP还原、HIC色谱、DMSO氧化和IMP-291亲和色谱，都与TF1所述 相同。加入TCEP之前，SE-HPLC未显示出a2b形成的任何证据(图24A)。而是具有代表a4 (8.40min；215kDa)、a2(9.32min；107kDa)和b(10.33min；50kDa)的峰。加入5mM TCEP快速导 致a2b复合物的形成，正如在8.77min的新峰所证明的那样(图24B)，该峰与二元结构所预期 的157kDa蛋白是一致的。图25A中的图谱显示从HIC和DMSO处理洗脱后收集的流分量。用 IMP-291亲和色谱将TF2纯化至几乎均一(图25C)。对IMP-291未结合流分进行的SE-HPLC分 析证明从产物中除去了a4、a2和游离κ链(图25B)。 [0487] 非还原型SDS-PAGE分析证明，大多数TF2以大的共价结构形式存在，相对迁移率类似于IgG(图26A)。额外的条带表明，在实验条件下，二硫键形成不完全。还原型SDS-PAGE显 示，在非还原型凝胶中明显的任何额外条带都与产物相关(图26B)，因为仅一个代表TF2的 组成性多肽的条带是明显的。然而，4个多肽中每一个的相对迁移率都非常接近，以致于无 法分辨。MALDI-TOF质谱(图27)揭示了156,434Da的单峰，是在TF2的计算分子量(157, 319Da)的99.5％之内。 [0488] 按照TF1所述的BIACORE测定TF2的功能，结果见图28。将TF2、C-DDD1-hMN-14+h679-AD1(用作非共价a2b复合物的对照样品)或C-DDD2-hMN-14+h679-AD2(用作非还原a2和 b组分的对照样品)稀释至1μg/ml(总蛋白)并通过固定了HSG的传感器芯片。对TF2的响应是 两个对照样品反应的约2倍，表明对照样品中仅有h679-Fab-AD组分与传感器芯片结合并保 留在其上。随后注射WI2 IgG，证明仅有TF2具有能与h679-Fab-AD紧密结合的DDD-Fab-hMN- 14组分，正如额外的信号响应所示。因WI2与固定在传感器芯片上的TF2结合而导致的响应 单元的额外增加，也对应于两个完整的功能性结合位点，每个都是由C-DDD2-Fab-hMN-14的 一个亚基引起的。TF2与WI2的两个Fab片段的结合能力证实了这一点，如图29所示。 [0489] 通过竞争性ELISA测定TF2的相对CEA-结合亲合力(图30)。用含有CEA的A3B3结构域的融合蛋白包被各板(0.5μg/孔)，所述蛋白被hMN-14识别。连续稀释TF1、TF2和hMN-14 IgG，一式四份，在含有缀合HRP的hMN-14IgG(1nM)的孔中孵育。数据显示TF2结合CEA的亲合 力与IgG相比至少相等，比TF1强2倍。这毫不奇怪，因为先前在类似测定中，与hMN-14 IgG相 比，发现C-DDD1-Fab-hMN-14具有更强的CEA-结合亲合力，这反过来比N-DDD1-Fab-hMN-14 结合得更紧密。C-DDD-Fab-hMN-14比亲本IgG亲合力明显增加的一个可能的解释就是：前者 中的Gly/Ser接头提供了比IgG更柔性的分子。尽管N-DDD变异体也具有柔性肽接头，但CEA 结合位点的位置彼此接近并邻近DDD二聚体，导致亲合力下降。 [0490] 将TF1和TF2设计成可用于体内的稳定束缚结构，其中在血液和组织中会发生大量稀释。用BIACORE评价人血清中TF2的稳定性，结果见图31。将TF2用新鲜人血清(是从4个供 体合并而获得的)稀释至0.1mg/ml并在5％CO2、37℃孵育数天。每天取样按1∶25进行稀释， 通过BIACORE进行分析，使用IMP-239 HSG传感器芯片。注射WI2 IgG，用于定量测定完整而 完全活性的TF2量。将血清样品与从贮液直接稀释的对照样品进行比较。TF2在血清中是高 度稳定的，7天后仍保持98％的双特异性结合活性。TF1在人或小鼠血清中也得到类似结果。 [0491] 实施例16.TF2在荷瘤小鼠体内的生物分布 [0492] 在携带皮下(s.c)人结肠直肠腺癌异种移植物(LS 174T)的雌性无胸腺裸鼠中，对TF2进行生物分布研究。在组织培养物中扩增细胞，直到细胞生长到足以皮下(s.c.)注射50 只小鼠，1×107细胞/小鼠。一周后测量肿瘤，将小鼠分为每时间点5只小鼠一组。该研究开 始时，平均肿瘤大小为0.141±0.044cm3。给所有小鼠都注射40μg125I-TF2(250pmol，2μCi)。 然后，在注射后0.5、2、4、16、24、48和72小时处死小鼠并进行尸检。该研究总共使用35只小 鼠。取出肿瘤以及不同组织并放在γ-计数器中，以测定组织中各时间点的％注射剂量/克 (％ID/g)。 [0493] 125I-TF2的放射性碘化产生2.7％未结合同位素，比活1.48mCi/mg。然后将标记样品单独进行SE-HPLC，以及在与20倍摩尔数过量的CEA混合后再进行SE-HPLC。约83％TF2在 保留时间为10.1分钟时洗脱下来。在标记TF2中有9％聚集物(RT＝9.03min)和8％低分子量 物(RT＝14.37min)。当与CEA混合时，95％的标记TF2变成高分子量物质(RT＝7.25min)。这 些结果表明，标记制剂对于给予荷瘤小鼠来说是可接受的。 [0494] 表1列出肿瘤和不同组织中的％ID/g计算值。肿瘤峰摄取发生在注射后4h(10.3±2.1％ID/g)。在注射后16-24小时间，肿瘤中的TF2含量没有明显不同(5.3±1.1％ID/g和 5.37±0.7％ID/g)，表明在这两个时间点之间可按血中的数值给予肽，而不影响肿瘤靶向。 TF2从正常组织中的摄取和清除非常类似于先前对TF1进行的观察。TF1和TF2看来都证实通 过RES系统(脾和肝)清除。 [0495] 也评价了TF2在荷瘤小鼠中的血PK，发现它们表现出双相清除。用WinNonlin Nonlinear Estimation Program(v.4.1)提供的二室分析，对这些数据进行了分析，所测参 数见表2。 [0496] 实施例17.在荷瘤小鼠中用TF2进行预靶向 [0497] 在携带皮下(s.c.)人结肠直肠腺癌异种移植物(LS 174T)的雌性无胸腺裸鼠中，用TF2进行预靶向研究。在组织培养物中扩增细胞，直到细胞生长到足以皮下(s.c.)注射55 只小鼠，1×107细胞/小鼠。一周后测量肿瘤，将小鼠分为每时间点5只小鼠一组。该研究开 始时，平均肿瘤大小为0.105±0.068cm3。给20只小鼠注射80μg125I-TF2(500pmol，2μCi)，然 后在16小时后给予99mTc-IMP-245(40μCi、92ng、50pmol)。在注射肽后0.5、1、4和24小时处死 小鼠并进行尸检。另外，24小时时间点组的3只小鼠在注射后1、4和24小时用γ-照相机照 相。作为对照，3只额外小鼠仅接受99mTc-IMP-245(无预靶向)并在注射后1、4和24小时照相， 照相后24小时再进行尸检。取出肿瘤以及不同组织并放在γ-计数器中，以测定组织中各时 间点的％ID/g。 [0498] 测定125I-TF2和用125I-TF2预靶向的99mTc-IMP-245的％ID/g值，分别概述于表3和4。在注射肽后前4小时(或给予TF2后20h)，TF2水平保持相对不变，范围为6.7±1.6％ID/g (在注射肽后0.5h，即给予TF2后16.5h)至6.5±1.5％ID/g(在4h时间点，即给予TF2后20h)。 在注射肽后0.5、1、4和24小时，用TF2预靶向的IMP-245的肿瘤摄取值(％ID/g)为22±3％、 30±14％、25±4％和16±3％。 [0499] 对于正常组织来说，在每个时间点进行检测，在用TF2预靶向的小鼠中，肝、肺和血液中肽含量明显低于用迄今为止开发的其它预靶向剂所得到的结果(Rossi等，Clin Cancer Res.2005；11(增刊19)：7122s-7129s)。这些数据表明TF2通过正常器官有效清除， 未留下与随后给予的肽结合的任何残余片段。 [0500] 高的肿瘤摄取以及在正常组织的低水平，导致良好的肿瘤∶非肿瘤(T/NT)比率(表5)，因而确认TF2是合适的预靶向剂，用于将基于di-HSG的效应物定位到产生CEA的肿瘤上。 [0501] 实施例18.用谷胱甘肽氧还系统产生TF2 [0502] 作为以上实施例13和14中公开方法的一个替代实施方案，可用谷胱甘肽氧还系统产生稳定束缚结构(例如TF1或TF2)，以形成特异性二硫键连接的稳定束缚结构。 [0503] 如下所述，完成了产生TF2的简便有效方法。全部过程都在室温下进行。首先按照大致的化学计量浓度将C-DDD2-Fab-hMN-14(蛋白L-纯化的)与h679-Fab-AD2(IMP-291-纯 化的)在含1mMEDTA的PBS(pH 7.4)中混合。加入还原型谷胱甘肽至终浓度1mM。30分钟后，加 入氧化型谷胱甘肽至终浓度2mM。BIACORE分析证明，在加入氧化型谷胱甘肽后2分钟，TF2的 形成完成了50％，在4小时内完成100％。按照以上实施例14所述，用IMP-291亲和色谱将TF2 纯化至几乎均一。 [0504] 实施例19.粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的位点特异性PEG化 [0505] 重组人GM-CSF(14kDa)在临床上用于治疗各种血液病。目前GM-SCF产品的一个局限是循环半衰期短，因此为了最佳疗效必须每天注射给予患者。已用于延长蛋白质治疗药 循环半衰期的一种方法是：用聚乙二醇(PEG)修饰蛋白质以增加其有效粒径。然而，目前将 PEG与蛋白质缀合(PEG化)的所有方法并非最佳的，并且通常需要修饰目标蛋白以达到位点 特异性偶合(Doherty等，Bioconjugate Chem.2005，16：1291-1298)。即便有这些修饰，缀合 收率也是不同的，而所得产物也不是均质的。 [0506] 通过以下概述的DNL技术可以定量收率实现GM-CSF的位点特异性PEG化。DDD2序列通过间隔区与GM-CSF C-端融合，产生GM-SCF二聚体，创建了一个AD2停靠位点，其再与PEG 缀合得到PEG-AD2。在用于TF2的所述类似条件下，通过结合GM-CSF-DDD2和PEG-AD2导致PEG 化GM-CSF的形成。注意到，除了延长循环半衰期外，PEG化产物中GM-CSF二聚体结构比目前 的单体GM-CSF结构具有更高效力。该策略可用于其它细胞因子(例如重组人IL-2)、酶(例如 重组人精氨酸酶)或生物活性肽(例如血小板生成素受体肽激动剂，参见Cwirta等，Science 1997，276：1696-1699)或那些需要更长循环半衰期以改进疗效的肽模拟物。 [0507] 实施例20.用于免疫-PCR、LAMP和IDAT的生物分子的位点特异性共价连接 [0508] 共价DNA-标记抗体可用于放大PCR测定响应(参见Nucl.Acid Res.1995，23：522-529；Nucl.Acid Res.1999，27：4553-4561)。这样的嵌合体可用缀合化学方法制得，该方法 常导致产物在化学计量上不确定，具有未知的连接位点，因而不适于定量测定。近年来，已 开发了产生确定的DNA-蛋白嵌合体(称为蝌蚪(tadpole))的方法(参见Burbulis等， Nat.Methods 2005，2：31-37)，并证明能够检测和计数少量的分子。蝌蚪方法利用包括内含 肽(intein)化学在内的复杂流程，将双链DNA片段位点特异性地连接目标蛋白。本发明的方 法和组合物也可用于将DNA以位点特异性方式与蛋白质共价连接，产生确定组合物的均质 产物，也比蝌蚪方法简单得多。通过改变连接的DNA，利用免疫-PCR、LAMP(环介导的等温扩 增(loop-mediated isothermalamplification))(参见Nucl.Acid Res.2000，28：e63)或 IDAT(T7 RNA聚合酶扩增的免疫检测)技术(参见Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001，98：5497- 5502)，本发明产生的DNA-蛋白嵌合体可用于检测和定量检测非常少量(100-1000)的分子。 [0509] 各试剂如下配制。 [0510] (i)通过将DDD2与目标蛋白(例如hMN-14 Fab、hA20 Fab等)的结合结构融合，制备组分A [0511] (ii)通过间隔基团，将AD2与所选双链DNA进行化学缀合，制备组分B。许多这类可直接用于缀合的DNA片段是市售的。其它的可通过化学合成。 [0512] (iii)A与B在巯基还原剂存在的条件下进行混合，再氧化，得到最终产物，其组成为一个拷贝的A和一个拷贝的B，A含有两个相同亚基，每个亚基都具有靶分子结合位点，B则 通过合适PCR技术进行扩增。 [0513] 实施例21.具有生物学功能的纳米粒 [0514] 本说明书提供了通用而有效的方法，用于显示具有特定生物学功能的惰性生物相容材料。相当大的努力都致力于纳米粒的合理的表面修饰与包被，以调节其药代动力学特 性、毒性、免疫原性和靶向能力。例如，已报道了缀合抗体或肽的靶向纳米粒成功实现体外 传感。然而，对于体内应用还存在诸多障碍(Weissleder R等，Nat.Biotechnol.2005；23： 1418-1423)。这些挑战之一是目前化学技术有待优化，尤其是有关位点特异性偶联，快速表 面修饰以及降低成本，这些可按以下概述来实现。 [0515] 在EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和sulfo-NHS(磺基琥珀酰亚胺酯)存在的条件下，通过C端羧基与环形AD2反应，将在表面修饰的具有游离氨基的纳米 粒与AD2连接。纯化后，该AD2-纳米粒与含有已经连接DDD2的目标结合结构的A组分混合，还 原，再氧化，得到终产物，该终产物从A获得靶向能力并保留纳米粒的特性。潜在应用包括用 荧光磁颗粒进行靶细胞体内造影以及用大孔径颗粒把药物递送到靶细胞(Tsapis等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2002；99：12001-12005)。 [0516] 实施例22.新的用DNL技术激活的免疫药物 [0517] 制备允许缀合目标细胞毒性药物的融合蛋白作为B组分，与制备作为A组分的靶向蛋白偶联，产生下述新的免疫药物。首先，选择良好表达的免疫球蛋白人轻链作为支架 (scafold)或载体蛋白，在其C-端与AD2序列融合。为了避免形成轻链二聚体，末端半胱氨酸 (它与Fd链形成二硫键)被丝氨酸取代。此外，至少一个N-糖基化位点(三肽序列N-X-T)被改 造成到轻链以便能添加寡糖，它能以重组方式高收率地制备并纯化为单一组分，用作通过 适当化学方法进行药物缀合的底物，例如Shih等所描述的将蒽环与氨基-葡聚糖缀合 (Cancer Res.1991；51：4192-4198)。这类含有药物的B-组分可结合各种A组分，该A组分含 有已连接到具有靶向和内化功能的结合结构的DDD2。或者，用AD2衍生的含有药物的氨基- 葡聚糖与合适的A组分组合，以便进行靶特异性药物治疗。其它良好表达的重组分子也可选 做药物缀合的支架或载体蛋白。 [0518] 实施例23.将病原体靶向嗜中性粒细胞以杀死病原体 [0519] 最近报道了包含重组人表面活性蛋白片段D(rfhSP-D)和抗CD89抗体Fab的化学缀合物，作为广谱抗感染药物，潜在用于治疗由各种病原体引起的疾病，所述病原体包括甲型 流感病毒、白色念珠菌和大肠杆菌(Tacken等，J.Immunol.2004，172：4934-4940)。如下所 述，DNL技术可用于生产稳定束缚的复合物，该复合物也可将病原体靶向嗜中性粒细胞以杀 死病原体。将含有卷曲螺旋型α-螺旋颈区(α-helical coiled coil neck domain)和C端糖 识别区(CRD)的hSP-D截短片段，在N-端与DDD2融合，产生能通过CRD多价结合病原体的A结 构。为了靶向嗜中性粒细胞上的FcR，将A结构与由抗CD89Fab与AD2融合蛋白组成的B组分连 接，产生由两个hSP-D CRD和一个抗CD89 Fab组成的稳定复合物。用人表面活性蛋白A(hSP- A)替代hSP-D和其它抗体(例如针对CD3和CD64的抗体)，可制备类似的抗感染药。 [0520] 实施例24.用DNL技术制备的蛋白质微阵列 [0521] 蛋白质微阵列技术的一个迫切问题就是：成功开发切实可行的方法，用于有效地将蛋白质固定在玻璃表面，同时保持这些蛋白质的生物学功能。因为如果不是适当而稳定 地连接到合适表面上，蛋白质就会失去活性，所以已经测试了多种策略，看它们在微阵列中 产生均一而稳定的蛋白质固定化效果。例如，Zhu等人在其酵母菌微阵列的研究工作中，利 用Ni-NTA-包被的玻片让(His)6-标记的蛋白质进行位点特异性地连接(Science 2001； 293：2101-2105)。然而，(His)6-标记与Ni-NTA间的非共价相互作用仅允许与这类微阵列相 容的有限数量的下游筛选技术。 [0522] 也已经报道了几种稳定和位点特异性蛋白质固定化的替代策略。Mrksich等人将角质酶-融合蛋白质固定在含有膦酸酯的玻璃表面上，该策略是通过丝氨酸酯酶角质酶与 带有膦酸酯配体的自装配单层细胞结合，然后经过取代反应将配体共价束缚到酶活性位点 上(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2002；99：5048-5052)。Kindermann等(J.Am.Chem.Soc.2003； 125：7810-7811)报道的另一方法，是基于人O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(hAGT)的不常 见机制，该机制将其底物烷基鸟嘌呤或苄基鸟嘌呤的烷基不可逆地转移给hAGT的反应性半 胱氨酸残基。通过将苄基连接到表面，hAGT融合蛋白将其自身以特异性和共价的方式固定。 [0523] Yin等(J.Am.Chem.Soc.2004；126：7754-7755)报道了另一种基于酶的策略，用于固定含有肽载体蛋白(PCP)的融合蛋白，该方法利用固定在表面的磷酸泛酰巯基乙胺转移 酶(Sfp)和磷酸泛酰巯基乙胺缀合物。利用截短形式的核糖核酸酶S，Soellner等 (J.Am.Chem.Soc.2003；125：11790-11791)证明通过Staudinger连接固定位点特异性蛋白 质，其中叠氮化物与硫代亚膦酸酯(phosphinothioester)反应生成稳定的酰胺。Tan等 (Bioorg.Med.Chem.Lett.2004；14：6067-6070)报道了改进的方法，利用内含肽介导的化学 方法使蛋白质发生位点特异性生物素化，随后固定在包被有抗生物素蛋白的表面而得到蛋 白质微阵列。 [0524] 与现有技术相比，本说明书提供具有几个优越性的位点特异性和共价固定蛋白质的通用方法更加简单、高效、通用等。可通过下述方法制备蛋白质微阵列。在EDC和sulfo- NHS存在的条件下，用环形AD2处理含有反应性氨基的合适表面，通过其C端羧基共价连接 AD2。AD2-衍生表面随后与含有亲和-识别域(例如Fab片段)和DDD2的融合蛋白一起孵育，还 原并再氧化，引起融合蛋白的共价和位点特异性固定化。用金包被的玻片也适用于AD2的衍 生化。 [0525] 实施例25.用并非源自PKA和AKAP的蛋白质-蛋白质相互作用结构域产生的多价、多特异性结构 [0526] 包括两个基本策略。第一个策略是寻找和评价适于替代DDD和AD作用的其它天然存在的蛋白质-蛋白质相互作用结构域。例如，HNF-1α的N端二聚化结构域可替代DDD，而 HFN-1二聚化辅因子(DcoH)可替代AD。第二个策略概述如下。 [0527] 人p53是由不同的功能性结构域组成的模块蛋白。人p53C端残基325-355(流程I)称为四聚体化结构域(p53tet)，在溶液中自动形成四聚体，它实际上是两个二聚体的二聚 体，其间只有微弱的亲和力(Kd～2uM)。然而，每个二聚体中的两个单体却紧密相连，据报道 Kd小于10-15M(Brokx等，J.Biol.Chem.2003；278：2327-2332)。因此，预期含有p53tet的融合 蛋白会形成非常紧密结合的二聚体，如同含有人PKA RIIα的DDD序列的融合蛋白那样。为了 将第二结构与p53tet二聚体连接在一起，通过酵母2-杂交系统或合适的噬菌体展示文库， 选择含有15-50个残基的针对p53tet的结合肽，Kd≤1μM。必要时，用半胱氨酸衍生具有最高 亲合力(即最低的Kd值)的肽，再与目标蛋白融合，就能被稳定束缚到p53tet二聚体上。 [0528] 流程I [0529] GEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQA(SEQ ID NO：28) [0530] 表1.带有LS 174T肿瘤的裸鼠中125I-TF2的肿瘤摄取和组织清除率 [0531] [0532] 表2.带有LS 174T肿瘤的小鼠中TF2的血液药代动力学 [0533] [0534] 表3.带有LS 174T肿瘤的裸鼠中TF2的肿瘤摄取和组织清除率 [0535] [0536] 表4.带有LS 174T肿瘤的裸鼠中用TF2预靶向，99mTc-IMP-245的肿瘤摄取和组织清除率 [0537] [0538] 表5.使用TF2，预靶向99mTc-肽(IMP-245)的T/NT比率 [0539] [0540] 表6.1类产物的实例(A2B，A/B＝Fab或scFv；A≠B) [0541] [0542] [0543] 表7A.2A类产物的实例(A2B，A＝Fab或scFv；B≠Fab或scFv) [0544] [0545] [0546] 表7B.2B类产物的实例(A2B、A≠Fab或scFv；B＝Fab或scFv) [0547] [0548] [0549] 表8.3类产物的实例(A2B，A≠B≠Fab或scFv) [0550] [0551] 表9.4类产物的实例(A3；A＝B＝Fab或scFv) [0552] [0553] [0554] 表10.5类产物的实例(A3、A＝B≠Fab或scFv) [0555] |
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