血管内皮通过释放血管舒张物质和血管收缩物质对血管紧张度进行 局部调节，血管舒张物质例如为源于内皮的松弛因子(EDRF)、一氧化 氮、前列环素和源于内皮的超极化因子(EDHF)；血管收缩物质例如为 血栓烷A2、自由基及内皮缩血管肽。已有多项临床研究表明，一氧化氮 在大的心外膜冠状动脉和冠状微循环中的血管紧张度的基础控制和受激 控制中都是重要的(参见以下综述：Vapaatalo H，Mervaala E.Clinically important factors influencing endothelial function.Med Sci Monit 2001；7(5)： 1075-1085.Drexler H，Hornig B.Endothelial dysfunction：a novel therapeutic target.J Mol Cell Cardiol 1999；31：51-60)。上述提到的内皮来源的不同舒 张因子可以纠正例如动脉硬化症中的内皮功能障碍。血管紧张度的调节、 凝血的调变、血管生长的促进与抑制、炎症的调变和作为药物效应靶标 和药物不良效应靶标的作用与内皮相关。提高例如缓激肽、凝血酶、乙 酰胆碱和5-羟色胺在血管中的流动会刺激释放EDRF。
内皮响应某些药理学刺激物和生理学刺激物而调控下层平滑肌的紧 张度。内皮还在血管生长、白细胞粘附、免疫调节、循环胺的代谢、脂 蛋白的代谢以及血源性信号的整合与转导中发挥作用。
内皮功能障碍的特征是：血管舒张介质的分泌下降、血管收缩物质 的生成增加、对血管收缩物质的敏感性增加和/或血管平滑肌对内皮血管 舒张物质的耐性增强。功能障碍是舒张因子和收缩因子之间不平衡或生 长促进剂与生长抑制剂之间不平衡的结果。炎症、脂蛋白氧化或其他氧 化应激反应是影响内皮功能障碍发展和维持的因素。从理论上说，内皮 功能障碍最明确、最直接的指示物是一氧化氮及其代谢物以及环GMP(单 磷酸鸟苷)。
内皮功能障碍可能是例如下列几种临床疾病的原因或结果：高血压、 动脉硬化症、冠心病、心力衰竭、糖尿病和高胆固醇血症。内皮功能障 碍最直接的指征是血管舒张因子的生成下降或受体功能下降与血管收 缩剂形成增加或敏感性增加之间的失衡，所述血管舒张因子例如为一氧 化氮、前列环素、源于内皮的超极化因子(EDHF)及利钠肽；所述血 管收缩剂例如为内皮缩血管肽-1、血管紧张素II、内过氧化物及血栓烷 A2。
内皮功能障碍可以通过数种已知的药物进行治疗，最重要的是血管 紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂、硝酸盐制剂 及降低胆固醇的药物。ACE抑制剂的效果主要基于它们改善缓激肽的作 用的能力，缓激肽能够增强内皮中一氧化氮的合成。一氧化氮生成的诱 导和/或增强或硝酸盐的加入都能平衡内源性一氧化氮生成的不足。这些 药物及硝酸盐发挥着外源性EDFR的作用并扩张血管，此外它们在血管 损伤中具有作为抗血栓形成化合物的活性。
Selwood等人的WO 02/34767 A1描述了多种肽，这些肽是血管内皮 生长因子(VEGF)的片段，可以用于抑制血管生成。根据这一发明，这 些肽含有3到8个氨基酸，其氨基酸序列的一个关键特征是碱性残基的 存在和排布，尤其是精氨酸(Arg)残基和/或赖氨酸(Lys)残基的存在 和排布。该文件详细说明了数种由6到16个氨基酸组成的肽。其中无一 包括如下序列：异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸(IPP)或缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸 (VPP)。根据该公报，这些肽可用于血管生成在病理学中起主要作用的 疾病。这些疾病可包括糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性 (ARDS)、癌症，子宫内膜移位症、牛皮癣和类风湿性关节炎。
Sandberg等人的WO 99/45941描述了一种用于促进组织软化、增强 组织弹性或改善组织外观的组合物。该组合物由对应于弹性蛋白热消化 所产生的41个肽片段中的任意一种的肽配制。该组合物优选包含具有式 R1-缬氨酰-缬氨酰-脯氨酰-谷氨酰胺-R2的多肽，其中R1是该肽的氨基 部分，R2是该肽的羧基部分。所述组合物优选以化妆品制剂的形式应用 于人体皮肤。根据该文件，所述组合物还可以用于治疗下列疾病：高血 压、冠心病、动脉硬化症、咽峡炎、冠状动脉血栓形成、慢性阻塞性肺 病及血管成形术后再狭窄。
均属于Mitts等人的WO 01/91700A2和美国专利6,962,904B1部分 基于与Sandberg等人的WO 99/45941相同的研究。这些文件描述了用于 增强组织弹性的组合物，这些组合物由对应于见于弹性蛋白的序列，特 别是对应于“-缬氨酸-缬氨酸-脯氨酸-”和“-缬氨酸-缬氨酸-脯氨酸-天冬 酰胺-”序列的肽配制。所述组合物可用于促进组织中弹性蛋白的产生。 根据这些公报，其主要应用依然是化妆品，但还提到这些组合物可用于 治疗例如高血压、冠心病、动脉硬化症、咽峡炎、冠状动脉血栓形成、 慢性阻塞性肺病及血管成形术后再狭窄。
与其他氨基酸序列相比，所述的弹性蛋白肽片段含有大量甘氨酸和/ 或脯氨酸残基。这些片段不包括序列异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸(IPP)和/ 或缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸(VPP)。
用发酵方法制备生物活性肽已有大量研究并在背景技术中进行了说 明，特别受关注的一点是乳源性肽。已表明这些肽具有例如以下性质： 阿片样受体结合性质、ACE抑制活性和抗微生物性质。已经进行了数项 与例如高血压有关的研究，但没有关于这些肽对内皮功能的影响的记载。 具体来说，背景技术中没有记载三肽缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸(VPP)和异 亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸(IPP)及含有它们的产品对内皮功能的影响。
三肽VPP和IPP是已知的的化合物，已被描述为可以作为ACE抑 制剂，具有抗高血压的效果。例如Nakamura等人在J Dairy Sci 78(1995) 777-783中记载了含有瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)和酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)的原料在制备两种ACE抑制剂的应用。这些化 合物经鉴定均为三肽Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro。不过该公报并未记载这 些三肽的体内抗高血压效果，仅提到这是研究的下一个目的。
Nakamura等人的美国专利5,449,661公开了一种含有三肽序列 Val-Pro-Pro的肽的制备以及其在降低高血压中的应用。该肽是通过用瑞 士乳杆菌菌株JCM-1004使脱脂奶粉发酵，随后利用色谱法纯化并冻干而 制得。
Yamamoto等人的WO 99/16862记载了瑞士杆菌菌株CM4，FERM BP-6060，该菌株能够产生大量的三肽Val-Pro-Pro和/或Ile-Pro-Pro。
Valio的WO 01/32905记载了一种具有抗高血压性质的产品及其制 备。该产品通过如下方法制备：利用乳酸菌使含有酪蛋白的原料发酵， 并对所得的含肽发酵产物进行纳米过滤。该产物的抗高血压性质部分是 因为其中包含的三肽IPP和VPP。Valio的WO 03/070267记载了IPP和 VPP以及WO 01/32905所记载的产品在制备提高矿物质利用度的产品中 的应用。该产品可用于，例如促进骨形成、强化骨骼系统及治疗或预防 骨质疏松症。
血管会牵涉到与粘弹性有关的疾病，这些疾病包括高血压、动脉硬 化症、咽峡炎、血管形成、心肌梗塞、冠状动脉血栓形成、血管成形术 后再狭窄和慢性阻塞性肺病。心血管疾病是世界上最常见的疾病之一， 在许多国家，心血管疾病都位列威胁生命的疾病的前五位。不幸的是， 随着生活水平的提高，所述疾病的风险也增加，所以心血管疾病在未来 的危害甚至会更大。现在，除常规药物以外，功能性产品正为消费者提 供具有吸引力的选择。
因此，增加血管的弹性，改善内皮功能和使内皮功能正常化的功能 性产品将作为日常饮食的一部分而深受欢迎。此外，同样值得考虑的是， 将对动脉僵硬性有益的肽作为医用或药用产品施用。

因此，本发明的一个目的是提供一种产品，所述产品作为日常饮食 中的一部分或作为医用或药用产品来改善内皮功能或使内皮功能正常 化，从而能够预防、减轻或治愈与内皮功能障碍有关的紊乱和疾病。内 皮功能障碍对血管的僵硬度或柔性有显著的影响，因而对许多严重紊乱 具有重要影响，这些紊乱包括例如冠心病、动脉硬化症、咽峡炎、冠状 动脉血栓形成、慢性阻塞性肺病和血管成形术后再狭窄。因此，增强血 管弹性的能力是本发明一个特别重要的特征。
本发明所用的产品由改善内皮功能的肽组成，或包含改善内皮功能 的肽。
本发明的另一个目的是使所述产品能够以原样获得、作为改善内皮 功能的试剂获得、或能够用于制备消费用功能性食品或药品。
本发明的再一个目的是提供一种预防、减轻或治愈内皮功能障碍和 与内皮功能障碍有关的紊乱和疾病的方法，所述方法通过对需要这种治 疗的个体施用足以产生所需效果的量的改善内皮功能的肽或含有这些肽 的产品来进行。
本发明的再一个目的是提供一种预防、减轻或治愈内皮功能障碍和 与内皮功能障碍有关的紊乱与疾病的方法，所述方法通过对个体施用足 以产生所需效果的量的产品，所述产品具有高含量的来源于酪蛋白的小 分子肽，并且是通过以下方法制得：利用瑞士乳杆菌菌株LBK-16H，DSM 13137或瑞士杆菌菌株LB 1936，DSM 17754，使含酪蛋白的原料发酵， 其中可以部分或全部去除酪蛋白和/或其它乳蛋白和/或乳糖。在一个优选 的实施方式中，还对发酵产品进行纳米过滤。

根据本发明，一个令人惊讶的发现是，上述目的可以通过使用小分 子肽，特别是三肽Ile-Pro-Pro(IPP)、Val-Pro-Pro(VPP)来实现。所述 肽现已证明能够使内皮功能正常化、增强血管的弹性并对抗动脉僵硬。
本发明所用的所述肽对应于通过水解酪蛋白或含有酪蛋白的材料 (如奶)所产生的生物活性肽。二肽、三肽和四肽短肽和它们的混合物 被认为是适合的。具体来说，这些肽是三肽IPP和VPP、包括IPP和VPP 在内的肽的混合物、以及包含这些肽的产品和组合物。
优选的实施方式为使内皮功能障碍和内皮依赖性损伤正常化提供了 极大的可能性。
因此，本发明涉及来源于酪蛋白的小分子肽在制备改善内皮功能的 产品中的应用。
本发明还涉及含有来源于酪蛋白的小分子肽的产品在制备改善内皮 功能的产品中的应用。
该来源于酪蛋白的小分子肽优选包含二肽、三肽和四肽及其混合物。 最优选的是，IPP和VPP的含量高。
本发明还涉及以下产品在制备改善内皮功能的最终产品中的应用， 所述以下产品具有高含量的来源于酪蛋白的小分子肽，并且通过以下方 法制得：利用乳酸菌使含有酪蛋白的原料发酵，并且可以对所获得的含 肽发酵产物进行纳米过滤。
作为一个优选的实施方式，本发明涉及含有来源于酪蛋白的肽、矿 物质及活的乳酸菌的酸化(soured)组合物在制备能够改善内皮功能障碍的 产品中的应用。
本发明还涉及一种使内皮功能和内皮依赖性损伤正常化的方法，所 述方法通过对个体施用足以产生所需效果的量的使内皮功能和内皮依赖 性损伤正常化的肽或含有所述肽的产品来进行。
所述个体主要是人。本发明使用的所述产品的积极效果自然也对动 物尤其是宠物和饲养的动物有益。这些动物的实例包括狗、猫、兔、马、 牛、猪、山羊、绵羊及家禽。
三肽VPP和IPP可通过合成来制备或水解含有所述序列的材料来制 备。在一个优选的实施方式中，这些肽可以通过由酪蛋白或含酪蛋白原 料的发酵来制备。特别优选的是采用WO 01/32905所述方法，其中利用 发酵形成含有生物活性肽的产品，随后进行浓缩和纳米过滤。这一优选 的实施方式为利用不同类型的原料并根据需要对最终产品的组成进行改 进提供了极大的可能性，如WO 01/32905(在此以参照形式将其引入本文) 所详细描述。
在通过发酵形成依照本发明而应用的生物活性肽时，原料可以是任 何包含所需生物活性肽序列作为其本身肽序列或蛋白质序列的一部分的 产品。乳蛋白，尤其是酪蛋白优选直接使用或以不同制剂形式使用。合 适的原料还包括含有酪蛋白的各种乳产品，例如脱脂乳或具有不同脂肪 含量的乳本身或相应的奶粉和酸乳产品，例如酸乳、培养乳(buttermilk)、 脱脂酸乳、凝固乳(curdled milk)、未成熟干酪等。
发酵可以利用能够由原料产生所需肽的任何乳酸菌来进行。合适的 乳酸菌可见于例如属于下列菌属的菌种：乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳 球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus) 和双歧杆菌属(Bifidobacterium)。蛋白水解能力最强的乳酸菌是瑞士乳杆 菌，所以其被认为最适合这一用途。一种优选的瑞士乳杆菌菌株是瑞士 乳杆菌LBK-16H，DSM13137，其在专利公报WO 01/32836中有详细的 说明。尤其优选的是瑞士乳杆菌LB 1936，DSM17754，其在专利公报 FI20065054中有详细的说明。
乳酸菌可以作为纯培养物或混合培养物使用，可以单独使用或与常 规使用的和可商购获得的酸化剂(souring agent)一起使用。乳酸菌也可以 与其它微生物一起使用。
发酵条件的选择要符合所用菌株的要求，从而形成足量的生物活性 肽，以达到所需效果。例如温度、pH值和通气量等适当条件的选择处于 所属技术领域的技术人员的能力范围之内。通常的发酵在温度为约 30℃～45℃进行。让发酵一直持续到形成了所需量的生物活性肽。正常 情况下，这需要约20小时～30小时。在发酵中形成了含有不同肽的混合 物。当发酵持续足够长的时间，主要获得的是相对较小的二肽和三肽， 例如Val-Pro-Pro(VPP)和Ile-Pro-Pro(IPP)。优选的培养时间为约22小 时～24小时。
所获得的细胞悬浮液可以直接使用，或利用常用方法对肽进行分离 纯化。一种优选的处理方法是浓缩，例如通过将细胞悬浮液进行部分或 完全的蒸发或干燥来进行浓缩，如在平板上将所述悬浮液铺开、干燥并 最后将其研碎成易于保存的干粉。
已证明，通过纳米过滤将细胞悬浮液进一步处理是一种很好的方法， 该方法可以生产出与所需矿物质组分一起存在于同一产品中的、对内皮 功能(例如动脉僵硬度)具有活性的肽。纳米过滤膜的类型和操作条件的选 择可能会对所得产物的组成产生影响。
进行纳米过滤直到干物质含量达到所需的范围，这一范围可以是约 20％～40％，或直到体积浓缩比例约为5～20。通过纳米过滤，增加了产 品的肽含量。最终产品的组成自然取决于所使用的发酵条件、可选的纳 米过滤处理和其他可能的前处理以及额外的处理。
依照本发明，三肽IPP和VPP及含有它们的产品令人惊讶地表现出 了降低动脉僵硬度从而改善内皮功能障碍的效果。在为期十周的干预中， 与对照组相比，接受了含有三肽IPP和VPP的产品的测试组的动态动脉 僵硬度指数(AASI，用于度量动脉僵硬度)有显著改善；即使在第一非 优化测试中，与对照组相比，这一指数也下降了约9％。在治疗周期结束 时，瑞士乳杆菌组的平均AASI为0.31±0.15，而对照组的平均AASI为 0.34±0.17。
上述产品可以直接使用以获得所需效果。这些产品也可以进行干燥 并以粉末形式或冻干制剂形式使用。这些产品还可以优选用于制备功能 食品或其它产品。还可以作为医用产品或药用产品应用。
在本公报中，“食品”这一概念具有广泛的含义，涵盖了可以为固体、 胶状体或液体形式的所有消费品，并涵盖了即制品(ready-made product) 和使用时加入所述生物活性肽或含有生物活性肽的产品作为添加物或产 品的一部分的产品。食品可以是例如乳业及饮料业的产品。典型的产品 包括乳产品，例如脱脂酸乳、凝固乳、凝乳、酸乳、酸化全乳、培养乳、 其它酸化乳产品、未成熟干酪和成熟干酪、小吃棒的填料等。另一类重 要的产品包括饮料，例如乳清饮料、水果饮料和碳酸饮料。
依照本发明，所述生物活性肽或含有所述生物活性肽的产品以足以 获得所需效果的量使用。当使用通过上述两步法获得的所述产品时，其 用量主要取决于乳清的浓度，例如以最终产品重量计为0.1％～30％，优 选为约5％～15％。
所述生物活性肽或含有所述生物活性肽的产品可以在食品制作过程 中加入到食品中，或加入已经制成的食品中。于是，除了相应食品所含 的其它成份之外，这些食品还包含所需的肽或含所需肽的产品，并且这 些食品的味道和性状完全与那些普通食品相一致。
本发明将通过下面的实施例进行详细说明。这些实施例只用来阐释 本发明，而不应该被看作是对本发明保护范围的任何限制。这些实施例 提出了并展现了IPP和VPP直接使用或联合使用时通过改善内皮功能而 对动脉僵硬度产生的有益的、有利的治疗效果以及用于施用所述生物活 性肽的优选最终产品。
实施例1
生物活性产品对动脉僵硬度的影响
动脉僵硬度可以采用超声装置或压平眼压计(applanation tonometry) 测量，或利用动态动脉僵硬度指数(AASI)度量。AASI定义为：1减去 在24小时动态监测过程中的心脏舒张压或心脏收缩压的斜率，它是动脉 僵硬度的一个可靠指数(Li Y，Wang JG，Dolan E，Gao PJ，Guo HF，Nawrot T. Ambulatory arterial stiffness index derived from 24-hour ambulatoty blood pressure monitoring.Hypertension 2006；47(3)：359-364)。
在一项随机的以安慰剂为对照的平行组研究中，4周适应期 (run-in-period)后，给94名未接受任何药物治疗的高血压患者提供根据实 施例2制备的瑞士乳杆菌菌株LBK-16H发酵乳或对照产品，历时10周。 在干预期开始时和结束时进行了24小时动态血压测量。瑞士乳杆菌组的 收缩血压和舒张血压的平均基线值分别是132.6±9.9/83.0±8.0毫米汞 柱，而对照组的收缩血压和舒张血压的平均基线值分别是130.3±9.6/ 80.2±7.0毫米汞柱。
10周干预期结束后，瑞士乳杆菌组的收缩血压(SBP)和舒张血压 (DBP)的下降比对照组的大。对SBP的治疗效果为-4.1(95％CI：-6.6 到-1.8，P<0.001)。对DBP的治疗效果为-1.8(95％CI：-3.7到-0.0，P <0.048)。
AASI指数利用动态血压值进行测量并使用Li等(同前)的方法对其 进行分析。在男性和女性中，AASI指数都随年龄增加而呈线性增加。对 AASI指数而言，小的指数值比大的指数值更有利，因此，如果该值下降， 则动脉僵硬度指数变好。瑞士乳杆菌组的平均基线AASI是0.36±0.15， 而对照组的平均基线AASI是0.36±0.17。治疗周期结束时，瑞士乳杆菌 组的平均AASI是0.31±0.14，而对照组是0.34±0.15。
在10周干预期期间，测试组的AASI指数的改善在统计学上是显 著的(p＝0.043)，而对照组的这种改善在统计学上不显著(p＝0.47) (表1)。
表1.10周干预期后AASI指数的变化

实施例2
可用于本发明的产品的制备
将瑞士乳杆菌菌株LBK16-H，DSM 13137在MRS肉汤中在37℃培 养24小时，并接种于复制乳(reconstituted milk)(10％)中以形成接种体。 两个生长周期后，将接种体(15％)接种于发酵罐培养基(由9％～10％脱 脂乳粉组成)中，并在110℃灭菌10分钟。在持续强烈搅拌下在37℃发酵 22小时～24小时。产品(a)可以以干燥形式和/或研碎形式直接使用， 或可利用本身已知的方法从中分离出所需的肽。
利用瑞士乳杆菌LB1936，DSM 17754，并分别以全脂乳(rich milk) 或培养乳替代脱脂乳粉，重复该过程，以制备相应的产品b和c。
实施例3
一种可用于本发明的最终产品的制备
肽浓缩物
通过向可商购获得的酸化乳加入约1％的肽浓缩物，制备了含有具有 纠正内皮功能障碍活性的肽的酸化乳。表2列出了这一产品的组成，为 了比较，表2还列出了可商购获得的酸化乳产品(Valio Ltd生产的AB酸 化乳)的组成。
对于肽浓缩物，按照实施例2所述方法进行发酵。所获得 的细胞悬浮液通过离心净化进行分离。经过如此预处理的乳清随后在 40℃和30巴的压力通过Nanomax-50膜进行纳米过滤。将所述乳清过滤 到体积浓缩比达到9为止。
表2 Evolus产品和市售酸化乳产品(AB酸化乳，Valio Ltd)的组成

*超过80％的乳糖已被酶解
**所建议的每日摄入量的25％
实施例4
一种可用于本发明的最终产品的制备
Evolus Tehojuoma发酵乳饮料
对于日剂量Tehojuoma发酵乳饮料，按照实施例2所述方 法进行发酵。而且，在发酵乳中添加1％的根据实施例3所述方法制备的 肽浓缩物。这一含有每日所需的活性成份的所述产品可以直接使 用。表3示出了该产品的营养信息。发酵乳饮料含有的其它成份为经巴 氏法灭菌的脱脂乳、乳蛋白浓缩物、增稠剂、海藻钙，酸调节剂、酸化 剂、调味剂、维生素(叶酸、B6、B12)和着色剂。

*超过80％的乳糖已被酶解
**所建议的每日摄入量的25％
***所建议的每日摄入量的33％
实施例5
一种可用于本发明的最终产品的制备
软式干酪
如新鲜干酪、新鲜涂抹干酪和村舍式干酪等软式干酪是通过常规生 产方法制作的。例如，新鲜涂抹干酪制作方法如下：将夸克干酪 (quarg)、奶油或黄油及其它成份混合、热处理并包装。向夸克干酪-脂 肪混合物中加入按照实施例3中所述方法制备的肽浓缩物。这一 含有每日所需的活性成份的产品拟直接使用。