抑制炎症的组合物 |
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| 申请号 | CN201180041925.5 | 申请日 | 2011-09-08 | 公开(公告)号 | CN103261399B | 公开(公告)日 | 2015-11-25 |
| 申请人 | 株式会社明治; | 发明人 | 池上秀二; 牧野圣也; 利光孝之; 伊藤裕之; 中尾笃人; | ||||
| 摘要 | 本 发明 的目的在于提供一种通过使AhR活化而能够抑制消化道内 炎症 性损伤的 益生菌 。本发明涉及具有芳香 烃 受体(AhR)活化能 力 的益生菌、包含该益生菌的抗炎剂、包含该抗炎剂的经口摄取用组合物、以及筛选前述益生菌的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus OLL1181菌株，独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏，委托编号：FERM BP-11269。 |
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| 说明书全文 | 抑制炎症的组合物技术领域背景技术[0002] 对于当今医学的发展而言，抗生素(Antibiotics)的发现和使用是重要的。但是，近年来，因抗生素的副作用、突变而导致出现多制剂耐药菌等问题逐渐成为话题。因而，相对于“抗生素”，“益生菌”这一思维模式近来在社会上得到广泛认知。益生菌是指“改善消化道内的菌群、起到对宿主有益的作用的有用微生物以及促进它们增殖的物质”，逐渐产生使用这些益生菌作用于消化道内(口腔内、肠内)的菌群(flora)，从而实现菌群的健康化并进行疾病的预防这种思维模式。 [0003] 芳香烃受体(Arylhydrocarbonreceptor：AhR)已知是属于基本在所有细胞、组织中均可见到表达的bHLH-PAS家族的转录因子，通过与配体结合而引起各种基因的转录活化。作为AhR的配体，已知有二 英、多氯联苯等化合物，但内源性的配体还是未知的受体。 [0004] 处于未与配体结合状态的AhR为非活性，在与Hsp90等分子伴侣会合的状态下存在于细胞质内。非活性型的AhR与配体结合时，分子伴侣脱离，已活化的AhR向核内移动。已向核内移动的AhR与被称为ARNT(芳香烃受体核转位蛋白，AhR Nuclear Translocator)的分子结合而形成异源二聚体，通过与DNA上的被称为外源性反应元件(Xenopic responsive element：XRE)的增强子序列相互作用来活化下游基因的转录。 [0005] 最近已知，AhR途径的活化会促进前列腺素E2(PGE2)的产生(非专利文献1)、PGE2起到保护消化道损伤的作用(非专利文献2)。因而，开始了是否可以通过使AhR活化来促进PGE2的产生，从而保护消化道不受损伤的尝试。 [0006] 作为上述尝试之一，有报道称，已知作为AhR配体之一的2,3,7,8-四氯二苯并对二 英(TCDD)抑制由葡聚糖硫酸钠(DSS)诱发的溃疡性大肠炎的炎症反应(非专利文献3)。该报道中公开了：给药TCDD的DSS处置小鼠与未给药TCDD的DSS处置小鼠相比，抑制了：体重显著降低、肠管缩短、炎症得分、炎症性细胞因子的产生。 [0007] 现有技术文献 [0008] 非专利文献 [0009] 非专利文献1:Stenson,W.F.,Curr Opin Gastroenterol.,2007Mar,23(2):107-10[0010] 非专利文献2:Martey,C.A.etal.,Am J Physiol Lung Cell MolPhysiol,289:L391-L399,2005 [0011] 非专利文献3:Takamura,T.etal.,Immunology and Cell Biology(2010)88,685-689发明内容 [0012] 本发明的目的在于提供一种通过使AhR活化而能够抑制消化道内炎症性损伤的益生菌。 [0013] 本发明人等在对消化道内炎症性疾病的治疗进行研究的过程中，鉴于通过给与类固醇、非类固醇系抗炎剂等进行的对症治疗方法中存在没有进行根本性治疗、在长期治疗过程中会引发副作用等问题的风险，而持续地摸索新的治疗方法时，注意到了通过使AhR活化来保护消化道不受损伤可能会成为新的治疗方法。 [0014] 然而，当今报道的AhR配体的毒性均较强，不适合作为抗炎剂，因而面临着摸索能够通过使AhR活化来发挥抗炎作用、且能够安全摄取的新型抗炎剂这一课题。因而，在持续进行深入研究的过程中注意到了作用于消化道内的菌群来改善肠内环境从而实现缓和症状以及延长缓解期的益生菌，但现在针对具有AhR活化能力的益生菌还未见任何报道，面临着连该益生菌是否存在都未经确认的这一进一步的课题。 [0015] 因而，在进一步持续研究的过程中，发现了筛选具有AhR活化能力的菌株的方法，成功地利用该方法分离出具有使AhR活化的能力的益生菌，从而完成了本发明。如上述那样，具有AhR活化能力的益生菌至今尚属未知，存在所述益生菌一事是令人震惊的发现。 [0016] 即，本发明涉及以下技术方案 [0017] (1)一种益生菌，其具有芳香烃受体(AhR)活化能力。 [0018] (2)根据(1)所述的益生菌，其中，益生菌选自由乳酸菌、双歧杆菌以及丙酸杆菌组成的组。 [0019] (3)根据(1)或(2)所述的益生菌，其中，益生菌为乳酸菌。 [0020] (4)Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus OLL1181菌株(委托编号：FERM BP-11269)。 [0021] (5)一种抗炎剂，其包含具有AhR活化能力的益生菌。 [0022] (6)根据(5)所述的抗炎剂，其中，具有AhR活化能力的益生菌选自由乳酸菌、双歧杆菌以及丙酸杆菌组成的组。 [0023] (7)根据(5)或(6)所述的抗炎剂，其中，具有AhR活化能力的益生菌为乳酸菌。 [0024] (8)根据(5)～(7)中任一项所述的抗炎剂，其中，具有AhR活化能力的益生菌为Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus OLL1181菌株。 [0025] (9)一种经口摄取用组合物，其包含(5)～(8)中任一项所述的抗炎剂。 [0026] (10)根据(9)所述的经口摄取用组合物，其中，经口摄取用组合物选自由饮料组合物、食品组合物、饲料组合物以及医药组合物组成的组。 [0027] (11)一种筛选具有AhR活化能力的益生菌的方法，其包括将AhR表达细胞用候补益生菌和/或其培养上清刺激的工序，其中，所述AhR表达细胞具有包含外源性反应元件(XRE)及其下游的报告基因区域的表达单元。 [0028] 根据本发明，可以制造能够经口安全摄取、通过使AhR活化而能够在消化道内起到抗炎作用的副作用的抗炎剂。进而，本发明的益生菌通过作用于AhR而具有能够诱发抗炎作用的明确作用点，因而可以期待非常高的效果，可以期待通过本发明的筛选方法选择的益生菌在借由AhR活化的抗炎作用这一点上均具有高的能力。 [0029] 进而，通过适用本发明的益生菌的抗炎作用，不仅可以应对以往的从抗炎剂所具有的副作用等观点出发具有难度的炎症性肠疾病等难治性疾病的长期治疗，且在以往的仅通过药剂来进行抑制炎症部位的炎症作用这一对症疗法的炎症性消化道疾病的治疗中，显示出能够通过活用生物体的动态平衡、改善体质来进行根本性治疗这一新的可能性。附图说明 [0030] 图1表示利用本发明的筛选方法筛选各种乳酸菌的结果。图中，No treat表示阴性对照，Posicon表示阳性对照。 [0031] 图2表示用本发明的菌株OLL1181菌株刺激过的HeXS34细胞培养上清的SEAP活性的结果。 [0032] 图3表示用本发明的OLL1181菌株刺激过的Caco2细胞的CYP1A1的相对表达量。作为对比，一并表示仅用MEP222701菌株和αNF进行刺激时的相对表达量。 [0033] 图4表示对小鼠给药本发明的菌株OLL1181菌株时的、体内(in vivo)大肠的CYP1A1的相对表达量。 [0034] 图5表示用本发明的菌株OLL1181菌株进行刺激时的、A：人Caco2细胞的COX-2的相对表达量、B：小鼠大肠的in vivo的COX-2的相对表达量、C：人Caco2细胞的培养上清的PGE2的分泌量。 [0035] 图6表示验证本发明的菌株OLL1181菌株对DSS诱发性肠炎的效果的实验结果。分别表示为：A：各试验组的生存率、B：各试验组的体重的变化、C：第11天各试验组的大肠的长度、D：第11天的各试验组的大肠的TNF-α和MPO的相对表达量。 具体实施方式[0036] 本发明涉及具有芳香烃受体(AhR)活化能力的益生菌。 [0037] 在本发明中，“AhR活化能力”是指使AhR活化而能够活化要开始的信号传导途径的能力，要活化的机理不限。因此，不需要菌体本身就是AhR的配体，例如也可以是菌所产生的分泌物质具有AhR活化能力，还可以是通过死菌体或其破碎物等使AhR活化。因此，在本发明中，在提及“微生物”、“细菌”的情况下或提及特定的菌的情况下，不仅包括活菌本身，还包括死菌体或其破碎物、该菌的培养物或分泌物。但是，优选为活菌、死菌体或其破碎物等菌体本身，从能够在消化道内形成菌群的观点出发，更优选为活菌。 [0038] 在本发明中，“益生菌”是指如上所述地“能够改善消化道内的菌群、起到对宿主有益的作用的有用微生物及促进增殖的物质”。因此，本发明的益生菌不仅包括形成菌群的细菌，还包括促进所述细菌增殖的物质。另外，在本发明中，“益生菌”包括能够起到对宿主有益的作用的有用微生物以及产生了这些微生物的物质(微生物的培养物)。具有AhR活化能力的增殖促进物质无论在物质本身具有AhR活化能力或物质本身不具有AhR活化能力的情况下，均包括促进具有AhR活化能力的细菌增殖的情况。由于能够形成适合的肠内环境、作用不依赖于肠内环境的个体差异等，因此益生菌优选为活菌，在希望AhR暂时性活化的情况下，优选死菌体、菌分泌物等。 [0039] 对本发明的益生菌中包含的菌没有特别限定，例如可列举出乳酸菌、双歧杆菌、丙酸杆菌、类杆菌、真细菌、厌氧性链球菌、肠球菌、大肠菌等。但从安全性等的观点出发，优选为乳酸菌、双歧杆菌以及丙酸杆菌，更优选乳酸菌以及双歧杆菌。其中，从菌体本身具有AhR活化能力、不仅存在活菌还存在死菌体也能够使AhR活化的菌的观点出发，进一步优选为乳酸菌。乳酸菌之中，从容易用于酸奶的制造、容易应用于食品等的观点出发，特别优选为Lactobacillus bulgaricus、Streptococcus thermophilus等。 [0040] 近年来，有报告称，通过脂多糖(LPS)的刺激使AhR与Stat1结合而抑制NF-κB的转录活性(Kimura,A.etal.,JExpMed.2009Aug31;206(9):2027-35)。然而，在细胞膜结构不具有LPS的乳酸菌、双歧杆菌以及丙酸杆菌等革兰氏阳性菌中发现具有AhR活化能力的菌一事是新的发现。 [0041] 根据本发明人等的研究，作为具有AhR活化能力的新型的益生菌，分离出了Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus OLL1181菌 株 (委 托 编 号：FERM BP-11269)。因此，在本发明的一个实施方式中，本发明的益生菌包含Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus OLL1181菌株。 [0042] 本发明的OLL1181菌株于2010年7月16日以FERM BP-11269的委托编号保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(〒305-8566日本国茨城县筑波市东1条1门1中央第6)，为具有以下特征的新型Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus菌。 [0043] (a)形态的性质 [0044] 杆菌 [0045] (b)培养的性质 [0046] 培养基名：Lactobacilli MRS Broth(Difco,Ref.No.288130) [0047] pH：未调整 [0048] 培养温度：37℃ [0049] 培养时间：18小时 [0050] (1)形状：圆形 [0051] (2)直径：1～2mm [0052] (3)色调：白色 [0053] (4)隆起状态：半球状 [0054] (5)边缘：全缘 [0055] (6)表面形状：平滑 [0056] (7)透明度：不透明 [0057] (8)粘稠度：黄油状 [0058] (c)生理学性质 [0059] (1)革兰氏染色性：阳性 [0061] (3)氧要求性：通性厌氧 [0062] (4)发育温度：15℃＋、45℃- [0063] OLL1181菌株可以活化AhR，使PGE2的产生在其信号传导途径的下游处增大，其结果，可以在消化道内发挥抗炎作用。通过本发明人等的研究发现OLL1181菌株的活菌和死菌体两者均具有AhR活化能力。不具有LPS的革兰氏阳性菌即OLL1181菌株的菌体具有AhR活化能力是令人震惊的发现。另外，OLL1181菌株为Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus菌，是不具有生物毒性的安全的菌，因此从能够用于包含食品组合物、饮料组合物等经口摄取用组合物的各种用途的观点出发，作为益生菌是非常有用的。另外，OLL1181菌株的菌体本身能够活化AhR，因此无论组合物中包含的菌是生是死，均能够发挥AhR活化能力。因此，从能够包含在各种组合物中的观点出发，也是非常有用的。 [0064] 本发明的益生菌具有AhR活化能力，通过使AhR活化来促进PGE2的产生，其结果，可以发挥抗炎性的效果。因此，本发明的益生菌可以用作抗炎剂的有效成分。在将本发明的益生菌用作抗炎剂的有效成分的情况下，可以使用活菌、死菌、培养物、其加工物以及它们的组合。前述培养物是指将本发明的益生菌的培养结束后的培养上清、培养基成分直接使用，前述加工物只要是来源于培养物就没有特别限定，例如可列举出对培养物进行浓缩、糊剂化、喷雾干燥、冻结干燥、真空干燥、滚筒干燥、液状化、稀释、破碎等加工而得到的物质。这些加工可以适当使用公知的方法。前述培养物中或前述加工物中可以包含菌体和/或其破碎物，包含菌体时，可以是活菌也可以是死菌。从通过摄取来抑制肠内有害菌的增殖、改善肠内环境的观点出发，优选组合物中包含活菌。另外，上述抗炎剂中除了本发明的益生菌之外，还可以没有特别限定地包含例如药学上可接受的载体、赋形剂、添加剂、稀释剂等任意成分。 [0065] 此外，在本发明的益生菌、其培养物或其加工物中适当地添加例如培养基成分、适于经口经管摄取的添加物以及水等溶剂、含糖分物质、蛋白质、脂质、维生素类、生物体必须微量金属、香料、药学上可接受的载体、食品添加物等任意成分，可以制成医药组合物、食品组合物等。 [0066] 本发明的抗炎剂可基于促进PGE2的产生来发挥抗炎性效果，因此，本发明的抗炎剂可以用于炎症性疾病的治疗、改善和/或预防用途。所述炎症性疾病可以为任何炎症性疾病，从可以使作为有效成分的益生菌的效果最大程度地发挥、即改善对炎症局部的作用和其它恶化因素(exacerbation factor)的效果等观点出发，对其没有限定，但优选用于例如炎症性肠疾病等消化道炎症。 [0067] 作为可包含在本发明的抗炎剂中的益生菌，从经口摄取的容易度、对消化道内菌群的作用效果的大小等观点出发，优选为乳酸菌、双歧杆菌以及丙酸杆菌，更优选为乳酸菌以及双歧杆菌。从菌体本身具有的AhR活化的作用效果的观点出发，进一步优选为乳酸菌，最优选为Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus OLL1181菌株。 [0068] 本发明的抗炎剂是可以通过作用于消化道内的细胞而对消化道、特别是肠内炎症有效地发挥对症疗法性效果、进而可以通过对消化道内菌群的作用而有效地发挥根本治疗性效果的制剂，优选经口摄取。因此，包含本发明的抗炎剂的经口摄取用组合物也包含在本发明中。 [0069] 本发明的益生菌、抗炎剂或经口摄取用组合物的单日摄取量没有特别限定，可以根据年龄、症状、体重、用途等适当选择。典型而言，可例示出单日摄取量以益生菌计为11 11 11 0.01～100×10 个/个体、优选为0.1～10×10 个/个体、更优选为0.3～5×10 个 11 /个体。另外，还可例示出单日摄取量以益生菌计为0.01～100×10 个/60kg体重、优选 11 11 为0.1～10×10 个/60kg体重、更优选为0.3～5×10 个/60kg体重。 [0070] 然而，本发明的益生菌、抗炎剂或经口摄取用组合物的摄取量不限定于上述列举的数值。 [0071] 本发明的抗炎剂或经口摄取用组合物中包含的益生菌的含量可以根据其使用形态适当选择。典型而言，可例示出以益生菌干燥菌体计为5～50w/w%、优选为1～75w/w%、更优选为0.1～100w/w%以及1～100w/w%。 [0072] 然而，本发明的抗炎剂或经口摄取用组合物中包含的益生菌的含量不限定于上述列举的数值。 [0074] 本发明的饮料组合物中，典型而言，包含选自具有AhR活化能力的益生菌、其培养物及其加工品中的1种或2种以上。本发明的饮料组合物中，在不妨碍益生菌的生长的条件下，还可以包含含糖分物质、蛋白质、脂质、维生素类、生物体必须微量金属(硫酸锰、硫酸锌、氯化镁、碳酸钾等)、香料、其它配合物。所述饮料组合物起到改善摄取个体的肠内环境、改善和/或预防炎症性疾病的效果。 [0075] 本发明的食品组合物中，典型而言，包含选自具有AhR活化能力的益生菌、其培养物及其加工品中的1种或2种以上。本发明的食品组合物中，在不妨碍益生菌的生长的条件下，还可以包含含糖分物质、蛋白质、脂质、维生素类、生物体必须微量金属(硫酸锰、硫酸锌、氯化镁、碳酸钾等)、香料、其它配合物。所述食品组合物起到改善摄取个体的肠内环境、改善和/或预防炎症性疾病的效果。 [0077] 作为蛋白质，例如可列举出全脂奶粉、脱脂奶粉、部分脱脂奶粉、酪蛋白、乳清粉、乳清蛋白质、乳清蛋白质浓缩物、乳清蛋白质分离物、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、乳铁蛋白、大豆蛋白质、鸡蛋蛋白质、肉蛋白质等动植物性蛋白质、这些水解物；黄油、乳性矿物、奶油、乳清、非蛋白态氮、唾液酸、磷脂、乳糖等各种来源于乳的成分等。 [0079] 作为维生素类，例如可列举出维生素A、胡萝卜素类、维生素B群、维生素C、维生素D群、维生素E、维生素K群、维生素P、维生素Q、烟酸(niacin)、烟酸(nicotinicacid)、泛酸、生物素、肌醇、胆碱、叶酸等；作为矿物类，例如可列举出钙、钾、镁、钠、铜、铁、锰、锌、硒等。 [0080] 对本发明的饮料组合物以及食品组合物的类别、种类没有限定，可以是功能性食品、特定保健用食品、特定用途食品、营养功能食品、健康食品、护理用食品，另外，也可以是点心、乳酸菌饮料、奶酪、酸奶等乳制品、调味料等。对饮料的形状也没有限定，可以取固体、液状、流食状、果冻状、片状、颗粒状、胶囊状等通常能够流通的所有饮料形状，也可以添加到各种食品(牛奶、清凉饮料、发酵乳、酸奶、奶酪、面包、饼干、苏打饼干、比萨饼、配方奶粉、流食、患者用食品、营养食品、冷冻食品、加工食品及其它市售食品等)中。上述饮料的制造可以通过本领域技术人员的通常方法进行。 [0081] 本发明的益生菌、其培养物或其加工物如上所述，除了可以加工成包含乳制品/发酵乳的一般饮料之外，还可以用作酸奶、奶酪等乳制品/发酵乳的制造用起动剂。制成起动剂时，在不妨碍本发明的益生菌的生存和增殖的条件下，另外，在不妨碍乳制品制造的条件下，也可以与其它微生物混合。例如，也可以与作为酸奶用乳酸菌的主要菌种 的 Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus、Streptococcus thermophilus、Lactobacillus acidophilus等混合，另外，可以与通常用于酸奶用途、奶酪用途的菌种混合而制成起动剂。基于上述起动剂的乳制品、发酵乳的制造可以通过常规方案进行。例如，通过在加温/混合/均质化/杀菌处理后进行冷却的乳或乳制品中混合上述起动剂，进行发酵/冷却，可以制造纯酸奶。 [0082] 本发明的饲料组合物中，典型而言，包含选自具有AhR活化能力的益生菌、其培养物及其加工品中的1种或2种以上。本发明的饲料组合物中，在不妨碍益生菌的生长的条件下，还可以包含含糖分物质、蛋白质、脂质、维生素类、生物体必须微量金属(硫酸锰、硫酸锌、氯化镁、碳酸钾等)、香料、其它配合物。所述饲料组合物起到改善摄取个体的肠内环境、改善和/或预防炎症性疾病的效果。 [0083] 本发明的医药组合物中，典型而言，包含选自具有AhR活化能力的益生菌、其培养物及其加工物中的1种或2种以上。所述医药组合物起到改善摄取个体的肠内环境、治疗、改善和/或预防炎症性疾病的效果。另外，所述医药组合物的给药途径没有特别限定，包括经口给药或非经口给药，例如，可例示出经口给药、经管给药、经肠给药。从简便且安全性的观点出发，优选为经口给药。此外，对剂型没有特别限定，可以根据给药途径适当选择，例如可列举出气雾剂、液剂、提取物、酏剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、眼软膏剂、经皮吸收型制剂、悬浊剂、乳剂、坐剂、散剂、酒精剂、片剂、糖浆剂、浸剂、煎剂、注射剂、贴剂、药酒、点眼剂、糖锭剂、软膏剂、糊剂、芳香水剂、擦剂、柠檬水、液体提取物、洗剂。 [0084] 作为经口给药制剂，可以制成公知的各种剂型，例如可以制成颗粒剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、液剂、糖浆剂、乳剂、悬浊剂、糖锭剂等剂型。另外，通过制成肠溶性制剂，还可以不受胃酸影响地、高效地运送至肠内。 [0085] 作为非经口给药，可列举出注射剂等形式的给药。另外，还可以将本发明的益生菌、其培养物或其加工物局部地给药至要施加处置的区域。例如，还可以通过手术中的局部注入、使用导管来进行给药。 [0086] 作为本发明的医药组合物中使用的载体，可以适当使用表面活性剂、赋形剂、着色料、着香料、保存料、稳定剂、缓冲剂、悬浊剂、等张剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等医药上可接受的载体，可以适当使用其它常用的载体。具体而言，可列举出轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩乙醛二乙氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。 [0087] 本发明是基于存在能够使AhR活化的益生菌这一新的发现而完成的，因此，包括筛选具有使AhR活化的能力的益生菌的方法以及对目标给药经该筛选而得的益生菌在内的、使AhR活化的方法以及预防和/或治疗炎症性疾病的方法也包含在本发明中。特别是，能够基于AhR活化能力来筛选起到对摄取个体有益的作用的益生菌一事在以往是完全未知的。在本发明中，炎症性疾病可以是全身性、局部性疾病，炎症部位任选是皮肤、粘膜、消化器官、呼吸器官、肝脏、血管、子宫等。作为是炎症性疾病的适合例子，可列举出炎症性肠疾病，但不限定于该例子。 [0088] AhR如上所述，一经活化，会向核内移动，并与DNA上的外源性反应元件(XRE、二英反应元件：Dioxin Responsive Element、也被称为DRE)结合，从而引起例如细胞色素P450酶(CYP1A1)等、其下游的基因的表达。因此，通过将AhR表达细胞用候补益生菌和/或其培养上清刺激，并观察报告基因的表达，可以试验出候补益生菌是否具有AhR活化能力，其中，所述AhR表达细胞具有包含至少1个XRE序列及其下游的报告基因区域的表达单元。 [0089] 包括使用了例如二 英类、PCB类等化学物质的、AhR活化化合物的筛选的体外(in vitro)生物测定方法是公知的。本发明中使用的AhR表达细胞只要是能够用于前述生物测定的细胞，则也可以使用任何细胞。从获取以及培养的容易性、检测方法的简便度等观点出发，可优选地列举出HeXS34细胞、Caco-2细胞等。所述AhR表达细胞所具有的包含XRE及其下游的报告基因的表达单元可以是内源性单元，也可以是通过形质转化等从外部导入的单元。从通过测定已特化的、检测噪音小等观点出发，优选具有从外部导入的表达单元。 [0090] 作为本发明中使用的报告基因，只要是能够定量地测量基因的转录产物即mRNA和/或蛋白质的表达量的基因，则可以是任何基因。例如使用定量性实时PCR等定量地检测例如上述的CYP1A1的表达量，也可以检测AhR活化能力。作为其例，可列举出如后述的实验例例3等中记载的、使用了Caco2细胞的试验体系。当然，还可以使用本领域技术人员所知的用作生物测定的所有报告基因，从定量容易性、表达稳定性等的观点出发，对其没有特别限定，例如可以使用分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、分泌型荧光素酶、绿色荧光蛋白质(GFP)等。作为其例，可列举出如后述的实验例 例1 等中记载的、使用了HeXS34细胞的试验体系。 [0091] 在本发明中，用于从外部向细胞内导入前述表达单元的质粒为包含至少1个XRE序列及其下游的报告基因的质粒时，将其称为异物应答性质粒。另外，前述异物应答性质粒的报告基因为SEAP时，可以将异物应答性质粒表示为pXRE-SEAP。异物应答性质粒的制作和向细胞内的导入例如可以按照WO2005/113767、WO2007/004361、Kasai等的论文(Kasaietal.,Toxicol Appl Pharmacol.2006;211(1):11-19)进行。 [0092] 本发明的筛选方法中，通过利用候补益生菌和/或其培养上清来刺激AhR表达细胞，对存在于XRE序列的下游的报告基因的表达量进行定量，可以测定AhR活化能力。报告基因的表达量高，则暗示着AhR活化能力强。因此，作为筛选方法，将候补益生菌与AhR表达细胞共培养后，计量报告基因的表达量，其表达量与同样计量的阴性对照中的报告基因的表达量相比显著高时，可以判断为具有AhR活化能力。 [0093] 在本说明书中，对AhR表达细胞进行“刺激”是指：典型而言，将AhR表达细胞在候补益生菌和/或其培养上清的存在下培养一定时间。因此，在候补益生菌为活菌时，包括将AhR表达细胞与候补益生菌共培养的方式；在死菌体、分泌物、破碎物和/或培养上清等的存在下培养一定时间的方式。要培养的时间可以根据候补益生菌、要试验的细胞、AhR的表达量、报告基因的种类等来适当选择优选的时间。 [0094] 以下，基于实施例来进一步说明本发明，但所述实施例为本发明的例示，并不能限定本发明、 [0095] 实施例 [0096] 在本实施例中，所得数值全部表示为平均值±标准偏差。另外，统计学分析全部使用独立样本(unpaired Student's)t检验进行，在p＜0.05的情况下，判断为具有显著差异。 [0097] 例1.具有AhR活化能力的乳酸菌的筛选 [0098] (1)HeXS34细胞的制备 [0099] HeXS34细 胞 的 制 备 按 照 已 经 报 道 的 (Kasai et al.,Toxicol Appl Pharmacol.2006;211(1):11-19)进行。 简单 来说，向复 制2次 的XRE共 有序 列(tctcacgcaactccg)的下游导入SEAP基因，将由此得到的异物应答性质粒pXRE-SEAP稳定地形质转换至Hepa-1c1c7细胞(小鼠肝癌细胞株、American Type CultureCollection(Manassas,VA,USA))，从而制备HeXS34细胞。 [0100] (2)通过经热杀菌的乳酸菌进行刺激 [0101] 在MEMα培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)内添加10%的胎牛血清(FBS)，在由此得到的培养基中维持的、在(1)中制备的HeXS34细胞以每个孔为5000个/90μl的浓度播种至96孔板中，在存在和不存在经冻结干燥的已热杀菌的乳酸菌株10μl(5×109个/ml)的条件下，培养24小时。作为阳性对照，使用50pM的2,3,7,8-四氯二苯并二 英(TCDD)。另外，作为阴性对照，设置了不添加乳酸菌或TCDD的孔。将培养上清接着供于SEAP测定。 [0102] (3)SEAP测定 [0103] 在(2)中得到的培养上清中使用Great EscAPe SEAP Chemiluminescence kit(Clontech)，通过化学发光法来定量SEAP。测定进行3次，以所得发光強度(LU)作为SEAP活性，求出其平均值。 [0104] 结果示于图1。在包含Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus OLL1181菌株的47菌株中，与阴性对照相比，可观察到高SEAP活性。 [0105] 需要说明的是，菌株名记载为MEP的菌株为株式会社明治保有菌株。另外，菌种名如下述表所示。 [0106] [表1] [0107] [0108] 例2.通过αNF抑制SEAP活性 [0109] 通过例1的筛选，选择OLL1181菌株作为具有AhR活化能力的候补菌株，选择MEP222701菌株作为不具有AhR活化能力的阴性对照，进一步供于实验。与例1同样地、用9 经热杀菌的前述2种乳酸菌株悬浊液(分别以5%v/v和10%v/v添加5×10个/ml溶液) 刺激24小时，将培养上清供于SEAP测定。此外，为了明确地表示AhR对XRE区域的活化作用，在利用乳酸菌进行刺激之前，使用用10μM的α-萘黄酮(αNF、AhR的对抗药)预培养30分钟而成的HeXS34细胞与未经预培养的HexS34细胞，分别用10%v/v的经热杀菌的OLL1181菌株悬浊液刺激24小时后，将培养上清与例1.(3)同样地供于SEAP测定。 [0110] 结果示于图2。A为比较OLL1181菌株与MEP222701菌株的SEAP活性的图，OLL11818 菌株与未处理区相比，乳酸菌株悬浊液的添加量为5%v/v(2.5×10个/mlwell)、10%v/v(5×108个/mlwell)的组中，SEAP活性均显著上升。B为对乳酸菌株悬浊液的添加量为 8 10%v/v(5×10个/mlwell)、未用αNF进行预培养的组进行比较的图，用αNF进行预培养的组与未进行预培养的组相比，显著地抑制了通过OLL1181菌株刺激而引起的SEAP活性的上升。基于该结果，可以认为通过OLL1181菌株刺激而引起的SEAP活性的上升是因为通过AhR活化而使XRE序列被活化。 [0111] 例3.使用了Caco2细胞的AhR活化能力的验证 [0112] (1)Caco2细胞的刺激 [0113] 使用来源于人结肠癌的细胞即Caco2细胞，进行了AhR活化能力的验证。将人Caco2细胞用添加有10%FBS和抗生素的DMEM培养基(Invitrogen/Gibco,arlsbad,CA)培养，在一部分用5μM的αNF预培养30分钟之后，与未经预培养的组两者用10%v/v的经热杀菌的OLL1181菌株悬浊液刺激4小时。 [0114] (2)定量性实时PCR [0115] 将(1)中所得的Caco2细胞供于定量性实时PCR。定量性实时PCR使用ABI7300real-time PCR系统(Applied Biosystems,Foster City,CA)按照使用说明书进行。引物和探针使用人的CYP1A1用(Assay ID：Hs02382618_s1)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用(Assay ID：Hs99999905_m1)(Applied Biosystems)。计算相对于GAPDH基因的表达量的CYP1A1基因的表达量，表示为CYP1A1基因的相对表达量。 [0116] 结果示于图3。通过OLL1181菌株的刺激，CYP1A1的表达显著增加，所述表达的增加因αNF而显著受到抑制。因此可知，在人结肠细胞中也引起了基于OLL1181菌株的AhR活化。 [0117] 例4.in vivo的AhR活化 [0118] 用胃探针对4～6周龄的C57BL/6小鼠(雌、体重14～18g、购自日本SLC公司)分别经口给药200μl的经热杀菌的OLL1181菌株悬浊液、经热杀菌的MEP222701菌株悬浊9 9 液(5×10个/ml)以及PBS。各菌株的给药用量相当于1×10 个/个体。给药4小时后切除大肠，与例3.(2)同样地使用小鼠的CYP1A1用(Assay ID：Mm00487218_m1)以及GAPDH用(Assay ID：Mm99999915_g1)引物和探针，用定量性实时PCR对CYP1A1的相对表达量进行定量。 [0119] 结果示于图4。给药OLL1181菌株的悬浊液的组与PBS给药组相比，CYP1A1的表达量显著增加，但MEP222701菌株给药组与PBS给药组未见显著差异。这显示了：通过经口给药OLL1181菌株，在大肠中即使在in vivo的条件下也可以引发AhR的活化。 [0120] 例5.诱发in vitro和in vivo的COX2的表达以及诱发前列腺素E2的产生 [0121] (1)诱发COX-2的表达的验证 [0122] 为了验证通过OLL1181菌株刺激来活化AhR，COX-2的表达得以诱发，由此，由花生四烯酸产生前列腺素E2的产生变得亢进，作为定量性实时PCR的引物和探针，使用人和小鼠的COX-2(人用Assay ID：Hs01573469_m1、小鼠用Assay ID：Mm01307334_g1)以及GAPDH用的引物和探针，除此以外，用与例3和例4同样的方法确认COX-2在in vitro和in vivo下的表达。计算相对于GAPDH基因的表达量的COX-2基因的表达量，表示为COX-2基因的相对表达量。 [0123] (2)前列腺素E2(PGE2)ELISA [0124] 作为刺激用的乳酸菌，除了OLL1181和MEP222701，还使用在例1的筛选中显示出高AhR活性的MEP222761，将刺激时间设为24小时，除此以外，与例3(1)同样地刺激人Caco2细胞，使用PGE2Competitive ELISA kit(Thermo Scientific inc.,Watham,MA)按照使用说明书对培养上清中分泌的PGE2的量进行定量。 [0125] 结果示于图5。A表示人Caco2细胞的invitro的COX-2的相对表达量，B表示小鼠大肠的in vivo的COX-2的相对表达量，C表示人Caco2细胞的PGE2产生量。可确认：无论是人in vitro还是小鼠in vivo，通过OLL1181菌株的刺激，COX-2的表达与阴性对照相比均显著增大。进而，可确认：在人Caco2细胞中，通过OLL1181菌株的刺激而产生了PGE2。可确认：所述PGE2的产生因αNF受到抑制，因此所产生的PGE2来源于AhR的活化。 [0126] 例6.通过OLL1181菌株使AhR活化来缓和DSS诱发肠炎 [0127] 为了诱发肠炎，使4～6周龄的C57BL/6小鼠(雌、体重14～18g、购自日本SLC公司)在7日内每日自由摄取溶解于饮用蒸馏水的3%葡聚糖硫酸钠(DSS、分子量5000、购自和光纯药工业株式会社)，其后使其在3日内自由摄取未添加DSS的蒸留水。为了验证由菌株带来的缓和效果，通过胃探针在7日内每日经口给药200μl经热杀菌的OLL1181菌株、9 9 MEP222701菌株以及MEP222761菌株(5×10个/ml)。各菌株的给药用量相当于1×10 个/个体。作为对照，在7日内每日经口给药200μlPBS来代替菌液。另外，还对未给药DSS的大肠炎非诱发组在7日内每日经口给药200μlPBS。实验以各组n＝10～12进行，在开始给药DSS起的第11天切除大肠，测量大肠的长度，与例3.(2)同样地使用小鼠TNF-α用(Assay ID：Mm00443258_m1)以及小鼠髓过氧物酶(MPO)(Assay ID：Mm00447886_m1)用的引物和探针，用定量性实时PCR对TNF-α和MPO的表达量进行定量。 [0128] 结果示于图6。A为表示截止至第11天的各组的生存率的图。在用DSS诱发大肠炎的组中，给药了PBS的对照组(DSS)以及MEP222701菌株给药组(MEP222701)中，第11天的生存率为20%左右，MEP222761菌株给药组(MEP222761)的生存率约为40%(未示出数据)、OLL1181菌株给药组(OLL1181)的生存率约为80%。未给药DSS而给药了PBS的大肠炎非诱发组(PBS)中，没有小鼠死亡。 [0129] B表示DSS大肠炎诱发组(DSS)、DSS大肠炎非诱发组(PBS)以及DSS大肠炎诱发＋OLL1181菌株给药组(OLL1181)的体重的变化。可确认：DSS大肠炎诱发组(DSS)存在体重降低的倾向，OLL1181菌株给药组与大肠炎诱发组(DSS)相比，从第8日开始平均体重超出，从第10日以后体重有若干增加。 [0130] C表示第11天的DSS大肠炎诱发组(DSS)、DSS大肠炎非诱发组(PBS)以及DSS大肠炎诱发＋OLL1181菌株给药组(OLL1181)的大肠的长度。与DSS大肠炎诱发组(DSS)相比，OLL1181菌株给药组的大肠显著长。 [0131] D表示第11天的DSS大肠炎诱发组(DSS)、DSS大肠炎非诱发组(PBS)以及DSS大肠炎诱发＋OLL1181菌株给药组(DSS＋OLL1181)的、大肠处的TNF-α和MPO的表达量。已知TNF-α的表达因PGE2而受到抑制，MPO已知作为炎症标记物。任意表达与DSS大肠炎诱发组(DSS)相比，OLL1181菌株给药组(DSS＋OLL1181)均显著受到抑制。 [0132] 例7.发酵乳制品(纯酸奶)的制造 [0133] 将牛奶、乳制品和水以最终制品的无脂乳固体成分达到9.5%、乳脂肪成分达到3.0%的方式进行混合，制备酸奶基础混合物。接着，将所制备的酸奶基础混合物均质化后，在95℃下加热杀菌5分钟，其后，冷却至约40℃。 [0134] 向前述酸奶基础混合物中接种从“明治保加利亚酸奶”中分离出的Lactobacillus bulgaricus OLL2038和Streptococcus thermophilus OLL1131的混合起动剂，使其发酵而制造酸奶(对照品A)。另外，除了使用Lactobacillus bulgaricus OLL1181菌株来代替混合起动剂的Lactobacillus bulgaricus OLL2038以外，用与对照品同样的方法来制造酸奶(发明品A)。 [0135] 如后述那样测定物性值，结果显示，用OLL1181菌株制造得到的酸奶(发明品A)与对照品的酸奶(对照品A)相比，具有同等以上的优选风味和物性。 [0136] [表2] [0138] 例8.发酵乳制品(酸奶饮料)的制造 [0139] 将牛奶、乳制品和水以最终制品的无脂乳固体成分达到8.0%、乳脂肪成分达到0.5%的方式进行混合，制备酸奶饮料用基础混合物并均质化后，将其在95℃下加热杀菌10分钟，然后冷却至约40℃。向该酸奶饮料用基础混合物中接种与例8相同的酸奶起动剂(从“明治保加利亚酸奶”中分离出的Lactobacillus bulgaricus OLL2038和Streptococcus thermophilusOLL1131的混合起动剂)，使其发酵而制备酸奶饮料用发酵乳。对该所得酸奶饮料用发酵乳进行均质化，得到酸奶饮料用液状发酵乳。将该酸奶饮料用液状发酵乳与已杀菌的糖液以6:4的质量比进行混合，制造酸奶饮料(对照品B)。另外，除了使用Lactobacillus bulgaricus OLL1181菌株来代替混合起动剂的Lactobacillus bulgaricusOLL2038以外，用与对照品同样的方法来制造酸奶饮料(发明品B)。 [0140] 如后述那样测定物性值，结果显示，用OLL1181菌株制造得到的酸奶饮料(发明品B)与对照的酸奶饮料(对照品B)相比，具有同等以上的优选风味和物性。 [0141] [表3] [0143] 物性的测定方法 [0145] 乳酸酸度使用0.1N的NaOH，以酚酞作为指示剂进行滴定，从而算出。 [0148] 风味由5名的专家组成员判定为良好、适合、不良这3个阶段。 [0149] 产业上的可利用性 [0150] 本发明的益生菌作用于肠内环境，可以缓和炎症性消化道疾病，可以根本性治疗至今为止为难治性、仅可用药剂进行对症治疗的炎症性消化道疾病。进而，本发明的益生菌不均有生物毒性，因而通过含有在医药组合物、食品组合物中，可以简便且有效地摄取。 |
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