减少无水动物脂肪中的游离脂肪酸和胆固醇的方法

(1) 本发明领域

本发明涉及减少动物脂肪尤其无水乳脂中的游离脂肪酸(FFA)， 最好是胆固醇和熔点的方法。该方法采用β-环糊精和水成液配方，后 者由作为中和剂的碱金属氢氧化物(Na或K)、作为脂肪酸受体的碱 土金属(Ca或Mg盐)、以及最好是低熔点的植物油组成。本发明特别 涉及一种方法，在该方法中液体配方与动物脂肪的混合物在温和加 热下被用于沉淀FFA、降低熔点、并用β-环糊精包合胆固醇，然后离 心分离混合物以移除不溶解的脂肪酸盐和包合物。本发明尤其涉及 到一个问题，即从无水乳脂中选择性地移除FFA，而不使类酯物质(无 水乳脂)发生沉淀或破坏无水乳脂中的精细挥发性香味组分，即内酯。

(2) 先有技术说明

人们很久以来就已经知道，非常高的血清胆固醇含量、高血压、 和异常心电图(EKG)都是引起心脏病发作的重要的作用因素。我们注 意到在察觉到抽烟、肥胖、缺少运动的结果以前很久这些因素就已 变得明显，而这一点很重要。在这些年中，人们强调了血清胆固醇 含量的重要性，在心血管研究中最与之一致的发现之一是，血浆胆 固醇的高含量与动脉粥样硬化相关，并使冠心病(CHD)的危险性增 强。这一结果通常是以血浆低密度脂蛋白(LDL)作为媒介引起的，它 是最致动脉粥样化的脂蛋白。(Grundy，S.M.，Am.J.Clin.Nutr. 45：1168(1987))。

高血清胆固醇含量的主要原因是遗传混乱、杂合的家族性血胆 固醇过多症(FH)、以及常吃高饱和脂肪-卡路里-胆固醇食物。

健康专家和医师通常认为饮食控制是治疗血胆固醇过多症和血 脂过多症的第一步。这甚至在后期药物治疗时也是需要的。改变饮 食，移民中的血清胆固醇和CHD提供了令人信服的证据，即饮食扮 演着主要角色(Dyerberg，J.，Nutrition Review 44(4)：125(1986))。

虽然胆固醇的消耗似乎不是CHD的主要原因，但Khosla，P.和 K.C.Hayes，Biochim Biophys Acta 1210：13(1993)提道说过量摄入食 物胆固醇将对C16:0-富脂(rich fat)的新陈代谢产生协同效应，使它们 变得血胆固醇过多。在缺乏食物胆固醇的情况下，单独就正常脂蛋 白方案而言，C16:0一般不会增加总的血清胆固醇浓度或LDL(Hayes，K. C.，Food Technology Journal 50(4)：第92-97页(1996))。进一步据报道， 胆固醇的氧化物是有毒的，会使主动脉平滑肌细胞在组织培养时恶 化，并且可能导致发展成动脉粥样硬化。

乳脂对氧化作用是稳定的，并且具有其它脂类所没有的独特香 味。乳脂因其商业重要性而得到人们极大的关注。它赋予奶制品影 响加工的与众不同的性能。乳脂是重要的脂肪酸的优良来源，它含 有高比例的短链脂肪酸，这使其易于被消化(Kennedy，J.，Food Technol. 11：76(1991))。而且，乳脂含有共轭亚油酸(CLA)，该物质被认为具 有抑制癌的潜能(Yeong等，J.Agric.Food Chem，37：75-81(1989))。CLA 由于富含于反刍动物制品中而显得与众不同。它们是在母牛的瘤胃 中在多不饱和脂肪酸(PUFA)的生物氢化过程中形成的，并随后进入 牛奶中(Gurr，M.I.，Advanced Dairy Chemistry，Lipids，P.F.Fox(ed.)， 第349页，Chapman & Hall，London(1994))。一项流行病学研究将芬 兰乡村的饮食习惯进行了对照，与丹麦城市哥本哈根相比，前者的 结肠癌发生率为四分之一(MacLennan，R.等，Am.J.Clin.Nutr.31：S239 (1978))。具有低结肠癌发生率的社区比高发生率人群消耗更多的马 铃薯和全牛奶，而吃较少的白面包和肉。乳脂含有高比例的饱和脂 肪酸，主要是C16:0(26.3％)，以及导致其低消耗量的胆固醇(0.2-0.4％)。 这是源于一种乳脂不宜食用的感觉。

在大多数的天然脂中，乳脂的化学特性和功能性质是最富于变 化的。乳脂的熔点随其脂肪酸组分的饱和度和链长的增加而增加 (Walstra，P.等，Advanced Dairy Chemistry，Lipids(P.F.Fox(ed)第5 章，第179-212页，Chapman & Hall，London(1994))。乳脂的熔点也 受脂肪酸残基在甘油分子上的位置的影响(Walstra等，IBID)。当以 天然形态存在时，乳脂并不总是适合于各种食物配制。例如，乳脂 具有很宽的熔化范围，-40至40℃(Walstra等，IBID)，这使得在冷藏 温度下制作可涂敷奶油甚为困难，现代消费者认为这是不合需要的 特质。因此，由于受限的功能(可流动性和可涂敷性)，乳脂应用的新 领域受到限制。

最佳的脂肪并非总是从天然获得的。当考虑其天然状态时，动 物脂肪具有有限的用途。但是当被看作生产具有理想健康特性的脂 肪的原材料时，它们就可以变成具有经济价值的资产。

油脂工业正着眼于改变脂肪分子的新技术。最大的挑战是使功 能要求与营养需求相一致。在物理和营养功能方面，乳脂或乳脂/植 物油的酯交换对于获取所需的软化点而言，是一项有用的技术。乳 脂的酯交换改变了脂肪酸在三酰甘油中的分布，并由此改变了其物 理性质，如熔化行为、结晶和可塑性。Christophe，A.M.等在Arch.Int. Physiol.Biochem 86：413(1978)中表明，在化学催化剂的存在下，乳 脂的酯交换降低了其使人体内血清胆固醇增高的能力。在体外经酯 交换的乳脂显得比天然乳脂能更快速地被胰脂肪酶水解(Christophe，A. M.等，Arch.Int.Physiol.Biochim 89：B156(1981))。

酯交换可以在化学催化剂的存在下，在相对低温(50℃)时通过加 热脂肪或者脂肪与油的混合物30分钟来实现(Eckey，，E.W.Ind.和Eng. Chem.40：1183(1948))。催化剂通常被用来使反应在低温时在短时间 内完成。碱金属和碱金属烷基化物是有效的低温催化剂，甲氧基钠 是最常用的。其中脂肪被加热到仅低于其熔点的直接酯交换是一项 有用的技术，它将饱和脂肪酸作为结晶三饱和甘油酯沉淀物从脂肪 中除去(Eckey，E.W.，Ind.和Eng.Chem.40：1183(1948))，并因此改 进了其营养特性(饱和∶不饱和脂肪酸比)。Eckey可从棉子油中除去 19％的三饱和甘油酯，棉子油含有25％的饱和脂肪酸。直接酯交换被 普遍用于工业以改进猪油的品质(Hawley，H.K.，和G.W.Holman，J. Am.Oil Chem.Soc.33：29(1956))。

然而，由于其适用性受到常常有损于乳脂香味这一事实的限制， 酯交换还没有用于乳脂工业以精炼和除臭以除去乳脂中的FFA(Frede， 1991；Bulletin of the International Dairy Federation No 260/1991)。FFA 一旦形成就消耗催化剂或使活性催化剂失去活性。Screenivasau，B.在 J.Am.Oil Soc.55：796(1978)报道说0.1的酸值(A.V.)可使0.1lb甲氧 基钠/1000lb油中毒。由此，在酯交换之前从无水乳脂中除去FFA 是一个重要的步骤。此外，FFA比酯化后的脂肪酸更易于氧化，并 因此可使乳脂容易发生以有臭味为特征的被描述为“发苦”的氧化 酸败。

授权给Perlman等人的美国专利第5,382,442号(1995)描述了增 加植物油或鱼油和动物脂肪的氧化稳定性的混合方法。该脂肪混合 物由植物油或鱼油和减少了胆固醇的动物脂肪组成，该动物脂肪包 含大约2份和大约9份亚油酸/1份豆蔻酸。

油脂的精炼与除臭在油脂工业中是用于除去FFA的非常普遍的 技术。被绝大多数欧洲和美国炼制业者(Braae，B.，J.Am.Oil Chem.Soc 53：353(1976)；Carr，R.A.，J.Am.Oil Chem.Soc 53：347(1976))所采用 的碱炼包含以下步骤：将脂肪或油加热到75-90℃；然后将其用12-18° Be’的(取决于油的类型(棉、大豆、玉米、棕榈、红花、花生))浓缩的 氢氧化钠苛性溶液处理30秒(短混合方法)或用28° Be’氢氧化钠处理 0.2秒(超短混合方法)。将这些方法用于乳脂对于主要乳脂香味组分 的内酯而言是非常有害的。内酯(γ或δ)是γ或δ-羟基酸的环酯，它在浓 缩苛性溶液的存在下，被快速水解以提供羟基酸的开链盐。所以， 先有技术方法，短反应时间、高浓缩苛性溶液、高温不能用于乳脂。

非常普遍地用于油脂工业的除臭包括在200℃-275℃和高真空下 (3-10托)将蒸汽吹过热油。除臭过程同时除去了FFA、脂肪可溶性维 生素(A、E、D、K)、单酸甘油酯、甾醇、和一些色素如caratenoid。 作为暗含的项目，除臭去掉了油脂的香气与香味，导致淡的制成品， 而这对于乳脂而言被认为是极不理想的。因此，对乳脂使用浓缩碱 金属氢氧化物进行的精炼以及除臭，减少了FFA，失去了挥发性精 细乳脂香味、香气和维生素含量。这就将乳脂置于和其它廉价原材 料一样的级别。

授权给Attebery的美国专利第3,560,219号描述了在碱性条件下 用金属盐使含水食物制品如乳酪乳清中的溶解脂类发生沉淀。但该 方法对游离脂肪酸不具选择性，因为食物制品中的所有脂类物质都 被沉淀了。因此，该方法不能用于由纯类脂组成的食物制品如无水 乳脂。

由此，先有技术承认存在一个需要，即将FFA从乳脂中除去而 不使乳脂本身发生沉淀或破坏精细挥发性乳脂香味组分。对于人类 饮食中胆固醇含量的日益增长的关注使得食品加工者们开发了几种 技术以从乳脂中减少胆固醇。

                通过酶减少乳脂胆固醇

胆固醇还原酶在NADPH存在下促进胆固醇转化为粪甾醇，后 者经过人体而不会被吸收(MacDonald，I.A.，等，J.Lipid Res.24：675 (1983))；到目前为止成功(success-to-date)是有限的。在用胆固醇氧化 酶处理过的牛奶中，胆固醇含量在37℃3小时内减少了78％(Smith，M. 等，Journal of Agricultural and Food Chemistry，39：2158(1991))。据报 道，胆固醇氧化物本身是有毒的(Peng，S.-K和R.J.Morin，Biological Effecfs of Cholesterol Oxides.CRC Press，Boca Raton，Ann Arbor， London 1991)。这些方法对于无水乳脂没有实用性。

                 短路蒸馏(SPD)

SPD包括分子蒸发成基本上没有气体的空间，即真空。控制因 素是速率，在该速率下，分子从蒸馏液体的加热表面逃逸，并被冷 却的冷凝器表面接收。除了化学和制药领域外，对于食物，采用从 天然油提馏维生素A和E、甾醇和挥发物，并分离单酸甘油酯、甘 油二酸酯和脂肪酸。Arul等人在J.Am.Oil Chem Soc.65：1642(1988) 中通过SPD在245-265℃的温度、220-100mmHg的压力下将乳脂分 馏成四种馏分。在室温下，两种馏分是液体，一种馏分是半固体， 还有一种馏分是固体。固体馏分含胆固醇的浓度为0.2mg/g脂肪， 而与之相对天然乳脂中的胆固醇浓度为2.6mg/g脂肪，或液体馏分 中为16.6mg/g脂肪。乳脂的SPD提供了一个从乳脂获取具有不同化 学和物理性质的馏分的机会。然而，该技术还存在一些主要的缺陷： (1)其中可观察到胆固醇减少的低收率馏分是固体，并因此具有有限 的功能；(2)高温的采用可分解或聚合三酰甘油特别是那些具有高不 饱和度的物质，这甚至在真空蒸馏时也存在；以及(3)高投资成本。

               超临界流体萃取(SFE)

在该方法中，在高的压力和温度下用高密度、低粘度和表面张 力减小的气体(通常为二氧化碳)处理产物。该技术被用于从不同的食 物中使蛋白质脱脂并减少胆固醇、用于除去咖啡和茶的咖啡因、还 用于从酒花中除去苦味芳香化合物。该方法的好处在于没有可能的 有毒溶剂，没有有毒副产品形成(Friedrich，J.P.和E.H.Pryde，J.Am. Oil Chem.Soc.61：223(1984))。Arul等人在J.Food Sci.52：1231-1236 (1987)中在50-70℃、10-35MPa下将乳脂分馏成八种不同的馏分。他 们发现在低和中间熔点馏分中，胆固醇趋向于浓缩。Lim，S.和Rizvi， S.S.H.，J.Food Science 61(4)：817-821(1996)达到了总胆固醇减少 92.6％，其加工收率为88.5％。萃取在40℃、24.1-27.5MPa下进行。 超临界二氧化碳的无差别溶解力是胆固醇减少中的主要缺陷，因为 三酰甘油将与胆固醇一起被萃取，这将打破正常的乳脂的芳香平衡。

                   真空蒸汽蒸馏

用于油的脱酸和除臭的真空蒸汽蒸馏在欧洲已被实际应用了很 多年。该技术包括在200-275℃的高真空下将过热蒸汽吹过热油。 General Mills，Inc.(美国明尼亚波利)公开了用于同时对奶油进行胆固 醇减少和脱酸的真空蒸汽蒸馏法(Marschner和Fine，美国专利第 4,804,555号，1989)。通过该技术达到的胆固醇除去率为90％，收率 为95％。该技术的主要缺陷在于热蒸汽使乳脂的挥发性香味组分与 胆固醇和FFA一起被除去了。精细奶油香味的失去将乳脂置于和其 它廉价脂肪一样的级别。

                   络合物的形成

该技术被用于减少牛奶和乳制品中的胆固醇，它是通过将胆固 醇与其酯用络合剂如β-环糊精(β-CD)进行络合。

环糊精是通过淀粉的酶降解而获得的环状低聚糖。他们包括在 电子回旋加速器形状的环中排列而得的六、七、或八个葡萄糖单体， 他们分别被表示为α、β或γ-环糊精。β-CD是不吸湿的，它在30℃、 86％相对湿度(RH)时的含水量为13.6％(Szejtli，J.等，Inclusion Compound 3：331(1984))。环糊精由于自由羟基在分子外缘的位置因 而是可溶于水的(Szejtli，J.等，Inclusion Compound 3：331(1984))。溶 解度是温度的函数。温度越高溶解度越大。β-CD的溶解度从0.5℃ 的0.8％增加到90℃的39.7％。内部空穴是疏水的，它使得环糊精与 分子如芳族醇、脂肪酸和它们的酯以及胆固醇发生络合。β-CD由于 下述几个原因被用于减少胆固醇：

1-β-CD内部空穴的相对尺寸和几何构造使其与游离和酯化的胆 固醇可良好络合。

2-β-CD的工业化生产的实现。

3-过去十年间对β-CD毒性的深入研究确保了其作为食物成分的 安全性。

当前，环糊精被用于：(1)对控制病原体、昆虫、杂草的农用化 合物的挥发性进行控制；(2)通过胶囊提高药学制品(药物、维生素)、 香料、皮肤护理洗液的稳定性；以及(3)改进饮料和加工食品的颜色、 气味和香味稳定性(Szejtli，J.，Inclusion Compound 3：311(1984))。

决定一个给定分子是否能形成络合物的最重要的参数是它的疏 水性、相对于环糊精空穴的相对尺寸和几何构造(Szejtli，J.，Inclusion Compound 3：331(1984))。当溶于水时，环糊精分子能够容纳较小的 客体分子、或比其内部空穴中的水更不亲水的分子的官能团(Szejtli， J.，Inclusion Compound 3：331(1984))。在水溶液中，轻微非极性的 环糊精空穴被水分子占据，这是一个积极的逆向过程(极性-非极性相 互作用)。因此这些水分子易于被适当的客体分子“如胆固醇或FFA 以及它们的酯”所取代，这些分子具有比水更小的极性(Szejtli，J.， Inclusion Compound 3：331(1984))。

通过向大鼠喂食(最多1.6g/体重kg/日)、向狗喂食(最多0.6g/体 重/kg日)，来研究β-CD的六个月口服慢性毒性(Szejtli，J.，Inclusion Compound 3：331(1984))。体重增加、食物消耗、以及临床生物化学 值都不受影响。β-CD未显示出胚胎中毒效应。由此可以认为口服β- CD是无毒物质(Szejtli，J.，Inclusion Compound 3：331(1984))。

Courregelongue等人的美国专利第4,880,573号描述了用10％β- CD从无水乳脂中移除41％的甾醇。Bayol等人的EP-A1-0 326 469 (1989)(欧洲专利)显示从无水乳脂中移除80％的Δ4-胆甾烯-3-酮。授 权给Roderbourg等人的美国专利第5,232,725号(1993)描述了一种用 β-CD作络合剂，在一步单一操作中将37％或更多的动物脂肪胆固醇 量与游离脂肪酸一起移除的方法。据授权给Graille等人的美国专利 第5,264,241号(1993)报道，采用β-CD从奶油中同时移除50％胆固醇 和52％FFA。授权给Maffrand等人的美国专利第5,223,295号描述了 一种从来自动物源的脂肪中移除胆固醇的方法，它是通过在含水介 质中用环糊精络合甾族化合物，并搅拌5小时而实现的。该方法不 仅相对较长，而且在单一操作中只能有限地减少胆固醇含量。授权 给Cully等人的美国专利第4,980,180号(1990)描述了一种用β-淀粉酶 从蛋材料移除β-CD的方法。该专利承认存在不能完全移除环糊精的 问题。在澳大利亚，Okenfull等人(1991)(PCT WO91/11114)发明了一 种称为SIDOAK的减少乳制品的胆固醇的方法。该方法包括向牛奶 中加入β-CD，并在低于10℃下混合。通过离心分离将胆固醇和β-CD 的不溶性络合物除去。所得到的最大胆固醇减少量为80-90％。Yen，C. G.和L.J.Tsai，J.Food Sci.60：561(1995)显示，用10％β-CD可从猪脂 中同时除去95％胆固醇和50％FFA。授权给Awad等人的美国专利第 5,484,624(1996)号用β-CD将蛋黄中的胆固醇减少了96％。该方法包 括在50℃将稀释的蛋黄(9＜PH＜10.5)与β-CD混合10分钟。通过离心 分离将络合物β-CD-胆固醇从介质中除去。

从所有用β-CD来减少动物脂肪中的胆固醇与FFA的方法所得 到的总的结论是存在改进的必要。通过酯交换对无水乳脂进行改性 以提高其营养性和功能性的方法仍然受到限制，因为高FFA含量会 使催化剂中毒。

由此，先有技术承认通过酯交换或混合对乳脂进行改性并减少 其胆固醇含量在脂肪制品的加工中将没有竞争，至少到目前为止没 有开发出同时减少胆固醇和FFA而不破坏乳脂的挥发性精细香味组 分特别是内酯的方法。乳脂的很宽的熔化范围，-40至40℃(Walstra 等，IBID)，使得在冷藏温度下制作可涂敷奶油甚为困难，而这被很 多现代消费者认为是不合需要的特质。因此，由于受限的功能(可流 动性和可涂敷性)，乳脂应用的新领域受到限制。通过物理方法将乳 脂分馏成几种馏分只是对在适当程度上改进其熔化特性有效。但是， 该已知方法是冗长的、耗时和昂贵的。分馏的另一缺点是乳脂的正 常芳香平衡遭到了破坏。因此，先有技术认为存在对于一种方法的 需要，该方法可生产低熔点的软乳脂，从而在冷藏温度下可涂敷。

                        目的

本发明的目的是提供一种改进的方法用以从动物脂肪特别是乳 脂中除去游离脂肪酸(FFA)。本发明的进一步的目的是提供一种从动 物脂肪中除去胆固醇的方法。再进而，本发明的再进一步的目的是 提供一种降低动物脂肪熔点的方法。再进而，本发明的目的是提供 一种方法，该方法实施起来不贵、可保护动物脂肪的香味、并可采 用传统设备容易地密封成大体积。通过参考下面的论述和附图，这 些和其它目的将变得逐渐明显。

                    本发明概述

本发明涉及减少无水液态动物脂肪中所存在的游离脂肪(FFA) 以形成加工过的动物脂肪的方法，该方法包括以下反应步骤：(a)在 高温下提供液态动物脂肪中的游离脂肪酸与碱金属氢氧化物水溶液 的反应混合物，该碱金属氢氧化物选自氢氧化钾、氢氧化钠和它们 的混合物，同时混合以使液态动物脂肪中所存在的FFA形成可溶性 脂肪酸盐(SFAS)；(b)使SFAS与碱土金属盐反应，从而使SFAS在 反应混合物中同时或者在步骤(a)之后形成不溶性脂肪酸盐(IFAS)；以 及(c)从反应混合物中分离IFAS，以形成加工动物脂肪。

特别地，本发明涉及用β-环糊精将胆固醇与游离脂肪酸一起除 去。本发明还进一步涉及用植物油与加工过的动物脂肪混合以降低 熔点。

                     附图简述

图1是流程图，它显示从无水动物脂肪(AMF)中除去FFA的优 选工艺。精炼溶液由蒸馏水、KOH和CaCl2组成。KOH∶FFA的比 例为1∶1。CaCl2∶FFA的比例为5∶1。

图2显示出在CaCl2∶FFA的摩尔比为5、精炼溶液：AMF(重量/ 重量)为1、混合时间为1分钟、混合速度为1800rpm、温度为50℃、 在室温下离心分离1085×g 10分钟时，KOH∶FFA的摩尔比对FFA 减少量和收率的影响。

图3显示出在KOH∶FFA的摩尔比为1、精炼溶液：AMF(重量/ 重量)为1、混合时间为1分钟、温度为50℃、在室温下离心分离1085 ×g 10分钟时，CaCl2∶FFA的摩尔比对FFA减少量和收率的影响。

图4显示出在KOH∶FFA的摩尔比为1、CaCl2∶FFA的摩尔比 为5、混合时间为1分钟、温度为50℃、混合速度为1800rpm、在室 温下离心分离1085×g 10分钟时，AMF：精炼溶液的重量比对FFA 减少量和收率的影响。

图5显示出在精炼溶液：AMF重量比为1、混合时间为10分钟、 温度为50℃、FFA∶KOH的摩尔比为1、CaCl2∶FFA的摩尔比为5、 在室温下离心分离1085×g 10分钟时，混合速度对FFA减少量和收 率的影响。

图6显示出在FFA∶KOH的摩尔比为1、CaCl2∶FFA的摩尔比为 5、精炼溶液：AMF重量比为1、混合速度为1800rpm、温度为50℃、 在室温下离心分离8700×g 10分钟时，混合时间对FFA减少量和收 率的影响。

图7显示出在FFA∶KOH的摩尔比为1、CaCl2∶FFA的摩尔比为 5、精炼溶液：AMF重量比为1、混合速度为1800rpm、温度为50℃、 混合时间10分钟、在室温下离心分离10分钟时，离心力对FFA减 少量和收率的影响。

图8是流程图，它显示出精炼FFA和AMF的优选工艺。精炼 溶液由蒸馏水、KOH和CaCl2组成。KOH∶FFA的比例为1∶1。CaCl2∶ FFA的比例为5∶1。

图9显示出在混合速率为1000rpm、β-环糊精∶胆固醇的摩尔比 为5.58时，用于AMF的百分比胆固醇减少量(Y1)的响应曲面。

图10显示出在混合时间为10分钟、β-环糊精∶胆固醇的摩尔比 为5.58时，对于AMF的百分比胆固醇减少量(Y1)的响应曲面。

图11显示出在混合时间为10分钟、混合速率为1000rpm时， 对于AMF的百分比胆固醇减少量(Y1)的响应曲面。

图12显示出在KOH∶FFA的摩尔比为1、混合速率为1000rpm 时，对于AMF的百分比胆固醇减少量(Y1)的响应曲面。

图13显示出在KOH∶FFA的摩尔比为1、β-环糊精∶胆固醇的 摩尔比为5.58时，对于AMF的百分比胆固醇减少量(Y1)的响应曲面。

图14显示出在KOH∶FFA的摩尔比为1、混合时间为10分钟时， 对于AMF的胆固醇减少量(Y1)的响应曲面。

图15显示对于AMF的百分比FFA减少量(Y2)的响应曲面。

图16是流程图，它显示用于除去胆固醇FFA以及降低其它无 水动物脂肪(AMF)的熔点的工艺。液体配方由蒸馏水、玉米油、KOH和CaCl2组成。KOH∶FFA的摩尔比为1∶1.CaCl2∶FFA的摩尔比为 5∶1.水与玉米油的重量比为11.5∶1.5。

                 优选实施方案说明

本发明提供了一种方法，它运用含水液态配方和β-环糊精降低 无水乳脂中的FFA、最好是熔点、以及胆固醇。含水液态配方由碱 金属氢氧化物(Na、K)、碱土金属(Ca和Mg)、低熔点植物油的混合 物组成。液态配方特别用于实现在单一操作中的目的，它赋予了本 发明很多优于先有技术工艺的优点。该方法滴定并选择性地使无水 乳脂中的FFA沉淀，为了保护乳脂香味，在非常温和的实验条件下 采用极稀浓度(0.023-0.058％)的碱金属氢氧化物(Na、K)和钙或镁盐作 为脂肪受体。还有，本方法使用与乳脂中所存在的游离脂肪酸相应 的化学计量量的碱金属氢氧化物，以选择性地除去游离脂肪酸而不 沉淀或破坏乳脂本身。本发明采用碱土金属来消除乳脂的损失，并 获得较高的收率和较高的胆固醇减少量。本方法减少FFA是以相对 较长的反应时间和较低的温度为基础的，它们在保护乳脂香味内酯 方面是有效的。本方法采用β-CD作为胆固醇的络合剂，同时降低无 水乳脂的胆固醇、熔点和FFA。本方法在具有工业可行的时间量内， 显著地降低了动物脂肪中的胆固醇、FFA和熔点。

                     材料和方法

从当地食品店获得商业级别的新鲜奶油、牛油和猪油。将新鲜 奶油转化成无水乳脂(AMF)，它是通过在55℃熔化，在室温下以5000 ×g离心分离10分钟，并用Whatman 1号滤纸将顶部脂肪层滤去而 实现的。将AMF储藏在-20℃下以备将来使用。

依照AOAC Official Methods of Analysis，16th ed.Association of Official Analytical Chemists，Washington，D.C.994.10(1995)，萃取并 测量总的胆固醇。总的胆固醇的测量是以非衍生物的形式在惠普 5890A气相色谱仪(GC)(Avondal，PA)上进行，该设备装有火焰离子化 检测器和涂有0.1μm的DB-1膜(100％甲基聚硅氧烷)的石英玻璃毛细 管柱(15m×0.25mm)(J & W Scientific，Folsom，CA)。

依照AOAC Official Methods of Analysis，16th ed.Association of Official Analytical Chemists，Washington，D.C.969.17(1995)测定 FFA。

采用软件包安装二阶模型进行统计分析(SAS Institute，Inc.SAS User’s Guide，Version 5，SAS Institute，Inc.Cary N.C.(1985))并绘制响 应曲面(Sigma，199？)。建议用于各响应值(Y)的模型为：

            Y＝Bo+∑BiXi+∑BiiXi2+∑BijXiXj

其中Bo、Bi、Bii、Bii是常数，并且是模型的回归系数，Xi是码 值(coded value)中的独立变量。从全回归消去变量的标准是以R2值和 f检验的显著性为基础的。

                    工艺展开

                  除去FFA的工艺

在图1中描述了从无水乳脂(AMF)中除去FFA的优选工艺。该 工艺以相对较长的反应时间、低浓度碱溶液、低温(40-50℃)为基础。 这与采用浓缩碱溶液(12-28°Be’)、高温(75-95℃)、短反应时间(0.2-30 秒)的先有技术工艺(用于棉籽、玉米、花生、大豆和棕榈油)形成对 照。下面描述了各步的合理性。本工艺中的精炼溶液是成功精炼的 关键控制因素。精炼溶液由碱金属氢氧化物(Na或K)和Ca或Mg的 氯化物的含水混合物组成。

                       实施例1

当稀释碱金属氢氧化物溶液(KOH∶FFA的摩尔比为1)与FFA(1) 或它们的酯(2)反应时，结果是进行下面的反应：

RCOOH+KOH→RCOOK+H2O              (1)

RCOOR’+KOH→RCOOK+R’OH          (2)

KOH的量是AMF中的FFA的函数。在图1所述的实验条件下， KOH∶FFA的摩尔比为1时足够中和介质中所存在的金部FFA。由于 皂化引起中性脂肪的损失，所以过量碱溶液非常不利于提高收率。 过量碱溶液对香味非常不利，因为过量(OH-)使内酯依照下面两个反 应水解成它们的相应的羟基酸：

KOH∶FFA摩尔比对FFA减少量和收率的影响显示在图2中。

                 对照实施例2

如图1概述的工艺所述，将含有0.293％FFA的10(g)无水乳脂 与含有0.763％CaCl2的10ml dH2O混合。用氢氧化钾将CaCl2溶液 的pH调节为碱性，pH7.5-8.5。在测定为碱性pH时所获得的游离脂 肪酸减少量低于20％，由此表明氢氧化钾不能在CaCl2之后加入。

                 对照实施例3

如图1概述的工艺所述，将含有0.293％FFA的10(g)无水乳脂 与含有0.763％CaCl2的10ml Tris-Hcl缓冲剂混合。缓冲剂的pH从7.5 到8.5。在测定为碱性pH时所获得的游离脂肪酸减少量低于35％。 结果与实施例2相似。

                    实施例4

CaCl2∶FFA摩尔比对FFA减少量和收率的影响显示在图3中。 Ca或Mg的氯化物被用作羧化物的受体。将它们加入精炼溶液中是 必需的，因为它们可以：(1)与羧化物反应形成不溶性盐(近似于石灰 石)，并且因此非常有效地通过离心将它们从介质中分离；(2)与可溶 性K或Na皂反应形成不溶性皂，并通过乳化作用使中性脂肪的损失 减到最少，且因此得到较高的收率；(3)与KOH协力共同增加FFA 的减少量；(4)用阳离子使介质饱和，并由此通过阻止下面反应的发 生来提高FFA的减少量：    

RCOO-+H2O�RCOOH+OH-

过量的阳离子需由CaCl2或MgCl2提供，而不由苛性溶液提供， 因为过量羟基对收率和香味有不利影响。

                    实施例5

由于乳化作用引起的损失，精炼溶液与AMF的重量比对于收率 很重要。但是，如图4所示，在图1所述的实验条件下，当精炼溶 液与AMF具有不同的重量比时，收率并没有明显的损失。

                    实施例6

图5显示出混合速度对FFA减少量和收率的影响。在向AMF 加入精炼溶液之后，应当完全混合以确保精炼溶液的溶质与FFA之 间的完全接触。本工艺所用的混合器为LIGHTNIN LAB MASTER， L1U03型，叶轮为A100型(直径1”)。

                    实施例7

如图6所示，所有的羟基(OH-)都被FFA消耗和中和掉了。混合 时间和温度对收率非常重要。在高苛性浓度存在下，在高温下采用 长混合时间增加了皂化损失，因为任何过量的苛性都被用于中性油 的皂化作用。用于油的先有技术工艺采用高苛性浓度、高温和非常 短的混合时间以防止由于皂化引起的损失。但是，在本发明中，采 用非常稀的苛性(FFA∶KOH摩尔比为1)、可完全熔化AMF的低温以 产生由精炼溶液引起的精细乳状液、测定宽范围的混合时间(1-10分 钟)，这些都没有影响收率。

                     实施例8

图7显示出最初测定的离心力范围。通过离心从介质中分离所 形成的皂。混合物最好直接离心分离以避免AMF结晶，并因此避免 了坏皂分离。离心分离是快速有效的。

                     实施例9

采用LIGHTNIN LAB MASTER(SI)混合器L1U03型和A100型 叶轮(直径1”)，将含有2.07％FFA的10(g)牛油与10mL精炼溶液 (0.412％KOH和5.409％CaCl2)以1800rpm进行混合，直至温度达到 70℃。温度一达到70℃，就将混合器计时器设定到1分钟，采用同 样的混合速率(1800rpm)。在室温下，将所形成的皂直接以8700×g 离心分离10分钟。在上部上清液相中回收减少了FFA的牛油。精炼 过的牛油中的FFA含量为0.08％。所达到的FFA减少量为96.01％。

                  实施例10

采用LIGHTNIN LAB MASTER(SI)混合器L1U03型和A100型 叶轮(直径1”)，将含有0.122％FFA的10(g)猪油与10mL精炼溶液 (0.024％KOH和0.326％CaCl2)以1800rpm进行混合，直至温度达到 50℃。温度一达到50℃，就将混合器计时器设定到1分钟，采用同 样的混合速率(1800rpm)。在室温下，将所形成的皂立即以8700×g 离心分离10分钟。在上部上清液相中回收减少了FFA的猪油。精炼 过的猪油中的FFA含量为0.02％。所达到的FFA减少量为83.60％。

用于减少动物脂肪中的FFA的本方法是基于将碱金属氢氧化物 用作中和剂、将Ca或Mg盐用作脂肪受体。本方法的观念是采用稀 释的精炼溶液、低温和相对长的反应时间。本方法具有大量特性使 其比用于油精炼的先有技术方法拥有可观的实践性优点。与先有技 术方法相对照，本方法是有效的，在单一步骤内将AMF中的FFA 减少到了0.02％，而不需除臭。用于本方法的温和的实验条件不会破 坏AMF的精细香味组分即内酯。

               除去FFA和胆固醇的工艺

图8概括描述了被开发来减少AMF中的胆固醇和FFA的工艺。

                    实施例11

将含有0.395％胆固醇和0.293％FFA的10(g)AMF与10mL精 炼溶液(0.0583％KOH和0.763％CaCl2)以1000rpm进行混合，直至 温度达到50℃。在50℃，将650mgβ-环糊精(β-环糊精∶胆固醇的摩 尔比为5.58)加入混合物中，同时在相同速率下混合10分钟以上。在 室温下，将所形成的皂和β-环糊精：胆固醇络合物直接以8700×g离 心分离10分钟。在上部上清液相中回收AMF中减少后的胆固醇和 FFA。所达到的胆固醇和FFA的减少量分别为54和92％。

                   对照实施例12

将含有0.395％胆固醇和0.293％FFA的10(g)AMF与10mL蒸 馏水以1000rpm进行混合，直至温度达到50℃。在50℃，将650mgβ- 环糊精(β-环糊精∶胆固醇的摩尔比为5.58)加入混合物中，同时在相 同速率下混合10分钟以上。在室温下，将所形成的β-环糊精：胆固 醇和β-环糊精：FFA络合物直接以8700×g离心分离10分钟。在上 部上清液相中回收AMF中减少后的胆固醇和FFA。所达到的胆固醇 和FFA的减少量分别为54和49.65％。由于减少量增加了42.35％， 所以本实验显示出了精炼溶液对于提高AMF中的FFA的减少量的 重要性。而且，由于胆固醇减少量保持不变，所以精炼溶液不会影 响胆固醇与β-环糊精之间络合物的形成。

                     实施例13

当很多因素和相互作用影响所需的响应值时，响应曲面操作法 (RSM)是使工艺最优化的一个有效工具(Hunter，1959)。由此，通过采 用响应曲面操作法，达到对胆固醇和FFA减少量的独立变量(KOH∶ FFA摩尔比、CaCl2∶FFA摩尔比、混合时间、β-环糊精∶胆固醇摩尔 比和混合速率)的联合作用的最优化。测量两个响应值：胆固醇减少 量％(Y1)被定义为样品中胆固醇的总量与对照品中胆固醇的总量之比 再乘以100；FFA减少量％(Y2)被定义为样品中FFA的总量与对照品 中FFA的总量之比再乘以100。依据初步实验，显示在表1中的五 个独立变量是KOH∶FFA摩尔比、CaCl2∶FFA摩尔比、混合时间、β- 环糊精∶胆固醇摩尔比、混合速率。其它重要的独立变量被保持固定 为：温度和离心分离(8700×g、10分钟、室温)。所采用的实验方案 是5个因素、5个水平中心组合(John L.Gill，Design and Analysis of Experiments in the Animal and Medical Science.的(2)卷9章，密歇根 州立大学(1993))。独立变量的码值是-2(最低级)、-1.0(中级)、1.0和 2(最高级)。为了探究各变量，依照图8所述的初步研究来选择中心 值(0)。显示在表2中的完整方案由32个实验点组成，它们包括中心 (0，0，0，0，0)的六(6)个复制。

表1-用于本工艺最优化的中心组合方案的变量和它们的等级                          码值等级   变量   符号     -2     -1     0     +1     +2   KOH∶FFA(摩尔比)   X1     0     0.5     1     1.5     2   CaCl2∶FFA(摩尔比)   X2     0     2.5     5     7.5     10   混合时间(分钟)   X3     5     7.5     10     12.5     15   β-cd：胆固醇   X4     4.72     5.15     5.58     6.01     6.4   混合速率(rpm)   X5     200     600     1000     1400     1800

                   表2-中心组合排列和响应值

                变量水平                响应值

运行      X1      X2      X3      X4      X5      Y1        Y2

1         -1      -1      -1      -1       1      61.78    69.53

2         -1      -1      -1       1      -1      28.58    58.07

3         -1      -1       1      -1      -1      46.46    68.06

4         -1      -1       1       1       1      77.3     75.3

5         -1       1      -1      -1      -1      38.53    69.16

6         -1       1      -1       1       1      63.66    79.12

7         -1       1       1      -1       1      68.22    77.6

8         -1       1       1       1      -1      40.5     70.79

9          1      -1      -1      -1      -1      20.41    92.42

10         1      -1      -1       1       1      65.41    92.28

11         1      -1       1      -1       1      65.98    92.38

12         1      -1       1       1      -1      42.84    92.21

13         1       1      -1      -1       1      54.28    96.16

14         1       1      -1       1      -1      38.21    90.36

15         1       1       1      -1      -1      32.28    92.35

16         1       1       1       1       1      74.23    92.48

17        -2       0       0       0       0      59.98    31.35

18         2       0       0       0       0      53.52    92.33

19         0      -2       0       0       0      38.03    91.92

20         0       2       0       0       0      53.32    92.38

21         0       0      -2       0       0      37.49    92.24

22         0       0       2       0       0      63.64    92.63

23         0       0       0      -2       0      46.85    92.64

24         0       0       0       2       0      55.7     92.45

25         0       0       0       0      -2      11.91    81.6

26         0       0       0       0       2      73.7     92.61

27         0       0       0       0       0      52.27    92.45

28         0       0       0       0       0      56.27    92.22

29         0       0       0       0       0      53.02    92.53

30         0       0       0       0       0      54.48    92.1

31         0       0       0       0       0      54.94    92.45

32         0       0       0       0       0      54.02    91.93

a码值

bY1是胆固醇减少量(％)，Y2是FFA减少量(％)。

对回归进行方差分析(ANOVA)以测试适合性的好坏。表3中列 出了各响应值的方差分析的结果和它们的对应的复合判定值(multiple determination)(R2)的系数以及变异系数(CV)。从F值和R2的分析看 起来，5个中只有4个独立变量(KOH∶FFA摩尔比、混合时间、β-环 糊精∶胆固醇摩尔比和混合速率)影响胆固醇减少量(Y1)。实际上，尽 管从模型中排除了氯化钙，R2仍保持较高(0.95)并且F检验显著性＜ 0.001。表4中列出了用于(Y1)的估计回归系数和对4个经选择的因素 的系数显著性检验的结果。还有，从F值和R2的分析看起来，5个 中只有3个独立变量(KOH∶FFA摩尔比、CaCl2∶FFA摩尔比和混合 速率)影响FFA减少量(Y2)。混合时间、β-环糊精的排除不影响模型， 因为R2仍保持较高(0.96)并且F检验显著性＜0.001。表5中列出了用 于(Y2)的估计回归系数和对3个经选择的因素的系数显著性检验的结 果。没有一个模型表现出不适合。两个模型对于令人满意的R2值和＜ 0.001的显著性F检验都被认为是适当的和可用的。运用该模型预测 的Y1、Y2和余值列在表6和7中。最优化以Y1为基础(百分比胆固 醇减少量)。

模型Y1对于指出方向以改变变量从而使胆固醇减少量达到最大 值是有用的。从显著性回归系数(表4)判断，影响胆固醇减少量的最 重要的因素是KOH∶FFA摩尔比、混合时间、β-环糊精∶胆固醇摩尔 比和混合速率。它们显示出显著性的一阶、二次方程式和两个因素 相互作用项(two factor interaction terms)。

               表3-对用于5个因素和2个响应值(胆固醇(Y1)和

           FFA(Y2)减少量)的二阶多项式回归的参数估计和方差分析

                          Y1                               Y2 源              系数              概率＞|T|         系数           概率＞|T| 截取     -18.66       0.91      29.09     0.87 X1     -139.81     ＜0.01      160.62   ＜0.01 X2      12.67       0.07     -3.75     0.06 X3      10.3       0.14     -4.98     0.5 X4      9.97       0.85     -13.76     0.82 X5     -0.01       0.68      0.06     0.16 X1*X1      3.8       0.26     -30.68   ＜0.01 X2*X2     -0.29       0.04     -0.01     0.92 X3*X3     -0.09       0.48     ＜-0.01     0.98 X4*X4     -2.25       0.63      0.14     0.97 X5*X5     ＜-0.01       0.01     ＜-0.01     0.16 X1*X2      1.38       0.14     -2.26     0.04 X1*X3      0.85       0.35     -1.96     0.07 X1*X4      21.15     ＜0.01     -7.71     0.2 X1*X5     ＜-0.01       0.55     ＜-0.01     0.69 X2*X3     -0.55     ＜0.01      0.04     0.82 X2*X4     -0.94       0.37      1.37     0.25 X2*X5     ＜0.01       0.94     ＜0.01     0.38 X3*X4     -1.1       0.3      1.71     0.16 X3*X5     ＜0.01       0.19     ＜-0.01     0.1 X4*X5      0.01       0.05     ＜-0.01     0.7

R2                       0.97                               0.95

F比                       20.07                              11.49

概率F                     ＜0.05                             ＜0.05

CV(％)                    8.77                               5.76

$Y=B_o+\underset{I=1}{\overset{5}{\Sigma }}\mathrm{BiXi}+\underset{I=1}{\overset{5}{\Sigma }}\mathrm{BijXiXj}+\underset{I=1}{\overset{5}{\Sigma }}\mathrm{BijXiXj}$

表4-对用于4个因素和1个响应值(胆固醇减少量 (Y1))的二阶多项式回归的参数估计和方差分析 源     系数   概率＞|T| 截取     51.91   ＜0.01 X1    -3.99     0.05 X3     10.76   ＜0.01 X4     4.97     0.01 X5     30.44   ＜0.01 X1*X1     5.23     0.14 X3*X3    -0.94     0.78 X4*X4    -0.06     0.98 X5*X5    -8.7     0.02 X1*X3    -0.72     0.87 X1*X4     12.86     0.01 X1*X5     2.31     0.62 X3*X4     0.26     0.95 X3*X5     1.06     0.82 X4*X5     4.36     0.35

R2＝0.95      F比＝22.79       概率F＜0.05      CV(％)＝9.1

$Y=B_o+\underset{I=1}{\overset{4}{\Sigma }}\mathrm{BiXj}+\underset{I=1}{\overset{4}{\Sigma }}\mathrm{BijXiXj}+\underset{I=1}{\overset{4}{\Sigma }}\mathrm{BijXiXj}$

$Y1=51.91-3.99X_1+10.76X_3+4.97X_4+30.44X_5-8.7{X_5}^2+12.86X_1{X}_4$

表5-对用于3个因素和1个响应值(FFA 减少量(Y2))的二阶多项式回归的参数估计和方差分析

源            系数        概率＞1_T1 源      系数   概率＞1T1 截取      92.11     ＜0.01 X1      24.58     ＜0.01 X2      2.39       0.07 X5      5.28     ＜0.01 X1*X1     -31.5     ＜0.01 X2*X2     -1.19       0.6 X5*X5     -6.24       0.01 X1*X2     -5.91       0.07 X1*X5     -7.37       0.02 X2*X5      0.99       0.75

R2＝0.96；   F比＝65.34      概率F＜0.05     CV(％)＝3.70

$Y=B_o+\underset{I=1}{\overset{3}{\Sigma }}\mathrm{BiXi}+\underset{I=1}{\overset{3}{\Sigma }}\mathrm{BijXiXj}+\underset{I=1}{\overset{3}{\Sigma }}\mathrm{BijXiXj}$

$Y2=92.11+24.58X_1+5.28X_5-31.5{X_1}^2-6.24{X_5}^2-7.37X_1{X}_5$

                表6-由用于4个因素的二阶多项式回归

                 预测的AMF中胆固醇的减少量和余值

运行      X1      X3      X4      X5      Y1        Y1        余值

                                          (实际值)  (估计值)  (实际值-

                                                              估计值)

1         -1      -1      -1       1      61.78     61.31     0.46

2         -1      -1       1      -1      28.58     30.82    -2.24

3         -1       1      -1      -1      469.46    45.15     1.3

4         -1       1       1       1      77.3      73.71     3.58

5         -1      -1      -1      -1      38.53     34.68     3.84

6         -1      -1       1       1      63.66     61.92     1.73

7         -1       1      -1       1      68.22     72.84    -4.62

8         -1       1       1      -1      40.5      41.45    -1.05

9          1      -1      -1      -1      20.41     23.61    -3.2

10         1      -1       1       1      65.41     66.23    -0.92

11         1       1      -1       1      65.98     63.36     2.61

12         1       1       1      -1      42.84     42.92    -0.08

13         1      -1      -1       1      54.28     52.55     1.72

14         1      -1       1      -1      38.21     32.92     5.28

15         1       1      -1      -1      32.28     33.35    -1.07

16         1       1       1       1      74.23     77.4     -3.17

17        -2       0       0       0      59.98     60.96    -0.98

18         2       0       0       0      53.52     53.47    -0.05

19         0       0       0       0      38.03     52.03    -14

20         0       0       0       0      53.32     52.03     1.28

21         0      -2       0       0      37.49     40.31    -2.82

22         0       2       0       0      63.64     61.85     1.78

23         0       0      -2       0      46.85     46.87    -0.02

24         0       0       2       0      55.7      56.81    -1.11

25         0       0       0      -2      11.91     12.77    -0.86

26         0       0       0       2      73.7      73.87    -0.17

27         0       0       0       0      52.27     52.03     0.23

28         0       0       0       0      56.27     52.03     4.23

29         0       0       0       0      53.02     52.03     0.98

30         0       0       0       0      54.48     52.03     2.44

31         0       0       0       0      54.94     52.03     2.9

32         0       0       0       0      54.02     52.03     1.98

             表7-由用于3个因素的二阶多项式

               回归预测的FFA减少量和余值

运行      X1      X2      X5      Y2        Y2        余值

                                  (实际值)  (估计值)  (实际值-

                                                      估计值)

1         -1      -1      -1      69.53     71.65    -2.12

2         -1      -1      -1      58.07     63.17    -5.1

3         -1      -1      -1      68.06     63.17     4.88

4         -1      -1       1      75.3      71.65     3.64

5         -1       1      -1      69.16     68.02     1.13

6         -1       1       1      79.12     77.5      1.61

7         -1       1       1      77.6      77.5      0.09

8         -1       1      -1      70.79     68.02     2.76

9          1      -1      -1      92.42     94.4     -1.98

10         1      -1       1      92.28     95.5     -3.22

11         1      -1       1      92.38     95.5     -3.12

12         1      -1      -1      92.21     94.4     -2.19

13         1       1       1      96.16     95.43     0.72

14         1       1      -1      90.36     93.34    -2.98

15         1       1      -1      92.35     93.34    -0.99

16         1       1       1      92.48     95.43    -2.95

17        -2       0       0      31.35     36.03    -4.6

18         2       0       0      92.33     85.19     7.13

19         0      -2       0      91.92     88.53     3.38

20         0       2       0      92.38     93.31    -0.93

21         0       0       0      92.24     92.11     0.12

22         0       0       0      92.63     92.11     0.51

23         0       0       0      92.64     92.11     0.52

24         0       0       0      92.45     92.11     0.33

25         0       0      -2      81.6      80.58     1.01

26         0       0       2      92.61     91.16     1.44

27         0       0       0      92.45     92.11     0.33

28         0       0       0      92.22     92.11     0.1

29         0       0       0      92.53     92.11     0.41

30         0       0       0      92.1      92.11    -0.01

31         0       0       0      92.45     92.11     0.33

32         0       0       0      91.93     92.11    -0.18

               KOH∶FFA摩尔比

KOH被用于中和FFA并将它们从介质中除去。所测定的KOH∶ FFA摩尔比的范围列在表2中。负斜率：b1＝-3.99(表4)表明胆固醇 减少量随KOH的增加而减小，KOH的增加采用任何混合时间和速 率(图9和10)。KOH对胆固醇减少量的负面影响可能是因为它具有 能将介质中所存在的FFA转化成皂分子的能力。由于皂分子在介质 中的浓度(10.39mM)超过了临界胶束浓度(cmc)，所以它们聚集形成胶 束，该临界胶束浓度据报道对于油酸钠为1.5mM(Small，D.M.， Molecular Biology and Biotechnology，R.A.Meyers(ed)，第503-511 页，美国VCH Publishers公司(1995))。带负电的羧化物基团栓在胶 束的表面，并与β-环糊精分子外缘的羧基形成氢键，并由此与胆固醇 竞争β-环糊精分子。

采用较高的β-环糊精：FFA摩尔比以抵消KOH的负面影响，如 图11所示，这在经济上是可行的。响应曲面的形状(图11)和两个因 素相互作用项(B1B4＝12.86)的斜率是这两个变量之间强烈的相互作用 所特有的。钙盐是羧化物的受体。钙盐的加入将胆固醇的减少量提 高了至少约15％，如实验#18和19所示(表2)。钙盐与可溶性钾皂 反应形成不可溶的钙皂，这导致皂胶束被破坏，并由此抵消皂胶束 对胆固醇减少量的不利影响。用在本实验领域内的CaCl2∶FFA摩尔 比对于模型没有明显的影响。所测定的CaCl2∶FFA摩尔比的范围列 在表2中。

                    混合时间

胆固醇减少量Y1极大程度取决于混合时间。正斜率B3＝10.76 表明在任何β-环糊精∶胆固醇摩尔比或任何混合速率下，胆固醇减少 量随混合时间的增加而增加(图12和13)。所测定的混合时间的范围 列在表2中。

                β-环糊精∶胆固醇摩尔比

理论上1摩尔β-环糊精将络合1摩尔化合物(Szejtli，J.，Inclusion Compound 3：331(1984))。一些较大分子量的化合物可与一个以上的 环糊精分子络合(Szjetli 1984，IBID)。所测定的β-环糊精∶胆固醇摩尔 比的范围列在表2中。胆固醇减少量极大程度取决于β-环糊精∶胆固 醇摩尔比。正斜率B4＝4.97表明胆固醇减少量随β-环糊精∶胆固醇摩 尔比的增加而增加(图14)。

                      混合速率

混合速率是确保β-环糊精与胆固醇之间的接触、使水包油乳状 液稳定的重要因素。温度一达到50℃，将β-环糊精加入并采用 LIGHTNIN LAB MASTER(MS)混合器L1U03型和A100型叶轮(直径 1”)混合10分钟。胆固醇减少量极大程度取决于混合速率。正斜率B5 ＝30.44强烈表明在任何β-环糊精∶胆固醇摩尔比下，胆固醇减少量 随混合速率的增加而增加。响应曲面的形状(图14)是β-环糊精∶胆固 醇摩尔比与混合速率之间强烈的相互作用所特有的。所测定的混合 速率的范围列在表2中。

           基于Y2的最优化(FFA减少量百分比)

模型Y2对于指出方向以改变变量从而使FFA减少量达到最大值 是有用的。从显著性回归系数(表5)判断，影响FFA减少量的最重要 的因素是KOH∶FFA摩尔比、CaCl2∶FFA摩尔比、和混合速率。它 们显示出显著性的一阶、二次方程式和两个因素相互作用项。

                 KOH∶FFA摩尔比

当准确测量强度(KOH∶FFA摩尔比为1)的极稀的碱金属氢氧化 物溶液与FFA反应时，结果是下面的反应：

         RCOOH+KOH→RCOOK+H2O

KOH的量是AMF中的FFA的函数。在图8所述的适当的实验条件 下，KOH∶FFA的摩尔比为1时足够中和介质中所存在的全部FFA。 由于皂化引起中性脂肪的损失，所以过量碱溶液非常不利于提高收 率。过量碱溶液对香味非常不利，因为过量(OH-)使内酯水解成它们 相应的羟基酸。FFA减少量极大程度取决于KOH∶FFA摩尔比。正 斜率B1＝24.58(表5)表明在任何混合速率下，FFA减少量随KOH∶FFA 摩尔比的增加而增加(图15)。所测定的KOH∶FFA摩尔比的范围列在 表2中。

                   氯化钙∶FFA摩尔比

氯化钙被用作羧化物的受体。将其加入精炼溶液是关键的，因 为它们可以：(1)与羧化物反应形成不溶性盐(近似于石灰石)，并且因 此通过离心从介质中将它们分离就变得非常有效；(2)与可溶性K或 Na皂反应形成不溶性皂，并通过乳化作用使中性脂肪的损失减到最 少，且因此得到较高的收率；(3)破坏皂胶束并使β-环糊精在带负电 的胶束表面的絮凝作用减到最小，并由此获得更高的胆固醇减少量(表 1的18和19)；(4)与KOH协力共同增加FFA的减少量；和(5)用阳 离子使介质饱和，并由此通过阻止下面反应的发生来提高FFA的减 少量：

RCOO-+H2O�RCOOH+OH-

过量的阳离子由钙盐提供，而不由苛性溶液提供，因为过量羟基对 收率和香味有不利影响。所测定的CaCl2∶FFA摩尔比的范围列在表 2中。由于β-环糊精本身可以减少FFA，所以氯化钙对FFA减少量 的影响通过介质中所存在的β-环糊精来预测。

                     混合速率

混合速率是确保精炼溶液中的溶质与FFA之间的接触的重要因 素。用在本实验领域内的混合速率对FFA减少量有轻微的影响(图 15)。正斜率B5＝5.28(表5)表明FFA减少量随混合速率的增加而增 加。所测定的混合速率的范围列在表2中。

                      实施例14

用于Y1的模型表明β-环糊精∶胆固醇摩尔比、混合时间和混合 速率越高，胆固醇减少量越大。用在表2的#4和#26中的这3个 独立变量的联合影响使AMF胆固醇分别减少了77.30％和73.70％。 这些处理的进一步优化可以提高胆固醇减少量。用在表2的实验#4 中的β-环糊精的量比用在实验#26中的量多。考虑到本方法的成本 效益，对表2的实验#26进行进一步的优化。由于增加β-环糊精的 量在经济上不可行，并且采用更高的混合速率可能会使介质的粘度 增加，而这在离心分离期间将引起收率问题，所以就混合时间对#26 进行优化。考虑到所研究的两个响应，发现胆固醇减少量可以通过 增加混合时间进一步提高。事实上，用于胆固醇减少量的理论数学 模型表明胆固醇可以在大约30-35分钟的混合时间被完全去除。

本发明的主要目的是在一步单一操作内，降低动物脂肪中的胆 固醇、游离脂肪酸和熔点，以生产可在冷藏温度涂敷的健康脂肪。 这些目的可通过采用图16概述的最终优化工艺来实现。

                     实施例15

将含有0.283％胆固醇和0.3％FFA的10(g)AMF以1400rpm和 水与玉米油的重量比分别为10∶0、11.5∶1.5、13∶3、16∶6和20∶10的10、 13、16、22、30(g)“液体配方”混合，直至温度达到50℃。用于所 有实验的“液体配方”由KOH、CaCl2、dH2O和玉米油组成。不同 组分的比例如下：KOH∶FFA的摩尔比为1∶1(固定比)、FFA∶CaCl2的 摩尔比为1∶5(固定比)以及上述H2O：玉米油的可变重量比。在50℃， 将650mgβ-环糊精加入混合物，同时以相同速率(1400rpm)混合30分 钟以上。在室温下，将所形成的皂和β-环糊精：胆固醇络合物直接用 离心机以8700×g分离10分钟。在上部上清液相中回收改性无水乳 脂。所获得的胆固醇、FFA熔点降低量在表8进行了说明。

                       实施例16

将含有0.0796％胆固醇和0.547％FFA的10(g)牛油与10(g)“液 体配方”(0.108％KOH、1.42％CaCl2、重量比为10∶0的水∶玉米油)以 1400rpm混合直至温度达到50℃。在50℃，将650mgβ-环糊精加入 混合物，同时以相同速率混合30分钟以上。然后将混合物加热到55 ℃以改进皂和β-环糊精：胆固醇络合物的分离。在室温下，将所形成 的皂和β-环糊精：胆固醇络合物直接用离心机以8700×g分离5分 钟。将离心机的转轴在热水浴中加热到50℃。在上部上清液相中回 收减少了胆固醇和FFA的牛油。所达到的胆固醇、FFA减少量分别 为100％和98.16％。

           表8-液体配方的水与玉米油的重量比

      对无水乳脂中的胆固醇、FFA、以及熔点降低量的影响

                                水∶玉米油(w/w)

               10∶0     11.5∶1.5    13∶3    16∶6    20∶10

胆固醇％       0.0118    0.0135       0.0208   0.0421   0.0628

FFA％          0.02      0.02         0.02     0.02     0.02

Weily熔点℃    35        33           30       27       25

                     实施例17

将含有0.071％胆固醇和0.122％FFA的10(g)猪油与10(g)“液 体配方”(0.024％KOH、0.326％CaCl2、重量比为10∶0的水∶玉米油) 以1400rpm混合直至温度达到50℃。在50℃，将650mgβ-环糊精加 入混合物，同时以相同速率混合30分钟以上。在室温下，将所形成 的皂和β-环糊精：胆固醇络合物直接用离心机以8700×g分离10分 钟。在上部上清液相中回收减少了胆固醇和FFA的猪油。所达到的 胆固醇、FFA减少量分别为100％和95.5％。

本发明降低动物脂肪中的FFA、胆固醇和熔点的方法是以作为 中和剂的碱金属氢氧化物、作为羧化物受体的钙盐、作为络合剂的β- 环糊精、以及低熔点植物油的使用为基础，来生产可在冷藏温度涂 敷的无胆固醇无水乳脂。本方法的观念是采用稀释含水“液体配方”、 低温和相对长的反应时间。本方法具有大量特性使其比用于减少乳 脂中的胆固醇和FFA的先有技术方法拥有可观的实践性优点。本方 法是有效的，因为在单一步骤内将胆固醇完全去除了，所获得的胆 固醇减少量比先有技术至少高出约20％。所观测到的FFA的减少量 高于92.40％，这比先有技术方法高出45％。本方法本轻利厚且是高 效的，因为它在单一操作内实现了我们的全部目的，这赋予了本方 法许多优于先有技术方法的好处。本方法可在一个封闭体系内进行 以防止AMF暴露在空气中，从而最大程度减少氧化变质。本方法不 需要昂贵的专用资本设备。它只需加热和混合之后进行离心分离。

没有FFA或胆固醇的加工过的动物脂肪可在低脂或无脂牛奶中 被均化以重新组成全牛奶。该产品可被用于制作乳酪或冰淇淋。

先前的说明仅仅是打算作为本发明的例证，本发明仅被下文所 附的权利要求书所限定。

                       本发明背景