寡核苷酸的制备方法

寡核苷酸的制备方法

本发明涉及制备寡核苷酸的方法。

寡核苷酸通常通过固相合成制备，其中新生的寡核苷酸偶联在载体上。通常，在四唑或取代四唑活化剂存在时使用亚磷酰胺化学来影响核苷的依次偶联。大多数合成应用中所用到的载体是刚性的、非溶胀的载体，具体为可控多孔玻璃和刚性聚苯乙烯。已经进行了许多使用可溶胀载体的尝试，可溶胀载体具有潜在负荷更高的优点。它们也使用基于四唑的常规活化剂。一般而言，结果是令人失望的，不是偶联反应缓慢就是需要大量的活化剂。

令人惊讶地是，如今已经找到了一类特殊的活化剂，能显著地改善使用亚磷酰胺化学和可溶胀载体的寡核苷酸合成。

本发明提供了合成寡核苷酸的方去，其中在活化剂存在下使用亚磷酰胺方法在可溶胀的载体上装配寡核苷酸，其中活化剂不为四唑或取代的四唑。

本发明的方法中所使用的活化剂包括杂芳环中含有少于4个氮原子的杂芳化合物的盐，尤其是含有5或6元环的杂芳化合物，其中环上含有1或2个氮原子。实例包括公开于PCT申请WO99/62922中(通过引用结合到本文中)的吡啶鎓、咪唑啉鎓和苯并咪唑啉鎓盐，具体为六氟磷酸盐、四氟硼酸盐、三氟甲磺酸盐、氢氯酸盐、三氟乙酸盐、二氯乙酸盐、甲磺酸盐、O-甲苯磺酸盐、溴化物或三氟磺酸盐(trifluorosulphonyl)；苯并三唑及其衍生物，尤其是羟基苯并三唑；糖精或其衍生物，优选作为与有机碱形成的盐-络合物使用，尤其是糖精的N-甲基咪唑、吡啶或3-甲基吡啶盐。

优选使用的糖精或糖精衍生物具有通式：

式(I)式1中，p为0或1-4的整数。每次出现的R为取代基，优选各自独立，为卤素、取代或未取代的脂族基、-NR1R2、-OR3、-OC(O)R3、-C(O)OR3、氰基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环基、-CHO、-COR3、-NHCOR3、取代或未取代的芳烷基、卤代烷基(如三氟甲基和三氯甲基)或-SR3。R优选为卤素、取代或未取代的脂族基、-NR1R2、-OR3、-OC(O)R3、-C(O)OR3或氰基。或者，两个相邻的R基团与它们连接的碳原子一起形成6元的饱和或不饱和环。形成的6元环优选为芳环。R1和R2各自独立为-H、取代或未取代的脂族基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基；或与它们连接的氮一起形成杂环基。R3为取代或未取代的脂族基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的芳烷基。X为O或S。X优选为O。特别优选X为O且p为0。

可存在的合适取代基包括芳基、卤代芳基、烷基、卤代烷基(如三氟甲基或三氯甲基)、脂族醚、芳族醚、苄基、取代苄基、卤素尤其是氯和氟、氰基、硝基、-S-(脂族或取代的脂族基)和-S-(芳族或取代的芳族)基团。

优选糖精或糖精衍生物作为与有机碱形成的盐络合物使用。

能与糖精或糖精衍生物形成盐-络合物的有机碱，是在pH7时趋向于接受质子的有机化合物。优选的有机碱为仲胺、叔胺或氮杂杂环碱，它们各自可以被一个或多个取代基取代或未取代。非质子有机碱为在没有接受质子之前其化学结构中没有任何氢键质子的有机碱。如本文所描述的，非质子有机碱如叔胺和非质子氮杂杂环化合物优选与式1化合物联合使用。

本文所用的氮杂杂环包括芳环中有一个或多个氮原子的杂芳基和非芳环体系中至少有一个氮原子的杂脂环基。氮杂杂芳碱优选具有5元或6元芳环，芳环上有1-3个氮原子。氮杂杂脂环化合物优选为5元或6元环，环上通常含有1个或2个氮原子。氮杂杂环碱的实例包括嘧啶、1-烷基吡唑(尤其是1-(C1-4烷基)吡唑)、1-芳基吡唑、1-苄基吡唑、吡嗪、N-烷基嘌呤(尤其是N-(C1-4烷基)嘌呤)、N-芳基嘌呤、N-苄基嘌呤、N-烷基吡咯(尤其是N-(C1-4烷基)吡咯)、N-芳基吡咯、N-苄基吡咯、吡啶、N-烷基咪唑(尤其是N-(C1-4烷基)咪唑)、N-芳基咪唑(尤其是N-苯基咪唑)、N-苄基咪唑、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、N-烷基吲哚(尤其是N-(C1-4烷基)吲哚)、N-芳基吲哚、N-苄基吲哚、N-烷基苯并咪唑(尤其是N-(C1-4烷基)苯并咪唑)、N-芳基苯并咪唑、N-苄基苯并咪唑、三嗪、噻唑、1-烷基-7-氮杂吲哚(尤其是1-(C1-4烷基)-7-氮杂吲哚)、1-芳基-7-氮杂吲哚、1-苄基-7-氮杂吲哚、吡咯烷、吗啉、哌啶和哌嗪。尤其优选氮杂杂环碱为吡啶类如吡啶和3-甲基吡啶、以及N-(C1-4烷基)咪唑如N-甲基咪唑。

叔胺为具有与三个碳原子结合的氮原子的有机碱，该氮原子经常结合三个芳基(通常为苯基)和/或烷基，通常为三个烷基，包括例如三烷基胺如三甲胺、三乙胺和二异丙基乙胺。此外，叔胺可以为氮杂杂环基，其中氮原子为非质子的。优选叔胺为氮杂杂环基。氮杂杂环叔胺的实例为N-烷基吡咯烷、N-芳基吡咯烷、N-烷基吡咯、N-芳基吡咯、N-烷基吗啉、N-芳基吗啉、N-烷基哌啶、N-芳基哌啶、N-二烷基哌嗪、N，N-二芳基哌嗪、N-烷基-N-芳基-哌嗪、奎宁环、1，5-二氮杂二环[4.3.0]壬-5-烯和1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯。叔胺也可以是氮杂杂芳基或氮杂杂脂环基化合物。

仲胺为含有与一个氢原子和两个碳原子结合的氮原子的有机碱。通常该氮原子结合两个烷基或芳基或形成氮杂杂环基团的部分。仲胺化合物的实例包括二乙胺和二异丙胺。

特别优选的有机碱包括吡啶、3-甲基吡啶和N-甲基咪唑。

本发明方法中可使用的可溶胀载体为当接触合适的溶剂时体积增加的载体。应该认识到，溶胀的程度在载体和载体之间不同，且依赖于溶剂的性质。优选可溶胀固体载体的溶胀比范围在5-20之间。溶胀比定义为：Vol最终＝使载体在给定溶剂中完全溶胀后的最终体积。

Vol最初＝载体的最初干燥柱床体积。

可溶胀载体典型地为交联聚合物，其中交联的数量低到足够允许溶胀。这些聚合物中的交联度可以表达为百分率，对应为来自含有两个或更多可聚合双键的单体的可聚合双键摩尔数占可聚合双键摩尔数总量的百分数。交联百分率常常在0.1、通常0.5至20％的范围内，如从1-10％，优选为不超过5％。含有交联不超过20％的聚合物通常是可溶胀的，而含有交联大于20％的聚合物通常是不可溶胀的。所使用的最优选的交联水平从1％-5％，尤其从1％-3％。

聚合物载体可以来源于包含一种或多种单体的组合物的聚合，优选来源于包含两种或更多单体的组合物的聚合。单体可包含一个或多个可聚合双键。优选聚合物载体来源于以下组合物的聚合：该组合物包含一种或多种只含有一个可聚合双键的单体和一种或多种含有两个或更多个可聚合双键的单体。最优选聚合物载体来源于以下组合物的聚合：该组合物包含一种或两种只含有一个可聚合双键的单体和一种含有两个或三个可聚合双键的单体。

只包含一个可聚合双键的单体实例包括苯乙烯和取代的苯乙烯如α-甲基苯乙烯、甲基苯乙烯、叔丁基苯乙烯、溴代苯乙烯和乙酰氧基苯乙烯；单烯不饱和二羧酸的烷基酯如马来酸二正丁酯和延胡索酸二正丁酯；羧酸的乙烯酯如乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯和叔碳酸乙烯酯如VeoVa9和VeoVa10(VeoVa为Shell的商标)；丙烯酰胺如甲基丙烯酰胺和乙基丙烯酰胺；异丁烯酰胺如甲基异丁烯酰胺和乙基异丁烯酰胺；腈单体如丙烯腈和甲基丙烯腈；丙烯酸和异丁烯酸酯，优选任选取代的丙烯酸和异丁烯酸的C1-20烷基酯和C1-20环烷基酯，如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸-2-乙基已酯、丙烯酸异丙酯、丙烯酸正丙酯、异丁烯酸甲酯、异丁烯酸乙酯、异丁烯酸正丁酯、异丁烯酸-2-乙基已酯、异丁烯酸异丙酯、丙烯酸正丙酯、丙烯酸羟乙酯、异丁烯酸羟乙酯、丙烯酸N，N-二甲基氨基乙酯和异丁烯酸N，N-二甲基氨基乙酯。也可使用只包含一个可聚合双键的上述单体的官能衍生物。

包含两个或更多个可聚合双键的单体实例包括二乙烯基苯(DVB)、四乙烯基苯以及多官能的丙烯酸酯和异丁烯酸酯如二丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三(甲基丙烯酸)酯、亚乙基双丙烯酰胺、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、季戊四醇三(甲基丙烯酸)酯、季戊四醇四(甲基丙烯酸)酯和N，N-二-丙烯酰乙二胺。优选的交联单体，尤其是用于制备交联聚苯乙烯，为DVB。

优选的可溶胀载体实例包括，包含聚苯乙烯的共聚物，如聚苯乙烯-聚乙二醇共聚物；官能化的聚苯乙烯，尤其是用聚乙二醇官能化的聚苯乙烯，包括WO00/02953中公开的聚合物，其通过引用结合到本文中；与聚乙二醇接枝共聚的聚苯乙烯，如可在商品名“Tentagel”下获得的聚合物，其中包含聚苯乙烯核心，聚乙二醇(MWt约4000)链接枝在该核心上；以及聚合物如聚乙酸乙烯酯。更优选的载体包括部分水解的聚(乙酸乙烯酯)。此外，假如需要，也可以使用聚(丙烯酰胺)载体，尤其是微孔性或软胶载体，如通常用于进行肽固相合成的载体。优选的聚(丙烯酰胺)载体为胺官能化的载体，尤其是来自通过丙烯酰-肌氨酸甲酯、N，N-二甲基丙烯酰胺和二丙烯酰乙二胺共聚制备得来的载体，如在产品目录名PL-DMA下销售的商用载体(Polymer Laboratories )。Atherton，E.；Sheppard，R.C.；在Solid PhaseSynthesis，Practical Approach，Publ.，IRL Press at Oxford UniversityPress(1984)中已经描述了载体的制备方法，其通过应用结合到本文中。在这种载体上的官能团为甲酯，最初通过与烷基二氨如乙二胺反应转化为伯胺。

可溶胀固体载体包含在其上进行寡核苷酸合成的官能团。这种官能团的实例为氨基和羟基。

通过直接连接到固体载体的官能团上，可以进行寡核苷酸合成。然而，在许多具体实施方案中，优选使用可裂解的连接基团将寡核苷酸通过官能团连接到载体上。这种连接基团的实例为本领域所熟知，具体包括琥珀酰基、草酰基和三苯甲基连接基团。

在许多实施方案中，载体在选择的溶剂中溶胀，以使载体上的官能团容易接近。可以通过考虑聚合物的组成预测选择的溶剂，它们通常是理论线性聚合物的“良好”溶剂，这种聚合物由相似的组分制得，但没有任何交联剂存在。

本发明的方法优选使用选择用于溶胀固体载体的溶剂。应该认识的是，基于所使用的固体载体的性质选择溶剂的性质。适合用于亚磷酰胺化学的合适溶剂的实例为本领域所熟知，具体包括乙腈、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、四氢呋喃和吡啶。

通过本发明的方法可以制备的寡核苷酸包括寡脱氧核糖核苷酸、寡核糖核苷酸和包含脱氧核糖核苷和核糖核苷混合物的寡核苷酸。寡核苷酸可以通过一种或多种寡核苷酸化学领域已知的修饰方法修饰，例如，核糖核苷部分可以在一个或多个2’-位被修饰为2’-烷氧基，如甲氧基或甲氧基乙氧基。脱氧核糖核苷部分可以在2’-位被修饰为取代基，例如卤素尤其是氟或烯基如烯丙基。也可存在脱碱基核苷。可存在一种或多种锁定核苷(locked nucleoside)。在许多实施方案中，寡核苷酸以天然的D-异构体形式存在。然而，某些或全部寡核苷酸可以全部或部分代表非天然的异构体，例如L-异构体或B-端基异构体。核苷间连接物可以是天然的磷酸酯，或是一个或多个修饰的连接物，例如可存在硫代磷酸酯或氨基磷酸酯连接物。

寡核苷酸可以包含一个或多个保护基团。这种保护基团和用来保护的位点的实例为本领域的技术人员所熟知，包括三苯甲基、单甲氧基三苯甲基和二甲氧基三苯甲基、乙酰丙酰基、异丁酰基、苯甲酰基、乙酰基和碳酸酯基，例如BOC，尤其是FMOC。

寡核苷酸可以包含天然和/或非天然的核碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮-6-氧杂嘌呤、6-氧杂嘌呤、3-脱氮腺苷、2-氧杂-5-甲基嘧啶、2-氧杂-4-甲硫基-5-甲基嘧啶、2-硫代羰基-4-氧杂-5-甲基嘧啶、4-氧杂-5-甲基嘧啶、2-氨基-嘌呤、5-氟尿嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、8-氨基嘌呤、4-三唑-5-甲基胸腺嘧啶、4-三唑-5-甲基尿嘧啶和次黄嘌呤。

寡核苷酸优选通过将核苷亚磷酰胺和含有游离羟基的核苷或寡核苷酸偶联来制备，尤其是通过将脱氧核糖核苷-3’-亚磷酰胺或核糖核苷-3’-亚磷酰胺与新生的包含游离5’-羟基的寡核苷酸偶联来制备。应该认识的是，本发明的方法同样适用于将5’-亚磷酰胺偶联到游离的3’-羟基上。

优选的亚磷酰胺为下式的化合物：其中R4为保护基团，优选为三苯甲基、单甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基，B为核苷碱基，R5代表-H、-F、-OR6、-NR7R8、-SR9或取代或未取代的脂族基如甲基或烯丙基。PG为磷保护基团，通常为用于寡核苷酸合成的可裂解磷保护基团，优选为取代或未取代的脂族基或下式的基团：-OCH2CH2CN、-SCH2CH2CN、-OR11、-SR11、-O-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5、-O-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3、-O-CH2CH2-C6H4-NO2、-S-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5、-S-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3或-S-CH2CH2-C6H4-NO2。R6代表-H、取代或未取代的脂族基(例如甲基、乙基、甲氧基乙基或烯丙基)、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、醇保护基团尤其是碱不稳定或甲硅烷基保护基团、或-(CH2)q-NR12R13。R7和R8各自独立为-H、取代或未取代的脂族基或氨基保护基团。或者，R7和R8与它们连接的氮原子一起形成杂环基。R9代表-H、取代或未取代的脂族基或硫醇保护基团。R11代表取代或未取代的脂族基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的芳烷基。R12和R13各自独立为-H、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的脂族基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂芳烷基或氨基保护基团。或者，R12和R13与它们连接的氮原子一起形成杂环基。q为1至约6的整数。每个R16独立为C1-6烷基，优选为异丙基。所使用的亚磷酰胺通常是β-氰基乙氧基-N，N-二异丙基-亚磷酰胺。

本发明的方法可以使用利用亚磷酰胺化学进行寡核苷酸固相合成的常规方法步骤，包括硫化、氧化和封闭阶段。

当使用硫化剂时，此硫化剂可以包含硫元素。优选的硫化剂为有机硫化剂。

有机硫化剂的实例包括1，1-二氧化-3H-苯并二硫杂茂-3-酮(也称为“Beaucage试剂”)、四硫化二苯甲酰(dibenzoyl tetrasulfide)、二硫化二苯乙酰、N，N，N’，N’-二硫化四乙基秋兰姆和3-氨基-[1，2，4]-二噻唑-5-硫酮(参见美国专利No.6,096,881，其全部内容通过引用结合到本文中)。

使用上述试剂硫化寡核苷酸的典型反应条件可以在Beaucage等，Tetrahedron(1993)，49：6123中找到，通过引用结合到本文中。

优选的硫化剂为3-氨基-[1，2，4]-二噻唑-5-硫酮和二硫化二苯乙酰。

例如，通过使用3-氨基-[1，2，4]-二噻唑-5-硫酮的在有机溶剂如吡啶/乙腈(1∶9)混合物或吡啶中的溶液，浓度约为0.05M至约0.2M，可以进行寡核苷酸的硫化。

可以使用的氧化剂的实例包括碘和过氧化物，如叔丁基过氧化氢。

例如，可以通过一系列步骤制备所需的寡核苷酸，包括被保护、通常是5’-被保护的核苷亚磷酰胺与游离羟基偶联；氧化或硫化在偶联步骤中形成的被保护的亚磷酸三酯，形成磷酸或硫代磷酸寡核苷酸酯；从寡核苷酸上去除保护基团；重复此循环直到装配成所需的序列。寡核苷酸可以从固体载体上裂解下来，任何残留的保护基团如核碱基和磷保护基团可以使用本领域已知的条件去除。

本发明的方法可以在多种合适的反应器中进行，包括例如柱、搅拌容器和固定床反应器。

可以通过以下实施例说明而不是限制本发明。

实施例1合成DMTrOABz-3’-琥珀酸酯将5’-DMTrOABz-3’-OH(75.0g，117mmol)装入烘干的500mlflorentine烧瓶中，随后加入琥珀酸酐(15.6g，160mmol)和N，N-二甲基氨基吡啶。用氮气充满烧瓶，烧瓶颈部装入橡胶隔片。用注射器将无水吡啶(250ml)装入烧瓶。所得溶液在室温下搅拌82小时，之后真空除去大部分的吡啶。所得粗品油在塞住的烧瓶中贮藏50小时。

将油溶于二氯甲烷(DCM，250ml)，用水(2×250ml)和磷酸三乙铵溶液(3M，pH7.5，250ml)洗涤此溶液。分离有机相，用MgSO4干燥，真空中去除溶剂。残渣溶于甲苯(200ml)，真空中去除溶剂。用甲苯(200ml)和DCM(200ml)各再重复一次。产生淡黄色的泡沫，该泡沫真空干燥3小时后可以被粉碎成自由流动的粉末(94.4g)。

测定(HPLC，面积％)该产物的浓度为97％，相应的产率为91％。制备5’-HOABz-3’-琥珀酸酯-聚苯乙烯树脂从Novabiochem获得的氨甲基化聚苯乙烯树脂(产品目录号01-64-0010)(与1％二乙烯基苯交联)(5g，“5.65mmol”，1当量)置于大的直边烧结漏斗中，并预先用N-甲基吡咯烷酮(NMP，约30ml)溶胀，经侧臂施加正压氮气在稠浆中鼓泡。大约30分钟后排出NMP。

5’-DMTrOABz-3’-琥珀酸酯(19.4g，3.9当量)和羟基苯并三唑(HOBt)(4.6g，6当量)溶于NMP(约35ml)，向此溶液中加入二异丙基碳二亚胺(DIC，2.1g，2.9当量)。加入DIC约2分钟后向此溶液中加入二异丙基乙胺(1.7g，3当量)。搅拌整个溶液，然后快速加入到烧结漏斗中的溶胀树脂中，再次从烧结漏斗下面通入正压氮气以搅动浓稠的黄色胶。DIC污染的玻璃器皿和装置在苛性碱浴中解毒。

盖住烧结漏斗以防止反应混合物受污染(非密封的封口物)，反应维持轻微鼓泡65小时。

经过这个周期后通过标准Kaiser测定检查反应的进程，得到阴性的结果(黄色)，就可认为完成反应。

通过用真空装置代替N2流，将溶液抽吸入烧瓶中，排出反应物溶液。用NMP(3×40ml)洗涤树脂。通过加入乙酸酐(4.2g，7.2当量)和N，N-二甲基氨基吡啶(0.07g，0.1当量)的NMP溶液(～35ml)并维持1小时，封闭任何残留的游离氨基。排出反应物，树脂用二甲基甲酰胺(DMF，5×40ml)、DCM(5×40ml)洗涤，最后用二乙醚(3×40ml)皱缩(collapse)。树脂用氮气流吹干，并且置于真空干燥箱中室温下过夜。用过的反应物溶液用NaOH溶液处理解毒。

将树脂(1.028g)装入带夹套的相反应器中，并用DCM(～10ml)洗涤。用流体循环器将反应器夹套冷却到0℃。应用抽吸，将3％(重量)二氯乙酸的DCM(84ml)溶液装入反应器。立即显示深红色。一旦所有酸溶液都经过了树脂床(110s)，用DMF(5×～10ml)和DCM(5×～10ml)洗涤树脂，最后用二乙醚(3×～20ml)皱缩。

制备5’-AcOG(isobu)TABzCBzABz-3’-聚苯乙烯树脂偶联反应(即偶联前洗涤到硫化)中所有“干燥”步骤的DMF为商业的无水DMF(来自Aldrich)，当需要的时候将其以约100ml批次过分子筛干燥过夜。这使得提供的DMF具有10-50ppm的含水量(Karl-Fischer)，而最初提供的为～150ppm。在这些步骤中，通过在反应器顶盖经Rotaflo栓施加正压N2，排出溶液。在这系列的反应中，最初使用的树脂为上面制备的0.5mmolg-1的HOABz-聚苯乙烯树脂。所有的亚磷酰胺被保护为脱氧核糖-3’-β-氰基乙氧基-N，N-二异丙基亚磷酰胺。

将HOABz-聚苯乙烯树脂(1.356g，0.69mmol)装入到有夹套的固相反应器中，反应器装有隔膜入口和Rotaflo栓。氮气的入口和出口都装有充满自动指示P2O5的管线内干燥管。用无水DMF(3×～5ml)和无水DCM(2×～5ml)洗涤树脂。核苷酸(141g，2.5当量)用MeCN(2×10ml)共沸干燥，并溶于无水DCM(～3ml)。将糖精的N-甲基咪唑盐(0.45g，2.5当量)装入装有隔膜的烘干管，并溶于无水DMF(～0.75mol)和无水DCM(～1.5ml)中。按顺序将亚酰胺和糖精盐溶液装入预先溶胀的树脂。

用N2对混合物持续轻微鼓泡2小时后，加入无水甲醇(～2ml)。约5分钟后将溶液从反应器中排出，用无水DMF(3×～5ml)和无水吡啶(2×～5ml)洗涤树脂。用过的反应物溶液通过高效液相色谱分析以评估反应结束时残留的活性亚酰胺的量。

将3-氨基-[1，2，4]-二噻唑-5-硫酮(0.25g，2.5当量)的无水吡啶溶液(～4ml)装入树脂，持续N2轻微鼓泡1小时，之后排出溶液。从反应器上移开顶盖，树脂用bench DMF(5×～5ml)和DCM(5×～5ml)洗涤，然后用Cap A溶液(5∶3∶2乙腈∶吡啶∶N-甲基咪唑，2×～5ml)洗涤。然后将Cap A溶液(2.5ml)和Cap B溶液(4∶1 乙腈∶乙醚，2.5ml)装入反应器，混合物维持1小时。

排出用过的封闭溶液，然后用DMF(5×～5ml)和DCM(5×～5ml)洗涤树脂，最后用二乙醚(3×～5ml)洗涤。然后将树脂在脱三苯甲基前放置过夜。

在脱三苯甲基前，将反应器夹套冷却到0℃，并且用DCM洗涤/预溶胀树脂。树脂维持在抽吸下，使3％二氯乙酸溶液(DCM中)经过树脂床，产生艳红色。所使用的体积基于每1mmol预期吸附在树脂上的DMT需要100ml 3％的酸溶液。一旦所有的酸溶液都经过了树脂床，用DMF(5×～5ml)和DCM(5×～5ml)洗涤树脂。再将1个体积的酸溶液经过树脂，此时呈现浅橙色。再次用DMF(5×～5ml)和DCM(5×～5ml)洗涤树脂，最后用二乙醚(3×～5ml)洗涤以备下一个偶联反应。

将HOABzPS树脂样品与dC、dA、T和dG亚酰胺偶联后，每次使用相同的方法，并且在最后脱三苯甲基步骤后封闭，得到重2.653g的5′-AcOG(isobu)TABzCBzABz-3′-聚苯乙烯树脂。

实施例2制备5’-AcOG(isobu)TABzCBzABz-3’-PDMA树脂通过丙烯酰-肌氨酸甲酯、N，N-二甲基丙烯酰胺和二丙烯酰乙二胺的共聚作用产生聚(丙烯酰胺)树脂(PL-DMA树脂，来自PolymerLabs，69g)，在2L的密封圆底烧瓶中用乙二胺(700ml)处理，并室温下放置过夜。然后将此淤浆转移到烧结漏斗中，并用DMF(12×700ml)洗涤。产生了不含有氨基的DMF洗出液。然后用含有梯度增加的DCM的DMF(2.5L；0-100％ DCM)洗涤树脂，然后用含有梯度增加的乙醚的DCM(900ml；0-100％乙醚)洗涤。然后树脂在氮气流中40℃下干燥过夜。产生的树脂每克中含有973微摩尔的氨基官能团(“PDMA”)。

偶联反应(即偶联前洗涤到硫化)中所有“干燥”步骤的DMF为商业的无水DMF(来自Aldrich)，当需要的时候将其以约100ml批次过分子筛干燥过夜。这使得提供的DMF具有10-50ppm的含水量(Karl-Fischer)，而最初提供的为～150ppm。在这些步骤中，通过在反应器顶盖上经Rotaflo栓施加正压N2，并同时在真空下抽吸，排出溶液。在这系列的反应中，最初使用的树脂为用与实施例1中制备5’-HOABz-3’-琥珀酸酯-聚苯乙烯相同的方法所制备的0.56mmolg-1 5’-HOABz-3’-PDMA树脂，除了用PDMA代替聚苯乙烯。所有亚磷酰胺为5’-二甲氧基三苯甲基保护的脱氧核糖-3’-β-氰基乙氧基-N，N-二异丙基亚磷酰胺。

将5’-HOABz-3’-PDMA树脂(1.00g，0.56mmol)装入有夹套的固相反应器中，反应器装有隔膜入口和Rotaflo栓。氮气的入口和出口都装有充满自动指示P2O5的管线内干燥管。用无水DMF(4×～5ml)和无水DCM(1×～5ml)洗涤树脂。亚酰胺(1.16g，2.5当量)用MeCN(2×10ml)共沸干燥，并溶于无水DCM(～5ml)。将糖精的N-甲基咪唑盐(0.37g，2.5当量)装入装有隔膜的烘干管，并溶于无水DMF(～1.5ml)和无水DCM(～2ml)中。然后按顺序将亚酰胺和糖精盐溶液装入预先溶胀的树脂。

经过用N2对混合物轻微鼓泡持续1小时30分钟后，加入无水甲醇(～3ml)。约5分钟后从反应器中排出溶液，用无水DMF(3×～5ml)洗涤树脂。用过的反应物溶液通过高效液相色谱分析以评估反应结束时残留的活性亚酰胺的量。

将3-氨基-[1，2，4]-二噻唑-5-硫酮(0.21g，2.5当量)的无水吡啶溶液(～7ml)装入树脂，持续轻微的N2鼓泡1小时，之后排出溶液。移开反应器顶盖，树脂用bench DMF(5×～10ml)和DCM(5×～10ml)洗涤，然后用Cap A溶液(5∶3∶2二氯甲烷∶吡啶∶N-甲基咪唑，3×～10ml)洗涤。将Cap A溶液(5ml)和Cap B溶液(4∶1 二氯甲烷∶乙醚，5ml)混合然后装入反应器，混合物维持1小时。

排出用过的封闭溶液，然后用DMF(5×～10ml)和DCM(5×～10ml)洗涤树脂，最后用二乙醚(3×～15ml)洗涤。然后将树脂在脱三苯甲基前放置过夜。

在脱三苯甲基前，将反应器夹套冷却到0℃，并且用DCM洗涤/预先溶胀树脂。制备5％二氯乙酸的DCM溶液(1mmol预期被吸附在树脂上的DMT需要100ml酸液，即此时60ml)。将此溶液(15ml)装入反应器，产生深红色，维持30秒，排出。将树脂维持在抽吸状态下，此时使新鲜酸溶液(30ml)经过树脂床。最后一份酸溶液(15ml)在树脂上维持1分钟，排出用过的溶液。然后用DMF(5×～10ml)和DCM(5×～10ml)洗涤树脂。重复循环，直到用DCM洗涤之后颗粒用酸测试不产生红色。这时，用二乙醚(3×～15ml)洗涤树脂至皱缩以备下一个偶联反应。

将5’-HOABz-3’-PDMA树脂样品与dC、dA、T和dG亚酰胺偶联后，每次使用相同的方法，并且最后脱三苯甲基步骤后封闭，得到重1.80g的5’-AcOG(isobu)TABzCBzABz-3’-PDMA树脂。

实施例310升规模制备三苯甲基-四甘醇苯乙烯阶段1将四甘醇(4188g，，21.5mol)在氮气环境下加入到装有机械搅拌器的10升容器中，在60rpm下搅拌。向容器中加入吡啶(544g，6.9mol)，混合物加热到50℃。三苯基甲基氯(1000g，3.6mol)在氮气环境下溶于甲苯(3000ml)，并保持温度在60℃下缓慢的加入到甘醇中。温度维持50℃ 2小时，然后冷却到室温。加入2升甲苯，混合物用6升去离子水萃取，水相用5升甲苯萃取。合并的有机抽萃取物用2×4升去离子水洗涤，500g硫酸钠干燥，减压除去溶剂，得到1230g(74％，基于三苯甲基)淡黄色油，纯度94.3％(通过NMR)。

阶段2单(三苯甲基)四甘醇(1766.4g，3.8mol)与3升四氢呋喃(THF)一起加入到10升容器中，搅拌下冷却到-12℃。将对甲苯磺酰氯(945g，5mol)加入到甘醇/THF混合液中。用1小时将KOH(880g，15.7mol)去离子水(3升)溶液加到上述溶液中，保持温度低于-5℃。完成添加之后将容器加热到25℃，维持12小时。进行相分离，下层的水相用2×2.5升THF洗涤，合并有机相并在减压下去除溶剂。在7.5升乙酸异丙酯中的橙色/棕色油用10升水抽提，然后用2×5升水抽提，硫酸镁(500g)干燥，去除溶剂得到粘稠的橙色油状产物1837g(78.0％)，纯度95.3％(通过NMR)。

阶段3将去离子水(1.5升)和THF(2.1升)加到10L的容器中，100rpm下开始搅拌。容器冷却到-12℃，缓慢加入氢氧化钾(535g，9.5mol)。THF(1升)中的乙酰氧基苯乙烯(575ml，3.7mol)冷却下用约30分钟加入到上述容器中。将此容器加热到30℃，维持1小时，然后冷却到20℃。1050ml THF中的阶段2的产物(1800g，2.9mol)用15分钟加入到反应器中，然后将混合物加热到60℃，维持40小时。冷却反应，进行相分离，有机相用2×2升8M的氢氧化钾水溶液洗涤。减压下去除溶剂，残渣溶于甲苯(5升)，用3×2升去离子水洗涤，然后用2×2升1M的氢氧化钠水溶液洗涤，最后用2×3升去离子水洗涤。有机相用硫酸钠(500g)干燥，减压下去除溶剂，得到1471g(75％)的橙色油状产物，NMR纯度79.7％。

四甘醇-官能化聚合物的合成和随后的脱保护将部分水解的聚(乙烯醇)(Airvol 540，34.9g 2.5％(重量)水溶液)和氯化钠(31.2g)装入含有去离子水(1181ml)并装备有机械搅拌器的2升圆柱状带挡板反应器中。将阶段3的产物(79.7％，87.2g)、苯乙烯(59.1g)、二乙烯基苯(80％，1.4g)和过氧化十二酰的混合物加入到反应器中，400rpm下搅拌。经过20分钟搅拌之后，搅拌速度降至300rpm，并且用50分钟水浴加热反应混合物至80℃。16小时之后，冷却反应混合物，转移至50μm的滤布包中，用去离子水(5×1升)洗涤。然后用THF(4×1升)和二氯甲烷(DCM，2×1升)洗涤此聚合物颗粒，并在5升flange烧瓶/顶端搅拌器中氮气下和二氯甲烷(1800ml)、三氟乙酸(128g)和三乙基甲硅烷(51.5g)的混合物一起室温搅拌4小时。然后用二氯甲烷(4×1升)和己烷(5×1升)洗涤产物，在真空干燥箱中干燥至恒重，得到78g具有0.97mmol/g羟基含量的白色聚合物颗粒。5’-DMTrOABz-3’-琥珀酸酯与四甘醇-官能化聚合物的偶联将通过前面步骤制备的四甘醇-官能化聚合物(0.51g，0.357mmol)装入装有小型磁力搅拌子的50ml圆底烧瓶中。5’-DMTrOABz-3’-琥珀酸酯(1.28g，4当量)和羟基苯并三唑(HOBt，0.29g，6当量)溶于N-甲基吡咯烷酮(NMP，约5ml)，向此溶液中加入二异丙基碳二亚胺(DIC，0.19g，4.2当量)。加完DIC约2分钟之后，向此溶液中加入二异丙基乙胺(0.19g，4.1当量)。搅拌整个溶液，然后快速加到含有树脂的烧瓶中。受DIC污染的玻璃器皿和设备在2M氢氧化钠浴中解毒。

塞住烧瓶，混合物缓慢搅拌约70小时。此红色/棕色混合物转移至烧结漏斗中，抽滤，树脂用NMP(3×～20ml)洗涤。通过加入乙酐(0.29g，8当量)和二甲氨基吡啶(DMAP，0.02g，0.5当量)的NMP(～30ml)溶液，使氮气通过树脂床轻微鼓泡搅拌1小时，封闭任何残留的游离羟基。排出反应物，用DMF(5×10ml)和DCM(5×10ml)洗涤树脂，最后用二乙醚(3×20ml)皱缩树脂。树脂用氮气流吹干，室温下在真空干燥箱中干燥过夜。用过的反应物用NaOH溶液处理解毒。

产物重量：0.739g

制备5’-HOABz-3’-琥珀酸酯-四甘醇-官能化的聚合物将前面步骤中制备的5’-DMTrOABz-3’-琥珀酸酯-四甘醇-官能化的聚合物(0.739g)装入固相反应器中，该固相反应器含有适合在氮气环境下操作的夹套烧结反应器，并且装有隔膜入口和Rotaflo栓。氮气的入口和出口都装充满自动指示P2O5的管线内干燥管。用DCM(～10ml)洗涤聚合物。将反应器夹套用流体循环器冷却到0℃。使DCM(60ml)中的3％(体积)二氯乙酸(DCA)抽吸下流经树脂床。在颗粒上产生红色，但并不快速扩散到溶液中。颗粒也悬浮在溶液上面。一旦所有的酸溶液全部经过反应器，用DMF(5×～5ml)洗涤树脂，然后用DCM(5×～5ml)洗涤。通过将氮气流向上通过树脂床并加入溶剂，洗涤树脂，然后用真空代替氮气供应，以干燥树脂。

当氮气流向上通过树脂床时，将DCM(15ml)中3％(体积)的DCA溶液装入反应器。立即产生深红色。1分钟后用真空代替氮气流，排出酸溶液。使另外的3％酸溶液在抽吸下流经树脂床。第三份15ml 3％的酸溶液用氮气泡在树脂上维持1分钟，然后在抽吸下被排出。树脂用DMF(5×～5ml)和DCM(5×～5ml)洗涤。

如前面段落所述再进行“维持-冲洗-维持”处理，洗涤树脂后，通过用二乙醚(3×～10ml)洗涤皱缩树脂。滤液的HPLC分析显示不存在N-苯甲酰腺嘌呤，假如腺苷发生脱嘌呤就预期会有N-苯甲酰腺嘌呤的存在。

合成GTACA寡核苷酸硫代磷酸酯使用亚磷酰胺化学，采用下列偶联和脱三苯甲基条件进行合成。使用常规的5’-二甲氧基三苯甲基脱氧核糖核苷-3’-β-氰基乙氧基-N，N-二异丙基-亚磷酰胺。

偶联偶联反应(即偶联前洗涤到硫化)中所有“干燥”步骤的DMF为商业的无水DMF(来自Aldrich)，当需要的时候将其以约100ml批次过4分子筛干燥过夜。这使得提供的DMF具有5-50ppm的含水量(Karl-Fischer)，而最初提供的为～150ppm。在这些步骤中，通过在反应器的顶盖上经Rotaflo栓施加正压N2，并在烧结漏斗下抽吸，排出溶液。在这系列的反应中，最初使用的载体为通过上述方法制备的5’-HOABz-3’-琥珀酸酯-四甘醇-官能化的聚合物。

给出了系列中第一步偶联和脱三苯甲基反应的细节(dCbz亚酰胺+5’-HOABz-3’-琥珀酸酯-四甘醇-官能化的聚合物)。以相同的方法使用相同量的相应亚磷酰胺试剂(dAbZ、dT和dGibu亚酰胺)，进行随后的偶联和脱三苯甲基步骤。

将5’-HOABz-3’-琥珀酸酯-四甘醇-官能化的聚合物(0.320mol)装入固相反应器中，该固相反应器适合在氮气环境下操作，并装有隔膜入口和Rotaflo栓。氮气的入口和出口都装有充满自动指示P2O5的管线内干燥管。用无水DMF(3×～5ml)和无水DCM(2×～5ml)洗涤树脂。亚酰胺(0.67g，0.8mmol，2.5当量)与MeCN(2×10ml)共沸干燥，并溶于无水DCM(～3ml)。将按照国际专利申请WO03/004512方法制备的糖精甲基咪唑盐(SMI，0.21g，0.8mmol，2.5当量)装入装有隔膜的烘干管中，并溶于无水DMF(～0.5ml)和无水DCM(～2.5ml)中。按照顺序，将亚酰胺和SMI溶液经过隔膜入口装入预先溶胀的树脂中。

用氮气轻微鼓泡混合物维持2小时之后，加入无水甲醇(～2ml)。约5分钟后从反应器排出溶液，并且用无水DMF(3×～5ml)和无水吡啶(2×～5ml)洗涤树脂。用过的反应物溶液通过HPLC分析以评估反应结束时残留的活性亚酰胺的量。

将氢化苍耳烷(xanthane hydride)(0.12g，0.8mmol，2.5当量)的无水吡啶(～4ml)溶液装入树脂，并用N2轻微鼓泡维持1小时，之后排出溶液。从反应器上去除顶盖，用bench DCM(5×～5ml)和DCM(5×～5ml)洗涤树脂，然后用Cap A溶液(5∶3∶2 乙腈∶吡啶∶N-甲基咪唑，2×～5ml)洗涤。然后将Cap A溶液和CapB溶液(4∶1 乙腈∶乙醚，2.5ml)装入反应器中，混合物维持1小时。

将用过的封闭反应物排出，然后用无水DMF(5×～5ml)和无水DCM(5×～5ml)洗涤树脂，最后用二乙醚(3×～5ml)洗涤。然后在脱三苯甲基之前将树脂放置过夜。

脱三苯甲基在脱三苯甲基前先将反应器夹套冷却到0℃，然后用DCM洗涤/预溶胀树脂。DCM中3％(体积)的DCA(“酸溶液”)用于树脂脱三苯甲基。每个脱三苯甲基循环所使用的酸溶液的体积基于每摩尔预期吸附在树脂上的DMT需要167ml酸液。

通过用氮气从烧结漏斗下通气搅拌，酸溶液(12ml)与树脂维持1分钟。通过抽吸排出鲜红色的溶液，再使25ml的酸溶液通过树脂床。第三份12ml的酸溶液在排出之前与树脂维持1分钟。用DMF(5×～5ml)和DCM(5×～5ml)洗涤树脂。

再重复此酸处理/洗涤循环一次。最后用DCM洗涤后，用二乙醚(3×～5ml)洗涤皱缩树脂。

通过三苯甲基分析，4步偶联反应步骤平均偶联收率为97.5％。