一种使用聚合光致酸化剂制备肽核酸探针的方法

涉及领域

本发明涉及一种使用聚合光致酸化剂制备肽核酸探针点阵的方 法，尤其是使用聚合光致酸化剂制备固定在固体基质上的寡肽核酸探 针点阵的方法。

现有技术说明

生物芯片，一种生物检测元件，用于基因组分析、医药诊断、生 物与环境监测，大体分为DNA芯片和蛋白质芯片，DNA芯片用于鉴定 核苷序列，蛋白质芯片用于识别蛋白质，如病原体、抗体、抗原和酶。

1953年Watson和Crick证实的DNA结构极大地冲击了分子生物 学、生物化学等生命科学。DNA这种生物聚合物是由腺嘌呤(A)、胞 嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)四种不同碱基和糖(脱氧核糖)及磷 酸构成的一种极稳定的双螺旋结构：磷酸-糖形成骨架，互补成对碱基 附加到糖上，如A对T,G对C，利用氢键稳定。碱基间特异性/互补氢 键在反义药物和基因治疗等药物开发中起很重要的作用，尤其是对遗 传病、癌症和心脏病治疗药物开发。

最近，为了诊断和防止遗传病，要有序而努力地鉴定大约100,000 人类基因，因此，大幅度需要尽可能快地提供大量基因组信息的方法。 尽管利用聚合酶链反应和自动测定仪导进了Sanger DNA测序法，但仍 然烦琐费时、成本高，需要高级训练的人员操作。为此，要不断考虑 能克服现有技术中这些缺陷的可选方法。近几年，使用病毒使DNA芯 片制作和应用有了一定进展。

一般来说，DNA芯片是从几百至几十万固定在不足1平方英寸固 体表面的已知寡核苷酸探针的高密度微点阵，这种固体如硅、表面衍 生的玻璃、聚丙烯或活化的聚丙烯酰胺。如果把靶标DNA片段放在DNA 芯片上，根据序列互补就能把靶标DNA片段杂交进芯片的探针。利用 光化学方法或放射化学方法检测被杂交DNA表现位置就能分析出靶标 DNA片段的序列。使用DNA芯片协助的方法能使DNA分析体系小型 化，从而能用极少量DNA样品进行诊断，且能同时分析靶标DNA的几 个序列，因此，能用简便、低价、快捷的方式获得遗传信息。

使用寡核苷酸DNA芯片的序列分析技术是一种新颖的方法，它比 传统的Sanger法更快更易用于靶标基因测序。Sanger测序法需要用 凝胶电脉来分离荧光标记或放射性标记的DNA片段，费时且技术难度 大的光照要求难以达到令人满意的水平。相反，使用寡核苷酸DNA芯 片杂交的测序主要是把荧光标记或放射性标记的靶标基因片段放置在 具有寡核苷酸探针的DNA芯片上，然后用溶剂简单地冲洗芯片，利用 氢键把基因片段互补到已知的寡核苷酸探针上。

Merryfield合成法是把化学化合物放在抗有机溶剂的固体基质上 进行反应后再在固体基质上进行有机反应的方法，由于它能很简便有 效地对反应产物进行纯化，所以，它能有效地用于合成重要生物学酶 的寡肽和基因的寡核苷酸(参见：Fed.Proc.,24:412,1962)。在催化 剂筛选和药物开发中主要使用的是一种与所述化学结合法相配合的有 效合成方法。此外，通过把在固体基质上使用的这种合成方法和在半 导体工业中使用的平板照相印刷技术结合起来，把制备寡核苷酸探针 点阵的各种技术进一步用于遗传诊断。所述技术包括把表面衍生化玻 璃特定区选择活化为寡核苷酸化学结合区。为了活化特定的靶区，让 光束通过按预定图样制成的平板照相印刷掩光体的透光区。通过控制 该掩光体图样和每步骤的核酸组成，能把特定的核酸放置在想要放置 的位置。这种技术是在半导体设备中使用的超微处理技术，能把几百 万个探针固定在一个指甲大小的芯片上。

例如，Fordor等提出的一种新的直接光解技术，用UV-敏感保护 基团把核酸或氨基酸附加在固体表面上，使用平板照相印刷掩光体把 表面选择区暴光除去该保护基团，接着用带有光敏保护基的新核酸或 氨基酸与其反应，在特定区域处聚合核苷酸或氨基酸(参见： USP5,445,934)。由于这种方法可以在特定区域对特定序列/长度的寡 核苷酸探针进行选择合成，所以，这种方法用于在预定位置合成具有 想要序列和长度的各种寡核苷酸探针。此外，由于这种方法使用了半 导体设备中所用超微处理，所以对制作具有高密度的寡核苷酸探针极 为有用。Fordor等也建议在制作高密度寡核苷酸探针中使用寡核苷酸 探针测序法，该测序法比Sanger法更易更快。但其不足之处是：光敏 保护基的去除是与光源强度成比例的，这不利于制作高密度芯片的超 微处理。

另一方面，作为一种改进DNA芯片密度的主要技术，半导体工业 中用于形成微形图样的使用光致抗蚀剂(以后称作“PR”)的平板照相 印刷处理引人注目。由于半导体芯片的大小和容量依赖于平板照相印 刷处理所占据空间的分辩能力，平板照相印刷处理在半导体与微电子 工业中起主要作用。平板照相印刷处理利用了暴光区与不暴光区间PR 的不同溶解度。暴露区的溶解度减小被称作负体系而溶解度增加被称 作正体系，半导体芯片生产中大多数是利用正体系。使用上述平板照 相印刷处理能在芯片的有限区域上排列更多的寡核苷酸探针。

目前，平板照相印刷处理已被广泛用于PR体系(参见： USP5,658,734)和光致酸化制图排列体系(以后称作“PPA”, USP5,843,655)。

使用PR体系的平板照相印刷处理(以后称作“PR处理”)的优点在 于可以使用半导体工业中已经开发或商用的材料。根据该体系，在表 面上暴光形成图形，并在冲洗后产生标准的固相核酸合成反应，最后 连接成核苷酸。PR包括重氮醌/甲酚-酚醛清漆、表面高度粘合剂，它 在i-line(365nm)中表现出相当好的图形特征且用于16兆DRAM处理。 但是，PR在碱溶液([OH-]＞0.1M)中会反应，会把保护碱基氨基酸基团 的酰胺断开。最好在PR下有保护涂层，以便克服所述的反应问题(参 见：J.Vac.Sci.Tech.,B7(6):1734,1989)。

PR处理包括三个步骤：第一步主要是利用PR涂覆、暴光和反应 形成PR图形；第二步是用酸溶液除去保护基和未暴光部分；第三步是 附加核苷酸及后处理。使用PR体系的平板照相印刷处理足以获得高水 平的分辩率，但主要缺陷是上述处理复杂。

为了简化复杂的处理和提高效率，现有技术中也有提仪使用PPA 体系。由于PPA体系使用了混合有光致酸化剂(以后称作“PAG”)的聚 合基质，只在暴光区产生酸并且在热处理后除去保护基，因此，PR处 理中的两个独立步骤可以一步完成。但是，PPA体系也存在几个问题。 例如，由于接触和除去保护基要使用大量的酸溶液，虽然酸溶液的体 积和浓度不影响PR处理，但PPA体系中产生的酸仍然保留在聚合基质 上，并且，为了平衡酸量，还要加入更多的PAG。然而，当PAG超过 一定水平时，PAG本身成形且分散光，继而干涉微图形的形成。换句 话说，用于使图形成形稳定和复制的PAG过量会降低处理效果。此外， 加热会使产生的酸从聚合物分散到保护基的表面(实际上接近热源)， 当在一个热平台上加热玻璃板时，产生的酸会从保护基分散到相对的 方向中，从而降低效率。进一步来说，必须用丙酮或丁酮等有机溶剂 来除去聚合物与偶联PAG的混合胶片，这使处理的成本更高。

现有技术中DNA芯片技术面临的另一个问题是降低结合合/不结 合的程度、寡核苷酸探针与靶标基因杂交过程中速度，并且，在一个 基因中会出现点突变。例如，根据寡核苷酸杂交期间负电寡核苷酸间 排斥力降低退火强度和速度的研究结果，Nielsen等采用中性带电的肽 核酸(以后称作“PNA”)取代了能用改良的Marryfield肽合成法合成的 寡核苷酸。PNA极大地提高了寡核苷酸杂交期间的结合力及速度，并 且，在实践中能用于对特殊基因中的单个碱基突变体进行检测，这可 以通过非互补寡核苷酸间减少的结合来认识(参见：Nature,8:53, 1993)。由于有这种正向特性，可以对使用PNA的反义药物进行调查研 究。虽然有这些益处，但目前仍没有关于利用平板照相印刷处理在高 密度肽核酸探针合成中使用PNA的报道。

因此，有必要开发和探索在固体基质上合成肽核酸及具有各种核 苷酸序列的寡核苷酸的可选择方法，同时，克服现有技术中使用PR和 PPA体系制作DNA芯片所面临的问题。

本发明的目的

本发明极力于提供制备具有各种核苷酸序列的肽核酸探针的有效 方法，开发了一种制备肽核酸点阵的有效方法，它能消除使用聚合光 致酸化剂(以后称作“聚合PAG”)在固体基质上固定结合负电寡核苷 酸的排斥问题，同时，克服了现有技术中PPA处理在聚合物中使用PAG 的问题。

本发明的主要目的是提供使用聚合光致酸化剂在固体基质上制备 具有各种核苷酸序列的肽核酸探针点阵的方法。

本发明的另一个目的是提供使用聚合光致酸化剂制备具有各种核 苷酸序列的肽核酸探针点阵的方法。 本发明的详细说明

制备具有各种核苷酸序列的肽核酸探针的过程是：在醇中用氨烷 基氧硅烷(aminoalkyloxysilane)使固体基质表面衍生化，并在该固体基 质上附加上具有酸敏保护基的连接子，用聚合光致酸化剂(PAG)涂布 该固体基质，把固体基质暴光使被涂部在光中产生酸以消除酸敏保护 基，用碱溶液或有机溶剂冲洗该固体基质并除去残留的聚合光致酸化 剂，把具有酸敏保护基的单体肽核酸附加到该固体基质上，并重复上 述各步。

本发明中所使用的聚合PAG是具有分子量为500至1,000,000的一 种聚合物，在其骨架或侧链上具有磺酸盐，在其侧链上具有有机光致 酸化基，以便暴光产生酸。

本发明的肽核酸单体具有N-(2-氨乙基)甘氨酸骨架，其腺嘌呤、 胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶碱基用酰胺键连接。利用骨架上的氨基和 另一个肽核酸单体的羰基间的酰胺键合成肽核酸。目前用酸敏叔丁氧 羰基保护基或碱敏氟甲基氧羰基保护基保护的肽核酸单体是商用的， 用酸稳定的二苯基甲氧羰基或苯甲酰基氧羰基保护基来保护腺嘌呤、 胞嘧啶及鸟嘌呤的环外氨基。本发明人使用单体的骨架氨基是用酸敏 叔丁氧羰基保护基保护的，并且合成碱基的环外氨基是用稳定的p-甲 氧苯甲酰基或异丁醇基保护的。

肽核酸合成方法采用了与现有技术中已知的寡核苷配合成法相同 的方式(参见：Acc.Chem.Res.,24:278,1991)。Nielson等采用固相合 成寡肽核酸方法如下：首先，用特定碱基(A、C、G或T)的肽核酸羰基 与固体支持物上的氨基反应，骨架中这类碱基的氨基是用酸敏或碱敏 功能基以酰胺键的形式彼此连接保护的。其次，用酸或碱处理反应所 产生的物质以消除氨基保护基，使氨基暴露，接着与特定碱基(A、C、 G或T)的肽核酸羰基反应，骨架中这类碱基的氨基是用酸敏或碱敏功 能基以酰胺键的形式彼此连接保护的，并且重复所述的步骤获得想要 碱基序列和数目的的寡肽，最后，用强酸处理通过化学反应从固体支 持物上分离出环外氨基保护基。可以看出这种方法的理想之处在于它 能尽可能地确保过量的肽核酸(5当量)完全反应，并且，通过过滤残留 单体和反应物及用有机溶剂冲洗很容易纯化抗有机溶剂的固体支持物 上的肽核酸。根据固相合成，本发明人用各种核苷酸序列制备的生物 芯片最终制成采用上述聚合PAG处理固定在固体基质上的肽核酸探针 点阵。

在制备具有各种核苷酸序列的肽核酸探针方法中使用的聚合PAG 和肽核酸单体是分别采用预备实施例1和2以及预备实施例3制备的。 预备实施例1：氯化盐型聚合PAG

把0.026摩尔苯甲醚二酚硫酸盐溶解在26ml N,N′-二甲基乙酰胺 中，加入0.077摩尔的三乙基酰胺，然后，冷却至0℃。把具有0.026摩 尔癸基氯化物的26ml庚烷加到所述溶液中，并在室温下反应过夜。分 离出顶层庚烷并从该混合物中小心除去，以滴状把N,N′-二甲基乙酰胺 层加进400ml二乙醚中得到沉淀物。过滤和干燥该沉淀物得到氯化盐 型聚合PAG。把得到的该物质再溶解在20ml甲醇中，在水中再沉淀， 过滤和干燥得到纯化合物。 预备实施例2：替代盐 预备实施例2-1：聚合PAG的p-甲苯磺酸盐

把从预备实施例1获得的氯化盐型聚合PAG 0.01摩尔溶解在10ml 甲醇中，加入0.03摩尔的p-甲苯磺酸钠盐。温育3小时后，除去7ml甲 醇使溶液浓缩，并加水沉淀。把沉淀物过滤和干燥获得聚合PAG的p- 甲苯磺酸盐。 预备实施例2-2：聚合PAG的萘酚磺酸盐

把从预备实施例1获得的氯化盐型聚合PAG 0.01摩尔溶解在10ml 甲醇中，然后加入0.03摩尔的1-萘酚-5-磺酸钠盐。温育3小时后，除去 7ml甲醇使溶液浓缩，并加水沉淀。把沉淀物过滤和干燥获得聚合PAG 的1-萘酚-5-磺酸盐。 预备实施例2-3：聚合PAG的9,10-二甲氧基-2-蒽磺酸盐

把从预备实施例1获得的氯化盐型聚合PAG 0.01摩尔溶解在10ml 甲醇中，然后加入0.012摩尔的9,10-二甲氧基-2-蒽磺酸盐。温育3小时 后，除去一些甲醇使溶液浓缩，并加水沉淀。把沉淀物过滤和干燥获 得聚合PAG的9,10-二甲氧基-2-蒽磺酸盐。 预备实施例3：肽核酸单体 预备实施例3-1：肽核酸单体骨架

在2升园型烧瓶中搅拌着混合107ml(1.60摩尔)乙二胺和60ml 1,4- 二噁烷。然后，加入600ml二叔丁碳酸盐溶液(在1,4-二噁烷中含有 43.65g(0.20摩尔))，连续搅拌着温育过夜。然后，在减压下蒸发溶剂， 并给剩余溶液加入1升水。过滤除去加水所产生的白色沉淀，并用二 氯甲烷提取。合并所获得有机相层，并用硫酸镁干燥，减压下浓缩获 得27.21g(1.36摩尔)的叔丁基N-(2-氨乙基)甘氨酸，为白色粉末。把 5.00g(0.25摩尔)叔丁基N-(2-氨乙基)甘氨酸溶解在2升反应瓶中的 500ml二氯甲烷中，然后立即加入41.5ml(0.30摩尔)的三乙胺，并滴状 加入62.54g(0.27摩尔)的苄基-2-溴代乙酸盐，连续搅拌着温育过夜。然 后，用二氯甲烷提取该反应产物，用水和一系列盐水冲洗。用硫酸镁 干燥产生的有机相层，并在减压下浓缩获得粗制化合物。以5％的甲醇 /二氯甲烷为迁移相采用硅胶柱色谱分离该粗制化合物，得到 47.80g(0.16摩尔)的苄基-N-[2-(叔丁氧基)氨乙基]甘氨酸白色粉末。

1H NMR(CDCl3)δ  7.39(s,5H),5.18(s,2H)

                 5.01(br s,1H),3.5(s,2H)

                 3.25(t,2H),2.78(t,2H),1.45(s,9H) 预备实施例3-2：腺嘌呤单体

把27.03g(0.20摩尔)的腺嘌呤溶解在500ml嘧啶中后，在超过55分 钟的时间内缓慢加入34.12g(0.20摩尔)的p-苯甲醚氯化物，搅拌着在100 ℃反应4小时。然后把反应温度降至室温，再连续搅拌反应过夜，减 压蒸馏除去嘧啶。分别在异丙醇和甲醇中把产生的粗制化合物再结 晶，得到33.7g(0.13摩尔)的N6-(4-甲氧苯甲酰基)腺嘌呤白色粉末。把 33.66g(125毫摩尔)的N6-(4-甲氧苯甲酰基)腺嘌呤和400ml DMF放进1 升反应烧瓶中，缓慢加入6.0g(150毫摩尔)的60％NaH，在超过1小时15 分的时间内滴状加入22.15ml(150毫摩尔)的叔丁基溴乙酸盐，然后， 反应过夜。减压除去反应溶剂DMF，加水后得到沉淀物。把该沉淀物 分离，在甲醇中再结晶得到33.46g(87.30毫摩尔)的N6-(4-甲氧苯甲酰 基)-9-(叔丁氧羰甲基)腺嘌呤白色固体。在2升反应烧瓶中放入 33.46g(87.30毫摩尔)的N6-(4-甲氧苯甲酰基)-9-(叔丁氧羰甲基)腺嘌呤 和800ml二氯甲烷，室温下混合，并加入180ml TFA。把反应物混合搅 拌着在相同温度下过夜。减压除去二氯甲烷和TFA后，把产生的粗制 化合物溶解在450ml 1N NaOH中用二氯甲烷冲洗该溶液，并用6N HCl酸化获得23.54g(71.9毫摩尔)的N6-(4-甲氧苯甲酰基)-9-(羰甲基)腺嘌呤 白色固体。在500ml反应烧瓶中依次加入21.99g(67.20毫摩尔)的N6-(4- 甲氧苯甲酰基)-9-(羰甲基)腺嘌呤、20.72g(62.7毫摩尔)的苄基-N-[2-(叔 丁氧基)氨乙基]甘氨酸和200ml二氯甲烷，再立即加入14.17g(73.92毫 摩尔)的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙羰基二酰胺。连续搅拌着在室温下使 该反应混合物温育过夜，用二氯甲烷和水提取，用盐水冲洗。用镁盐 把有机相层干燥，减压浓缩获得粗制化合物，接着，以5％甲醇/二氯 甲烷为迁移相通过闪蒸塔色谱纯化该粗制化合物，得到28.24g(45.70摩 尔)苄基-N-[2-(叔丁氧羰基)氨乙基]-N-[(N6-(4-甲氧苯甲酰基)-腺嘌呤-9- 基)乙酰]甘氨酸白色粉末。给28.24g(45.70摩尔)的所述化合物加入 400ml甲醇，再在活性碳(Pd/C)上搅拌着加入1.0g钯。在氢气球创造的 氢气环境中振荡该反应瓶3小时。通过钙铁石过滤除去催化剂，并减 压蒸发溶剂。把产物溶解在200ml 1N NaOH中，用二氯甲烷冲洗，用6N HCl酸化，并分别用二氯甲烷和已烷再结晶得到17.07g(32.40毫摩尔)N- [2-(叔丁氧羰基)氨乙基]-N-[(N2-(4-甲氧苯甲酰基)-腺嘌呤-9-基)乙酰]甘 氨酸(白色粉末)的纯产品。

1H NMR(DMSO-D6)δ  11.0(s,1H),8.67(s,1H),8.30(S,1H)

                   8.05(d,2H),7.08(d,2H),5.16(2xs,2H)

                   3.98(2xs,2H),3.84(s,3H),3.04(m,1H)

                   1.38(s,9H) 预备实施例3-3：鸟嘌呤单体

把3.02g(20毫摩尔)的鸟嘌呤溶解在60ml DMF中后，加入6.2ml(44 毫摩尔)的三乙胺和4.6ml(44毫摩尔)的异丁基氯化物，连续搅拌着在120 ℃进行反应过夜。然后把反应温度降至室温，加20ml甲醇使反应终止， 减压浓缩该反应溶液，加入热异丙醇使其沉淀。过滤并分离沉淀物， 得到1.84g(8.32毫摩尔)的N2-(异丁醇基)鸟嘌呤白色粉末。给1.83g(8.27 毫摩尔)的N2-(异丁醇基)鸟嘌呤加上50ml DMF和0.40g(10毫摩尔)的 60％NaH。在室温下搅拌1小时产生悬浮液，加入1.35ml(9.14毫摩尔) 的叔丁基溴代乙酸盐，在相同温度下连续搅拌混合至少2小时。然后， 把产生的该溶液用CO2/甲醇处理，减压浓缩得到粗制化合物。用乙基 丙酸盐提取该粗制化合物，把产生的有机相层减压浓缩，得到N2-(异 丁醇基)-9-(叔丁氧羰甲基)鸟嘌呤和N2-(异丁醇基)-7-(叔丁氧羰甲基)鸟 嘌呤的混合物白色粉。给该混合物搅拌加入50ml二氯甲烷和19ml TFA。连续搅拌着把该最终反应混合物温育2天，减压浓缩，得到N2-(异 丁醇基)-9-(羧甲基)鸟嘌呤和N2-(异丁醇基)-7-(羧甲基)鸟嘌呤的混合物 1.5g(5.64毫摩尔)。用乙酸乙酯处理该混合物，得到白色沉淀物，减压 过滤并干燥得到0.72g(2.57毫摩尔)的N2-(异丁醇基)-9-(羧甲基)鸟嘌 呤，把690mg(2.47毫摩尔)的该化合物和922mg(2.99毫摩尔)的苄N-[2- (叔丁氧基)氨乙基]甘氨酸及577mg(3.01毫摩尔)的EDC溶解在20ml DMF中，在室温下连续搅拌该反应混合物3小时。减压除去DMF后， 用乙酸乙酯提取所产生的化合物，并减压浓缩有机相层。把该粗制化 合物溶解在10ml二氯甲烷中，用已烷再结晶，得到白色沉淀物。分 离该沉淀物并以10％甲醇/二氯甲烷为迁移相通过闪蒸塔色谱进一步纯 化该沉淀物，得到1.24g(2.18毫摩尔)苄基-N-[2-(叔丁氧羰基)氨乙基]- N-[(N2-(异丁醇基)-鸟嘌呤-9-基)乙酰]甘氨酸。给1.22g(2.14毫摩尔)的 该化合物加入25ml甲醇，并搅拌着混合0.25g 10％的Pd/C。在氢气球创 造的氢气环境中振荡该反应瓶2小时45分。通过钙铁石过滤除去催化 剂，并减压浓缩该过滤物。把该粗制化合物溶解在乙酸乙酯中并搅拌 过夜获得白色沉淀物。把该沉淀物过滤、干燥得到0.92g(1.91毫摩 尔)N-[2-(叔丁氧羰基)氨乙基]-N-[(N2-(异丁醇基)-鸟嘌呤-9-基)乙酰]甘 氨酸白色粉末。

1H NMR(DMSO-D6)δ7.82(2xs,1H),7.03-6.81(m,2H),

                   4.94(2xs,2H),3.99(2xs,2H),

                   3.04(d,1H),3.19(2xt,2H),2.89(t,2H),

                   2.78(m,1H),1.19(d,6H) 预备实施例3-4：胞嘧啶单体

把22.02g(0.20摩尔)的胞嘧啶溶解在嘧啶中，在超过45分钟的时间 内缓慢加入37.53g(0.22摩尔)的p-苯甲醚氯化物。然后，缓慢把反应温 度升到120℃，并连续搅拌着在该温度下反应过夜。减压浓缩产生的 物质获得粗制产物。把粗制产物溶解在甲醇中，加热、冷却，获得沉 淀物过滤、干燥，得到25.78g(0.11摩尔)的N4-(4-甲氧苯甲酰基)胞嘧啶。 在1升反应瓶中给25.75g(0.11摩尔)的N4-(4-甲氧苯甲酰基)胞嘧啶加上 500ml DMF，然后依次加上5.04g(0.13摩尔)的60％NaH和18.61ml(0.13 摩尔)的叔丁基溴代乙酸盐。在室温下搅拌反应混合物过夜后，减压除 去DMF。把得到的粗制物在甲醇中再结晶获得22.52g(62.60毫摩尔)的 1-(叔丁氧羰甲基)-N4-(4-甲氧苯甲酰基)胞嘧啶白色粉末。把22.52g (62.60毫摩尔)的该化合物与600ml二氯甲烷放进2升的反应瓶中在室温 下混合，然后加入130ml TFA。在室温下搅拌着把该反应混合物过夜。 减压除去二氯甲烷和TFA后，把产生粗制化合物溶解在450ml 1N NaOH中，用6N HCl酸化，得到18.82g(62.10毫摩尔)的1-(羧甲基)-N4-(4-甲 氧苯甲酰基)胞嘧啶白色粉末。在500ml反应瓶中，把18.82g(62.10毫 摩尔)的该化合物与12.05g(68.3毫摩尔)的苄基-N-[2-(叔丁氧羰基)氨 乙基]甘氨酸混合，然后，依次混合上120ml DMF和13.09g(68.30毫摩 尔)的EDC。在室温下搅拌着使该反应混合物过夜，减压除去DMF溶 剂。用二氯甲烷提取该粗制产物，减压浓缩，分别用二氯甲烷和已烷 再结晶。获得26.90g(45.30毫摩尔)苄基-N-[2-(叔丁氧羰基)氨乙基]-N- [(N4-(4-甲氧苯甲酰基)-胞嘧啶-1-基)乙酰]甘氨酸白色沉淀物。把 26.90g(45.30毫摩尔)该化合物溶解在850ml甲醇中，并搅拌着加入1.0g Pd/C。在氢气球创造的氢气环境中振荡该反应溶液4小时。通过钙铁 石过滤除去催化剂，并减压浓缩该过滤物。把该产物溶解在200ml 1N NaOH中，用二氯甲烷冲洗，用6N HCl酸化，得到18.83g(37.40毫摩尔) 的N-[2-(叔丁氧羰基)氨乙基]-N-[(N4-(4-甲氧苯甲酰基)-胞嘧啶-1-基)乙 酰]甘氨酸白色粉末。

1H NMR(DMSO-D6)δ8.03(d,2H),7.95(2xs,1H),

                   7.30(2xs,1H),7.04(d,2H),

                   4.84-4.66(2xs,2H),4.20-3.98(2xs,2H),

                   3.82(s,3H),3.22-3.03(t,4H),

                   1.37(s,9H) 预备实施例3-5：胸腺嘧啶单体

在2升园型烧瓶中混合上50.45g(0.40摩尔)的胸腺嘧啶、55.28g(0.40 摩尔)的碳酸钾和1.20ml DMF后，立即给产生的白色悬乳液中加入 44.40ml(0.40摩尔)的乙基溴代乙酸盐，并在室温下搅拌48小时。过滤 除去未溶解的固体，减压除去过滤物中的DMF。把反应温度降至0℃ 形成沉淀物后，搅拌着在30分钟内把该沉淀物与400ml水和11ml 6N HCl混合。过滤获得白色沉淀物1-(乙氧羰甲基)胸腺嘧啶。在1升反应 瓶中，把该化合物与400ml水和200ml 2N NaOH混合，并加热回流10分 钟。加热中当白色悬乳液变清亮时，把反应液冷却至0℃，加上90ml 6N HCl得到白色沉淀。过滤该沉淀物，用水冲洗，在真空烤箱中干燥得 到47.56g(0.26摩尔)的1-(羧甲基)胸腺嘧啶白色粉末。把10.94g(54.40毫 摩尔)的该化合物与15.27g(49.50毫摩尔)的苄基-N-[2-(叔丁氧羰基)氨乙 基]甘氨酸溶解在250ml DMF中。然后，加上11.39g(59.40毫摩尔)的EDC 在室温下搅拌过夜。减压除去反应液中的DMF后，给其余溶液加入 500ml水，并用二氯甲烷提取。把产生的有机相用硫酸镁干燥，减压 浓缩获得粗制化合物。以10％甲醇/二氯甲烷为迁移相通过闪蒸塔色谱 纯化该粗制化合物，得到21.76g(45.90毫摩尔)苄基-N-[2-(叔丁氧羰基) 氨乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)乙酰]甘氨酸白色粉末。把21.76g(45.90毫 摩尔)的该化合物溶解在400ml甲醇中，并混合上5.0g 10％的Pd/C。然 后，在氢气球创造的氢气环境中再振荡该反应混合物4小时30分。通 过钙铁石过滤除去催化剂，给过滤物加上50ml 1N NaOH和100ml水， 随后用二氯甲烷冲洗，用6N HCl酸化。用乙酸乙酯提取该混合物。收 集有机相，用硫酸镁干燥，减压浓缩，然后再在真空烤箱中干燥得到 17.05g(43.60毫摩尔)的N-[2-(叔丁氧羰基)氨乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基) 乙酰]甘氨酸白色粉末。

1H NMR(DMSO-D6)δ11.30(d,1H),7.30(2xs,1H),

                   4.64-4.46(2xs,2H),4.19-4.01(2xs,2H),

                   3.34(s,2H),3.38-3.30(t,2H),

                   3.17-2.89(t,2H),1.91(s,3H),

                   1.37(s,9H)

下面将详细说明使用聚合光致酸化剂制备具有各种核苷酸序列的 肽核酸点阵的方法 步骤1：在固体基质上附加连接子

在醇中把固体基质的表面用氨烷基氧硅烷衍生化，把带有酸敏保 护基的连接子附加在该固体基质上。

首先，在固体基质的表面固定胺基，例如，把具有抗有机溶剂的 材料制的板浸入0.05-0.15％(v/v)、最优选在0.1(v/v)的氨烷基氧硅烷溶 液中，这种板材如硅氧烷、表面衍生化的玻璃、聚丙烯或活化的丙酰 胺，建议使用表面衍生化的玻璃，尤其是把玻璃板微区固体基质浸入， 严格来说是用醇中的氨基丙三醇氧硅烷(最好是在乙醇中)，在室温下 混合3-7分钟，最好是5分钟，用醇冲洗，最好是用乙醇冲洗，在100-140 ℃下的真空烤箱中干燥10-30分钟，110-130℃更好，最好是120℃，建 议用15-25分钟，最好为20分钟。然后，放置在氩气中10-14小时，最 好为12小时，浸入DMF，并彻底用二氯甲醇冲洗。

其次，为了把带有酸敏保护基的连接子附加在该固体基质上固定的 胺基上，制备在N-甲基吡咯烷酮中含有0.05-0.5mM(最好为0.2mM)的二异 丙基乙胺的0.02-0.2mM氨烷基羧酸溶液，建议用0.1mM氨烷基羧酸，最 好是6-N-叔丁氧羰基氨三甲胺丁酸，并与在NMP中含有0.05-0.5mM(最好 为0.12mM)HATU(o-(7-氮苯三氮)-1,1,3,3-四甲基脲已氟磷酸盐)(o-(7- azabenzotriazol-1-ly)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate)的溶液 混合。把上述两种溶液混合后，活化1-5分钟，最好为2分钟，浸入制 备的该固体基质并在40-90℃下振荡着温育30分钟至4小时，建议温育 1-3小时，最好为2小时，温度最好为60℃。振荡着在1∶2-1∶4(v/v)(最好 为1∶3(v/v))的乙酸酐/嘧啶溶液中温育0.5-2小时，最好为1小时，从而 用乙酰基使未反应的胺基戴帽。 步骤2：用聚合PAG涂布

用聚合PAG涂布要制备的固体基质：用有机溶剂中含有5-50％(w/v) 聚合PAG给附加有连接子或单体的该固体基质白旋涂布，有机溶剂最 好为NMP，转速为1,000-5,000rpm，最好为3,000rpm。 步骤3：除去酸敏保护基

把涂布后的该固体基质暴光产生酸，消除酸敏保护基：在50-100 ℃下把该涂布的固体基质软焙1分钟，最好是在80℃软焙30秒至2分 钟，在短波白光中暴光6秒至2分钟，最好为1分钟，使用掩光体在50-100 ℃下再烘焙3分钟，最好在80℃下进行30秒至5分钟，产生酸，在选择 的暴光位置处最终除去保护基。 步骤4：除去残留的聚合PAG

用碱溶液或有机溶剂冲洗制备的该固体基质，除去残留的聚合 PAG：在完成步骤3后，用稀释的三烷基铵氢氧化物、NaOH溶液、KOH溶液或有机溶剂冲洗并除去残留的聚合PAG。 步骤5：与肽核酸单体反应

把单体肽核酸与酸敏保护基附加在要制备的固体基质上：把固体 基质上选择暴光的胺基与预备实施例3制备的肽核酸单体反应。制备 具有10-20μM肽核酸单体的一种NMP溶液，最好是具有15μM肽核酸单 体的NMP溶液，其中二异丙基乙胺与被溶解的核酸单体比率为1∶1- 1∶5(w/w)，以及制备含有HATU的另一种NMP溶液，其中HATU与被溶 解的核酸单体比率为1∶1-1∶2(w/w)。把这两种溶液混合，活化1-5分钟， 并且振荡着在50-100℃下与要制备的固体基质反应，最好是在60℃下 1-3小时，2小时更佳。振荡着在1∶2-1∶4(v/v)(最好为1∶3(v/v))的乙酸酐/ 嘧啶溶液中温育0.5-2小时，最好为1小时，从而用乙酰基使未反应的 胺基戴帽。

重复步骤2-5最终制得固定在固体基质上的肽核酸探针点阵。

在室温下，在DMF中把0.5-2mM(最好为1mM)的荧光异硫氰酸盐 温育30分至2小时，最好为1小时，使在固体基质上自由反应基，即肽 核酸的胺基，用荧光标记物标记，随后依次用DMF和乙醇冲洗。在暗 处保存至用共焦荧光激光仪分析。

使用聚合PAG制备具有各种核苷酸序列肽核酸点阵的方法优于现 有技术之处如下：

第一，本发明方法使得溶于适当溶剂中的聚合PAG能直接进行 自旋涂布，而现有技术中PPA处理使用的是聚合PAG与聚合基质混合。

第二，PPA处理中产生的酸分别作用于聚合基质，并且用于脱保 护基的实际酸量较少，而本发明方法中使用的PAG本身被脱保护的基 团接触，并且产生的大量酸参与脱保护反应。

第三，能把PAG直接附加到聚合骨架上，从而在处理过程中使 PAG对产生的热或化学物质稳定，保证能获得极薄相当高质的图形， 在涂布过程中不用再作形，从而使图形形成容易，并且，通过暴光产 生的酸容易分散到底部。

第四，由于在成形后可以用稀释的碱溶液冲洗聚合PAG，所以 本发明的方法节约成本。

用下面的实施例进一步说明本发明，但这并不作为对本发明的限 定。 实施例1：肽核酸探针的制备 实施例1-1：在玻璃板上附加连接子

把微观玻璃板浸入清洗液中(含有1L 95％乙醇、12ml水、120g的 NaOH)，用水漂洗几次，空气干燥。把该玻璃板用95％的乙醇漂洗后， 在室温下浸入0.1％(v/v)氨丙基三醇硅烷中振荡5分钟，再用95％的乙醇 漂洗三次，在恒定120℃真空烤箱中干燥20分钟。然后，把该玻璃板 放置在氩气中12小时，浸入DMF中，用二氯甲烷漂洗，使胺基固定在 该微观玻璃板的固体基质上。

接着，把含有0.1mM的6-N-叔丁氧羰基氨三甲胺丁酸和0.2mM二 异丙基乙胺的0.5ml的NMP溶液与含有0.12mM HATU的NMP溶液混合 2分钟。通过把上述制备的固体基质浸入所述的混合溶液中在60℃下 振荡2小时，使连接子附加在表面衍生化的玻璃板上。然后，振荡着 在乙酸酐/嘧啶(1∶3(v/v))溶液中温育1小时，从而用乙酰基使未反应的 胺基戴帽。 实施例1-2：肽核酸的附加

把从预备实施例2得到的聚合PAG溶解在NMP中，使最终浓度为 30％(w/v)，并3,000rpm下自旋涂布在带有连接子的该玻璃板上，该连 接子中含有实施例1-1制备的酸敏保护基。在80℃下把被涂布的玻璃板 软焙1分钟，用掩光体在短波白光中暴光，随后在80℃下再烘焙3分钟， 利用产生的酸有选择地除去暴光位置处的保护基。

然后，用1％的三烷基铵氢氧化物冲洗掉该玻璃板上分离的保护 基和残余的聚合PAG。把溶解有0.3g三烷基铵氢氧化物的NMP溶液与 溶解有0.4g HATU的NMP溶液混合，其中溶解有0.3g三烷基铵氢氧化 物的NMP溶液含有预备实施例3制备的肽核酸单体0.3g，活化2分钟。 把带有被选择除去保护基的玻璃板浸入该活化的溶液振荡2小时，肽 核酸单体连接到到该玻璃板上脱保护的胺基上。振荡着在乙酸酐/嘧啶 (1∶3(v/v))溶液中温育1小时，从而用乙酰基使未反应的胺基戴帽。

接着，重复聚合PAG涂布处理，使用掩光体进行暴光，除去保护 基，使具有受保护胺基的肽核酸单体反应，戴帽，把玻璃板上的肽核 酸加长获得想要的长度。

在室温下，在DMF中与1mM的荧光异硫氰酸盐温育1小时，使在 玻璃板上的自由反应基，即肽核酸的胺基，产生荧光标记，随后依次 用DMF和乙醇冲洗，干燥并保存在暗处。用荧光分光光度计分析该玻 璃板，获得具有10μ分辩率的微观图形。

如上详细说明和论证，本发明提供了在固体基质上制备具有各种 固定的核苷酸序列的肽核酸点阵的方法，该方法能用于DNA芯片的制 作。根据本发明，能采用简便而有效地方式使用聚合光致酸化剂来制 备中性肽核酸探针，有望替代传统负电寡核苷酸探针，并能克服现有 技术DNA芯片制作中使用PR体系和PPA体系所面临的问题。

正如在此所述，对于本领域普通技术人员来说，很明显在不脱离 本发明精神或范围可以对本发明进行一定的变化和修饰。

本发明的背景