固态合成可应用于制备多种聚合物，例如含有核碱基(nucleobase) 的聚合物(例如寡核苷酸及其类似物)、含有氨基酸的聚合物(例如 蛋白质，肽，及它们的类似物)。固态合成还可应用于通过组合法的 化合物的制备。
寡核苷酸已经用于多种生物学和生物化学应用中。它们已经用作 用于聚合酶链式反应(PCR)的引物和探针；用作用于靶标确认、药物 研究与开发中的反义剂，用作核酶，用作适配体，以及用作免疫系统 的普通刺激物。由于寡核苷酸普及程度的增加，对较大规模批量和较 大数量的小规模批量的制备的需要已逐步增加。另外，已经更多地强 调对寡核苷酸合成的成本的降低，以及强调改进纯度和增加寡核苷酸 产物的收率。
很多创新已经被引入到寡核苷酸合成的领域中。在这些创新中， 已经开发了优秀的正交保护基团、活化剂、试剂和合成条件。寡核苷 酸自身已经经历了多种改性和改进。其中，是化学改进了寡核苷酸对 于特定目标的亲和性，改进了寡核苷酸在体内的稳定性，增强了寡核 苷酸的药物动力学(PK)和毒物学(Tox)性质等。这些新的化学通常 涉及对寡核苷酸的一个或多个组成部分进行化学改性。
术语“寡核苷酸”因此包括这样的一类化合物，其包括天然存在 的，以及改性的寡核苷酸。天然存在和改性的寡核苷酸都已经证明可 用于多种环境(setting)中，并且都可以通过类似的方法制备，其中合 适的改性被用于解释所采用的特定的改性。天然存在的寡核苷酸，即 短链DNA或RNA可预想为分别被命名为寡-RNA和寡-DNA的如下通 式中的一员：
             天然存在的寡核苷酸

寡-RNA                                                         寡-DNA，
其中m为1至约100的整数，并且Bx为一种天然存在的核碱基。
在生理pH，寡核苷酸以阴离子存在，作为磷酸酯在中性pH下容 易解离，并且寡核苷酸将通常作为盐以固相存在，或者是无定形的或 者是结晶的。因此，除非另外限定，术语“寡核苷酸”包括上述阴离 子、盐和游离酸形式的每一种。
本质上，天然存在的寡核苷酸可被认为是m个由如下核苷酸表示 的单体子单元的低聚物：
          天然存在的核苷酸单体

核糖核苷酸                                                        脱氧核糖核苷酸，
其中每个Bx为核碱基，其中最后的残基为核苷(即，没有3’-磷 酸酯基团的核苷酸)。
如上所述，为了改进寡核苷酸的亲和性、稳定性、PK、Tox和其 它性质，已经对它们进行了多种化学改性。通常，术语“寡核苷酸”， 如现在在本领域中所用的，尤其包括下式的化合物：
             寡核苷酸(通式)

其中m为1至约100的整数，每个G1为O或S，每个G2为OH 或SH，每个G3为O、S、CH2或NH，每个G5为二价部分，例如O、 S、CH2、CFH、CF2、-CH＝CH-等，每个R2’为H、OH、O-rg，其中rg 为可除去的保护基团，2’-取代基，或与R4’一起形成桥接，每个R3’为 H，取代基，或与R4’一起形成桥接，每个R4’为H，取代基，与R2’一 起形成桥接，与R3’一起形成桥接，或与R5’一起形成桥接，每个q为0 或1，每个R5’为H，取代基，或与R4’一起形成桥接，每个G6为O、S、 CH2或NH，并且每个G7为H、PO3H2或结合基团，和每个Bx为如本 文中所描述的核碱基(即，天然存在的或改性的)。
寡核苷酸的标准的合成方法包括首先由Caruthers等人描述的固相 法(参见例如，美国专利5,750,666，其通过引用并入本文中，尤其是 3-58栏，其中公开了制备寡核苷酸的原料和一般方法，并且尤其公开 了硫代磷酸寡核苷酸，这一部分通过引用明确并入本文中)。这些方 法后来被Kster等人改进(参见例如，美国专利RE 34,069，其通过引 用并入本文中，尤其是其中公开的栏，这一部分通过引用明确并入本 文中)。这些方法由多位发明人进一步改进，如下文更详细讨论的。 合成RNA的方法尤其公开于美国专利6,111,086、6,008,400和5,889,136 中，每篇专利以其全部内容并入本文中。尤其有关的是US 6,008,400 的栏7-20，其通过引用明确并入本文中。
通过Kster等人的方法制备寡核苷酸的一般过程可被描述如下：
首先，通过将适当的核苷通过连接部分共价连接于固体载体介质 (SS)而制备合成载体。这样的合成载体如下所示：
合成载体(通式)

其中SS为固体载体介质，LL为将核苷通过G3连接到所述载体上 的连接基团。该连接基团通常为双官能基团，其在合成过程中将终端 的3’-核苷(并因此是刚产生的寡核苷酸)共价结合到固体载体介质， 但其在正交于将5’-保护基团，和如果合适任何2’-保护基团除去的条件 的条件下被切断。T’为可除去的保护基团，并且其余的变量已经被定 义，并在本文中被更详细地描述。适当的合成载体可从Amersham Biosciences以商标名为Primer Support 200TM获得。具有连接到其上的 合成载体的固体载体介质可随后在适当的溶剂如乙腈中溶胀，并引入 到合适的固相合成仪器的柱中，例如一种得自Amersham Biosciences 的合成器，如KTAoligopilotTM或OligoProcessTM牌的DNA/RNA合成 器。
在前述方法中，从所述低聚物的3’至5’端进行合成。在每个循环 中，进行下述步骤：(1)除去T’，(2)结合，(3)氧化，(4)封 端。步骤(1)-(4)中的每一个都可以，并通常接着一个或多个洗 涤步骤，其中将干净的溶剂引入到柱中以从该柱上洗涤可溶性物质， 推动试剂和/或活化剂通过该柱，或二者。步骤(1)-(4)描述如下：
      低聚物合成循环——步骤1

通常，将T’选择在正交于在合成结束时用于将寡核苷酸从固体载 体介质上切除的那些条件，以及用于除去在合成中使用的其它保护基 团的那些条件的条件下除去。本领域公认的用于寡核苷酸合成的保护 基团为DMT(4，4’-二甲氧基三苯甲基)。DMT基团因为其在弱酸性条 件下可除去而尤其有用。因此，可接受的除去试剂为在合适的如乙腈 的溶剂中的3％DCA。所述洗涤溶剂，如果用，可以方便地采用乙腈。
所述载体典型地为可控孔度玻璃或聚合珠载体。一些聚合珠载体 公开于如下专利中：US 6,016,895、US 6,043,353、US 5,391,667和US 6,300,486，每篇专利通过引用明确引入本文中。
在除去保护基团T’后，合成循环的下一步是结合下一个核苷合成 子。这通过将脱保护的载体结合核苷与核苷亚磷酰胺，在活化剂的存 在下反应而完成，如下所示：
           低聚物合成循环——步骤2

所述亚磷酰胺(amidite)具有如下结构
              亚磷酰胺(通式)

其中，pg为磷保护基团，例如氰乙基，并且NRN1RN2为胺离去基 团，例如二异丙基氨基。参见前述Kster等人，对于亚磷酰胺的制备 的信息。典型使用的活化剂包括例如四唑，二氰基咪唑或吡啶盐。其 它合适的亚磷酰胺和制备亚磷酰胺的方法阐述于如下专利中：US 6,133,438、US 5,646,265、US 6,124,450、US 5,847,106、US 6,001,982、 US 5,705,621、US 5,955,600、US 6,160,152、US 6,335,439、US 6,274,725、 US 6,329,519，每篇专利通过引用明确并入本文中，尤其因为它们涉及 亚磷酰胺的制备。合适的活化剂阐述于Caruther等人的专利和Kster 等人的专利中。尤其合适的活化剂阐述于下述专利中：US 6,031,092和 US 6,476,216，每篇专利通过引用明确并入本文中。
合成循环的下一步骤是氧化，其指用合适的氧化剂将P(III)物质氧 化为P(V)氧化态：
            低聚物合成循环——步骤3

其中G1为O或S。
所述氧化剂为适合于引入G1的氧化试剂。在其中G1为氧的情况 下，合适的氧化剂阐述于上述Caruthers等人的专利中。在其中G2为硫 的情况下，所述氧化剂还可以被称为硫杂化剂或硫转移剂。合适的硫 杂化剂包括所谓的Beaucage试剂，3H-1，2-苯并硫醇(benzothiol)、苯 基乙酰基二硫化物(也称为PADS；参见例如专利：US 6,114,519和 6,242,591，每篇专利通过引用并入本文中)和二硫化四烷基秋兰姆 (thiouram disulfides)(例如，N，N，N’，N’-四甲基二硫化四烷基秋兰姆， 由美国专利5,166,387公开)。所述的洗涤可以是如乙腈的适当溶剂。
氧化步骤之后为封端步骤，其尽管没有在本文中说明，但它对于 合成是重要的，因为它使在步骤1中不经过结合的游离的5’-OH基团 封闭，以免在随后的合成循环中被结合。合适的封端试剂阐述于 Caruthers等人，Kster等人，和本文中描述的其它专利中。合适的封 端试剂包括乙酸酐和N-甲基咪唑的组合。
重复合成循环步骤(1)-(4)(假如需要)n-1次以制备载体结 合的寡核苷酸：
               载体结合的寡核苷酸

其中每个变量为如本文中所定义的那样。
通常，所述保护基团pg可以通过由上述Caruthers等人或Kster 等人描述的方法除去。如果pg为氰基乙基，Kster等人的方法，例如 与碱性溶液反应，通常适用于除去所述磷保护基团。在一些情况下， 希望避免形成加合物，例如N1-氰基乙基胸苷基团。在这些情况下，希 望在试剂中包括叔胺，例如三乙胺(TEA)，如在美国专利US 6,465,628 中所教导的那样，该专利通过引用明确引入本文中。通常，如果所述 核碱基被保护，它们就在碱性条件下脱保护。将所述脱保护的寡核苷 酸从载体上切下给出如下5’-保护的寡核苷酸：
        游离的5’-保护的寡核苷酸

其然后可通过反相液相色谱纯化，5’-端在乙酸中脱保护，脱盐， 冻干或其它干燥，并在惰性气氛下贮存直至需要。任选地，G3H基团 可用结合基团衍生化。所形成的寡核苷酸显现为具有下式：
                   寡核苷酸

尽管在固相载体介质上合成是已知的，但需要具有改进性质的固 体载体介质，所述性质尤其关于负载(以每克固体载体介质的结合到 该固体载体介质的第一核苷的mmol表示，或简单的以mmol/g表示)， 在多种合成循环过程中恒定的溶胀性质，以及在合成过程中制备的全 长低聚物的质量。另外，所述载体应当易于制备。本发明的目的就在 于此，以及其它的，重要的目的。

在一些实施方案中，本发明提供制备聚合珠的方法，其包括提供 有机相和将所述有机相与水相在可有效形成聚合珠的时间、温度和压 力的条件下接触。
在一些实施方案中，所述有机相包含单体、引发剂和一种或多种 有机溶剂，并且所述水相包含水和分散剂。在优选的实施方案中，所 述单体包括烯烃单体、交联单体和功能化单体。在另一些优选的实施 方案中，所述一种或多种有机溶剂包括一种或多种液态烃；和/或具有 5-12个碳原子的醇。在本发明的另一个优选的实施方案中，所述烯烃 单体包括一种或多种芳族-乙烯基化合物并优选包括苯乙烯和/或乙基 苯乙烯。在另一个优选的实施方案中，所述交联单体为具有两个非共 轭的优选结合于芳族部分的乙烯基的烯属交联单体，其中所述芳族部 分为5或6元芳环，并最优选为二乙烯基苯。在另一个优选的实施方 案中，所述功能化单体为具有被保护的官能团的烯属单体，其中所述 被保护的官能团当脱保护时，产生能与酸或酸酐反应形成酯或酰胺的 基团，或具有被保护的羟基的烯属单体，并优选为乙酰氧基苯乙烯。 在另一个优选的实施方案中，所述引发剂为稳定了的过氧化物或偶氮 化合物，最优选为过氧化苯甲酰。在另一个优选的实施方案中，所述 有机溶剂包括一种或多种液态烷烃、苯、甲苯、二甲苯和/或具有5-12 个碳原子的醇，其中优选所述有机溶剂包括一种或多种辛烷，并最优 选异辛烷，和/或2-乙基己醇。在另一个优选的实施方案中，所述分散 剂包括多元醇，优选聚乙烯醇。
在本发明的一些实施方案中，不同组分以如下量存在：初始存在 于单体中的烯烃单体的重量百分比为约60％至约96％；初始存在于单 体中的交联单体的重量百分比为约3％至9.9％；初始存在于单体中的功 能化单体的重量百分比为约1％至约20％；初始存在于有机相中的单体 的重量百分比为约33％至约67％；初始存在于有机相中的有机溶剂的 重量百分比为约33％至约67％；存在于有机溶剂中的液态烃的重量百 分比为约0％至约80％；初始存在于有机溶剂中的具有5-12个碳原子 的醇的重量百分比为约20％至约100％，和初始存在于水相中的分散剂 的重量百分比为约0.01％至约20％。
在另一些优选的实施方案中，不同组分以如下量存在：初始存在 于单体中的烯烃单体的重量百分比为约75％至约94％；初始存在于单 体中的交联单体的重量百分比为约4％至9.9％；初始存在于单体中的功 能化单体的重量百分比为约2％至约10％；初始存在于有机相中的单体 的重量百分比为约35％至约60％；初始存在于有机相中的有机溶剂的 重量百分比为约40％至约65％；存在于有机溶剂中的烃的重量百分比 为约5％至约70％；初始存在于有机溶剂中的具有5-12个碳原子的醇 的重量百分比为约30％至约95％。
在又一些优选的实施方案中，不同组分以如下量存在：初始存在 于单体中的烯烃单体的重量百分比为约82％至约91.5％；初始存在于单 体中的交联单体的重量百分比为约5.5％至9.9％；初始存在于单体中的 功能化单体的重量百分比为约3％至约8％；初始存在于有机相中的单 体的重量百分比为约40％至约50％；初始存在于有机相中的有机溶剂 的重量百分比为约50％至约60％；存在于有机溶剂中的液态烃的重量 百分比为约10％至约60％；初始存在于有机溶剂中的具有5-12个碳原 子的醇的重量百分比为约40％至约90％。
在本发明一些其它的实施方案中，所述有机相与所述水相的接触 在温度为约25℃至约95℃下，更优选在约70℃至约85℃下，和最优 选在约75℃至约80℃下进行。
本发明还提供合成预定序列的多核苷酸的方法，其包括使用由包 含交联单体的多种单体制备的聚苯乙烯载体，其中初始存在于所述多 种单体中的交联单体为约3-9.9wt％。在一些优选的实施方案中，初始 存在于所述多种单体中的交联单体为约5.5-9.9％，并最优选约7％。在 另一些优选的实施方案中，所述交联单体为二乙烯基苯。
本发明还提供由本文中所述的任何方法形成的聚合珠。在一些实 施方案中，所述珠具有每克珠约100μmol至每克珠约350μmol的负载 能力。在一些实施方案中，所述珠具有约5至约500μm，优选约10至 约300μm和最优选约30至约150μm的平均粒子大小。在一些实施方 案中，所述珠具有约5至约500nm，优选约10至约100nm和最优选约 20至约100nm的孔径大小。在一些实施方案中，所述珠具有约5至约 200m2/g，优选约10至约100m2/g和最优选约20至约70m2/g的比表面 积。
本发明还提供式I或式II的化合物：

其中：
G3为O、S、CH2或NH；
G5为O、S、CH2、CFH、CF2或-CH＝CH-；
G6为O、S、CH2或NH；
每个R2’为H、OH、O-rg，其中rg为可除去的保护基团，2’-取代 基，或与R4’一起形成桥接；
每个R3’为H，取代基，或与R4’一起形成桥接；
每个R4’为H，取代基，与R2’一起形成桥接，与R3’一起形成桥接， 或与R5’一起形成桥接；
q为0或1；
R5’为H，取代基，或与R4’一起形成桥接；
Bx为核碱基；
T’为H或可除去的保护基团；
LL为连接部分；和
SS为由本文中描述的方法制备的珠。

其中：
m为0至约100的整数；
每个G1为O或S；
每个G2为OH或SH；
每个G3为O、S、CH2或NH；
每个G5为O、S、CH2、CFH、CF2或-CH＝CH-；
每个R2’为H、OH、O-rg，其中rg为可除去的保护基团，2’-取代 基，或与R4’一起形成桥接；
每个R3’为H，取代基，或与R4’一起形成桥接；
每个R4’为H，取代基，与R2’一起形成桥接，与R3’一起形成桥接， 或与R5’一起形成桥接；
每个q为0或1；
每个R5’为H，取代基，或与R4’一起形成桥接；
每个G6独立地为O、S、CH2或NH；
每个Bx为核碱基；
pg为可除去的亚磷保护基团
T’为可除去的保护基团；
LL为连接部分；和
SS为由本文中描述的方法制备的珠。
在另一些实施方案中，本发明提供制备聚合珠的方法，其包括(a) 提供包含烯烃单体、交联单体、功能化单体和引发剂的有机相；和(b) 将该有机相与水相在可有效形成聚合珠的时间、温度和压力的条件下 接触。
在一些实施方案中，所述水相包含水和分散剂，该分散剂在一些 实施方案中包括多元醇，例如聚乙烯醇。
在一些实施方案中，所述水相包含水和分散剂，该分散剂在一些 实施方案中包括多元醇；并且所述有机相还包含有机溶剂，该有机溶 剂包括一种和多种液态烃和/或具有5-12个碳原子的醇。
在一些实施方案中，所述烯烃单体包含单独的非芳香性不饱和基 团。在另一些实施方案中，所述烯烃单体为芳基-乙烯基化合物，例如 苯乙烯。
在一些实施方案中，所述交联单体为烯属交联单体。在一些实施 方案中，所述交联单体为具有两个非共轭的乙烯基的交联单体。在一 些实施方案中，所述交联单体为具有两个非共轭的结合于芳香族部分 的乙烯基的交联单体；其中所述芳香族部分为5或6元芳环。在一些 实施方案中，所述交联单体为二乙烯基苯。
在一些实施方案中，所述功能化单体为具有被保护的官能团的烯 属功能化单体，其中所述被保护的官能团当脱保护时，产生适合于与 酸或酸酐反应，优选形成酯或酰胺的官能团。在一些实施方案中，所 述功能化单体为具有被保护的羟基的烯属单体。在一些实施方案中， 所述功能化单体为一种或多种丙酰氧基苯乙烯或乙酰氧基苯乙烯，其 中尤其最优选乙酰氧基苯乙烯。
在一些实施方案中，所述有机相还包含有机溶剂，该有机溶剂在 一些实施方案中，包括一种或多种液态烃和/或具有5-12个碳原子的醇。 在一些实施方案中，所述有机溶剂包括一种或多种液态烃，例如一种 或多种液态烷烃、苯、甲苯、二甲苯，例如辛烷，例如异辛烷和/或具 有5-12个碳原子的醇，例如2-乙基己醇。
在一些实施方案中，所述聚合引发剂为稳定了的过氧化物，例如 过氧化苯甲酰或偶氮化合物。
在一些实施方案中，所述烯烃单体为芳基-乙烯基化合物，并且所 述交联单体为具有两个非共轭的乙烯基的烯属交联单体。在另一些实 施方案中，所述烯烃单体为芳基-乙烯基化合物，并且所述交联单体为 具有两个非共轭的结合到芳香族部分的乙烯基的烯属交联单体；其中 所述芳香族部分为5或6元芳环。在其它一些实施方案中，所述烯烃 单体为芳基-乙烯基化合物，并且所述功能化单体为具有被保护的官能 团的烯属单体，其中所述被保护的官能团当脱保护时，产生能与酸和 酸酐反应以形成酯或酰胺的官能团。
在一些实施方案中，所述烯烃单体为芳基-乙烯基化合物，并且所 述功能化单体为具有被保护的羟基的烯属单体。在另一些实施方案中， 所述烯属单体为苯乙烯或乙基苯乙烯，并且所述功能化单体为乙酰氧 基苯乙烯。在又一些实施方案中，所述交联单体为具有两个非共轭的 结合到芳香族部分的乙烯基的烯属交联单体；其中所述芳香族部分为5 或6元芳环，并且所述功能化单体为具有被保护的官能团的烯属单体， 其中所述被保护的官能团当脱保护时，产生能与酸和酸酐反应以形成 酯或酰胺的官能团。在又一些实施方案中，交联单体为具有两个非共 轭的结合到芳香族部分的乙烯基的烯属交联单体；其中所述芳香族部 分为5或6元芳环，并且所述功能化单体为具有被保护的羟基的烯属 单体。在又一些实施方案中，所述交联单体为二乙烯基苯，并且所述 功能化单体为乙酰氧基苯乙烯。
在一些实施方案中，所述烯烃单体为芳基-乙烯基化合物，所述交 联单体为具有两个非共轭的结合到芳香族部分的乙烯基的烯属交联单 体；其中所述芳香族部分为5或6元芳环，并且所述功能化单体为具 有被保护的官能团的烯属单体，其中所述被保护的官能团当脱保护时， 产生能与酸和酸酐反应以形成酯或酰胺的官能团。
在另一些实施方案中，所述烯烃单体为芳基-乙烯基化合物，所述 交联单体为具有两个非共轭的结合到芳香族部分的乙烯基的烯属交联 单体；其中所述芳香族部分为5或6元芳环，并且所述功能化单体为 具有被保护的羟基的烯属单体。
在另一些实施方案中，所述烯烃单体为苯乙烯，所述交联单体为 二乙烯基苯，并且所述功能化单体为乙酰氧基苯乙烯。
在每个上述实施方案的一些中，所述水相包含水和分散剂，该分 散剂在一些实施方案中包括聚乙烯醇。
在上述方法的一些实施方案中，所述接触还包括将水相和有机相 搅动，例如通过搅拌所述水相和有机相。在另一些实施方案中，本发 明的方法还包括洗涤所述珠的步骤。在一些实施方案中，所述珠用一 种或多种洗涤溶剂洗涤，所述洗涤溶剂中的至少一种包括丙酮、水或 甲醇。
在上述方法的一些实施方案中，初始存在于有机相中的二乙烯基 苯的量为初始存在于有机相中总单体的约3至约20wt％；或为初始存 在于有机相中总单体的约4至约15wt％；或为初始存在于有机相中总 单体的约5.5至约10wt％。
在前述方法的一些实施方案中，初始存在于有机相中的乙酰氧基 苯乙烯的量为初始存在于有机相中总单体的约1至约20wt％；或为初 始存在于有机相中总单体的约2至约10wt％；或为初始存在于有机相 中总单体的约3至约8wt％。
在一些实施方案中，其中所述水相包含水和分散剂，所述有机相 还包含有机溶剂，该有机溶剂包括一种或多种液态烃和/或具有5-12个 碳原子的醇。在一些这样的实施方案中，初始存在于有机相中的有机 溶剂的重量百分比为约33％至约67％；初始存在于有机相中的总单体 的重量百分比为约33％至约67％；初始存在于总单体中的烯烃单体的 重量百分比为约60％至约96％；初始存在于单体中的交联单体的重量 百分比为约3％至约20％；初始存在于单体中的功能化单体的重量百分 比为约1％至约20％；和存在于有机溶剂中的烃的重量百分比为约0％ 至约80％；和初始存在于有机溶剂中的具有5-12个碳原子的醇的重量 百分比为约20％至约100％；在另一些这样的实施方案中，初始存在于 有机相中的有机溶剂的重量百分比为约40％至约65％；初始存在于有 机相中的总单体的重量百分比为约35％至约60％；初始存在于单体中 的烯烃单体的重量百分比为约75％至约94％；初始存在于总单体中的 交联单体的重量百分比为约4％至约15％；初始存在于总单体中的功能 化单体的重量百分比为约3％至约8％；和存在于有机溶剂中的烃的重 量百分比为约5％至约70％；和初始存在于有机溶剂中的具有5-12个 碳原子的醇的重量百分比为约30％至约95％。在又一些这样的实施方 案中，初始存在于有机相中的有机溶剂的重量百分比为约50％至约 60％，初始存在于有机相中的总单体的重量百分比为约40％至约50％； 初始存在于总单体中的烯烃单体的重量百分比为约82％至约91.5％；初 始存在于总单体中的交联单体的重量百分比为约5.5％至约10％；初始 存在于单体中的功能化单体的重量百分比为约3％至约8％；和存在于 有机溶剂中的烃的重量百分比为约10％至约60％；和初始存在于有机 溶剂中的具有5-12个碳原子的醇的重量百分比为约40％至约90％。在 一些这样的实施方案中，所述分散剂包括聚乙烯醇。在另一些这样的 实施方案中，所述烯烃单体为苯乙烯或乙基苯乙烯，所述交联单体为 二乙烯基苯，所述功能化单体为乙酰氧基苯乙烯，所述烃为异辛烷， 和具有5-12个碳原子的醇为2-乙基己醇。在一些这样的实施方案中， 初始存在于水相中的分散剂的重量百分比为约0.01％至约20％。
在本文中所述方法的一些实施方案中，将所述有机相和水相加热 至温度为约25℃至约95℃；或约40℃至约90℃；或约70℃至约85℃； 或约75℃至约80℃。
本发明还提供制备载体结合的核苷的方法，其包括：(a)提供由 本发明的方法制备的聚合珠，并任选将所述珠与活化试剂反应以提供 活化的聚合珠；(b)将所述任选活化的聚合珠与至少一种连接试剂反 应以制备具有载体结合的连接部分的珠；和(c)将所述载体结合的连 接部分与核苷连接以形成载体结合的核苷。
本发明还提供制备载体结合的核苷的方法，其包括：(a)提供由 本发明的方法制备的聚合珠，并任选将所述珠与活化试剂反应以提供 活化的聚合珠；和(b)将所述任选活化的聚合珠与带有连接部分的核 苷反应以制备载体结合的核苷。
本发明还提供制备寡核苷酸的方法，其包括：(a)提供由本文中 所述的本发明的任何上述方法制备的载体结合的核苷，所述载体结合 的核苷具有至少一个被保护的羟基；(b)使所述载体结合的核苷的羟 基脱保护；(c)将所述载体结合的核苷与活化的被保护的核苷接触以 生成亚磷酸酯中间体；(d)将该亚磷酸酯中间体与氧化剂接触以生成 磷酸三酯中间体；(e)任选封端未反应的核苷；(f)任选重复步骤(b) -(e)至少一次；和(g)从固体载体上切下寡核苷酸。在一些这样 的实施方案中，步骤(b)的脱保护步骤包括除去酸不稳定的保护基。
本发明还提供制备寡核苷酸的方法，其包括：(a)提供由本文中 所述的本发明的任何上述方法制备的载体结合的核苷，所述载体结合 的核苷具有至少一个被保护的羟基；(b)使所述载体结合的核苷的羟 基脱保护；(c)将所述载体结合的核苷与活化的被保护的核苷接触以 生成亚磷酸酯中间体；(d)将该亚磷酸酯中间体与氧化剂接触以生成 磷酸三酯中间体；(e)任选封端未反应的核苷；(f)任选重复步骤(b) -(e)至少一次；和(g)从固体载体上切下寡核苷酸。在一些这样 的实施方案中，步骤(b)的脱保护步骤包括除去酸不稳定的保护基。
本发明还提供式I的化合物：

其中LL为连接部分；SS为如本文中所述的本发明的珠；并且其 它组成变量为如下文中所述的。在一些实施方案中，G3、G5和G6各自 为O；和在另一些实施方案中，一个R2’为H，并且R3’和R4’各自为H。
本发明还提供式II的化合物：

其中组成变量为如下文中所述的。在一些实施方案中，每个G3、 G5和G6为O。在另一些这样的实施方案中，每对临近的R2’基团之一 为H，并且每个R3’和每个R4’为H。
本发明还提供制备上式I的化合物的方法，该方法包括：a)提供 式III的化合物：

和b)将式III的化合物与如本文中所述的本发明的珠，在可有效 形成式I化合物的条件下进行反应。在一些实施方案中，G3、G5和G6 各自为O。在另一些实施方案中，一个R2’为H，并且R3’和R4’各自为 H。
本发明还提供制备式I的化合物的方法，该方法包括：a)提供如 如本文中所述的本发明的珠；b)将双官能团连接部分LL的一端结合 于所述珠的官能团上；和c)将双官能团连接部分LL的另一端与式IV 化合物：

反应以形成式I化合物。在一些实施方案中，G3、G5和G6各自为O。 在另一些实施方案中，一个R2’为H，并且R3’和R4’各自为H。
本发明还提供制备式II化合物的方法，所述式II化合物为：

其中LL为连接部分，SS为如本文中所述的本发明的珠，并且其 它组成变量为如下文中所述的，所述方法包括：a)提供如上所述的式 I的化合物：

其中T’为可除去的保护基团；b)除去保护基团T’以形成脱保护 的载体结合的核苷；c)使步骤(b)的脱保护的载体结合的核苷与被 保护的核苷亚磷酰胺或式V反应以形成式VI的亚磷酸酯化合物，其中 所述式V为：

其中组成变量为如下文所定义的；其中所述式VI为：

d)将式VI的磷酸酯氧化或硫化以形成式II的化合物，其中m为 1；e)任选使未反应的核苷封端；和f)任选重复步骤(b)-(e)一 次或多次。在一些实施方案中，每个G3、G5和G6为O。在另一些实施 方案中，每对临近的R2’基团之一为H，并且每个R3’和每个R4’为H。
在上述合成方法的一些实施方案中，所述方法还包括将形成的寡 核苷酸从所述固体载体上切下。
本发明还提供制备包含氨基酸单体的低聚物的方法，该方法包括： (a)提供聚合物底物，所述聚合物底物具有式SS-LL-ZZ，其中SS为 本发明的聚合珠，LL为任选的连接部分，和ZZ为能够与氨基酸的羧 基或氨基形成锚定键的化学基团；(b)将第一氨基酸合成子与所述聚 合物底物结合，该第一氨基酸合成子在其羧基或氨基处具有保护基团； (c)从结合的第一氨基酸上除去保护基团以生成游离氨基或羧基；和 (d)使所述游离氨基或羧基与第二氨基酸合成子反应，以形成肽链。 在一些实施方案中，所述方法还包括如下步骤：(e)从第二氨基酸合 成子上除去保护基团以在所述肽链上生成末端游离氨基或羧基；和(f) 使在所述肽链上的游离氨基或羧基与另外的被保护的氨基酸合成子反 应以延长所述肽链。在另一些实施方案中，步骤e和f进行多次。一些 实施方案还包括将所述锚定键切断而基本上不使所述肽链降解。在一 些实施方案中，所述氨基酸合成子为天然存在的氨基酸。在另一些实 施方案中，所述氨基酸合成子为肽核酸合成子。
本发明还提供制备式X化合物的方法，所述式X为：

其中，组成变量为如下文所定义的，所述方法包括如下步骤：(a) 提供聚合物底物，所述的聚合物底物具有式SS-LL-ZZ，其中SS为权 利要求67的聚合珠，LL为连接部分，和ZZ为能够与氨基酸形成锚定 键的化学基团；(b)将所述聚合物底物与第一氨基酸通过所述锚定键 结合，所述第一氨基酸具有式(XX)：

其中，组成变量为如下文所定义的，(c)从所述结合的第一氨基 酸除去所述氨基保护基团以产生游离氨基；和(d)将所述游离氨基与 具有式(XX)的第二氨基酸反应以形成肽链。在一些实施方案中，所 述方法还包括如下步骤：(e)从所述第二氨基酸上除去所述氨基保护 基团以在所述肽链上生成末端游离氨基；和(f)使在所述肽链上的游 离氨基与具有式(XX)的另外的氨基酸反应以延长所述肽链。在一些 实施方案中，步骤e和f进行多次。一些实施方案还包括将留在所述肽 链的氨基酸部分上的至少一个保护基除去。一些实施方案还包括切断 所述锚定键而基本上不降解所述肽链。在一些实施方案中，能够形成 所述锚定键的化学基团为具有间隔基团的氯取代的、溴取代的和碘取 代的烷基，氨基取代的烷基，氨基和芳基取代的烷基，氨基取代的和 烷芳基取代的烷基，羟基取代的烷基，或其衍生物，所述间隔基团可 被切断而基本上不会降解所述多肽。在一些实施方案中，氯取代的烷 基为氯甲基，氨基取代的烷基为氨基甲基，氨基取代的和烷基取代的 芳基为″-氨基苄基，氨基取代的和烷芳基取代的烷基选自″-氨基-3- 甲基苄基和″-氨基-4-甲基苄基，和羟基取代的烷基为羟基甲基。在一 些实施方案中，所述化学基团衍生于含氨基的部分，所述含氨基的部 分选自氨基取代的烷基，氨基取代的和芳基取代的烷基，和氨基取代 的和烷芳基取代的烷基；并且所述化学基团包括间隔基团，所述间隔 基团衍生于4-(卤代烷基)芳基-低级链烷酸、Boc-氨基酰基-4-(氧基甲基) 芳基-低级链烷酸、N-Boc-对-酰基二苯甲基胺、N-Boc-4’-(低级烷基)- 对-酰基二苯甲基胺、N-Boc-4’-(低级烷氧基)-对-酰基二苯甲基胺和4- 羟基甲基苯氧基-低级链烷酸。
在一些实施方案中，化合物X具有下式：

其中组成变量为如下文所定义的。
在另一些实施方案中，化合物X具有下式：

其中组成变量为如下文所定义的。
在一些实施方案中，具有式(XX)的氨基酸具有下式：

其中组成变量为如下文所定义的。
在另一些实施方案中，具有式(XX)的氨基酸具有下式：

其中组成变量为如下文所定义的。
在一些实施方案中，本发明的聚合珠的负载能力为每克珠至少约 50微摩尔；每克珠至少约100微摩尔；每克珠至少约150微摩尔； 每克珠至少约200微摩尔；每克珠至少约250微摩尔；每克珠至少约 300微摩尔；每克珠至少约350微摩尔；每克珠至少约400微摩尔； 每克珠至少约450微摩尔。在一些实施方案中，所述珠的负载能力为 每克珠约100微摩尔至每克珠约350微摩尔。
有利地，本发明的珠相对易于制备并易于与多种连接部分和核苷 一起使用。另外，本发明的珠可用于多种自动固相合成仪。本发明的 珠具有优异的负载能力，每克载体能够包含大于100mmol的第一核苷 /寡核苷酸。本发明的珠还具有优良的物理性质，包括与多种合成试剂 和溶剂的相容性，对广泛的合成溶液具有一致的溶胀性质，有利的反 压力曲线，在珠和孔径大小方面极好的均一性，和导致的良好的合成 (全长低聚物)特性。
制备本发明的珠的方法是容易实现的，可扩大规模的和具有出色 的成本特性。另外，关于上述的相对容易生产和应用的优点，本发明 的珠可适合于多种连接部分的应用，所述连接部分可用于将核苷、氨 基酸或任一种的衍生物与所述载体共价结合。另外，本发明的珠允许 有效地生产高质量(全长)的寡核苷酸和其它聚合物物质。
本发明的详细说明
本发明提供用于低聚物合成的交联的功能化的聚合珠，制备其的 方法，在低聚物合成中使用其的方法，载体结合的核苷，以及制备和 使用其的方法，以及载体结合的寡核苷酸和酰胺连接的低聚物，使用 其的方法，和利用本发明的聚合珠制备的寡核苷酸和酰胺连接的低聚 物。
在一些实施方案中，所述珠通过包含如下步骤的方法制备：(a) 提供包含烯烃单体、交联单体、功能化单体和引发剂的有机相；和(b) 将所述有机相与水相在可有效形成聚合珠的时间、温度的条件下接触。
在一些实施方案中，本发明的珠包括交联聚烯烃。在一些优选的 实施方案中，本发明的珠包括交联聚苯乙烯。根据本文中所述的本发 明的方法，所述珠通过使包含烯烃和交联剂的组合物，在适合于形成 具有希望性质的珠的条件下进行自由基反应而形成。优选的烯烃为苯 乙烯。
所述水相通常包括水和分散剂，所述分散剂据信促进形成稳定的 珠。所述分散剂可以是单独化合物，或分散剂的混合物。在一些实施 方案中，所述分散剂包括一种或多种多元醇，聚丙烯酸，羧甲基纤维 素，明胶，碳化钙，磷酸钙，硫酸钙，硫酸钡，膨润土。在一些优选 的实施方案中，所述分散剂包括聚乙烯醇或者由其组成。在一些实施 方案中，所述分散剂存在于水相中的量为该水相重量的约0.01％至约 20％，或约0.1％至约10％。
所述有机相包含烯烃单体、交联单体、功能化单体和引发剂。在 一些实施方案中，所述有机相还包含一种或多种有机溶剂。
在一些实施方案中，所述烯烃单体包括单独的非芳香性不饱和基 团，例如乙烯基。优选地，所述烯属单体还包括芳基部分，例如苯基。 因此，在一些优选的实施方案中，所述烯烃单体为芳基-乙烯基化合物。 在特别优选的实施方案中，所述烯烃单体为苯乙烯或乙基苯乙烯。
所述有机相包括一种或多种交联聚合链的交联单体，即双官能团 化合物。在一些实施方案中，所述交联单体为双烯属交联单体；即包 含能形成分离的键的至少两个碳碳双键。在一些实施方案中，所述烯 属交联单体具有两个非共轭的乙烯基。在一些实施方案中，所述烯属 交联单体具有两个非共轭的连接到芳族部分的乙烯基，所述芳族部分 在一些实施方案中，为5或6元芳环，例如苯环。在一个优选的实施 方案中，交联单体为1，2-、1，3-或1，4-二乙烯基苯，或其一种或多种的 混合物。更优选地，所述交联单体包括1，3-或1，4-二乙烯基苯或由其组 成。
本发明的珠还包含一种或多种类型的官能团，该官能团由一种或 多种功能化单体提供。功能化的单体为聚合物或优选为单体，其提供 能与连接部分或直接与核苷、氨基酸形成共价键的官能团，或提供组 合合成用的核心部分的官能团。在特别优选的实施方案中，所述官能 团为-OH。所述官能团可以由在聚合过程中可与苯乙烯和/或交联单体 反应的功能化单体提供。在一些实施方案中，所述功能化单体具有至 少一个共价结合于官能团的烯属基团。在一些优选的实施方案中，所 述功能化的基团为酰氧基基团。
在特别优选的实施方案中，所述功能化试剂具有下式：

其中RF选自取代的或未取代的C1-C10烷基。
特别优选的功能化单体为乙酰氧基苯乙烯、丙酰氧基苯乙烯，其 中尤其最优选乙酰氧基苯乙烯。
在一些实施方案中，所述官能团用一种或多种保护基团保护，所 述保护基团在低聚物合成前必须除去。这些官能团包括酰基基团，例 如乙酰基、丙酰基、苯甲酰基和其它官能团保护基团。因此，本发明 的实施方案包括保护的和脱保护的功能化的交联聚烯烃聚合物。在一 些实施方案中，所述官能团当脱保护时，产生适合于与酸或酸酐反应 优选形成酯或酰胺的官能团。
所述有机相可还包括一种或多种有机溶剂。合适的溶剂包括一种 或多种液态烃和/或具有5-12个碳原子的醇。在一些实施方案中，所述 有机溶剂包括一种或多种液态烃，优选一种或多种液态烷烃、苯、甲 苯、二甲苯，例如一种或多种辛烷和/或具有5-12个碳原子的醇。在优 选的实施方案中，所述有机溶剂包括异辛烷和2-乙基己醇。
所述有机相可还包含一种或多种引发剂。合适的引发剂包括能够 引发自由基聚合反应的化合物，例如稳定了的过氧化物或偶氮化合物。 在一些优选的实施方案中，所述引发剂选自过氧化苯甲酰、过氧化二 月桂酰、1，1-二(叔丁基过氧)-2-甲基环己烷，二叔丁基过氧化物、过氧 化二硬脂酰、二叔己基过氧化物、叔丁基枯基过氧化物、1，1-二(叔己 基过氧)-3，3，5-三甲基环己烷、1，1-二(叔丁基过氧)环己烷、1，1，3，3-四甲 基丁基过氧-2-乙基己酸盐、2-乙基过己酸叔己酯、2，2’-偶氮二异丁腈、 2，2’-偶氮二-2-甲基丁腈或2，2’-偶氮二-2，4-二甲基戊腈。在一个优选的 实施方案中，所述引发剂包括或包含过氧化苯甲酰。
在一些优选的实施方案中，所述烯烃单体为苯乙烯或乙基苯乙烯， 所述交联单体为二乙烯基苯，并且所述功能化单体为乙酰氧基苯乙烯。 在一些这样的实施方案中，所述有机溶剂为异辛烷和2-乙基己醇，所 述引发剂为过氧化苯甲酰。
在本发明的一个优选的实施方案中，提供制备适合于寡核苷酸合 成的功能化的交联聚苯乙烯珠的方法，所述方法包括：(a)将水和聚 乙烯醇(PVA)混合以形成水溶液；(b)将异辛烷和2-乙基己醇溶剂、 苯乙烯单体、二乙烯基苯交联单体、过氧化苯甲酰引发剂和乙酰氧基 苯乙烯功能化单体混合以形成有机溶液；和(c)将所述水溶液和所述 有机溶液混合以形成适合于寡核苷酸合成的功能化的交联聚苯乙烯 珠。
根据本发明方法的一些实施方案，有机相和水相的接触包括例如 通过搅拌使两相搅动。在一些实施方案中，将两相搅动直至5、直至7、 直至10、直至12或直至15小时或更长。通常，在固定速率下搅拌有 机相和水相的混合物以促进产生需要的珠大小分布是有利的。在一些 优选的实施方案中，所述混合物通过桨、锚式桨、螺旋桨或盘式涡轮 在250rpm下搅拌需要的时间。
通常，在搅动过程中使所述有机相和水相加热至温度为约25℃至 约95℃；约40℃至约90℃；约70℃至约85℃；或约75℃至约80℃。
在有机相和水相反应后，优选用一种或多种洗涤溶剂洗涤所述的 珠。在一些实施方案中，至少一种洗涤溶剂为丙酮、水或甲醇。洗涤 可以通过数种用于洗涤固体载体介质技术的任何一种完成，例如通过 将反应混合物过滤并将洗溶剂涤洗涤穿过在过滤器上的珠。在一些实 施方案中，所述珠可然后根据大小分离以收集需要大小的珠，例如通 过将所述珠分散于合适的例如丙酮的溶剂中，并筛分该悬浮液。然后 将所述的珠例如在真空下干燥。
在一些优选的实施方案中，初始存在于有机相中的交联单体，例 如二乙烯基苯的量为初始存在于该有机相中的总单体重量的约3％至 约20％，约4％至约15％，或约5.5％至约10％。
在另一些优选的实施方案中，所述交联单体，例如二乙烯基苯对 初始存在于有机相中的总单体的摩尔比为约1∶27至约1∶8；约1∶25至 约1∶10；或约1∶20至约1∶13。
在另一些优选的实施方案中，初始存在于有机相中的功能化单体， 例如乙酰氧基苯乙烯的量为初始存在于该有机相中的总单体重量的约 1％至约20％，约2％至约10％，或约3％至约8％。
在另一些优选的实施方案中，所述功能化单体，例如乙酰氧基苯 乙烯对初始存在于有机相中的单体的摩尔比为约1∶99至约1∶10；或约 1∶62至约1∶18。在另一些优选的实施方案中，所述摩尔比为约1∶46至 约1∶21。
在一些优选的实施方案中，所述有机相另外还包含有机溶剂，该 有机溶剂包括一种或多种液态烃和/或具有5-12个碳原子的醇，优选异 辛烷和2-乙基己醇；和
初始存在于有机相中的有机溶剂的重量百分比为约33％至约 67％，或约40％至约65％，或约50％至约60％；
初始存在于有机相中的总单体的重量百分比为约33％至约67％， 或约35％至约60％，或约40％至约50％；
初始存在于总单体中的烯烃单体，优选苯乙烯或乙基苯乙烯的重 量百分比为约60％至约96％，或约75％至约94％，或约82％至约91.5％；
初始存在于总单体中的交联单体，优选一种或多种二乙烯基苯的 重量百分比为约3％至约20％，或约4％至约15％，或约5.5％至约10％；
初始存在于总单体中的功能化单体，优选乙酰氧基苯乙烯的重量 百分比为约1％至约20％，或约2％至约10％，或约3％至约8％；
存在于有机溶剂中的烃，优选异辛烷的重量百分比为约0％至约 80％，或约5％至约70％，或约10％至约60％；和
初始存在于有机溶剂中的具有5-12个碳原子的醇，优选2-乙基己 醇的重量百分比为约20％至约100％，或约30％至约95％，或约40％至 约90％。
在一些这样的实施方案中，所述水相包含水和分散剂，优选多元 醇例如聚乙烯醇，其中存在于该水相中的分散剂的量为该水相重量的 约0.01％至约20％，或约0.1％至约10％。
在本文中的方法的一些实施方案中，所述水相的体积对所述有机 相的体积的比为约2∶3至约50∶1；或约1∶1至约20∶1；或约3∶2至约10∶1。
本发明还提供制备载体结合的核苷的方法，其包括：(a)提供由 本发明的方法制备的聚合珠，并任选将所述珠与活化试剂反应以提供 活化的聚合珠；(b)将该活化的聚合珠与至少一种交联试剂反应以制 备具有载体结合的连接部分的珠；和(c)将所述载体结合的连接部分 与核苷连接以形成载体结合的核苷。
在另一些实施方案中，本发明还提供制备载体结合的核苷的方法， 其包括：(a)提供由本发明方法制备的聚合珠，并任选将所述珠与活 化试剂反应以提供活化的聚合珠；和(b)将所述活化的聚合珠与连接 有连接部分的核苷反应以制备载体结合的核苷。
在另一些实施方案中，本发明还提供制备寡核苷酸的方法，其包 括：(a)提供由本发明的方法制备的载体结合的核苷；(b)使所述 载体结合的核苷的羟基脱保护，例如通过除去酸不稳定的保护基团； (c)将所述载体结合的核苷与活化的被保护的核苷接触以生成亚磷酸 酯中间体；(d)将该亚磷酸酯中间体与氧化试剂接触以生成磷酸三酯 中间体；(e)任选封端未反应的核苷；(f)任选重复步骤(b)-(e) 至少一次；和(g)从固体载体上切下寡核苷酸。
在一些实施方案中，本发明提供式I的化合物：

其中：
G3为O、S、CH2或NH；
G5为O、S、CH2、CFH、CF2或-CH＝CH-；
G6为O、S、CH2或NH；
每个R2’为H、OH、O-rg，其中rg为可除去的保护基团，2’-取代 基，或与R4’一起形成桥接；
每个R3’为H，取代基，或与R4’一起形成桥接；
每个R4’为H，取代基，与R2’一起形成桥接，与R3’一起形成桥接， 或与R5’一起形成桥接；
q为0或1；
R5’为H，取代基，或与R4’一起形成桥接；
Bx为核碱基；
T’为H或可除去的保护基团；
LL为连接部分或单键；和
SS为由本文中所述的本发明的珠。
在式I化合物的一些优选的实施方案中，G3、G5和G6各自为O。 在式I化合物的另一些优选的实施方案中，至少一个R2’为H，并且R3’ 和R4’各自为H。
本发明还提供式II的化合物：

其中：
m为0至约100的整数；
每个G1为O或S；
每个G2为OH或SH；
每个G3为O、S、CH2或NH；
每个G5为O、S、CH2、CFH、CF2或-CH＝CH-；
每个R2’为H、OH、O-rg，其中rg为可除去的保护基团，2’-取代 基，或与R4’一起形成桥接；
每个R3’为H，取代基，或与R4’一起形成桥接；
每个R4’为H，取代基，与R2’一起形成桥接，与R3’一起形成桥接， 或与R5’一起形成桥接；
每个q为0或1；
每个R5’为H，取代基，或与R4’一起形成桥接；
每个G6独立地为O、S、CH2或NH；
每个Bx为核碱基；
T’为可除去的保护基团；
LL为连接部分；和
SS为如本文中所描述的本发明的珠。
在式II化合物的一些优选的实施方案中，每个G3、G5和G6为O。 在式II化合物的另一些优选的实施方案中，每对临近的R2’基团中至少 一个为H，并且每个R3’和每个R4’为H。
在另一些实施方案中，本发明提供制备式I化合物的方法，所述 式I化合物为：

其中：
G3为O、S、CH2或NH；
G5为O、S、CH2、CFH、CF2或-CH＝CH-；
每个R2’为H、OH、O-rg，其中rg为可除去的保护基团，2’-取代 基，或与R4’一起形成桥接；
每个R3’为H，取代基，或与R4’一起形成桥接；
每个R4’为H，取代基，与R2’一起形成桥接，与R3’一起形成桥接， 或与R5’一起形成桥接；
q为0或1；
R5’为H，取代基，或与R4’一起形成桥接；
Bx为核碱基；
pg为可除去的亚磷保护基团
T’为可除去的保护基团；
LL为连接部分或单键；和
SS为如本文中所述的本发明的珠；
该方法包括：
a)提供式III的化合物：

和
b)将式III的化合物与本发明的珠在有效形成式I化合物的条件 下进行反应。在该方法的一些实施方案中，G3、G5和G6各自为O。在 另一些实施方案中，至少一个R2’为H，并且R3’和R4’各自为H。
在另一些实施方案中，本发明提供制备式I化合物的方法，所述 式I化合物为：

其中：
G3为O、S或NH；
G5为O、S、CH2、CFH、CF2或-CH＝CH-；
每个R2’为H、OH、O-rg，其中rg为可除去的保护基团，2’-取代 基，或与R4’一起形成桥接；
每个R3’为H，取代基，或与R4’一起形成桥接；
每个R4’为H，取代基，与R2’一起形成桥接，与R3’一起形成桥接， 或与R5’一起形成桥接；
q为0或1；
R5’为H，取代基，或与R4’一起形成桥接；
Bx为核碱基；
T’为可除去的保护基团；
LL为连接部分；和
SS为如本文中所述的本发明的珠；
该方法包括：
a)提供本发明的珠；
b)将双官能团连接部分LL的一端结合于所述珠的官能团上；和
c)将双官能团连接部分LL的另一端与式IV化合物反应以形成式 I化合物，所述式IV化合物为：

在一些实施方案中，G3、G5和G6各自为O。在另一些实施方案中， 至少一个R2’为H，并且R3’和R4’各自为H。
本发明还提供制备式II化合物的方法，所述式II化合物为：

其中：
m为1至约100的整数；
每个G1为O或S；
每个G2为OH或SH；
每个G3为O、S、CH2或NH；
每个G5为O、S、CH2、CFH、CF2或-CH＝CH-；
每个R2’为H、OH、O-rg，其中rg为可除去的保护基团，2’-取代 基，或与R4’一起形成桥接；
每个R3’为H，取代基，或与R4’一起形成桥接；
每个R4’为H，取代基，与R2’一起形成桥接，与R3’一起形成桥接， 或与R5’一起形成桥接；
每个q为0或1；
每个R5’为H，取代基，或与R4’一起形成桥接；
每个G6为O、S、CH2或NH；
每个Bx为核碱基；
T’为H或保护基团；
LL为连接部分或单键；和
SS为如本文中所述的本发明的珠；所述方法包括：
a)提供式I化合物：

其中T’为可除去的保护基团；
b)移除保护基团T’以形成脱保护的载体结合的核苷；
c)将步骤(b)的脱保护的载体结合的核苷与被保护的核苷亚磷 酰胺或式V反应以形成式VI的亚磷酸酯化合物，其中所述式V为：

其中RN1和RN2为具有1-6的碳原子的烷基；
其中所述式VI为：

d)将式VI的磷酸酯进行氧化或硫化以形成式II的化合物，其中 m为1；
e)任选封端未反应的核苷；和
f)任选重复步骤(b)-(e)一次或多次。
在一些实施方案中，每个G3、G5和G6为O。在另一些实施方案 中，每对临近的R2’基团中的至少一个为H，并且每个R3’和每个R4’ 为H。在另一些实施方案中，所述方法还包括从固体载体上切下形成 的寡核苷酸。
本发明的聚合珠还用于制备酰胺连接的低聚物，例如蛋白质、肽 及它们的类似物，和酰胺连接的核碱基-或连接有核碱基类似物的低聚 物，例如肽核酸。如本文中所用的，术语“氨基酸”指具有氨基和羧 基二者的单体物质。因此，“氨基酸”包括如存在于肽和蛋白质中的 天然存在的α-氨基酸，它们的类似物，其它天然存在的氨基酸，例如γ- 氨基丁酸，和其它可制备低聚物的非天然存在的氨基酸。因此，在一 些实施方案中，本发明提供制备包含氨基酸单体的低聚物的方法，该 方法包括：
(a)提供聚合物底物，所述聚合物底物具有式SS-LL-ZZ，其中 SS为本发明的聚合珠，LL为任选的连接部分，和ZZ为能够与氨基酸 的羧基或氨基形成锚定键的化学基团；
(b)通过氨基酸的羧基或氨基将第一氨基酸合成子结合到所述底 物上，所述合成子在其未结合的羧基或氨基处具有保护基团；
(c)从结合的第一氨基酸上除去保护基团以生成游离氨基或羧 基；和
(d)使所述游离氨基或羧基与第二氨基酸合成子反应，以形成肽 链。在另一些实施方案中，所述方法还包括如下步骤：
(e)从第二氨基酸合成子上除去保护基团以在所述肽链上生成末 端游离氨基或羧基；和
(f)使在所述肽链上的游离氨基或羧基与另外的被保护的氨基酸 合成子反应以延长所述肽链。
在需要较长物质的一些实施方案中，步骤e和f进行多次。当获 得了需要的序列时，将所述锚定键切下而基本上不降解所组装的链。
在一些优选的实施方案中，所述氨基酸合成子为天然存在的氨基 酸，它们的类似物，或肽核酸。
在一些另外的实施方案中，本发明提供制备式X化合物的方法， 所述式X化合物为：

其中：
n至少为2，
每个L1-Ln独立地选自氢、羟基、(C1-C4)烷酰基，天然存在的 核碱基，非天然存在的核碱基，芳族部分，DNA嵌入剂，核碱基结合 基团，杂环部分，以及报告配体，L1-Ln中至少一个为天然存在的核碱 基，非天然存在的核碱基，DNA嵌入剂，或核碱基结合基团；
每个C1-Cn为(CR6R7)y，其中R6为氢，并且R7选自天然存在的α- 氨基酸的侧链，或R6和R7独立地选自氢、(C2-C6)烷基、芳基、芳烷基、 杂芳基、羟基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基硫基、NR3R4和SR5，其中 R3和R4为如上所定义的，并且R5为氢，(C1-C6)烷基，羟基取代的、 烷氧基取代的或烷基硫基取代的(C1-C6)烷基，或R6和R7一起形成脂环 或杂环体系；
每个D1-Dn为(CR6R7)y，其中R6和R7为如上所定义的；
每个y和z为0或1-10的整数，y+z的和大于2但不超过10；
每个G1-Gn-1在任一方向中，为-NR3CO-、-NR3CS-、-NR3SO-或 -NR3SO2-，其中R3为如上所定义的；
选择每个A1-An和B1-Bn，使得：
(a’)A为式(IIa)、(IIb)或(IIc)的基团，和B为N或R3N+， 只要至少一个A为式(IIc)的基团；或
(b’)A为式(IId)的基团，和B为CH；或
(c’)A为式(IIa)或(IIb)的基团，和B为N或R3N+，只要 至少一个y或z不为1或2；

其中：
X为O、S、Se、NR3、CH2或C(CH3)2；
Y为单键、O、S或NR4；
每个p和q为0或1-5的整数，并且p+q的和不超过10；
每个r和s为0或1-5的整数，并且r+s的和不超过10；
每个R1和R2独立地选自氢、可以是羟基取代的或烷氧基取代的 或烷基硫基取代的(C1-C4)烷基、羟基、烷氧基、烷基硫基、氨基和卤 素；和
每个R3和R4独立地选自氢、(C1-C4)烷基、羟基取代的或烷氧基 取代的或烷基硫基取代的(C1-C4)烷基、羟基、烷氧基、烷基硫基和氨 基；
Q为-CO2H、-CONR’R”、-SO3H或-SO2NR’R”，或-CO2H或-SO3H； 和
I为-NHRR””或NRC(O)R””，其中R’、R”、R和R””独 立地选自氢、烷基、氨基保护基、报告配体、嵌入剂、螯合剂、肽、 蛋白质、糖类、脂质、类固醇、寡核苷酸和可溶和不可溶的聚合物；
所述方法包括如下步骤：
(a)提供聚合物底物，所述聚合物动物具有式SS-LL-ZZ，其中 SS为如本文中描述的本发明的聚合珠，LL为连接部分，和ZZ为能够 与氨基酸形成锚定键的化学基团；
(b)将所述聚合物底物与第一氨基酸通过所述锚定键结合，所述 第一氨基酸具有式(XX)：

其中，
L选自天然存在的核碱基，非天然存在的核碱基，芳族部分，DNA 嵌入部分，核碱基结合基团，杂环部分和报告配体，其中氨基任选被 氨基保护基团保护；
每个C为(CR6R7)y，其中R6为氢，并且R7选自天然存在的α-氨 基酸的侧链，或R6和R7独立地选自氢、(C2-C6)烷基、芳基、芳烷基、 杂芳基、羟基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基硫基、NR3R4和SR5，其中 R3和R4为如上所定义的，并且R5为氢，(C1-C6)烷基，羟基取代的、 烷氧基取代的或烷基硫基取代的(C1-C6)烷基，或R6和R7一起形成脂环 或杂环体系；
每个D为(CR6R7)z，其中R6和R7为如上所定义的；
每个y和z为0或1-10的整数，y+z的和大于2但不超过10；
选择A和B，使得：
(a’)A为式(IIc)的基团，和B为N或R3N+；或
(b’)A为式(IId)的基团，和B为CH；或
(c’)A为式(IIa)或(IIb)的基团，和B为N或R3N+，只要 至少一个y或z不为1或2；

其中：
X为O、S、Se、NR3、CH2或C(CH3)2；
Y为单键、O、S或NR4；
每个p和q为0或1-5的整数，并且p+q的和不超过10；
每个r和s为0或1-5的整数，并且r+s的和不超过10；
每个R1和R2独立地选自氢、可以是羟基取代的或烷氧基取代的 或烷基硫基取代的(C1-C4)烷基、羟基、烷氧基、烷基硫基、氨基和卤 素；和
每个R3和R4独立地选自氢、(C1-C4)烷基、羟基取代的或烷氧基 取代的或烷基硫基取代的(C1-C4)烷基、羟基、烷氧基、烷基硫基和氨 基；
每个E为COOH，CSOH，SOOH，SO2OH或其活化的或被保护 的衍生物；和
每个F为NHR3或NPgR3，其中R3为如上定义的，和Pg为氨基 保护基；
(c)从所述结合的第一氨基酸除去所述氨基保护基以产生游离氨 基；和
(d)将所述游离氨基与具有式(XX)的第二氨基酸反应以形成 肽链。在一些实施方案中，所述方法还包括如下步骤：
(e)从所述第二氨基酸上除去所述氨基保护基以在所述肽链上生 成末端游离氨基；和
(f)使在所述肽链上的游离氨基与具有式(XX)的另外的氨基 酸反应以延长所述肽链。在另一些实施方案中，步骤e和f多次进行。 另一些实施方案还包括将留在所述肽链的氨基酸部分上的至少一个保 护基除去。优选地，当需要的序列的合成完成时，从载体上将锚定键 切断而基本上不降解所述组装好的链。
在上述方法的一些实施方案中，能够形成所述锚定键接的化学基 团为具有间隔基团的氯取代的、溴取代的和碘取代的烷基，氨基取代 的烷基，氨基和芳基取代的烷基，氨基取代的和烷芳基取代的烷基， 羟基取代的烷基，或其衍生物，所述间隔基团可被切断而基本上不会 降解所述多肽。在一些实施方案中，氯取代的烷基为氯甲基，氨基取 代的烷基为氨基甲基，氨基取代的和烷基取代的芳基为α-氨基苄基， 氨基取代的和烷芳基取代的烷基选自α-氨基-3-甲基苄基和α-氨基-4-甲 基苄基，并且羟基取代的烷基为羟基甲基。在另一些实施方案中，所 述化学基团衍生于含氨基的部分，所述含氨基的部分选自氨基取代的 烷基，氨基取代的和芳基取代的烷基，和氨基取代的和烷芳基取代的 烷基；并且所述化学基团包括间隔基团，所述间隔基团衍生于4-(卤代 烷基)芳基-低级链烷酸、Boc-氨基酰基-4-(氧基甲基)芳基-低级链烷酸、 N-Boc-对-酰基二苯甲基胺、N-Boc-4’-(低级烷基)-对-酰基二苯甲基胺、 N-Boc-4’-(低级烷氧基)-对-酰基二苯甲基胺和4-羟基甲基苯氧基-低级 链烷酸。
在一些实施方案中，所述化合物X具有下式：

其中：
每个L独立地选自氢、苯基、杂环部分、天然存在的核碱基和非 天然存在的核碱基；
每个R7’独立地选自氢和天然存在的α氨基酸的侧链；
n为1-60的整数，
每个k、l和m独立地为0或1-5的整数；
每个p为0或1；
Rh为OH、NH2或-NHLysNH2；和
Ri为H或COCH3。
在另一些实施方案中，化合物X具有下式：

其中：
每个L独立地选自氢、苯基、杂环部分、天然存在的核碱基和非 天然存在的核碱基；
每个R7’独立地选自氢和天然存在的α氨基酸的侧链；
n为1-60的整数，
每个k、l和m独立地为0或1-5的整数；
每个p为0或1；
Rh为OH、NH2或-NHLysNH2；和
Ri为H或COCH3。 在另一些实施方案中，具有式(XX)的所述氨基酸具有具有下式：

其中：
每个L独立地选自氢、苯基、杂环部分、天然存在的核碱基和非 天然存在的核碱基；
每个R7’独立地选自氢和天然存在的α氨基酸的侧链；和
每个k、l和m独立地为0或1-5的整数。
在又一些实施方案中，具有式(XX)的所述氨基酸具有下式：

其中：
每个L独立地选自氢、苯基、杂环部分、天然存在的核碱基和非 天然存在的核碱基；
每个R7’独立地选自氢和天然存在的α氨基酸的侧链；和
每个k、l和m独立地为0或1-5的整数。
在一些实施方案中，本发明提供交联的功能化的聚苯乙烯珠，其 具有出色的性质，例如在珠大小分布、孔径大小方面出色的均匀性， 密度，溶胀性质和/或对典型用于低聚物合成的溶剂和试剂的耐受性。 在一些实施方案中，所述的珠具有的优异的负载能力。在一些实施方 案中，所述的珠具有的负载能力为每克珠至少约50μmol；每克珠至少 约100μmol；每克珠至少约150μmol；每克珠至少约200μmol；每克 珠至少约250μmol；每克珠至少约300μmol；每克珠至少约350μmol； 每克珠至少约400μmol；或每克珠至少约450μmol。在一些实施方案 中，所述的珠具有每克珠约100μmol至每克珠约350μmol的负载能力。
在一些实施方案中，本发明的珠的平均粒子大小为约1μm至约 1000μm。在优选的实施方案中，本发明的珠的平均粒子大小为约5μm 至约500μm。在特别优选的实施方案中，本发明的珠的平均粒子大小 为约10μm至约300μm。
本发明的聚合珠载体适于制备任何可用组合方法合成的多种单体 和低聚物分子。现在广泛公知组合文库自身是可用的，并且这些文库 和包含它们的化合物具有很大的商业重要性。事实上，化学的一个分 支已经开发出组合文库的许多商业方面。为了使每个传统的组合途径 的优点最大化，用于组合去褶合(combinatorial deconvolution)的新策 略已经由几个小组独立开发出来。选择技术已经与如下物质的文库一 起使用：肽(Geysen等人，J.Immun.Meth.，1987，102，259；Houghten 等人，Nature，1991，354，84；Owens等人，Biochem.Biophys.Res. Commun.，1991，181，402；Doyle，PCT WO 94/28424；Brennan，PCT WO 94/27719)；核酸(Wyatt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1994，91， 1356；Ecker等人，Nucleic Acids Res.，1993，21，1853)；非肽和小分子 (Simon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1992，89，9367；Zuckermann 等人，J.Am.Chem.Soc，1992，114，10646；Bartlett等人，WO 91/19735； Ohlmeyer等人，Proc.Natl Acad.ScL U.S.A.，1993，90，10922；DeWitt等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1993，90，6909；Cody等人，美国专利 5,324,483；Houghten等人，PCT WO 94/26775；Ellman，美国专利 5,288,514；Still等人，WO 94/08051；Kauffman等人，PCT WO 94/24314； Carell等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1994，33，2059；Carell等人， Angew.Chem.Int.Ed.Engel.，1994，33，2061；Lebl等人，WO 94/28028)。 上述每篇文献以其全部内容通过引用并入本文中。上述参考文献的综 述说明这些技术的最先进的是用于选择肽和核酸的那些。
迄今为止所报导的大部分技术涉及重复体的合成和低聚物的日益 增加地简化亚类的筛选，所述低聚物例如肽和寡核苷酸。已经应用的 单体或亚单体包括氨基酸、类氨基酸分子，即氨基甲酸酯前体，和核 苷酸，这两者都是双官能的。利用这些技术，对于在任一细胞水平的 分析(cell-based assays)中的活性，或对于纯化的蛋白质目标的结合和 /或抑制，已经对文库进行分析。
一些组合方法利用多官能支架，该多官能支架带有多重差异位点， 并用多种构件单元衍生这些位点，以形成不同小分子化合物的文库。 文库可以被生成，使得每个单独化合物可以被分别合成和分离，或作 为几种需要的化合物的混合物合成和使用。可通过使用支架和/或构件 单元的混合物获得化合物的混合物。
组合文库的多样性表现为所用的每种支架和构件单元的固有物理 和化学性质，在每个衍生步骤过程中所用的不同的构件单元的数量， 由衍生化学引起的键的物理和化学性质，以及所述支架和构件单元化 学的相互作用。合在一起，这些相互作用对于在组合文库中的每种单 独化合物提供独特的构象。
本发明的聚合珠载体适用于制备可由这些组合方法合成的多样的 单体和低聚物分子中的任何一种。这些包括常规小分子药物，和较大 的物质，例如低聚类肽物(peptidomimetics)，拟肽和核苷酸，以及衍 生于其它预组织的或刚性支架的低聚物分子。
例如，酸、胺和氨基酸属于构件单元的类，它们已经被认为在组 合化学中是非常有用的，因为它们与多种官能团的反应性和不同结构 的大量这种化合物的可商购性。例如，氨基酸已经广泛用于合成小分 子组合文库。作为关键构件单元的氨基酸在组成取代杂环库中的用途 已经在环状脲和在“探测文库”中由几个小组实践用于开发已知药效 团(Bunin和Ellman，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，10997；DeWitt等人.， Proc.Natl.Acad.Sd.USA，1993，90，6909；Nefzi，等人，Tetrahedron Lett.， 1997，38，931；Bartlett，等人.，Book of Abstracts，213th American Chemical Society National Meeting，San Francisco，1997，American Chemical Society，Washington D.C.，ORGN-273)。
在一些组合过程中，所述支架具有多种被掩蔽的(即被保护的) 官能团(多样性位点)。所有这些多样性位点以如下方式被保护或掩 蔽，所述方式为：保护和脱保护的方案实质上是正交的，即一个基团 可以被选择性地脱保护而不会影响任何其它掩蔽基团的完整性。因为 所述支架在低聚物或单体化合物的合成过程中被连接或构建，这允许 单独多样性位点的选择性功能化。或者，如果希望，这还允许多个多 样性位点同时反应。
所述多样性位点可用不同的构件单元组合。适用于组合的位点包 括反应性氨基和羟基。支架在多样性位点处的衍生利用多种构件单元 完成，所述构件单元包括但不限于：羧酸、酰卤、酸酐、磺酸、磺酰 卤、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酮、醛、胺和氨基酸。
在一些实施方案中，本发明提供官能团到连结于本发明的固体载 体的单环或双环支架上的加成。所述组合文库的制备开始于直接连结 于或通过对合成条件稳定但可在合成结束时切断以将化合物释放到溶 液中的连接部分连结于固体载体的单环或双环支架。优选的连接部分 包括酯，特别是衍生于琥珀酸的那些酯。或者，可将所述支架结合于 结合到所述载体上的固定部分，例如DMT、乙二醇或类似的二醇。
所述支架可以是均匀的，或者为结构不同的单环和/或双环体系的 组，其给出相对取向不同的官能团和附着部分，不同的取代基。其它 组合的位点可在所述支架上以被保护的羟基或氨基或其它被掩蔽官能 团的形式呈现，如果需要它们可以选择性地与构件单元反应。
用于组合文库的支架和构件单元连接不同的官能团，这些官能团 合在一起对形成的库成员提供不同的性质(多样性)。这些官能团包 括氢键给体和受体，离子部分、极性部分、疏水部分、芳香中心和电 子给体和受体。所述单独支架和构件单元的性质合在一起贡献于在单 独化合物中被发现的独特性。因此，这些化合物的库具有无数性质， 即，“多样性”。合在一起共同形成单独库化合物的所述单独支架和 构件单元的性质，贡献于该化合物的独特性并对其赋予某些特性用于 与细胞、酶或核酸的目标位点相互作用。
如本文中所用的，术语“寡核苷酸”的意思是具有m个包含于下 式中的括号[]内的子单元的低聚物：
                 寡核苷酸

其中，其它变量如上所定义，并且在下文中更详细描述。应当理 解的是，尽管待制备的寡核苷酸被描述为单链构象，但对于寡核苷酸 通常以双链构象使用。例如，在通常被称为siRNA的反义方法中，RNA 或RNA类寡核苷酸的两条链被一起制备和复性，其中在末端两个核苷 酸经常重叠。因此，本发明要制备单链和双链寡核苷酸二者。
核碱基
所述核碱基Bx可以相同或不同，并包括天然存在的核碱基腺嘌呤 (A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C)， 以及改性的核碱基。改性的核碱基包括在结构上与天然存在的核碱基 相关的杂环部分，但所述杂环部分已经被化学改性以向所改性的核碱 基赋予一些天然存在的核碱基所不具有的性质。本文中所用的术语“核 碱基”意于与“核酸碱基或其类似物”具有相同意义。通常，核碱基 为包含一个或多个能氢键结合于寡核苷酸的碱基的原子或原子团的任 何结构。
如本文中所用的，“未改性的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱 的腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱的胸腺嘧啶(T)、胞嘧 啶(C)和尿嘧啶(U)。改性的核碱基包括其它合成的和天然的核碱 基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次 黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、 腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸 腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3) 尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶 和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、 8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代 特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌 呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8- 氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤和3-脱氮杂鸟嘌呤和 3-脱氮杂腺嘌呤。其它改性的核碱基包括三环嘧啶，例如吩噁嗪胞苷 (1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并 [5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)，G-夹(clamps)，例如取代的吩噁嗪胞 苷(例如9-(2-氨基甲氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、 咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并 [3′，2′:4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮)。改性的核碱基还可包含其中嘌呤或 嘧啶碱基用其它杂环取代的那些，例如7-脱氮杂-腺嘌呤、7-脱氮杂鸟 苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其它核碱基包括公开于美国专利3,687,808 的那些，公开于The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering第858-859页，Kroschwitz，J.I.编，John Wiley & Sons，1990 中的那些，由Englisch等人，Angewandte Chemie，International Edition， 1991，30，613公开的那些，以及由Sanghvi，Y.S，第15章，Antisense Research and Applications，第289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.， 编，CRC Press，1993公开的那些。
某些核碱基特别用于增加本发明低聚化合物的结合亲和性。这些 包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括 2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶 取代已经被说明使核酸双螺旋的稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.， Crooke，S.T.和Lebleu，B.，编，Antisense Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，第276-278页)并且是目前优选的碱基取代，甚 至更特别当与2′-O-甲氧基乙基糖改性相组合时。
教导某些上述改性的核碱基以及其它改性的核碱基的制备的典型 的美国专利包括但不限于，上述的U.S.3,687,808，以及U.S.：4,845,205、 5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、 5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、 5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,645,985、5,830,653、5,763,588、 6,005,096和5,681,941，它们中某些与本申请被共同拥有，并且每篇都 通过引用并入本文中，以及美国专利5,750,692，其与本申请被共同拥 有，并且也通过引用并入本文中。
还可以在所述寡核甘酸上的其它位置上，特别是在3’末端核苷酸 上糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置进行另外的改性。例如，本发 明结合寡核甘酸的配体的另外的改性涉及向所述寡核甘酸化学连接一 个或多个提高活性、所述寡核甘酸的细胞分布或细胞摄取的另外的非 配体部分或轭合物，。这些部分包括但不限于脂质部分，例如胆固醇 部分(Letsinger等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553)，胆 酸(Manoharan等人.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1994，4，1053)，硫代 醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人.，Ann.N.Y.Acad.Sci.， 1992，660，306；Manoharan等人.，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3， 2765)，硫代胆固醇(Oberhauser等人.，Nucl.Acids Res.，1992，20，533)， 脂肪族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人.， EMBO J.，1991，10，111；Kabanov等人.，FEBS Lett.，1990，259，327； Svinarchuk等人.，Biochimie，1993，75，49)磷脂，例如，二(十六烷基)-rac- 丙三醇或1，2-二-O-十六烷基-rac-丙三氧基-3-H磷酸三乙铵(Manoharan 等人.，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651；Shea等人.，Nucl.Acids Res.， 1990，18，3777)，聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人.，Nucleosides & Nucleotides，1995，14，969)，或金刚烷乙酸(Manoharan等人.， Tetrahedron Lett.，1995，36，3651)，棕榈酰部分(Mishra等人.，Biochim. Biophys.Acta，1995，1264，229)，或十八胺或己基胺基-羰基-氧基胆固 醇部分(Crooke等人.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277，923)
典型的教导这种寡核甘酸轭合物的美国专利包括但不限于：美国 专利4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、 5,552,53 8、5,578,717、5,580,731、5,580,731、5,591,584、5,109,124、 5,118,802、5,138,045、5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、 5,608,046、4,587,044、4,605,735、4,667,025、4,762,779、4,789,737、 4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、4,958,013、5,082,830、 5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,245,022、 5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、 5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、 5,5 14,785、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、 5,595,726、5,597,696、5,599,923、5,599,928和5,688,941，这些专利中 的某些是共同拥有的，并且每篇专利都通过引用并入本文中。
在本发明的一些实施方案中，低聚化合物，例如寡核甘酸被制备 成具有代替一种或多种杂环碱基部分的多环杂环化合物。以前已经有 人报道了很多三环杂环化合物。这些化合物通常用于反义应用以增加 改性链对目标链的结合性质。最多研究的改性目标为鸟苷，因此它们 已经被称为G-夹或胞苷类似物。许多这些多环杂环化合物具有通式：

在第二条链中与鸟苷形成3个氢键的典型的胞嘧啶类似物包括 1，3-二氮杂吩噁嗪-2-酮(R10＝O，R11-R14＝H)[Kurchavov，等人， Nucleosides and Nucleotides，1997，16，1837-1846]，1，3-二氮杂吩噻嗪-2- 酮(R10＝S，R11-R14＝H)，[Lin，K.-Y.； Jones，R.J.；Matteucci，M.J.Am. Chem.Soc.1995，117，3873-3874]和6，7，8，9-四氟-1，3-二氮杂吩噁嗪-2- 酮(R10＝O，R11-R14＝F)[Wang，J.；Lin，K.-Y.，Matteucci，M.Tetrahedron Lett.1998，39，8385-8388]。被并入到寡核甘酸中，这些碱的改性被说明 与互补的鸟嘌呤杂交，并且鸟嘌呤还通过扩展的堆积作用显示出与腺 嘌呤杂交并增强了螺旋热稳定性(也参见2002年5月24日提交的名 称为“Modified Peptide Nucleic Acids”的美国专利申请10/155,920；和 2002年5月24日提交的名称为“Nuclease Resistant Chimeric Oligonucleotides”的美国专利申请10/013,295；两篇专利均与本申请被 共同拥有并通过引用以其全部内容并入本文中)。
当胞嘧啶类似物/替代物具有连接于刚性1，3-二氮杂吩噁嗪-2-酮支 架(R10＝O，R11＝-O-(CH2)2-NH2，R12-14＝H)的氨基乙氧基部分时，可 观察到更多的螺旋稳定性质[Lin，K.-Y.；Matteucci，M.J.Am.Chem.Soc. 1998，120，8531-8532]。结合研究说明单独的并入可增强模型寡核苷酸 对其互补的目标DNA或RNA的结合亲和力，相对于已知对于单独改 性最高亲和性增强的5-甲基胞嘧啶(dC5me)的ΔTm为直至18°。另 一方面，螺旋稳定性的增加不损害寡核苷酸的特异性。所述Tm数据表 明与dC5me相比在完全匹配和不匹配序列之间的区别甚至更高。这暗 示所限定的氨基用作附加的氢键给体以与Hoogsteen面，即互补的鸟嘌 呤的O6相互作用，从而形成4个氢键。这意味着G-夹的增加的亲和 性是由扩展的碱基堆积和另外的特定的氢键介导的。
适用于本发明的其它三环杂环化合物和使用它们的方法公开于 2000年5月22日公布的美国专利6,028,183，和1999年12月28日公 布的美国专利6,007,992中，两篇专利的内容都与本申请被共同受让并 以其全部内容并入本文中。这些化合物包括具有下式的那些：

其中R11包括(CH3)2N-(CH2)2-O-、H2N-(CH2)3-、 Ph-CH2-O-C(＝O)-N(H)-(CH2)3-、H2N-、芴基 -CH2-O-C(＝O)-N(H)-(CH2)3-、Phthalimidyl-CH2-O-C(＝O)-N(H)-(CH2)3-、 Ph-CH2-O-C(＝O)-N(H)-(CH2)2-O-、Ph-CH2-O-C(＝O)-N(H)-(CH2)3-O-、 (CH3)2N-N(H)-(CH2)2-O-、芴基-CH2-O-C(＝O)-N(H)-(CH2)2-O-、芴基 -CH2-O-C(＝O)-N(H)-(CH2)3-O-、H2N-(CH2)2-O-CH2-、N3-(CH2)2-O-CH2-、 H2N-(CH2)2-O-和NH2C(＝NH)NH-。
另外公开的有下式的三环杂环化合物：

其中：R10a为O、S或N-CH3；R11a为A(Z)x1，其中A为间隔部分 并且Z独立地为任选结合于可检测标记的标记结合基团，但R11a不是 胺，被保护的胺，硝基或氰基；X1为1、2或3；并且Rb独立地为-CH＝、 -N＝、-C(C1-8烷基)＝或-C(卤素)＝，但没有临近的Rb都为-N＝，或两个临 近的Rb连在一起形成具有如下结构的环：

其中Rc独立地为-CH＝、-N＝、-C(C1-8烷基)＝或-C(卤素)＝，但没有 临近的Rb都为-N＝。
所述吩噁嗪衍生物的增强的结合亲和性与它们未破坏的序列特异 性一起使得它们对于开发更有效的反义基药物而言是有价值的核碱基 类似物。事实上，在体外实验中得到的有前景的数据说明包含吩噁嗪 取代部分的七核苷能够活化RNaseH，增强细胞吸收并显示出增加的反 义活性[Lin，K.-Y.；Matteucci，M.J.Am.Chem.Soc.1998，120， 8531-8532]。所述的活性增强在G夹的情况下甚至更显著，因为单独取 代被说明显著改进20聚体2’-脱氧硫代磷酸寡核苷酸的体外效能 [Flanagan，W.M.；Wolf，J.J.；Olson，P.； Grant，D.；Lin，K.-Y.；Wagner，R. W.；Matteucci，M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，96，3513-3518]。然 而，为了最优化寡核苷酸的设计和为了更好地理解这些杂环改性对生 物活性的影响，评价它们对所述低聚物的核酸酶稳定性的作用是重要 的。
适合于本发明的其它三环和四环杂环化合物包括具有下式的那 些：

其中R14为NO2或者R14和R12二者都独立地为-CH3。这些化合物 的合成公开于1995年7月18日公布的美国专利5,434,257、1996年3 月26日公布的美国专利5,502,177和1997年7月8日公布的美国专利 5,646,269中，其全部内容与苯申请被共同受让并以它们的全部内容并 入本文中。
同样公开于“257、177和269”专利中的适合于本发明的其它三 环杂环化合物包括具有下式的那些，和互变异构体，溶剂合物和其盐：

其中a和b独立地为0或1，其中a和b的和为0或1；A为N、 C或CH；X为S、O、C＝O、NH或NCH2、R6；Y为C＝O；Z与A一 起形成包含5或6个环原子的芳环或杂芳环结构，其中所述杂芳环包 含一个O环杂原子、一个N环杂原子、一个S环杂原子、被碳原子分 开的一个O和一个N环杂原子、被C原子分开的一个S和一个N环杂 原子、被碳原子分开的两个N环杂原子或其中至少2个被碳原子分开 的3个N环杂原子，并且其中所述的芳环或在芳环碳原子未取代以除 H以外的形式，或至少1个非桥接环碳原子取代以R20或＝O；或者Z 与A一起形成包含6个环原子的芳环结构，其中所述芳环碳原子未取 代以除H以外的形式，或至少1个非桥接环碳原子取代以R6或＝O； R6独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、NO2、N(R3)2、CN或 卤素，或R6与临近的Z基团的R6一起形成苯环；R20独立地为H、C1-6 烷基、C2-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、NO2、N(R21)2、CN或卤素，或 R20与临近的R20一起形成包含5或6个环原子的环，和互变异构体， 溶剂合物和其盐；R21独立地为H或保护基团；R3为保护基团或H。
包括在“257、177和269”专利中的碱基的更明确的例子为下式 的化合物：

其中每个R16独立地选自氢和多种取代基团。
其它的具有下式的多环碱基部分公开于2001年11月28日提交的 美国专利申请09/996,292中，其与本申请被共同拥有，并通过引用并 入本文中：

其中A6为O或S；A7为CH2、N-CH3、O或S；每个A8和A9为 氢或A8和A9之一为氢并且另一个A8和A9选自： -O-(CH2)p1-G和

其中G为-CN、-OA10、-SA10、-N(H)A10、-ON(H)A10或 -C(＝NH)N(H)A10；Q1为H、-NHA10、-C(＝O)N(H)A10、-C(＝S)N(H)A10 或-C(＝NH)N(H)A10；每个Q2独立地为H或Pg；A10为H、Pg、取代的 或未取代的C1-C10烷基、乙酰基、苄基、-(CH2)p3NH2、-(CH2)p3N(H)Pg、 D或Lα-氨基酸或衍生于D、L或外消旋α-氨基酸的肽；Pg为氮、氧 或硫醇的保护基；每个p1独立地为2至约6；p2为1至约3；和p3为 1至约4。
糖和糖取代基
所述糖部分：

其中每条虚线(---)指结合于临近磷原子的点，表示如本发明包 括的普通核苷或核苷酸的糖部分。
相应于R’2的合适的2’-取代基包括：OH、F、O-烷基(例如O- 甲基)、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基；O-炔基、S-炔基、 N-炔基；O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可以分别为取代 的或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基或炔基。特别优选的为 O[(CH2)gO]hCH3、O(CH2)gOCH3、O(CH2)gNH2、O(CH2)gCH3、 O(CH2)gONH2和O(CH2)gON[(CH2)gCH3]2，其中g和h为1至约10。其 它优选的寡核苷酸包括在2’位置上的如下一种：C1至C10低级烷基、 取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷 基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、 ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多 烷氨基、取代的甲硅烷基、RNA切断基团、报告基团、嵌入剂、改进 寡核苷酸药物代谢动力学性质的基团，或改进寡核苷酸药物动力学性 质的基团，以及其它具有类似性质的取代基。优选的2’-改性包括2’- 甲氧基乙氧基(2’-O-CH2CH2OCH3，也称为2’-O-(甲氧基乙基)或2’-MOE) (Martin等人，Helv.Chim，Acta，1995，78，486-504)。另外优选的改性 包括2’-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为 2’-DMAOE，如本文后面的实施例中所述的，以及2’-二甲基氨基乙氧 基乙氧基(本领域中还称为2’-O二甲基-氨基-乙氧基-乙基或 2’-DMAEOE)，即2’-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2，同样描述于下文的实施 例中。
其它优选的改性包括2’-甲氧基(2’-O-CH3)，2’-氨基丙氧基 (2’-OCH2CH2CH2NH2)，2’-烯丙基(2’-CH2-CH＝CH2)，2’-O-烯丙 基(2’-O-CH2-CH＝CH2)和2’-氟(2′-F)。所述2’-改性可以在arabino (上)位置或ribo(下)位置。优选的2’-arabino改性为2’-F。类似的 改性还可以在所述寡核苷酸的其它位置上进行，特别是在3’末端核苷 酸上的糖的3’-位置或在2’-5’连接的寡核苷酸和5’末端核苷酸的5’位 置。
其它典型的取代基基团包括式Ia或IIa的基团：

其中Rb为O、S或NH；Rd为单键、O或C(＝O)；Re为C1-C10烷 基，N(Rk)(Rm)、N(Rk)(Rn)、N＝C(Rp)(Rq)、N＝C(Rp)(Rr)或具有式IIIa：

每个Rs、Rt、Ru和Rv独立地为氢、C(O)Rw，取代或未取代的C1-C10 烷基，取代或未取代的C2-C10烯基，取代或未取代的C2-C10炔基，烷 基磺酰基、芳基磺酰基，化学官能团或结合基团，其中所述取代基选 自羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧 基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基；或任选地，Ru和Rv与它们所连 接的氮原子一起形成邻苯二甲酰亚氨基部分；每个Rw独立地为取代的 和未取代的C1-C10烷基，三氟甲基、氰基乙氧基、甲氧基、乙氧基、 叔丁氧基、烯丙基氧基、9-芴基甲氧基、2-(三甲基甲硅烷基)-乙氧基、 2，2，2-三氯乙氧基、苄氧基、丁酰基、异丁酰基、苯基或芳基；Rk为氢、 氮的保护基团或-Rx-Ry；Rp为氢、氮的保护基团或-Rx-Ry；Rx为键或连 接部分；Ry为化学官能团、结合基团或固体载体介质介质；每个Rm和 Rn独立地为H、氮的保护基团、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或 未取代的C2-C10烯基、取代或未取代C2-C10炔基，其中所述取代基选 自羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧 基、卤素、烷基、芳基、烯基、炔基；NH3 +，N(Ru)(Rv)，胍基和酰基， 其中所述酰基为酸的酰胺或酯；或者Rm和Rn一起是氮的保护基团， 它们连接于任选包括选自N和O的附加的杂原子的环结构中，或者是 化学官能团；Ri为ORz、SRz或N(Rz)2；每个Rz独立地为H、C1-C8烷 基、C1-C8卤代烷基、C(＝NH)N(H)Ru、C(＝O)N(H)Ru或OC(＝O)N(H)Ru； Rf、Rg和Rh包含具有约4至约7个碳原子或具有约3至约6个碳原子 和1或2个杂原子的环体系，其中所述的杂原子选自氧、氮和硫，并 且其中所述的环体系为脂肪族的、不饱和脂肪族的、芳香族的、或饱 和或不饱和的杂环；
Ri为具有1至约10个碳原子的烷基或卤代烷基、具有2至约10 个碳原子的烯基、具有2至约10个碳原子的炔基、具有6至约14个 碳原子的芳基、N(Rk)(Rm)ORk、卤素、SRk或CN；ma为1至约10； 每个mb独立地为0或1；mc为0或1至10的整数；md为1至10的 整数；me为0、1或2；并且如果mc为0，则md大于1。
式I的典型取代基公开于美国专利6,172,209中。式II的典型环状 取代基公开于美国专利6,271,358中。
特别有用的糖取代基包括O[(CH2)gO]hCH3、O(CH2)gOCH3、 O(CH2)gNH2、O(CH2)gCH3、O(CH2)gONH2和O(CH2)gON[(CH2)gCH3)]2， 其中g和h为1至约10。
一些特别有用的本发明的低聚化合物包含至少一种具有一种如下 取代基的核苷：C1至C10低级烷基，取代的低级烷基，烷芳基，芳烷基， O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、 SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、 氨基烷基烷基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切断基团、报告 基团、嵌入剂、用于改进低聚化合物药物代谢动力学性质的基团、用 于改进低聚化合物药物动力学性质的基团，以及具有类似性质的其它 取代基。优选的改性包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O-CH2CH2OCH3，也称为 2’-O-(甲氧基乙基)或2’-MOE)(Martin等人，Helv.Chim，Acta，1995，78， 486)，即，烷氧基烷氧基基团。另外优选的改性为2’-二甲基氨基氧基 乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2’-DMAOE。典型的氨基 氧基取代基描述于共同拥有的1999年6月25日提交的，名称为 “Aminooxy-Functionalized Oligomers”的美国专利申请09/344,260中； 和1999年8月9日提交的，名称为“Aminooxy-Functionalized Oligomers and Methods for Making Same”的美国专利申请09/370,541中；通过引 用以其全文并入本文中。
其它特别有利的2’-改性包括2’-甲氧基(2’-O-CH3)、2’-氨基丙 氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)和2’-氟(2’-F)。类似的改性还可以在核 苷和低聚物的其它位置处进行，特别是在3’末端核苷上的糖的3’-位置 或在核苷的3’-位置，其具有从2’-位置的键，例如2’-5’连接的低聚物 和在5’-末端核苷的5’位置。低聚物还可以具有糖类似物，例如替代异 戊烯呋喃糖(pentofuranosyl sugar)的环丁基部分。教导制备这些改性 的糖结构的典型的美国专利包括但不限于美国专利4,981,957、
5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、 5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、 5,610,300、5,627,0531 5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633和 5,700,920，这些专利中的某些是共同拥有的，并且每篇专利都通过引 用并入本文中，以及共同拥有的1995年6月5日提交的美国专利申请 08/468,037，其也通过应用并入本文中。
式III和IV所示的典型的胍基取代基基团公开于共同拥有的1999 年7月7日提交的，2002年10月23日上交公布费的名称为 “Functionalized Oligomers”的美国专利申请09/034,040中。
典型的乙酰氨基取代基公开于美国专利6,147,200中，其通过引用 并入本文中。典型的二甲基氨基乙基氧基乙基取代基公开于1999年8 月6日提交的名称为“2′-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-Modified Oligonucleotides”的国际专利申请PCT/US99/17895中，其通过引用以 其全文并入本文中。对于那些包括异戊烯呋喃糖的核苷，磷酸酯基团 可连接于该糖的2’，3’或5’羟基部分的任一个。在形成寡核苷酸中， 所述磷酸酯基团将彼此临近的核苷彼此共价连接以形成线性聚合物。 该线性聚合结构的两端可通过杂化或通过形成共价键连接以形成环状 结构，然而，通常优选开放的线性结构。在所述寡核苷酸结构中，磷 酸酯基团通常被认为形成所述寡核苷酸的核苷间键合。RNA和DNA 的正常核苷间键合为3’至5’磷酸二酯键。
尽管本发明可适合于制备用于任何需要的最终用途的寡核苷酸 (例如对于我们在聚合酶链反应中的探针)，所述寡核苷酸的一个优 选的用途为反义治疗。经常用于反义治疗的作用的一种模式为所谓的 RNAse H机制，从而将DNA的链引入细胞中，在那里该DNA和RNA 的链杂化。该DNA-RNA杂化体通过切断RNA链的内切核酸酶，RNAse H识别。在一般情况下，所述RNA链为信使RNA(mRNA)，其在被 切断后，不能转译成相应的在核糖体中的肽和蛋白质序列。以此方式， DNA可用作调节某些基因表达的试剂。
已经发现通过将短段DNA并入到寡核苷酸中，所述RNAse H机 制可有效用于调节目标肽和蛋白质的表达。在本发明的一些实施方案 中，并入一段DNA和一段RNA或2’-改性的RNA的寡核苷酸可用于 有效调节基因表达。在优选的实施方案中，所述寡核苷酸包含由两段2’- 改性的RNA侧面相接形成的DNA段。优选的2’-改性包括如本文中所 述的2’-MOE。
所述核糖部分也已经被广泛研究以评价相对于未改性的寡核苷 酸，其改性所具有的对寡核苷酸的性质的作用。所述糖部分的2’-位置 为所研究的用于改性的最重要的位点之一。一些2’-取代基基团已经被 说明增加了亲脂性以及增强了例如对目标RNA的结合亲和性的性质， 寡核苷酸的化学稳定性和对核酸酶的耐受性。显示增强的结合亲和性 的在2’-位置处的许多改性同样也将所述糖的环强迫成C3-内式构象。
RNA以已经被命名为“A形式”几何学形式存在，而DNA以“B 形式”几何学形式存在。通常，RNA:DNA双链体是更稳定的，或具有 比DNA:DNA双链体更高的熔融温度(Tm)(Sanger等人，Principles of Nucleic Acid Structure，1984，Springer-Verlag；New York，NY.；Lesnik等 人，Biochemistry，1995，34，10807-10815；Conte等人，Nucleic Acids Res.， 1997，25，2627-2634)。RNA增加的稳定性已经归结于数种结构特征， 最显著地是由A形式几何学导致的碱基堆积作用的改进(Searle等人， Nucleic Acids Res.，1993，21，2051-2056)。在RNA中2’羟基的存在使 所述糖偏向C3’内式折叠，即也指定为Northern折叠，其导致所述双链 体有利于形成A形式几何学。另一方面，脱氧核酸优选C2’内式糖折 叠，即还称为Southern折叠，其被认为赋予较不稳定的B形式几何学 (Sanger，W.(1984)Principles of Nucleic Acid Structure，Springer- Verlag，New York，NY)。另外，RNA的2’羟基可形成通过氢键介导的 水的网络，该网络帮助稳定所述RNA双链体(Egli等人，Biochemistry， 1996，35，8489-8494)。
然而，DNA:RNA杂化双链体通常比纯RNA:RNA双链体较不稳 定，并且取决于它们的序列可以比DNA:RNA双链体更稳定或更不稳 定(Searle等人，Nucleic Acids Res.，1993，21，2051-2056)。杂化双链体 的结构位于A-和B-形式几何学之间；其可导致弱的堆积作用(Lane 等人，Eur.J.Biochem.，1993，215，297-306；Fedoroff等人，J.Mol.Biol.， 1993，233，509-523；Gonzalez等人，Biochemistry，1995，34，4969-4982； Horton等人，J.Mol.Biol.，1996，364，521-533)。DNA:RNA杂化体的稳 定性对于反义治疗是重要的，因为所述机制需要将改性的DNA链结合 到mRNA链。为了有效抑制所述mRNA，所述反义DNA应具有非常 高的与mRNA的结合亲和性。否则在DNA和目标RNA链之间的相互 作用将很少发生，从而降低了所述反义寡核苷酸的效能。
已经有人提出多种合成改性以增加对核酸酶的耐受性，或增强所 述反义链对于其目标mRNA的亲和性(Crooke等人，Med.Res.Rev.， 1996，16，319-344；De Mesmaeker等人，Ace.Chem.Res.，1995，28， 366-374)。已经研究了很多改性的含有磷的键在寡核苷酸中作为对于 天然的、易于切断的磷酸二酯的替代物。通常，它们的大部分，例如 硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸酯和二硫代磷酸酯，均导致寡核苷酸 具有对互补的目标物的降低的结合性并降低杂化稳定性。
RNA以已经被命名为“A形式”几何学形式存在，而DNA以“B 形式”几何学形式存在。通常，RNA:DNA双链体是更稳定的，或具有 比DNA:DNA双链体更高的熔融温度(Tm)(Sanger等人，Principles of Nucleic Acid Structure，1984，Springer-Verlag；New York，NY.；Lesnik等 人，Biochemistry，1995，34，10807-10815；Conte等人，Nucleic Acids Res.， 1997，25，2627-2634)。RNA增加的稳定性已经归结于数种结构特征， 最显著地是由A形式几何学导致的碱基堆积作用的改进(Searle等人， Nucleic Acids Res.，1993，21，2051-2056)。在RNA中2＝羟基的存在使 所述糖偏向C3＝内式折叠，即也指定为Northern折叠，其导致所述双 链体有利于形成A形式几何学。另一方面，脱氧核酸优选C2’内式糖 折叠，即还称为Southern折叠，其被认为赋予较不稳定的B形式几何 学(Sanger，W.(1984)Principles of Nucleic Acid Structure，Springer- Verlag，New York，NY)。另外，RNA的2＝羟基可形成通过氢键介导 的水的网络，该网络帮助稳定所述RNA双链体(Egli等人，Biochemistry， 1996，35，8489-8494)。
然而，DNA:RNA杂化双链体通常比纯RNA:RNA双链体较不稳 定，并且取决于它们的序列可以比DNA:RNA双链体更稳定或更不稳 定(Searle等人，Nucleic Acids Res.，1993，21，2051-2056)。杂化双链体 的结构位于A-和B-形式几何学之间；其可导致弱的堆积作用(Lane 等人，Eur.J.Biochem.，1993，215，297-306；Fedoroff等人，J.Mol.Biol.， 1993，233，509-523；Gonzalez等人，Biochemistry，1995，34，4969-4982； Horton等人，J.Mol.Biol.，1996，264，521-533)。DNA:RNA杂化体的稳 定性是反义治疗的重要方面，因为所提出的机制需要将改性的DNA链 结合到mRNA链。理想地，所述反义DNA应具有非常高的与mRNA 的结合亲和性。否则在DNA和目标RNA链之间的相互作用将很少发 生，从而降低了所述反义寡核苷酸的效能。
赋予增加的对核酸酶的耐受性和对核苷酸非常高的结合亲和性的 一种合成的2’-改性为2＝-甲氧基乙氧基(MOE，2’-OCH2CH2OCH3) 侧链(Baker等人.，J.Biol.Chem.，1997，272，11944-12000；Freier等人， Nucleic Acids Res.，1997，25，4429-4443)。MOE取代的一个直接的优点 为结合亲和性的改进，其大于许多类似的2’-改性，例如O-甲基、O- 丙基和O-氨基丙基(Freier和Altmann，Nucleic Acids Research，(1997) 25：4429-4443)。2＝-O-甲氧基乙基取代的寡核苷酸还已经被说明为对 于体内应用具有有前途的特征的基因表达的反义抑制剂(Martin，P.， Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504；Altmann等人，Chimia，1996，50， 168-176；Altmann等人，Biochem.Soc.Trans.，1996，24，630-637；和 Altmann等人，Nucleosides Nucleotides，1997，16，917-926)。关于DNA， 它们显示出改进的RNA亲和性和较高的核酸酶耐受性。具有2＝-O-甲 氧基乙基核糖核苷翼和中心的DNA-硫代磷酸酯窗的嵌合的寡核苷酸 还已经被说明在动物模型中在低剂量下有效地降低了肿瘤的生长。 MOE取代的寡核苷酸已经显示出突出的作为在数种疾病状态中的反义 剂的前景。一种这样的MOE取代的寡核苷酸目前正在临床试验中被研 究用于治疗CMV视网膜炎。
LNA(其中2’和4’位置通过桥接相连的寡核苷酸)也与互补的具 有高的热亲和性的DNA、RNA或LNA形成双链体。圆二色性(CD) 光谱说明包含全改性的LNA的双链体(例如，LNA:RNA)结构上类似 于A形式的RNA:RNA双链体。LNA:DNA双链体的核磁共振(NMR) 检测确定了LNA单体的3’-内式构象。双链DNA的识别也已经被证明 暗示了由LNA的链侵入。失配序列的研究说明LNA遵从Watson-Crick 碱基配对原则，具有比相应的未改性的参比链通常改进的选择性。
LNA，其中2’-羟基连接到所述糖环的4’碳原子上从而形成 2′-C，4′-C-氧基亚甲基键，从而形成双环糖部分。所述键可以是桥接2’ 氧原子和4’碳原子的methelyne(-CH2-)n基团，其中n为1或2(Singh 等人.，Chem.Commun.，1998，4，455-456)。LNA和LNA类似物显示出 与互补的DNA和RNA非常高的双链体热稳定性(Tm＝+3至+10C)， 对3’-外式溶核降解的稳定性，以及良好的稳定性。其它优选的桥接基 团包括2’-脱氧-2’-CH2OCH2-4’桥接。
备选的连接部分
除了磷酸二酯和硫代磷酸二酯键，其它的连接部分在本领域中是 已知的。尽管本发明首先涉及的必须与磷酸二酯和硫代磷酸二酯寡核 苷酸有关系，但如在下文中进一步详细描述的具有多于一种类型的键 的嵌入式化合物，以及具有不是磷酸二酯/硫代磷酸二酯的键的低聚物 也以总体上或部分地落入本发明的范围内。
本领域技术人员知晓的典型的不是磷酸二酯/硫代磷酸二酯的键 包括：二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，膦酸甲酯和膦 酸其它烷基酯包括膦酸3’-亚烷基酯、膦酸5’-亚烷基酯和手性的膦酸 酯，亚膦酸酯，氨基磷酸酯包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷 酸酯，硫逐氨基磷酸酯，硫逐烷基-膦酸酯，硫逐烷基磷酸三酯，硒代 磷酸酯和硼代磷酸酯。其它的键包括：硫代二酯(-O-C(O)-S-)、硫逐 氨基甲酸酯(-O-C(O)(NJ)-S-)、硅氧烷(-O-Si(J)2-O-)、氨基甲酸酯 (-O-C(O)-NH-和-NH-C(O)-O-)、氨基磺酸酯(-O-S(O)(O)-N-和 -N-S(O)(O)-N-)、吗啉代氨基磺酸酯(-O-S(O)(N(吗啉代)-)、氨磺酰 (-O-SO2-NH-)、硫化物(-CH2-S-CH2-)、磺酸酯(-O-SO2-CH2-) N，N’-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)、硫甲缩醛(-S-CH2-O-)、 甲缩醛(-O-CH2-O-)、硫代缩酮(-S-C(J)2-O-)、缩酮(-O-C(J)2-O-)、 胺(-NH-CH2-CH2-)、羟胺(-CH2-N(J)-O-)、羟亚胺(-CH＝N-O-) 和肼基(hydrazinyl)(-CH2-N(H)-N(H)-)。
在每种上述关于寡核苷酸键的结构中，J指取代基，该取代基通常 为氢或烷基或从一种类型的键变化到另一种类型的键的复合基团。
除了涉及天然存在的键的-O-P-O-原子的改性或替代的如上所述 的连接基团以外，在本发明的范围内还包括如下连接基团，其包括5’- 亚甲基基团以及一个或多个-O-P-O-原子的改性。这种类型的键在现有 技术中有很好地记载并包括但不限于：酰胺(-CH2-CH2-N(H)-C(O))和 -CH2-O-N＝CH-；以及烷基磷((-C(J)2-P(＝O)(OJ)-C(J)2-C(J)2-)。J为如 上所定义的。
寡核苷酸的合成
寡核苷酸通常如上所述在载体介质，例如固体载体介质上制备。 通常，将第一合成子(例如单体，如核苷)首先连结到载体介质上， 并且然后通过将单体顺序结合到载体结合的合成子上而合成寡核苷 酸。该重复地伸长最终导致最终的低聚化合物或其它聚合物，如多肽。 合适的载体介质可以是可溶的或不可溶的，或者可以具有在不同溶剂 中可变的溶解性以所述增长的载体结合聚合物随需要在溶液中溶解或 析出。传统的载体介质，如固体载体介质大部分是不可溶的并且通常 放置于反应容器中，而试剂和溶剂与增长的链反应和或洗涤该增长的 链直至所述低聚物达到目标长度，之后将其从所述载体上切下，并且 如果需要，进一步建立以产生最终的聚合物。最近的方法已经引入可 溶的载体，包括可溶的聚合物载体以在合成中在需要的点沉淀和溶解 所述重复的合成产品(Gravert等人.，Chem.Rev.，1997，97，489-510)。
术语“载体介质”意于包括所有本领域技术人员已知的用于合成 低聚化合物和相关的化合物如肽的载体形式。适用于本发明方法的一 些典型的载体形式包括但不限于如下物质：可控孔度玻璃(CPG)；可 控草酰基多孔玻璃(参见例如Alul，等人.，Nucleic Acids Research 1991， 19，1527)；含二氧化硅的粒子，例如多孔玻璃珠和硅胶，如通过三氯 -[3-(4-氯甲基)苯基]丙基硅烷和多孔玻璃珠的反应而形成的(参见Parr 和Grohmann，Angew.Chem.Internal.Ed.1972，11，314，由Waters Associates，Framingham，Mass.，USA以商标名为“PORASIL E”出售)； 1，4-二羟基甲基苯的单酯和二氧化硅(参见Bayer和Jung，Tetrahedron Lett，1970，4503，sold under the trademark″BIOPAK″由Waters Associates以商标名为“BIOPAK”出售)；TENTAGEL(参见例如 Wright等人.，Tetrahedron Letters 1993，34，3373)；交联苯乙烯/二乙烯 基苯共聚物珠状基质或POROS，聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物(得自 Perceptive Biosystems)；可溶性载体介质，聚乙二醇PEG(参见Bonora 等人.，Organic Process Research & Development，2000，4，225-231)。
适用于本发明的其它载体介质包括但不限于PEPS载体，具有附 属长链聚苯乙烯(PS)接枝的聚乙烯(PE)膜(分子量在106量级(参 见Berg，等人，J.Am.Chem.Soc，1989，111，8024和国际专利申请WO 90/02749)，)。该膜的负载能力与具有适应同时多种合成的附加灵活 性的珠状介质一样高。所述PEPS膜可以是分离的、标记的片的形式， 每个片用作单独的单元。在合成循环的所有相同步骤中，所述片在一 个反应容器中保持在一起以同时制备大量的肽，速率接近于通过常规 方法制备单独肽的速率。同样，采用PEPS聚合物其它几何形式的实验， 例如无纺毡、针织网、棍或微孔板还没有说明任何合成效能的限制。
适用于本发明的其它载体介质包括但不限于基于与N，N′-二丙烯 酰基乙二胺交联的二甲基丙烯酰胺的共聚物的粒子，其包括已知量的 N-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基-N’-丙烯酰基六亚甲基二胺。几种间隔分 子通常通过β-丙氨酰基基团，随后通过氨基酸残基子单元加上。同样， 包含β-丙氨酰基的单体在聚合形成树脂珠的过程中可用丙烯酰 safcosine单体替代。聚合后，进行所述珠与乙二胺的反应以形成包含 作为共价连接官能团的一级胺的树脂粒子。所述基于聚丙烯酰胺的载 体比基于聚苯乙烯的载体亲水性更强并通常与包括二甲基甲酰胺、二 甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等的极性疏质子溶剂一起使用。(参见 Atherton，等人，J.Am.Chem.Soc，1975，97，6584，Bioorg.Chem.1979，8， 351，和J.C.S.Perkin I 538(1981))。
适用于本发明的另外的载体介质包括但不限于树脂和也对所用的 有机合成反应条件充分惰性的其它材料的复合材料。一种典型的复合 材料(参见Scott，等人，J.Chrom.Sci.，1971，9，577)利用包含反应性氯 甲基基团的疏水交联苯乙烯聚合物涂覆的玻璃颗粒，并由Northgate Laboratories，Inc.，of Hamden，Conn.，USA提供。另一种典型的复合体包 含在其上已经接枝有聚苯乙烯的氟化的乙烯聚合物的核心(参见Kent 和Merrifield，Israeli Chem.1978，17，243和van Rietschoten在Peptides 1974，Y.Wolman，编，Wiley and Sons，New York，1975，的113-116页 中)。不是PEPS的接触的固体载体介质，如棉制片(Lebl和Eichler， Peptide Res.1989，2，232)和羟基丙基丙烯酸酯涂覆的聚丙烯膜(Daniels， 等人，Tetrahedron Lett.1989，4345)。为固定增长的肽链和为进行所述 间隔化的合成的丙烯酸接枝的聚乙烯棒和96微孔板。(Geysen，等人， Proc.Natl.Acad.ScL USA，1984，81，3998)。包含常规使用的聚合物珠 的“茶叶袋”(Houghten，Proc.Natl.Acad.ScL USA，1985，82，5131)。 具有不同密度的两种不同载体的同时使用(Tregear，Chemistry and Biology of Peptides，J.Meienhofer，编，Ann Arbor Sci.Publ.，Ann Arbor， 1972第175-178页)。通过支管，反应容器的组合(Gorman，Anal. Biochem.，1984，136，397)。多层柱固相合成(例如，Krchnak等人.，Int. J.Peptide Protein Res.，1989，33，209)，和Holm和Meldal，在 “Proceedings of the 20th European Peptide Symposium”中，G.Jung和 E.Bayer，编，Walter de Gruyter & Co.，Berlin，1989第208-210页)。纤 维素纸(Eichler，等人.，Collect.Czech.Chem.Commun.，1989，54，1746)。 介导肽的合成的载体也已有报道(参见Synthetic Peptides：A User′s Guide，Gregory A.Grant，编  Oxford University Press 1992； US-A-4,415,732；4,458,066；4,500,707；4,668,777；4,973,679；5,132,418； 4,725,677和Re-34,069)。
载体结合寡核苷酸的合成依赖于核苷酸到增长中的链的一个末端 的顺序加成。典型地，将第一核苷(在存在的任何环外胺官能团上具 有保护基)连接到适当的玻璃珠载体上并且将活化的亚磷酸酯化合物 (典型地为也带有适当保护基团的核苷酸亚磷酰胺)逐步加成以延长 增长的寡核苷酸。用于固相合成的另外的方法可见于Caruthers的美国 专利4,415,732、4,458,066、4,500,707、4,668,777、4,973,679和5,132,418； 和Kster的美国专利4,725,677和Re-34,069。
常规用于基于载体介质的低聚化合物和相关化合物的合成的市售 装置由包括例如Applied Biosystems(Foster City，CA)的数家卖主出售。 本领域已知的用于所述合成的任何其它设备可另外或备选采用。适当 的固相合成技术，包括自动合成技术描述于F.Eckstein(编)， Oligonucleotides and Analogues，a Practical Approach，Oxford University Press，New York(1991)中。
通常，所述磷保护基团(pg)为具有可β-消除的式-CH2CH2-Gw的 基团的烷氧基或烷基硫基或O或S，其中，Gw为拉电子基团。适用于 在本发明中使用的Pg的合适的例子包括阐述于Caruthers的美国专利 4,415,732、4,458,066、4,500,707、4,668,777、4,973,679和5,132,418； 和Kster的美国专利4,725,677和Re-34,069中的那些。通常，优选拉 烷基或氰基乙基的基团，因为市售的亚磷酰胺通常并入甲基或氰基乙 基磷保护基团。
除去pg的方法取决于待被除去的具体的pg。可β-消除的基团， 例如公开于Kster等人的专利中的那些通常在弱碱性溶液中除去，其 中提取酸性的β-氢并且通过重排消除-CH2CH2-Gw基团以形成相应的 acrylo-化合物-CH2＝CH2-Gw。相反，烷基基团通常通过在该烷基的α- 碳上亲核进攻而除去。这些pg描述于如本文中所引用的Caruthers等人 的专利中。
本领域技术人员将认识到P(III)到P(V)的氧化可通过多种试剂进 行。另外，本领域技术人员将认识到P(V)物质可存在为磷酸三酯，硫 代磷酸二酯或二硫代磷酸二酯。每种类型的P(V)键具有如本文中所述 的用途和优点。因此，术语“氧化剂”应当被广义的理解为能将P(III) 物质(例如亚磷酸酯)转化为P(V)物质的任何试剂。因此术语“氧化 剂”包括“硫化剂”，其与“硫杂化试剂”具有相同的含义。氧化， 除非另外被修饰，指引入氧或硫，伴随着P氧化态从III至V的增加。 如果重点指出氧化剂向P(III)物质引入氧而形成P(V)物质，所述氧化剂 将在本文中被称为“氧引入氧化剂”。
在亚磷酰胺方案下用于制备磷酸二酯键的氧化剂(即氧引入氧化 剂)已经由例如本文中引用的Caruthers等人和Kster等人描述。已经 用于合成包含硫代磷酸酯键的寡核苷酸的硫化剂的例子包括硫元素、 二苯甲酰四硫化物、3-H-1，2-苯并二硫醇-3-酮-1，1-二氧化物(也称为 Beaucage试剂)、四乙基秋兰姆二硫化物(TETD)和双(O，O-二异丙 氧基硫膦基)二硫化物(称为Stec试剂)。用于制备硫代磷酸二酯键的 氧化剂包括苯基乙酰基二硫化物(PADS)，如由Cole等人在美国专利 6,242,591中所描述的。在本发明的一些实施方案中，所述硫代磷酸二 酯和磷酸二酯键可在糖子单元间交替。在本发明的另一些实施方案中， 可单独采用硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，所述硫杂化剂可以是 二秋兰姆二硫化物。参见公开了一些适当二秋兰姆二硫化物的US 5,166,387。已经令人惊奇地发现一种二秋兰姆二硫化物可以与标准封 端试剂一起使用，使得封端和氧化可在同一步骤中进行。这与标准氧 化剂，例如Beaucage试剂形成对比，标准氧化剂需要使封端和氧化在 分离的步骤中进行，在两个步骤之间通常包括柱洗涤。
5’-保护基团bg或T’为正交于用于保护核碱基的保护基团的保护 基团，并且如果适合同样正交于2’-O-保护基团以及正交于连接于固体 载体介质的3’-连接部分。在本发明的一些实施方案中，所述5’-保护基 团是酸不稳定的。在本发明的一些实施方案中，所述5’-保护基团选自 任选取代的三苯甲基基团和任选取代的pixyl基团。在一些实施方案中 所述pixyl基团取代以一个或多个选自烷基、烷氧基、卤素、烯基和炔 基的取代基。在一些实施方案中，所述三苯甲基取代以约1至约3个 烷氧基，特别是约1至约3个甲氧基。在本发明具体的实施方案中， 所述三苯甲基在4-和(如果适用)4’-位置取代以1或2个甲氧基。特 别可接受的三苯甲基为4，4′-二甲氧基三苯甲基(DMT或DMTr)。
在本发明的上下文中，术语“试剂推动”具有如下含义：基本上 没有任何活性物质(即试剂、活化剂、副产物或不是溶剂的其它物质) 的溶剂的量，该溶剂的量被引入到柱子中用于如下目的并具有如下作 用：推动试剂溶液到随后试剂溶液的柱头上并通过它。试剂推动不需 要整个柱体积，尽管在一些情况下，它可包括一个或多个柱体积。在 一些实施方案中，溶剂推动包括至少从由用于即刻随后合成步骤的试 剂溶液形成的柱的刚好的前头的横截面充分清除试剂、副产物和/或活 化剂所需要的最小体积。如果在柱的横截面中(随后的试剂溶液前锋 所处的位置)的化合物的浓度低到足以基本上不影响随后试剂溶液的 活性，则活性化合物，无论是试剂、副产物或活化剂被完全清除了。 本领域技术人员将认识到“试剂推动”所需的溶剂的体积将取决于溶 剂、溶剂中试剂的稳定性、副产物等，即在柱上，试剂、活化剂、副 产物等的量，即从柱中待清除的量而变化。在本领域技术人员的技能 范围内考虑选择对于每种试剂推动的适当的量，特别用根据如下实施 例的观点。
如本文中所用的，除非“柱洗”被另外修饰，其具有与“试剂推 动”相同的含义。在本发明的一些实施方案中，柱洗可意味至少一个 柱体积被允许在随后的试剂溶液应用到柱之前通过该柱。如果柱洗的 柱体积(CV)是明确的，这说明等于解包装的柱的内部体积的溶剂体 积用于所述柱洗。
在本发明的上下文中，洗涤溶剂为基本上不包含在合成步骤之间 施用于柱的活性化合物的溶剂。“洗涤步骤”为其中洗涤溶剂施加到 柱上的步骤。“试剂推动”和“柱洗”都包括在“洗涤步骤”的定义 范围内。
洗涤溶剂可以是纯化学化合物或化学化合物的混合物，所述溶剂 可溶解活性化合物。
在本发明的一些实施方案中，在一次洗涤步骤中使用的洗涤溶剂 可包含一定百分比但不超过50v/v％的乙腈。
封端和氧化步骤的顺序如果需要可以调换。即封端可以先于或后 于氧化。同样，选择合适的硫杂化剂，氧化和封端步骤可合并在一个 步骤中。例如，已经令人惊奇地发现，用乙酸酐封端可在N，N’-二甲基 二秋兰姆二硫化物的存在下进行。
多种溶剂可用于所述氧化反应。合适的溶剂为在本文中引用的 Caruthers等人和Kster等人的专利中确定的。Cole等人的专利描述了 乙腈作为苯基乙酰基二硫化物的溶剂。其它合适的溶剂包括甲苯、呫 吨、二氯甲烷等。
用于从载体上切下寡核苷酸的试剂阐述于在例如本文中引用的 Caruthers等人和Kster等人的专利中。当磷保护基团为O-CH2CH2CN 时，在烷基化的胺例如三乙胺的存在下，切断包含胸苷(T)的核苷酸 被认为是良好的实践，因为现在已知的避免了氰基-乙基化的胸苷核苷 酸(CNET)的产生。CNET加成物的避免总体上描述于美国专利 6,465,628中，该专利通过引用并入本文中，并尤其是在20-30栏的实 施例中，这部分通过引用明确并入本文中。
所述寡核苷酸可通过本领域已知的标准步骤建立，例如通过体积 排阻色谱、高效液相色谱(例如反相HPLC)、示差沉淀等。在本发明 的一些实施方案中，所述寡核苷酸被从固体载体介质上切下，而5’-羟 基保护基仍在最终的核苷上。这种所谓的带有DMT(或带有三苯甲基) 的寡核苷酸然后进行色谱分析，之后通过在有机酸中处理除去所述 DMT基团，之后将该寡核苷酸脱盐并进一步纯化形成最终的产物。
所述5’-羟基保护基可以是在适当条件下可选择性除去的任何基 团。具体而言，4，4′-二甲氧基三苯甲基(DMT)基团是用于在5’-位置 保护的有利的基团，因为它易于在酸性条件下(例如在二氯乙酸 (DCA)、三氯乙酸(TCA)或乙酸存在下)被切下。从所述载体结 合寡核苷酸上除去DMT通常与DCA(例如在适当溶剂中的约3至约 10％(v/v)的DCA)一起进行。从所述载体上切下后寡核苷酸的除去通 常与乙酸一起进行。
如本文中所述的，寡核苷酸可与其它低聚部分一起制备为嵌合体。 在本发明的上下文中，术语“低聚化合物”指能够杂化核酸分子一段 区域的聚合结构，并且“低聚部分”为所述低聚物的一部分。低聚化 合物包括寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、改性的寡核苷酸和拟 寡核苷酸。低聚物可以是线性或环状的，并可以包含支化。它们可以 是单链或双链，并且当是双链时，可包括垂悬物。通常低聚化合物包 含连接的单体子单元的骨架，其中每个连接的单体子单元直接或键接 结合于杂环碱基部分。连接所述单体子单元的，所述单体子单元和杂 环碱基部分的键可以在结构上不同，该结构引起多种基序用于形成低 聚化合物，包括hemimers、gapmers和嵌合体。如本领域已知的，核苷 是碱基-糖的组合。所述核苷的碱基部分通常是杂环碱基部分。这种杂 环碱基的两种最常见的类别是嘌呤和嘧啶。在本发明的上下文中，术 语“寡核苷”指通过不具有磷原子的核苷间键合连接的核苷。这中类 型的核苷间键合包括短链烷基、环烷基、混合杂原子烷基、混合杂原 子环烷基、一种或多种短链杂原子和一种或多种短链杂环。这些核苷 间键合包括但不限于硅氧烷、硫化物、亚砜、砜、乙酰基、formacetyl、 硫代formacetyl、亚甲基formacetyl、硫代formacetyl、链烯基、氨基磺 酸；亚甲基亚胺，亚甲基肼基，磺酸酯，磺酰胺，酰胺和其它具有混 合N、O、S和CH2的构件部分的键合。
用于合成上述取代核苷间键合的合成方案公开于美国专利 5,466,677、5,034,506、5,124,047、5,278,302、5,321,131、5,519,126、 4,469,863、5,455,233、5,214,134、5,470,967、5,434,257中。涉及核苷 间键合的其它的骨架信息可见于WO 91/08213；WO 90/15065；WO 91/15500；WO 92/20822；WO 92/20823；WO 91/15500；WO 89/12060；EP 216860；PCT/US 92/04294；PCT/US 90/03138；PCT/US 91/06855； PCT/US 92/03385；PCT/US 91/03680；美国申请07/990,848；07,892,902； 07/806,710；07/763,130；07/690,786；Stirchak，E.P.，等人.，Nucleic Acid Res.，1989，17，6129-6141；Hewitt，J.M.，等人.，1992，11，1661-1666；Sood， A.，等人.，J.Am.Chem.Soc，1990，112，9000-9001；Vaseur，JJ.等人.，J. Amer.Chem.Soc，1992，114，4006-4007；Musichi，B.，等人.，J.Org. Chem.，1990，55，4231-4233；Reynolds，R.C.，等人.，J.Org.Chem.，1992， 57，2983-2985；Mertes，M.P.，等人.，J.Med.Chem.，1969，12，154-157； Mungall，W.S.，等人.，J.Org.Chem.，1977，42，703-706；Stirchak，E.P.，等 人.，J.Org.Chem.，1987，52，4202-4206；Coull，J.M.，等人.，Tet.Lett.， 1987，28，745；and Wang，H.，等人.，Tet.Lett.，1991，32，7385-7388。
用于合成寡核苷酸的亚磷酰胺得自多种商业来源(包括Glen Research，Sterling，Virginia；Amersham Pharmacia Biotech Inc.， Piscataway，New Jersey；Cruachem Inc.，Aston，Pennsylvania；Chemgenes Corporation，Waltham，Massachusetts；Proligo LLC，Boulder，Colorado； PE Biosystems，Foster City California；Beckman Coulter Inc.，Fullerton， California)。这些商业来源销售高纯度的亚磷酰胺，其通常具有好于 98％的纯度。对于所有出售的亚磷酰胺未通过板纯度(board purity)的 那些，在大部分情况下将包括用每购买的批的分析，给出至少购买的 具体亚磷酰胺的纯度。准备市售的亚磷酰胺用于大部分自动DNA合成， 并且同样准备用于直接用于合成需要序列的寡核苷酸的中间体的制 备。亚磷酰胺可通过由Caruthers等人(US 4,415,732、4,458,066、 4,500,707、4,668,777、4,973,679和5,132,418)和Kster等人(US RE 34,069)公开的方法制备。
双链寡核苷酸，例如双链RNA，可通过本文中所述的本发明的方 法制备。在RNA合成的情况下，必须用合适的可除去保护基团保护所 述亚磷酰胺试剂的2’-OH。2’-OH的合适的保护基团描述于美国专利 6,008,400、6,111,086和5,889,136中。用于RNA合成特别适合的2’- 保护基为如US 6,111,086中描述的ACE保护基。在一些实施方案中， 使用用于在RNA合成中所用的亚磷酰胺的不同的5’-保护基被认为是 有利的。合适的5’-保护基阐述于US 6,008,400中。特别适合的5’-保护 基为如在US 6,008,400中教导的三甲基硅氧基(TMSO)基团。参见具 体实施例，10-13栏。所述双链RNA的单独的链可以分别合成并然后 复性以形成所述双链(双链体)寡核苷酸。
寡核苷酸的应用
典型的优选的反义化合物包括含有至少8个连续核碱基的DNA或 RNA序列，从一种示例性优选的反义化合物的5’-终端起(其余的核碱 基为连续段的相同DNA或RNA，其开始于可特异性杂化到目标核酸 的所述反义化合物的5’-终端的立即上游，并连续到直至所述DNA或 RNA包含约8至约80个核碱基)。类似优选的反义化合物由包含至少 8个连续核碱基的DNA或RNA片段表示，从一种示例性优选的反义 化合物的3’-终端起(其余的核碱基为连续段的相同DNA或RNA，其 开始于可特异性杂化到目标核酸的所述反义化合物的5’-终端的立即下 游，并连续到直至所述DNA或RNA包含约8至约80个核碱基)。本 领域技术人员一旦掌握了得自经验的优选的本文中描述的反义化合 物，将能够确定进一步优选的反义化合物而不用不适当的实验。
本发明的杂化到目标并抑制目标的表达的反义和其它化合物通过 实验确定，并且这些化合物的典型序列在本文中被确定为本发明优选 的实施方案。尽管所述反应化合物的具体序列在本文中阐明，但本领 域技术人员将认识到这些用于说明和描述在本发明范围内的具体的实 施方案。其它优选的反义化合物可由本领域技术人员确定。
用于本发明的优选的反义化合物的具体的例子包括包含改性骨架 或非天然核苷间键合的寡核苷酸。如本说明书中定义的，具有改性骨 架的寡核苷酸包括把在所述骨架中保持磷原子的那些和在所述骨架中 没有磷原子的那些。为了本说明书的目的，并且作为本领域中经常参 考的，在它们核苷间骨架中不具有磷原子的改性的寡核苷酸也可认为 是寡核苷。
由RNAse H-决定的反义
一种抑制特定基因表达的方法包括使用寡核苷酸或寡核苷酸类似 物作为“反义”剂。反义技术涉及将寡核苷酸或其类似物指向特定的 目标信使RNA(mRNA)序列。外源性“反义”分子和内源性mRNA 的相互作用通过多种途径调节转录。这些途径包括转录停止、RNAse H 募集和RNAi(例如siRNA)。反义技术允许特定蛋白质活性以相对可 预料的方式调制。
实施例
参考如下非限制性的、示例性实施例将进一步理解本发明，所述 实施例可通过通常描述于上的方法实施。
实施例1
将去离子水(1500ml)和聚乙烯醇(40g)放置于装备有机械搅 拌器、冷凝器和氮气入口的反应瓶(2L)中。该反应在整个聚合过程 中保持在氮气氛下。将由苯乙烯(190g)、55％-二乙烯苯(45％-乙 基苯乙烯)(30g)、乙酰氧基苯乙烯(10g)、过氧化苯甲酰(4g)、 异辛烷(90g)、2-乙基己醇(200g)组成的有机溶液加入到所述反应 容器中。在固定速率下(250rpm)搅拌该混合物以形成希望的珠大小 分布。然后将反应器在75℃下加热。7h后，停止马达并将形成的珠过 滤并用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分和 在真空下干燥。将去离子水(300mL)、乙醇(1000mL)和干燥过的 珠放置于装配有机械搅拌器(200rpm)和冷凝器的反应瓶(2L)中。 然后将反应器在70℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠过滤并 用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分和在真 空下干燥。
实施例2
将去离子水(1500ml)和聚乙烯醇(40g)放置于装备有机械搅 拌器、冷凝器和氮气入口的反应瓶(2L)中。该反应在整个聚合过程 中保持在氮气氛下。将由苯乙烯(190g)、55％-二乙烯苯(45％-乙 基苯乙烯)(30g)、乙酰氧基苯乙烯(10g)、过氧化苯甲酰(4g)、 异辛烷(90g)、2-乙基己醇(200g)组成的有机溶液加入到所述反应 容器中。在固定速率下(250rpm)搅拌该混合物以形成希望的珠大小 分布。然后将反应器在75℃下加热。15h后，停止马达并将形成的珠 过滤并用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分 和在真空下干燥。将去离子水(300mL)、乙醇(1000mL)和干燥过 的珠放置于装配有机械搅拌器(200rpm)和冷凝器的反应瓶(2L)中。 然后将反应器在70℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠过滤并 用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分和在真 空下干燥。
实施例3
将去离子水(1500ml)和聚乙烯醇(40g)放置于装备有机械搅 拌器、冷凝器和氮气入口的反应瓶(2L)中。该反应在整个聚合过程 中保持在氮气氛下。将由苯乙烯(190g)、55％-二乙烯苯(45％-乙 基苯乙烯)(30g)、乙酰氧基苯乙烯(10g)、过氧化苯甲酰(4g)、 异辛烷(90g)、2-乙基己醇(200g)组成的有机溶液加入到所述反应 容器中。在固定速率下(250rpm)搅拌该混合物以形成希望的珠大小 分布。然后将反应器在75℃下加热。20h后，停止马达并将形成的珠 过滤并用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分 和在真空下干燥。将去离子水(300mL)、乙醇(1000mL)和干燥过 的珠放置于装配有机械搅拌器(200rpm)和冷凝器的反应瓶(2L)中。 然后将反应器在70℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠过滤并 用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分和在真 空下干燥。
实施例4
将去离子水(1500ml)和聚乙烯醇(40g)放置于装备有机械搅 拌器、冷凝器和氮气入口的反应瓶(2L)中。该反应在整个聚合过程 中保持在氮气氛下。将由苯乙烯(190g)、55％-二乙烯苯(45％-乙 基苯乙烯)(30g)、乙酰氧基苯乙烯(10g)、过氧化苯甲酰(4g)、 异辛烷(90g)、2-乙基己醇(200g)组成的有机溶液加入到所述反应 容器中。在固定速率下(250rpm)搅拌该混合物以形成希望的珠大小 分布。然后将反应器在80℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠 过滤并用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分 和在真空下干燥。将去离子水(300mL)、乙醇(1000mL)和干燥过 的珠放置于装配有机械搅拌器(200rpm)和冷凝器的反应瓶(2L)中。 然后将反应器在70℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠过滤并 用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分和在真 空下干燥。
实施例5
将去离子水(1500ml)和聚乙烯醇(40g)放置于装备有机械搅 拌器、冷凝器和氮气入口的反应瓶(2L)中。该反应在整个聚合过程 中保持在氮气氛下。将由苯乙烯(190g)、55％-二乙烯苯(45％-乙 基苯乙烯)(30g)、乙酰氧基苯乙烯(10g)、过氧化苯甲酰(4g)、 异辛烷(90g)、2-乙基己醇(200g)组成的有机溶液加入到所述反应 容器中。在固定速率下(250rpm)搅拌该混合物以形成希望的珠大小 分布。然后将反应器在85℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠 过滤并用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分 和在真空下干燥。将去离子水(300mL)、乙醇(1000mL)和干燥过 的珠放置于装配有机械搅拌器(200rpm)和冷凝器的反应瓶(2L)中。 然后将反应器在70℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠过滤并 用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分和在真 空下干燥。
实施例6
将去离子水(1500ml)和聚乙烯醇(40g)放置于装备有机械搅 拌器、冷凝器和氮气入口的反应瓶(2L)中。该反应在整个聚合过程 中保持在氮气氛下。将由苯乙烯(250g)、55％-二乙烯苯(45％-乙 基苯乙烯)(30g)、乙酰氧基苯乙烯(10g)、过氧化苯甲酰(4g)、 异辛烷(90g)、2-乙基己醇(200g)组成的有机溶液加入到所述反应 容器中。在固定速率下(250rpm)搅拌该混合物以形成希望的珠大小 分布。然后将反应器在75℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠 过滤并用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分 和在真空下干燥。将去离子水(300mL)、乙醇(1000mL)和干燥过 的珠放置于装配有机械搅拌器(200rpm)和冷凝器的反应瓶(2L)中。 然后将反应器在70℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠过滤并 用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分和在真 空下干燥。
实施例7
将去离子水(1500ml)和聚乙烯醇(40g)放置于装备有机械搅 拌器、冷凝器和氮气入口的反应瓶(2L)中。该反应在整个聚合过程 中保持在氮气氛下。将由苯乙烯(110g)、55％-二乙烯苯(45％-乙 基苯乙烯)(30g)、乙酰氧基苯乙烯(10g)、过氧化苯甲酰(4g)、 异辛烷(90g)、2-乙基己醇(200g)组成的有机溶液加入到所述反应 容器中。在固定速率下(250rpm)搅拌该混合物以形成希望的珠大小 分布。然后将反应器在75℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠 过滤并用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分 和在真空下干燥。将去离子水(300mL)、乙醇(1000mL)和干燥过 的珠放置于装配有机械搅拌器(200rpm)和冷凝器的反应瓶(2L)中。 然后将反应器在70℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠过滤并 用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分和在真 空下干燥。
实施例8
将去离子水(1500ml)和聚乙烯醇(40g)放置于装备有机械搅 拌器、冷凝器和氮气入口的反应瓶(2L)中。该反应在整个聚合过程 中保持在氮气氛下。将由苯乙烯(190g)、55％-二乙烯苯(45％-乙 基苯乙烯)(15g)、乙酰氧基苯乙烯(10g)、过氧化苯甲酰(4g)、 异辛烷(90g)、2-乙基己醇(200g)组成的有机溶液加入到所述反应 容器中。在固定速率下(250rpm)搅拌该混合物以形成希望的珠大小 分布。然后将反应器在75℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠 过滤并用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分 和在真空下干燥。将去离子水(300mL)、乙醇(1000mL)和干燥过 的珠放置于装配有机械搅拌器(200rpm)和冷凝器的反应瓶(2L)中。 然后将反应器在70℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠过滤并 用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分和在真 空下干燥。
实施例9
将去离子水(1500ml)和聚乙烯醇(40g)放置于装备有机械搅 拌器、冷凝器和氮气入口的反应瓶(2L)中。该反应在整个聚合过程 中保持在氮气氛下。将由苯乙烯(190g)、55％-二乙烯苯(45％-乙 基苯乙烯)(30g)、乙酰氧基苯乙烯(20g)、过氧化苯甲酰(4g)、 异辛烷(90g)、2-乙基己醇(200g)组成的有机溶液加入到所述反应 容器中。在固定速率下(250rpm)搅拌该混合物以形成希望的珠大小 分布。然后将反应器在75℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠 过滤并用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分 和在真空下干燥。将去离子水(300mL)、乙醇(1000mL)和干燥过 的珠放置于装配有机械搅拌器(200rpm)和冷凝器的反应瓶(2L)中。 然后将反应器在70℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠过滤并 用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分和在真 空下干燥。
实施例10
将去离子水(1500ml)和聚乙烯醇(40g)放置于装备有机械搅 拌器、冷凝器和氮气入口的反应瓶(2L)中。该反应在整个聚合过程 中保持在氮气氛下。将由苯乙烯(190g)、55％-二乙烯苯(45％-乙 基苯乙烯)(30g)、乙酰氧基苯乙烯(10g)、过氧化苯甲酰(4g)、 异辛烷(40g)、2-乙基己醇(200g)组成的有机溶液加入到所述反应 容器中。在固定速率下(250rpm)搅拌该混合物以形成希望的珠大小 分布。然后将反应器在75℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠 过滤并用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分 和在真空下干燥。将去离子水(300mL)、乙醇(1000mL)和干燥过 的珠放置于装配有机械搅拌器(200rpm)和冷凝器的反应瓶(2L)中。 然后将反应器在70℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠过滤并 用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分和在真 空下干燥。
实施例11
将去离子水(1500ml)和聚乙烯醇(40g)放置于装备有机械搅 拌器、冷凝器和氮气入口的反应瓶(2L)中。该反应在整个聚合过程 中保持在氮气氛下。将由苯乙烯(190g)、55％-二乙烯苯(45％-乙 基苯乙烯)(30g)、乙酰氧基苯乙烯(10g)、过氧化苯甲酰(4g)、 异辛烷(90g)、2-乙基己醇(200g)组成的有机溶液加入到所述反应 容器中。在固定速率下(350rpm)搅拌该混合物以形成希望的珠大小 分布。然后将反应器在75℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠 过滤并用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分 和在真空下干燥。将去离子水(300mL)、乙醇(1000mL)和干燥过 的珠放置于装配有机械搅拌器(200rpm)和冷凝器的反应瓶(2L)中。 然后将反应器在70℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠过滤并 用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分和在真 空下干燥。
实施例12
将去离子水(1500ml)和聚乙烯醇(40g)放置于装备有机械搅 拌器、冷凝器和氮气入口的反应瓶(2L)中。该反应在整个聚合过程 中保持在氮气氛下。将由苯乙烯(190g)、55％-二乙烯苯(45％-乙 基苯乙烯)(30g)、乙酰氧基苯乙烯(10g)、过氧化苯甲酰(4g)、 异辛烷(90g)、2-乙基己醇(200g)组成的有机溶液加入到所述反应 容器中。在固定速率下(450rpm)搅拌该混合物以形成希望的珠大小 分布。然后将反应器在75℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠 过滤并用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分 和在真空下干燥。将去离子水(300mL)、乙醇(1000mL)和干燥过 的珠放置于装配有机械搅拌器(200rpm)和冷凝器的反应瓶(2L)中。 然后将反应器在70℃下加热。12h后，停止马达并将形成的珠过滤并 用去离子水和丙酮洗涤。将这些珠分散于丙酮中并且然后筛分和在真 空下干燥。
实施例13：将5’-O-DMT胸苷-3’-O-琥珀酸酯装载于固体载体上
经保护的核苷的装载利用得自实验1的固体载体在标准条件下进 行。将固体载体，Hunig氏碱(12当量)，HBTU活化剂(4当量)， 作为三乙基铵盐的DMT T核苷琥珀酸酯(2.0当量)放置于圆底烧瓶 中并密闭，并在室温下机械振摇10小时。然后将所述载体用乙腈(100 ml)洗涤并干燥。然后将用于寡聚的Cap A和Cap B溶液的混合物(各 20ml)加入到固体载体中，随后加入催化量的4-二甲基氨基吡啶，并 且机械振摇过夜。所述载体用乙腈(200ml)、甲醇(100ml)和最后 用无水乙醚(200ml)洗涤。最终将所述载体彻底干燥并贮存。
实施例14：将5’-O-DMT-N4-苯甲酰基-2’-脱氧胞苷-3’-O-琥珀酸 酯装载于固体载体上
经保护的核苷的装载利用得自实验1的固体载体在标准条件下进 行。将固体载体，Hunig氏碱(12当量)，HBTU活化剂(4当量)， 作为三乙基铵盐的5’-0-DMT-N4-苯甲酰基-2’-脱氧胞苷-3’-O-琥珀酸 酯(2.0当量)放置于圆底烧瓶中并密闭，并在室温下机械振摇10小 时。然后将所述载体用乙腈(100ml)洗涤并干燥。然后将用于寡聚的 Cap A和Cap B溶液的混合物(各20ml)加入到固体载体中，随后加 入催化量的4-二甲基氨基吡啶，并且机械振摇过夜。所述载体用乙腈 (200ml)、甲醇(100ml)和最后用无水乙醚(200ml)洗涤。最终 将所述载体彻底干燥并贮存。
实施例15：将5’-O-DMT-N6-苯甲酰基-2’-脱氧腺苷-3’-O-琥珀酸 酯装载于固体载体上
经保护的核苷的装载利用得自实验1的固体载体在标准条件下进 行。将固体载体，Hunig氏碱(12当量)，HBTU活化剂(4当量)， 作为三乙基铵盐的5’-O-DMT-N6-苯甲酰基-2’-脱氧腺苷-3’-O-琥珀酸 酯(2.0当量)放置于圆底烧瓶中并密闭，并在室温下机械振摇10小 时。然后将所述载体用乙腈(100ml)洗涤并干燥。然后将用于寡聚的 Cap A和Cap B溶液的混合物(各20ml)加入到固体载体中，随后加 入催化量的4-二甲基氨基吡啶，并且机械振摇过夜。所述载体用乙腈 (200ml)、甲醇(100ml)和最后用无水乙醚(200ml)洗涤。最终 将所述载体彻底干燥并贮存。
实施例16：将5’-O-DMT-N2-异丁酰基-2’-脱氧鸟苷-3’-O-琥珀酸 酯装载于固体载体上
经保护的核苷的装载利用得自实验1的固体载体在标准条件下进 行。将固体载体，Hunig氏碱(12当量)，HBTU活化剂(4当量)， 作为三乙基铵盐的5’-O-DMT-N2-异丁酰基-2’-脱氧腺苷-3’-O-琥珀酸 酯(2.0当量)放置于圆底烧瓶中并密闭，并在室温下机械振摇10小 时。然后将所述载体用乙腈(100ml)洗涤并干燥。然后将用于寡聚的 Cap A和Cap B溶液的混合物(各20ml)加入到固体载体中，随后加 入催化量的4-二甲基氨基吡啶，并且机械振摇过夜。所述载体用乙腈 (200ml)、甲醇(100ml)和最后用无水乙醚(200ml)洗涤。最终 将所述载体彻底干燥并贮存。
实施例17：将5’-O-DMT-2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷-3’-O-琥珀 酸酯装载于固体载体上
经保护的核苷的装载利用得自实验1的固体载体在标准条件下进 行。将固体载体，Hunig氏碱(12当量)，HBTU活化剂(4当量)， 作为三乙基铵盐的5’-O-DMT-2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷-3’-O-琥珀 酸酯(2.0当量)放置于圆底烧瓶中并密闭，并在室温下机械振摇10 小时。然后将所述载体用乙腈(100ml)洗涤并干燥。然后将用于寡聚 的Cap A和Cap B溶液的混合物(各20ml)加入到固体载体中，随后 加入催化量的4-二甲基氨基吡啶，并且机械振摇过夜。所述载体用乙 腈(200ml)、甲醇(100ml)和最后用无水乙醚(200ml)洗涤。最 终将所述载体彻底干燥并贮存。
实施例18：将5’-O-DMT-N4-苯甲酰基-2’-O-甲氧基乙基胞苷-3’-O- 琥珀酸酯装载于固体载体上
经保护的核苷的装载利用得自实验1的固体载体在标准条件下进 行。将固体载体，Hunig氏碱(12当量)，HBTU活化剂(4当量)， 作为三乙基铵盐的5’-O-DMT-N4-苯甲酰基-2’-O-甲氧基乙基胞苷 -3’-O-琥珀酸酯(2.0当量)放置于圆底烧瓶中并密闭，并在室温下机 械振摇10小时。然后将所述载体用乙腈(100ml)洗涤并干燥。然后 将用于寡聚的Cap A和Cap B溶液的混合物(各20ml)加入到固体载 体中，随后加入催化量的4-二甲基氨基吡啶，并且机械振摇过夜。所 述载体用乙腈(200ml)、甲醇(100ml)和最后用无水乙醚(200ml) 洗涤。最终将所述载体彻底干燥并贮存。
实施例19：将5’-O-DMT-N6-苯甲酰基-2’-O-甲氧基乙基腺苷-3’-O- 琥珀酸酯装载于固体载体上
经保护的核苷的装载利用得自实验1的固体载体在标准条件下进 行。将固体载体，Hunig氏碱(12当量)，HBTU活化剂(4当量)， 作为三乙基铵盐的5’-O-DMT-N6-苯甲酰基-2’-O-甲氧基乙基腺苷 -3’-O-琥珀酸酯(2.0当量)放置于圆底烧瓶中并密闭，并在室温下机 械振摇10小时。然后将所述载体用乙腈(100ml)洗涤并干燥。然后 将用于寡聚的Cap A和Cap B溶液的混合物(各20ml)加入到固体载 体中，随后加入催化量的4-二甲基氨基吡啶，并且机械振摇过夜。所 述载体用乙腈(200ml)、甲醇(100ml)和最后用无水乙醚(200ml) 洗涤。最终将所述载体彻底干燥并贮存。
实施例20：将5’-O-DMT-N2-异丁酰基-2’-O-甲氧基乙基鸟苷-3’-O- 琥珀酸酯装载于固体载体上
经保护的核苷的装载利用得自实验1的固体载体在标准条件下进 行。将固体载体，Hunig氏碱(12当量)，HBTU活化剂(4当量)， 作为三乙基铵盐的5’-O-DMT-N2-异丁酰基-2’-O-甲氧基乙基鸟苷 -3’-O-琥珀酸酯(2.0当量)放置于圆底烧瓶中并密闭，并在室温下机 械振摇10小时。然后将所述载体用乙腈(100ml)洗涤并干燥。然后 将用于寡聚的Cap A和Cap B溶液的混合物(各20ml)加入到固体载 体中，随后加入催化量的4-二甲基氨基吡啶，并且机械振摇过夜。所 述载体用乙腈(200ml)、甲醇(100ml)和最后用无水乙醚(200ml) 洗涤。最终将所述载体彻底干燥并贮存。
实施例2 1：全改性的5’-d(TCC-CGC-CTG-TGA-CAT-GCA-TT)-3’ 硫代磷酸酯20聚体的合成
上述序列的合成在Amersham Biosciences Akta 100 DNA/RNA合 成器上以约420微摩尔量级利用如上制备的氰基乙基亚磷酰胺和DMT 胸苷衍生的固体载体进行。脱三苯甲基反应利用10％二氯乙酸的甲苯 溶液(体积/体积)进行。硫化反应利用0.2M苯基乙酰二硫化物的乙 腈∶3-甲基吡啶(1∶1 v/v)溶液进行2分钟。合成结束时，用乙腈洗涤 所述载体，切断，用氢氧化铵在55℃下脱保护12小时。粗制的材料以 常规方式纯化以提供所需的硫代磷酸寡核苷酸。
实施例22：全改性的5’-d(GTT-CTC-GCT-GGT-GAG-TTT-CA)-3’ 硫代磷酸酯20聚体的合成
上述序列的合成在Amersham Biosciences Akta 100 DNA/RNA合 成器上以约420微摩尔量级利用如上制备的氰基乙基亚磷酰胺和DMT N6-苯甲酰基-2’-脱氧腺苷衍生的固体载体进行。脱三苯甲基反应利用 10％二氯乙酸的甲苯溶液(体积/体积)进行。硫化反应利用0.2M苯 基乙酰二硫化物的乙腈∶3-甲基吡啶(1∶1 v/v)溶液进行2分钟。合成 结束时，用乙腈洗涤所述载体，切断，用氢氧化铵在55℃下脱保护12 小时。粗制的材料以常规方式纯化以提供所需的硫代磷酸寡核苷酸。
实施例23：全改性的5’-d(GCC-CAA-GCT-GGC-ATC-CGT-CA)-3’ 硫代磷酸酯20聚体的合成
上述序列的合成在Amersham Biosciences Akta 100 DNA/RNA合 成器上以约420微摩尔量级利用如上制备的氰基乙基亚磷酰胺和DMT N6-苯甲酰基-2’-脱氧腺苷衍生的固体载体进行。脱三苯甲基反应利用 10％二氯乙酸的甲苯溶液(体积/体积)进行。硫化反应利用0.2M苯 基乙酰二硫化物的乙腈∶3-甲基吡啶(1∶1 v/v)溶液进行2分钟。合成 结束时，用乙腈洗涤所述载体，切断，用氢氧化铵在55℃下脱保护12 小时。粗制的材料以常规方式纯化以提供所需的硫代磷酸寡核苷酸。
实施例24：全改性的5’-d(TCC-GTC-ATC-GCT-CCT-CAG-GG)-3’ 硫代磷酸酯20聚体的合成
上述序列的合成在Amersham Biosciences Akta 100 DNA/RNA合 成器上以约420微摩尔量级利用如上制备的氰基乙基亚磷酰胺和DMT N2-异丁酰基-2’-脱氧鸟苷衍生的固体载体进行。脱三苯甲基反应利用 10％二氯乙酸的甲苯溶液(体积/体积)进行。硫化反应利用0.2M苯 基乙酰二硫化物的乙腈∶3-甲基吡啶(1∶1 v/v)溶液进行2分钟。合成 结束时，用乙腈洗涤所述载体，切断，用氢氧化铵在55℃下脱保护12 小时。粗制的材料以常规方式纯化以提供所需的硫代磷酸寡核苷酸。
实施例25：全改性的5’-d(GTT-CTC-GCT-GGT-GAG-TTT-CA)-3’ 硫代磷酸酯20聚体的合成
上述序列的合成在Amersham Biosciences Akta 100 DNA/RNA合 成器上以约420微摩尔量级利用如上制备的氰基乙基亚磷酰胺和DMT N6-苯甲酰基-2’-脱氧腺苷衍生的固体载体进行。脱三苯甲基反应利用 10％二氯乙酸的甲苯溶液(体积/体积)进行。硫化反应利用0.2M苯 基乙酰二硫化物的乙腈∶3-甲基吡啶(1∶1 v/v)溶液进行2分钟。合成 结束时，用乙腈洗涤所述载体，切断，用氢氧化铵在55℃下脱保护12 小时。粗制的材料以常规方式纯化以提供所需的硫代磷酸寡核苷酸。
实施例26：全改性的5’-[2’-O-甲氧基乙基 -(TGTG]-d(CTA-TTC-TGT-G-)-[2’-O-甲氧基乙基-(AATT]-3’硫代磷酸 酯18聚体的合成
上述序列的合成在Amersham Biosciences Akta 100 DNA/RNA合 成器上以约420微摩尔量级利用如上制备的氰基乙基亚磷酰胺和 5’-DMT-2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷衍生的固体载体进行。脱三苯甲 基反应利用10％二氯乙酸的甲苯溶液(体积/体积)进行。硫化反应利 用0.2M苯基乙酰二硫化物的乙腈∶3-甲基吡啶(1∶1 v/v)溶液进行2 分钟。合成结束时，用乙腈洗涤所述载体，切断，用氢氧化铵在55℃ 下脱保护12小时。粗制的材料以常规方式纯化以提供所需的硫代磷酸 寡核苷酸。
实施例27：全改性的5’-[2’-O-甲氧基乙基 -(CAGC))-d(AGC-AGA-GTC-TTC-A-)-[2’-O-甲氧基乙基-(TCAT]-3’硫 代磷酸酯21聚体的合成
上述序列的合成在Amersham Biosciences Akta 100 DNA/RNA合 成器上以约420微摩尔量级利用如上制备的氰基乙基亚磷酰胺和 5’-DMT-2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷衍生的固体载体进行。脱三苯甲 基反应利用10％二氯乙酸的甲苯溶液(体积/体积)进行。硫化反应利 用0.2M苯基乙酰二硫化物的乙腈∶3-甲基吡啶(1∶1 v/v)溶液进行2 分钟。合成结束时，用乙腈洗涤所述载体，切断，用氢氧化铵在55℃ 下脱保护12小时。粗制的材料以常规方式纯化以提供所需的硫代磷酸 寡核苷酸。
实施例28：全改性的5’-[2’-O-甲氧基乙基 -(GCTCC))-d(TTC-CAC-TGA-T)-[2’-O-甲氧基乙基-(CCTGC]-3’硫代磷 酸酯20聚体的合成
上述序列的合成在Amersham Biosciences Akta 100 DNA/RNA合 成器上以约420微摩尔量级利用如上制备的氰基乙基亚磷酰胺和 5’-DMT-2’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷衍生的固体载体进行。脱三苯甲 基反应利用10％二氯乙酸的甲苯溶液(体积/体积)进行。硫化反应利 用0.2M苯基乙酰二硫化物的乙腈∶3-甲基吡啶(1∶1 v/v)溶液进行2 分钟。合成结束时，用乙腈洗涤所述载体，切断，用氢氧化铵在55℃ 下脱保护12小时。粗制的材料以常规方式纯化以提供所需的硫代磷酸 寡核苷酸。
实施例29：全改性的5’-[2’-O-甲氧基乙基 -(GCTCC]-d(TTC-CAC-TGA-T)-[2’-O-甲氧基乙基-(CCTGC]-3’硫代磷 酸酯20聚体的合成
上述序列的合成在Amersham Biosciences Akta 100 DNA/RNA合 成器上以约420微摩尔量级利用如上制备的氰基乙基亚磷酰胺和 5’-DMT-2’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷衍生的固体载体进行。脱三苯甲 基反应利用10％二氯乙酸的甲苯溶液(体积/体积)进行。硫化反应利 用0.2M苯基乙酰二硫化物的乙腈∶3-甲基吡啶(1∶1 v/v)溶液进行2 分钟。合成结束时，用乙腈洗涤所述载体，切断，用氢氧化铵在55℃ 下脱保护12小时。粗制的材料以常规方式纯化以提供所需的硫代磷酸 寡核苷酸。
实施例30：全改性的5’-[2’-O-甲氧基乙基 -(GCCTC]-d(AGT-CTG-CTT-C)-[2’-O-甲氧基乙基-(GCACC]-3’硫代磷 酸酯20聚体的合成
上述序列的合成在Amersham Biosciences Akta 100 DNA/RNA合 成器上以约420微摩尔量级利用如上制备的氰基乙基亚磷酰胺和 5’-O-DMT-2’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷衍生的固体载体进行。脱三苯 甲基反应利用10％二氯乙酸的甲苯溶液(体积/体积)进行。硫化反应 利用0.2M苯基乙酰二硫化物的乙腈∶3-甲基吡啶(1∶1 v/v)溶液进行2 分钟。合成结束时，用乙腈洗涤所述载体，切断，用氢氧化铵在55℃ 下脱保护12小时。粗制的材料以常规方式纯化以提供所需的硫代磷酸 寡核苷酸。
实施例31：全改性的5’-d(TCC-CGC-CTG-TGA-CAT-GCA-TT)-3’ 磷酸二酯20聚体的合成
上述序列的合成在Amersham Biosciences Akta 100 DNA/RNA合 成器上以约420微摩尔量级利用如上制备的氰基乙基亚磷酰胺和DMT 胸苷衍生的固体载体进行。脱三苯甲基反应利用10％二氯乙酸的甲苯 溶液(体积/体积)进行。氧化反应利用标准碘溶液进行2分钟。合成 结束时，用乙腈洗涤所述载体，切断，用氢氧化铵在55℃下脱保护12 小时。粗制的材料以常规方式纯化以提供所需的磷酸酯寡核苷酸。
实施例32：全改性的5’-d(GTT-CTC-GCT-GGT-GAG-TTT-CA)-3’ 磷酸二酯20聚体的合成
上述序列的合成在Amersham Biosciences Akta 100 DNA/RNA合 成器上以约420微摩尔量级利用如上制备的氰基乙基亚磷酰胺和DMT N6-苯甲酰基-2’-脱氧腺苷衍生的固体载体进行。脱三苯甲基反应利用 10％二氯乙酸的甲苯溶液(体积/体积)进行。氧化反应利用标准碘溶 液进行2分钟。合成结束时，用乙腈洗涤所述载体，切断，用氢氧化 铵在55℃下脱保护12小时。粗制的材料以常规方式纯化以提供所需的 磷酸酯寡核苷酸。
实施例33：全改性的5’-d(GCC-CAA-GCT-GGC-ATC-CGT-CA)-3’ 磷酸二酯20聚体的合成
上述序列的合成在Amersham Biosciences Akta 100 DNA/RNA合 成器上以约420微摩尔量级利用如上制备的氰基乙基亚磷酰胺和DMT N6-苯甲酰基-2’-脱氧腺苷衍生的固体载体进行。脱三苯甲基反应利用 10％二氯乙酸的甲苯溶液(体积/体积)进行。氧化反应利用标准碘溶 液进行2分钟。合成结束时，用乙腈洗涤所述载体，切断，用氢氧化 铵在55℃下脱保护12小时。粗制的材料以常规方式纯化以提供所需的 磷酸酯寡核苷酸。
实施例34：全改性的5’-d(TCC-GTC-ATC-GCT-CCT-CAG-GG)-3’ 磷酸二酯20聚体的合成
上述序列的合成在Amersham Biosciences Akta 100 DNA/RNA合 成器上以约420微摩尔量级利用如上制备的氰基乙基亚磷酰胺和DMT N2-异丁酰基-2’-脱氧鸟苷衍生的固体载体进行。脱三苯甲基反应利用 10％二氯乙酸的甲苯溶液(体积/体积)进行。氧化反应利用标准碘溶 液进行2分钟。合成结束时，用乙腈洗涤所述载体，切断，用氢氧化 铵在55℃下脱保护12小时。粗制的材料以常规方式纯化以提供所需的 磷酸酯寡核苷酸。
实施例35：全改性的5’-d(GTT-CTC-GCT-GGT-GAG-TTT-CA)-3’ 磷酸二酯20聚体的合成
上述序列的合成在Amersham Biosciences Akta 100 DNA/RNA合 成器上以约420微摩尔量级利用如上制备的氰基乙基亚磷酰胺和DMT N6-苯甲酰基-2’-脱氧腺苷衍生的固体载体进行。脱三苯甲基反应利用 10％二氯乙酸的甲苯溶液(体积/体积)进行。氧化反应利用标准碘溶 液进行2分钟。合成结束时，用乙腈洗涤所述载体，切断，用氢氧化 铵在55℃下脱保护12小时。粗制的材料以常规方式纯化以提供所需的 磷酸酯寡核苷酸。
实施例36：合成寡核苷酸的通用步骤
A根据如下步骤进行2.2mM的合成
1.将11.0g 200μm负载的载体放入35mm流通(flow-through) 柱；
2.向所述柱中加入约150mL甲苯并使载体溶胀数分钟。溶胀了 的载体从柱底板到载体床顶上测量约为5.2cm。
3.将柱顶网状适配器下降至约7.2cm，使载体床和柱顶板之间的 间隙为2cm。
4.确保柱的锁定机制。
5.利用核苷亚磷酰胺进行固相寡核苷酸合成以形成具有磷酸二 酯、硫代磷酸酯或硫代磷酸酯核苷间键合的寡核苷酸。
如果所述载体没有预先衍生化成包含这样的第一合成子，合成步 骤5可以包括第一核苷利用标准试剂通过连接部分(例如单连接部分) 对载体的结合。或者，如果载体已经预先衍生化了，将该已衍生化的 载体如上所述装载于柱上，随着加入亚磷酰胺合成子进行合成。另外， 如果载体(衍生化的或未衍生化的)在装载到柱上之前已经预先溶胀， 则将该溶胀了的载体装载以形成上述的2cm间隙。
实施例37：聚合珠的合成
为了确定多种实验参数对珠性质的影响，在不同的制备条件下制 备数种珠，检验它们的物理性质。结果总结于下表。   实验参数     实验数     1    2     3   4   5   6     7     8    9     10     11    12   水(g)   聚乙烯醇(g)   苯乙烯(g)   乙基苯乙烯(g)   DVB(g)   乙酰氧基苯乙烯     (g)   BPO(g)   异辛烷(g)   2-乙基己醇(g)    1500    40    190    13.5    16.5      10      4    90    200    1500    40    190    13.5    16.5      10      4    90    200     1500     40     190     13.5     16.5       10       4     90     200   1500   40   190   13.5   16.5     10     4   90   200   1500   40   190   13.5   16.5     10     4   90   200   1500   40   250   13.5   16.5     10     4   90   200     1500     40     110     13.5     16.5       10       4     90     200     1500     40     190     6.75     8.25       10       4     90     200    1500    40    190    13.5    16.5      20      4    90    200     1500     40     190     13.5     16.5       10       4     40     200     1500     40     190     13.5     16.5       10       4     90     200    1500    40    190    13.5    16.5      10      4    90    200   搅拌(rpm)   温度(℃)   时间(h)    250    75    7    250    75    15     250     75     20   250   80   7   250   85   7   250   75   7     250     75     7     250     75     7    250    75    7     250     75     7     350     75     7    450    75    7
单体/总单体百分数     苯乙烯+乙基苯     乙烯     88     88   88     88     88     91     82     92     85     88     88     88     DVB     7     7   7     7     7     6     1 1     4     7     7     7     7     乙酰氧基苯乙烯     4     4   4     4     4     3     7     5     8     4     4     4
有机溶剂百分数     异辛烷     31     31     31   31   31   31   31   31     31     17     31     31     2-乙基己醇     69     69     69   69   69   69   69   69     69     83     69     69
有机相百分数     有机溶剂     56     56     56     56     56     50     66     57     55     51     56     56     总单体     44     44     44     44     44     50     34     43     45     49     44     44
有机相/水相百分数   有机相   25     25     25     25     25   27   22   25   26   23   25   25   水相   75     75     75     75     75   73   78   75   74   77   75   75
珠性质  1平均粒度(μm)   80   80   81   80   78   101   72   78   80   75   62   38  2平均孔大小  (nm)   27   27   29   25   21   19   110   10   23   21   34   41  3比表面积  (m2/g)   51   51   50   25   61   37   28   21   48   43   62   70
1通过激光散射测量
2通过水银孔隙度计测量
3通过BET法测量
本领域技术人员将了解很多变化和修正可形成本发明优选的实施 方案，并且这些变化和修正可不背离本发明的主旨而进行。因此所附 权利要求覆盖所有这样的落入本发明的主旨和范围的等同变化。
本发明中提及的每篇专利、申请、和包括书籍的印刷出版物通过 引用以其全部内容并入本文中。
本申请要求2004年9约2日提交的美国临时申请60/606,873的利 益，其全部公开内容通过引用并入本文中。