用于产生用于定向进化的文库的方法 |
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| 申请号 | CN201480023547.1 | 申请日 | 2014-02-26 | 公开(公告)号 | CN105283588A | 公开(公告)日 | 2016-01-27 |
| 申请人 | 艾希奥美公司; | 发明人 | M.维纳; M.基斯; | ||||
| 摘要 | 本文公开的是生成例如可以用于定向进化中的目的序列的变体文库的有效方法，在一个实施方案中，该方法包括扩增反应，例如易错PCR，以生成目的序列的双链DNA(dsDNA)变体，这之后dsDNA变体的一条链可以选择性降解，以产生单链DNA(ssDNA)变体。ssDNA变体可以与ssDNA中间体例如尿嘧啶化的环状ssDNA中间体杂交，以形成异源双链DNA，其可以转化到细胞例如大肠杆菌细胞内，获得变体文库。这种方法消除无效的亚克隆步骤和由许多现有方法要求的昂贵引物组的需要。 | ||||||
| 权利要求 | 1.生成目的序列的变体文库的方法，所述方法包括下述步骤： |
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| 说明书全文 | 用于产生用于定向进化的文库的方法[0002] 发明背景一般而言，本发明涉及改进的核酸文库产生。 [0003] 多样化遗传序列的文库可以用于鉴定具有特定功能的蛋白。例如，商业上有价值的功能序列可以通过下述进行鉴定：表达多样化遗传序列的文库，就特定功能测试所得的 蛋白，并且分离良好表现的那些序列。该过程可以被称为定向进化。通过多样化和选择的 反复循环，序列可以进一步就特定功能进行最佳化。选自多样化序列库的序列可以用于生 物学、医学或工业应用中。例如，通过定向进化鉴定的序列可以用于抗体工程改造中。 [0004] 生成多样化遗传序列的文库的现有方法通常是无效的。例如，现有方法可以包括无效的连接步骤或需要昂贵的引物组。对已知方法的速度和成本效益的改进将增加文库生 成的效率，允许多重功能序列的高流通量平行处理，并且促进新功能序列的鉴定。 [0005] 发明概述本发明包括生成目的序列的变体文库的方法。该方法可以包括下述步骤：首先提供包 括目的序列的模板DNA分子，并且提供一对寡核苷酸，其中寡核苷酸之一可以是受保护的，并且另一寡核苷酸可以是未受保护的，并且其中寡核苷酸与目的序列的相反链杂交且侧接 目的序列。后续步骤可以包括使用寡核苷酸对模板DNA分子进行扩增反应，从而生成dsDNA 变体群体，随后为使dsDNA变体群体与酶一起孵育的步骤，所述酶能够相对于dsDNA变体的 受保护链选择性降解未受保护的链，从而产生ssDNA变体群体。接下来，ssDNA变体群体可 以与ssDNA中间体(intermediaries)杂交，其可以包括与目的序列或其片段基本上相同的 序列，生成异源双链DNA。在异源双链DNA生成后，后续步骤可以包括将异源双链DNA转化 到细胞内，从而生成目的序列的变体文库。 [0006] 模板DNA分子可以是线性dsDNA分子、环状dsDNA分子、环状ssDNA分子、尿嘧啶化的(uracilated)环状ssDNA分子或甲基化的环状ssDNA分子。模板DNA分子的序列可 以与ssDNA中间体的序列基本上相同。 [0007] 目的序列可以大于100个碱基对，大于300、大于500或大于700个碱基对。目的序列可以是100 - 2000个碱基对、300 - 1500个碱基对或700 - 1200个碱基对。 [0008] 在一些实施方案中，受保护的寡核苷酸可以是包括三个或更多个5'硫代硫酸酯的寡核苷酸。受保护的寡核苷酸可以包括三、四或五个5'硫代硫酸酯。未受保护的寡核苷 酸可以是不包括三个或更多个5'硫代硫酸酯的寡核苷酸。在一些实施方案中，能够相对于 受保护的链选择性降解未受保护的链的酶可以是T7核酸外切酶或λ核酸外切酶。在其他 实施方案中，受保护的寡核苷酸可以是包括5'磷酸酯的寡核苷酸，并且未受保护的寡核苷 酸可以是不包括5'磷酸酯的寡核苷酸。在此类实施方案中，能够相对于受保护的链选择性 降解未受保护的链的酶可以是λ核酸外切酶。 [0009] 在多个实施方案中，扩增反应可以是PCR反应、易错PCR反应、等温扩增反应或滚环扩增反应。在一些实施方案中，dsDNA变体群体的50% dsDNA变体与目的序列具有小于 99.5%同一性，或与目的序列具有小于98%同一性。 [0010] 上述实施方案中的任一个均可进一步包括在与能够相对于受保护的链选择性降解未受保护的链的酶一起孵育前，纯化dsDNA变体群体。上述实施方案中的任一个均可进 一步包括在与ssDNA中间体杂交前，纯化ssDNA变体群体。 [0011] 在上述实施方案的任一个中，ssDNA中间体可以包括与目的序列或其片段具有至少50%、至少70%、至少90%或100%同一性的序列。ssDNA中间体可以是包括与噬菌粒序列 基本上相同的序列片段的噬菌粒或载体。 [0012] 在上述实施方案的任一个中，ssDNA变体群体与ssDNA中间体的杂交可以包括ssDNA变体群体和ssDNA中间体在变性温度下的共孵育，随后逐步冷却至退火温度。变性温 度可以是约90℃。退火温度可以是约55℃。逐步冷却以约-1℃/分钟的速率发生。 [0014] 在上述实施方案的任一个中，ssDNA中间体可以包括经修饰的核碱基，或除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶外的核碱基。细胞能够选择性降解ssDNA中间体。在一些 特定实施方案中，ssDNA中间体可以是尿嘧啶化的ssDNA中间体。在其他特定实施方案中， ssDNA中间体可以是甲基化的ssDNA中间体。在某些实施方案中，能够选择性降解ssDNA中 + 间体的细胞可以是Ung细菌细胞或TG1大肠杆菌(E. coli)细胞。在其他实施方案中，能 + 够选择性降解ssDNA中间体的细胞可以是Mcr细菌细胞。 [0015] 进一步的实施方案可以包括通过使异源双链DNA与DNA聚合酶的孵育，延伸与ssDNA中间体杂交的ssDNA变体。异源双链DNA与DNA聚合酶的孵育可以包括异源双链DNA 与DNA聚合酶和DNA连接酶的孵育。ssDNA中间体可以是甲基化的ssDNA中间体，并且该方 法可以进一步包括使异源双链DNA变性，且使变性产物与选择性降解甲基化的DNA的酶一 起孵育的步骤。在特定实施方案中，甲基化的ssDNA中间体可以包括甲基化的腺嘌呤核碱 基，并且选择性降解甲基化的DNA的酶可以是DpnI。在一些实施方案中，ssDNA变体可以是 甲基化的，并且ssDNA中间体可以是非甲基化的，并且该方法进一步包括使异源双链DNA变 性，且使变性产物与选择性降解非甲基化的DNA的酶一起孵育的步骤。在特定实施方案中，甲基化的ssDNA变体包括甲基化的胞嘧啶或鸟嘌呤核碱基，并且使得选择性降解非甲基化 的DNA的酶可以是Sau3AI或识别DNA序列5'-GATC-3'的限制性酶。 [0016] 在上述实施方案的任一个中，该方法可以进一步包括在转化到细胞内之前，纯化异源双链DNA。异源双链DNA转化到细胞内可以包括两个或更多个、10个或更多个、20个或 更多个、或者50个或更多个细胞等分试样的独立转化。变体文库的一个或多个等分试样可 以进行培养，以生成培养的文库。等分试样可以在回收培养基中进行培养。变体文库的一 个或多个等分试样可以独立地进行培养，或在单一培养物中组合。培养的文库可以沉淀，以生成沉淀的培养的文库。沉淀的培养的文库可以贮存于-20℃或更低的温度下。沉淀的培 养的文库可以重悬浮，以生成重悬浮的沉淀的培养的文库。重悬浮的沉淀的培养的文库可 以贮存于-20℃或更低的温度下。培养的文库的一个或多个等分试样可以与辅助噬菌体一 起孵育，生成噬菌体展示文库。培养的文库的一个或多个等分试样可以独立地与辅助噬菌 体一起孵育，或可以组合用于与辅助噬菌体一起孵育。噬菌体展示文库可以沉淀，以生成沉淀的噬菌体展示文库。沉淀的噬菌体展示文库可以贮存于-20℃或更低的温度下。沉淀的 噬菌体展示文库可以重悬浮，以生成重悬浮的沉淀的噬菌体展示文库。重悬浮的沉淀的噬 菌体展示文库可以贮存于-20℃或更低的温度下。培养的文库可以进行稀释或系列稀释， 以生成稀释或系列稀释的培养的文库。稀释或系列稀释的培养的文库可以铺平板至培养平 板，使得培养平板可以在有助于细胞生长或分裂的温度下进行孵育。 [0017] 在上述实施方案的任一个中，目的序列可以编码抗体或其结构域或片段、聚合酶或其结构域或片段、酶或其结构域或片段、单链可变片段抗体或其结构域或片段、激酶或其结构域或片段、DNA结合蛋白或其结构域或片段、RNA结合蛋白或其结构域或片段、转录因 子或其结构域或片段、或者人蛋白或其结构域或片段。目的序列或ssDNA中间体的序列可 以包括细菌噬菌体外壳蛋白。 [0018] 在一些实施方案中，至少30%、至少50%或至少70%的经转化的细胞可以包括目的序列的变体。 [0019] 在上述实施方案的任一个中，可以由两种或更多种不同目的序列各自开始，平行进行提供包括目的序列的模板DNA分子，提供一对寡核苷酸，使用寡核苷酸对模板DNA分子 进行扩增反应，并且使所得的dsDNA变体群体与能够相对于dsDNA变体的受保护链选择性 降解未受保护的链的酶一起孵育的步骤，以产生两种或更多种ssDNA变体的群体，使得寡 核苷酸、扩增反应和酶可以在将步骤中的任一个或全部的应用于两种或更多种不同目的序 列各自中不同。ssDNA变体群体可以在与ssDNA中间体的后续杂交之前或期间混合。在一 些实施方案中，两种或更多种不同目的序列中的至少两种可以由单一模板DNA分子扩增。 在某些实施方案中，两种或更多种不同目的序列中的全部可以由单一模板DNA分子扩增。 在一些实施方案中，两种或更多种不同目的序列中的至少两种可以由不同模板DNA分子扩 增。在某些实施方案中，两种或更多种不同目的序列各自可以由不同模板DNA分子扩增。在另外其他实施方案中，对于两种或更多种不同目的序列中的至少两种，平行进行的一个或 多个步骤可以在单一反应中进行。在一些实施方案中，对于两种或更多种不同目的序列中 的全部，平行进行的一个或多个步骤可以在单一反应中进行。在一些实施方案中，对于两种或更多种不同目的序列中的至少两种，或者对于两种或更多种不同目的序列各自，平行进 行的一个或多个步骤可以分开进行。在特定实施方案中，ssDNA中间体可以包括与两种或更多种不同目的序列各自或其片段基本上相同的序列，使得杂交涵盖两个或更多个ssDNA变 体群体各自与ssDNA中间体的杂交。在某些实施方案中，两个或更多个ssDNA变体群体可 以同时或相继地与ssDNA中间体杂交。 [0020] 通过易错PCR生成dsDNA变体群体的方法可以包括下述步骤：提供包括目的序列的模板DNA分子，提供一对寡核苷酸，使得寡核苷酸与目的序列的相反链杂交，使得寡核苷酸之一包括三个或更多个5'硫代硫酸酯，并且另一寡核苷酸不包括三个或更多个5'硫代 硫酸酯，并且寡核苷酸侧接目的序列，并且使用寡核苷酸对模板DNA分子进行易错PCR，从 而生成dsDNA变体群体。 [0021] 通过易错PCR生成ssDNA变体群体的方法可以包括下述步骤：提供包括目的序列的模板DNA分子，提供一对寡核苷酸，使得寡核苷酸与目的序列的相反链杂交，使得寡核苷酸之一包括三个或更多个5'硫代硫酸酯，并且另一寡核苷酸不包括三个或更多个5'硫代 硫酸酯，并且寡核苷酸侧接目的序列，使用寡核苷酸对模板DNA分子进行易错PCR，从而生 成dsDNA变体群体，并且使dsDNA变体群体与能够水解dsDNA变体的非硫代磷酸酯链、但非 硫代磷酸酯链的酶一起孵育，从而产生ssDNA变体群体。 [0022] 通过PCR生成dsDNA分子群体的方法可以包括下述步骤：提供包括目的序列的模板DNA分子，提供一对寡核苷酸，使得寡核苷酸与目的序列的相反链杂交，使得寡核苷酸之一包括三个或更多个5'硫代硫酸酯，并且另一寡核苷酸不包括三个或更多个5'硫代硫 酸酯，并且寡核苷酸侧接目的序列，并且使用寡核苷酸对模板DNA分子进行PCR，从而生成 dsDNA分子群体。 [0023] 通过PCR生成ssDNA分子群体的方法可以包括下述步骤：提供包括目的序列的模板DNA分子，提供一对寡核苷酸，使得寡核苷酸与目的序列的相反链杂交，使得寡核苷酸之一包括三个或更多个5'硫代硫酸酯，并且另一寡核苷酸不包括三个或更多个5'硫代硫酸 酯，并且寡核苷酸侧接目的序列，使用寡核苷酸对模板DNA分子进行PCR，从而生成dsDNA分子群体，并且使dsDNA分子群体与能够水解dsDNA分子的非硫代磷酸酯链、但非硫代磷酸酯 链的酶一起孵育，从而产生ssDNA分子群体。 [0024] 噬菌体展示方法可以包括下述步骤：提供通过本发明的实施方案生成的变体文库，培养变体文库的一个或多个等分试样，以生成培养的变体文库，使培养的变体文库的一个或多个等分试样与辅助噬菌体一起孵育，以生成噬菌体展示文库，使得噬菌体展示文库 的细胞展示由目的序列编码的蛋白变体，使噬菌体展示文库的细胞与靶分子接触，使得由 目的序列编码的蛋白变体中的一种或多种可以与靶分子相互作用，并且从噬菌体展示文库 的细胞中分离展示与靶分子相互作用的变体蛋白的那些细胞。变体蛋白可以通过下述与 靶分子相互作用：结合靶分子，切割靶分子，催化靶分子的反应，诱导靶分子中的构象变化，或修饰靶分子。靶分子可以是小分子、蛋白或其结构域或片段、病原体蛋白或其结构域或片段、酶或其结构域或片段、或者人蛋白或其结构域或片段。 [0025] 选择性降解非重组核酸的方法可以包括下述步骤：提供包括具有限制性位点的至少一个区段的第一核酸；提供包括不含限制性位点的至少一个区段的第二核酸；对第一核 酸和第二核酸实施用于重组第一核酸和第二核酸的反应，使得第一核酸的区段替换为第二 核酸的区段，从而生成不包括限制性位点的重组产物；将反应产物转化到表达能够切割限 制性位点的限制性酶的细胞内；并且以足以允许由细胞表达的限制性酶切割的方式孵育细 胞。该方法可以进一步包括测定细胞是否包括不含由限制性酶切割的限制性位点的重组产 物的步骤，和/或从细胞中分离重组产物的步骤。限制性酶可以是Eco29kI。在这些方法的 任一种中，重组产物可以编码免疫球蛋白轻链和/或免疫球蛋白重链，由第一核酸的至少 一部分和第二核酸的至少一部分编码的免疫球蛋白轻链和/或免疫球蛋白重链中的一种 或多种。 [0026] 选择性降解非诱变核酸的方法可以包括下述步骤：提供包括具有限制性位点的至少一个区段的第一核酸；提供具有至少一个区段的第二核酸，所述至少一个区段不含限制 性位点，且能够与具有限制性位点的第一核酸的至少一个区段杂交；使第二核酸与第一核 酸杂交，生成异源双链DNA；分辨异源双链DNA，从而生成不包括限制性位点的产物；将反 应产物转化到表达能够切割限制性位点的限制性酶的细胞内；并且以足以允许由细胞表达 的限制性酶切割的方式孵育细胞。该方法可以进一步包括测定细胞是否包括不含由限制 性酶切割的限制性位点的产物的步骤，和/或从细胞中分离产物的步骤。限制性酶可以是 Eco29kI。在这些方法的任一种中，产物可以编码免疫球蛋白轻链和/或免疫球蛋白重链， 由第二核酸的至少一部分或其序列编码的免疫球蛋白轻链和/或免疫球蛋白重链中的一 种或多种。在这些方法的任一种中，第一核酸可以是ssDNA中间体，并且第二核酸可以是 ssDNA变体。 [0027] 从诱变开放读码框选择性表达蛋白的方法可以包括下述步骤：提供在以其他方式能够表达的开放读码框的至少一个区段中包括一个或多个终止密码子的第一核酸；提供包 括不含终止密码子的至少一个区段的第二核酸；对第一核酸和第二核酸实施用于重组第一 核酸和第二核酸的反应，使得第一核酸的区段替换为第二核酸的区段，从而生成在开放读 码框中不包括终止密码子的重组产物；将反应的产物转化到细胞内；并且使细胞孵育足以 允许开放读码框表达的时间段。该方法可以进一步包括测定细胞是否包括由开放读码框表 达的蛋白或其部分的步骤，所述开放读码框包括第一核酸的一部分的序列和第二核酸的至 少一部分的序列，和/或从细胞中分离由开放读码框表达的蛋白或其片段的步骤，所述开 放读码框包括第一核酸的一部分的序列和第二核酸的至少一部分的序列。在这些方法的任 一种中，重组产物可以编码免疫球蛋白轻链和/或免疫球蛋白重链，由第一核酸的至少一 部分和第二核酸的至少一部分编码的免疫球蛋白轻链和/或免疫球蛋白重链中的一种或 多种。在这些方法的任一种中，重组反应可以是诱变反应，其中第一核酸是ssDNA中间体，并且第二核酸是ssDNA变体。 [0028] 从诱变开放读码框选择性表达蛋白的方法可以包括下述步骤：提供在以其他方式能够表达的开放读码框的至少一个区段中包括一个或多个终止密码子的第一核酸；提供包 括至少一个区段的第二核酸，所述至少一个区段不含终止密码子，且能够与具有一个或多 个终止密码子的第一核酸的至少一个区段杂交；使第二核酸与第一核酸杂交，生成异源双 链DNA；分辨异源双链DNA，从而生成在开放读码框中不包括终止密码子的产物，将反应的 产物转化到细胞内；并且使细胞孵育足以允许开放读码框表达的时间段。该方法可以进一 步包括测定细胞是否包括由开放读码框表达的蛋白或其部分的步骤，所述开放读码框包括 第一核酸的一部分的序列和第二核酸的至少一部分的序列，和/或从细胞中分离由开放读 码框表达的蛋白或其片段的步骤，所述开放读码框包括第一核酸的一部分的序列和第二核 酸的至少一部分的序列。在这些方法的任一种中，产物可以编码免疫球蛋白轻链和/或免 疫球蛋白重链，由第二核酸的至少一部分或其序列编码的免疫球蛋白轻链和/或免疫球蛋 白重链中的一种或多种。在这些方法的任一种中，重组反应可以是诱变反应，其中第一核酸是ssDNA中间体，并且第二核酸是ssDNA变体。组合物可以通过本发明的方法产生。这些 包括dsDNA变体群体、ssDNA变体群体、变体文库、培养的文库、沉淀的培养的文库、噬菌体展示文库、沉淀的噬菌体展示文库、稀释的培养的文库、系列稀释的培养的文库、以及铺平板的系列稀释的培养的文库。 [0029] 如本文使用，术语“约”意指所述值的+/- 10%。 [0030] “基本上相同”意指与参考核酸序列相比较，具有至少35%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、85%、90%、95%或甚至99%同一性的核酸。序列同一性通常使用序列分析软件，伴随其中指定的缺省参数(Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue， Madison，WI 53705)进行测量。该软件程序通过对各种置换、缺失及其他修饰指定同源性 程度来匹配相似序列。比较序列的长度一般为至少20个核苷酸(例如60个核苷酸)、优选 至少90个核苷酸、且优选至少120个核苷酸或全长。本文应当理解可以在序列的核碱基之 间发现缺口，所述序列的核碱基与原始序列的核碱基相同或相似。缺口可以包括无核碱基 或者与原始核酸不相同或不相似的一个或多个核碱基。 [0031] 核苷酸序列基本上相同的另一种指示是两种分子在严格条件下是否彼此杂交。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下将不同。一般地，严格条件选择为比在限定离 子强度和pH下关于特异性序列的热解链温度(Tm)低约5℃至约20℃，通常为约10℃至约 15℃。Tm是在其下50%的靶序列与匹配探针杂交的温度(在限定离子强度和pH下)。通 常，严格条件将是其中盐浓度为在pH 7下约0.02摩尔，并且温度为至少约60℃的那些条 件。例如，在标准southern杂交操作中，严格条件包括在42℃下在6× SSC中的初始洗涤， 随后为在至少约55℃下、通常为约60℃且通常为约65℃的温度下，在0.2× SSC中的一次 或多次另外的洗涤。 [0032] DNA“序列”意指DNA分子中的一系列核碱基。DNA分子可以是单链的(ss)或双链的(ds)。当提及dsDNA分子的序列时，该术语可以指dsDNA分子的两条链之一或两者的 序列。当提及ssDNA分子的序列时，该术语可以指ssDNA分子的序列、与ssDNA分子互补的 链的序列或两者。 [0033] “目的序列”意指DNA分子中的一系列核碱基，其可以用作生成变体文库中的起点。 [0034] DNA的“片段”是包括至少约10个连续核碱基的序列，例如约10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、 650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500或4000个核碱基的序列。蛋白的“片段”意指一系列至少6个氨基酸，例如约6、8、10、20、25、30、35、40、45、50、55、 60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、 750、800、850、900、950、1000个或更多个氨基酸。 [0035] “目的序列的变体”意指衍生自目的序列的序列，例如通过扩增反应衍生自目的序列的序列，与目的序列相比较，其含有一种或多种序列变化。目的序列的变体可以与所述目的序列具有70%-99.9%同一性，例如约70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、 99.5%或99.9%同一性。变体可以与目的序列基本上相同。变体可以是单链(ss)或双链 (ds)DNA分子。dsDNA变体可以是扩增反应的产物。ssDNA变体可以是dsDNA变体的一条链， 其已与其互补链解离，例如如果互补链是降解的。如本文使用，术语“大引物(megaprimer)”与术语“ssDNA变体”可互换。 [0036] “降解”意指通过经由酶或化学品处理而切割、去除或替换核碱基，来改变DNA分子。 [0037] “受保护的”意指在相同条件下，与未受保护的DNA分子相比较，DNA分子更缓慢地降解。受保护的DNA分子可以是完全不降解的DNA分子。受保护的DNA分子可以是这样的DNA分子，其包括经修饰的核碱基，除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶外的核碱基，或除磷酸二酯键外的核苷酸间键，使得与未受保护的DNA分子的降解相比较，DNA分子的降解被 抑制。可替代地，受保护的DNA分子可以是与如此修饰的DNA分子的降解相比较，不以能够 增加DNA分子降解的方式修饰的DNA分子。 [0038] “选择性降解”意指与其他DNA分子相比较，提供的酶更快速地降解一些DNA分子。例如，酶可以相对于受保护的链选择性降解未受保护的链。未受保护的链可以被选择 性降解的速率例如比受保护的链在其下降解的速率大至少约20倍。例如，未受保护的链可 以以比受保护的链大约20-、30-、40-、50-、60-、70-、80-、90-、100-、200-、300-、400-、500-、 600-、700-、800-、900-、1000-、2000-、3000-、4000-、5000-倍或更多倍的速率选择性降解。 在一些情况下，酶可以完全不降解受保护的链。 [0040] “5'硫代磷酸酯”意指例如在5'末端核苷酸间键位置处，存在于寡核苷酸中的硫代硫酸酯。5'硫代磷酸酯可以是寡核苷酸的末端5'键，或可以通过一个或多个核苷酸与5' 末端键分开。在具有两个或更多个5'硫代磷酸酯的寡核苷酸中，硫代磷酸酯可以占据包括 5'末端核苷酸间键位置在内的连续核苷酸间键位置。可替代地，硫代硫酸酯可以占据不连 续的核苷酸间键位置，并且占据的位置可以不包括5'末端核苷酸间键位置在内。具有两个 或更多个5'硫代磷酸酯的寡核苷酸的硫代磷酸酯可以是连续的硫代磷酸酯、不连续的硫 代磷酸酯、或连续和不连续的硫代磷酸酯的混合物。具有两个或更多个5'硫代磷酸酯的寡 核苷酸可以包括2个或更多个连续硫代磷酸酯，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、 50或100个或更多个连续硫代磷酸酯，或可以不具有连续的硫代磷酸酯。具有三个或更多 个5'硫代磷酸酯的寡核苷酸可以包括3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或100个或更多个硫代磷酸酯。 [0041] 具有零个、一个或两个硫代磷酸酯的寡核苷酸是“非硫代磷酸酯寡核苷酸”。具有三个或更多个硫代磷酸酯的寡核苷酸是“硫代磷酸酯寡核苷酸”。 [0042] 一对寡核苷酸被称为“侧接”模板DNA分子中的目的序列，如果在模板DNA分子的相反链上发现寡核苷酸可以与之杂交的序列，使得当寡核苷酸与这些杂交序列比对时，寡 核苷酸的3'末端彼此面对，并且目的序列将落在寡核苷酸的5'末端之间。 [0043] “扩增反应”意指生成目的序列拷贝的任何反应。拷贝可以是目的序列或目的序列变体的完全拷贝。扩增反应的保真度取决于诸如利用的聚合酶、核苷酸、缓冲液和循环条件的因素，以及其他因素。本领域已知的扩增反应包括聚合酶链式反应(PCR)和易错PCR。扩增反应可以使用两种寡核苷酸进行，例如受保护的寡核苷酸和未受保护的寡核苷酸，例如 硫代磷酸酯寡核苷酸和非硫代磷酸酯寡核苷酸。 [0044] 如本文使用，“受保护的链”意指通过从受保护的寡核苷酸引发的延伸，在扩增反应中产生的DNA分子。 [0045] 如本文使用，“未受保护的链”意指通过从未受保护的寡核苷酸引发的延伸，在扩增反应中产生的DNA分子。 [0046] 如本文使用，“硫代磷酸酯链”意指具有3个或更多个5'硫代磷酸酯的DNA分子。 [0047] 如本文使用，“非硫代磷酸酯链”意指具有少于三个5'硫代磷酸酯的DNA分子。 [0048] “ssDNA中间体”意指ssDNA变体可以与之杂交的ssDNA分子。ssDNA中间体可以是用于转化的载体。例如，ssDNA中间体可以是噬菌粒。 [0049] “异源双链DNA”意指由与ssDNA中间体杂交的ssDNA变体构成的分子群体，或在转化到细胞内之前，通过后续加工步骤例如延伸、变性或链特异性消化，而衍生自此类分子群体的组合物。“异源双链DNA分子”意指与ssDNA中间体杂交的ssDNA变体，或在转化到细胞内之前，通过后续加工步骤例如延伸、变性或链特异性消化，而衍生自此类分子的产物。 [0050] “纯化”意指从原材料中分离约20% - 100%的所需产物，例如约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的所需产物。 [0051] 附图简述图1是本发明的方法的实例的图解。重组抗体目的序列在易错PCR条件下进行扩增。 所得到的dsDNA变体用T7核酸外切酶进行处理，以选择性降解dsDNA分子的一条链，导致 ssDNA变体或大引物。这些ssDNA变体(大引物)与尿嘧啶化的环状单链噬菌粒退火，并且 用于引发通过DNA聚合酶的体外合成。将连接的异源双链产物转化到大肠杆菌菌株内，所 述大肠杆菌菌株能够从DNA中去除尿嘧啶，并且修复DNA有利于含有ssDNA变体的新近合 成的重组链。 [0052] 图2是用SYBR Gold染色的非变性聚丙烯酰胺凝胶，显示dsDNA易错PCR产物转换为ssDNA分子。第一泳道含有梯状条带(ladder)。未经处理的dsDNA易错PCR产物显 示于梯状条带后的前五个泳道中。将T7核酸外切酶加入末5个泳道中的易错PCR产物中。 使用未经修饰的正向引物和磷酸化的反向引物生成易错PCR产物，所述磷酸化的反向引物 是未经修饰的，或者用一个、两个、三个或四个5'硫代磷酸酯进行修饰，如在每个泳道上标记。如由该凝胶分析可见，需要至少三个5'硫代磷酸酯以保护链免于T7酶的核酸外切酶 活性。 [0053] 图3是显示ssDNA转换为异源双链DNA的琼脂糖凝胶电泳。ssDNA分子与尿嘧啶化的环状ssDNA分子杂交，以形成异源双链体。泳道M是2 log DNA梯状条带(New England Biolabs)。泳道一、二和三分别为单独的尿嘧啶化的环状ssDNA分子(pAX143)、由3:1比 率的ssDNA变体与尿嘧啶化的环状ssDNA中间体形成的异源双链体、以及由10:1比率的 ssDNA变体与尿嘧啶化的环状ssDNA中间体形成的异源双链体。Y轴标记指示单独的尿嘧 啶化的环状ssDNA(pAX143)(ssDNA)和异源双链DNA(hetDNA)的条带。 [0054] 图4是显示scFv构建体的一对图解。上面的构建体代表ssDNA中间体序列。下面的构建体代表模板DNA分子。 [0055] 图5是显示重和轻链可变序列克隆到分开载体内，以转移到相同细胞内用于免疫球蛋白表达的图解。 [0056] 图6是显示重链序列和轻链序列可以插入其内，例如用于双顺反子表达的载体的图解。 [0057] 图7是显示重和轻链免疫球蛋白链序列的诱变，伴随后续转化到具有Eco29kI的TG1细胞内的图解。 [0058] 图8是显示重和轻链免疫球蛋白结构域的诱变的图解。 [0059] 详述从多样化遗传序列的文库中分离功能序列的过程可以被称为定向进化。产生遗传序列 的大型多样性文库的有效方法是该过程中的关键步骤。此类文库可以是目的序列的变体群 体。本发明涉及生成例如可以用于定向进化中的目的序列的变体文库的有效方法。如下文 详细描述，该方法可以包括扩增反应，例如易错PCR，以生成目的序列的双链DNA(dsDNA)变体，这之后dsDNA变体的一条链可以选择性降解，以产生单链DNA(ssDNA)变体。ssDNA变 体可以与ssDNA中间体例如尿嘧啶化的环状ssDNA中间体杂交，以形成异源双链DNA。在 一些实施方案中，使用ssDNA中间体作为模板，异源双链DNA与DNA聚合酶一起孵育，以延 伸ssDNA变体。异源双链DNA可以转化到细胞例如大肠杆菌细胞内，获得变体文库。这种 方法消除无效的亚克隆步骤和由许多现有方法要求的昂贵引物组的需要。 [0060] 目的序列本方法还涉及目的序列的变体文库。目的序列可以是随机化的序列、不具已知功能的 序列或编码蛋白的序列。目的序列可以编码酶或其结构域或片段、激酶或其结构域或片段、转录因子或其结构域或片段、DNA结合蛋白或其结构域或片段、RNA结合蛋白或其结构域或 片段、抗体或其结构域或片段、聚合酶或其结构域或片段、或者人蛋白或其结构域或片段。 [0061] 扩增反应在本方法中，dsDNA变体可以由模板DNA分子扩增。模板DNA分子是包括目的序列的 分子。模板DNA分子可以是ssDNA分子、dsDNA分子、环状ssDNA分子、环状dsDNA分子、尿 嘧啶化的环状ssDNA分子、或尿嘧啶化的环状dsDNA分子。模板DNA分子可以是PCR产物、 质粒、噬菌粒、噬菌体包装的DNA分子、或分离的DNA分子。 [0062] 在本方法中，目的序列可以使用一对寡核苷酸进行扩增，所述一对寡核苷酸中的一种寡核苷酸是受保护的寡核苷酸，并且另一种是未受保护的寡核苷酸。目的序列可以通 过扩增反应使用此类寡核苷酸对进行扩增，所述扩增反应例如PCR、易错PCR、等温扩增或 滚环扩增。 [0063] 各种扩增方法可以诱导扩增子的序列与目的模板序列的序列不同的序列变化。某些PCR方法促进核苷酸错误掺入。易错PCR是此类方法的实例。易错PCR可以通过本领 域已知的任何方法进行。易错PCR通常为标准PCR的修饰形式，其增强在其下突变引入 由模板序列扩增的序列内的比率。增加PCR的突变率的方法包括增加MgCl2的浓度、增加 MnCl2的浓度、以其他方式改变二价阳离子的可用性，包括在PCR反应中的每种核苷酸的不 相等比例，或包括核苷酸类似物。易错PCR的具体方法是本领域已知的。例如，Rasila等 人(Analytical Biochemistry，2009，388:71-80)描述了使用Taq DNA聚合酶和诱变缓冲 液的易错PCR，并且美国专利号6803216描述了使用新型易错DNA聚合酶的PCR诱变。其他 方法也是本领域已知的。 [0064] 因为DNA聚合酶在PCR中的使用始终导致一定程度的突变，所以PCR的标准方法也可以用于产生目的序列的dsDNA变体。天然和经工程改造的DNA聚合酶两者的固有错误 率不同。本发明的扩增反应产物可以是目的序列的dsDNA变体。 [0065] 寡核苷酸本发明的扩增反应可以利用一对寡核苷酸，其中一种寡核苷酸是受保护的寡核苷酸， 并且另一种是未受保护的寡核苷酸。由于在本发明中使用的寡核苷酸，每种dsDNA变体可 以具有受保护的链和未受保护的链。受保护的链可以相对于未受保护的链选择性降解，允 许dsDNA变体转换为ssDNA变体。 [0066] 在本发明的一个实例中，侧接目的序列的硫代磷酸酯寡核苷酸和非硫代磷酸酯寡核苷酸用于从模板DNA分子扩增目的序列。这些寡核苷酸设计为将三个或更多个5'硫代 磷酸酯选择性掺入dsDNA变体的一条链而不是另一条链内。更具体而言，与目的序列互补 的寡核苷酸之一(硫代磷酸酯寡核苷酸)具有三个或更多个5'硫代磷酸酯，而与目的序列 的相反链互补的第二寡核苷酸(非硫代磷酸酯寡核苷酸)具有少于三个硫代磷酸酯。 [0067] 硫代磷酸酯寡核苷酸可以包括三个或更多个硫代磷酸酯，例如约3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或100个硫代磷酸酯。优选地，硫代磷酸酯寡核苷酸包括3 - 100个硫代磷酸酯、更优选3 - 20个硫代磷酸酯、或再更优选3 - 10个硫代磷酸酯。硫代磷酸酯可 以是连续的或分布遍及硫代磷酸酯寡核苷酸。非硫代磷酸酯寡核苷酸可以包括少于三个硫 代磷酸酯，例如两个、一个或零个硫代磷酸酯。硫代磷酸酯寡核苷酸或非硫代磷酸酯寡核苷酸中任一的长度可以是8 - 200个碱基对，例如约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、100、150或200个碱基对。 [0068] 由于使用的寡核苷酸，目的序列的每种dsDNA变体可以包括具有三个或更多个5'硫代磷酸酯的链和具有少于三个5'硫代磷酸酯的链。具有三个或更多个5'硫代磷酸酯的 链可以相对于具有少于三个5'硫代磷酸酯的链被保护免于降解。 [0069] 在本发明的另一个实例中，受保护的寡核苷酸包括5'磷酸酯，并且未受保护的寡核苷酸不包括5'磷酸酯。缺乏5'磷酸酯的未受保护的链可以比受保护的链更快速地降解， 提供用于产生ssDNA变体的手段。在一些实施方案中，提供受保护的寡核苷酸的机制可以 与提供未受保护的寡核苷酸的不同机制组合使用。 [0070] dsDNA变体转换为ssDNA变体本发明利用酶、化合物或化学品，其选择性降解dsDNA变体的未受保护的链，以将 dsDNA变体有效转换成ssDNA变体。通常，DNA水解不是链特异性的。在本发明中，dsDNA 变体的单条链的选择性降解是可能的，因为一条链是受保护的链，而另一条链是未受保护 的链。 [0071] 例如，三个或更多个5'硫代磷酸酯可以保护DNA链免于降解。相比之下，具有零个、一个或两个硫代磷酸酯的链将不受保护。其中受保护的链包括三个或更多个5'硫代磷 酸酯，并且未受保护的链包括少于三个5'硫代磷酸酯的dsDNA变体，可以通过选择性降解 具有少于三个5'硫代磷酸酯的DNA链的酶而转换为ssDNA变体。 [0072] 能够选择性降解具有少于三个5'硫代磷酸酯的链的核酸外切酶的实例包括T7核酸外切酶和λ核酸外切酶。T7和λ核酸外切酶两者均以5'至3'方向水解双链DNA。如 果dsDNA分子的一条链受5'硫代磷酸酯保护，并且相反链不是，则相反链将被T7或λ核酸 外切酶选择性降解。未受保护的链可以是完全降解的。选择性降解产生ssDNA变体。ssDNA 变体随后可以与ssDNA中间体杂交(例如图1)。在另一个实例中，受保护的寡核苷酸是包 括5'磷酸酯的核苷酸，而未受保护的寡核苷酸不包括5'磷酸酯。未受保护的链可以被核 酸外切酶比受保护的链更快速地降解。λ核酸外切酶是可以相对于具有5'磷酸酯的链选 择性降解不含5'磷酸酯的链的核酸酶的实例。其中受保护的链包括5'磷酸酯，并且未受 保护的链不包括5'磷酸酯的dsDNA变体的处理，可以将dsDNA变体转换成ssDNA变体。 [0073] ssDNA变体掺入异源双链DNA内生成目的序列的变体文库要求用目的序列的变体转化细胞。为了使这发生，ssDNA变 体可以调整为细胞例如大肠杆菌可以用其成功转化的形式。在本发明中，ssDNA变体通过与ssDNA中间体杂交而掺入异源双链DNA内。在一些实施方案中，ssDNA变体在杂交前是纯化 的。ssDNA变体与ssDNA中间体一起孵育，所述ssDNA中间体包括ssDNA变体可以与之杂交 的序列。在一些情况下，该序列与目的序列相同或基本上相同。例如，ssDNA中间体可以包括与目的序列30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%相同的序列。 [0074] ssDNA中间体可以是环状ssDNA分子或线性ssDNA分子。ssDNA中间体可以是噬菌粒，或包括与噬菌粒相同或基本上相同的序列片段。ssDNA中间体可以通过本领域已知的各种技术进行修饰用于噬菌体展示的目的，例如使得目的序列的ssDNA变体掺入对于噬菌 体展示最佳化的基因表达机制内。ssDNA中间体可以是尿嘧啶化的或甲基化的。 [0075] 为了使ssDNA变体与ssDNA中间体杂交，ssDNA变体和ssDNA中间体可以在允许杂交的温度或一系列温度下共孵育。例如，它们可以在变性温度下共孵育，伴随逐步冷却至退火温度。杂交方法是本领域已知的。示例性温度可以包括在约90℃下变性，在约55℃下 退火，且以约-1℃/分钟从变性温度冷却到退火温度。 [0076] 在某些实施方案中，杂交的ssDNA变体可以在DNA聚合酶和游离核苷酸的存在下引发DNA延伸。延伸可以通过在其下DNA聚合酶是活性的温度下孵育延伸反应来完成。延 伸反应可以任选包括连接酶。在一些实施方案中，其中ssDNA中间体是例如尿嘧啶化的或 甲基化的，完全延伸可以导致异源双链DNA分子，其包括ssDNA中间体的原始尿嘧啶化的或 甲基化的链，以及具有与ssDNA中间体相同的序列的新的非尿嘧啶化的和/或非甲基化的 链，除了已掺入的ssDNA变体中存在的变化或差异以及在延伸期间引入的任何另外变化或 差异之外。 [0077] 在一些实施方案中，异源双链DNA可以在转化前在体外进行处理，以便选择性降解ssDNA中间体链。这可以通过下述来完成：使异源双链DNA变性，并且用能够选择性降解 ssDNA中间体链的酶、化合物或化学品处理变性的异源双链DNA。例如，如果ssDNA中间体 链而不是ssDNA变体链包括经修饰的核碱基，或除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶外的核碱基，则特定酶可以在体外选择性降解ssDNA中间体。在一个实例中，ssDNA中间体链包 括甲基化的腺嘌呤核碱基，并且变性的异源双链DNA用酶DpnI进行处理，所述酶DpnI选择 性降解甲基化的DNA。可替代地，ssDNA变体链可以包括经修饰的核碱基，或除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶外的核碱基，其在ssDNA中间体链中未发现，并且选择性保护ssDNA 变体链免于降解。在一个实例中，ssDNA变体链而不是ssDNA中间体链包括甲基化的核碱 基，并且变性的异源双链DNA用酶Sau3AI进行处理，所述酶Sau3AI选择性降解非甲基化的 DNA。一组链中存在的修饰或非典型碱基可以完全或仅部分不存在于另一组的链中。 [0078] 来自两个或更多个ssDNA变体群体的ssDNA变体掺入异源双链DNA内在一些实施方案中，衍生自单一目的序列的ssDNA变体可以与ssDNA中间体杂交。在 其他实施方案中，衍生自两种或更多种不同目的序列的ssDNA变体可以与ssDNA中间体杂 交。例如，ssDNA变体可以由dsDNA生成，所述dsDNA由两种或更多种不同目的序列各自生 成。任何两种不同的目的序列可以在单一模板DNA序列或不同模板DNA序列中发现。像这 样，任何两个或更多个不同的dsDNA变体群体可以由单一模板DNA分子，或者两种或更多种 不同的模板DNA分子扩增。 [0079] 单对寡核苷酸，包括受保护的寡核苷酸和未受保护的寡核苷酸，能够扩增两种或更多种目的序列。可替代地，两个或更多个不同寡核苷酸对可以用于扩增两种或更多种目 的序列，每对能够扩增一种或多种目的序列。通过其相对于未受保护的寡核苷酸，给定寡核苷酸对的受保护的寡核苷酸被选择性保护免于降解的机制，对于任何两对寡核苷酸可以是 相同的，或对于任何两对寡核苷酸可以是不同的。 [0080] 由任何两种目的序列各自产生dsDNA变体群体可以分开进行，使得由每种目的序列生成的ssDNA变体是物理上分开的。例如，任何两种不同的目的序列的扩增可以在分开 的反应室中进行。分开进行的任何两个扩增反应可以是相同类型的扩增反应，例如两个易 错PCR，或不同类型的反应，例如一个反应可以是易错PCR，而另一个可以是标准PCR或等温扩增。可替代地，任何两种目的序列的扩增可以在单一反应中进行。类似地，任何两个dsDNA变体群体转换为ssDNA变体可以分开地或在单一反应中进行。dsDNA变体的转换可以通过 任何选择性降解机制来完成，所述选择性降解机制的适用性可以通过在每种扩增反应中利 用的寡核苷酸来决定。 [0081] 两个或更多个分开生成的ssDNA变体群体可以在与ssDNA中间体杂交之前或期间组合。ssDNA中间体可以包括与目的序列各自基本上相同的序列。单一序列可以与超过一 种目的序列基本上相同。可替代地，单一序列可以与仅一种目的序列基本上相同。任何两种目的序列均可与ssDNA中间体的单一序列、ssDNA中间体的重叠序列、或ssDNA中间体的非 重叠序列基本上相同。ssDNA中间体可以包含单一目的序列可以与之杂交的多个重叠或非 重叠序列。ssDNA变体群体与ssDNA中间体的杂交可以同时或相继地发生。组合的ssDNA 变体群体可以通过上文描述的方法与ssDNA中间体杂交，并且所得到的异源双链DNA可以 适合在本发明的任何杂交后步骤、处理或反应中利用。所述步骤、反应或处理中的任一个均可平行发生，意指它们以允许不同ssDNA群体掺入单一异源双链DNA内的方式发生。平行 发生的步骤、反应或处理可以同时发生或在相似时间段内发生，或者可以不同时发生或不 在相似时间段内发生。使两个或更多个ssDNA变体群体与ssDNA中间体杂交的方法可以包 括由两种或更多种目的序列，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20种目的序列生成ssDNA中间体。 [0082] 使两个或更多个ssDNA变体群体与ssDNA中间体杂交的方法的使用的实例可以是修饰在编码目的蛋白的序列内的多个序列片段。例如，抗体可以具有固定构架和限定抗体 功能的多个不邻接的互补决定区(CDR)。编码每个CDR的序列或其片段可以是目的序列。 通过在本发明的方法中由每种CDR目的序列生成ssDNA变体，可以生成仅在其中需要变异 的区域(CDR)而不是其他区域(固定构架)中具有序列变化的目的序列的变体文库。目的 序列的这些变体可以用于定向进化的方法中，以鉴定具有特定功能的抗体。 [0083] 用异源双链DNA或通过异源双链DNA中间体链的选择性体外降解产生的ssDNA变体链转化细胞 用异源双链DNA或通过异源双链DNA中间体链的选择性体外降解产生的ssDNA变体链 转化细胞可以通过本领域已知的任何方法来完成。实例包括电穿孔、化学转化和热休克转 化。细胞可以进行处理，以使对于所选转化方法的能力最佳化。在一些实施方案中，异源双链DNA可以在转化前进行纯化。转化可以包括1 - 50个或更多个等分试样的转化。例如， 可以转化1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个等分试样。转化体可以是目的序列的变体文库。转化体可以在回收培养基中进行培养。个别等分试样可以在回收培养基中组合或 分开培养。在回收后，培养的转化体可以沉淀。沉淀的转化体可以贮存于-20℃或更低的温度下。可替代地，沉淀的转化体可以重悬浮。重悬浮的文库可以与辅助噬菌体一起孵育，导致噬菌体展示文库。可替代地，重悬浮的文库的一些或全部等分试样可以贮存于-20℃或更低的温度下。噬菌体展示文库可以沉淀。沉淀的噬菌体展示文库可以贮存于-20℃或更低 的温度下。可替代地，沉淀的噬菌体展示文库可以重悬浮。重悬浮的沉淀的噬菌体展示文 库可以贮存于-20℃或更低的温度下。培养的变体文库、重悬浮的变体文库、噬菌体展示文库或重悬浮的噬菌体展示文库可以任选稀释，且铺平板到培养平板上。 [0084] 本发明的细胞可以是真核生物例如哺乳动物、昆虫或酵母的细胞，或细菌例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌(B. subtilis)的细胞。利用尿嘧啶化的ssDNA中间体的实施方案 + 可以转化能够选择性降解尿嘧啶化的DNA的细胞，例如Ung大肠杆菌。利用甲基化的ssDNA + 中间体的实施方案可以转化能够选择性降解甲基化的DNA的细胞，例如Mcr 细菌。 [0085] 错配核苷酸的分辨异源双链DNA或通过异源双链DNA中间体链的选择性体外降解产生的ssDNA变体链可 以进行分辨，意指异源双链DNA或ssDNA变体链可以通过体外或体内过程进行修饰，以生成 具有较少错配核苷酸或无错配核苷酸的双链载体。分辨的载体可以掺入一种或多种ssDNA 变体的序列，与目的序列相比较，所述一种或多种ssDNA变体的序列具有存在的一种或多 种(例如果存在的话)变化或差异。在一些情况下，分辨的载体通过体外或体内反应形成， 其中一种或多种ssDNA变体与之杂交的异源双链DNA的中间体链的一个或多个错配核苷 酸这样进行修饰，使得中间体链的错配核苷酸替换(即修复)为与杂交的ssDNA变体链互 补的核苷酸。修复也可以这样发生，使得ssDNA变体链的一个或多个错配核苷酸这样进行 修饰，使得ssDNA变体链的错配核苷酸替换为与它与之杂交的中间体链的区段互补的核苷 酸。 [0086] 异源双链DNA的中间体链可以包括以保存(即有利于)ssDNA变体链序列的方式促进修复的修饰。在一些实施方案中，ssDNA变体链可以包括以有利于ssDNA变体链序列 的方式促进修复的修饰。在特定情况下，中间体链是尿嘧啶化的。在再更特定的情况下，将+ + DNA转化到ung细菌细胞例如 ung大肠杆菌细胞内。 [0087] 在其他情况下，通过异源双链DNA中间体链的选择性体外降解产生的ssDNA变体链在体内进行分辨。此类分辨可以例如通过生成与ssDNA变体链互补的新DNA链而发生。 [0088] 非重组载体的体内降解本发明包括降解非重组载体的方法，用于与本发明的一个或多个或所有实施方案结合 使用，或者不依赖于本发明的一个或多个或所有实施方案使用。在包括降解非重组载体的 实施方案中，受体载体在待去除、替换或以其他方式修饰的一个或多个区段内包括一个或 多个限制性位点。在例如通过克隆去除、替换或以其他方式修饰一个或多个区段后，细胞表达的限制性酶可以选择性降解中间体链。例如，在一些实施方案中，一个或多个限制性位点是SacII位点，并且限制性酶是Eco29kI(例如在Pertzev等人Nucleic Acids Res. 1992 April 25；20(8): 1991中描述，所述参考文献通过引用并入本文)。Eco29kI是能够切割 SacII限制性位点(CCGCGG)，并且可以在细菌细胞例如大肠杆菌中表达的SacII同裂酶。 SacII限制性位点的一个优点在于它包括A或T核苷酸，允许dut和ung策略与本发明的多 个实施方案组合的最佳使用。细胞可以是例如细菌细胞例如大肠杆菌细胞，或更具体而言，例如TG1细胞。因此，载体在表达一种或多种限制性酶的细胞内降解，在所述载体中一个或多个区段各自是未经修饰的、替换或去除的，使得所得到的载体不包括限制性位点。 [0089] 在特定实施方案中，非重组载体或载体链的体内降解可以用于促进免疫球蛋白的重组，使得scFv可变区和IgG恒定区以免疫球蛋白的形式排列。scFv可以包括轻链可变结 构域、接头、重链可变结构域和Gp3蛋白。在一些实施方案中，编码至少IgG重链恒定结构 域的核酸包括区段，其包括限制性位点和编码至少IgG重链恒定结构域的核酸。IgG重链可 以包括包含限制性位点的区段。重链和轻链核酸可以存在于分开的载体上、单一载体上，或在双顺反子表达系统中排列。在特定实施方案中，scFv轻链可变结构域和重链可变结构域 分别克隆到编码IgG轻链恒定结构域的核酸和编码IgG重链恒定结构域的核酸内，使得克 隆去除或修饰各自的限制性位点且导致形成编码IgG重链的核酸和编码IgG轻链的核酸。 如上所述，这两种构建体可以存在于分开载体(例如用于在单一细胞内表达)或单一载体 (例如用于分开的表达或在双顺反子排列中)上。 [0090] 在特定实施方案中，限制性位点是SacII限制性位点。在特定实施方案中，体内降解是通过Eco29kI。在特定情况下，中间体链是尿嘧啶化的。在再更特定的情况下，将DNA+ + 转化到ung细菌细胞例如 ung大肠杆菌细胞内。 [0091] 通过本文描述的方法描述、生成或能够生成的载体可以适合于转移到非细菌细胞类型例如CHO细胞内。载体可以包括足以指导载体中存在的一种或多种蛋白在一个或多个 细胞类型中表达的序列信息，所述细胞类型例如哺乳动物细胞、昆虫细胞和/或细菌细胞。 作为非限制性实例，通过本发明的方法生成的载体可以包括能够在CHO细胞中表达的IgG 重链和IgG轻链(图8)。 [0092] 有利于分辨ssDNA中间体链或未充分掺入ssDNA变体的载体的降解在本发明的多个实施方案的任一个中，可以提供用于选择性降解载体的机制，所述载 体有利于分辨ssDNA中间体链或未充分掺入ssDNA变体。特别地，ssDNA中间体可以包括包 含一个或多个限制性位点(例如可以由限制性酶识别且切割的序列)的一个或多个区段， 而能够与ssDNA中间体链区段杂交的ssDNA变体不包括那些限制性位点。相应地，一般而 言，如果限制性位点有利于ssDNA变体进行修复，则分辨的载体不被能够切割这些位点的 限制性酶降解。相比之下，如果限制性位点中的一个或多个有利于ssDNA中间体修复，则所得到的载体对通过能够切割那些位点的限制性酶的切割敏感。 [0093] 在一个实例中，ssDNA中间体包括特定限制性位点的单个拷贝，并且限制性位点位于ssDNA变体能够与之杂交的区域内。ssDNA变体不包括任何取向的限制性位点。相应地，限制性位点包括一个或多个错配核苷酸，其可以例如在体内进行修复。如果限制性位点错 配有利于ssDNA变体进行修复，则所得到的载体对通过特定限制性酶的降解敏感。可替代 地，如果限制性位点错配有利于ssDNA中间体进行修复，则所得到的载体将包括限制性位 点，且对通过特定酶的降解敏感。在具体实例中，ssDNA中间体是尿嘧啶化的。 [0094] 在多个实施方案中，ssDNA变体不包括限制性位点，因为限制性位点不存在于ssDNA变体基于其生成的模板分子中。在其他实施方案中，ssDNA变体不包括限制性位点， 因为限制性位点被诱变事件破坏。如上所述，本发明的多个实施方案可以包括衍生自两种 或更多种不同目的序列，并且能够与ssDNA中间体杂交的ssDNA变体。在此类情况下，两种 或更多种ssDNA变体各自能够与之杂交的ssDNA中间体的区段可以各自包括限制性位点。 在一些情况下，ssDNA变体能够与之杂交的两个或更多个区段各自包括相同的特定限制性 位点。在其他实施方案中，ssDNA变体能够与之杂交的两个或更多个区段包括两个或更多 个不同的限制性位点。 [0095] 在某些情况下，一种或多种ssDNA变体能够与之杂交的ssDNA中间体的一个或多个区段可以各自包括单个限制性位点。在其他实施方案中，一种或多种ssDNA变体能够与 之杂交的ssDNA中间体的区段可以包括两个或更多个限制性位点。 [0096] 在一些实施方案中，一种或多种分辨的载体是分离的和/或纯化的且用一种或多种限制性酶在体外进行处理，以降解有利于分辨ssDNA中间体链或未充分掺入ssDNA变体 的载体。 [0097] 在一些实施方案中，有利于分辨ssDNA中间体链或未充分掺入ssDNA变体的一种或多种载体在体内被降解。特别地，分辨的载体可以存在于表达限制性酶的细胞中，且包括限制性酶能够降解的一个或多个限制性位点。在再更特定的实施方案中，分辨的载体可以 存在于表达限制性酶Eco29kI的细胞中。细胞可以是例如细菌细胞，例如大肠杆菌细胞，例如TG1细胞。 [0098] 在特定实施方案中，非重组载体的体内降解可以用于促进以免疫球蛋白形式的重和轻链可变区以及IgG恒定区的ssDNA变体的重组。轻链可变结构域和重链可变结构域可 以是例如scFv轻链可变结构域和重链可变结构域。在一些实施方案中，编码至少IgG重链 恒定结构域的核酸包括包含限制性位点的区段，并且编码至少IgG轻链恒定结构域的核酸 包括包含限制性位点的区段。重链和轻链核酸可以存在于分开的载体上、单一载体上，或在双顺反子表达系统中排列(参见例如图5-7)。在特定实施方案中，轻链可变结构域和重链 可变结构域分别与编码IgG轻链恒定结构域的核酸和编码IgG重链恒定结构域的核酸杂 交，使得杂交载体的分辨去除或修饰各自的限制性位点。这导致形成编码IgG重链的核酸 和编码IgG轻链的核酸，各自可能掺入一种或多种ssDNA变体。如上所述，这两种构建体可 以存在于分开载体(例如用于在单一细胞内表达)或单一载体(例如用于分开的表达或在 双顺反子排列中)上。构建体可以转移到例如细菌内且可以在其中分辨。 [0099] 在特定实施方案中，限制性位点是SacII限制性位点。在特定实施方案中，体内降解是通过Eco29kI且细菌是表达Eco29kI的细菌。 [0100] 通过本文描述的方法描述、生成或能够生成的载体可以适合于转移至非细菌细胞类型例如CHO细胞。载体可以包括足以指导载体中存在的一种或多种蛋白在一个或多个细 胞类型中表达的序列信息。作为非限制性实例，通过本发明的方法生成的载体可以包括能 够在CHO细胞中表达的IgG重链和IgG轻链(图8)。 [0101] 用于降解有利于分辨ssDNA中间体链或未充分掺入ssDNA变体的载体的上述方法和组合物可以使在多个靶向基因座各自处的重组核酸、充分重组的核酸、或核酸重组体 的回收改善10%或更多，例如10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、500%或 1000%或更多。 [0102] 目的序列的变体文库的大小和特征本发明的方法可以获得变体总数目大于约1E+05，例如约1E+05、1E+06、1E+07、1E+08、 1E+09、1E+10、1E+11或1E+12种变体或更多的变体文库。在通过本发明的方法产生的转化 体中，重组转化体的数目可以大于30%，例如约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在重组体中的突变率可以是至少约0.75%，例如约0.75%、0.8%、0.85%、0.9%、0.95%、1%、1.5%、 2%、2.5%或3%。文库大小、重组体百分比和重组体中的突变率取决于异源双链DNA分子的 数目、尝试的转化次数、转化方法、扩增目的序列的方法及其他因素。 [0103] 测定诱变效率本发明的方法可以用于产生目的序列的变体文库。在本文描述的方法的一些实施方案 中，测定诱变效率是有利的。用于测定诱变效率的机制可以是定量的、半定量的或定性的。 [0104] 在测定诱变效率的一种机制中，蓝色/白色报道分子筛选与本发明的方法结合使用。用于蓝色/白色报道分子筛选中的一些已知构建体包括LacZ基因。在此类实施方案 中，LacZ的表达可以是组成性的、例如可通过IPTG诱导的、或通过多种手段包括例如阻遏 调节的。LacZ基因可以存在于细胞的基因组中、质粒上、本发明的异源双链DNA分子中、或本发明的分辨载体中。LacZ基因的表达产生β-半乳糖苷酶，能够以导致蓝色色素的方式 切割X-gal的酶。包括足够量的β-半乳糖苷酶和X-gal的细胞将是蓝色的。诱变可以破 坏通过β-半乳糖苷酶的X-gal切割。当这发生时，细胞将看起来是白色的。此外，白色菌 落百分比指示诱变效率。高百分比的白色菌落指示足以破坏LacZ表达和/或通过β-半乳 糖苷酶的X-gal切割的突变经常发生，而低百分比的白色菌落指示此类突变经常不发生。 [0106] 在某些实施方案中，在其中应用蓝色/白色筛选的细胞是实验细胞，例如包括已诱变的序列的细胞，以便鉴定具有特定特征的变体。在其他实施方案中，细胞是与实验细胞平行诱变的对照细胞。 [0107] 在本发明的多个其他实施方案中，筛选鉴定除蓝色色素沉着外的表型。在此类情况下，标记物构建体无需是包括lacZ基因的构建体，而是包括能够体现可检测表型的一些 其他标记物基因的构建体。例如，能够被诱变破坏的可检测表型可以是、但不限于发光、荧光、抗生素抗性、抗生素敏感性、毒素抗性、毒素敏感性、改变的生长速率、改变的对分析物的响应、改变的细胞结构、改变的集落形成、或改变的营养缺陷型。另外的可检测表型是本领域已知的。此外，能够体现这些可检测表型的基因也是本领域已知的。例如，可检测表型可以起因于下述的表达：绿色荧光蛋白(例如gfp)、红色荧光蛋白(例如rfp)、黄色荧光 蛋白(例如yfp)、氨苄青霉素抗性基因(amp)、四环素抗性基因(tet)、卡那霉素抗性基因 (kan)、β-半乳糖苷酶(β-gal)、丙氨酸合成基因(例如argA)、半胱氨酸合成基因(例如 cysE)、亮氨酸合成基因(例如lysA)、苏氨酸合成基因(例如thrC)、或本领域已知的多种 其他天然或合成基因中的任一种。可替代地，标记物蛋白可以是功能盒，其例如通过转录因子的表达，指导或促成体现可检测表型的基因的表达。在此类情况下，体现可检测表型的基因可以是对于细胞内源的或由载体编码的。在其中细胞子集预期不能在测定条件下发展的 实施方案中，关于许可条件的复制平板或另一种相似效应的技术可以用于测定具有所示表 型的细胞百分比。进一步地，用于选择或分离具有可检测表型的细胞的方法是本领域已知 的。取决于可检测表型，选择或分离具有起因于标记物蛋白表达的表型的一种或多种细胞 可以包括流式细胞术、在有关抗生素或毒素的存在下培养细胞群体、在特定有机化合物的 存在或不存在下培养细胞群体、或显微镜技术。选择且分离具有特定可检测表型的细胞的 另外方法是本领域已知的。 [0108] 定向进化本发明的变体文库可以用于噬菌体展示或定向进化的方法中。本发明的ssDNA中间体 可以是适用于噬菌体展示的噬菌粒，其实例是本领域已知的。目的序列的变体文库的细胞 与辅助噬菌体一起孵育，可以导致由目的序列的变体编码的蛋白的展示。展示蛋白变体的 细胞可以与一种或多种靶分子共孵育，所述一种或多种靶分子例如蛋白变体可以与之相互 作用的一种或多种蛋白、分子或化合物。靶分子可以是小分子、蛋白或其结构域、人蛋白或其结构域，酶，病原体蛋白或其结构域，抗体或其结构域，或重组蛋白。蛋白变体可以结合、切割或修饰靶分子。可替代地或另外地，目的序列的蛋白变体可以诱导靶分子中的构象变 化，或催化靶分子的反应。通过定向进化鉴定的序列可以用作后续多样化和选择循环中的 目的序列。 [0109] 实施例1：尿嘧啶化的环状ssDNA的产生在本发明中，尿嘧啶化的环状ssDNA可以充当DNA模板分子、尿嘧啶化的环状ssDNA中 间体或两者。尿嘧啶化的环状ssDNA可以是噬菌体或噬菌粒ssDNA分子。一种产生尿嘧啶 + + 化的环状ssDNA的方法利用CJ236大肠杆菌细胞(基因型：FΔ(HindIII)::cat(Tra Pil R Cam)/ ung-1 relA1 dut-1 thi-1 spoT1 mcrA；New England Biolabs)。该菌株的细胞缺 乏功能dUTPase和尿嘧啶-N糖基化酶。首先，将电感受态的CJ236细胞的等分试样(25 µl) 吸取到冷却的0.1mm间隙比色杯内，并且将1 µl pAPIII6质粒DNA加入CJ236细胞中。细 胞在BioRad电穿孔仪中以1.6伏特进行电穿孔。紧在电穿孔后，加入1 ml SOC培养基，并 且将培养基加上细胞转移至14 ml Falcon品牌培养管。培养物在37℃下伴随振荡(~225 rpm)孵育1小时。在该一小时结束时，将250 µl经转化的细胞直接涂布到LB +CAM +AMP 平板上。这些平板在37℃下孵育过夜。 [0110] 为了产生噬菌体，将1 ml含有LB和氨苄青霉素(60 µg/ml)的生长培养基和10011 µl M13K07辅助噬菌体(NEB，10 PFU/ml)加入培养管中。随后使用单个10 µl吸管端，用 来自过夜转化平板的30个菌落接种培养基。将培养物以200 rpm在37℃下振荡两小时，这 之后加入0.5 µl卡那霉素原液(最终浓度30 µg/ml)，并且将培养物以225 rpm在37℃下 振荡6小时或直至混浊。将培养物稀释到在250 ml玻璃带挡板烧瓶中的30 ml新鲜2YT 培养基内，所述新鲜2YT培养基含有氨苄青霉素(60 µg/ml)、卡那霉素(30 µg/ml)和尿苷 (0.3 µg/ml)。将培养物以225 rpm在30℃下振荡过夜(大约18小时)。 [0111] 在振荡过夜后，将30 ml培养物转移至圆底离心管，并且细胞通过在SorvallRC-5B离心机中在4℃下以15,000 rpm离心15分钟沉淀，所述Sorvall RC-5B离心机使 用SS34转子或等价转子。上清液使用0.22 µm管顶滤器进行过滤，并且将滤液转移至含 有6 ml 20% PEG8000/2.5 M NaCl的新的圆底管。每个管用石蜡膜覆盖，且倒转几次以混 合，并且随后在冰上孵育60分钟。每个管在4℃下以10K rpm在使用SS34转子的Sorvall RC-5B离心机中离心20分钟。将上清液倾析，并且将管再次以5K rpm在使用SS34转子的 Sorvall RC-5B离心机中离心5分钟。使用吸管抽吸剩余液体，留下噬菌体沉淀。将噬菌体 沉淀重悬浮于500 µl 1×无菌PBS中，并且转移至1.7 ml管。将重悬浮的噬菌体在4℃下 在台式微量离心机中以4℃以最高速度(14K rpm)离心5分钟。 [0112] 离心的重悬浮的噬菌体的上清液转移至新的1.5 ml管。接下来，将7 µl缓冲液MP(Qiagen M13试剂盒)加入噬菌体制剂且混合，随后在室温下孵育5分钟。将样品施加于 QIAprep旋转柱(Qiagen M13试剂盒)。将柱以8K rpm在台式微量离心机中离心30秒，并 且弃去流通物。随后将700 µl缓冲液MLB加入柱(Qiagen M13试剂盒)中，并且将柱以8K rpm在台式微量离心机中离心15秒。将700 µl另外的缓冲液MLB加入柱中，并且使柱在 室温下孵育至少1分钟，随后以8K rpm在台式微量离心机中离心30秒。接下来，加入700 µl缓冲液PE(Qiagen M13试剂盒)，并且将柱以8K rpm在台式微量离心机中离心15秒。 重复该步骤。将柱转移至新鲜的1.7 ml管。将100 µl缓冲液EB(M13试剂盒)加入柱膜 中，并且使柱在室温下孵育10分钟，并且随后以8K rpm在台式离心机中离心30秒。含有 dU-ssDNA的洗脱物通过在1%琼脂糖TAE凝胶上运行1.0 µl洗脱物进行分析。DNA作为占 优势的单一条带出现，但通常可见较低电泳迁移率的模糊条带，可能由dU-ssDNA中的二级 结构引起。 [0113] 实施例2：易错PCR在本发明中，易错PCR可以用于生成目的序列的变体。在本实施例中，一种PCR引物 通过引入硫代磷酸酯在其5'末端处进行修饰。目的序列使用寡核苷酸和第二寡核苷酸进 行扩增，所述寡核苷酸具有三个或更多个5'硫代磷酸酯，并且能够与目的序列的一条链杂 交，所述第二寡核苷酸具有少于三个硫代磷酸酯，能够与目的序列的相反链杂交。为了进行易错PCR，使10 µL 10×诱变PCR缓冲液[70 mM MgCl2、500 mM KCl、100 mM Tris(pH 8.3)、 0.1%(wt/vol)明胶]与10 µL 10× dNTP混合物(2 mM dGTP、2 mM dATP、10 mM dCTP、10 mM dTTP)、各30 pmoles设计为扩增目的DNA的正向引物和反向引物组合。对于scFv基 因，我们使用：(AXL6AS4-PCRR 5'Phos G*T*C*G*ACTGAGGAGACGGTGACC)；和(AXL6KunkPCRF2 AAGCTTTCCTATGAGCTGACACAGCC)，其中星号限定通过硫代磷酸酯连接的碱基对。反应利用1、 10或20 fmoles输入DNA(即每种量的分开反应)，其中水加入至88 µL的总体积。随后加 入10 µL 5 mM MnCl2并且充分混合；验证任何沉淀物的不存在。加入2 µL Taq DNA聚合 酶，以使最终体积达到100 µL。反应在Biorad T100热循环仪上循环30个循环(94℃1分 钟、55℃1分钟、72℃1分钟)。在PCR完成后，根据制造商的方案，使用Qiagen QIAquick PCR纯化试剂盒进行反应提纯(cleanup)。产物大小为大约800个碱基对。 [0114] 实施例3：T7处理为了消化具有少于三个硫代磷酸酯的链，使用Qiagen QIAquick PCR纯化试剂盒纯化 的40 µl PCR产物与10 µl T7核酸外切酶(10,000单位/ml)一起，在1× NEB缓冲液中 在25℃下在BioRad T100热循环仪中孵育1小时。T7处理的产物使用Qiagen QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化，并且在40 µl EB缓冲液/反应中进行洗脱。 [0115] 这些硫代磷酸酯提供了保护初始双链PCR产物免于5'至3'核酸外切酶T7的水解作用，而相对的未受保护的链被水解。我们发现一个或两个硫代磷酸酯不足以阻止水解，但3或4个硫代磷酸酯的添加导致相应链的完全保护。 [0116] 硫代磷酸酯可以通过保护任何不完全连接的异源双链体产物免于通过大肠杆菌中的细胞溶质核酸外切酶的降解，在体内提供另外利益，阻止突变的偏差掺入。 [0117] 双链PCR产物转换为单链 DNA变体。 [0118] 在有利于核苷酸错误掺入的条件下，来自800碱基对scFv基因扩增的PCR产物用或不用T7或λ核酸外切酶在25℃下处理1小时。在处理后，产物在用SYBR-Gold染色的 非变性丙烯酰胺凝胶上显现。ssDNA产物显示比相应的dsDNA更慢的迁移率(图2)。如预 期，如果引物无一含有硫代磷酸酯，则T7核酸外切酶完全降解未受保护的DNA。在5'末端 上的一个或两个硫代磷酸酯残基还不提供免于酶的水解作用的足够保护(图2)。然而，当 5'末端之一具有3或4个硫代磷酸酯时，PCR产物完全转换为ssDNA(图2)。λ核酸外切 酶还将dsDNA转换为ssDNA，但当非硫代磷酸酯引物是5'磷酸化的时，反应更有效。 [0119] 实施例4：异源双链体形成为了将易错PCR和随后T7消化的单链产物掺入DNA异源双链体内，将40 µl T7处理和 提纯的反应加入13 µl pAX143 ssDNA、25 µl 10× TM(0.1 M MgCl2、0.5 M Tris，pH 7.5)缓冲液和172 µl dH20中。pAX143是噬菌粒的衍生物，具有与细菌噬菌体M13 gpIII外壳 蛋白融合的单链可变片段抗体(scFv)的pAP-III6。pAX143中的scFv含有在CDR各自中 的终止密码子和Sac II限制性位点，使得非重组克隆致使无功能。在具有合成寡核苷酸的 反应中，将200 ng寡核苷酸加入20 µg环状单链模板中。退火反应通过在90℃下孵育2 分钟来进行，随后为在BioRad T100热循环仪中从90℃到55℃以-1℃/分钟的逐步下降。 退火的产物随后与10 µl 10 mM ATP、10 µl 100 mM dNTP混合物、15 µl 100 mM DTT、0.5 µl(30 U)T4 DNA连接酶和3 µl(30 U)T7 DNA聚合酶组合。将混合物同样等分到5个PCR 管内，并且在20℃下在BioRad T100热循环仪中孵育过夜(16小时)。 [0120] 将所得的DNA脱盐，并且使用Qiagen QIAquick DNA纯化试剂盒进行纯化。这通过将反应与1.0 ml缓冲液QG(Qiagen QIAquick DNA纯化试剂盒)混合来完成。通过将35 µl缓冲液EB(Qiagen QIAquick DNA纯化试剂盒)加入每个柱，来洗脱样品。将来自2个柱 的洗脱物(最终70 µl)合并，并且在琼脂糖凝胶上显现2 µl产物连同2 µl ssDNA。观察 到高达3个条带。上部(且通常为最普遍的)条带对应于链置换的DNA，中间(通常为模糊 的)条带对应于切口DNA(即未正确延伸且连接的)，并且下部条带代表正确延伸且连接的 产物。ssDNA比正确连接的条带更缓慢地运行。 [0121] 对于易错PCR产物的标准克隆，将DNA用HindIII和SalI消化，且连接到pAPIII6载体内用于噬菌体展示。 [0122] 实施例5：CJ236菌株的转化+ + R CJ236菌株(基因型：FΔ(HindIII)::cat(Tra Pil Cam)/ ung-1 relA1 dut-1 thi-1 spoT1 mcrA )购自New England Biolabs。该菌株缺乏功能dUTPase和尿嘧啶-N糖基化 酶，并且用于生成尿嘧啶化的单链DNA模板。将电感受态的CJ236细胞的等分试样(25 µl) 吸取到冷却的0.1mm间隙比色杯内，并且将1 µl pAPIII6质粒DNA加入比色杯中的CJ236 细胞中。细胞在BioRad电穿孔仪中以1.6伏特进行电穿孔。紧在电穿孔后，加入1 ml SOC 培养基，并且将培养基加上细胞转移至14 ml Falcon品牌培养管。培养物在37℃下伴随 振荡(~225 rpm)孵育1小时。在该一小时结束时，将250 µl经转化的细胞直接涂布到LB +CAM +AMP平板上。平板在37℃下孵育过夜。 [0123] 实施例6：文库转化TG1大肠杆菌菌株(F' [traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]supE thi-1 Δ(lac-proAB) Δ(mcrB-hsdSM)5,(rK-mK-)购自Lucigen。对于转化反应，使0.5 µl异源双链DNA或连接 产物与25 µl TG1电感受态细胞(Lucigen)混合，并且加入0.1 cm间隙比色杯。使用设为 1.6 kV、(关于“设置伏特” r1.60)、200 ohms、25 µF的GenePulser，使细胞加上DNA电穿孔。使电穿孔的细胞与1 ml Lucigen回收物混合，并且转移至14 ml Falcon培养管，随后 -2 在37℃下振荡。在1小时后，取出2 µl培养物且10 稀释到198 µl 2YT培养基内，且涡旋 -2 以混合。随后，使用干净的吸管，将2 µl 10 稀释物进一步稀释到198 µl 2YT培养基内， -4 -2 -14 用于10 稀释。重复这些10 系列稀释，直到10 。各100 µl稀释物通过无菌涂布器铺 平板到TYE-AMP-葡萄糖平板上，并且使平板在37℃下孵育过夜。 [0124] 实施例7：Kunkel诱变在大肠杆菌中研究具有5'硫代磷酸酯键的ssDNA产物对Kunkel诱变效率，并且特别 是有利于体外合成的重组体链的尿嘧啶化的DNA链的偏差修复的作用。在5'末端处含有4 个硫代磷酸酯的合成寡核苷酸，与缺乏硫代磷酸酯的相同寡核苷酸平行，用于标准Kunkel 诱变反应中。将异源双链DNA产物转化到大肠杆菌TG1细胞内，其编码对于去除DNA中的 尿嘧啶所需的野生型形式的酶，并且有利于重组非尿嘧啶化的链的扩增。重组体分别以44%和50%的比率由未经修饰的和经修饰的寡核苷酸生成(表1)，指示硫代磷酸酯寡核苷酸可 以用于Kunkel诱变。 [0125] 合成寡核苷酸取代ssDNA变体，其通过对应于突变的scFv基因的800碱基对易错PCR片段的T7核酸外切酶处理而生成。因为突变的ssDNA变体比寡核苷酸大20倍，所以 ssDNA变体与尿嘧啶化的环状单链模板的比率必须进行最佳化，以达到异源双链体产物的 有效产生(图3)。在dsDNA产物电穿孔到TG1细胞内之后，将个别克隆送去测序，以测定重 组体数目。重组体以46%的比率生成，其与用合成寡核苷酸观察到的效率相当。除完全重 组体之外，ssDNA变体反应还以35%频率获得部分重组体(26种重组体中的9种；表1)，在 其中掺入ssDNA变体序列的部分。 [0126] 表1. 来自Kunkel诱变反应的重组体分析输入DNA 重组体数目 非重组体数目 部分重组体数目 重组体% 标准寡核苷酸 7 9 0 43.75 硫代磷酸酯化的寡核苷酸 8 8 0 50 硫代磷酸酯化的ssDNA变体 12 5 9 46 [0127] 实施例8：使用AXM诱变生成多样化文库为了比较本方法与通过易错PCR生成亲和力成熟文库的常规方法，与上文相同的scFv 基因通过易错PCR进行扩增，且使用标准技术亚克隆到噬菌粒载体内。在连接的产物电穿 孔到TG1细胞内之后，将系列稀释物铺平板到固体培养基上，以便获得转化体数目的估计 量。将个别克隆测序，以测定重组体百分比和突变频率。 [0128] 在来自标准文库的转化体中，75%是重组体，并且平均起来，每个重组克隆具有8个突变，其等于大约1%的点突变率(表2)。使用AXM诱变方法观察到1.5 %的相似突变率 (表2)。尽管重组体的频率对于标准文库略微高于AXM诱变文库，但转化体的总数目比使 8 5 用AXM诱变方法高几个数量级(分别为2.8 × 10相对于1 × 10 )。基于这些效率，使 8 用AXM诱变方法来自单次转化的总体文库多样性为大约10个重组克隆(表2)。为了达到 相似大小的文库，使用标准方法将需要1000次转化。该结果显示本方法允许文库的有效生 8 成，所述文库具有来自单次转化的10个重组克隆。常规易错PCR和亚克隆方法需要1000 次转化，来获得相等大小的文库。 [0129] 表2. 使用常规方法和AXM诱变方法的文库多样性比较诱变方法 转化体数目 重组体% 文库多样性 平均突变数目 重组体的突变率 标准易错PCR 1.00E+05 75 7.50E+04 8.3 1.1 AXM诱变 2.80E+08 46.15 1.29E+08 11.7 1.5 [0130] 实施例9：测定诱变效率的方法蓝色/白色筛选用于测定诱变的效率。包括能够表达β-半乳糖苷酶的lacZ基因的 pBluescript载体用于这些实验中。对照细胞用已与LacZ ssDNA变体杂交的pBluescript 载体进行转化，所述LacZ ssDNA变体已通过标准PCR进行扩增。这些经转化的细胞在X-gal 的存在下进行培养；1490个这些细胞中的1480个是蓝色的(0.01%白色菌落)。用已与 LacZ ssDNA变体杂交的pBluescript载体转化的细胞在X-gal的存在下分开培养，所述 LacZ ssDNA变体已通过易错PCR进行扩增。627个细胞中的525个是蓝色的(19%白色菌 落)。另外的细胞用已通过易错PCR扩增的scFv模板分开转化。在其中scFv模板通过易 错PCR扩增、与载体杂交且在X-gal上培养的两种样品各自中，100%的菌落是白色的。对于 这些细胞测定21%的Kunkel效率(表3)。 [0131] 表3：用于测定诱变效率的蓝色/白色筛选PCR 模板 菌落(白色)菌落(蓝色) 白色% Kunkel效率(%) 诱变频率(每 100 bp) 标准PCR pBluescript 10 1480 0.01 n/a n/a EP PCR pBluescript 102 525 19 n/a 1/8 EP PCR scFv 1 800+ 0 n/a 21 2 EP PCR scFv 2 800+ 0 n/a 21 2.7 [0132] 实施例10：在分开载体上的免疫球蛋白重和轻链的诱变在本发明的一个实例中，第一目的序列编码免疫球蛋白重链，并且第二目的序列编 码免疫球蛋白轻链。各自根据本发明的方法进行诱变，以产生dsDNA变体，其随后转换为 ssDNA变体且与ssDNA中间体杂交，以形成异源双链体。免疫球蛋白轻链ssDNA变体将与第 一ssDNA中间体杂交，而免疫球蛋白重链ssDNA变体将与第二、分开的ssDNA中间体杂交。 使用ssDNA中间体作为模板分子，杂交的ssDNA变体将引发DNA延伸。延伸反应将包括连 接酶。其后，ssDNA中间体将在转化到细菌内之前或之后得到降解。任何或所有步骤可以在单一反应库中或者两个或更多个分开的反应库中发生，所述两个或更多个分开的反应库例 如包括关于免疫球蛋白轻链变体的至少一个，以及关于免疫球蛋白重链变体的另一个。单 一细菌库用所产生的免疫球蛋白轻链载体和所产生的免疫球蛋白重链载体进行转化。经转 化的细胞的子集用一种或多种免疫球蛋白轻链载体和一种或多种免疫球蛋白重链载体两 者进行转化。在此类情况下，重链变体和轻链变体可以共表达，允许表达的重链蛋白和表达的轻链蛋白形成免疫球蛋白复合物，即抗体。重链变体和轻链变体的表达可以在载体最初 转化到其内的细菌细胞类型中，或由其衍生的一种或多种载体随后转移到其内的不同细胞 类型中发生。 [0133] 实施例11：在单一载体上的免疫球蛋白重和轻链的诱变在本发明的一个实例中，第一目的序列编码免疫球蛋白重链，并且第二目的序列编码 免疫球蛋白轻链。将免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链序列克隆到单一载体内。各自根据 本发明的方法进行诱变，以产生dsDNA变体，其随后转换为ssDNA变体且与ssDNA中间体杂 交，以形成异源双链体，每种ssDNA中间体具有能够与免疫球蛋白重链ssDNA变体杂交的至 少一个基因座，以及能够与免疫球蛋白轻链ssDNA变体杂交的分开基因座。使用ssDNA中 间体作为模板分子，杂交的ssDNA变体将引发DNA延伸。延伸反应将包括连接酶。其后， ssDNA中间体将在转化到细菌内之前或之后得到降解。通过本发明的方法克隆到单一载体 内的重链变体和轻链变体可以共表达，允许表达的重链蛋白和表达的轻链蛋白形成免疫球 蛋白复合物，即抗体。重链变体和轻链变体的表达可以在载体最初转化到其内的细菌细胞 类型中，或由其衍生的一种或多种载体随后转移到其内的不同细胞类型中发生。 [0134] 实施例12：使用Eco29kI限制性位点来选择分辨的载体在本发明的一些情况下，希望将对应于多个不同多核苷酸区段的ssDNA变体掺入单一 的分辨的载体内。在本实施例中，本发明的方法用于在单一构建体中，将单链抗体的6个 互补决定区各自替换为能够与之杂交的ssDNA变体的序列。单链抗体包括轻链可变结构 域(VL)互补决定区(CDR)1(一起，VL-CDR1)、VL-CDR2、VL-CDR3、接头、重链可变结构域(VH)CDR1(一起，VH-CDR1)、VH-CDR2和VH-CDR3。任何两个邻近CDR之间的距离可以是例如30 - 40个碱基对。 [0135] 基于对应于CDR各自的模板序列，生成能够与CDR各自杂交的ssDNA变体。模板序列不包括SacII限制性位点或UGA终止密码子(图4)。ssDNA变体与尿嘧啶化的ssDNA中 间体杂交，所述尿嘧啶化的ssDNA中间体具有CDR ssDNA变体能够与之杂交的序列，但进一 步包括在相应的ssDNA变体能够与之杂交的每个CDR的区段内的SacII限制性位点和UGA 终止密码子(图4)。ssDNA变体与ssDNA中间体杂交，并且随后转移至细菌，其中错配的核 苷酸得到分辨。这些细菌表达Eco29kI限制性酶，其能够降解包括完全SacII限制性位点 的载体。相应地，如果中间体链的6个CDR中的任何一个不与ssDNA变体杂交，或如果6个 CDR中的任何一个与相应的ssDNA变体杂交，但并非有利于ssDNA中间体链分辨，而是有利 于在SacII限制性位点处的杂交ssDNA变体分辨，则所得到的载体包括一个或多个SacII 限制性位点。此类载体在表达Eco29kI的细菌中得到降解。通过消除在6个CDR各自处并 非有利于ssDNA变体分辨的那些载体，鉴定在所有6个CDR处修饰的构建体的效率得到增 加。类似地，任何UGA终止密码子突变的存在破坏由分辨的载体编码的单链抗体或其变体 的表达。 [0136] 实施例14：使用Eco29kI限制来改善重组体百分比为了证实当使用本文描述的Eco29kI限制方法时鉴定重组体的效率增加，测试几种条 件。在第一条件下，ssDNA变体由scFv模板(scFv1或scFv2)生成。ssDNA变体不包括SacII 限制性位点。ssDNA变体与ssDNA中间体杂交，所述ssDNA中间体在ssDNA变体能够与之杂 交的ssDNA中间体的区段内包括SacII限制性位点。转化到表达Eco29kI的TG1细胞内导 致错配核苷酸的分辨，以及包括SacII限制性位点的载体的降解。在第二条件下，scFv 2模板用于生成ssDNA变体，并且ssDNA变体与不包括SacII限制性位点的ssDNA中间体杂交。 在该第二条件下，转化到表达Eco29kI的TG1细胞内不导致包括SacII限制性位点的载体 的降解。因为包括SacII限制性位点的载体的降解选择性降解并非完成重组的载体，所以 重组体百分比增加。这种效应在有或没有用SacII的体外处理下，在不表达Eco29kI的细 胞(TG1细胞)中进行比较。 [0137] 下文结果显示在表达Eco29kI的TG1细胞中非重组载体的限制产生比使用不表达Eco29kI的TG1细胞观察到的更高重组体百分比。 [0138] 表4. 重组体百分比 [0140] 虽然本发明已与具体实施方案结合进行描述，但应当理解它能够具有进一步的修饰。因此，本申请预期涵盖一般而言遵循本发明原则的本发明的任何变动、用途或适应，包括本公开内容在本领域的已知或习惯实践内的偏离。 |
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