[0001] 本发明涉及肽的加工，所述肽的结构因与化合物结合而受约束，所述化合物提供结构骨架，赋予所述肽构象。具体而言，本发明涉及这类肽的蛋白水解处理，以选择蛋白酶抗性肽或者选择所产生的切割产物。

[0002] 介绍

[0003] 对生物靶标有高亲和力和特异性的分子的制备是化学、生物和制药科学的中心问题。具体而言，结合配体对于可干预生物过程的药物的制备是重要的。与所选靶配体结合的配体的制备通常包括产生众多推定的结合分子和检测所述分子的结合性能的过程。

[0004] 合成的分子结构所束缚的多肽在本领域中已知(Kemp，D.S.和McNamara，P.E.，J.Org.Chem，1985；Timmerman，P.等人，ChemBioChem，2005)。Meloen和同事们曾使用三(溴甲基)苯和相关分子进行将多个肽环快速和定量环化至合成支架上，以用于蛋白质表面的结构模拟(Timmerman，P.等人，ChemBioChem，2005)。制备候选药物化合物的方法在WO 2004/077062和WO 2006/078161中公开，其中通过将含半胱氨酸的多肽连接到分子支架(如例如三(溴甲基)苯)来制备所述化合物。

[0005] WO2004/077062公开了选择候选药物化合物的方法。具体而言，此文件公开了包含第一和第二活性基团的各种支架分子，并在偶联反应中用另一种分子接触所述支架以在所述支架和所述另一种分子之间形成至少两个键。

[0006] WO2006/078161公开了结合化合物、免疫原性化合物和肽模拟物。此文件公开了从现有的蛋白质中获得的肽的各个集合的人工合成。然后将这些肽与具有为了制备组合文库而引入的一些氨基酸变化的固定合成肽结合。通过经由化学键引入此多样性来分离以各种氨基酸变化为特征的肽，使获得所需结合活性的机会增加。此文件的图7显示各种环肽构建体的合成示意图。然而，所产生的肽有单特异性。在提供多个肽环的位置，所述环协同结合到单一靶标。

[0007] 在我们共同待审的国际专利申请WO2009098450中，我们公开了将生物选择技术例如噬菌体展示用于选择合成的分子结构所束缚的肽。

[0008] 在本领域中已知修饰多肽(包括多肽库)的蛋白水解处理的应用。例如，GB2428293(Domantis Limited)描述了以下方法，其通过用蛋白酶处理噬菌体来还原噬菌体上所展示肽的化合价，使得大多数噬菌体不展示肽和一部分是单价的。

[0009] 基于噬菌体展示蛋白对蛋白水解降解的抗性而从该蛋白库中选择稳定折叠的蛋白质的策略，已用于改善天然蛋白质的稳定性。蛋白水解的降解通常限制于解折叠的蛋白质或折叠蛋白质的高度柔性区域。折叠的蛋白质大部分是蛋白酶抗性的，因为蛋白水解切割要求多肽链呈蛋白酶活性位点的特定立体化学，从而使蛋白酶活性位点有柔性、可接近和能够局部解折叠。

[0010] 此外，本领域中已将蛋白酶用于制备所需切割产物，例如在Fc、Fab和Fv抗体片段的制备中。

[0011] 我们发现，蛋白酶消化技术可适于修饰合成分子支架所束缚的结构化多肽，无论其是否在噬菌体上展示。这些技术不仅使蛋白酶抗性结构化肽的制备而且使蛋白酶切割产物的制备成为可能，在上述蛋白酶切割产物中大多数多肽仍然束缚于支架。

[0012] 发明概述

[0013] 在第一个实施方案中，提供制备一种或多种肽配体的方法，所述肽配体包含在两个或更多个氨基酸残基上与分子支架共价连接的多肽，所述方法包括以下步骤：

[0014] (a)在遗传展示系统中展示一种或多种肽配体，其中所述多肽包含两个或更多个与分子支架形成共价键的活性基团和至少一个环，所述环包含位于(subtend)两个所述活性基团之间的两个或更多个氨基酸的序列；

[0015] (b)将所述肽配体暴露于一种或多种蛋白酶；和

[0016] (c)针对靶标结合筛选所述肽配体，和选择与所述靶标结合的配体。

[0017] 在相关的实施方案中，本发明提供制备一种或多种肽配体的方法，所述肽配体包含在两个或更多个氨基酸残基上与分子支架共价连接的多肽，所述方法包括以下步骤：

[0018] (a)在遗传展示系统中展示一种或多种肽配体，其中所述多肽包含两个或更多个与分子支架形成共价键的活性基团和至少一个环，所述环包含位于两个所述活性基团之间的两个或更多个氨基酸的序列；

[0019] (b)针对靶标结合筛选所述肽配体，和选择与所述靶标结合的配体；

[0020] (c)将与所述靶标结合的肽配体暴露于一种或多种蛋白酶；和

[0021] (d)针对靶标结合进一步筛选所述肽配体。

[0022] 可应用的系统包括噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、核糖体或多核糖体展示、mRNA展示和人造微荚膜中的体外表达。在Litovchick等人，PNAS 10月7日，2008年第105卷第40期；15293-15298中描述了mRNA展示系统。优选技术是使用丝状噬菌体的噬菌体展示。

[0023] 针对与一个或多个靶标结合的能力选择肽配体。所述配体可为单特异性的，即它们与单一靶标结合；或多特异性的，即能够与两个或更多个不同靶标结合。多特异性配体可呈开放构象，其中它们可同时与两个或更多个不同的靶标结合；或可呈闭合构象，其中它们在任何时候只可与一个靶标结合。

[0024] 肽配体包含至少一个多肽环，所述多肽环由位于至少两个与分子支架连接的活性基团之间的氨基酸序列形成。优选的是，所述肽配体包含两个或更多个环，可包含3个、4个或更多个环。例如，所述多肽可包含3个或更多个活性基团，两个或更多个环位于所述活性基团之间。包含3个活性基团的多肽在线性形式下将支持两个环，或如果被环化则支持三个环。

[0025] 本发明方法的具体应用是要制备肽配体的库。这类库可例如通过在噬菌体上展示多肽的库和随后将它们与分子支架缀合来制备，如WO2009098450所述。

[0026] 可将蛋白水解用来在配体上原位修饰肽，或者选择抵抗蛋白水解攻击的那些缀合物。因此，在第一个结构中，本发明涉及对有蛋白酶抗性的肽配体的选择。这类配体可用于存在蛋白酶的环境中，例如在粘膜表面。在此结构中，本发明尤其可用于缀合物的库，所述库可根据它们的蛋白酶抗性来筛选及分类。

[0027] 所述库可在蛋白水解处理时首次用于实验(naive)，而选自所述库的有蛋白水解抗性的成员可在蛋白水解处理后针对与一个或多个靶标的结合进行筛选。

[0028] 在这样的一个实施方案中，所述方法优选地还包括：任选使用还原剂处理所述库；对所述库进行蛋白酶抗性选择；针对靶标结合筛选所述库，和选择与所述靶标结合的第一个库的成员。

[0029] 在另一个实施方案中，在蛋白水解处理前可针对与一个或多个靶标的结合筛选所述库。

[0030] 在这样的一个实施方案中，所述方法还包括以下步骤：针对靶标结合筛选所述库，和选择在蛋白酶处理前与所述靶标结合的第一个库的成员；任选使用还原剂处理所选择的库；对所述库进行蛋白酶抗性选择；和随后针对与所述靶标的结合进一步筛选所述库。

[0031] 此外本发明涉及多肽的库，每个多肽包含两个或更多个与分子支架共价连接的活性基团，和至少一个环，所述环包含位于两个所述活性基团之间的两个或更多个氨基酸的序列，所述库为蛋白酶抗性的。

[0032] 如上文所述，这样的库可为首次用于实验的，或可针对与一个或多个靶标的结合进行选择。针对靶标结合的选择可在对蛋白酶抗性的选择之前进行，在对蛋白酶抗性的选择之后进行，或两者均进行。

[0033] 按照本发明的第二个结构，可用蛋白水解处理肽配体以产生固定在支架上的经切割的多肽。在这样的一个实施方案中，所述方法还包括选择对蛋白酶切割敏感的肽配体。

[0034] 例如，所述过程可产生包含两个或更多个独立多肽的配体，每一个所述多肽均在至少一个位置上与分子支架连接。这可使所述多肽相对不受构象约束。

[0035] 在一个实施方案中，所述方法可用肽配体的库实施。

[0036] 此外本发明提供肽配体的库，每种缀合物包含两个或更多个多肽，每个所述多肽包含一个或多个共价连接到分子支架的活性基团。

[0037] 优选的是，肽配体能够特异性地与一个或多个靶标结合。

[0038] 适宜地，肽配体是多特异性的。

[0039] 所述缀合物在遗传展示系统例如噬菌体展示上有利地被展示。

[0040] 在另一个方面，本发明提供调节肽配体与一个或多个靶标结合的方法，所述方法包括将所述肽配体暴露于蛋白酶。

[0041] 蛋白水解切割可用于选择有蛋白酶抗性的配体，这类配体可用于在医学应用中，在医学应用中所述配体对于在富含蛋白酶环境中操作可为必需的。例如，本发明的肽配体可作为免疫系统分子的配体(例如作为抗原)起作用。它们可因此用作疫苗、佐剂和免疫治疗药物。然而，在另一个实施方案中，切割可特定地定向于切割肽的特定环，从而改变配体的结合特征。

[0042] 在一个实施方案中，只有当未被切割且构象上受与支架的连接影响时，配体的一个或多个环才可与其指定的靶标结合。在该情况下，可使用蛋白酶处理以避免特定环结合到其指定的靶标。例如，如果所述肽配体为双特异性的，则可通过在所需环中包含特定蛋白酶切割位点并且将所述配体暴露于关连蛋白酶，来切割任一个环以避免与相关靶标结合。

[0043] 在这样的一个实施方案中，可选择特定的蛋白酶以调节针对一个或多个靶标的一种或多种肽配体的结合活性。因此，可通过对一个或多个环的蛋白酶切割来使既定配体为双特异性或单特异性的。

[0044] 在另一个实施方案中，只有在经切割和大体上不受其仍然连接的支架构象约束时，配体的一个或多个环才可与其指定的靶标结合。在这个实施方案中，可选择性地使用切割以促进环与其指定靶标的结合。

[0045] 附图简述

[0046] 图1显示，在不经DTT预处理、经DTT预处理以及经DTT和后接的胰凝乳蛋白酶预处理的情况下，噬菌体克隆10和48(实施例1)与MDM2结合为环状缀合物或非缀合肽。

[0047] 图2显示对肽PEP10和PEP48的荧光各向异性曲线，表明对MDM2的亲和力。见实施例1。

[0048] 发明详述

[0049] 除非另有注释，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本领域(例如肽化学、细胞培养和噬菌体展示、核酸化学和生物化学领域)普通技术人员所通常理解的相同含义。将标准技术应用于分子生物学、遗传学和生物化学的方法(见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，2001，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel 等 人，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第四版，John Wiley&Sons，Inc.)，所述文献通过引用结合到本文中。

[0050] 本文所提及的肽配体是指与分子支架共价结合的肽。典型地，这类肽包含能够与所述支架形成共价键的两个或更多个活性基团，和位于所述活性基团之间的序列，所述序列被称为环序列，因为它在所述肽与支架结合时形成环。

[0051] 活性基团是能够与分子支架形成共价键的基团。典型地，活性基团存在于肽的氨基酸侧链上。优选的是包含氨基的基团例如半胱氨酸、赖氨酸和硒代半胱氨酸。

[0052] 蛋白水解是通过蛋白水解酶(被称为蛋白酶)对多肽的切割。合适的蛋白酶包括胰蛋白酶(在赖氨酸、精氨酸处切割)、胰凝乳蛋白酶(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸)、嗜热菌蛋白酶(小脂族残基)、枯草杆菌蛋白酶(小脂族残基)、Glu-C(谷氨酸)、因子Xa(异亮氨酸/亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸精氨酸)、Arg-C(精氨酸)和凝血酶。在一个实施方案中，由于不能确保库中的潜在随机多肽序列产生特定蛋白酶的精确切割位点，所以使用能够切割多种位点的蛋白酶。

[0053] 在需要切割特定序列时，可使用更有特异性的蛋白酶。对特异性的蛋白酶在下文进一步描述。

[0054] 蛋白酶抗性用于表示对蛋白水解切割所增加的抗性。例如，可通过对肽或多肽骨架的一级序列的修饰获得这种抗性。例如，一级序列的改变可移除蛋白酶的切割位点，只要所述改变不涉及对靶标结合进行关键接触的残基即可。对于噬菌体上展示的肽，核酸编码的20种氨基酸残基之一最容易发生改变。对于通过化学合成制备的肽，可使用一系列其它侧链，例如把赖氨酸变成鸟氨酸或把精氨酸变成瓜氨酸，等等。

[0055] 优选的是，蛋白酶抗性肽对蛋白水解切割的抗性是未经修饰肽的2、3、4、5、10、20倍或更多倍。

[0056] 多特异性是与两个或更多个靶标结合的能力。典型地，结合肽能够结合单一靶标例如在抗体的情况下的表位，因为它们的构象特性。然而，可开发可与两个或更多个靶标结合的肽；例如，如上所提及的本领域已知的双特异性抗体。本发明中，肽配体能够与两个或更多个靶标结合，因而是多特异性的。优选的是，它们与两个靶标结合，从而是双特异性的。结合可为独立的，这意指肽上的靶标结合位点不在结构上被任一个靶标的结合所阻碍。在此情况下，两个靶标均可独立结合。一般地说，据预期与一个靶标的结合会至少部分阻碍与其它靶标的结合。

[0057] 可通过把肽配体的各个环连接在一起形成多特异性肽，所述环与各个靶标结合。连接在一起的环可为相邻的环，或可被第三个环或甚至更多的环隔离。当在多特异性肽中将环置于直接相邻时，优选的是除去限定其中一个环的活性基团之一，以避免活性基团在一个位置上的有效重复。

[0058] 靶标是肽配体与之结合的分子或其部分。通常，靶标与表位相似，因此可在相同的分子上呈不同的表位形式，或在不同的分子上呈不同的表位形式。当靶标在相同分子上时，使用双特异性配体将增加所述配体对所述分子的亲合力，并可由于将所述分子交联或占据所述分子的限定功能部分而赋予其它的特性。

[0059] 分子支架为能够在多个点上与肽连接以赋予所述肽一种或多种结构特征的任何分子。它并非交联剂，因为其并非仅取代二硫键；相反，它提供了肽的两个或更多个连接点。优选的是，分子支架包含针对肽的至少三个连接点，称为支架活性基团。这些基团能够与肽上的活性基团反应形成共价键。优选的分子支架结构在下文中描述。

[0060] 库是变体(在此情况下为多肽变体)的集合，所述变体在它们的序列方面有差异。通常，活性基团的位置和性质不变，但形成它们间的环的序列可随机化。库在大小方面有差
2 11
异，但应认为其包含至少10 个成员。可构建10 个或更多个成员的库。

[0061] 根据本领域众所周知的方法(例如来自噬菌体展示技术的方法)进行针对结合活性(或任何其它所需活性)的筛选。例如，可使用固定于固相的靶标以鉴定和分离库中的结合成员。筛选容许根据所需特性来选择库的成员。

[0062] 术语文库是指异质多肽或核酸的混合物。文库由各自具有单一的多肽或核酸序列的成员组成。在这种程度上，文库与库同义。文库成员间的序列差异是造成文库中存在多样性的原因。文库可呈多肽或核酸的简单混合物的形式，或可呈转化有核酸文库的生物体或细胞(例如细菌、病毒、动物或植物细胞等)的形式。优选的是，每个单独的生物体或细胞均包含仅一个或有限数目的文库成员。

[0063] 有利地，把核酸掺入表达载体中，以容许所述核酸编码的多肽的表达。因此，在一个优选的方面，文库可呈宿主生物体群的形式，每个生物体均包含一个或多个拷贝的表达载体，其包含核酸形式的文库的单个成员，所述成员可经表达以制备其相应的多肽成员。因此，宿主生物体群具有编码遗传多样性多肽变体的大库的潜力。

[0064] 优选的是，核酸文库编码多肽库。文库的每个核酸成员优选地含有与文库的一个或多个其它成员相关的序列。相关序列意指与文库的至少一个其它成员具有至少50％同一性、适宜至少60％同一性、适宜至少70％同一性、适宜至少80％同一性、适宜至少90％同一性、适宜至少95％同一性、适宜至少98％同一性、适宜至少99％同一性的氨基酸序列。同一性适当地在参比序列的至少3个氨基酸，适当地至少4、5、6、7、8、9或者10个氨基酸，适当地至少12个氨基酸，适当地至少14个氨基酸，适当至少16个氨基酸、适当地至少17个氨基酸的连续区段或者全长内判断。

[0065] 与肽配体连接的官能团是例如介导其它结合活性或容许与效应物基团结合的基团。因此，官能团包括抗体及其结合片段、本文所述其它肽配体、化学活性基团，等等。

[0066] 效应物基团是与具有特定活性的肽配体连接的基团。例如，它可为增加肽配体半寿期的蛋白质，例如人类血清白蛋白(HSA)。效应物基团也包括药物(例如细胞毒类药物)、免疫效应物(例如抗体Fc区)、和符合下列参数的化合物：不多于5个氢键供体(带有一个或多个氢原子的氮或氧原子)；不多于10个氢键受体(氮或氧原子)；分子量低于500道尔顿；和辛醇-水分配系数log P小于5。

[0067] A.肽配体

[0068] 在我们公布的国际专利申请WO 2009/098450以及国际专利申请WO 2004/077062和WO 2006/078161中描述了肽配体的设计和制备。下面概述了构建肽配体。

[0069] (i)分子支架

[0070] 分子支架有时被称为“分子核心”或“连接体化合物”。适宜的是，分子支架具有分子对称性。适宜的是，分子支架具有三个支架活性基团和具有三重对称性。这具有仅制备单一反应产物的优点。如果分子支架不是对称性分子，那么可产生多种反应产物。这可导致复杂化，或需要将所需异构体与其它反应产物分离。

[0071] 适宜的是，分子支架可为小分子。适宜的是，分子支架是小的有机分子。

[0072] 适宜的是，分子支架可为或可基于天然单体(例如核苷、糖或甾体)。适当的是，分子支架可包含这类实体的短聚合体例如二聚体或三聚体。

[0073] 适宜的是，分子支架可包含三(溴甲基)苯尤其是1，3，5-三(溴甲基)苯(“TBMB”)或其衍生物或可由其组成。

[0074] 另一种合适的分子支架是2，4，6-三(溴甲基) 其与1，3，5-三(溴甲基)苯相似但包含另外的三个与苯环连接的甲基。这具有以下优点：另外的甲基可与多肽形成进一步接触，从而增加额外的结构约束。

[0075] 本发明的分子支架选自小分子或大分子结构。所述分子支架由有机的、无机的、或有机和无机并存的组分组成。

[0076] 在一个优选的方案中，分子支架是小的有机分子，例如线性烷烃。更适宜的是，分子支架是支链烷烃、环烷烃、多环烷烃、芳烃(aromate)、杂环烷烃或杂环芳烃，这提供较小柔性(例如，更强刚性)的优点。最适宜的是，分子支架包含苄型基团。

[0077] 在另一个实施方案中，分子支架选自如例如多肽、多核苷酸或多糖等大分子结构。

[0078] 本发明的分子支架包含以下化学基团，其容许本发明编码文库的多肽的官能团与所述分子支架形成共价键。所述化学基团选自大范围的官能团，包括胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烃、炔烃、酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、叠氮化物、烷基卤化物和酰基卤化物。

[0079] (ii)多肽

[0080] 所编码多肽的活性基团由天然氨基酸或非天然氨基酸的侧链适当地提供。所编码多肽的活性基团适当地选自硫醇基、氨基、羧基、胍基、酚基或羟基。所编码多肽的活性基团可适当地选自叠氮化物、酮-羰基、炔基、乙烯基、或芳基卤基团。用于与分子支架连接的所编码多肽的活性基团可适当地为所述多肽的氨基或羧基末端。

[0081] 在一些实施方案中，用于与分子支架连接的多肽的每个活性基团均为相同类型。例如，每个活性基团均可为半胱氨酸残基。

[0082] 任何天然的或非天然的氨基酸均可取代遗传编码的组合化学文库成员的合适氨基酸。这些可置换的氨基酸不包括含有用于将多肽与分子核心交联的官能团的氨基酸。一组可不同的邻近氨基酸被定义为多肽区段。单个多肽区段的大小适当地从1个氨基酸变化到20个氨基酸。多肽区段具有随机序列、恒定序列或含有随机和恒定氨基酸的序列。含有活性基团的氨基酸位于本发明所编码多肽内的确定的或随机的位置。

[0083] 在一个实施方案中，受两个含有与分子支架/分子核心结合的活性基团的氨基酸限制的多肽区段是具有10个或更少个氨基酸的短氨基酸序列。所述编码的多肽序列和分子核心的反应生成具有高度构象约束的文库成员。构象约束的配体通常具有更高的特异性和更强的结合亲和力。

[0084] (iii)多肽的活性基团

[0085] 本发明的分子支架可通过多肽上的官能团或活性基团与所述多肽结合。这些通常由多肽聚合物中存在的特定氨基酸侧链形成。这种活性基团可为半胱氨酸侧链、赖氨酸侧链、或N-末端氨基或其它合适的活性基团。

[0086] 适宜至少一个活性基团是半胱氨酸基团。基团例如赖氨酸或N-末端氨基通常活性不足以在适宜时间范围内在它们自身上与分子支架结合。然而，一旦分子支架与至少一个半胱氨酸连接或结合，那么一般的反应动力学意味着在那之后赖氨酸或胺键可快速而稳定地形成。因此，适宜至少一个活性基团为半胱氨酸基团。

[0087] 如果多肽上除半胱氨酸/赖氨酸/胺基之外的活性基团是所需的，那么可选择不同的分子支架以与靶多肽上选择的特定的功能活性基团配对。

[0088] 适宜地将半胱氨酸、赖氨酸或胺基用作所述目的多肽上的官能团或活性基团。

[0089] 适宜地在分子支架和目的多肽之间形成至少三个共价键。

[0090] 在一些实施方案中，可在分子支架和目的多肽之间形成四个键或甚至更多个键。然而，如果使用多于四个键，那么通常形成的产物混合物变得更加复杂并可阻碍随后的使用或应用。因此，优选分子支架和目的多肽之间的三个键或四个键。

[0091] 天然氨基酸的合适活性基团是半胱氨酸的硫醇基、赖氨酸的氨基、天冬氨酸或谷氨酸的羧基、精氨酸的胍基、酪氨酸的酚基或丝氨酸的羟基。非天然氨基酸可提供广泛的活性基团，包括叠氮化物、酮-羰基、炔基、乙烯基或芳基卤基团。多肽末端的氨基和羧基也可作为活性基团以与分子支架/分子核心形成共价键。

[0092] 本发明的编码多肽适当地包含至少三个活性基团。所述多肽也可包含四个或更多个活性基团。使用越多的活性基团，可将越多的多样性区段束缚至分子支架/分子核心。然而，不推荐过量活性基团与分子支架/分子核心连接，因为这可导致难以控制数目的产物异构体。适当地使用三个、四个或五个与分子支架的共价键；最适当地三个或四个共价键；最适当地三个共价键。

[0093] B：支架与噬菌体肽的连接

[0094] 我们的国际专利申请WO 2009/098450描述了不破坏噬菌体感染性的支架与噬菌体肽连接的详细条件。支架分子的连接涉及以下原理。

[0095] 具体而言，在靶多肽中还原半胱氨酸需要最有效率的反应。随后，通常除去用于化学还原那些半胱氨酸的还原剂以进行所需连接。可在分子支架连接之前用还原剂还原噬菌体编码多肽的硫醇基。在这类实施方案中，尤其是在噬菌体展示的实施方案中，或尤其是当还原剂是TCEP时，适宜地通过过滤例如过滤噬菌体除去过量的还原剂。然而在一些实施方案中，还原剂可以以下水平存在于连接期间，在所述水平下所述还原剂与分子支架的反应并不足以损害所述分子支架和肽的半胱氨酸的反应。

[0096] 可通过在肽和分子支架的反应中包含TCEP来预防硫醇基的再氧化。

[0097] 适宜地通过对反应缓冲液除气来预防硫醇基的再氧化。

[0098] 还适宜地通过经由螯合例如用乙二胺四乙酸(EDTA)螯合形成金属离子络合物，来预防硫醇基的再氧化。

[0099] 最适宜地通过在分子支架的反应中包含TCEP，通过螯合和通过使用已除气的缓冲液来预防或抑制硫醇基的再氧化。

[0100] 在本发明的一个实施方案中，通过将多肽的活性基团(例如噬菌体编码多肽的硫醇基)和分子支架反应一小时来完成所述多肽和所述分子支架的连接。

[0101] 适宜地它们在30℃下反应。

[0102] 适宜地它们与浓度为10μM至40μM的分子支架(例如三(溴甲基)苯)反应。

[0103] 适宜地在水性缓冲液中反应。

[0104] 适宜地在pH 8下反应。

[0105] 适宜地反应缓冲液包含乙腈。适宜地反应缓冲液包含20％乙腈。

[0106] 优化这些反应条件以使多肽的硫醇基和三(溴甲基)苯的活性基团定量地反应。在相同的反应条件下，大约20％噬菌体颗粒保持传染性以把遗传密码引入细菌细胞用于繁殖和解码。

[0107] 在一个实施方案中，分子支架例如TBMB可如下与靶多肽例如噬菌体编码的多肽连接：通过在30℃下和存在10μM TCEP于包含20％乙腈的pH 8的水性缓冲液中，将所述多肽的硫醇基与10μM TBMB(例如三(溴甲基)苯)反应1小时。在另一个实施方案中，反应可在相同缓冲液中在30μM TCEP存在的情况下使用40μM TBMB进行。

[0108] C：蛋白水解切割

[0109] 蛋白酶切割

[0110] 在一些实施方案中，本发明的多肽成分一旦束缚于分子支架/分子核心，就被蛋白水解切割。

[0111] 例如，在将多肽束缚于分子核心后可蛋白水解切割所述多肽的一个或多个酰胺键。这具有制备短多肽的优点，每个所述短多肽均通过至少一个共价键与所述分子支架连接，但呈现不同的分子结构，所述分子结构保持在包含编码母体多肽的核酸的复合物中。通过在本领域中所知的任何合适方法(例如受控水解或更适宜地通过合适的蛋白酶酶促切割)适当地催化所述多肽切割。所述蛋白酶可为任何合适的蛋白酶但优选具有特定多肽识别序列或基序的蛋白酶。这有利于致使更多确定的和/或更可预测的多肽切割产物的产生。实际上，在此实施方案中，例如通过操纵其编码核酸，可系统地增加或从靶多肽中除去蛋白酶识别序列。这有利地提供了更大程度的控制和容许了在根据本发明展示的分子中产生更大的多样性。最适宜所述多肽包含至少一个蛋白酶识别位点。适宜每个所述切割位点包含在以下氨基酸序列中，所述氨基酸序列处于用于与所述分子支架共价连接的多肽的活性基团之间。适宜每个所述切割位点包含在以下氨基酸序列中，所述氨基酸序列处于用于与所述分子支架共价连接的多肽的活性基团之间。

[0112] 用蛋白酶适当地切割肽环，所述蛋白酶在特定氨基酸位置识别和加工多肽(例如胰蛋白酶(在P1位置的精氨酸和赖氨酸)或者嗜热菌蛋白酶(在P1位置的脂族侧链))。所述酶在容许有效加工所展示分子的肽环但不加工噬菌体颗粒的浓度下使用。最优的条件可随多肽环的长度和使用的蛋白酶而改变。胰蛋白酶例如通常在10℃下于TBS-Ca缓冲液(25mM Tris HCl/137mM NaCl/1mM CaCl2，pH 7.4)中以200nM使用达10分钟。Kristensen，P. 和 Winter，G.(Proteolytic selection for protein folding using filamentous bacteriophages(使用丝状噬菌体对蛋白质折叠的蛋白水解选择)；Fold Des.1998；3(5)：
321-8)描述了适合修饰所展示多肽但不修饰噬菌体的整系列的蛋白酶。在噬菌体上的肽的酶促加工可为“部分蛋白水解”，因为不能排除切割数量有限的噬菌体衣壳蛋白。因此在条件的优化中，适当地选择在靶标的最大化切割和噬菌体颗粒的最大保留之间的最佳平衡。

[0113] 适当地所述靶多肽包含至少一个这种蛋白水解切割位点。

[0114] 适当地所述靶多肽包含至少两个这种蛋白水解切割位点。

[0115] 适当地所述靶多肽包含至少三个这种蛋白水解切割位点。

[0116] 在每个这样的蛋白水解实施方案中，适当地所述蛋白酶位点位于分子支架所对的靶多肽环之中。这具有将分子支架维持在复合物上的优点，否则多肽-分子支架复合物可从编码靶多肽的核酸中分离，这对于本发明大的多数应用是不需要的。

[0117] 使用短环(短是指例如，6个或更少个氨基酸残基)可损害某些蛋白酶在环内切割的能力。因此，在一些情况下，选择更长的环是所需的，所述环可能更易受蛋白酶影响。此外在用内切蛋白酶切割所述环之后，可能需要进一步用其它内切蛋白酶或实际上用外切蛋白酶(例如羧肽酶或氨肽酶)切短所述环。

[0118] 当靶多肽包含多于一个这类蛋白酶位点时，适宜每个所述位点存在于靶多肽和分子支架之间形成的两个共价键之间。如必要的话多个切割位点可存在于键与键之间。

[0119] 蛋白酶抗性

[0120] 在另一个实施方案中，多肽可为蛋白酶切割抗性的。总体而言，紧紧折叠的多肽结构对蛋白酶更有抵抗力，因为所述蛋白酶不能物理地进入所述多肽以切割它。因此，通过影响多肽环的折叠，对肽配体中的支架和支架连接的操纵可调节蛋白酶的敏感性。

[0121] 如前述部分所表明，可引入蛋白酶步骤以切割与化学支架连接的环内的可接近位点。如果肽缀合物的库展示在噬菌体上，这致使肽各自通过至少一个共价键与所述化学支架连接，但维持在包含编码母体多肽的核酸的复合物中。预期在用抗原选择前用蛋白酶对经化学修饰的噬菌体的处理，引起含有肽的噬菌体与经切割的环缀合，还引起含有肽的噬菌体与由于缺乏切割位点或以其它方式对切割有抗性而未经切割的环缀合。如果一种与抗原结合而另一种不结合，则可如下辨别这些种类：通过比较在蛋白酶处理之前和之后所选噬菌体克隆与靶抗原的结合。因此预期带有切割环的种类在蛋白酶处理之后而非之前结合；而预期蛋白酶抗性种类在处理之前和之后均结合。注意到如果缀合物与切割和未切割的环均结合(如在激肽释放酶切割后与PK15结合；见Heinis等人，2009)，它可被误认为是蛋白酶抗性的。这表明将直接方法用于检查切割(例如通过化学合成所述肽缀合物)和检查切割的证据(例如通过质谱法)的重要性。

[0122] 如果优选切割的环缀合物为蛋白酶抗性缀合物，有利是在第一轮选择之前用蛋白酶处理经化学修饰的噬菌体库，和在随后的几轮中继续使用相同的蛋白酶，或具有共同切割位点的蛋白酶。然而作为备选可需要蛋白酶抗性缀合物。这类肽可用于口服给予(因耐受肠蛋白酶)或以其它方式经历在血液、组织或细胞中的蛋白水解攻击的那些。此外在较低的剂量下可给予蛋白酶抗性的治疗。在此情况下，不存在蛋白酶情况下的第一轮选择，然后用蛋白酶的随后一轮选择，应该有利于选择抗性种类。

[0123] 在所述选择过程中蛋白酶的使用有进一步的效用。例如，因为下述原因一些未成形的环(序列的线性区段)可存在于文库中：(a)在核苷酸合成中的错误未能编码所需的半胱氨酸残基，或(b)在溶液中所需半胱氨酸残基与游离半胱氨酸形成二硫键(也许由于不充分的还原或再氧化)，或已以不可逆的方式反应(例如被氧化成半胱磺酸，或所需半胱氨酸之一已与支架的不同分子起反应生成其它物质)。因为序列的线性区段比环更易受蛋白酶攻击，那么，依赖于存在的切割位点，使用蛋白酶可能避免这样的结合物(binder)。

[0124] 蛋白酶步骤(在还原剂存在的情况下)同样有利于消除环，所述环通过在所需半胱氨酸之间的二硫化物而非通过化学支架形成。这是可预期的，如果有在噬菌体上存在半胱氨酸的不充分还原(或者随后再氧化)。因此我们在化学交联步骤期间使用已除气的缓冲液；我们也在与TBMB反应期间保持低水平的还原剂(TCEP)以维持还原环境。然而，在第一轮选择之后，我们发现许多包含四个半胱氨酸残基的序列(三个所需半胱氨酸残基和另一个半胱氨酸残基在环中)，例如PEP21(CFNSEWSCLQSCSNC)。预期这类额外的半胱氨酸存在于所述肽库中，由于合成的核苷酸文库包含随机的密码子(NNK多样性：其中N代表腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸中各自25％的混合物，和K代表胸腺嘧啶和鸟嘌呤核苷酸各自50％的混合物)。在某些条件下，例如如果有不充分的还原，或者所需半胱氨酸和化学支架的不完全反应(可能由于氨基或水对所述支架的竞争性反应)，可预期额外的半胱氨酸在氧化条件下与所述三个所需半胱氨酸之一形成二硫化物环。或者，额外的半胱氨酸可与所述支架反应，让所需半胱氨酸中的两个形成二硫化物-封闭环。

[0125] 无论它们的制备背后是任何准确机制，这类二硫化物-封闭环可与支架-封闭环竞争，并占优势。应该可能的是，通过使用由三联体而非单体建立的合成核苷酸文库，来降低所述额外半胱氨酸的出现率，从而避免环中的半胱氨酸密码子；和/或在还原剂存在的情况下进行选择，以便打开所述二硫化物-封闭环。更适宜的是，我们发现为了打开然后切割所述环，在还原剂(例如二硫苏糖醇或TCEP)存在的情况下用蛋白酶对经化学修饰的噬菌体库的处理，有助于最小化这类物质的影响。

[0126] 因此，在一个实施方案中，本发明的肽配体大体上是蛋白酶抗性的。在针对靶标选择后将所述肽配体暴露于切割将有利于鉴定有蛋白酶切割抗性的结合性肽配体。然而不能排除在切割后某些肽配体将保留与所述靶标结合的能力。本发明因此提供选择具有增强的蛋白酶抗性的肽配体的方法，其包括以下步骤：

[0127] (a)提供第一多肽库；

[0128] (b)将所述多肽与分子支架缀合以形成多肽缀合物库，所述分子支架在两个或更多个氨基酸残基上与所述多肽结合；

[0129] (c)针对靶标结合筛选所述库，和选择所述第一个库与所述靶标结合的成员；

[0130] (d)任选地，用还原剂处理所选库。

[0131] (e)用蛋白酶处理所述库；和

[0132] (f)针对与所述靶标的结合进一步筛选所述库。

[0133] 在另一个实施方案中，本发明的肽配体大体上受蛋白酶切割。在库筛选之前包括蛋白酶步骤，这有利于鉴定以切割形式与所述靶标结合的肽配体。本发明因此提供选择经蛋白酶切割的肽配体的方法，其包括以下步骤：

[0134] (a)提供第一多肽库；

[0135] (b)将所述多肽与分子支架缀合以形成多肽缀合物库，所述分子支架在两个或更多个氨基酸残基上与所述多肽结合；

[0136] (c)任选地用还原剂处理所述库

[0137] (d)用蛋白酶处理所述库；和

[0138] (e)针对靶标结合筛选所述库，和选择在用蛋白酶处理后与所述靶标结合的第一个库的成员。

[0139] 针对蛋白酶抗性的筛选可简单地呈用蛋白酶有限消化的形式以鉴定所述库的以下成员，其中结合对蛋白酶是敏感的，或需要蛋白酶的作用。最理想的是使用在以下条件下具有活性的蛋白酶，在所述条件中将二环肽例如在血清存在下使用。

[0140] 蛋白酶切割的条件

[0141] 在一个方面，在噬菌体上展示的肽的切割可在限定的蛋白酶切割位点上发生。切割位点是在肽序列中的以下位置，其中蛋白酶能够切割线性肽。例如，这样的位点可天然地存在于噬菌体上展示的肽中，无论是由于随机诱变还是对包含切割位点的肽的选择。

[0142] 或者，可将切割位点改造到肽中，例如通过编码所述肽的核酸的定向诱变。

[0143] 切割位点可为酶促切位点例如被蛋白酶例如凝血酶、因子Xa、肠肽酶例如丝氨酸蛋白酶、肠激酶(包括在WO 01/98366中描述的那些)或例如被胰蛋白酶切割的酶促切位点，或者它可为化学试剂(例如CNBr)可切割的化学切割位点，CNBr在甲硫氨酸残基上切割。

[0144] 优选的是，使用酶促切割剂。重要的是，平衡对配体中肽的切割和对噬菌体的切割，对噬菌体的切割将破坏噬菌体的传染性。

[0145] 存在许多高度特异性的蛋白酶。尽管本发明不在于任何具体蛋白酶的选择，但蛋白酶优选在使用的条件下足够特异，使得在所述切割条件下，其有能力切割肽配体中的切割位点而不切割对噬菌体的生存力所必需的任何多肽。特定切割条件例如低温的选择，让使用在另外情况下不适合的蛋白酶可行。

[0146] 凝血和补体系统包含许多非常特异的蛋白酶。通常，在级联早期的酶比较晚期的酶更有特异性。例如，因子X(FX)比凝血酶更有特异性。牛FX在序列Ile-Glu-Gly-Arg之后切割而人FX在Ile-Asp-Gly-Arg之后切割。可根据需要使用任一个蛋白酶-连接物对。

[0147] 如果使用凝血酶，则凝血酶敏感性位点存在于纤维蛋白原、因子XIII、和凝血酶原中。从其中得到FX的物种将影响所述蛋白酶的精确特异性，所述蛋白酶适合于切割在其体内的天然靶标中所发现的精确序列。

[0148] 人因子XI在两个地方切割人因子IX：QTSKLTR/AEAVF和SFNDFTR/VVGGE。这样的蛋白酶因此提供了非常特异的切割系统，其仅仅在非常有限数量的位点上切割肽。

[0149] 人激肽释放酶在R353：LFSSMTR/VVGFLV处切割人FXII。

[0150] 此序列与上述的hFXI位点有显著相似性。

[0151] 人FXII在R369：KIPPR/IVGGT处切割人FXI。

[0152] 用于切割融合蛋白的其它蛋白酶，包括肠激酶、胰蛋白酶、胶原酶、凝乳酶、尿激酶、肾素和某些信号肽。参见Rutter，US 4,769,326，其通过引用结合到本文中。

[0153] 在本发明优选的实施方案中，蛋白酶为选自以下蛋白酶的组别中的任一种：识TM别和切割切割位点LEVLFQGP的PreScission ；切割位点IEGRGI的因子Xa；和切割位点LVPRGS和位点LVPKGS的凝血酶。

[0154] 本领域技术人员认识的是，必须小心地控制切割条件，使得噬菌体不因必需噬菌体多肽的切割而失活。如上文所指出，Kristensen，P.和Winter，G.(使用丝状噬菌体对蛋白质折叠的蛋白水解选择；Fold Des.1998；3(5)：321-8)描述了适合修饰所展示的多肽但不修饰噬菌体的整系列的蛋白酶。

[0155] D：靶标

[0156] 本发明肽配体可经设计以与任何既定靶标结合。本领域技术人员认识的是，靶分子的选择是广泛且多种多样的。它们可为例如人或动物蛋白质、细胞因子、细胞因子受体、酶的酶辅因子或DNA结合蛋白。合适的细胞因子和生长因子包括但不限于：ApoE，Apo-SAA、BDNF、心肌营养蛋白-1、EGF、EGF受体、ENA78、嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、Exodus-2、酸性FGF-、碱性FGF、成纤维细胞生长因子-10、FLT3配体、CXXXC趋化分子(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-I、胰岛素、IFNy、IGF-I、IGF-II、IL-Ia、IL-1(3、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a.)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-17a、IL-17c、IL-17d、IL-17e、IL-17f、IL-18(IGIF)、IL-21、IL-22、IL-23、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、抑制素α、抑制素β、IP-10、角质形成细胞生长因子-2(KGF-2)、KGF、瘦蛋白、LIF、淋巴细胞趋化因子(Lymphotactin)、缪氏抑制物质、单核细胞集落抑制因子、单核细胞趋化蛋白质(monocyte attractant protein)、M-CSF、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP-Ia、MIP-1p、MIP-3a、MIP3、MIP-4、骨髓祖代抑制因子-1(myeloid progenitor inhibitor factor-1，MPIF-1)、NAP-2、神经秩蛋白(neuturin)、神经生长因子、P-NGF、NT-3、NT-4、制瘤素M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDFIa、SDFIp、SCF、SCGF、干细胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-2、TGF-3、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF受体I、TNF受体II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF受体1、VEGF受体2、VEGF受体3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER 1、HER2、HER3和HER 4；细胞因子受体包括前述细胞因子的受体。趋化因子靶标包括CC趋化因子配体CCL21/6Ckine、CCL12/MCP-5、CCL6/C10、CCL22/MDC、CCL14/HCC-1/HCC-3、CCL3L1/MIP-1α同工型LD78β、CCL23/Ckβ8-1、CCL3/MIP-1α、CCL28、CCL4L1/LAG-1、CCL27/CTACK、CCL4/MIP-1β、CCL24/嗜酸性粒细胞趋化因子-2/MPIF-2、CCL15/MIP-1δ、CCL26-样/嗜酸性粒细胞趋化因子-3-样、CCL9/10/MIP-1γ、CCL26/嗜酸性粒细胞趋化因子-3、CCL19/MIP-3β、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、CCL20/MIP-3α、CCL14a/HCC-1、CCL23/MPIF-1、CCL14b/HCC-3、CCL18/PARC、CCL16/HCC-4、CCL5/RANTES、CCL1/I-309/TCA-3、TAFA1/FAM19A1、MCK-2、TAFA5/FAM19A5、CCL2/JE/MCP-1、TAFA3/FAM19A3、CCL8/MCP-2、TAFA4/FAM19A4、CCL7/MCP-3/MARC、CCL17/TARC、CCL13/MCP-4和CCL25/TECK；趋化因子受体包括CCR1、CCR7、CCR2、CCR8、CCR3、CCR9、CCR4、CCR10、CCR5、CCRL2/LCCR/CRAM-A/B和CCR6；CXC趋化因子配体包括CXCL13/BLC/BCA-1、CXCL10/IP-10/CRG-2、CXCL14/BRAK、LIX、CXCL16、CXCL15/Lungkine、CXCL5/ENA-78、CXCL9/MIG、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL1/2/3/GRO、CXCL4/PF4、CXCL1/GROα/KC/CINC-1、CXCL12/SDF-1α、CXCL2/GROβ/MIP-2/CINC-3、CXCL12/SDF-1β、CXCL3/GROγ/CINC-2/DCIP-1、CXCL12/SDF-1、CXCL11/I-TAC、CXCL7/胸腺趋化因子-1和CXCL8/IL-8；
CXC趋化因子受体包括CXCR3、CXCR7/RDC-1、CXCR4、CXCR1/IL-8RA、CXCR5、CXCR2/IL-8RB和CXCR6；TNF超家族配体包括4-1BB配体/TNFSF9、LIGHT/TNFSF14、APIL/TNFSF13、淋巴毒素、BAFF/BLyS/TNFSF13B、淋巴毒素β/TNFSF3、CD27配体/TNFSF7、OX40配体/TNFSF4、CD30配体/TNFSF8、TL1A/TNFSF15、CD40配体/TNFSF5、TNF-α/TNFSF1A、EDA(pan)、TNF-β/TNFSF1B、EDA-A1/外胚层发育异常蛋白A1、TRAIL/TNFSF10、EDA-A2、TRANCE/TNFSF11、Fas配体/TNFSF6、TWEAK/TNFSF12和GITR配体/TNFSF18；TNF超家族受体包括4-1BB/TNFRSF9/CD137、NGF R/TNFRSF16、BAFFR/TNFRSF13C、护骨蛋白/TNFRSF11B、BCMA/TNFRSF17、OX40/TNFRSF4、CD27/TNFRSF7、RANK/TNFRSF11A 、CD30/TNFRSF8、RELT/TNFRSF19L、CD40/TNFRSF5、TACI/TNFRSF13B、DcR3/TNFRSF6B、TNFRH3/TNFRSF26、DcTRAILR1/TNFRSF23、TNF RI/TNFRSF1A、DcTRAIL R2/TNFRSF22、TNFRII/TNFRSF1 B、DR3/TNFRSF25、TRAIL R1/TNFRSF10A、DR6/TNFRSF21、TRAIL R2/TNFRSF10B、EDAR、TRAILR3/TNFRSF10C、Fas/TNFRSF6/CD95、TRAIL R4/TNFRSF10D、GITR/TNFRSF18、TROY/TNFRSF19、HVEM/TNFRSF14、TWEAKR/TNFRSF12、淋巴毒素β R/TNFRSF3和XEDAR；Toll样受体，包括TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8和TLR-9；酶，包括组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶F、MMP 1、MMP2、MMP3、MMP 7、MMP 8、MMP 9、MMP
10、MMP 11、MMP 12、MMP 13、MMP 14、MMP 15、MMP 16、MMP 17、MMP 19、MMP 20、MMP 21、MMP
23A、MMP 23B、MMP26、MMP 27、MMP 28、尿激酶、激肽释放酶(包括KLK1、KLK2、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK9、KLK10、KLK11、KLK12、KLK13、KLK14和KLK15)；补体系统的组分；胞内信号分子和转录因子；p53；和MDM2。

[0157] 理解的是这份列表绝非穷举的。

[0158] 靶标还可为大血浆蛋白，例如血清白蛋白，如下所述。

[0159] 在多肽缀合物与两个表位(在相同或不同的靶标上)结合时，靶分子可选自此列表。所述靶标可能竞争与所述多肽缀合物的结合，如此它们不能两者同时都结合。或者，它们两者可同时都结合，使得所述多肽缀合物连接所述靶标。

[0160] 当肽环经切割或未经切割时，靶标可被配体结合。因此，在一个实施方案中，仅当肽配体的至少一个环未经切割且肽呈现受与支架的结合限制的结构时，一个或多个靶标才被结合。在适当的环中的配体的切割导致结合消失。如果所述配体是双特异性的，可视情况通过切割一个或多个环调节与所述靶标中的一个或另一个，或与两者的结合。

[0161] 相反地，当一个或多个环受切割时所述配体可与靶标结合，所述肽起适配子样分子的作用，当大体上摆脱了支架强加的构象约束时所述适配子样分子与其靶标结合。在这样的一个实施方案中，所述环的切割引起结合。

[0162] 因此，通过用适当的蛋白酶切割一个或多个环，可调节所述配体与一个或多个靶标的结合。

[0163] 在另一个实施方案中，可选择蛋白酶抗性配体，以用于结合靶标例如蛋白酶，或以用于富含蛋白酶的环境中，例如在血浆中或黏膜表面。

[0164] 这样的配体可用于医疗应用例如疫苗、治疗剂和诊断。实施例

[0165] 根据下列实施例进一步描述本发明。

[0166] 实施例1.针对MDM2的蛋白酶抗性二环肽

[0167] MDM2是一种酶(E3遍在蛋白连接酶)，其识别p53(肿瘤抑制基因)的反式激活结构域，引起蛋白体对p53的遍在蛋白化和降解。p53-MDM2的相互作用的nutlin抑制剂可导致p53通路的体内活化，而且有人提议这种作用剂可具有作为抗癌剂的潜力。在这里我们描述针对MDM2(靶“抗原”)对两种二环肽(PEP10和PEP48)的选择。每种合成肽的亲和力是亚微摩尔，在250-750nM范围内。竞争ELISA显示至少一种所述肽结合与线性肽相同的位点，所述线性肽先前显示阻断p53-MDM2相互作用。

[0168] 方案一般按照之前在Heinis等人，2009，Nature Chemical Biology 5，502-507中所描述的方案，除非另有注释。在Heinis等人的工作中，两个靶标激肽释放酶和组织蛋白酶G都是蛋白酶，并且激肽释放酶抑制剂对激肽释放酶的蛋白水解是相当有抗性的，尽管其包含激肽释放酶的切割位点。MDM2不是蛋白酶，因此不明确所选肽是否也是有蛋白酶抗性。因此和其它原因(详见下文)，在噬菌体肽库和TBMB(包括在还原条件下)的反应之后和针对MDM2对库的选择之前，我们包括一个或多个蛋白酶(胰凝乳蛋白酶)的步骤。正如通过噬菌体ELISA所示，两种所选噬菌体肽PEP10和PEP48呈现对蛋白水解的抗性。

[0169] 噬菌体的制备和纯化

[0170] 制备有至少4×109个克隆的多样性的噬菌体肽库并将TBMB在少许改变的情况下如前述缀合。

[0171] 1.将如前述的噬菌体cx6文库(其制备自TG1细胞)用于感染所述非抑制基因菌株HB2151(Carter，Bedouelle和Winter.1985.Nucleic Acids Res.13：4431-43)，并将感染的细胞涂板。将细菌从平板刮入约8ml 2xTY培养基，30μg/ml氯霉素，10％甘油(v/v)。

[0172] 2.将约0.8ml原液加入到含有30μg/ml氯霉素的800ml 2xTY培养基，以获得在600nm处约为0.1的OD。在30℃下孵育培养物，并在2升烧瓶中在200rpm下振荡16小时。

[0173] 3.将细胞培养基在4,000rpm(Heraeus Megafuge 2R)于4℃下离心30分钟。将上清液转移到200ml冷的20％PEG，2.5M NaCL。将混合物置于冰上1小时。

[0174] 4.将沉淀的上清液/噬菌体混合物在4℃下离心30分钟并丢弃上清液。

[0175] 5.将噬菌体重悬在35ml PBS、5mM EDTA中，随后在4000rpm(Heraeus Megafuge2R)下离心15分钟以除去细胞碎片。将上清液转移到新的50ml Falcon管中。

[0176] 用TBMB修饰噬菌体

[0177] 1.将5ml 8mM TCEP(在H2O中)加入到噬菌体以获得最终浓度1mM的TCEP。倒转管若干次以混合并且在42℃水浴下孵育1小时。

[0178] 2.用二次PEG沉淀除去TCEP。将10ml 20％PEG、2.5M NaCL(已除气的溶液)加入，混合，和在冰上孵育45分钟，然后在4000rpm4℃下离心30分钟。

[0179] 3.小心除去上清液并将沉淀重悬在12ml PBS，5mM EDTA，10μM TCEP(已除气的缓冲液)中。

[0180] 4.将3ml含50μMTBMB的乙腈加入到12ml还原噬菌体中，以获得10μM的TBMB终浓度。倒转管若干次并在30℃水浴中静置1小时。在冰上冷却噬菌体，1/5体积的20％PEG、2.5M NaCL沉淀30分钟。通过在4000rpm(Hereaus Megafuge 2R)下离心20分钟收集噬菌体。除去上清液和将所述噬菌体重悬在4ml PBS中。将噬菌体转移进2ml Eppendorf管并在13000rpm(Eppendorf台式离心机)下离心10分钟。转移上清液到新的Eppendorf管中并测量噬菌体的传染性。

[0181] 噬菌体选择：总体方案

[0182] 第一轮选择

[0183] 1.针对固定在链霉亲和素包被的Dynabeads(Dynal Biotech)表面的生物素化MDM2(bio-MDM2)肽(残基2-125)选则如上的经纯化和化学缀合的噬菌体。首先将80μl珠粒用含2％(w/v)Marvell奶粉的PBS(PBSM)洗涤并封闭40分钟，随后用100nM bio-MDM2在总体积1ml中孵育20分钟。

[0184] 2.用PBSM孵育经化学修饰的噬菌体(1010-1011TU)40分钟。

[0185] 3.用含0.1％Tween的PBS(PBST)将来自步骤1的封闭的Ag包被珠粒从过量Ag中洗涤，并用封闭的噬菌体在总体积1ml中孵育30分钟。

[0186] 4.先用10x PBST然后用2x PBS洗涤未结合的噬菌体。在每样第三次洗涤的步骤之后，将所述噬菌体包被珠粒转移到新的Eppendorf管中。

[0187] 5.在回转轮上通过用500μl 50mM pH2.2的甘氨酸孵育10分钟来洗脱噬菌体。用250μl的1M pH7.5的Tris中和洗脱的噬菌体。

[0188] 6.用10ml HB2151细胞在37℃下不振荡的条件下孵育375μl噬菌体90分钟。

[0189] 7.然后将感染的细胞在37℃下振荡30分钟，然后涂布在氯霉素平板(20x20cm)上。

[0190] 8.如上所述将集落从平板中刮入2xTY、氯霉素、10％甘油中，和在-80℃下储存为甘油原液。将细胞部分用于制备第二轮选择的噬菌体。

[0191] 第二轮选择

[0192] 除少数改变之外第二轮选择与第一轮相似。

[0193] 1.用Neutravidin包被的磁珠代替链霉亲和素包被的磁珠。

[0194] 2.选择中使用的抗原的量为20nM.

[0195] 3.首先用50μg/ml胰凝乳蛋白酶处理经化学修饰的噬菌体(1010-5x1010TU)2分钟，随后用PBSM封闭40分钟。

[0196] 4.先用15x PBST然后用2xPBS洗涤未结合的噬菌体，其它同上。

[0197] 噬菌体选择：变体方案

[0198] 使用上述总体方案选择克隆48，而由于引入改良方案而制备出克隆10。所述改良如下：

[0199] 1.在首轮用50μg/ml胰凝乳蛋白酶预处理经化学修饰的噬菌体2分钟，然后用PBSM封闭40分钟。

[0200] 2.在第二轮首先用5mM DTT还原经化学修饰的噬菌体20分钟，然后用50μg/ml胰凝乳蛋白酶孵育2分钟并用PBSM封闭40分钟。

[0201] 肽合成

[0202] 用游离N-和C-末端合成来自噬菌体克隆48和噬菌体克隆10的编码肽。PEP10：H-Ser-Cys-Glu-Leu-Trp-Asn-Pro-Lys-Cys-Arg-Leu-Ser-Pro-Phe-Glu-Cys-Lys-Gly-OH；
PEP48：H-Ser-Cys-Val-Arg-Phe-Gly-Trp-Thr-Cys-Asp-Asn-Ser-Trp-His-Gly-Cys-Lys-Gly-OH。

[0203] 通过Fmoc-肽合成法在CEM Liberty微波肽合成仪上在0.1mmolFmoc-Gly-PEG PS树脂上，使用5倍过量的分别用含PyBop的DMF和含DIPEA的NMP(1当量和2当量)激活的Fmoc-氨基酸进行所述合成。侧链保护基团如下：Arg(Pbf)；Asn(Trt)；Asp(OtBu)；Cys(Trt)；Glu(OtBu)；Lys(Boc)；Ser(tBu)；Thr(tBu)；Trp(Boc)。使用含有0.1M HOBT的
20％v/v哌啶/DMF进行Fmoc-脱保护。用DMF、然后丙烷-2-醇洗涤氢-肽基-树脂，并真空干燥。使用94∶2.5∶2.5∶1v/v/v/vTFA/EDT/水/iPr3SiH达2小时实现侧链保护基团的裂解和自支持体体的裂解。过滤肽/TFA混合物以除去支持体，用水稀释所述肽/TFA混合物和用Et2O洗涤(5次)，冻干含水层。

[0204] 在Phenomenex Jupiter 5μ C18 250x4.6mm柱上进行反相hplc。缓冲液A：0.1％TFA/水；缓冲液B：含有10％缓冲液A的CH3CN。用10％缓冲液B等度洗脱所述柱2分钟，然后用10-90％的线性梯度在25分钟内洗脱。在215/230nm下检测；流速1.5ml/分钟。

[0205] 冻干肽并用质谱法检查。PEP10 MALDI-TOF质量(M+H)：2099.9Da(理论值：2098.4Da.)PEP48MALDI-TOF质量(M+H)：2043.8Da(理论值：2042.8Da.)。然后将所述肽用TBMB缀合。

[0206] TBMB-肽缀合物的合成

[0207] 进行初始反应以模拟在噬菌体选择期间使用的条件。典型地，将5mg经纯化的肽溶解在1ml水中和加入0.8ml 50mM NH3HCO3，然后加入40μl TCEP。将溶解在MeCN中的TBMB(基于肽的重量的3当量)加入到反应物中。使反应1.5小时然后通过HPLC监测。结束时用HPLC纯化反应物。通常获得0.5-1.5mg终产物。此方法导致产生许多副产物，主要产物的期望质量为+250amu。这相当于将TCEP加入到所需产物，并且此产物的收率随着反应时间增加。另外其它更高质量的相当于加入第二TBMB的产物，通过MALDI-TOF质谱法观察，但没有分离。

[0208] 基于TCEP加合物的形成开发出一种优选的方法。将所述肽从树脂上切割下来后，直接通过HPLC将其纯化，或在HPLC纯化之前先用TCEP预处理15分钟。将在HPLC洗脱缓冲液(通常6ml)中的来自HPLC反应的产物，用50mM NH3HCO3(4ml)和如上所述加入到MeCN的TBMB中和。10％THF的加入产生了清液，因而加速了所述反应。通过质谱监测反应，但典型地在1-2小时内完成。有极少的副产物来自此反应(尽管通过质谱观察到产物+16的存在)。所述反应需要浓缩以在HPLC纯化之前除去有机溶剂，否则所述产物易于随溶剂前沿一起洗脱。此方法中的产物收率通常为0.5-1.5mg/3mg肽，但这是未经优化的。

[0209] 结合测定

[0210] 噬菌体ELISA测定

[0211] 将0.6μg/mL生物素化MDM2肽(残基2-125)固定在链霉亲和素-包被的平板(Roche)上。用PBSM(但4％在奶粉中)封闭平板，在室温下在所述平板上孵育线性或者TBMB-缀合的噬菌体(在存在或缺乏5mM DTT的PBSM中107TU/孔)50分钟。相似地，噬菌体首先在5mMDTT中还原20分钟，经胰凝乳蛋白酶(50μg/ml在PBS中)处理2分钟，与PBSM(终浓度)混合和在室温下在所述平板上孵育50分钟。使用抗M13-HRP单克隆抗体(1∶5000，Amersham)检测噬菌体。

[0212] 结果(图1)定性显示噬菌体克隆10和克隆48两者与MDM2结合为环状缀合物但不结合为非缀合肽(无论是否用DTT预处理)。此外，缀合肽的结合抵抗蛋白水解。注意到5mM DTT可还原胰凝乳蛋白酶的二硫键而导致其作为蛋白酶的失活。为确保所述胰凝乳蛋白酶在测定条件下是有活性的，我们在如上所述用5mM DTT预处理之后孵育带有与MDM2结合的线性肽的对照噬菌体。在我们的实验条件下，所述对照噬菌体的结合活性在蛋白水解时丧失。在其它实验中我们在室温下于PBS中在有胰凝乳蛋白酶(0.1mg/ml-1mg/ml)存在的情况下使用高达0.2mM-5mM的TCEP达2分钟。这些条件也允许我们辨别噬菌体上的线性肽和环肽。

[0213] 荧光各向异性测定

[0214] 在配备有由实验软件控制的Hamilton Microlab滴定仪的Horiba Jobin Yvon荧光计上进行滴定实验。所用的λex和λem分别为295nm和350nm。用于激发和发射的狭缝宽度为5nm和15nm，将积分时间10s用于每次测量。利用肽10、48中色氨酸的固有荧光测定它们对MDM2(残基2-125)的结合亲和力。在23℃下在PBS、5mM DTT中进行所述实验。通常将250μl MDM2(150μM)滴定入1.2ml肽(1μM)中。通过利用平衡式Kd＝[A][B]/[AB]的二次解用标准的1∶1结合模型分析滴定数据。Kd是离解速率，[A]和[B]分别是指滴定剂(MDM2)和荧光肽10和48的浓度。拟合方程包含额外项以说明线性漂移。

[0215] 结果(图2及以下)表明每个肽的亲和力均为亚摩尔，在250-750nM范围内。重复进行对PEP48的所述测量。

[0216] PEP10+MDM2，以λex＝295nm测量，Kd＝267nM；

[0217] PEP48+MDM2，以λex＝280nm测量，Kd＝760nM，

[0218] PEP48+MDM2，以λex＝295nm测量，Kd＝567nM

[0219] 竞争测定

[0220] 以Kd＝3.3nM(Pazgier等人，2009PNAS，106，4665-4670)在p53位点与MDM2结合的肽pMI(TSFAEYWNLLSP)与PEP48噬菌体竞争结合MDM2。将0.6μg/ml生物素化MDM2肽(残基2-125)固定在链霉亲和素包被的平板(Roche)上。用PBSM封闭平板。将TBMB-缀7
合的噬菌体(在1％PBSM中10TU/孔)与一系列浓度的pDI(从6.94nM到1μM)预混合，在室温下在平板上孵育75分钟。使用抗M13-HRP单克隆抗体(1∶5000，Amersham)检测噬菌体。通过加入pMI肽抑制PEP48噬菌体与MDM2的结合，估计的IC50＝125nM。

[0221] 实施例2.二环肽的蛋白酶抗性

[0222] 分别针对蛋白酶激肽释放酶和组织蛋白酶G选择二环肽PK15和CG4(Heinis等人，2009)，如果所述二环肽抵抗这些蛋白酶的消化，那么不会让人惊讶的是，尤其是支架的约束性质应有助于抵抗蛋白水解攻击。

[0223] 我们用激肽释放酶和其它蛋白酶比较线性PK15(用碘乙酰胺处理的半胱氨酸)和与TBMB支架缀合的PK15，见下表(程度从+++(大体上完整)变化到-(完全切割)。正如所预期，与TBMB的PK15缀合物比线性PK15对激肽释放酶的攻击更有抗性。如通过比较不同浓度的酶所示，因子为大约100倍。

[0224] 对于其它蛋白酶，因子取决于蛋白酶在10和100倍之间变化。我们也比较二环CG4L1-PK15L1(WO 2009/098450)对蛋白水解的抗性。在此情况下，因子取决于蛋白酶在1和大于100倍之间变化。因此，所述缀合物对对除选择过程中其所暴露于的蛋白酶(激肽释放酶)之外的蛋白酶的抗性增加。

[0225] 按照蛋白酶的抗性变化表明，在选择或筛选过程中包括蛋白水解步骤是理想的，如在实施例1中已描述的。最理想的是使用在以下条件下有活性的蛋白酶，在所述条件中例如在血清存在的条件下使用所述二环肽。出于兴趣，我们检查PK15对血清的抗性。这显示在37℃下在大约2小时内血清中的蛋白酶消化了线性PK15。然而所述PK15缀合物抵抗蛋白水解达至少48小时；更迟的时间仍待试验。

[0226] 表：用各种蛋白酶消化肽缀合物。

[0227]

[0228]

[0229] 数字对应于μg酶/反应的数量

[0230] 方法

[0231] 关于方法，见下述实施例3。在37℃下进行蛋白水解。在10mMTris pH 7.4、150mM NaCl、10mM MgCl2、1mM CaCl2、0.1％BSA、0.01％Triton X100、5％DMSO中进行组织蛋白酶G和激肽释放酶反应。在100mM Tris pH 7.4、10mM CaCl2中进行胰凝乳蛋白酶反应。在100mM Tris pH 7.4，0.5％SDS中进行链霉蛋白酶和蛋白酶K反应。在50mM KH2PO4pH 7.5中进行枯草杆菌蛋白酶反应。在67mM磷酸钠pH 7.6下进行胰蛋白酶反应。带有血清的反应条件涉及将所述肽溶解在1xPBS中(总体积24μl)和将6μl人血清加入到反应中。

[0232] 实施例3.PK15的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶切割位点

[0233] 为鉴定PK15的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶切割位点，我们如实施例2中所述使用碘乙酰胺衍生肽和TBMB缀合物。蛋白水解条件也如实施例2中所述。通过质谱分析，根据对经切割物质的分子质量分析，我们能够说明在所述碘乙酰胺衍生肽(AC*SDRFRNC*PADEALC*G)中R7和R9两者均被胰蛋白酶切割，和F8被胰凝乳蛋白酶切割。在所述TBMB缀合肽中存在相同的切割位点，但如实施例2中所述，切割以慢得多的速率进行。此外就胰蛋白酶而言，最初的切割步骤是在R7上，接着在更长的孵育中在R9上切割。

[0234] 方法

[0235] 在Proteo C12(4μ，Phenomenex)柱上使用Varian 940HPLC纯化肽和缀合物。使用的缓冲液是0.1％TFA(A)和90％MeCN、0.1％TFA(B)。通常在10-65％缓冲液B梯度中在23分钟内洗脱样品。

[0236] 对于TBMB缀合，我们使用我们的一般条件，其如下所示。将5-6mg粗肽在合成后(见实施例1关于典型的合成条件)溶解在600μl水(如果不溶则加入20μl 10％氨溶液)中，随后加入60μl TCEP并容许静置20分钟。在两次注射中通过HPLC(上述条件)收集在ca 3-4ml洗脱缓冲液中的肽来纯化所述还原肽。通过加入等体积的100mM磷酸铵缓冲液和1ml乙腈中和所述溶液。将10当量的TBMB溶解在1ml乙腈中并加入到所述还原肽中。监测pH，如果pH为酸性则进一步加入100mM磷酸铵。通常反应在20-30分钟内完成。然后通过HPLC纯化反应物，首先上样多达4.5ml的所述反应物到在0.1％TFA之中平衡的柱之上，用0.1％TFA洗涤8分钟然后如下所述从柱中洗脱。将纯的流分冻干并在水(10％DMSO如果不溶)中溶解。自始至终用MALDI-TOF质谱监测产物和反应，使用ZipTip对反应混合物脱盐。缀合物的产量通常为1-2mg。

[0237] 对于所述碘乙酰胺缀合物，我们使用我们的一般条件(如下所示)。在合成之后，将粗肽(5-6mg)溶解在水(600μl)中，用TCEP(6μl 0.5M)处理20分钟，然后进行HPLC。用等体积的100mM重碳酸铵中和来自HPLC(ca 3ml)的纯化流分，并用10当量的含碘乙酰胺的1ml MeCN处理。在这些条件下反应通常在30分钟内完成。用HPLC直接纯化反应混合物：上样多达4.5ml所述混合物到在0.1％TFA中平衡的柱上，用0.1％TFA洗涤8分钟然后如前文所述洗脱。

[0238] 将肽(线性的和缀合物)以1mg/ml浓度溶解在水中，提供有效浓度约0.5mM的储液，使用氨基酸分析确定所述浓度。在30μl的总反应体积中将2μl肽缀合物(20μM终浓度)(约30μM在反应中，取决于实际分子量)溶解在反应缓冲液(见下文)中，随后在37℃下将蛋白酶(通常在每个反应1、0.1和0.01μg的范围内)和样品孵育1小时。将
10μl等分试样在10μl1％TFA中淬灭。用MALDI-TOF质谱分析样品以鉴别碎片峰，从而确定切割位点。在对切割位点有歧义时，通过MALDI-TOF-TOF(Bruker Ultraflex 3)或者通过线性离子阱(Thermoscientific Orbitrap XL)分析样品以确定精确的质量。

[0239] 实施例4.骨架改变以抵抗蛋白水解

[0240] 如实施例2中所述，PK15二环缀合物比线性形式对胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的消化更有抗性。然而如实施例3中所述，在延长孵育之后胰蛋白酶在精氨酸残基处而胰凝乳蛋白酶在苯丙氨酸之后将其切割。通过在氨基酸侧链中产生改变，有可能提供对蛋白水解的进一步抗性。也可通过在肽骨架中进行改变来实现此，所示改变如本文所述和由在切割位点附近引入D-氨基酸或N-甲基化或还原肽键所例示。因此为提供PK15在蛋白酶切割位点的抗性，合成下列变体：

[0241] H-ACSDR f RNCPADEALCG-OH( 其 中 f 代 表 D- 苯 丙 氨 酸 )， 和H-ACSDRF-(NMeArg)-NCPADEALCG-OH，和H-ACSDRF Y[CH2NH]RNCPADEALCG-OH(其中所述Y[CH2NH]代表还原肽键)。

[0242] 在肽合成的下列描述中，缩写如下。THF：四氢呋喃；NMM：N-甲基吗啉；IBCF：氯甲酸异丁酯；DMF：N，N-二甲基甲酰胺；DiPEA：二异丙基乙胺：TFA：三氟乙酸；EDT：二硫乙烷；PyBOP：苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基-磷 鏻六氟磷酸盐；PyBrOP：溴-三-吡咯烷基-磷 六氟磷酸盐

[0243] 如实施例1所述合成D-苯丙氨酸肽(H-ACSDR f RNCPADEALCG-OH)，加入D-苯丙氨酸代替L-苯丙氨酸。

[0244] 如实施例1所述在CEM Liberty自动化肽合成仪上合成NMe-精氨酸肽，H-ACSDRF-(NMeArg)-NCPADEALCG-OH，直至NMe精氨酸前面的氨基酸。在注射器中填充树脂和在Fmoc基团脱保护之后，将6当量Fmoc-NMe-Arg(Mtr)-OH，6当量PyBOP和12当量DiPEA溶解在4mL DMF中。将所述溶液加入所述树脂中搅拌40分钟。重复所述步骤以加倍偶联。然后使用20％v/v哌啶/DMF进行Fmoc-脱保护。在用DMF洗涤(4次)后，将6当量Fmoc-苯丙氨酸-OH、6当量PyBrOP和12当量DiPEA溶解在4mL DMF中。将所述溶液加入所述树脂和搅拌3小时。重复所述步骤以加倍偶联。然后用DMF洗涤所述树脂，放回在CEM Liberty肽合成仪上以完成所述序列。使用82.5∶5∶5∶5∶2.5v/v/v/v/v的TFA/苯酚/苯硫基甲烷/水/EDT过夜实现侧链保护基团的裂解和自支持体体的裂解。过滤所述肽/TFA混合物以除去支持体，用水稀释所述肽/TFA混合物并用Et20洗涤(5次)，将含水层冻干。

[0245] 带有还原肽键的肽，H-ACSDRF Y[CH2NH]RNCPADEALCG-OH，首先需要制备Fmoc-苯丙胺醛。将5mmolFmoc-苯丙氨酸-OH溶解在10ml无水THF中和在氮气下保持在-15℃。然后加入5mmol NMM和5mmol IBCF。15分钟后，过滤悬浮液，用2×5ml无水THF漂洗。将
5mmol吗啉滴加到滤液中，在一小时后，完成反应。真空浓缩混合物并加入乙酸乙酯。用5％KHSO4溶液，然后5％KHCO3溶液和蒸馏水洗涤有机层，经硫酸镁干燥和真空浓缩。用硅胶快速层析纯化获得的Weinreb酰胺。然后将1.95mmol所述化合物溶解在20ml无水THF中并置于氮气下的冰浴上。添加1.25当量的LiAlH4，通过对用KHSO4水溶液(aquous)单独水解的等分的TLC来检测反应。在45分钟后，所述反应完成并用5mL KHSO4水溶液淬灭。用乙醚萃取化合物并且不经任何进一步提纯而使用。

[0246] 为在肽序列中引入还原键，如实施例2在自动肽合成仪CEMLiberty上合成所述肽直至涉及还原键的精氨酸。在使用20％哌啶/DMF将Fmoc基团脱保护之后，将在5mL含1％AcOH的DMF中的3当量Fmoc-苯丙胺醛溶液加入到支持在注射器中的树脂上的肽中。
然后将3当量的NaBH3CN在1小时内分批加入。将反应搅拌过夜，然后用DMF洗涤所述树脂并放回CEM Liberty合成仪上以完成所述序列。

[0247] 使用94∶2.5∶2.5∶1v/v/v/v的TFA/EDT/水/iPr3SiH达2小时实现侧链保护基团的裂解和自所述支持体的裂解。过滤肽/TFA混合物以除去所述支持体，用水稀释所述肽/TFA混合物并用Et2O洗涤(5次)，将含水层冻干。

[0248] 在纯化之后，将所述肽与TBMB缀合并如下测定对激肽释放酶活性的抑制：

[0249] 酶购自Sigma Aldrich，底物购自Bachem AG。测定缓冲液由10mM Tris pH 7.4、150mM NaCl、10mM MgCl2、1mM CaCl2、0.1％BSA、0.01％Triton X100和5％DMSO组成。加入底物之前将酶和抑制剂一起在室温(RT)下孵育30分钟。将所有试验在30℃下记录90分钟。

[0250] 在BMG Pherastar平板读数仪上在波长exc/em 350/450nm下进行测定。购买的激肽释放酶为1080μg/mL的溶液，在测定缓冲液中稀释至使用浓度0.3nM。将底物Z-Phe-Arg-amc以贮存浓度10mM溶解在DMSO中，用测定缓冲液稀释到使用浓度300μM。将抑制剂溶解在测定缓冲液中至贮存浓度60μM。在孔中引入50μL每种试剂以使终体积
150μl/孔。测定中激肽释放酶的终浓度为0.1nM，底物为100μM。

[0251] 抑制剂的终浓度为：0.5nM、1nM、2nM、5nM、8nM、10nM、20nM、50nM、80nM、100nM、200nM、500nM、800nM、1μM、2μM、5μM、8μM、10μM和20μM。通过绘制荧光＝f(时间)数据和通过拟合抑制剂的每个浓度的线性趋势线，来获得反应的初始速率。通过绘制初始速率＝f([I])获得抑制曲线，可估计IC50值。

[0252] 这显示所 有肽均抑制 激肽释放酶 的活性；H-ACSDRfRNCPADEALCG-OH、H-ACSDRF-(NMeArg)-NCPADEALCG-OH和H-ACSDRF Y[CH2NH]RNCPADEALCG-OH肽的值分别为4μM、3.1μM、16.6μM。

[0253] 然而正如所预期的，所述骨架变化也引起对蛋白水解的抗性增加(关于方法见实施例2)。使用在实施例2中描述的最高的胰蛋白酶浓度(0.1μg)(其中在5分钟内在R7上完全切割PK 15TBMB缀合物)，所有三种(骨架经修饰)肽TBMB缀合物未经切割。实际上使用1μg胰蛋白酶和1小时后，任何所述骨架经修饰的TBMB缀合物有很少或没有切割。使用实施例2中描述的最高的胰凝乳蛋白酶浓度(0.1μg)(其中在1小时后被切割的PK15TBMB缀合物为大约50％)，所有三种骨架经修饰肽TBMB缀合物未经切割。使用1μg胰凝乳蛋白酶(其中在1小时后完全切割PK 15TBMB缀合物)，所述骨架经修饰的缀合物大部分(75-85％)完整无缺。

[0254] 因此所述骨架经修饰的缀合物具有提高的对蛋白酶的稳定性，尽管对靶标的结合亲和力有一些损失。

[0255] 在上述说明书中提到的所有出版物均通过引用结合到本文。本发明的所述方面和实施方案的各种修改和改变对本领域技术人员是显而易见的，而不会不背离本发明的范围。虽然已结合特定的优选实施方案描述了本发明，但应该理解的是，要求保护的本发明不应过度地限于这类特定的实施方案。实际上，用于实施本发明的所述方式的各种修改意图包含在随附权利要求的范围内，所述修改对于本领域技术人员是显而易见的。