改善的用于合成模制分子的方法

发明的技术领域

本发明涉及合成模制分子(templated molecules)的方法。所述方法 意味着高度局部浓度的旨在参与键形成的反应基团，从而提高键形成的概 率。本发明也涉及文库，即众多的模制分子，其中每个模制分子连接于指 导其合成的模板。

背景

产生携带新特性的分子仍然是具有挑战性的工作。最近，已提出许多 将允许更为有效地产生和筛选更大数目的分子的方法。采取的方法包括编 码和/或模制不同于天然生物多聚物例如肽、RNA和DNA的分子。这些 方法允许研究人员在短时间内产生并筛选巨大数目的分子。这将产生携带 期望特性的更好的分子。

生物学的中心法则描述了从DNA到RNA再到蛋白的单向信息流。 最近，已建立了诸如噬菌体展示、质粒表面肽、核糖体展示和mRNA-蛋 白融合的方法，这允许信息从蛋白/肽水平向RNA或DNA转移。这能够 将分子进化的效用施加到置于富集过程的巨大数目的肽，之后，通过使用 从肽到DNA的信息流，然后扩增所述DNA，扩增富集的分子库(富集了 特定的特点，例如与受体蛋白结合)。

最近，已建立了允许编码多肽及其它生化多聚物的方法。这种方法的 一个实例在US5,723,598中披露，其涉及生化多聚物的鉴定，该多聚物参 与和靶的预选结合交互作用以形成结合反应复合体。所述现有技术的方法 涵盖了双功能分子文库的产生。双功能分子的一部分是生化多聚物，而另 一部分是标识寡核苷酸，包括编码和鉴定生化多聚物的核苷酸序列。在产 生双功能分子文库之后，进行有关针对靶的亲和力的分离，并且通过PCR 扩增双功能分子的标识寡核苷酸部分。最后，对PCR扩增子进行序列分 析并解码，以鉴定生化多聚物。然而，该方法不允许文库成员的一锅扩增。 此外，核苷酸序列只有在费力的测序过程之后才能起到鉴定生化分子的作 用。因而从标识序列到生化多聚物的信息流受到限制。

Halpin和Harbury已在WO 00/23458中提出了对上文刚刚说明的方 法的改善，其中形成的分子不仅被鉴定而且被核酸标签指导。所述方法是 建立在传统的包括两个或多个合成步骤的合成组合文库的分离-和-组合 (split-and-combine)策略的基础上的。使用众多核酸模板，各自在一端 具有化学反应位点，并且散布在链中各处的是众多的密码子区，每个所述 密码子区又规定不同的密码子。由第一密码子区鉴定的每一条链独立地在 化学反应位点与特殊选择的试剂反应。随后，汇集所有的链，并基于第二 密码子区进行第二次分离。所述分离-和-组合法进行合适的次数，以产生 具有典型地103至106个不同化合物的文库。所述分离-和-组合法繁琐并 且只产生相对小的文库。

Gartner ZJ和Liu DR(J.Am.Chem.Soc.2001，123，6961-6963)公开 了利用DNA序列特异性地指导化学反应的方法。已证明DNA模制合成 提供的近位效应可用于促进化学反应。当不止一个化学实体要参与形成所 编码的分子时，需要有与模板反应位点间隔一个或多个密码子的构件。典 型地，构件和模板反应位点之间的距离等于若干个核苷酸如30个核苷酸， 这意味着相对于由与邻接于反应位点的密码子退火的构件所携带的化学 实体，离模板反应位点最大距离处的反应被提升得更少。

本发明目的在于提出提高反应物局部浓度的解决办法以提升反应概 率。

发明概述

本发明提供了合成模制分子的方法，所述方法包括步骤：

a)提供至少一个包括一个或多个密码子的模板，

b)提供连接于拉链结构域的第一功能实体(functional entity)，所 述拉链结构域包括分子对的第一部件，它能够可逆地与该分子对的第二部 件相互作用，

c)提供一个或多个构件(building block)，各自包含反密码子、另 一功能实体以及连接所述反密码子和功能实体的接头，其中反密码子与模 板密码子互补，而功能实体连接于包括所述分子对第二部件的拉链结构 域，并且能够与第一功能实体化学上连接，

d)使步骤a)、b)和c)中的组分在允许反密码子与模板的密码子特异 性杂交以及分子对的两部件二聚化的条件下相互接触，

e)使构件的功能实体与第一功能实体形成化学连接，

f)任选地断裂一个或多个接头，条件是至少一个接头仍然连接着功 能实体和模板，

g)获得连接于指导了其合成的模板的模制分子。

模板在优选的实施方案中包括两个或多个密码子，例如3到15个密 码子。在本发明的一方面的第一功能实体可以是支架(scaffold)，可接 着连接于两个或多个功能实体。所述方法可只进行一次，以使支架功能实 体和期望量的功能实体相连接，或者可重复步骤d)到g)一次或多次，以 顺次添加持有待连接于功能实体或新生模制分子的功能实体的构件。

当进行多步骤合成时，步骤d)到g)的重复是利用根据步骤g)的连接 于指导了其合成的模板的模制分子作为根据步骤d)的接触步骤中连接于 拉链结构域的第一功能实体进行的。

拉链结构域可表征为能够以有秩序的方式可逆二聚化的两个相互作 用的部分，从而使得与它们连接的反应基团密切接近。在优选的方面需要 可逆性，以允许具有相同二聚化结构域的不同功能实体在不同的时间与连 接于反应位点的互补拉链结构域相互作用。许多类型的分子部分可作为拉 链结构域使用，其中这里接着的是合适的拉链结构域对的非详尽性列表： i)DNA/DNA、DNA/RNA、LNA/DNA、PNA/RNA、核苷酸和核苷酸类似 物的多种组合；ii)肽/肽，如碱性和酸性亮氨酸拉链(两个α-螺旋的卷曲螺 旋结构)，抗体/抗原；iii)核酸-肽，例如锌指DNA结合结构域/dsDNA； iv)肽/小有机分子，如链霉抗生物素蛋白/生物素；v)小有机分子/小有机 分子，例如次氮基三乙酸(NTA)/次氮基三乙酸(NTA)-Zn++；vi)带正电 荷部分/带负电荷部分，例如聚谷氨酸/聚赖氨酸。拉链盒可根据它假定要 增强的反应的条件选择。例如，如果反应在中等温度和合理的高盐浓度下 进行，则可以使用DNA/DNA拉链盒。通过改变拉链盒(互补的DNA链) 的长度，人们可设计具有期望的稳定性和动力学的拉链盒。其它类型的拉 链盒将会非常地依赖于pH。例如，谷氨酸盐/赖氨酸对的相互作用强度和 动力学将取决于pH，因为例如聚谷氨酸盐在高pH时将带高度的负电荷， 而在低pH时根本不带电荷。

功能实体在本发明的一方面通过一个或多个共价键连接于模板。不 过，可能适当的是第一功能实体连接于与模板所持有的核酸序列互补的核 酸序列，以使得支架能够通过杂交连接到模板上。以这种方式，模板有可 能编码若干不同的支架。在本发明优选的实施方案中，第一功能实体是支 架，即通常是通过添加从一个或多个构件发射出的功能基团而被修饰的化 学部分。支架可以是单个反应基团，或者包括两个或多个反应基团的化学 结构。通常，支架在模制分子的合成中自始至终保持与模板连接。

通常，当拉链结构域包括核酸时，持有第一功能实体的构件的极性与 持有另一功能实体的构件的极性相比是相反的，也就是说，如果第一功能 实体连接在寡核苷酸的5′端，则另一功能实体优选连接在构件寡核苷酸的 3′端，或者反之亦然。在某些方面，当模制分子的形成包括不止一种构件 时，优选支架构件与模板的侧翼位置退火，也就是不位于编码构件的密码 子之间。

拉链结构域可以以促使功能实体靠近的任何方式相对于第一功能实 体放置。在一个方面，拉链结构域存在于模板之中。在一种设置中，拉链 结构域位于编码支架寡聚物的密码子和编码构件的密码子之间。在本发明 的另一个方面，拉链结构域是构件结构的接头的一部分。优选地，拉链结 构域靠近功能实体。更优选拉链结构域离功能实体间隔不多于2个核酸单 体。在最优选的实施方案中，构件功能实体和第一功能实体的拉链结构域 距离各自的实体有相同数目的核酸单体，以提供高的功能实体局部浓度。 构件功能实体和第一功能实体的拉链结构域各自离功能实体的距离优选 为0个核苷酸单体。换言之，优选旨在形成连接的两功能实体连接于拉链 结构域的末端核苷酸。

期望的拉链结构域核酸单体数目很大程度地主要取决于合成期间所 用的温度和严谨条件。如果首选低严谨度和/或相对的低温，则核酸单体 的数目可低至3。不过，拉链结构域序列中低的核酸单体数目可能增加与 例如模板或构件杂交的风险。因此，一般而言优选使用至少4个核酸单体。 根据本发明优选的实施方案，拉链结构域序列包括3到20个核酸单体。 在又一更为优选的实施方案中，拉链结构域序列包括4到16个核酸单体。 最为优选的是包括5到10个核酸单体的拉链结构域序列。

反密码子和拉链结构域之间的连键可以是单键或者长达数100，例 如在1和300之间的化学部分。连键可具有任何合适的化学性质，不过， 一般优选连键是寡核苷酸。在优选的实施方案中，连键为单键，即反密码 子与拉链结构域毗连。

在本发明优选的方面，密码子：反密码子杂交体的退火温度高于拉链 结构域杂交体的退火温度，以确保即使拉链结构域的相互作用消除时，构 件仍保持与模板连接。当根据步骤d)的接触步骤是通过使温度在拉链结 构域的退火温度上下交替进行的时候，上述方面是特别优选的。当交替进 行多次时，交替的效果得以提高。为避免构件自模板释放，最高温度优选 低于密码子：反密码子杂交体的退火温度。

根据本发明优选的方面，当模板包括两个或多个密码子时，连接于这 些密码子的构件具有基本上相同的拉链结构域序列。温度的交替则将会吸 引不同的功能实体通过构件退火到支架上。从而，有可能使多种功能实体 与支架密切靠近。

密码子：反密码子杂交体和二聚化拉链结构域的退火温度之间的差异 合适地在10℃或以上。更优选退火温度之间的差异在25℃或以上。

在本发明一方面，密码子和反密码子的杂交以及拉链结构域的二聚化 在分开的步骤中发生，即允许反密码子与模板密码子特异性杂交的条件与 允许分子对的双方最佳二聚化的条件截然不同。分开步骤保障了各步骤的 最佳条件。在第二步的二聚化步骤中，优选使用确保密码子和反密码子保 持连接的条件和有利于功能实体之间的反应的条件。

反密码子与密码子特异性杂交期间的条件适当地包括密码子和/或反 密码子的浓度，其高于分子对的双方二聚化期间所用的密码子和/或反密 码子的浓度。浓度的差异增强密码子：反密码子杂合体在功能实体反应之 前就已形成的概率，从而确保遗传信息的转移。适当地，密码子与反密码 子杂交期间的浓度与拉链结构域的双方二聚化所用的浓度相比高至少10 倍。拉链结构域二聚化期间稀释的条件也有利于模板指导的反应，而不是 出现在介质中的随机的反应基团之间的交叉反应，因为相对于介质中一般 的反应基团的浓度，编码的反应基团的局部浓度被提高了。

在本发明的一方面，所述方法被用于产生连接于指导了该分子合成的 模板(或者备选地，是互补模板)的模制分子文库。作为实例，可通过具 有不止一个可能的密码子：反密码子相互作用而产生文库。这可通过拥有 带不同功能实体但相似反密码子的若干构件进行。不过，为获得连接在支 架上的功能实体的身份与模板密码子之间一对一的关系，通常优选各构件 携带标识功能实体的特定反密码子。

文库优选包括带有不同的独特密码子和/或独特密码子次序的多种模 板。通常提供具有与模板的独特密码子相应的反密码子的多种构件。在本 发明的一个方面，为每一种独特的密码子提供一特定构件。在另一个方面， 有些密码子不与构件匹配，或者备选地被不带功能实体的寡核苷酸序列封 闭。

以下就特定的非限制性实例举例说明原理。这个实例中的反密码子大 约长20个核苷酸(并具有大约60℃的针对其互补序列的解链温度)，而拉 链结构域长大约5个核苷酸(并具有低得多的解链温度，例如17℃左右)。 使构件和多种模板在中等温度下(如55℃)一起温育，允许反密码子找到并 与相应的密码子结合。在该温度下，反密码子与密码子有效且特异性地相 互作用，而拉链盒并不有效互作。洗掉过量未结合的构件。然后通过将温 度降至例如10℃，以及可能地改变除温度以外的条件，起始相邻功能实 体反应基团之间的反应。在10℃时常规构件的拉链结构域将与支架功能 实体拉链结构域的互补序列相互作用，从而使得反应基团极为密切靠近 (见图14)。这显著提高了反应基团的局部浓度，结果，反应基团发生 反应。然后再次将温度升至中等温度(55℃)，并且拉链盒解链，导致功能 实体的分离。当温度随后降至大约10℃时，另一个构件可使其拉链结构 域与支架拉链结构域杂交，之后其功能实体可与支架反应。

拉链结构域

拉链盒是在某些环境条件下彼此具有亲和力的分子亲合对。分子亲合 对的基本特性在于这两部分能够相互作用以组装为分子亲合对。在生物技 术领域，公知有许多可用作为分子亲合对的相互作用的分子部件。实例包 括但不限于蛋白-蛋白相互作用、蛋白-多糖相互作用、RNA-蛋白相互作 用、DNA-DNA相互作用、DNA-RNA相互作用、RNA-RNA相互作用、 生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用、酶-配体相互作用、抗体-配体相互作 用、蛋白--配体相互作用等。

分子亲合部件之间的相互作用可产生或强或弱的键合。如果在亲合对 的两方之间形成共价键，则部件间的结合可视为是强的，而氢键的建立、 疏水结构域间的相互作用以及金属螯合作用一般产生弱键合。一般优选相 对弱的键合。在本发明优选的方面，亲合对的第一部件能够与亲合对的第 二部件可逆地相互作用，以根据介质变化的条件保障部件的连接或脱离。

在本发明优选的方面，分子亲和对是建立在核苷酸间的相互作用的基 础上的，也就是亲和对的第一部件是核苷酸序列，而亲和对的第二部件是 能够与所述亲和对第一部件杂交的核苷酸序列。亲和对的第一部件可以是 模板或构件的一部分，并且可包括具有连接在主链上的选自天然存在的核 酸碱基(nuleobase)即腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的 核酸碱基的寡核苷酸，例如(脱氧)核糖磷酸单位的重复序列。亲和对的 第二部件可以是具有互补于并被第一部件特异性识别的核酸碱基的寡核 苷酸，也就是如果第一部件含胞嘧啶，则第二部件含鸟嘌呤，并且反之亦 然，并且如果第一部件含胸腺嘧啶或尿嘧啶，则第二部件含腺嘌呤。不过 在本发明的一个方面，优选亲和对的第二部件的至少有些核酸碱基是非特 异性碱基配对的核酸碱基。非特异性碱基配对的核酸碱基是当连接到主链 上时能够与上文提及的5个天然存在的核酸碱基中的至少2个配对的碱 基。优选地，两个或多个天然核酸碱基与所述非特异性碱基配对的核酸碱 基之间的碱基配对基本上等能发生，也就是形成的键具有相同数量级的强 度。术语“非特异性碱基配对的核酸碱基”在文中与术语“通用碱基”交换使 用。

在天然tRNA中，发现了核酸碱基次黄苷。次黄苷具有与3种核酸碱 基即胞嘧啶、胸腺嘧啶和腺嘌呤非特异性杂交的能力。已经形成了具有同 样的与天然核酸碱基非特异性碱基配对能力的其它合成化合物，且其中包 括下文描述的化合物：

通用碱基的实例

次黄嘌呤           5-硝基吲哚            3-硝基吡咯        N8-8氮杂-7脱氮腺嘌呤

MICS                 5MICS                PIM

dP                  dK                    烟云杯伞素

模板

模板的密码子可以是具有特异性地被另一实体识别的能力的任何生 化实体。不过，优选密码子是核苷酸序列。核苷酸序列在主链上携带系列 核酸碱基。密码子的核酸碱基可以是能够被互补实体特异性识别的任何化 学实体。核酸碱基通常选自天然核酸碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸 腺嘧啶和胞嘧啶)，而且可以使用其它遵守Watson-Crick氢键规则的其 它核酸碱基，例如US6,037,120中披露的合成核酸碱基。

密码子可以是单个核苷酸。在文库的产生中，这将允许将四种不同的 功能实体掺入到模板指导的分子中。不过，为获得更高的多样性，密码子 优选包括至少两个更优选至少3个核苷酸。理论上，这将会分别提供42 和43个不同的功能实体。密码子通常不会包括多于100个核苷酸。优选 使密码子具有3到30个核苷酸的序列。

至少两个模板密码子是顺次排列的，即彼此紧靠着，而且可以被间隔 基团隔开。根据欲形成的模板指导的分子，模板可以包括更多的密码子。 每一个更多的密码子可能被合适的间隔基团隔开。优选的，所有或者至少 大多数模板密码子是顺次排列的，并且每一个密码子通过间隔基团与相邻 的密码子隔开。一般地，优选模板上具有不止两个密码子，以允许合成更 为复杂的模板指导的分子。在本发明优选的方面，模板密码子的数目是2 到100。更为优选的是包括3到15个密码子的模板。

间隔序列可用于多种目的。在本发明的一种设置中，间隔基团标识密 码子的位置。通常，密码子上游或下游的间隔基团包含允许确定密码子位 置的信息。间隔基团也可以或者额外提供具有高亲和力的区域。所述高亲 合区将确保模板和反密码子的杂交在框内进行。而且，间隔序列调整退火 温度至期望水平。

具高亲和力的间隔序列可通过掺入与同族核酸碱基形成3个氢键的 一个或多个核酸碱基提供。具有这种性质的核酸碱基的实例是鸟嘌呤。备 选地，或者附加地，可对间隔序列进行主链修饰。有多种主链修饰提供更 高的亲和力，例如核糖成分的2′-O-甲基取代、肽核酸(PNA)以及核糖成 分的2′-4′-O-亚甲基环化，也称之为LNA(封闭核酸)。

模板可以包括侧翼区。侧翼区之一在本发明的一方面可起将模板固定 在固体支持物如微阵列表面的作用。在本发明的另一个方面，侧翼区可包 括信号基团，例如荧光团或放射性基团，以允许直接检测模板的存在。侧 翼区也可作为扩增反应如PCR的引发位点。

通过在模板中掺入生物素基团，并随后偶联于链霉抗生物素蛋白涂敷 的固体支持物，也可以将模板固定在固体支持物如珠子或基质材料上。多 种其它固定方法是技术人员公知的，包括将模板偶联于抗体，并将该偶联 物固定到涂敷有合适抗原的固体支持物上。在优选的方面，模板的引发位 点可用于参与扩增反应和作为固定手段的双重目的。固定可通过例如用包 括互补于引发位点的寡核苷酸序列的固体支持物处理包括引发位点的模 板来实现。

在一个方面，第一功能实体共价连接在模板上。反应基团的共价连接 通常需要模板指导的分子在所述反应基团上或其附近形成。最终的模板指 导的分子因而共价连接于指导和编码了其合成的模板上。如果形成包括根 据本发明制备的多种复合物的文库，则可使用高度严谨的选择操作条件， 而没有从模板中分离模板指导的分子的风险。

在本发明的另一个方面，第一功能实体非共价地连接于模板。通常， 所述非共价连接涉及氢键和疏水相互作用。特别地，非共价连接涉及寡核 苷酸或其部分之间的杂交反应。在优选的实施方案中，功能实体与互补于 模板核苷酸序列的核苷酸序列连接。连接了反应基团的互补序列可起锚点 的作用，即使新生的模板指导的分子结合在模板上。通常地，锚点互补序 列具有比每一个构件更高的退火温度，以确保即使是在分离构件的条件下 锚点的连接。

第一功能实体如支架，可通过选择性可断裂的接头与模板相联，该接 头使得模板指导的分子能够在实验人员决定的时间上从模板上分离。第一 功能实体通常包括反应基团。该反应基团可以是新生模板指导的分子的一 部分，其可能以修饰的形式出现在最终的模制分子中。反应基团也可以是 支架的一部分，例如包括不止一个反应基团的分子实体。此外，反应基团 可以是需要在开始本发明的方法之前激活的原形式。

在本发明涉及产生文库的方面，可能期望将第一功能实体与互补于模 板上的(另一)密码子的反密码子偶联，从而有可能具有不止一类的存在 于介质中的功能实体。备选地，包括反应基团的功能实体或支架可以变化 不同。

当模板是线性的时候，分子亲合对的第一部件通常位于活性密码子和 功能实体或共价连接于或通过杂交连接于模板的模制分子之间，以确保反 应基团之间更近地靠近。更优选地，分子亲合对的第一部件安置得相对于 模板反应基团更近。

分子亲合对的第二部件位于构件中。如果构件所连接的密码子接近于 模板反应基团，或以另外的方式表达，构件的反密码子可以至少部分地与 分子亲合对的第二部件相同，则分子亲合对的第二部件可以省略。具有旨 在与模板反应基团远端的密码子相互作用的反密码子的构件，例如支架， 包括作为接头一部分的分子亲合对的第二部件。术语“远端”应理解为活性 密码子(即与构件反密码子杂交的密码子)相对于模板反应基团留有一个 或多个失活密码子的间隔的情形。

构件接头中的分子亲合对的第二部件优选安置得靠近功能实体，以增 进构件反应基团和模板反应基团之间的接近性。更优选分子亲合对的第二 部件离携带功能实体的核苷酸有0到两个核苷酸的距离。

杂交条件

构建寡核苷酸期望的设计是本领域技术人员能力之内的事。当期望特 定的退火温度时，提出适当的核酸单体组分及其长度是标准操作。适当的 设计的构建可由软件辅助，例如Vector NTI Suite或互联网址 http:// www.nwfsc.noaa.gov/protocols/oligoTMcalc.html上的公共数据库。

允许密码子和反密码子特异性杂交的条件受到许多因素包括温度、盐 浓度、缓冲液类型以及酸度的影响。选择合适的条件以确保模板和构件之 间的接触在杂交条件下进行是本领域技术人员能力之内的事。两条单链寡 核苷酸形成双链体的温度称之为退火温度或解链温度。解链曲线通常不 陡，说明退火在一温度范围内发生。解链曲线的二阶导数在文中用以表示 解链温度。

功能实体

构件功能实体行使作为最终掺入模制分子中的结构实体的前体的功 能。因此，当在本申请及权利要求书中声称将功能实体转移到新生模板指 导的分子中时，应当理解并非原始功能实体的所有原子必需都在最终形成 的模板指导的分子中发现。并且，作为连接中涉及的反应的结果，在出现 在新生模制分子中时，功能实体的结构可以改变。特别是，导致功能实体 释放的断裂可能产生反应基团，其在随后的步骤中可参与形成新生模制分 子和功能实体之间的连接。

构件功能实体包括至少一个能够参与反应的反应基团，所述反应导致 构件功能实体与携带模板反应基团的模板部分或杂交于模板的互补元件 之间的连接。连接由功能实体的一个或多个反应基团帮助。出现在功能实 体上的反应基团的数目适当地为1到10。以仅仅一个反应基团为特点的 构件通常(i.a.)用于多聚物的末位，而具有两个反应基团的构件适用于 形成多聚物的干部或能够进一步反应的支架。旨在形成连接的两个或多个 反应基团，典型地存在于支架上。支架可以是核心结构，其构成用于创建 多种变体的基础。由支架形成的变体典型地通过支架反应基团与其它构件 反应基团的反应，任选地通过填充基团或催化剂介导，在建立实体间连接 的条件下形成。待与支架连接的功能实体可含有一个、两个或数个能够形 成连接的反应基团。

构件的反应基团可能能够与另一构件、新生模制分子或模板反应位点 的反应基团形成直接连接。在本发明的某些实施方案中，间接连接利用桥 接填充基团形成。应当理解并非功能实体的所有原子必需保持在形成的 (新生)模制分子中。而是，功能实体应视为最终的模制分子结构的前体。

根据步骤f)的任选的断裂可以以任何合适的方式进行。在本发明的一 方面，断裂涉及使用试剂和/或酶。断裂导致另一功能实体转移到新生模 板指导的分子上，或者将新生模板指导的分子转移到构件的功能实体上。 在有些情况下，作为接头断裂的结果引入新的化学基团可能是有利的。新 的化学基团可在随后的循环中或者直接地或者在被激活后用于进一步的 反应。在其它情况下，期望断裂后没有接头痕迹的残留。

在另一个方面，连接和断裂作为同时发生的反应进行，即构件的功能 实体或新生模板指导的分子是反应的离去基团。一般而言，优选设计系统 使连接和断裂同时发生，因为这将会减少步骤的数目和复杂性。也可以设 计同时连接和断裂，从而没有接头痕迹残留，或者引入用于进一步反应的 化学基团，如上文所述的那样。

对于根据本发明的方法重要的是，在断裂步骤之后至少一个接头保持 完整。所述至少一个接头将把新生模板指导的分子和指导了其合成的模板 连接起来。如果所述方法基本上涉及功能实体向支架或进化中的多聚物的 转移，最终的架构分子(scaffolded molecule)或多聚物可用选择性可断 裂接头连接。设计选择性可断裂接头使得它在导致功能实体向新生模板指 导的分子转移的条件下不被断裂。

构件

根据本发明的方法中所用的构件可根据构件所涉及的特定实体设计。 作为实例，反密码子可用聚乙二醇(PEG)接头连接于分子亲合对的第二部 件，而功能实体可直接连接于分子亲合对的第二部件。在另一个且优选的 实例中，反密码子、接头和分子亲合对的第二部件是毗邻的线性寡核苷酸。

功能实体优选在末端核苷酸处或者寡核苷酸下游1或2个核苷酸的核 苷酸处与接头连接。功能实体的连接可在任何可用于连接的实体处进行， 即功能实体可在核酸碱基或主链处与寡核苷酸的核苷酸连接。一般而言， 优选在核苷间键的磷酸根或核酸碱基处连接功能实体。

在本发明的一方面，功能实体的反应基团连接在接头寡核苷酸上。反 应基团优选是能够通过各自的反应基团间的直接反应或者通过利用合适 的填充基团，与新生模板指导的分子建立连接的一类反应基团。偶联功能 实体和接头的反应基团优选与建立连接的同时发生断裂。功能实体可在有 些情况下含有能够在随后的循环中参与形成连接的第二反应基团。第二反 应基团可以是需要在能够参与形成连接之前活化的一类反应基团。

寡核苷酸接头可通过间隔成分而离开功能实体。可设计间隔子从而由 反应基团提供的构象空间就与新生的模板指导的分子的反应基团反应而 言最佳化。

包括反密码子的构件的设计可旨在获得对于所有或某些构件：模板杂 交体的特定范围内的退火温度，以确保反密码子在功能实体彼此通过化学 反应连接之前与模板退火。当构件以基本上相同的亲和力与模板退火时， 有必要在每个循环中添加构件，即构件与模板的接触涉及各个构件的单独 添加。

在本发明的一方面，设计构件使待在第一个循环添加到模板的构件具 有比随后的构件更低的退火温度。通过在第二或随后的步骤中使用比以前 的步骤更高的连接步骤温度，有可能仅使目的构件退火到模板上，而多数 以前用过的或未反应的构件将会是单链的。任选地，可在每个循环之间使 用回收步骤，以富集可用于退火到随后的构件上的单链模板的数目。回收 步骤可包括将生物素掺入到构件寡核苷酸中，并利用链霉抗生物素蛋白涂 敷的珠子在高于退火温度的温度下从模板上分离构件，如文中别处所描述 的那样。

在断裂步骤之后，分离分子亲合对的部件，以允许随后的构件与拉链 结构域的第一部件相互作用。任选地，断裂步骤可在分离开分子亲合对之 后进行。如果分子亲合对是双链寡核苷酸，则亲合对的部件可通过提高严 谨度如通过升高温度分离。在备选方案中，由构件携带的亲合对的第二部 件可如下文所述通过酶促或化学降解。

在构件反应(例如通过将功能实体转移到支架上)之后，反密码子可 能在随后的循环期间保持退火到模板上。不过，在重复步骤d)到g)之前， 一般优选从模板上除去已反应的不含新生模板指导的分子的构件的反密 码子。退火的反密码子的缺失使得在接头中掺入通用碱基以获得接头和失 活的先前已用密码子之间的亲合性成为可能。

反密码子可使用多种技术除去，例如通过提高严谨度(典型地是通过 升高温度)从模板中分离；部分或完全酶促消化；或化学降解。利用提高 严谨度的方法是应用最为简单的。不过，如果可发生再退火或期望选择性 除去反密码子，则可考虑使用酶促或化学方法或它们的混合。

除去已用构件、未反应的构件和过量构件的方法包括掺入生物素或相 似的小分子，并利用生物素和涂敷的珠子上的抗生物素蛋白或链霉抗生物 素蛋白之间的粘附性取出所述构件。更具体地，生物素在构件的合成期间 掺入其中。在转移或者备选地在本发明的断裂步骤之后，混合物用涂敷有 链霉抗生物素蛋白的珠子在允许链霉抗生物素蛋白偶联于生物素的条件 下处理。随后，将温度升至高于构件：模板杂交体的退火温度，并使混合 物经历提高的重力，例如通过在离心机中旋转。则上清将包括从构件上释 放的模板。生物素-链霉抗生物素蛋白偶联的替代方法是形成S-S桥。作 为实例，包括反密码子的寡核苷酸提供有-SH基，例如C6 S-S硫醇修饰 剂(Glen Research# 10-1936-90)的还原产物。构件的-SH基可在氧化条件 下偶联于固体支持物上的另一个-SH基，并且如果固体材料是珠子，可通 过离心一起除去构件连同固体支持物，或者如果固体支持物是柱子的固相 基质，则可通过洗脱除去构件。

对于某些应用，选择性降解含反密码子的寡核苷酸可能是有利的。存 在多种方法用于降解DNA：RNA双链体的RNA部分。从而，模板可作 为单链寡核苷酸提供，而反密码子可以是同源RNA单链。则所述DNA： RNA双链体可用选自RNAseH、RNAseA、RNAse 1的酶降解。在备选 方法中，RNA：DNA双链体的RNA部分可通过在弱碱条件下(pH 9-10) 或用含水Pb(Ac)2处理而化学上降解。

如果核苷间接头包括硫代磷酸酯，则接头可用碘断裂。因此，根据这 个方法，其上已杂交了在核苷间接头上包括硫代磷酸酯的DNA或RNA 反密码子的寡核苷酸模板如DNA或RNA模板可用含水碘或碘乙醇处理 以断裂反密码子。

根据另一个方法，如果DNA单体含尿嘧啶核酸碱基，则可通过首先 用尿嘧啶糖基化酶处理双链体以除去尿嘧啶成分，并随后用弱酸处理，在 双链体中断裂一条链。而另一方法涉及在核苷间接头中引入膦酸甲酯，并 用哌啶断裂接头，例如通过用100mM浓度的哌啶在37℃处理1小时。

多种从模板中除去反密码子的方法可用于反密码子的选择性降解。当 新生模板指导的分子以及构件是由模板编码的时候，选择性降解的优势尤 为明显。在一个方面，支架是由模板编码的，而构件是相继掺入的。通过 使用任何上述方法，有可能选择性地除去构件，包括反密码子和接头，而 用于识别编码支架的密码子的反密码子仍然连接在模板上。

模制分子

当遵循最终产生的模制分子通过互补元件(可能也可能不包括反密码 子)连接于模板的策略时，亲和力相对弱，因为只有氢键和疏水相互作用 将部件紧固在一起。因此，在本发明的一方面，最终含模制分子的互补元 件可通过比模板的其它密码子：反密码子杂合体具有更高退火温度的互补 元件：模板杂合体连接在模板上。备选地，而且在某些应用中优选地，模 制分子通过共价连接与指导了其合成的模板连接。共价连接可能是附加于 氢键之外的，或者共价连接可能是替代氢键的。共价连接的存在允许复合 物更为苛刻的化学处理。在本发明的一个方面，共价连接是选择性可断裂 的，以保证模制分子从互补模板的分离。

根据本发明的方法可以，作为进一步的步骤，包括将模制分子转移到 模板上的锚点或互补于模板的序列上，以建立模板和模制分子间的有效化 学连接。模制分子与模板或互补于模板的序列的有效偶联可期望允许对所 制造分子的变性富集条件或变性模制后修饰。锚点可能涉及模制分子上反 应基团以及模板上反应伴侣的存在，藉此这些反应基团之间的反应将会建 立共价链接。备选地，锚点可存在于与模板杂交的互补序列中。在优选的 实施方案中，互补序列比一个或多个构件(特别是末端构件)具有更高的 退火温度，以使得能够在富集期间使用更高的严谨度，以及任选地，能够 清除用过的构件。

文库

本发明也涉及双功能复合物文库。所述文库由许多不同的复合物组 成，例如至少103、106、109、1012或1015个不同的复合物。此多种不同的 复合物通过最初提供多种不同模板以及多种构件产生。构件的每个反密码 子被改造从而能够与至少一个模板的至少一个密码子相互作用。多种不同 模板被同时置于文中上述的方法中。所述方法的扩增部分可能重复期望的 次数以进化模制分子。扩增的每次重复通过使模板与新的一小组另外的构 件接触起始。

本发明多种不同的模板按照通用策略被方便地构建。根据该策略，在 模板上提供了许多编码区。之后，每个编码区限定了一个或多个独特的密 码子。从而，特定模板包括给定数目的独特密码子。作为整体考虑，此多 种模板可以表征为包括可能的独特密码子的不同组合的总量或其任何子 集的文库。编码区适当地位于线性序列中，使得各编码区彼此紧邻，任选 地，被间隔序列隔开。在有些实施方案中，使用支链模板可能是有利的， 以确保反应基团靠近、在反应基团附近引入催化剂或引入第三反应物。

模板的独特密码子优选由核酸单体如核苷酸的序列组成。每个密码子 优选是独特的，意思是在相同编码区内没有其它密码子具有完全相同的序 列和核酸单体长度。优选地，独特密码子在所述多种模板的任何地方都没 有相应的序列。为避免个体模板之间的杂交，也期望设计每一个独特密码 子从而其互补序列不存在于任何其它模板上。

编码区的数目可根据尤其是期望的最终模制化合物的数目、可用的构 件以及想象的模制化合物的结构等进行选择。根据本发明，编码区的数目 优选至少3个，以获得期望的多样性。编码区数目的上限尚未阐明；不过 相信超过100的数目可能引起实践问题。通常地，优选使用具有2至50 个编码区的模板，更优选3至30个，并且更为优选的是4至15个。

在每个编码区内，独特密码子的数目可根据多样性的需求进行选择。 各编码区内独特密码子的数目可以类似或不同。独特密码子的数目可低至 1。当在进化的模制分子中需要特定的分子实体时，这可以是一种选择。 独特密码子数目的上限可选择得相当高，只要反密码子寡核苷酸与模板上 其互补物的特异性杂交发生即可。上限的实例可以是10,000，但可以根据 需要选择低于此限或者高于此限。

作为相对小的文库的实例，对于具有4个编码区、其中各编码区限定 30个独特的密码子的模板可获得大约106个不同的复合物。如果每个独特 密码子只能在模板中存在一次，需要提供至少120个不同的构件。多种模 板和构件可用于产生4-mer的化合物，例如α或β肽。由具有5个编码区 以及各编码区内100个独特密码子的模板起始，可制备具有1010个复合物 的更大文库。

文库可用于许多应用，包括寻找可用于治疗或诊断方法的化合物以及 植物保护化合物，象杀虫剂、杀真菌剂等。文库可包括根据本发明的任何 数目的复合物。

鉴定可用于例如治疗用途的最具活性的化合物的一种方法是对文库 进行富集处理。根据本发明的一个方面，对包含模制分子的复合物文库就 预定活性而言的富集包括步骤：

i)建立包含模制分子的复合物第一文库，所述文库可根据本发明的 任一方法获得，

ii)将文库暴露于富集文库中具有预定活性的复合物的条件之下，

iii)扩增经富集的文库中的复合物，

iv)任选地，重复步骤ii)到iii)，和

v)获得经富集的具有更高比率的含具有预定活性的模制分子的复合 物的文库。

扩增步骤正常地是优选的，尽管不总是必要的。特别地，当进行若干 个富集循环时，有利的是进行扩增以获得足够的复合物。在本发明优选的 方面，富集的文库中复合物的扩增包括如下步骤：使复合物文库与扩增手 段接触，扩增模板或互补模板，并利用扩增产物作为模板实施根据本发明 的方法。扩增手段可以是任何适于模板扩增的核酸扩增手段，例如PCR。 优选地，复合物的扩增构成了101到1015倍的扩增。

为允许进行多次富集循环，步骤ii)和iii)重复至少2、3、5次，例如 至少10次，例如至少15次。复合物可在完成每个循环后鉴定，或者可 以只在最后一个循环后鉴定。对于中间的鉴定没有明确的需求，因为如果 为模板或其互补物提供合适的引物区，就可进行扩增而无需知晓模板序列 或互补于该模板的序列。富集处理后的鉴定包括模板序列的确定和/或模 制分子和/或具有预定活性的整个复合体的结构确定。

优选地，富集文库的条件包括使结合伴侣与目的模制分子接触。所述 结合伴侣可以在溶液中，或者可以直接或间接地固定在支持物上。富集通 常利用亲和或活性测定实施。在本发明的一个方面，富集通过筛选对靶分 子或靶实体具亲和力或效应的复合物进行。在另一个方面，富集通过选择 催化活性进行。备选地，富集文库的条件包括电泳分离、凝胶过滤、免疫 沉淀、等电聚焦、离心和固定中的任何一种或多种。

富集处理可涉及细胞。从而，在一个实施方案中，富集文库的条件包 括提供能够内在化模制分子或者与具有期望预定活性的模制分子进行相 互作用的细胞。

当复合物文库已被富集为包括表现出预定活性的复合物的小库时，期 望单独地获得每一种复合物。模制分子可通过断裂一个或多个构件的接 头，以将模制分子从模板上释放下来而从复合物中获得。

核苷酸

本发明所用的核苷酸可以在寡核苷酸中连接在一起。各核苷酸单体正 常地由两部分组成，即核酸碱基部分和主链。主链在有些情况下可以再分 为糖部分和核苷之间的接头。

核酸碱基部分可选自天然存在的核酸碱基以及非天然存在的核酸碱 基。对本领域技术人员清楚的是以前曾被认为是“非天然存在的”多种核酸 碱基后来已在自然界中发现。因而，“核酸碱基”不仅包括已知的嘌呤和嘧 啶杂环，而且包括其杂环类似物及互变异构体。核酸碱基举例说明性的实 例有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨 基嘌呤、8-氧-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N4，N4-桥亚 乙基胞嘧啶(N4，N4-ethanocytosin)、N6，N6-桥亚乙基-2，6-二氨基-嘌呤、 5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞 嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑基嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、次黄嘌呤核 苷以及在Benner等的美国专利No.5,432,272中描述的“非天然存在的”核 酸碱基。术语“核酸碱基”旨在涵盖这些实例中的每一种和全部，及其类似 物和互变异构体。尤其令人感兴趣的核酸碱基有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧 啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和尿嘧啶，它们被认为是天然存在的与人类治 疗和诊断应用有关的核酸碱基。

合适的特定核酸碱基对的实例示于下文：

天然碱基对

合成碱基对

合成的嘌呤碱基

合适的主链单元的实例示于下文(B代表核酸碱基)：

主链的糖部分适当地为戊糖，但可以是PNA合适的一部分或六元环。 可能的戊糖的合适实例包括核糖、2′-脱氧核糖、2′-O-甲基-核糖、2′-氟- 核糖以及2′-4′-O-亚甲基-核糖(LNA)。所述核酸碱基适当地连接在戊糖 实体的1′位。

当主链的糖部分为戊糖如核糖或2′-脱氧核糖时，核苷之间的接头连 接在前单体的3′端与后一单体的5′端。核苷之间的键可以是天然存在的磷 酸二酯键或其衍生物。此类衍生物的实例包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、 氨基磷酸酯、磷酸三酯以及二硫代磷酸酯。此外，核苷之间的接头可以是 本领域公知的许多不含磷的接头中的任何一种。

优选的核酸单体包括形成通过磷酸二酯键连接的DNA以及RNA家 族的一部分的天然存在的核苷。DNA家族的成员包括脱氧腺苷、脱氧鸟 苷、脱氧胸苷和脱氧胞苷。RNA家族的成员包括腺苷、鸟苷、尿苷、胞 苷和肌苷。肌苷为非特异性配对的核苷，并且如上文所讨论的那样可用作 为通用碱基，因为肌苷能够近乎等能地与A、T和C配对。

每个密码子被一反密码子互补。反密码子具有和与之互补的密码子特 异性接合的能力。密码子和互补反密码子之间的亲和力通过符合众所周知 的Watson-Crick碱基配对系统的氢键实现。因此，反密码子可由与密码 子本身同类的核酸单体构成。

官能团

功能实体可包括一个或多个官能团，即最终形成模制分子一部分的基 团。模制分子可单独或者联合地包括一个或多个如下官能团：

1.羟基

2.伯胺、仲胺、叔胺

3.羧酸

4.磷酸盐/酯、膦酸盐/酯

5.磺酸盐/酯、磺酰胺类

6.酰胺类

7.氨基甲酸酯类

8.碳酸盐/酯

9.尿素类

10.烷烃、烯烃、炔烃

11.酸酐

12.酮

13.醛

14.硝酸盐/酯(nitatrates)、亚硝酸盐/酯

15.亚胺

16.苯基及其它芳族基团。

17.吡啶、嘧啶、嘌呤、吲哚、咪唑以及杂环碱基

18.杂环类

19.多环化合物

20.黄素类

21.卤化物

22.金属

23.螯合物

24.以机制为基础的抑制剂

25.小分子催化剂

26.糊精、糖类

27.荧光素、罗丹明及其它荧光团

28.多肽(polyketides)、肽、各种多聚物

29.酶和核酶及其它生物学催化剂

30.用于官能团聚合后/激活后偶联的官能团

31.药物，例如紫杉酚部分、无环鸟苷部分、“天然产物”

32.超分子结构，例如纳米簇

33.脂肪

34.寡核苷酸、寡核苷酸类似物(例如，PNA、LNA、吗啉代 (morpholinos))

35.氢

反应基团

反应基团尤其涉及形成功能实体的一部分，并且能够直接或经由合适 的桥接分子实体参与形成连接的反应的基团。反应基团的实例列举如下：

1.N-羧基酐(N-carboxyanhydrides，NCA)

2.N-硫代羧基酐(N-thiocarboxyanhydrides，NTA)

3.胺

4.羧酸

5.酮

6.醛

7.羟基

8.硫醇

9.酯

10.硫酯

11.双键共轭体系

12.烷基卤化物

13.肼类

14.N-羟基琥珀酰亚胺酯

15.环氧化物

16.haloacetyls

17.UDP-活化的糖类

18.硫化物

19.氰酸盐

20.羰基咪唑

21.噻嗪酮类(thiazinanones)

22.膦类

23.羟胺类

24.磺酸盐/酯

25.活化的核苷酸

26.氯乙烯

27.烯烃、奎宁类

模制分子

根据本发明，事实上任何分子可利用本文公开的一般方法模制合成。 能够被合成的化合物的实例包括但不限于下文所列的化合物：α-、β-、γ- 和ω-肽；单-、双-和三-取代的肽；L-和D-型肽；环己烷和环戊烷主链修 饰的β-肽；vinylogous多肽；糖多肽；聚酰胺；vinylogous氨磺酰肽；聚 磺酰胺类；缀合肽(即具有辅基)；聚酯；多糖；聚氨基甲酸酯类；聚碳酸 酯类；聚脲类；聚-肽基膦酸酯；azatides；类肽(寡聚N-取代的甘氨酸)； 聚醚；ethoxyformacetal寡聚物；聚-硫醚；聚乙二醇(PEG)；聚乙烯类； 聚二硫化物；聚亚芳基硫化物；多核苷酸；PNA；LNA；吗啉代；寡聚 吡咯啉酮；聚肟类；聚亚胺；聚乙烯亚胺；聚醋酸酯类；聚苯乙烯；聚乙 炔；聚乙烯化合物；脂肪；磷脂；糖酯；多环化合物(脂肪族)；多环化 合物(芳香族)；多杂环化合物；蛋白聚糖；聚硅氧烷；聚异氰化物；聚异 氰酸酯；聚甲基丙烯酸酯类；单官能、双官能、三官能及寡聚官能开链烃； 单官能、双官能、三官能及寡聚官能非芳族碳环；单环、双环、三环及多 环烃；桥接多环烃；单官能、双官能、三官能及寡聚官能非芳族杂环；单 环、双环、三环及多环杂环；桥接多环杂环；单官能、双官能、三官能及 寡聚官能芳族碳环；单环、双环、三环及多环芳族碳环；单官能、双官能、 三官能及寡聚官能芳族杂环；单环、双环、三环及多环杂环；螯合物； fullerenes；类固醇类；环孢菌素类似物；以及上述分子部分的任何组合。

富集

包括模制分子的复合物文库就期望活性(例如与特定靶结合、催化活 性或活性测定中的特殊效应)而言的选择或筛选(通常称之为富集)可根 据任何标准方案实施。例如，亲和选择可根据用于噬菌体展示、多核糖体 展示或者mRNA-蛋白融合物展示肽的原理实施。催化活性的选择可通过 在过渡态类似物亲和柱上的亲和选择(Baca等，Proc.Natl.Acad.Sci USA. 1997；94(19)：10063-8)或者通过基于功能的选择策略(Pedersen等，Proc. Natl.Acad.Sci.USA.1998，95(18)：10523-8)实施。期望特征的筛选可根据 基于标准微量滴定板的测定法或通过FACS分选测定法实施。

一般地，亲和选择包括将靶或结合伴侣固定于固相支持物例如柱子 上。随后，在允许部分复合物与靶结合的条件下将根据本发明制造的复合 物添加到柱子上。将未与靶结合的复合物从柱子上洗脱掉并排出。连接在 靶上的复合物部分可利用与模制分子结合的模板扩增。

扩增方法的选择取决于密码子和反密码子的选择。天然寡核苷酸能够 通过现有技术的任何方法扩增。这些方法包括但不限于聚合酶链式反应 (PCR)；以及例如基于核酸序列的扩增(例如Compton，Nature 350，91-92 (1991))、扩增的反义RNA(例如van Gelder等，PNAS 85：77652-77656 (1988))；自持性序列复制系统(例如Gnatelli等，PNAS 87：1874-1878 (1990))；例如在Schmidt等NAR 25：4797-4802(1997)中描述的聚合酶非 依赖性扩增以及体内扩增携带克隆的DNA片断的质粒。也可以使用连接 酶介导的扩增法，例如LCR(连接酶链式反应)。

对于非天然核苷酸，有效扩增方法的选择较少。由于非天然核苷酸根 据定义能够由包括聚合酶在内的某些酶掺入，有可能通过在各延伸循环期 间添加聚合酶进行人工聚合酶链式反应。

对于含核苷酸类似物的寡核苷酸，存在较少的扩增方法。人们可以使 用非酶介导的扩增策略(Schmidt等，NAR 25：4797-4802(1997))。对于主 链修饰的寡核苷酸类似物例如PNA和LNA，可使用该扩增法。在扩增之 前或期间，可对模板或互补模板进行突变或重组，以便为下一轮的选择或 筛选创造更大的多样性。

在扩增复合物的模板部分之后，利用扩增产物作为模板实施根据本发 明的方法。得到的是简化的或者富集的连接于模板分子的模板复合物文 库。

如果认为有必要进一步富集文库，可重复所述选择和扩增步骤。当重 复所述选择和扩增步骤时，涉及靶和复合物的结合步骤优选在更为严格的 条件下进行，以确保仅复合物的一部分粘附到靶上。

富集循环可进行2到15次或者甚至更多次，而每个循环的富集达10 到1000倍。在一种方法中，起始文库数量为1014个复合物。在每循环100 倍浓度富集的7个循环后，在理论上应当能够获得对靶具有最高亲和力的 复合物。不过，更有可能最终的循环呈递小的目的复合物库，这尚需通过 其它途径检测。

在最后一轮选择后，通常期望对各个模板进行测序，以确定各个模板 分子的组成。如果模板含有天然核苷酸，标准程序是任选地PCR扩增所 分离的模板(如果模板是RNA分子，有必要在PCR扩增前利用反转录酶 产生cDNA)，然后将DNA片断克隆到例如质粒中，转化这些质粒，然后 对含有一个和多个串连DNA序列的各质粒克隆进行测序。在这种情况下， 实用的是在模板中央编码序列的两侧翼序列中均设计限制性位点(即在引 物结合位点中)。这将允许容易地对分离的核苷酸进行克隆。序列分析可 通过标准双脱氧链终止法进行，或者通过更加经典的方法，例如 Maxam-Gilbert序列分析。

如果模板含有非天然核苷酸，通过介由微生物宿主的转移克隆个体序 列可能是不行的。不过，使用每个珠子携带一种寡核苷酸序列的珠子群， 有可能在体外克隆，随后连接在特定珠子上的所有核苷酸可任选地进行扩 增然后测序(Brenner等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，1665-1670)。 备选地，可充分稀释分离物群，然后分成小份置于微量滴定板中，从而孔 中平均含有例如0.1个模板。通过例如PCR扩增单个模板，现在将有可 能利用标准方法进行序列分析。当然，这需要所述非天然核苷酸是PCR 中所用的热稳定聚合酶的底物。

如果使用需要更短寡核苷酸的备选方法，则可能期望对起始模板进行 设计以在模板的编码/模制区的任一侧都含有限制性位点。从而，在最后 一轮选择后，模板可被限制性断裂，以获得编码模制分子的短寡核苷酸， 然后这些短寡核苷酸可应用于多种分析操作。

也有可能通过使用具有随机但是预定序列的寡核苷酸的DNA阵列对 分离物进行序列分析。

也可能期望作为库对分离物群进行序列分析，例如如果序列预期是相 互对齐的话，例如由于起始文库是由以具有已知(相对高)的期望活性的 多聚物序列为基础的简并序列组成的。因此，在选择前就预期所有分离物 具有与起始模板序列相似的序列。因而，分离物群可作为整体测序，获得 作为整体的该群的保守序列。

本发明也涉及允许选择能够与不同靶结合的小分子的方法。模板展示 分子技术包含直接选择和扩增的内在功能。所选分子的结合应当是选择性 的，原因在于它们仅与特定的靶配位，由此防止或诱发特定的生物学效应。 最后，这些结合分子应当有可能作为例如治疗制剂或者作为诊断制剂使 用。

模板展示分子文库可容易地与筛选、选择或测定组合，以评估分子配 体的结合对靶的功能的影响。在更为具体的实施方案中，模板展示法提供 了分离和鉴定与超分子、超高分子、高分子和低分子结构(例如核酸和蛋 白质，包括酶、受体、抗体及糖蛋白)、信号分子(例如cAMP、肌醇三 磷酸、肽、前列腺素)以及表面(例如金属、塑料、合成物、玻璃、陶瓷、 橡胶、皮肤、组织)结合的分子配体的快速方法。

具体地，本上下文的选择或分离(partitioning)是指结合于靶分子 的模板展示分子复合物即复合物-靶对，能够藉以与未结合靶分子的模板 展示分子分开的任何方法。选择可通过本领域公知的多种方法完成。

可实施选择策略，从而允许针对几乎任何靶的选择。重要的是，该选 择策略中没有步骤需要靶或文库分子的任何详细的结构信息。全部过程是 通过文库分子对给定靶的特异性识别/配位中所涉及的结合亲和力驱动 的。不过，在有些应用中，如果需要，也可以包括类似于利用噬菌体展示 对催化活性进行选择的功能(Soumillion等(1994)J.Mol.Biol.237： 415-22；Pedersen等(1998)PNAS.18：10523-10528)。多种选择方法的实 例在下文描述。

这种内在的模板展示分子选择方法非常适于优化，其中进行始于结合 分子的选择而止于优化的结合分子的系列选择步骤。使用多种机器人系 统，各步骤中的单个操作有可能自动化。这是因为存在事件的相继流，并 且其中各事件可独立进行。在最优选的设置中，向完全自动化的系统提供 合适的模板展示分子文库和靶分子，其最终产生优化的结合分子。甚至更 为优选地，在整个操作期间这个方法应当无需任何机器人系统之外的外部 操作而运行。

所述模板展示的分子文库将包含能够潜在地与任何已知或未知的靶 相配的分子。靶上的结合区可以是酶的催化位点、受体的结合口袋(例如 GPCR)、涉及蛋白-蛋白相互作用的蛋白表面区域(尤其是热点区)以及 DNA上的特定位点(例如大沟)。模板展示分子技术将主要地鉴定与靶分子 相配的分子。靶的天然功能可能被刺激(激动)或降低(拮抗)或者不受 模板展示分子结合的影响。这将取决于精确的结合模式以及模板展示分子 在靶上占据的特定结合位点。不过，已知不同蛋白上的功能位点(例如蛋 白-蛋白相互作用或催化位点)比蛋白上其它更为中性的表面区域更倾向 于结合分子。另外，这些功能位点正常地含有似乎主要负责结合能的更小 区域，即所谓的热点区(Wells等(1993)Recent Prog.Hormone Res.48； 253-262)。这种现象将增加直接选择影响某一靶的生物学功能的小分子的 可能性。

本发明的模板展示分子技术将允许类似于其它展示法例如噬菌体展 示的选择程序(Smith(1985)Science 228：1315-1317)。噬菌体展示选择已 成功地用于肽(Wells & Lowman.(1992)Curr.Op.Struct.Biol. 2，597-604)、蛋白(Marks等(1992)J.Biol.Chem.267：16007-16010)和抗 体(Winter等(1994)Annu.Rev.Immunol.12：433-455)。相似的选择程序 也用于其它类型的展示系统例如核糖体展示(Mattheakis等(1994)Proc. Natl.Acad.Sci.91：9022-9026)和mRNA展示(Roberts等(1997)Proc. Natl.Acad.Sci.94：12297-302)。

模制分子(展示的分子)和DNA复制单元(编码模板)间的连接允 许使用多种选择策略鉴定结合分子。本发明允许针对实质上任何已知靶鉴 定结合分子的广泛策略。另外，通过分离针对未知抗原(表位)的结合分 子并使用这些结合分子用于鉴定和验证，该技术也将允许发现新的未知 靶。

正如将被理解的那样，从模板展示分子文库中选择结合分子可以以任 何形式进行，以鉴定最佳的结合分子。针对纯化的靶的典型的选择操作将 包括如下主要步骤：产生模板展示分子文库：利用合适的固定方法固定靶 分子；添加文库，以允许模板展示分子的结合；除去未结合的模板展示分 子；洗脱结合于固定的靶的模板展示分子；扩增富集的模板展示分子，以 通过序列分析鉴定或者输入用于下一轮的选择。大致步骤示意性地示于图 12中。

在优选的实施方案中，利用模板展示分子文库的标准选择方案是使用 生物淘选法。在该技术中，靶(例如蛋白或肽偶联物)被固定在固相支持 物上，而潜在地与靶配位的模板展示分子是被选择并富集的那些。不过， 该选择操作需要集合的模板展示分子能够与未结合的那些即溶液中的那 些分开。有许多本领域普通技术人员公知的可实现这点的方法。

亲和富集循环的第一步是将对固定的靶表现出低亲和力的模板展示 分子洗掉，留下连接在靶上的强结合的模板展示分子。富集的群在严谨洗 涤之后仍与靶结合，然后用例如酸、离液性盐、加热洗脱，用已知配体竞 争性洗脱或者蛋白水解释放靶/模板分子。洗脱的模板展示分子适于进行 PCR，导致很多数量级的扩增，也就是，在第一轮选择中富集的每单个模 板展示分子以大为增加的拷贝数参与下一轮的选择。在典型的3至10轮 富集之后，得到极大地富集了与靶结合最为强烈的模板展示分子的分子 群。之后定量地测定仍与固定的靶结合的模板展示分子的比例。然后对变 体模板序列单个地进行序列分析。

当怀疑靶是否吸附到管上(例如从SDS-PAGE凝胶上洗脱的未折叠 的靶)时，将靶(肽、蛋白、DNA或其它抗原)固定在珠子上可能是有 益的。衍生化的珠子然后只需通过在台式离心机中沉淀珠子就可用于从模 板展示分子中进行选择。备选地，珠子可用于制备亲和柱，并将模板展示 分子文库悬液通过柱子再循环。有许多反应基质可用于固定靶分子，包括 例如连接到-NH2基和-SH基上。磁珠实质上是上述的一种变体；将靶连 接到磁珠上，其然后在选择中使用。可获得具有-NH2基或-COOH基连接 位点(其可用于偶联)的活化的珠子。靶也可以印迹到硝酸纤维素或PVDF 上。当使用印迹策略时，重要的是确保所用的印迹条在固定靶后封阻(例 如用BSA或相似蛋白)。

在另一个优选的实施方案中，选择或分离也可利用例如但不限于如下 方法进行：免疫沉淀或间接免疫沉淀，其中靶分子与模板展示结合分子一 起捕获；亲和柱层析，其中将靶固定在柱上，而使模板展示文库流过，以 捕获靶结合分子；凝胶移位(琼脂糖或聚丙烯酰胺)，其中所选的模板展 示分子与靶一起在凝胶中迁移；FACS分选以锁定与模板展示分子配位的 细胞；CsCl梯度离心以分离靶分子连同模板展示结合分子；质谱法以鉴 定标记了模板展示分子的靶分子等。一般而言，模板展示分子/靶复合物 可与未与靶结合的模板展示分子相分离的任何方法都是可用的。

表1：利用模板展示技术可能用于鉴定结合分子的选择方法的实例

靶类型   选择方法 可溶性受体 细胞表面受体 酶抑制剂   直接固定、免疫沉淀、亲和柱、FACS分选、MS   细胞表面减法选择、FACS分选、亲和柱   直接固定、免疫沉淀、亲和柱、FACS分选、MS 表面表位   细胞表面减法选择、体内选择、FACS分选、亲和柱

模板展示分子的洗脱可以不同的方式进行。结合分子可通过变性、酸 或离液性盐而从靶分子上释放，然后转移到另一瓶中用于扩增。备选地， 洗脱可以是更为特异性的，以降低背景。洗脱可利用蛋白水解，以断裂靶 和固定表面之间或者展示分子和模板之间的接头实现。并且，洗脱可通过 用已知配体的竞争实现。备选地，可在选择反应结束时在洗涤孔中直接进 行PCR反应。

本发明可能的一个特点是结合分子无需可从靶中洗脱而具有可选择 性的事实，因为只需要编码的模板DNA用于进一步的扩增或克隆，而并 非结合分子本身。已知有些选择操作能够如此紧密地与最热切的配体结 合，以致于非常难于洗脱。不过，本发明的方法可成功地实施，产生热切 的配体，即使是共价结合的配体。

备选的选择方案包括已知配体作为文库中各展示分子的片断。所述已 知配体将通过与靶分子上限定的部分配位而指导选择，并将选择集中在与 同一区域结合的分子上。这对于提高具有期望生物学功能但具有太低效力 的配体的亲和力尤其有用。

本发明另一方面涉及增加单个所选结合分子或所选结合分子混合物 的多样性或复杂性的方法。在最初的选择后，可改变富集分子以进一步增 加展示分子的化学多样性或复杂性。这可利用本领域公知的许多方法进 行。例如，使用合成的随机寡核苷酸、短粗刺状的寡核苷酸或随机突变。 随机化可被集中以允许偏好密码子或定位于模板核苷酸序列的预定部分 或亚序列。其它优选的方法是以与用于蛋白同源基因的DNA改组相似的 方式重组编码结合分子的模板(Stemmer(1994)Nature 370：389-91)。该方 法可用于重组初始的文库或者更优选地重组富集的编码模板。

在本发明的另一个实施方案中，当需要针对只可能在细胞表面表达的 特定抗原例如离子通道或跨膜受体的结合分子时，细胞颗粒本身可用作为 选择剂。在这类方法中，缺乏特定靶的细胞应当用来进行一轮或多轮的负 选择或者大量过量地存在于选择过程中。此时，将无关的模板展示分子除 去。例如，对于针对表达在全细胞上的受体的正选择，负选择应当针对未 转化的细胞。该方法也称之为减法选择，并且已成功地用于抗体文库的噬 菌体展示(Hoogenboom等(1998)Immunotech.4：1-20)。

选择方法的特定实例可包括针对细胞表面受体的选择，该受体从膜上 内在化，从而受体连同所选的结合分子可进入细胞质或细胞核。根据特定 选择的结合分子的解离速率常数，这些分子在摄取后主要地存在于胞质或 核中。

本领域技术人员将会认可选择过程可在任何设置中进行，其中靶用作 为诱饵，而模板展示分子能够配合到其上。

本发明的选择方法可与二次选择或筛选联合，以鉴定在结合后能够改 变靶分子功能的分子配体。因而，本文所述的方法可用于分离或产生与任 何蛋白或核酸结合并改变其功能的结合分子。本发明的方法被认为可用于 鉴定、分离或产生将影响靶酶的催化活性的结合分子，也就是抑制催化作 用或改变底物结合，影响蛋白受体的功能，即抑制与受体的结合或者改变 与受体结合的特异性；影响蛋白多聚物的形成，即破坏蛋白亚基的四级结 构；以及改变蛋白的运输性质，即破坏蛋白对小分子或离子的运输。

本发明的又一方面涉及允许选择过程中的功能也包括在内的方法。例 如，当已进行针对某一靶的富集，产生许多不同的命中目标时，则这些命 中目标可直接测试功能(例如细胞信号传导)。这能够利用例如荧光激活 细胞分选(FACS)进行。

改变的表型可以用广泛种类的方法检测。一般地，改变的表型利用例 如细胞形态的显微镜分析、标准细胞存活率测定(包括升高的细胞死亡和 升高的细胞存活率)、标准标记测定例如用于特定细胞或分子存在水平的 荧光指示分析法(包括FACS或其它染料染色技术)、杀死细胞后生物 化学检测靶化合物的表达等来检测。在有些情况下，特定的信号传导路径 可利用多种报告基因构建体探测。

可与模板展示分子技术联合的二次选择法尤其包括选择或筛选酶抑 制、改变或底物结合、功能丧失、结构破坏等。本领域普通技术人员能够 在各种备选的选择或筛选方法中选择与本文所述的方法相容的。

本发明的结合分子可被选择除结合之外的其它性质，例如在选择期 间，终产物对期望的工作环境下某些条件的稳定性可作为选择标准包括在 内。如果期望在某一蛋白酶存下稳定的结合分子，则该蛋白酶可以是选择 期间所用的缓冲介质的一部分。类似地，选择也可在血清或细胞提取物或 任何类型的介质中进行。正如将被理解的那样，当使用该模板展示方法时， 应当避免破坏或降解模板的条件，以允许扩增。可将其它期望的性质直接 掺入到展示分子中，如本领域技术人员将会理解的那样。例如，通过使用 具有高疏水性的构件，膜亲和力可作为性质包括在内。

通过模板展示分子技术选择的分子可通过多种合成方法产生。化学合 成是可以实现的，因为所选结合分子的结构很容易从编码模板的核酸序列 获得。所选分子的化学合成是可能的，也是因为除了将其组装在一起的化 学反应，构成结合分子的构件也是已知的。

在优选的实施方案中，合成所选的结合分子，并在多种合适的体外和 体内测试中测试，以验证所选候选物的生物学效应和效力。这可以以多种 方式进行，正如本领域技术人员将会理解的那样，并且可能取决于所述生 物活性分子的组成。

靶的鉴定和确认

在另一个方面，本发明提供了鉴定或分离参与病理学过程或其它生物 学事件的靶的方法。在这个方面，靶分子再次优选为蛋白或核酸，但其中 也可包括碳水化合物以及能够实现特异分子配体结合的各种分子。原则 上，模板展示分子技术可用于选择见于细胞、组织或体内的抗原上的特定 表位。这些表位可能属于参与重要生物学事件的靶。另外，这些表位可能 也参与该靶的生物学功能。

抗体和肽文库的噬菌体展示已无数次成功地用于鉴定新的细胞抗原 (例如Pasqualini等(1996)Nature 380：364-366；Pasqualini等(2000) Cancer Res.60：722-727；Scheffer等(2002)Br J Cancer 86：954-962； Kupsch等(1999)Clin Cancer Res.5：925-931；Tseng-Law等(1999)Exp. Hemato.27：936-945；Gevorkian等(1998)Clin.Immunol.Immunopathol. 86：305-309)。尤为有效的曾是对怀疑表达细胞特异性抗原的细胞的直接 选择。重要的是，当选择细胞表面抗原时，模板分子可维持在细胞外侧。 这将提高模板分子在从细胞表面释放后保持完整的概率。

模板展示分子的体内选择具有巨大的潜力。通过体内模板展示分子 文库选择，有可能分离到能够特异导向正常组织及其它病理组织(如肿瘤) 的分子。该原理已利用肽文库的噬菌体展示阐释了(Pasqualini & Ruoslathi(1996)Nature 280：364-366)。该系统也已用在人类中以鉴定定 位于不同器官的肽基序(Arap等(2002)Nat.Med.2：121-127)。类似的选 择方法可用于模板展示文库。被噬菌体颗粒有效保护的噬菌体展示中的编 码DNA允许体内选择。因此，模板的体内稳定性对于扩增和鉴定将很重 要。模板可以以类似于稳定aptamers用于体内应用的方式利用多种核苷 酸衍生物来稳定(Nolte(1996)Nature Biotechnol.14：1116-1121；Pagratis 等(1997)Nature Biotechnol.15：68-72)。不过，有理由相信模板结构将 会由于用于编码展示分子的修饰碱基而稳定抵抗降解。其它类型的保护也 是可能的，其中模板分子利用多种方法从溶液中防护起来。这可包括例如 脂质体、PEG化、结合蛋白或其它种类的保护。模板分子也可整合到保 护模板免受外部操作影响的另一设计的结构中。例如，可设计接头掺入到 囊泡中，以将模板置于囊泡内侧，而展示分子置于外侧。这种排布将保护 模板分子免受外部操作影响，而同时允许暴露展示分子以容许选择。

多数抗体具有大的凹型结合区，这在某种程度上需要抗原上突出的表 位。并且，抗体分子是大的高分子(150KDa)，这将在空间上减少许多不 同抗原(如细胞表面上的)的接近。模板展示技术应当能够接近并识别无 法接近抗体的表位。小结合分子将能够结合到活性位点、沟及抗原上的其 它区域。编码模板元件也比抗体更小，这将提高模板-结合分子的物理接 近。另外，模板展示分子文库的多样性和复杂性与肽文库相比将会大得多。 这将提高发现能够与由于不足的化学而无法接近肽的表位配位的分子的 概率。综上所述，模板展示分子技术具有鉴定用抗体或肽不可能鉴定到的 新抗原的潜力。本领域普通技术人员将会认可各类细胞可用于选择操作。 也将会理解新抗原的选择可利用早先所述的减法方法进行。

本发明的另一个方面涉及确认鉴定的靶的方法。如果它们改变靶的生 物学应答，鉴定的结合分子可直接应用。这可在体外利用任何直接的或基 于细胞的测定法或者直接在体内任何表型应答的研究中进行。该方法的长 处在于使用相同的分子用于鉴定和确认多种靶。最有利的是，结合分子也 可直接用作为治疗制剂。

在另一个优选的实施方案中，利用模板展示分子拉出靶分子。这可以 例如通过针对表达在细菌噬菌体上的cDNA文库的选择实现(文库对文 库)。通过混合模板展示分子文库和cDNA文库，将有可能发现模板展示 分子文库中的小分子与来自cDNA文库的蛋白之间的结合对。一种可能 性是混合噬菌体展示文库和模板展示文库，并对噬菌体或模板文库进行选 择。然后将所选的文库涂板，以定位噬菌体克隆，而编码噬菌体和模板展 示分子的DNA则可利用PCR予以鉴定。也可使用cDNA之外的其它类 型的文库，例如核酸、碳水化合物、合成多聚物。

在本发明的另一个实施方案中，模板展示分子技术可用于解释体内和 体外药物代谢。这可包括I期(活化)和II期(解毒)反应。主要的反应类型 是氧化、还原和水解。其它酶催化偶联。这些酶可在选择过程中用作为靶， 以消除倾向于与这些酶配位的展示分子。对应于这些展示分子的模板随后 在制备模板展示分子文库时可用于竞争或消除这些分子。

然后这些获得的文库将不含具有与I-II期中涉及的酶结合倾向的分 子，并可能尽快清除。例如，可对各种单独的酶或细胞色素P450酶、黄 素单加氧酶、单胺氧化酶、酯酶、酰胺酶、水解酶、还原酶、脱氢酶、氧 化酶、UDP-葡糖醛酸基转移酶、谷胱甘肽S-转移酶以及其它相关酶的任 意组合进行选择，以鉴定倾向于与这些代谢酶配位的这些结合分子。抑制 剂由于其结合亲和力很容易选择，而底物需要至少微摩尔级的亲和力才能 鉴定。

本发明另一个有意义的实施方案是直接选择被被动或主动运输穿过 上皮质膜或其它膜的分子的可能性。一种可能的选择测定是利用CaCO-2 细胞，一种人类结肠上皮细胞系，其通常被认可为胃肠道中上皮屏障的一 个良好的模型。CaCO-2测定包括在组织培养孔插入物中培养人类结肠上 皮细胞系，使所得的单层在顶部和底部间室之间形成生物学屏障。将模板 展示分子文库置于细胞单层的任一侧，收集能够透过细胞单层的分子并扩 增。该过程可重复直至鉴定到活性分子。这种测定的其它细胞系或设置是 有可能的，并且对本领域技术人员是显而易见的。

本发明的另一方面涉及选择所选分子稳定性的方法。这可通过将富集 的结合分子库置于将有可能降解或改变结合分子结构的环境中来进行。各 种条件可以是某些蛋白酶或蛋白酶混合物、细胞提取物，以及来自例如胃 肠道的各种体液。其它条件可以是各种盐或酸环境，或者升高的温度。另 一种可能是产生已知配体的文库，并对该文库进行稳定性测试和选择，以 鉴定在如上所述的某些条件下稳定的分子。

治疗用途

本发明的模板展示技术可用于封阻或刺激多种靶。治疗上相关的靶是 已知或怀疑参与发生故障并因此导致疾病的调控过程的物质。此类过程的 实例有受体-配体相互作用、转录-DNA相互作用、以及涉及粘附分子的细 胞-细胞相互作用、辅因子-酶相互作用、以及胞内信号传导中的蛋白-蛋白 相互作用。靶分子意味着任何期望分子配体的任何目的化合物。因而，例 如，靶可以包括但不限于化学化合物、化学化合物混合物、空间定位的化 合物阵列、生物学大分子例如DNA或mRNA、细菌噬菌体肽展示文库、 核糖体肽展示文库、由生物学材料例如细菌、植物、真菌或动物(例如哺 乳动物)细胞或组织制备的提取物、蛋白、融合蛋白、肽、酶、受体、受 体配体、激素、抗原、抗体、药物、染料、生长因子、脂肪、底物、毒素、 病毒等。靶的其它实例包括但不限于例如全细胞、全组织、相关或无关蛋 白的混合物、病毒或细菌菌株的混合物等。

治疗性药物靶可根据功能分成不同的类别：受体、酶、激素、转录因 子、离子通道、核受体、DNA(Drews，J.(2000)Science 287：1960-1964)。 其中，受体、核受体以及代谢酶构成了绝大多数已知的既有药物靶。具体 的，G蛋白偶联受体(GPCR)连同用于药理学干预的蛋白酶构成了最重要 的药物靶类别之一。尽管上述实例集中于最相关的靶，对于本领域技术人 员来说清楚的是，任何其它治疗靶可能是目的靶。

使用模板展示分子技术的本发明可用于鉴定所有这些类别的药物靶 的激动剂或拮抗剂，取决于各靶拥有的特定性质。多数靶有可能以纯化的 形式获得，用于直接的选择操作。其它靶必须在它们处于其天然环境中时 使用，例如包埋的细胞表面受体。在那些情况下，利用模板展示分子文库 的选择可利用早先所述的减法选择进行。

本发明的模板展示分子技术的一种特定的应用是产生能够作为拮抗 剂起作用的分子，其中的分子阻断受体与一个或多个配体之间的相互作 用。另一种应用包括细胞靶向。例如，产生的识别特定表面蛋白或受体的 分子将能够与某些细胞类型结合。此类分子可能额外携带另一种治疗制 剂，以提高效力和降低副作用(例如癌症治疗)。涉及抗病毒剂的应用也 包括在内。例如，产生的与病毒颗粒上的表位强烈结合的分子，可能可用 作为抗病毒剂。本发明的模板展示分子技术的另一种特定的应用是产生能 够作为激动剂起作用的分子，其中所述分子刺激或激活受体以引发细胞信 号传导路径。

附图简要说明

下列附图在本说明书中提及：

图1再现了展示与共同的模板退火的两个寡核苷酸的氨基官能团交 联的PAGE凝胶。

图2再现了显示与共同的模板退火并且以0、1、2和30个碱基对的 间隔交联的两个寡核苷酸的PAGE凝胶。

图3再现了展示分别以胺和羧酸终止的两个寡核苷酸交联的PAGE 凝胶。

图4再现了显示不同pH分布对交联效率影响的PAGE凝胶。

图5再现了显示不同pH分布对交联效率影响的PAGE凝胶。

图6再现了展示在pH9时的交联效率的PAGE凝胶。

图7再现了展示在pH10时的交联效率的PAGE凝胶。

图8再现了分析当使用10mer拉链盒时模板不存在的影响的PAGE 凝胶。

图9再现了分析更高的温育温度对交联效率影响的PAGE凝胶。

图10显示了展示5mer拉链盒对交联效率影响的PAGE凝胶图像。

图11显示了展示当使用10mer拉链盒时不同温度对交联效率影响的 PAGE凝胶图像。

图12显示了实验所用一般原理的示意图。

图13显示了在(A)架构分子(scaffolded molecule)和(B)聚合分子的 合成中使用二聚化结构域的示意图。

图14显示了一般原理的优选实施方案。

图15显示了两相同的功能实体向支架分子转移的LC-层析图。

图16公开了实施例中所用的两组寡聚物设置。

图17显示了实施例15中实验A和B的结果。

图18显示了实施例16中报道的实验D、E和F的结果。

图19公开了实施例17中报道的实验A和B的结果。

图20公开了实施例17的结果。

图21显示了实施例18中进行的实验的结果。

图22显示了实施例19中公开的实验的结果。

图23显示了实施例20中报道的实验A到B的结果。

图24公开了实施例21中报道的实验E到H的结果。

图25显示了实施例21的结果。

在图13中，显示了在(A)架构分子和(B)聚合分子的合成中使用二聚 化结构域的示意图。当模制合成架构分子时(在该实例中含有4个同类的 反应基团Y)，方便的是使用具有相同拉链盒(″b″)的4个构件，以及具 有互补于(″b″)的拉链盒(″a″)的一个构件(携带4个反应基团Y)。当模制 合成聚合分子时，人们可在拉链之间进行交替，即第一构件携带拉链盒 (″a″)，阵列中的第二构件携带与(″a″)二聚化的(″b″)，第三构件携带(″a″) 等。

图14所示的优选实施方案通过两个拉链盒的二聚化使得X和Y更紧 密靠近，提高了反应基团X和Y的局部浓度。在该实例中，显示了3个 构件，各自携带一个拉链盒，其中两个具有同样的序列(″a″)而一个是互 补序列(″b″)。首先，构件在中温下(此时拉链盒之间的相互作用可忽略) 与模板退火。然后将温度降至更低的温度，此时两互补拉链结构域((第 一构件的)″a″和(第二构件的)″b″)彼此退火。这使得X和Y紧密靠 近，并且X和Y可反应形成YX。在该实例中，X和Y之间的反应包括 X从第一构件转移到携带Y的第二构件上。当温度上升到中温时，拉链 盒解离。当温度随后降低时，第二构件的拉链结构域可与第三构件(其携 带反应基团X)的拉链盒退火。结果，现在这个X可转移到第二构件上， 作为增加的接近性的结果，由此提高了X和Y之间的反应性。

实施例

用于实施例1到11的一般方法和材料

为了检测当两个寡聚物与同一模板上的相邻位点退火时分别偶联于 寡核苷酸的两个反应基团之间的反应效率，使用下文紧跟着所示的一般设 置。两个寡聚物含有由羧酸或胺衍生的末端核苷酸(X、Y和Z)，如示意 结构下面所描述的那样。在两寡聚物末端的反应基团反应(“交联”)之后， 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析交联效率，由于两寡聚物作为交联的结果偶 联在一起，因此更慢地迁移过柱。

间隔：0、1、2、30nt(分别为Ah7、8、9、11)

构件：

●Ah1：5′-GCTACTCGTACGAGX

●Ah3：5′-GCTACTCGTACGAGY

●Ah5：5′-GCTACTCGTACGAGZ

●Ah2：5′-XCACTTGCAGACAGC

●Ah4：5′-YCACTTGCAGACAGC

●Ah6：5′-ZCACTTGCAGACAGC

●Ah14：5′-GCTACTCGTACGAG

●Ah23：5′-GCTACTGGCATCGGX

●Ah24：5′-GCTACTGGCATCGGY

●Ah27：5′-YCACTTGCAGACAGC

在涉及拉链盒的实施例中，使用了如下的序列

●AH36：5′-CGACCTCTGGATTGCATCGGTCATGGCTGACTGTCCGTCGAA- TGT GTCCAGTTACX

●AH37：5′-Z GTAACTGGACTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACCT- GTCGAGCATCCAGCT

●AH51：5′-Z GTAACACCTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACCT- GTCGAGCATCCAGCT

●AH67：5′-ZCATTGACCTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTG- ACCTGTCGAGCATCCAGCT

●AH69：5′- AGZAACACCTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTG- ACCTGTCGAGCATCCAGCT

●AH66：5′-ZTT GTAACTGGACTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACC- TGTCGAGCATCCAGCT

●AH65：5′-CGACCTCTGGATTGCATCGGTCATGGCTGACTGTCCGTCG- AATGT GTCCAGTTACTTX

拉链盒序列以下划线标出。

●X＝羧基-dT

●Y＝氨基修饰剂C2 dT

●Z＝氨基修饰剂C6 dT

羧基修饰剂C2 dT

氨基修饰剂C2 dT

氨基修饰剂C6 dT

寡核苷酸按照常规的亚磷酰胺法制备。X利用商业上可获得的羧基 -dT亚磷酰胺(来自Glen research的10-1035-90)掺入。以Y和Z终止的 寡核苷酸可利用通用程序从相应的以X终止的寡核苷酸制备：

模板：

Ah28：5′-GCTGTCTGCAAGTGAACCGATGCCAGTAGC

Ah38：5′-AGCTGGATGCTCGACAGGTCCCGATGCAATCCAGAGGTCG

Ah7：5′-GCTGTCTGCAAGTGAACTCGTACGAGTAGCGACAGTCGACATCGGTCACG-

生物素-3’

Ah8：5′-GCTGTCTGCAAGTGACACTCGTACGAGTAGCGACAGTCGACATCGGTCACG-

生物素-3’

Ah9：5′-GCTGTCTGCAAGTGACGACTCGTACGAGTAGCGACAGTCGACATCGGTCACG-

生物素-3’

Ah11：5′-

GCTGTCTGCAAGTGACGACTGATCCAGTGACATGCGTACCATCGAACTCGTACGAGTA

GCGACAGTCGACATCGGTCACG-生物素-3’

模板通过常规的亚磷酰胺合成制备。

缓冲液：

缓冲液A(100mM Hepes pH＝7,5，1M NaCl)

缓冲液B：(100mM NaPO4 pH＝6，1M NaCl)

缓冲液C：(100mM 硼酸钠pH＝9，1M NaCl)

缓冲液D：(100mM 硼酸钠pH＝10，1M NaCl)

缓冲液E：(500mM NaPO4 pH＝7，1M NaCl)

缓冲液F：(500mM NaPO4 pH＝8，1M NaCl)

DNA寡核苷酸的退火

在相关缓冲液中混合寡聚物，并在80℃加热，然后冷却到 28℃(-2℃/30秒)。

用32P的5′-标记.

混合200pmol寡核苷酸、2μl 10×磷酸化缓冲液(Promega cat#4103)、 1μl T4多核苷酸激酶(Promega cat#4103)、1μl γ-32P ATP，添H2O至20 μl。于37℃温育10-30分钟。

PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)

样品与甲酰胺染料(98％甲酰胺，10mM EDTA，pH8，0.025％二甲苯 蓝，0.025％溴酚蓝)1∶1混合，于80℃温育2分钟，然后在变性10％聚丙 烯酰胺凝胶上跑样。凝胶显影利用放射自显影(Kodak，BioMax胶片)。

实施例1

混合2μl缓冲液A、2μl相关寡聚物1(2pmol/μl)、2μl相关寡聚物 2(2pmol/μl)、4μl相关寡聚物3(2pmol/μl)(见下文表I)。

表I：

 实验  寡聚物1(32P标记的)  寡聚物2  寡聚物3  A  Ah3  Ah4  Ah7  B  Ah5  Ah6  Ah7  C  Ah5  Ah6  无  D  Ah5  Ah6  Ah8  E  Ah5  Ah6  Ah9  F  Ah14  Ah6  Ah7

如上文所述退火。添加1μl 100mM、1μl 10mM或者0.1μl 10mM TSAT(Tris-琥珀酰亚胺基氨基三乙酸，Pierce cat#33063，溶于DMSO)。 于25℃温育大约1小时，然后通过10％尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

结果示于图1。

实施例2

混合2μl缓冲液A、2μl相关寡聚物1(0.2pmol/μl)、1μl相关寡聚 物2(10pmol/μl)、1μl相关寡聚物3(10pmol/μl)、4μl H2O(见下文表II)。

表II：

 实验  寡聚物1(32P标记的)  寡聚物2  寡聚物3  G  Ah5  Ah6  无  H  Ah5  Ah6  Ah7  I  Ah5  Ah6  Ah8  J  Ah5  Ah6  Ah9  K  Ah5  Ah6  Ah11

如上文所述退火。添加1μl 100mM、10mM或1mM TSAT(Tris- 琥珀酰亚胺基氨基三乙酸，Pierce cat#33063，溶于DMSO)。于25℃温育 大约5小时，然后跑样10％尿素聚丙烯酰胺凝胶，如上文所述。

结果示于图2。

实施例3

混合2μl缓冲液A、2 μl相关寡聚物1(0.2pmol/μl)、1μl相关寡聚 物2(10pmol/μl)、1μl相关寡聚物3(10pmol/μl)、4μl H2O(见下文表III)。

表III：

 实验  寡聚物1(32P标记的)  寡聚物2  寡聚物3  L  Ah1  Ah6  无  M  Ah1  Ah6  Ah7  N  Ah1  Ah6  Ah8  O  Ah1  Ah6  Ah9  P  Ah1  Ah6  Ah11

退火如上文所述。添加1μl 1M、100mM、10mM或1mM EDC(1- 乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，Fluka#03450)和1μl 100mM NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)(Aldrich cat#13，067-2)。于25℃温育大约5小 时，然后通过10％尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，如上文所述。

结果示于图3。

实施例4

混合2μl缓冲液A、B、C、D、E或F、2μl相关寡聚物1(0.2pmol/μl)、 1μl相关寡聚物2(10pmol/μl)、1μl相关寡聚物3(10pmol/μl)、4μl H2O (见下文表IV)。

表IV：

 实验  寡聚物1(32P标记的)  寡聚物2  寡聚物3  Q  Ah1  Ah6  Ah7  R  Ah5  Ah6  Ah7

如上文所述退火。实验Q添加1μl 100 mM EDC和1μl 100mM NHS。实验R添加1μl 100mM TSAT。于25℃温育大约1.5小时，然后 通过10％尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

结果示于图4。

实施例5

混合2μl缓冲液A或D、2μl相关寡聚物1(0.2 pmol/μl)、1μl相关 寡聚物2(10pmol/μl)、2μl相关寡聚物3(10pmol/μl)、2μl H2O(见下文 表V)。

表V：

 实验  寡聚物1(32P标记的)  寡聚物2  寡聚物3  S  Ah5  Ah6  Ah7  T  Ah14  Ah6  Ah7

如上文所述退火。添加1μl 100mM TSAT。于25℃温育大约1.5小 时，然后通过10％尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

结果示于图5。

实施例6

混合2μl缓冲液A、B或D、1μl相关寡聚物1(2pmol/μl)、1μl相 关寡聚物2(10pmol/μl)、1μl相关寡聚物3(10pmol/μl)、5μl H2O(见下 文表VI)。

表VI：

实验 寡聚物1(32P标记的)  寡聚物2  寡聚物3 UA(缓冲液A) Ah23  Ah27  Ah28 VA(缓冲液A) Ah23  Ah27  无 UB(缓冲液B) Ah23  Ah27  Ah28 VB(缓冲液B) Ah23  Ah27  无 X(缓冲液D) Ah24  Ah27  Ah28 Y(缓冲液D) Ah24  Ah27  无

如上文所述退火。实验U和V添加1μl 100mM EDC和1μl 100mM NHS，于24℃温育大约1小时，接着添加2μl缓冲液C，然后于24℃温 育30分钟。实验X和Y添加2μl 50mM TSAT。于24℃温育大约1.5小 时，然后通过10％尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，如上文所述。

结果示于图6。

实施例7

混合2μl第一缓冲液(见下文)、1μl Ah 23(2pmol/μl)、1μl Ah 27 (10pmol/μl)、1μl Ah 28(10pmol/μl)、5μl H2O。如上文所述退火，然 后添加1μl 100mM NHS和1μl 1M EDC，于24℃温育30分钟，然后添 加3μl第二缓冲液(见下文)。于24℃温育40分钟，然后通过10％尿素 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

表VII：

实验 第一缓冲液 第二缓冲液 7-1 缓冲液A 缓冲液A 7-2 缓冲液A 缓冲液C 7-3 缓冲液A 缓冲液D 7-4 缓冲液B 缓冲液D 7-5 缓冲液B 缓冲液C

结果示于图7。

实施例8

混合物8-1：混合2μl缓冲液B、5μl Ah 36(0.4pmol/μl)、1μl Ah 37 (2pmol/μl)、1μl Ah 38(2pmol/μl)、1μl H2O。

混合物8-2：混合2μl缓冲液B、5μl Ah 36(0.4pmol/μl)、1μl Ah 37 (2pmol/μl)、2μl H2O。

通过加热至80℃，然后冷却到44℃(-2℃/30秒)而退火。

添加1μl 100mM NHS和1μl 1M EDC。在所示温度下(见下文) 温育45分钟，然后添加2μl缓冲液D。温育大约2小时，然后通过10％ 尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

温育温度：

45℃、48.2℃、53.0℃、58.5℃、63.1℃、65.6℃

结果示于图8。

实施例9

混合物9-1：混合2μl缓冲液B、1μl Ah 36(2pmol/μl)、1μl Ah 51(2 pmol/μl)、1μl Ah 38(2pmol/μl)、5μl H2O。

混合物9-2：混合2μl缓冲液B、1μl Ah 36(2pmol/μl)、1μl Ah 51(2 pmol/μl)、6μl H2O。

通过加热至80℃，然后冷却到35℃(-2℃/30秒)(对于温度1到6)，或 者加热至80℃，然后冷却到15℃(-2℃/30秒)(对于温度7到12)而退火。

添加1μl 100mM NHS和1μl 1M EDC。在所示温度下(见下文) 温育1小时，然后添加2μl缓冲液D。温育1小时，然后通过10％尿素 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，如上文所述。

温育温度：

1)34.9℃，2)36.3℃，3)40.3℃，4)45.7℃，5)51.0℃，6)55.77，7) 14.9℃，8)17.8℃，9)22.7℃，10)28.3℃，11)31.0℃，12)36℃

混合物9-3：混合2μl缓冲液B、0.5μl Ah 36(2pmol/μl)、1μl Ah 51 (2pmol/μl)、1μl Ah 38(2pmol/μl)、5.5μl H2O。

混合物9-4：混合2μl缓冲液B、0.5μl Ah 36(2pmol/μl)、1μl Ah 51 (2pmol/μl)、6.5μl H2O。

通过在80℃加热，然后冷却到5℃(-2℃/30秒)退火。

添加1μl 100mM NHS和1μl 1M EDC。在不同温度下(见下文) 温育1小时，然后添加2μl缓冲液D。温育1小时，然后通过10％尿素 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

温育温度：

1)5.9℃，2)9.9℃，3)12.6℃，4)18.3℃，5)23.3℃，6)27.9℃7)35.6℃， 8)45.9℃

结果示于图9，A和B。

实施例10

混合2μl缓冲液A、1μl相关寡聚物1(2pmol/μl)、1μl相关寡聚物 2(10pmol/μl)、1μl相关寡聚物3(10pmol/μl)、5μl H2O(见下表)。如上 文所述退火。

添加1μl 100mM NHS和1μl 1M EDC。在不同温度1)7.7℃，2) 15.4℃，3)21.0℃，4)26.2℃温育大约2小时，以及5)10℃温育1秒，然 后35℃温育1秒。重复99次。通过10％尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

表VIII：

实验  寡聚物1(32P) 寡聚物2 寡聚物3 10-1  Ah36 无 Ah38 10-2  Ah36 无 无 10-3  Ah36 Ah51 Ah38 10-4  Ah36 Ah51 无 10-5  Ah36 Ah67 Ah38 10-6  Ah36 Ah67 无 10-7  Ah36 Ah69 Ah38 10-8  Ah36 Ah69 无

结果示于图10A和图10B。

实施例11

混合2.5μl缓冲液A、1μl相关寡聚物1(2pmol/μl)、1μl相关寡聚 物2(10pmol/μl)、1μl相关寡聚物3(10pmol/μl)、4.5μl H2O(见下表)。 通过加热至80℃，然后冷却到30℃或55℃退火。

添加1μl 100mM NHS和1μl 1M EDC。在30℃或55℃温育。然后 通过10％尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

表IX：

 实验  寡聚物1(32P标记的)  寡聚物2  寡聚物3  11-1  Ah36  Ah37  Ah38  11-2  Ah36  Ah37  无  11-3  Ah65  Ah66  Ah38  11-4  Ah65  Ah66  无  11-5  Ah36  Ah66  Ah38  11-6  Ah36  Ah66  无  11-7  Ah65  Ah37  Ah38  11-8  Ah65  Ah37  无

结果示于图11。

实施例1到11的结果的讨论

接头长度和反应基团之间的间距对交联效率的影响

我们首先检测了改变连接胺和核苷酸的接头的长度的影响。寡聚物 Ah3和Ah5分别含有与核苷酸的碱基隔离7个和11个键的胺(称之为氨 基修饰剂C2 dT和氨基修饰剂C6 dT，见上文的式子)。这些寡聚物紧接 着寡聚物Ah 4或Ah6(分别携带氨基修饰剂C2 dT和氨基修饰剂C6 dT) 退火，也就是两寡聚物之间间隔0个碱基对。

如图1泳道A和B中所看到的，对于每个氨基修饰剂交联效率大致 相等。

在所有后续实验中，寡聚物Ah5(含有氨基修饰剂C6 dT)用作为反应 基团胺。

接着，两个寡聚物与模板退火，这两个寡聚物之间间隔0、1、2及 30个碱基对，并检查交联效率。首先，研究了利用TSAT(Tris-琥珀酰亚 胺基氨基三乙酸，Pierce cat#33063，溶于DMSO)的交联。当使用寡聚物 Ah5和Ah6时，间隔0碱基对的交联反应效率最高(图1，泳道B；图2， H部分)，间隔1个碱基对的效率较低(图1，泳道D；图2，I部分)， 而且间隔2和30个碱基对的效率极低(图1，泳道E和F；图2，J和K 部分)。

其次，检查了胺和羧酸的交联。在这个实验中，加入EDC(1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺氢氯化物)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，以使两 个反应基团交联。当使用寡聚物Ah1和Ah6时，零碱基对的最短间隔的 交联效率再一次最高(图3，M部分)，对于1个碱基对的间隔交联效率 相对较高(图3，N部分)，而对于2和30个碱基对的间隔，交联效率分别 为中度和可忽略的(图3，O和P部分)。

TSAT和EDC浓度的优化

利用寡聚物Ah5和Ah6测试了TSAT浓度的重要性。浓度为1或 10mM的TSAT导致比0.1mM和100mM TSAT更为有效的交联(图1 和2)。当使用最高的TSAT浓度(100mM)时所获得的较低的交联效率可 通过两个TSAT分子与每一个相邻的胺反应来解释。

接着，检查了EDC浓度对携带胺的寡聚物(Ah6)和携带羧酸的寡聚物 (Ah1)交联的重要性。以前，已发现大约10mM的NHS浓度当与EDC 一起使用时提供最高的交联效率。如图3所示，100mM EDC与0.1mM、 1mM和10mM EDC相比产生最高的交联效率。

用于TSAT和EDC/NHS交联反应的pH的优化

接着，我们测试不同pH分布对使用EDC/NHS或TSAT试剂的交联 效率的影响。

pH10提供了两个胺最为有效的TSAT交联(图4，R部分；图5，S部 分)。该研究中使用寡聚物Ah5和Ah6。在实验6(图6)中，使用pH10 以及携带胺的寡聚物Ah24和Ah27之间零碱基对的间隔得到80％的交联 效率。在其它实验中，将互补元件(与模板退火的寡聚物区域)和反应基团 (胺或羧酸)隔开的接头大得多(例如图11和12)，此时交联效率低得 多。

接着利用寡聚物Ah1和Ah6检查不同pH分布对使用EDC/NHS的 交联效率的影响。介导最有效的交联的恒定pH是pH7.5(图4，Q部分)。 不过，更好的交联效率在pH最初保持在pH6，然后上升至pH9(图6)或 10(图7)时获得。在后两种实验中，利用寡聚物Ah23和Ah27。在那些条 件下，交联效率几乎为100％。请注意，在这些实验中，连接反应基团和 互补元件的接头相对较短(例如Ah27为11个键)。

当使用拉链盒序列时的交联效率的检查

我们接着利用携带反应基团(胺或羧酸)的寡聚物检查了交联效率， 其中连接反应基团和退火区的接头大约为25个核苷酸。

在第一个实验中，利用Ah36(携带羧酸)和Ah67(携带胺)。所用的 模板(Ah38)紧邻着与这两个寡聚物退火，即间距零碱基对。

在该实验条件下，观察到小于5％的交联效率，并且仅仅是在最高测 试温度时(图10，A和B，泳道5)。为提高交联效率，我们分别在寡聚物 Ah67和Ah36的5′和3′端(携带反应基团的相同末端)引入了所谓的拉 链盒序列。拉链盒是互补的序列，因而可使得两个寡聚物的反应基团更为 亲密地靠近。测试了两个不同长度的拉链盒，即10′mer的拉链盒 (Ah37/Ah66，Ah37形成10个碱基对的DNA双链体)和5′mer的拉链盒 (形成5个碱基对的DNA双链体)。见图12。而且，测试了不同设计的拉 链盒，例如反应基团紧邻拉链盒连接(Ah36、Ah37、Ah51)，或者放置在 拉链盒上游两个核苷酸处(Ah65，Ah66)或者置于拉链盒中间(Ah67)的寡 聚物。

我们首先测试5′mer的拉链盒对交联效率的影响。正如所观察到的那 样，5′mer的拉链盒显著提高交联效率(图10，A和B，比较泳道3和5)。 注意在所有测试温度下模板是交联绝对必要的。最高交联效率在温度在 10℃和35℃之间上下循环99次时获得(图10B)。高效率也在温度恒定保 持在21℃或26℃时获得(图10A和B，泳道3)。交联效率在高于26℃ 时不再升高(图9，A和B)。

我们接着测试了在10′mer的拉链盒形式下的交联效率。寡聚物Ah36 和Ah37与Ah38模板退火，并在多种温度下检查交联效率。在不存在模 板时观察到令人惊讶的高度交联(图8，45℃和48.2℃)。但是，在高于58.5℃ 的温度时，在不存在模板时未观察到交联。

接着，测试了反应基团相对于拉链盒的不同定位。如图10，A和B，泳 道7所示，当一个或多个反应基团位于拉链盒中间(即反应基团连接于参 与DNA双螺旋形成的核苷酸；Ah67)时，交联效率显著下降。

也在10′mer拉链盒的环境下测试了反应基团相对于拉链盒的定位。 在这种环境下，当两个反应基团都距拉链盒有两个核苷酸(Ah65，Ah66) 时，交联效率稍有下降(图11，对比泳道1和3)。当测试Ah65、Ah66、 Ah36和Ah37的不同组合时(即当反应基团紧挨着拉链盒，或者在其上游 两个核苷酸放置时)，交联效率无显著变化。注意模板在10′mer拉链盒的 环境中的所有温度下并非是绝对必要的。这种温度非依赖性在较低的温度 下尤为突出(例如图11，30℃)。

实施例12：三胺支架构件

含具有羧酸部分的经修饰核酸碱基的寡聚物利用常规的亚磷酰胺法 合成：

(SEQ ID NO)5′-GAC CTG TCG AGC ATC CAG CTT CAT GGG AAT TCC TCG

TCC A CA ATG XT

X利用商业上可获得的羧基-dT亚磷酰胺(10-1035-90，来自Glen research)掺入。下划线的核酸碱基代表拉链区。

反应的示意方案：

将所述含具有羧酸部分的经修饰核酸碱基的寡聚物(1nmol)与水(100 μL)、hepes缓冲液(40μL 200mM，pH＝7.5)、NHS(20μL 100mM溶液)、 EDC(20μL新鲜制备的1M溶液)和四(氨基甲基)甲烷四氢氯化物(20μL 100mM溶液)混合。将反应混合物室温放置o/n。通过真空蒸发使体积降 至60μL。通过添加NH3浓缩物(20μL)跟着进行HPLC纯化可获得纯的 寡聚物。利用如下梯度大约6分钟后有可能分离到峰：0-3分钟100％A， 然后3-10分钟15％A和85％B，然后10-15分钟100％B，然后15-20 分钟100％A。A＝10mM TEAA中的2％乙腈，而B＝10mM TEAA中 的80％乙腈。

实施例13：将功能实体连接到硫寡聚物上的一般操作

如下含修饰的核酸碱基(具有S-三苯基甲基保护的硫部分)的寡聚 物利用常规的亚磷酰胺法合成：

(SEQ ID NO)5′-WC A TTG ACC TGT CTG CCB TGT CAG TCG GTA CTG TGG

TAA CGC GGA TCG ACC T

(SEQ ID NO)5′-W CA TTG ACC TGA ACC ATG BTA AGC TGC CTG TCA GTC

GGT ACT ACG ACT ACG TTC AGG CAA GA

W利用商业上可获得的硫醇修饰剂亚磷酰胺(10-1926-90，来自Glen research)掺入。B是利用商业上可获得的亚磷酰胺(10-1953-95，来自Glen research)掺入的内部生物素。以下划线标出的核酸碱基表示拉链区。

S-三苯甲基保护的硫寡聚物(10nmol)在真空中蒸发，并重悬于TEAA 缓冲液(200μL 0.1M溶液，pH＝6.4)中。添加AgNO3(30μL 1M溶液)， 并将混合物室温下放置1-2小时。添加DTT(46μL 1M溶液)，并静置5-10 分钟。将反应混合物离心(20,000G 20分钟)并收集上清。固体用另外的 TEAA缓冲液(100μl 0.1M溶液，pH＝6.4)抽提。纯的硫寡聚物通过常规的 乙醇沉淀获得。

加载反应的示意方案：

各硫寡聚物(1nmol)在真空中干燥，并用二甲基甲酰胺(50μl 0.1M溶 液)中的包含如下功能实体的化学实体处理：

并室温放置o/n。将构件离心(20.000G 10分钟)，并取出上清。添加 二甲基甲酰胺(1mL)，并将构件离心(20.000G 10分钟)。除去二甲基甲酰 胺，并将荷载的硫寡聚物重悬于TEAA缓冲液(25μL 0.1M溶液，pH＝6.4) 中，并通过HPLC分析。

实施例14：编码的架构分子(scaffolded molecule)的合成

模板

将模板寡聚物5′-BTCTTGCCTGAACGTAGTCGTAGGTCGAT CCGCGTTACC AGAGCTGGATGCTC GACAGGTCCCGATGCAAT CCAGAGGTCG(SEQ ID NO)(1nmol)与实施例13中制备的两个构件以 及实施例12中制备的支架构件(1nmol)在hepes缓冲液(20μL 100mM hepes和1M NaCl溶液，pH＝7.5)和水(添加至终体积100μL)中混合。构 件通过加热至50℃并冷却(-2℃/30秒)至30℃与模板退火。混合物以波动 的温度(10℃1秒然后35℃1秒)静置o/n。寡聚物复合物通过添加链霉抗 生物素蛋白珠子(100μL，用2×1mL 100mM hepes缓冲液和1M NaCl， pH＝7.5预洗涤)而连接于链霉抗生物素蛋白。珠子用hepes缓冲液(1mL) 洗涤。三胺架构构件通过添加水(200μL)，接着加热至70℃而从结合链霉 抗生物素蛋白的复合物中分离。将水转移并在真空中蒸发，重悬于TEAA 缓冲液(45μL 0.1M溶液)中，并通过HPLC分析产物形成(见图15)。

HPLC层析证明了两个功能实体向支架构件的转移。顶部的层析显示 了参照支架构件。底部的层析显示了在一个(峰在7.94分钟)及两个(峰 在10.76分钟)相同官能实体部分转移后链霉抗生物素蛋白纯化的支架构 件。使用如下梯度：0-3分钟100％A，然后3-10分钟15％A和85％B， 然后10-15分钟100％B。A＝10mM TEAA中的2％乙腈，而B＝10mM TEAA中的80％乙腈。

由于功能实体的亲脂性，在HPLC层析中观察到具有两个功能实体 的架构分子与具有一个的相比更长的保留时间。具有两个相同功能实体的 架构分子的模制合成效率为大约25％(在图15中10.76分钟的峰)。

用于实施例15到21的一般方法和材料：

为了检查当两个寡聚物与同一模板退火时，分别偶联于一个寡核苷酸 的两个反应基团之间的反应效率，利用了图16所示的两组设置(设置A和 设置B)。两个寡聚物含有由羧酸或胺衍生化的末端核苷酸。在两寡聚物 末端上的反应基团反应(“交联”)之后，可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 交联效率，由于两寡聚物作为这种交联的结果偶联在一起，因此更慢地迁 移过柱。

DNA寡聚物：

X＝羧基-dT

Z＝氨基修饰剂C6

6＝氨基修饰剂5cat.Nr.10-1905

拉链盒序列以下划线标出。注意当构件拉链盒与模板中的拉链盒相互 作用时，拉链盒双链体的长度比下划线标出的长一个核苷酸。

AH36：5′-

CGACCTCTGGATTGCATCGGTCATGGCTGACTGTCCGTCGAATGTGTCCA GT-

TACX

AH51：5′-

Z GTAACACCTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACCTGTCGAGCATC-

CAGCT

AH82：5′-Z GTAACACCTGGACCTGTCGAGCATCCAGCT

AH201：5′-TCTGGATTGCATCGGGA GTTACX

AH133：5′-

Z GTAACTCCTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACCTGTCGAGCATC-

CAGCT

AH134：5′-

Z GTAACTGCTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACCTGTCGAGCATC-

CAGCT

AH135：5′-

Z GTAACTGGTGTGTAAGCTGCCTGTCAGTCGGTACTGACCTGTCGAGCATC-

CAGCT

AH142：5′-

CGACCTCTGGATTGCATCGGTCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTGACTGTC

CGTCGAATGTGTCCA GTTACX

AH156：5′-ZGACCTGTCGAGCATCCAGCT

AH202：5′-TCTGGATTGCATCGG GTTACX

AH203：5′-TCTGGATTGCATCGGTTTTTX

AH236：5′-6 GTAACACCTGGACCTGTCGAGCATCCAGCT

AH240：5′-CGACCTCTGGATTGCATCGGGCACG GTTACX

AH249：5′-ZCTGGACAGCTCGTAGGTCGTTTTTTTTTTT

AH251：5′-ZGACCTGTCGAGCATCCAGCT

AH252：5′-XGACCTGTCGAGCATCCAGCT

AH255：5′-CGACCTCTGGATTGCATCGG TGTTACZ

AH258：5′-ACGACTACGTTCAGGCAAGA GTTACZ

AH260：5′-XCTGGACAGCTCGTAGGTCGTTTTTTTTTTT

AH261：5′-CGACCTCTGGATTGCATCGGZ

AH262：5′-CGACCTCTGGATTGCATCGG TTACZ

AH270：5′-6 GTAACGACCTGTCGAGCATCCAGCT

AH271：5′-6 GTAACTGGACCTGTCGAGCATCCAGCT

AH272：5′-ACGACTACGTTCAGGCAAGA GTTACX

AH273：5′-ACGACTACGTTCAGGCAAGAGC GTTACX

AH274：5′-ACGACTACGTTCAGGCAAGAGCACG GTTACX

AH275：5′-CGACCTCTGGATTGCATCGGGC GTTACX

AH276：5′-CTGGTAACGCGGATCGACCTGCACG GTTACX

AH277：5′-CTGGTAACGCGGATCGACCTGC GTTACX

寡核苷酸按照常规的亚磷酰胺法制备。X代表商业上可获得的羧基 -dT亚磷酰胺(10-1035-90，来自Glen research)。Z代表氨基修饰剂C6 dT (10-1039，来自Glen Research)。6代表氨基修饰剂5(10-1905，来自Glen Research)。

模板：

拉链盒序列以下划线标出。

AH38：5′-AGCTGGATGCTCGACAGGTCCCGATGCAATCCAGAGGTCG

AH140：5′-

AGCTGGATGCTCGACAGGTCAGGTCGATCCGCGTTACCAGTCTTGCCTGAACG

TAGTCGTCCGATGCAATCCAGAGGTCG

AH154：5′-

AGCTGGATGCTCGACAGGTCA AGTAACAGGTCGATCCGCGTTACCAGTCTTGC

CTGAACGTAGTCGTCCGATGCAATCCAGAGGTCG

AH250：5′-

CGACCTACGAGCTGTCCAGA AGTAACAGGTCGATCC

AH256：5′-

AGCTGGATGCTCGACAGGTCA AGTAACACCAGGTCGATCCGCGTTACCAGTCT

TGCCTGAACGTAGTCGTCCGATGCAATCCAGAGGTCG

AH263：5′-

CGACCTACGAGCTGTCCAGA AGTAACAGGTCGATCCGCGTTACCAGTCTTGCC

TGAACGTAGTCGTCTGGTCACGTGGATCCTTGA

AH278：5′-

AGCTGGATGCTCGACAGGTCGAGGTCGATCCGCGTTACCAGTCTTGCCTGAAC

GTAGTCGTCCGATGCAATCCAGAGGTCG

AH279：5′-

CGACCTACGAGCTGTCCAGA AGTAACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

TTTTTTTTCTGGTCACGTGGATCCTTGA

模板通过常规的亚磷酰胺合成制备。

缓冲液：

缓冲液A(100mM Hepes pH＝7.5；1M NaCl)

缓冲液B(20mM Hepes pH＝7.5；200mM NaCl)

用32P的5′-标记：

混合5pmol寡核苷酸、2μl 10×磷酸化缓冲液(Promega cat#4103)、1 μl T4多核苷酸激酶(Promega cat#4103)、1μl γ-32P ATP，添H2O至20μl。 于37℃温育10-30分钟。

PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)

样品与甲酰胺染料(98％甲酰胺，10mM EDTA，pH8，0.025％二甲苯 蓝，0.025％溴酚蓝)1∶1混合，于80℃温育2分钟，然后在变性10％聚丙 烯酰胺凝胶上跑样。凝胶显影利用放射自显影(Kodak，BioMax胶片)。

实施例15

为了检查在设置B的环境中浓度对退火效率、反应效率和模板依赖 性的影响，我们进行了如下实验，其包括i)在高构件和模板浓度下的退 火和反应(实验A和B)，ii)在高浓度下退火，接着稀释100倍，并在 此低浓度下反应(E和F)，和iii)在低浓度下退火和反应(C和D)。为 检查模板非依赖性反应发生的程度，我们也包括了对照复合物，它由竞争 性模板和携带反应基团(胺)的竞争性寡聚物组成。

实验

混合10μl缓冲液A、多种浓度的相关寡聚物(见下表X)，并加H2O 至50μl。

表X：

实验 寡聚物1 (32P标记的)(BB1) 寡聚物2 (BB0) 寡聚物3(模板) 寡聚物4 (竞争性寡聚物) 寡聚物5 (竞争性模板) A Ah202(1pmol) Ah156 (5pmol) Ah154 5pmol) Ah249 (500pmol) Ah250 (500pmol) B Ah202(1pmol) Ah156 (5pmol) Ah154 (5pmol) Ah249 (500pmol) C Ah202(0.01pmol) Ah251(0.05pmol) Ah256(0.05 pmol) Ah249(5pmol) Ah257 (5pmol) D Ah202(0.01pmol) Ah251(0.05pmol) Ah256(0.05 pmol) Ah249(5pmol) E Ah202(1pmol) Ah251 (5pmol) Ah154 (5pmol) F Ah202(1pmol) Ah251 (5pmol) Ah154 (5pmol) Ah249 (500pmol) Ah263 (500pmol)

对于A-D退火从80℃到20℃(-1℃/30秒)，而对于E和F，从80℃ 到20℃(-1℃/1分钟)退火。E和F退火之后在缓冲液B中稀释100倍。 然后添加溶于H2O的5μl 500mM DMT-MM(根据Kunishima等 Tetrahedron(2001)，57，1551制备)。在各种温度下温育o/n，然后通过10％ 尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

结果示于图17(实验A和B)以及图18(实验C、D、E和F)。

结论：

模制非依赖性反应通常在20℃时观察到。这种假象推测不是由模板 中的拉链盒介导的，因为即使当竞争性模板(携带拉链盒)不包括在温育 混合物中时也观察到这种现象(见例如图17，实验B，泳道1)。在高浓 度退火，接着稀释并在所得的低浓度下反应则消除了模板非依赖性反应， 但维持了构件寡聚物在反应步骤前在模板上的有效退火(将实验E和F的 有效交联和模板非依赖性反应的缺乏与不太吸引人的实验A、B、C和D 对比)。

实施例16

为了检查在设置B中当构件在位置3处退火时拉链盒的作用，利用 两个不同的构件寡聚物进行了实验，其中一个具有6-mer的拉链盒(构件 寡聚物的6个核苷酸与模板上的互补拉链盒退火)，另一个不具有拉链盒。

实验

混合10μl缓冲液A、多种浓度的相关寡聚物(见下表XI)，并加 H2O至50μl。

表XI：

实验 寡聚物1 (32P标记的)(BB1) 寡聚物2 (BB0) 寡聚物3 (模板) 寡聚物4 (竞争性寡聚物) A  Ah202(0.01pmol) Ah156 (0.05pmol) Ah256 (0.05pmol) Ah249 (5pmol) B  Ah261(0.01pmol) Ah252 (0.05pmol) Ah256 (0.05pmol) Ah260 (5pmol)

从80℃到20℃(-1℃/30秒)退火。然后添加溶于H2O的5μl 500mM DMT-MM(根据Kunishima等Tetrahedron(2001)，57，1551制备)。在各 种温度下温育o/n，然后通过10％尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

结果示于图19。

结论：

实验A使用携带6-mer拉链盒的构件，并且观察到大约30％的交联 效率(实验A，泳道2-4)。当使用不带拉链盒的构件时(实验B)，未 观察到交联(泳道3-4的斑点是胶片上的假象，而并不代表交联)。没有 观察到交联，并且即使是在20℃时也没有观察到反应(很可能是因为构件 不携带拉链盒)。

实施例17

我们利用长度为5、6或7个核苷酸的拉链盒，利用在位置3处退火 的构件检查了设置B中的交联效率。

实验

混合10μl缓冲液A、多种浓度的相关寡聚物(见下表XII)，并加 H2O至50μl。

表XII：

实 验 寡聚物1 (32P标记的)(BB1) 寡聚物2 (BB0) 寡聚物3(模板) 寡聚物4 (竞争性寡聚物) 寡聚物5 (竞争性模板) A  Ah262(1pmol) Ah252 (5pmol) Ah154 (5pmol) B  Ah262(1pmol) Ah252 (5pmol) Ah154 (5pmol) Ah260(500pmol) Ah263 (500pmol) C  Ah202(1pmol) Ah251 (5pmol) Ah154 (5pmol) D  Ah202(1pmol) Ah251 (5pmol) Ah154 (5pmol) Ah249(500pmol) Ah263 (500pmol) E  Ah255(1pmol) Ah252 (5pmol) Ah154 (5pmol) F  Ah255(1pmol) Ah252 (5pmol) Ah154 (5pmol) Ah260(500pmol) Ah263 (500pmol)

从80℃到20℃(-1℃/分)退火。在缓冲液B+50mM DMT-MM(根据 Kunishima等Tetrahedron(2001)，57，1551制备)中稀释100倍。在各种 温度下温育o/n，然后通过10％尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

结果示于图20。

结论：

长度为5、6或7个核苷酸的拉链盒在温度范围24-28℃内介导有效的 交联(图20，A、C、E部分)。在这些条件下(其中在高浓度退火且 在低浓度交联)，未观察到竞争性复合物的交联(图20，B、D和F部 分)。

实施例18

在本实验中，我们分析了设置A中多种接头长度的交联效率(所述 接头连接反密码子和拉链盒)。

实验

混合10μl缓冲液A、各种浓度的相关寡聚物(见下表XIII)，并加 H2O至50μl。

表XIII：

实验  寡聚物1(32P标记的)(BB1) 寡聚物2(BB0) 寡聚物3(模板) 1  Ah202(1pmol) Ah270(10pmol) Ah140(5pmol) 2  Ah202(1pmol) Ah270(10pmol) Ah278(5pmol) 3  Ah275(1pmol) Ah271(10pmol) Ah140(5pmol) 4  Ah275(1pmol) Ah271(10pmol) Ah278(5pmol) 5  Ah240(1pmol) Ah236(10pmol) Ah140(5pmol) 6  Ah240(1pmol) Ah236(10pmol) Ah278(5pmol) 7  Ah240(1pmol) Ah236(10pmol) 8  Ah272(1pmol) Ah270(10pmol) Ah140(5pmol) 9  Ah272(1pmol) Ah270(10pmol) Ah278(5pmol) 10  Ah273(1pmol) Ah271(10pmol) Ah140(5pmol) 11  Ah273(1pmol) Ah271(10pmol) Ah278(5pmol) 12  Ah274(1pmol) Ah236(10pmol) Ah140(5pmol) 13  Ah274(1pmol) Ah236(10pmol) Ah278(5pmol) 14  Ah274(1pmol) Ah236(10pmol) 15  Ah155(1pmol) Ah270(10pmol) Ah140(5pmol) 16  Ah155(1pmol) Ah270(10pmol) Ah278(5pmol) 17  Ah277(1pmol) Ah271(10pmol) Ah140(5pmol) 18  Ah277(1pmol) Ah271(10pmol) Ah278(5pmol) 19  Ah276(1pmol) Ah236(10pmol) Ah140(5pmol) 20  Ah276(1pmol) Ah236(10pmol) Ah278(5pmol) 21  Ah276(1pmol) Ah236(10pmol)

从80℃到20℃(-1℃/分)退火。添加5μl 500mM DMT-MM(根据 Kunishima等Tetrahedron(2001)，57，1551制备)。于10℃温育5秒，然 后35℃温育1秒。重复o/n，然后通过10％尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

结果示于图21。

结论：

检查了两个方面：i)接头长度对交联效率的影响(检查了0、2和5个 核苷酸的接头长度)，ii)两反应构件之间的间距的重要性。图21中，泳 道1-6涉及与位置3退火的构件寡聚物；泳道7涉及同样的构件，不过泳 道7中不存在模板。泳道8-13涉及与位置2退火的构件寡聚物；泳道14 涉及同样的构件寡聚物，不过没有模板存在。泳道15-20涉及与位置1退 火的构件寡聚物；泳道21涉及同样的寡聚物，并且没有模板存在。泳道 1、3、5、8、10、12、15、17、19使用其中结合的构件寡聚物之间的间 距比泳道2、4、6、9、11、13、16、18和20的实验中所用模板大一个核 苷酸的模板。

就交联效率而言的最佳接头长度在所有位置均为0(图21，泳道1、2 有关位置3；泳道8、9有关位置2；泳道15、16有关位置)。在与位置1 和0结合的构件之间隔开0或1个核苷酸，对两构件之间的交联效率没有 影响(图21，例如对比泳道1和2)。在所有3个位置观察到非常高的交 联效率。利用5个核苷酸的拉链盒，当构件寡聚物在位置3、2和1退火 并且接头长度为0核苷酸时，反应效率大约分别为50％、95％和95％(图 21，泳道1、2和8、9以及15、16)。

实施例19

在本实施例的实验5、8、14和17中，我们分析了设置B中多种接 头长度的交联效率。

实验

混合10μl缓冲液A、多种浓度的相关寡聚物(见下表XIV)，并加 H2O至50μl。

表XIV：

实验 寡聚物1(32P标记的)(BB1) 寡聚物2(BB0) 寡聚物3(模板) 1  Ah240(5pmol) 2  Ah240(5pmol) Ah82(10pmol) Ah136(10pmol) 3  Ah240(5pmol) Ah82(10pmol) Ah140(10pmol) 4  Ah240(5pmol) Ah82(10pmol) 5  Ah240(5pmol) Ah156(10pmol) Ah154(10pmol) 6  Ah240(5pmol) Ah156(10pmol) 7  Ah202(5pmol) 8  Ah202(5pmol) Ah156(10pmol) Ah154(10pmol) 9  Ah203(5pmol) Ah156(10pmol) 10  Ah203(5pmol) 11  Ah203(5pmol) Ah156(10pmol) Ah154(10pmol) 12  Ah203(5pmol) Ah156(10pmol) 13  Ah36(5pmol) 14  Ah36(5pmol) Ah156(10pmol) Ah154(10pmol) 15  Ah36(5pmol) Ah156(10pmol) 16  Ah142(5pmol) 17  Ah142(5pmol) Ah156(10pmol) Ah154(10pmol) 18  Ah142(5pmol) Ah156(10pmol)

从80℃到20℃(-1℃/分)退火。添加5μl 500mM DMT-MM(根据 Kunishima等Tetrahedron(2001)，57，1551制备)。于10℃温育5秒，然 后35℃温育1秒。重复o/n，然后通过10％尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

结果示于图22。

结论：

本实验测量了寡聚物设置B中结合于位置3的构件寡聚物之间的反 应效率。0、5、30和50个核苷酸的接头长度分别介导大约90％(泳道8)、 50％(泳道5)、20-40％(泳道14)和20-40％(泳道17)的反应效率。换言之， 0核苷酸的接头长度对于设置B是最佳的，就如在设置A中也观察到的 那样。在设置B中，位置2和位置1的反应效率达到大约75％和90％(数 据未显示)。

实施例20

我们利用5、6、7或8个核苷酸的拉链盒长度，在可观察到模板非依 赖性反应的条件下(即退火和反应都在高的模板和构件浓度下进行)，测 试了多种温度下的模板非依赖性反应的程度。

实验

混合2μl缓冲液A、多种浓度的相关寡聚物(见下表XV)，并加 H2O至10μl。

表XV：

实验 寡聚物1(32P标记的)(BB1) 寡聚物2(BB0) 寡聚物3(模板) A  Ah36(2pmol) Ah51(10pmol) Ah38(10pmol) B  Ah36(2pmol) Ah51(10pmol) C  Ah36(2pmol) Ah133(10pmol) Ah38(10pmol) D  Ah36(2pmol) Ah133(10pmol) E  Ah36(2pmol) Ah134(10pmol) Ah38(10pmol) F  Ah36(2pmol) Ah134(10pmol) G  Ah36(2pmol) Ah135(10pmol) Ah38(10pmol) H  Ah36(2pmol) Ah135(10pmol)

从80℃到20℃(-1℃/分)退火。添加1μl 500mM DMT-MM(根据 Kunishima等Tetrahedron(2001)，57，1551制备)。在多种温度下温育o/n， 然后通过10％尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

结果示于图23和24。

结论：

利用5-mer的拉链盒(实验A和B)，在9.9℃和50.8℃之间的温度上 未观察到模板非依赖性反应(图23，泳道1-12)。利用长度为6、7或8个 核苷酸的拉链盒，分别在5-28℃、5-32℃和5-35℃的温度范围内观察到模 板非依赖性反应。因此当进行不能由实验人员(如通过添加试剂)起始的 模控反应(templated reactions)时，推荐在不导致模板非依赖性反应的 温度下(例如，对于5、6、7和8个核苷酸的拉链盒长度，分别为25℃、 30℃、34℃和37℃)进行退火和反应。

当进行能够由实验人员(例如通过添加试剂或UV照射)起始的反应 时，复合物可在较低的温度下形成，以确保高度的拉链盒-拉链盒复合体 形成，之后，过量的构件寡聚物可通过洗涤去掉，然后可起始反应。由于 洗涤后构件寡聚物较低的浓度，模板非依赖性反应将会非常微不足道。

实施例21

在多步骤程序中(其中向模板支架复合物添加构件寡聚物和反应，一 次进行一个)，重要的是寡聚物(前一步骤所用的，并且仍结合在模板上) 不妨碍后添加的构件寡聚物的反应。

这里我们检查了设置A和设置B中结合于位置2和位置0处的构件 寡聚物之间的交联效率是否受到结合于位置3的构件寡聚物的影响。

实验

混合10μl缓冲液A、多种浓度的相关寡聚物(见下表XVI)，并加 H2O至50μl。

表XVI：

实 验 寡聚物1 (32P标记的) (BB1) 寡聚物1+ 寡聚物2 (BB0) 寡聚物3(模 板) 寡聚物4 (竞争性 寡聚物) 寡聚物5 (竞争性 模板) A Ah258(1pmol) Ah202 (10pmol) Ah252 (10pmol) Ah154 (5pmol) B Ah258(1pmol) Ah252 (10pmol) Ah154 (5pmol) C Ah258(1pmol) Ah202 (10pmol) Ah252 (10pmol) Ah154 (5pmol) Ah260(10 pmol) Ah279 (5pmol) D Ah258(1pmol) Ah252 (10pmol) Ah154 (5pmol) Ah260(10 pmol) Ah279 (5pmol) E Ah272(1pmol) Ah255 (10pmol) Ah270 (10pmol) Ah140 (5pmol) F Ah272(1pmol) Ah270 (10pmol) Ah140 (5pmol)

在不含BB1时从80℃到20℃(-1℃/分)退火。添加BB1，并再次从 55℃到30℃退火(-1℃/分)。在缓冲液B+50mM DMT-MM(根据 Kunishima等Tetrahedron(2001)，57，1551制备)中稀释100倍。对于A 到D，于30℃温育o/n，而对于E和F，于10℃温育5秒然后35℃温育1 秒，重复o/n，然后通过10％尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

结果示于图25。

结论：

被占据的位置3不妨碍结合于位置2和0的构件的交联(图25，对比 泳道A和泳道B、泳道C和泳道D、泳道E和F)。