蛋白质或胜肽的印刷方法、及蛋白质或胜肽阵列、功能性蛋白质或功能性胜肽的鉴定方法 |
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| 申请号 | CN201510626865.3 | 申请日 | 2011-08-25 | 公开(公告)号 | CN105418764A | 公开(公告)日 | 2016-03-23 |
| 申请人 | 国立大学法人东京大学; 株式会社尼康; | 发明人 | 一木隆范; 马尼许毕亚尼; 塩野博文; | ||||
| 摘要 | 本 发明 具有如下步骤：(a)将微凹版与 基板 重迭的步骤，所述微凹版是由微小凹部构成，于所述微小凹部内具有核酸与无细胞 蛋白质 合成系统；(b)在所述微小凹部内，根据所述核酸，进行转录反应与蛋白质或胜肽合成反应；(c)将在所述微小凹部内合成的所述蛋白质或胜肽固定在所述基板上。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种蛋白质或胜肽的印刷方法，其特征在于具有如下步骤： |
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| 说明书全文 | 蛋白质或胜肽的印刷方法、及蛋白质或胜肽阵列、功能性蛋白质或功能性胜肽的鉴定方法 [0001] 本专利申请是申请号为201180041500.4的名称为“蛋白质或胜肽的印刷方法、及蛋白质阵列或胜肽阵列、以及功能性蛋白质或功能性胜肽的鉴定方法”的发明专利申请的分案申请，原申请的申请日是2011年08月25日。 技术领域[0002] 本发明是有关于一种蛋白质或胜肽的印刷方法、及通过该等方法所制造的阵列、以及使用该阵列的功能性蛋白质或功能性胜肽的鉴定方法。本申请基于2010年8月27日在日本提出申请的日本特愿2010-191060号、及2010年11月18日在日本提出申请的日本特愿2010-258302号而要求优先权，并将其内容引用至本文中 背景技术[0004] 尤其是可实现次微米级的大面积图案化的微接触印刷法(以下，称为μCP法)受到瞩目。μCP法由于无需光刻图案化(photolithographic patterning)所必需的强酸或强碱，所以适用于蛋白质或其它生物体分子的图案化。 [0005] 然而，蛋白质或其它生物体分子容易发生变性或分解，因而对于所述μCP法正进行各种改良(例如非专利文献1)。 [0007] [现有技术文献] [0008] [非专利文献] [0009] [非专利文献1]James等人、Langmuir、第14卷、第741～744页、1998年发明内容 [0010] [发明所要解决的问题] [0011] 然而，非专利文献1中所提出的方法是利用凸版印刷技术的方法， 是直接印刷蛋白质等生物体分子的方法，因而用作墨水的该蛋白质容易干燥，例如对将保存稳定性低的蛋白质进行印刷的方法而言，尚有改良的余地。 [0012] 本发明是鉴于所述情况研究而成的，其目的在于提供一种可降低对保存稳定性低的蛋白质或胜肽的损害且将所述蛋白质或胜肽印刷为任意形状的蛋白质或胜肽的印刷方法、及通过该等方法所制造的阵列、以及使用该阵列的功能性蛋白质或功能性胜肽的鉴定方法。 [0013] [解决问题的技术手段] [0014] 本发明者等人为了解决所述问题而进行了努力研究，结果发现：通过应用凹版印刷(intaglio printing)技术，可解决所述问题。 [0015] 即，本发明的一个实施方式是提供下述(1)至(12)。 [0016] (1)本发明的一个实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的特征在于包括具有步骤：(a)于由具有特定开口形状的微小凹部构成的微凹版中，于所述微小凹部内准备核酸与无细胞蛋白质合成系统的步骤；(b)以与在所述微小凹部中合成的下述蛋白质或胜肽相接触的方式将基板与所述微凹版重迭的步骤；(c)于所述微小凹部内，使用所述无细胞蛋白质合成系统，由所述核酸来合成蛋白质或胜肽，并将所述蛋白质或胜肽沿着所述微小凹部所具有的特定的开口形状固定在所述基板上的步骤。 [0018] (3)本发明的一个实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法优选为所述固相结合部位识别部位为镍离子或钴离子。 [0019] (4)本发明的一个实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法优选为所述氨基酸序列为聚组胺酸。 [0020] (5)本发明的一个实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的特征在于具有如下步骤：(a)于由具有特定开口形状的微小凹部构成的微凹版中，于所述微小凹部内准备核酸、生物素化嘌呤霉素衍生物及无细胞蛋白质合成系统的步骤；(b)以与在所述微小凹部中合成的下述蛋白质或胜肽相接触的方式将经抗生物素蛋白修饰的基板与所述微凹版重迭的步骤；(c)于所述微小凹部内，使用所述无细胞蛋白质合成系统，由所述核酸来合成蛋白质或胜肽，并将所述蛋白质或胜肽沿着所述微小凹部所具有的特定开口形状固定在所述基板上的步骤。 [0021] (6)本发明的实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法优选为所述生物素化嘌呤霉素衍生物为以下述通式(1)表示的化合物， [0022] [0023] [式中，Z为以下述式(2)、(3)、或(4)表示的基] [0024]1 2 [0026] [0027] [式中，﹡表示键合部位]。 [0028] (7)本发明的一个实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法优选为所述Z为以所述式(2)表示的基。 [0029] (8)本发明的一个实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法优选为所述无细胞蛋白质合成系统仅由经独立纯化的蛋白质合成中的必要因子构成。 [0030] (9)本发明的一个实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法优选为于所述步骤(a)中，所述核酸为经固相结合部位修饰的DNA，并且是利用经固相结合部位识别部位修饰的磁珠进行固定化的核酸。 [0031] (10)本发明的一个实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法优选为于所述步骤(a)中，所述核酸为经生物素修饰的DNA，并且是利用经链霉亲和素(Streptavidin)修饰的磁珠进行固定化的核酸。 [0032] (11)本发明的一个实施方式的蛋白质阵列或胜肽阵列的特征在于：其是使用所述蛋白质或胜肽的印刷方法而制造。 [0033] (12)本发明的一个实施方式的功能性蛋白质或功能性胜肽的鉴定方法的特征在于：其是使用蛋白质阵列或胜肽阵列进行功能性筛选，并使用所述步骤(a)中所对应的微小凹部内的核酸来鉴定通过所述功能性筛选而确定的所述步骤(c)中经固定化的蛋白质或胜肽。 [0034] [发明的效果] [0035] 根据本发明的蛋白质或胜肽的印刷方法，可在不对保存稳定性低的蛋白质或胜肽造成损害的情况下，获得所述蛋白质或所述胜肽被印刷为任意形状的蛋白质阵列或胜肽阵列。 [0036] 根据本发明，也可将所述蛋白质阵列或所述胜肽阵列高密度化，所涉及的高密度蛋白质阵列或高密度化胜肽阵列不仅固定有庞大种类的蛋白质或胜肽，而且在每1个位点固定有多分子数的蛋白质或胜肽，因此利用价值高。 [0038] 图1A是本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的示意图。 [0039] 图1B是本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的示意图。 [0040] 图1C是本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的示意图。 [0041] 图2A是本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的示意图。 [0042] 图2B是本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的示意图。 [0043] 图2C是本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的示意图。 [0044] 图2D是本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的示意图。 [0045] 图2E是本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的示意图。 [0046] 图3A是本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的示意图。 [0047] 图3B是本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的示意图。 [0048] 图3C是本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的示意图。 [0049] 图4A是本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的示意图。 [0050] 图4B是本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的示意图。 [0051] 图4C是本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的示意图。 [0052] 图4D是本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的示意图。 [0053] 图4E是本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的示意图。 [0055] 图6是将实施例中的GFP-His蛋白质图案化而获得的玻璃基板的荧光显微镜图像。 [0056] 图7是实施例中的SDS-PAGE的结果。 [0057] 图8是将实施例中的GFP蛋白质图案化而获得的载玻片的荧光图像。 [0058] [符号的说明] [0059] 1、11 微凹版 [0060] 2、12 微小凹部 [0061] 3 核酸 [0062] 4、14 磁珠 [0063] 5、15 基板 [0064] 10 生物素化嘌呤霉素衍生物 [0065] 13 DNA [0066] 16 mRNA [0067] 7、17 蛋白质或胜肽 [0068] 9、19 无细胞蛋白质合成系统 [0069] 18、18' 蛋白质阵列或胜肽阵列 具体实施方式[0070] 《蛋白质或胜肽的印刷方法》 [0071] [第1实施方式] [0072] 如图1A～图1C所示，本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的特征在于具有如下步骤： [0073] (a)于由具有特定开口形状的多个微小凹部2构成的微凹版1中，于所述微小凹部2内准备核酸3与无细胞蛋白质合成系统9的步骤； [0074] (b)以与在所述微小凹部2中合成的下述蛋白质或胜肽7相接触的方式将基板5与所述微凹版1重迭的步骤； [0075] (c)于所述微小凹部2内，使用所述无细胞蛋白质合成系统9，由所述核酸3来合成蛋白质或胜肽7，并将所述蛋白质或胜肽7沿着所述微小凹部2所具有的特定的开口形状固定在所述基板5上的步骤。 [0076] 以下，一边参照图2A～图2E，一边对各步骤进行说明。 [0077] 步骤(a)是于由具有特定开口形状的微小凹部12构成的微凹版11中，于所述微小凹部12内准备核酸与无细胞蛋白质合成系统19的步骤。 [0078] 所述微凹版11优选为由多个微小凹部12构成。本实施方式是使用由各自具有障壁的微小凹部12构成的微凹版11，所以在基板15印刷蛋白质或胜肽17时，无需担心各位点间的泄漏等，而可实现微细形状的图案印刷，于下述步骤(c)中，所述微小凹部12所具有的特定开口形状直接被印刷到基板15上，而反映为位点形状。 [0079] 因此，可通过该形状而制造高密度化蛋白质阵列18。此外，基板15上的位点形状取决于所述微小凹部12的开口形状，因此本实施方式中可通过任意形状来决定基板15上的位点形状。 [0080] 另外，固定在DNA微阵列上的DNA的分子数存在限制，相对于此，本实施方式中由于可在微凹版11上添加多分子数的DNA，故通过使用下述无细胞蛋白质合成系统，可合成多分子数的蛋白质，从而可制作每1个位点固定了多分子数的蛋白质的蛋白质阵列。另外，由于本实施方式是使用由微小凹部12构成的微凹版11，所以可一次进行转录阶段与转译阶段，而有效率。 [0081] 于微凹版11的表面及微小凹部12内壁可适宜地涂布DNA等生物体分子的非特异性吸附防止用阻断剂、例如聚乙二醇(PEG)或2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)。通过涂布所述阻断剂，可抑制生物体分子向基板表面或微小反应槽的内壁的非特异性吸附。 [0082] 微凹版11所使用的基板材料优选为透明的玻璃或聚合物材料，基于抑制泄漏的目的，更优选为聚二甲基硅氧烷等弹性体材料。此外，于使用弹性体材料作为微凹版11所使用的基板材料的情况下具有如下优点：微小的灰尘等粒子夹在凹版与基板15之间时所产生的影响整个凹版与基板的密合性的不良影响会因弹性体的局部变形而得到避免。 [0083] 于步骤(a)中，微小凹部12内所准备的核酸只要是编码用于印刷的蛋白质或胜肽的核酸，则没有特别限定，优选DNA或mRNA，就操作容易性的观点而言优选DNA。 [0084] 就确定该DNA的位置信息的必要性的观点而言，该DNA优选固定在微凹版11上。 [0085] 对于固定而言，除了利用抗生物素蛋白-生物素结合的方法以外，还可采用利用「以氨基、醛基、SH基等官能基来修饰DNA，并以具有氨基、醛基、环氧基等的硅烷偶联剂将固相进行表面处理」的方法等，特别优选利用抗生物素蛋白-生物素结合的方法。于该情况下，优选将抗生物素蛋白固定在固相，使生物素与DNA结合。 [0086] 就之后回收DNA的观点而言，所述固相优选为珠子，就可在短时间内排列在微凹版11中的各微小凹部12中的观点而言，更优选磁珠。 [0087] 另外，于使用珠子的情况下，与将DNA固定在基板上的情况相比，可固定更多分子数的DNA。所述的DNA分子数由于反映出使用无细胞蛋白质合成系统所合成的蛋白质的分子数，所以根据本实施方式，与由DNA微阵列制作蛋白质阵列的方法相比，可在每1个位点固定更多分子数的蛋白质。 [0088] 于本实施方式中，于使用磁珠作为固相的情况下，优选在微凹版11所使用的基板材料下铺设磁性体板。 [0089] 通过使用所述构造的微凹版11，可将磁珠14容易且确实地配置在微小凹部12内。具体而言，在该基板材料的下部配置磁铁，向该基板材料上滴加使固定有DNA13的磁珠14分散而成的分散液。利用由磁珠14及磁性体薄膜产生的磁力作用，将磁珠吸引到微小凹部 12内，而使配置变得容易。此外，通过使磁铁适宜地沿着与基板平行的方向运动，使磁珠14分散，而提高向微小凹部12内的填充率。利用磁铁对用于配置珠子的基板所施加的磁场强度在取得所需效果的基础上优选为100～10000高斯。 [0090] 另外，由于撤去磁铁后，磁性体板的磁化仍残留，所以磁珠14可继续保持稳定的配置。 [0091] 作为所述磁性体的材料，可适宜地使用镍、镍合金、铁及铁合金等金属，本实施方式中优选使用残留磁化大的磁性材料。 [0092] 磁珠14向微小凹部12的填充率取决于微小凹部12的直径，微小凹部12的直径少许高于磁珠14的直径时，填充率较高，优选微小凹部12的直径为磁珠的直径的1～2倍。另外，在向1个微小凹部12中填充1个磁珠14的基础上，微小凹部12的深度优选为磁珠 14的直径的1～2倍。 [0093] 微小凹部12优选经过亲水化，通过利用氧电浆照射等对该微小凹部12进行亲水化处理，而使分散有磁珠的液体向微小凹部12内部的填充变得容易，填充率提高。 [0094] 于本实施方式中，于微小凹部12内准备核酸时，也可将DNA数据库等多种DNA混合物与DNA扩增试剂混合，利用适当的缓冲液等稀释混合物，再分注到微小凹部12中。另外，作为DNA数据库，也可使用导入了基因变异的变异DNA数据库作为适合用于分子进化工程学用途的DNA数据库。此处，优选以各微小凹部12中在概率上存在1个DNA分子的方式进行稀释并分注。DNA、扩增试剂与稀释的前后没有特别限定，于分注后，如果以适合DNA扩增的方式设定微凹版11的条件并进行反应，则于每个微小凹部12使不同种类的DNA扩增。 [0095] 此处，于扩增DNA的情况下，优选利用PCR反应，可使用用于该反应所需的反应溶液的市售品。另外，于将微小凹部12内的DNA固定在珠子的情况下，如果以于DNA组入生物素的方式进行扩增反应，利用抗生物素蛋白进行涂布并使用珠子，则DNA可容易地经由抗生物素蛋白-生物素结合而固定在珠上。作为使于DNA组入生物素的方法，例如可采用使用经生物素标记的PCR引子的方法等。 [0096] 步骤(b)是以与在所述微小凹部12中合成的下述蛋白质或胜肽17相接触的方式将基板15与所述微凹版11重迭的步骤。 [0097] 所述步骤(b)是利用于版的凹陷部分装入墨水并从上方按压纸等的凹版印刷(intaglio printing)技术的步骤。所述步骤(b)是向微凹版11上的凹部即微小凹部12中滴加反应溶液，从上方将基板15与所述微凹版11重迭，并使用手压机等进行按压的步骤，于下述步骤(c)中，是在基板15上印刷蛋白质或胜肽17。因此，微小凹部12所具有的特定开口形状直接反映为基板15的位点形状，因而根据本实施方式，可在基板上印刷出任意尺寸及形状的蛋白质或胜肽。因此，如果该形状微细，则所转印的位点的形状也变得微细。利用所述微细形状，变得可制作出高密度化的蛋白质阵列或胜肽阵列。 [0098] 此外，通过下述步骤(c)，可在不改变序列上已固定的核酸的位置信息的情况下由该核酸合成蛋白质或胜肽，并将该蛋白质或该胜肽印刷在基板上。 [0099] 所述微小凹部12所具有的所述开口形状为任意，优选可填充至少1个珠子的形状。例如所述微小凹部12所具有的所述开口形状可为圆形状、四边形状、六边形状、线状等。 [0100] 作为所述步骤(b)中所使用的基板15，可列举：玻璃基板、硅基板、聚合物基板、金属基板等。 [0101] 于本实施方式中，与微凹版11重迭的基板15的表面并非必须平坦，例如也可为了增加固定蛋白质或胜肽17的表面积而加工成凹凸状。但是，于将基板15与微凹版11重迭时，为了使微凹版11上的全部微小凹部12内的试剂等不泄漏而被密封，微凹版11所接触的部分的基板表面必须平坦。 [0102] 步骤(c)是于所述微小凹部12内，使用所述无细胞蛋白质合成系统19，由所述核酸来合成蛋白质或胜肽17，并将所述蛋白质或胜肽17沿着所述微小凹部12所具有的特定开口形状固定在所述基板15上的步骤。 [0103] 所谓无细胞蛋白质合成系统，是指由从适当的细胞所提取的具有蛋白质合成能力的成分构成的蛋白质转译系统，该系统包含核糖体、转译起始因子(translation initiation factor)、转译延长因子(translation elongation factor)、释放因子(release factor)、氨基酰基tRNA合成酶等转译所需要素。作为此种蛋白质转译系统，可列举：大肠杆菌提取液、兔网织红血球提取液、小麦胚芽提取液等。 [0104] 此外，作为所述转译所需的要素，可列举仅由经独立纯化的因子所构成的再构成型无细胞蛋白质合成系统。再构成型无细胞蛋白质合成系统与先前使用细胞提取液的情况相比，可容易地防止混入核酸酶及蛋白酶，因此可提高转译效率。就所述转译效率的观点而言，于本实施方式中，优选使用再构成型无细胞蛋白质合成系统作为无细胞蛋白质合成系统。 [0105] 通过使用此种系统，而于所述微小凹部12内制造蛋白质或胜肽17。 [0106] 所合成的蛋白质由于容易因分解或变性而失活，所以于印刷在基板上时需要尽可能在稳定的状态下维持该蛋白质。于本实施方式中，由于是将微小凹部12内所合成的蛋白质17直接印刷在基板15上，所以可制作出尽可能抑制了蛋白质失活的阵列18。 [0107] 于无细胞蛋白质合成系统19所使用的核酸为DNA13的情况下，所述步骤(c)包括使用无细胞蛋白质转录系统而由所述DNA13来合成mRNA16的步骤。所述mRNA16是通过利用RNA聚合酶，由编码欲筛选的蛋白质的经固定化的DNA13进行转录而获得。作为RNA聚合酶，例如可列举T7RNA聚合酶。 [0108] 为了使转录反应及下述转译反应在最佳状态下进行，可组合对微凹版11的温度、微小凹部12内的pH值条件等进行控制的其它装置等而实施。 [0109] 另外，由于较为简便，所以转录转译也可使用经偶联的系统。 [0110] 于步骤(c)中，继所述蛋白质或胜肽17的合成之后，接着进行将所述蛋白质或胜肽固定于基板15。具体而言，于步骤(a)中向微凹版11上的微小凹部12中添加必要的试剂及材料(核酸)后，于步骤(b)中使用基板15而从上方密封微凹版11，而形成密闭状态。于步骤(c)中，在将试剂混合之前，进行DNA13→mRNA16→蛋白质17的一系列转录/转译反应，接着将所转译的蛋白质17所具有的标签与所述基板15结合。 [0111] 于本实施方式中，由于将蛋白质或胜肽固定于基板，所以优选所述蛋白质或所述胜肽含有作为固相结合部位的氨基酸序列，且所述基板具有对所述氨基酸序列具有亲和性的固相结合部位识别部位。 [0112] 作为此种固相结合部位/固相结合部位识别部位的组合，可列举：麦芽糖结合蛋白质/麦芽糖、G蛋白质/鸟嘌呤核苷酸、聚组胺酸/镍或者钴等的金属离子、谷胱甘肽-S-转移酶/谷胱甘肽、DNA结合蛋白质/DNA、抗体/抗原分子(抗原决定位)、钙调蛋白/钙调蛋白结合胜肽、ATP结合蛋白质/ATP、或者雌二醇受体蛋白质/雌二醇等各种受体蛋白质/其配体等。 [0113] 该等中，作为固相结合部位/固相结合部位识别部位的组合，优选麦芽糖结合蛋白质/麦芽糖、聚组胺酸/镍或者钴等的金属离子、谷胱甘肽-S-转移酶/谷胱甘肽、抗体/抗原分子(抗原决定位)等，就便捷性而言，最优选聚组胺酸/镍或者钴等的金属离子的组合。 [0114] 作为聚组胺酸，优选使用六聚物以上的聚组胺酸。为了使蛋白质或胜肽中含有聚组胺酸，优选通过PCR等预先在cDNA的末端附加编码该聚组胺酸的碱基序列。 [0115] 另外，所述固相结合部位识别部位，可在该基板上，基于规定间距的圆形状或四边形状的图案、规定间距的线图案、或此等的组合图案等规定图案而形成。于该情况下，所述蛋白质或胜肽是根据在基板图案化的固相结合部位识别部位的图案而印刷为任意的尺寸及形状。 [0116] 其次，将经重迭的所述基板15从所述微凹版11剥离(步骤d)。所述基板15上的位点的形状是由所述微小凹部12所具有的特定的开口形状直接反映。此外，所述基板15上的位点是在不改变所对应的微凹版11上已固定的DNA13的位置信息的情况下印刷的。 [0117] 利用PBS等清洗这样固定了蛋白质或胜肽17的基板15，而制造蛋白质阵列或胜肽阵列18(步骤e)。 [0118] [第2实施方式] [0119] 如图3A～图3C所示，本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法的特征在于具有如下步骤： [0120] (a)于由具有特定开口形状的微小凹部2构成的微凹版1中，于所述微小凹部2内准备核酸3、生物素化嘌呤霉素衍生物10及无细胞蛋白质合成系统9的步骤； [0121] (b)以与在所述微小凹部2中合成的下述蛋白质或胜肽7相接触的方式将经抗生物素蛋白修饰的基板5与所述微凹版1重迭的步骤； [0122] (c)于所述微小凹部2内，使用所述无细胞蛋白质合成系统9，由所述核酸3来合成蛋白质或胜肽7，并将所述蛋白质或胜肽7沿着所述微小凹部2所具有的特定开口形状固定在所述基板5上的步骤。 [0123] 以下，一边参照图4A～图4E，一边对各步骤进行说明。于图4A～图4E中，对于与图2A～图2E的蛋白质或胜肽的印刷方法的示意图所示的构成要素相同的构成要素，附上相同符号并省略说明。 [0124] 于步骤(a)中，作为微小凹部12内所准备的核酸，优选固定在固相的DNA。作为固定化，优选利用抗生物素蛋白-生物素结合的方法，更优选将抗生物素蛋白固定在固相并使生物素与DNA结合的方法。 [0125] 步骤(b)中所使用的基板15经过抗生物素蛋白修饰，于下述步骤(c)中，可固定经生物素化的合成蛋白质或胜肽17。此处，作为用于修饰基板15的抗生物素蛋白，就便捷性而言优选链霉亲和素。 [0126] 于本实施方式中，所谓生物素化嘌呤霉素衍生物10，是指嘌呤霉素与经生物素化的核苷酸的复合体。嘌呤霉素是3'末端的化学结构与氨基酰基tRNA类似的化合物，具有于转译系统中合成了蛋白质时与所合成的蛋白质的C末端相结合的性质。因此，于本实施方式中，在合成蛋白质或胜肽时，于步骤(a)中微小凹部12内所准备的生物素化嘌呤霉素衍生物10与所合成的蛋白质或胜肽17的C末端相结合。 [0127] 于本实施方式中，所述生物素化嘌呤霉素衍生物优选为以所述通式(1)表示的化合物。于所述通式(1)中，Z为以所述式(2)、(3)、或(4)表示的基。 [0128] 即，作为所述生物素化嘌呤霉素衍生物，更优选脱氧胞苷嘌呤霉素(deoxycytidyl puromycin)、核糖胞苷嘌呤霉素(ribocytidyl puromycin)、脱氧尿苷嘌呤霉素经生物素化而成的衍生物。 [0129] 此外，于所述通式(1)中，Z优选为以所述式(2)表示的基，作为所述生物素化嘌呤霉素衍生物，特别优选以下述式(6)表示的生物素化脱氧胞苷嘌呤霉素衍生物。 [0130] [0131] [式中，X1及X2中的至少一个为以下述式(5)表示的基，另一个为荧光基或氢原子] [0132] [0133] [式中，﹡表示键合部位] [0134] 所述式(2)～(4)、(6)中，X1及X2中的至少一个为以所述式(5)表示的基(生物1 2 1 2 素)。具体而言，可以是仅X或X 为生物素，也可以是X 及X 两者均为生物素。因嘌呤霉素衍生物具有生物素，所以于步骤(c)中合成蛋白质或胜肽17时，于其C末端附加生物素。 因此，于本实施方式中，不需要预先在用作模板的cDNA的末端附加编码六组胺酸或其它胜肽/蛋白质标签的碱基序列。 [0135] 另外，于步骤(a)中，作为微小凹部12内所准备的核酸，于使用变异DNA数据库的情况下，有时该变异DNA数据库中存在于编码区中导 入了终止密码子的DNA。在以此种DNA作为模板来合成蛋白质的情况下，预先在DNA的3'末端侧附加编码聚组胺酸的碱基序列的方法无法在C末端附加聚组胺酸标签。另一方面，于本实施方式中，亦可于此种截短型的蛋白质附加生物素。因此，本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法适合用于分子进化工程学的方法。 [0136] 所述式(1)中，于X1或X2不为生物素的情况下，X1或X2为荧光基或氢原子。作为荧光基，可列举：荧光素(fluorescein)、若丹明(rhodamine)、花青染料(Cy dye)、Alexa(注册商标)Fluor、HiLyte(商标名)Fluor等蛋白质或胜肽的荧光标记所通用的荧光色素。因生物素化嘌呤霉素衍生物10具有荧光基，所以可通过测定荧光强度来确认所制作的蛋白质阵列或胜肽阵列中所固定的蛋白质或胜肽的量。 [0137] 作为微小凹部12中所添加的反应溶液总量中的生物素化嘌呤霉素衍生物10的浓度，优选1μM～100μM，更优选10μM～50μM。于浓度为1μM以上的情况，蛋白质的生物素化的效率不会变得过低，于浓度为100μM以下的情况，蛋白质的表达量不会变得过低。 [0138] 所合成的蛋白质由于容易因分解或变性而失活，所以在印刷到基板上时需要尽可能在稳定的状态下维持该蛋白质。于本实施方式中，由于是将微小凹部12内所合成的蛋白质17直接印刷在基板15上，所以可制作出尽可能抑制了蛋白质失活的阵列18'。 [0139] 《蛋白质阵列或胜肽阵列》 [0140] 使用本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法所制造的本实施方式的蛋白质阵列或胜肽阵列具有任意的位点形状，也可应对位点的高密度化。另外，该蛋白质阵列或胜肽阵列在使用时可随时由所述微凹版而制造，所以可抑制阵列上的蛋白质或胜肽的变性等。 [0141] 《功能性蛋白质或功能性胜肽的鉴定方法》 [0142] 本实施方式的功能性蛋白质或功能性胜肽的鉴定方法是使用所述的蛋白质阵列或胜肽阵列进行功能性筛选，并使用所述步骤(a)中所对应的微小凹部内的核酸来鉴定通过所述功能性筛选而确定的所述步骤(c)中经固定化的蛋白质或胜肽的方法。 [0143] 所述功能性筛选方法取决于蛋白质或胜肽所具有的所欲功能，在测定蛋白质或胜肽的活性的情况下，例如可列举以下步骤。 [0144] 首先，与步骤(a)中的微凹版同样地，准备与固定于蛋白质阵列或胜肽阵列上的位点位置相对应的微凹版。 [0145] 接着，于微凹版的微小凹部内预先填充测定蛋白质或胜肽的活性所需的溶液，再将蛋白质阵列或胜肽阵列与微凹版重迭而使之反应。 [0146] 通过该等步骤，可测定阵列上的蛋白质或胜肽的活性。 [0147] 通过本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法所制造的蛋白质阵列或胜肽阵列是在不改变所对应的微凹版上经固定的核酸的位置信息的情况下印刷在基板上。因此，使用该蛋白质阵列或该胜肽阵列，利用所述功能性筛选来回收与该经界定的位点相对应的微凹版上的微小凹部内的DNA，并分析其碱基序列，由此可鉴定出具有特定功能的蛋白质等、及编码该蛋白质等的DNA。 [0148] 根据本实施方式的功能性蛋白质或功能性胜肽的鉴定方法，可从高密度化蛋白质阵列或胜肽阵列迅速鉴定出具有所欲功能的蛋白质或胜肽，因此适合用于分子进化工程学用途。 [0149] 以下，通过实施例更具体地说明本发明，但本发明不受以下实施例的限定。 [0150] [实施例] [0151] (cDNA结合磁珠的制作) [0152] 取直径约40μm的经链霉亲和素修饰的珠子30μl(约3000个)置于1.5ml的试管中，使用磁铁将珠子吸引到试管的底部，并除去上清液。使用1×结合缓冲液(Binding Buffer)(10mM的Tris-HCl(pH值8.0)、1mM的EDTA、1M的氯化钠及0.1％的TritonX-100)清洗两次后，添加经生物素修饰的GFP(Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白)-His标签cDNA 50μl[40pmol]与2×结合缓冲液(20mM的Tris-HCl(pH值8.0)、2mM的EDTA、2M的氯化钠及0.2％的TritonX-100)50μl，并倒转混合60分钟。使用磁铁将珠子吸引到试管的底部，除去上清液后，悬浮于PBS或者TNT(商标名)反应缓冲液(Reaction Buffer)(普洛麦格公司(Promega))10μl中。 [0153] (将cDNA结合磁珠导入至凹版) [0154] 将通过所述方式制作的cDNA结合磁珠悬浮液10μl导入到由100×100个微孔(直径80μm、深度45μm)排列成阵列状的二氧化硅玻璃制的模板(30mm×30mm，t＝0.5)的凹部中。 [0155] 使用倒置显微镜，观察cDNA结合磁珠是否被导入到微孔模具中。将结果示于图5。 [0156] 图5中，于凹版的各凹部中逐个导入了cDNA结合磁珠。如此，确认磁珠被效率良好地导入到微孔模具中。 [0157] (使用了玻璃基板的GFP-His标签蛋白质的图案化) [0158] 在向微孔模具中导入了cDNA结合磁珠的凹版上，滴加同时引起转录、转译的无细胞蛋白质合成系统溶液(TNT(商标名)偶联小麦胚芽提取物系统(Coupled Wheat germ Extract System)(普洛麦格公司(Promega)))后，密合经镍-氮川三乙酸(Nickel-nitlirotriacetic acid，Ni-NTA)修饰的玻璃基板，并保持约1小时。 [0159] 其后，将Ni-NTA基板从凹版上剥离，利用PBS缓冲液进行清洗，并利用荧光显微镜(Ex：488nm，Em：515nm)确认GFP-His标签蛋白质是否在基板上图案化。将结果示于图6。 [0160] 如图6所示，在玻璃基板上观察到源自GFP的荧光位点排列成阵列状。由该情况确认，与导入了GFP-His标签cDNA结合磁珠的凹版相对应，GFP-His标签蛋白质在经Ni-NTA修饰的玻璃基板上图案化。 [0161] 基于以上结果，根据本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法，可在微孔模具等微小构造体中进行蛋白质或胜肽的合成，并将所合成的蛋白质或胜肽以微细的图案形状固定在基板表面。因此，根据本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法，可在基板印刷出任意的尺寸及形状的蛋白质。 [0162] (荧光标记生物素化嘌呤霉素-核苷酸复合体的合成) [0163] 通过标准亚磷酰胺法而合成了X1为Cy5且X2为以所述式(5)表示的作为生物素的所述式(6)所表示的化合物(以下，称为荧光标记生物素化嘌呤霉素-核苷酸复合体)。1 2 另外，制作了X为Cy5且X 为氢原子的化合物(以下，称为荧光标记嘌呤霉素-核苷酸复合体)作为对照。 [0164] (使用无细胞转录/转译系统的蛋白质合成及生物素化) [0165] 使用限制性内切酶，将插入了GFP(Green Fluorescent Protein)cDNA的pET21a-d(+)载体(Novagen公司制造)直线化。 [0166] 接着，以该直线化的载体作为模板，使用ExTaq DNA聚合酶(日本宝生物工程(Takara Bio)公司制造)对含有源自载体的T7启动子的GFPcDNA进行扩增。使用QIAquick PCR纯化试剂套组(凯杰(QIAGEN)公司制造)对经扩增的片段(PCR产物)进行纯化，并用作无细胞转录/转译系统的模板。 [0167] 接着，使用PURESYSTEM(商标名)classic II(BioComber公司制造)作为无细胞转录/转译系统而合成蛋白质。详细而言，将5μl(0.1μg/μl)的PCR产物与PURESYSTEM(商标名)classic II的溶解产物(转录/转译系统混合物)35μl混合后，向预先添加了2μl的荧光标记生物素化嘌呤霉素-核苷酸复合体(最终浓度：2～40μM)的384孔微量滴定板的各孔中分别添加8μl。反应是在37℃、1小时的条件下进行，将培养板置于冰上而停止反应。使用12％的凝胶对反应产物进行SDS-PAGE，并使用FluoroImager(GE Healthcare公司制造，商品名：Typhoon 9410)进行分析。将结果示于图7。 [0168] 图7中，泳道1表示未添加荧光标记生物素化嘌呤霉素-核苷酸复合体及荧光标记嘌呤霉素-核苷酸复合体的GFP表达样本，泳道2表示添加了10μM的荧光标记嘌呤霉素-核苷酸复合体的GFP表达样本，泳道3 表示添加了2μM的荧光标记生物素化嘌呤霉素-核苷酸复合体的GFP表达样本，泳道4表示添加了10μM的荧光标记生物素化嘌呤霉素-核苷酸复合体的GFP表达样本，泳道5表示添加了40μM的荧光标记生物素化嘌呤霉素-核苷酸复合体的GFP表达样本，箭头表示作为目标蛋白质的GFP。上段及下段的电泳结果是使用不同的成像法分析相同的凝胶而获得的结果。上段(GreenScan)是取得由GFP产生的荧光图像的结果，下段是取得由Cy5产生的荧光图像的结果。 [0169] 于上段的泳道3～5中，确认到GFP的表达。另外，于下段的泳道3～5中，确认到组入了荧光标记生物素化嘌呤霉素-核苷酸复合体的生物素化GFP的表达。 [0170] 此外，于上段的泳道4及泳道5中，泳道4检测到更强的源自GFP的荧光强度。另一方面，于下段的泳道4及泳道5中，泳道5检测到更强的Cy5荧光强度。由该等情况确认，添加了40μM的荧光标记生物素化嘌呤霉素-核苷酸复合体的样本在生物素化效率方面特别高。 [0171] (使用载玻片的生物素化GFP蛋白质的图案化) [0172] 在涂布了生物素的载玻片(MicroSurface公司制造，商品名：Bio-02)上，滴加20μg的链霉亲和素与含有10％的甘油的PBS(pH值7.5)，而制作涂布了链霉亲和素的载玻片。接着，通过(使用无细胞转录/转译系统的蛋白质合成及生物素化)中所述的方法，向384孔微量滴定板的各孔中滴加GFP蛋白质合成反应液，并密合涂布了链霉亲和素的载玻片，在加湿腔室中、在室温下保持约30分钟。 [0173] 其后，将涂布了链霉亲和素的载玻片从384孔微量滴定板凹版上剥离，利用PBS1×洗涤缓冲液(100mM的磷酸盐、150mM的氯化钠、0.05％的TritonX-100)以15秒钟清洗 3次。此外，使用水进行冲洗，并风干。使用FluoroImager确认源自GFP的荧光，从而确认GFP蛋白质是否在载玻片上图案化。将结果示于图8。 [0174] 图8中，左上的位点表示添加了10μM的荧光标记嘌呤霉素-核苷酸复合体的GFP表达样本，右上的位点表示添加了2μM的荧光标记生物素化嘌呤霉素-核苷酸复合体的GFP表达样本，左下的位点表示添加了10μM的荧光标记生物素化嘌呤霉素-核苷酸复合体的GFP表达样本，右下的位点表示添加了40μM的荧光标记生物素化嘌呤霉素-核苷酸复合体的GFP表达样本。确认在左上的位点未观察到荧光，另一方面，在其它位点，荧光强度依赖于荧光标记生物素化嘌呤霉素-核苷酸复合体的用量而增强。 [0175] 由该情况确认，通过向蛋白质合成系统中添加生物素化嘌呤霉素-核苷酸复合体，蛋白质被生物素化，而容易在基板上图案化。 [0176] 基于以上结果，根据本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法，可在微孔模具等微小构造体中进行生物素化蛋白质或生物素化胜肽的合成，并将所合成的生物素化蛋白质或生物素化胜肽以微细的图案形状固定在经抗生物素蛋白修饰的基板表面。因此，根据本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法，可在基板简便且效率良好地印刷出任意的尺寸及形状的蛋白质。 [0177] 此外，本实施方式的蛋白质阵列或胜肽阵列由于是以所述方式使用本实施方式的蛋白质或胜肽的印刷方法而简便且效率良好地制造的，所以可灵活地应对近年来在基因水平上进行诊断的与生活习惯病或癌症等相关的基因、或者病原细菌或病毒的基因的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)分析。并且，根据本实施方式的蛋白质阵列或胜肽阵列，可在蛋白质水平上迅速且详细地进行单核苷酸多态性诊断。 [0178] [工业上的可利用性] [0179] 本发明可利用于与生活习惯病或癌症等相关的基因、或者病原细菌或病毒的基因的单核苷酸多态性分析的领域。 |
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