[0001] 相关申请案的交叉引用

[0002] 本申请案要求2013年8月26日提出的美国序列号13/975,678、2013年2月19日提出的美国序列号61/766,609和2012年8月27日提出的美国序列号61/693,683的权
益，每一者以全文引用的方式并入本文中。
发明内容

[0003] 本文中提供了总体上关于代谢和生物合成过程的方法以及能够产生有机化合物的微生物生物体。确切地说，本文中提供了一种非天然存在的微生物生物体(NNOMO)，其具有可以增强甲醇存在下还原当量的可用性和/或将甲醇转变成甲醛的甲醇代谢途径
(MMP)。此类NNOMO和还原当量可以用于增加由微生物生物体产生的例如1,4-丁二醇(BDO)等有机化合物的产物产率。本文中还提供了产生BDO最佳产率的NNOMO和其方法。

[0004] 在第一方面，本文中提供了一种具有甲醇代谢途径(MMP)的NNOMO，其中所述生物体包含至少一种编码MMP酶(MMPE)的外源性核酸，所述外源性核酸以足够增强甲醇存在下还原当量的可用性的量表达。在某些实施例中，MMP包含一或多种选自由以下各者组成的群组的酶：甲醇甲基转移酶(EM1)；亚甲基四氢叶酸还原酶(EM2)；亚甲基四氢叶酸脱氢酶(EM3)；次甲基四氢叶酸环水解酶(EM4)；甲酰四氢叶酸脱甲酰酶(EM5)；甲酰四氢叶酸合成酶(EM6)；甲酸氢裂合酶(EM15)；氢化酶(EM16)；甲酸脱氢酶(EM8)；甲醇脱氢酶(EM9)；甲醛活化酶(EM10)；甲醛脱氢酶(EM11)；S-(羟基甲基)谷胱甘肽合酶(EM12)；谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶(EM13)；和S-甲酰谷胱甘肽水解酶(EM14)。此类生物体有利地允许还原当量的产生，还原当量接着可以为生物体所用，用于使用本文中提供的任一个BDO途径(BDOP)产生BDO。

[0005] 在一个实施例中，MMP包含EM9。在另一个实施例中，MMP包含EM9和EM10。在其它实施例中，MMP包含EM1和EM2。在一个实施例中，MMP包含EM9、EM3、EM4和EM5。在另一个实施例中，MMP包含EM9、EM3、EM4和EM6。在其它实施例中，MMP包含EM9和EM11。在另一个实施例中，MMP包含EM9、EM12和EM13和EM14。在其它实施例中，MMP包含EM9、EM13
和EM14。在一个实施例中，MMP包含EM9、EM10、EM3、EM4和EM5。在另一个实施例中，MMP包含EM9、EM10、EM3、EM4和EM6。在其它实施例中，MMP包含EM1、EM2、EM3和EM4和EM5。
在一个实施例中，MMP包含EM1、EM2、EM3、EM4和EM6。在某些以上实施例中，MMP进一步包含EM8。在其它以上实施例中，MMP进一步包含和EM15。在其它以上实施例中，MMP进一步包含EM16。在某些实施例中，生物体包含两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性核酸，每一种都编码MMPE。

[0006] 在某些实施例中，生物体进一步包含1,4-BDO途径(BDOP)。在某些实施例中，所述生物体包含至少一种编码BDOPE的外源性核酸，所述外源性核酸以足够产生BDO的量表达。在某些实施例中，BDOPE选自由以下各者组成的群组：丁二酰基-CoA转移酶(EB1)或
丁二酰基-CoA合成酶(EB2A)(或丁二酰基-CoA连接酶)；丁二酰基-CoA还原酶(形成
醛)(EB3)；4-羟基丁酸(4-HB)脱氢酶(EB4)；4-HB激酶(EB5)；转磷酸-4-羟基丁酰酶
(EB6)；4-羟基丁酰基-CoA还原酶(形成醛)(EB7)；1,4-丁二醇脱氢酶(EB8)；丁二酸还
原酶(EB9)；丁二酰基-CoA还原酶(形成醇)(EB10)；4-羟基丁酰基-CoA转移酶(EB11)
或4-羟基丁酰基-CoA合成酶(EB12)；4-HB还原酶(EB13)；4-羟基丁酰基-磷酸还原酶
(EB14)；和4-羟基丁酰基-CoA还原酶(形成醇)(EB15)。

[0007] 在一个实施例中，BDOP包含EB3、EB4、EB5、EB6、EB7和EB8。在一个实施例中，BDOP包含EB3、EB4、EB11或EB12、EB7和EB8。在一个实施例中，BDOP包含EB3、EB4、EB11或EB12和EB15。在一个实施例中，BDOP包含EB3、EB4、EB5、EB6和EB15。在一个实施例中，BDOP包含EB3、EB4、EB13和EB8。在一个实施例中，BDOP包含EB3、EB4、EB5、EB14和EB8。在一个实施例中，BDOP包含EB10、EB5、EB6、EB7和EB8。在一个实施例中，BDOP包含EB10、EB5、EB6和EB15。在一个实施例中，BDOP包含EB10、EB11或EB12、EB7和EB8。在一个实施例中，BDOP包含EB10、EB11或EB12和EB15。在一个实施例中，BDOP包含EB10、EB13和EB8。在一个实施例中，BDOP包含EB10、EB5、EB14和EB8。在一个实施例中，BDOP包含EB9、EB4、EB5、EB6、EB7和EB8。在一个实施例中，BDOP包含EB9、EB4、EB11或EB12、EB7和EB8。在一个实施例中，BDOP包含EB9、EB4、EB11或EB12和EB15。在一个实施例中，BDOP包含EB9、EB4、EB5、EB6和EB15。在一个实施例中，BDOP包含EB9、EB4、EB13和EB8。在一个实施例中，BDOP包含EB9、EB4、EB5、EB14和EB8。在某些以上实施例中，BDOP进一步包含EB1。在其它以上实施例中，BDOP进一步包含EB2A。在一些实施例中，生物体包含四种、五种、六种或七种外源性核酸，每一种都编码BDOPE。

[0008] 在其它实施例中，如本文中提供的具有单独或与BDOP组合的MMP的生物体进一步包含甲醛同化途径(FAP)，FAP利用例如从甲醇氧化所获得的甲醛形成可以用于例如形成生物质的某些中心代谢途径的中间物。在某些实施例中，生物体进一步包含FAP，其中所述生物体包含至少一种编码甲醛同化途径酶(FAPE)的外源性核酸，所述外源性核酸以足够
产生糖酵解和/或可以用于形成生物质的代谢途径的中间物的量表达。在一个实施例中，FAPE以足够产生糖酵解的中间物的量表达。在另一个实施例中，FAPE以足够产生可以用
于形成生物质的代谢途径的中间物的量表达。在一些实施例中，FAP包含己酮糖-6-磷酸
(H6P)合酶(EF1)、6-磷酸-3-己酮糖异构酶(EF2)、二羟基丙酮(DHA)合酶(EF3)或DHA
激酶(EF4)。在一个实施例中，FAP包含EF1和EF2。在一个实施例中，中间物是H6P、果
糖-6-磷酸(F6P)或其组合。在其它实施例中，FAP包含EF3或EF4。在一个实施例中，中
间物是DHA、DHA磷酸酯或其组合。在某些实施例中，生物体包含两种外源性核酸，每一种都编码FAPE。

[0009] 在某些实施例中，本文中提供了一种具有MMP的NNOMO，其中所述生物体包含至少一种编码EM9的外源性核酸，所述外源性核酸以足够增强甲醇存在下还原当量的可用性的量表达和/或以足够将甲醇转变成甲醛的量表达。在一些实施例中，生物体包含至少一种编码EM9的外源性核酸，所述外源性核酸以足够增强甲醇存在下还原当量的可用性的量表达。在其它实施例中，生物体包含至少一种编码EM9的外源性核酸，所述外源性核酸以足够将甲醇转变成甲醛的量表达。在一些实施例中，微生物生物体进一步包含FAP。在某些实施例中，生物体进一步包含至少一种编码FAPE的外源性核酸，所述外源性核酸以足够产生糖酵解的中间物的量表达。在某些实施例中，FAPE选自由以下各者组成的群组：EF1、EF2、EF3和EF4。

[0010] 在某些实施例中，至少一种外源性核酸是异源核酸。在一些实施例中，生物体处于实质上厌氧培养基中。在一些实施例中，微生物生物体是细菌、酵母或真菌物种。

[0011] 在一些实施例中，生物体进一步包含一或多种基因破坏，所述基因破坏发生在一或多种编码与所述微生物生物体天然产生乙醇、甘油、乙酸酯、乳酸酯、甲酸酯、CO2和/或氨基酸有关的蛋白质或酶的内源性基因中，其中所述一或多种基因破坏在所述微生物生物体中赋予BDO的产生增加。在一些实施例中，一或多种与微生物生物体天然产生乙醇、甘油、乙酸酯、乳酸酯、甲酸酯、CO2和/或氨基酸有关的内源性酶具有减弱的酶活性或表达水平。在某些实施例中，生物体包含一种到二十五种基因破坏。在其它实施例中，生物体包含一种到二十种基因破坏。在一些实施例中，生物体包含一种到十五种基因破坏。在其它实施例中，生物体包含一种到十种基因破坏。在一些实施例中，生物体包含一种到五种基因破坏。
在某些实施例中，生物体包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、23、24或25种基因破坏或更多。

[0012] 在另一方面，本文中提供了一种产生甲醛的方法，其包含在足够产生甲醛的条件和时段下培养本文中提供的NNOMO。在某些实施例中，NNOMO包含编码EM9的外源性核酸。在某些实施例中，甲醛被消耗以提供还原当量。在其它实施例中，甲醛被消耗以并入BDO或另一目标产物中。

[0013] 在另一方面，本文中提供了一种产生糖酵解和/或可以用于形成生物质的代谢途径的中间物的方法，其包含在足够产生中间物的条件和时段下培养本文中提供的NNOMO。在某些实施例中，NNOMO包含编码EM9的外源性核酸。在某些实施例中，甲醛被消耗以提供还原当量。在其它实施例中，甲醛被消耗以并入BDO或另一目标产物中。

[0014] 在另一方面，本文中提供了一种产生BDO的方法，其包含在足够产生BDO的条件和时段下培养本文中提供的包含MMP和BDOP的任一NNOMO。在某些实施例中，生物体在实质上厌氧培养基中培养。
附图说明

[0015] 图1展示能够从甲醇提取还原当量的例示性代谢途径。所示酶转化通过以下酶进行：1A)甲醇甲基转移酶(EM1)；1B)亚甲基四氢叶酸还原酶(EM2)；1C)亚甲基四氢叶酸脱氢酶(EM3)；1D)次甲基四氢叶酸环水解酶(EM4)；1E)甲酰四氢叶酸脱甲酰酶(EM5)；1F)甲酰四氢叶酸合成酶(EM6)；1G)甲酸氢裂合酶(EM15)；1H)氢化酶(EM16)；1I)甲酸脱氢酶(EM8)；1J)甲醇脱氢酶(EM9)；1K)甲醛活化酶(EM10)；1L)甲醛脱氢酶(EM11)；1M)S-(羟基甲基)谷胱甘肽合酶(EM12)；1N)谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶(EM13)；和1O)S-甲酰谷
胱甘肽水解酶(EM14)。在某些实施例中，步骤K和/或M是自发的。

[0016] 图2展示例示性BDOP，其可以用于在由本文中提供的MMP产生的还原当量可用时增加碳水化合物的BDO产率。BDO产生通过以下酶进行：2A)丁二酰基-CoA转移酶(EB1)
或丁二酰基-CoA合成酶(EB2A)；2B)丁二酰基-CoA还原酶(形成醛)(EB3)；2C)4-HB脱氢
酶(EB4)；2D)4-HB激酶(EB5)；2E)转磷酸-4-羟基丁酰酶(EB6)；2F)4-羟基丁酰基-CoA
还原酶(形成醛)(EB7)；2G)1,4-丁二醇脱氢酶(EB8)；2H)丁二酸还原酶(EB9)；2I)丁二
酰基-CoA还原酶(形成醇)(EB10)；2J)4-羟基丁酰基-CoA转移酶(EB11)或4-羟基丁酰
基-CoA合成酶(EB12)；2K)4-HB还原酶(EB13)；2L)4-羟基丁酰基-磷酸还原酶(EB14)；
和2M)4-羟基丁酰基-CoA还原酶(形成醇)(EB15)。

[0017] 图3展示例示性FAP。酶转化通过以下酶进行：3A)H6P合酶(EF1)和3B)6-磷酸-3-己酮糖异构酶(EF2)。

[0018] 图4展示例示性FAP。酶转化通过以下酶进行：4A)DHA合酶(EF3)和4B)DHA激酶(EF4)。

[0019] 3.1定义

[0020] 如本文所用，术语“非天然存在”在提及本文中提供的微生物生物体或微生物使用时意图指所述微生物生物体具有至少一个在所提及物种的天然存在的菌株，包括所提及物种的野生型菌株中通常未发现的遗传改变。遗传改变包括例如引入编码代谢多肽的可表达的核酸的修饰、其它核酸添加、核酸缺失和/或微生物生物体遗传物质的其它功能性破坏。此类修饰包括例如所提及物种的异源、同源或异源与同源多肽的编码区域和其功能片段。
其它修饰包括例如其中修饰改变基因或操纵子的表达的非编码调节区域。例示性代谢多肽包括在BDO或4-HB生物合成途径内的酶或蛋白质。

[0021] 代谢修饰是指从天然存在的状态改变的生化反应。因此，NNOMO可以具有对编码代谢多肽或其功能片段的核酸的遗传修饰。本文公开例示性代谢修饰。

[0022] 如本文所用，术语“分离”在提及微生物生物体使用时意图指实质上不含至少一种如所提及微生物生物体天然发现的组分的生物体。所述术语包括从自然环境下发现其时的一些或所有组分去除的微生物生物体。所述术语还包括从非天然存在的环境下发现所述微生物生物体时的一些或所有组分去除的微生物生物体。因此，分离的微生物生物体部分或完全地与天然发现其时或其在非天然存在的环境中生长、储存或存在时的其它物质分离。分离的微生物生物体的特定实例包括部分纯的微生物、实质上纯的微生物和在非天然存在的介质中培养的微生物。

[0023] 如本文所用，术语“微生物(microbial)”、“微生物生物体”或“微生物(microorganism)”意图指包括在古生菌、细菌或真核生物的领域内的呈显微细胞形式存在的任何生物体。因此，所述术语意图涵盖具有显微尺寸的原核或真核细胞或生物体，并且包括所有物种的细菌、古生菌和真细菌以及真核微生物，例如酵母和真菌。所述术语还包括任何物种的细胞培养物，其可以培养用于产生生物化学物质。

[0024] 如本文所用，术语“CoA”或“辅酶A”意图指存在为许多酶(主酶)形成活性酶系统的活性所需的有机辅因子或辅基(酶的非蛋白质部分)。辅酶A在某些缩合酶中起作用，在乙酰基或其它酰基转移和脂肪酸合成与氧化、丙酮酸氧化和其它乙酰化中起作用。

[0025] 如本文所用，术语“实质上厌氧”在提及培养物或生长条件使用时意图指对于液体介质中溶解氧，氧的量少于饱和的约10％。所述术语还意图包括维持气氛少于约1％氧气的液体或固体培养基的密封腔室。

[0026] 如本文所用，术语“基因破坏”或其语法上的同等物意图指使编码的基因产物无活性或减弱的遗传改变。所述遗传改变可以是例如整个基因的缺失、转录或转译所需的调节序列的缺失、产生截短基因产物的一部分基因的缺失或通过使编码的基因产物失活或减弱的各种突变策略的任一者。基因破坏的一种特别有用的方法是完整的基因缺失，因为其减少或消除了本文中提供的NNOMO中遗传回复的发生。基因破坏的表型作用可以是无效突变，其可以由许多类型的突变，包括失活点突变、整个基因缺失和染色体区段或整个染色体缺失而引起。特定的反义核酸化合物和酶抑制剂(例如抗生素)也可以产生无效突变表型，因此相当于基因破坏。

[0027] 如本文所用，术语“生长偶合”在提及生物化学产物产生使用时意图指在微生物的生长期期间产生所提及生物化学产物的生物合成。在一个具体实施例中，生长偶合的产生可能是专性的，意指所提及生物化学物质的生物合成是在微生物的生长期期间产生的专性产物。术语“生长偶合”在提及生物化学物质的消耗使用时意图指在微生物的生长期期间消耗所提及生物化学物质。

[0028] 如本文所用，术语“减弱”或其语法上的同等物意图指削弱、减少或降低酶或蛋白质的活性或量。如果减弱引起活性或量降到既定途径发挥作用所需要的临界水平之下，那么减弱酶或蛋白质的活性或量可以模拟完整的破坏。然而，模拟一种途径完整的破坏的酶或蛋白质的活性或量减弱可以仍然足够另一个途径继续发挥作用。举例来说，内源性酶或蛋白质的减弱可以足够模拟相同酶或蛋白质产生脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸产物的完整的破坏，但酶或蛋白质的剩余活性或量可以仍然足够维持其它途径，例如对主体微生物生物体生存、复制或生长来说关键的途径。酶或蛋白质的减弱也可以是以足够增加脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的产率但不一定模拟酶或蛋白质的完整的破坏的量削弱、减少或降低酶或蛋白质的活性或量。

[0029] “外源性”在用于本文中时意图指所提及分子或所提及活性引入宿主微生物生物体中。分子可以例如通过将编码核酸引入宿主遗传物质中，例如通过整合到宿主染色体中或作为例如质体等非染色体遗传物质来引入。因此，所述术语在提及编码核酸的表达使用时是指编码核酸以可表达的形式引入微生物生物体中。当提及生物合成活性使用时，所述术语是指引入宿主提及生物体中的活性。来源可以是例如在引入宿主微生物生物体中后表达所提及活性的同源或异源编码核酸。因此，术语“内源性”是指存在于宿主中的所提及分子或活性。类似地，所述术语在提及编码核酸的表达使用时是指微生物生物体内含有的编码核酸的表达。术语“异源”是指分子或活性来源于除所提及物种以外的来源，而“同源”是指分子或活性来源于宿主微生物生物体。因此，编码核酸的外源性表达可以利用异源或同源编码核酸任一者或两者。

[0030] 应了解当超过一种外源性核酸包括在微生物生物体中时，超过一种外源性核酸是指如以上所讨论的所提及编码核酸或生物合成活性。进一步了解，如本文所公开，此类超过一种外源性核酸可以引入宿主微生物生物体中分开的核酸分子上、多顺反子性核酸分子上或其组合，并且仍然被认为是超过一种外源性核酸。举例来说，如本文所公开，微生物生物体可以进行工程化，以表达两种或两种以上编码所希望途径的酶或蛋白质的外源性核酸。在编码所希望活性的两种外源性核酸引入宿主微生物生物体中的情况下，应了解两种外源性核酸可以作为单一核酸引入在例如单一质体上、分开的质体上，可以整合到宿主染色体中单一位点或多个位点上，并且仍然被认为是两种外源性核酸。类似地，应了解超过两种外源性核酸可以呈任何所希望的组合，引入在例如单一质体上、分开的质体上，可以整合到宿主染色体中单一位点或多个位点上，并且仍然被认为是两种或两种以上外源性核酸，例如三种外源性核酸。因此，所提及外源性核酸或生物合成活性的数目是指编码核酸的数目，或生物合成活性的数目，而非引入宿主生物体中的分开核酸的数目。

[0031] 本文中提供的NNOMO可以含有稳定的遗传改变，其是指可以培养超过五代而没有改变损失的微生物。一般来说，稳定的遗传改变包括持续超过10代的修饰，特别是稳定修饰将持续超过约25代，并且更特别是稳定的遗传修饰将超过50代，包括无限期地。

[0032] 本领域的技术人员将了解包括本文中示例的代谢修饰在内的遗传改变是关于例如大肠杆菌等适合的宿主生物体和其对应的代谢反应或适合于所希望遗传物质(例如所
希望代谢途径的基因)的原始生物体来描述的。然而，在多种生物体的完整基因组测序和基因组领域中高水平的技能下，本领域的技术人员将能够容易地应用本文中提供的传授内容和指导于基本上所有其它生物体。举例来说，本文中示例的大肠杆菌代谢改变可以通过并入来自除所提及物种以外的物种的相同或类似编码核酸而容易地应用于其它物种。此类遗传改变包括例如一般说来物种同源物的遗传改变，和具体地说，直系同源、旁系同源或非直系同源基因置换。

[0033] 直系同源物是通过垂直传递而相关并且负责不同生物体中实质上相同或一致的功能的基因。举例来说，小鼠环氧化物水解酶和人类环氧化物水解酶可以视为环氧化物水解的生物功能的直系同源物。当例如基因共享足够指示其是同源的量的序列类似性或通
过从共同祖先进化而相关时，其是通过垂直传递而相关。如果在无法鉴别主要序列类似性的程度上，基因共享足够指示其从共同祖先进化而来的量的三维结构而不一定是序列类似性，那么基因也可以视为直系同源物。直系同源的基因可以编码具有约25％到100％氨基酸序列一致性的序列类似性的蛋白质。如果编码氨基酸类似性小于25％的蛋白质的基因的三维结构也展示类似性，那么其也可以被视为通过垂直传递产生。包括组织血纤维蛋白溶酶原活化剂和弹性蛋白酶在内的酶的丝氨酸蛋白酶家族的成员被认为从共同祖先通过垂
直传递而产生。

[0034] 直系同源物包括通过例如进化，结构或总的活性已经有差异的基因或其编码基因产物。举例来说，在一种物种编码显示两种功能的基因产物并且此类功能已经在第二物种中分成不同基因的情况下，三种基因和其对应产物视为直系同源物。对于生物化学产物的产生，本领域的技术人员将了解，将选择具有待引入或破坏的代谢活性的直系同源基因用于构筑NNOMO。显示可分离活性的直系同源物的一个实例是不同活性已经在两种或两种以上物种之间或单一物种内分成不同的基因产物的情况。一个特定实例是弹性蛋白酶蛋白水解作用与血纤维蛋白溶酶原蛋白水解作用两种类型丝氨酸蛋白酶活性分成如血纤维蛋白溶酶原活化剂和弹性蛋白酶等不同分子。第二实例是支原体5'-3核酸外切酶和果蝇DNA
聚合酶III活性的分离。来自第一物种的DNA聚合酶可以视为核酸外切酶或来自第二物种
的聚合酶任一者或两者的直系同源，反之亦然。

[0035] 相比之下，旁系同源物是通过例如复制、接着进化趋异而相关的同源物并且具有类似或共同而不一致的功能。旁系同源物可以起源于或来源于例如相同的物种或不同的物种。举例来说，微粒体环氧化物水解酶(环氧化物水解酶I)和可溶性环氧化物水解酶(环氧化物水解酶II)因为表示从共同祖先共进化而来的催化不同反应并在相同的物种中具
有不同功能的两种不同酶，而可以被视为旁系同源物。旁系同源物是来自相同物种，具有表明其是同源的彼此显著序列类似性的蛋白质，或通过从共同祖先共进化而相关。旁系同源蛋白质家族群组包括HipA同源物、荧光素酶基因、肽酶等等。

[0036] 非直系同源基因置换是可以替换不同物种中所提及基因功能的来自一种物种的非直系同源基因。替换包括例如与不同物种中所提及的功能相比，能够在起源物种中执行实质上相同或类似的功能。虽然一般来说，非直系同源基因置换将可鉴别为在结构上与编码所提及功能的已知基因相关，但是在结构上更少相关但功能上类似的基因和其对应基因产物将仍然属于所述术语在用于本文中时的含义内。功能类似性需要例如与编码设法替换的功能的基因相比，非直系同源基因产物的活性位点或结合区域中至少一些结构类似性。
因此，非直系同源基因包括例如旁系同源物或无关的基因。

[0037] 因此，在鉴别和构筑本文中提供的具有BDO或4-HB生物合成能力的NNOMO方面，本领域的技术人员将了解在本文中提供的传授内容和指导应用于具体的物种下，代谢修饰的鉴别可以包括直系同源物的鉴别和包括或失活。在旁系同源物和/或非直系同源基因置换存在于编码催化类似或实质上类似的代谢反应的酶的所提及微生物的程度上，本领域的技术人员也可以利用这些进化相关的基因。

[0038] 直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置换可以通过本领域的技术人员众所周知的方法测定。举例来说，两种多肽的核酸或氨基酸序列的检查将揭露比较序列之间的序列一致性和类似性。基于此类类似性，本领域的技术人员可以确定类似性是否足够地高以指示蛋白质通过从共同祖先进化而相关。本领域的技术人员众所周知的算法，例如
Align、BLAST、Clustal W等等，比较和确定原始序列类似性或一致性，以及确定可以分配权重或评分的序列中间隙的存在或显著性。此类算法也是本领域中已知的并且类似地可应
用于确定核苷酸序列类似性或一致性。基于众所周知的用于计算统计类似性或发现随机
多肽中类似匹配的可能性和所确定匹配的显著性的方法，计算足够确定相关性的类似性的参数。必要时，两种或两种以上序列的电脑比较也可以通过本领域的技术人员视觉上最佳化。相关基因产物或蛋白质可以预测具有高类似性，例如25％到100％序列一致性。如果扫描足够尺寸的数据库，那么无关的蛋白质的一致性可以基本上与预期碰巧发生相同(约
5％)。5％与24％之间的序列可能或可能不表示足够断定比较序列是相关的同源性。既定数据集尺寸下确定此类匹配的显著性的其它统计分析可以进行以确定这些序列的相关性。

[0039] 使用BLAST算法用于确定两种或两种以上序列的相关性的例示性参数例如可以如下阐述。简单地说，可以使用BLASTP 2.0.8版本(1999年1月5日)及以下参数执行氨
基酸序列比对：矩阵：0BLOSUM62；间隙开口：11；间隙延伸：1；x_减少：50；预期：10.0；字长：3；过滤器：开。可以使用BLASTN 2.0.6版本(1998年9月16日)及以下参数执行核
酸序列比对：匹配：1；错配：-2；间隙开口：5；间隙延伸：2；x_减少：50；预期：10.0；字长：
11；过滤器：关。本领域的技术人员将知道可以对以上参数进行什么修饰来例如增加或减少比较的严格性和确定两种或两种以上序列的相关性。

[0040] 3.2利用由甲醇代谢产生的还原当量的微生物生物体

[0041] 本文中提供了经工程化以提高可以用于产生产物分子的还原当量的可用性的MMP。例示性产物分子包括不限于BDO和/或4HB，不过在本文中提供的传授内容和指导下，本领域的技术人员将认识到，产生中利用还原当量的任何产物分子都可以显示增强的通过本文中提供的生物合成途径的产生。

[0042] 甲醇是一种相对廉价的有机原料，其可以经由催化从合成气组分CO和H2获得。甲醇可以用作还原当量的来源以增加产物分子从碳水化合物的摩尔产率。

[0043] BDO是用于产生高性能聚合物、溶剂和精细化学品的有用化学品。其是产生例如四氢呋喃(THF)和γ-丁内酯(GBL)等其它高价值化学品的基础。价值链包含包括以下的三个主要部分：(1)聚合物、(2)THF衍生物和(3)GBL衍生物。在聚合物的情况下，BDO是用于产生聚对苯二甲酸亚丁酯(PBT)的共聚单体。PBT是一种用于汽车、电气、水系和小型仪器应用的中等性能的工程化热塑塑料。转变成THF和随后转变成聚四亚甲基醚二醇(PTMEG)
提供了一种用于制造例如 纤维等弹力纤维产物的中间物。PTMEG也与BDO组合产
生专门聚酯醚(COPE)。COPE是具有极好的机械特性和油/环境耐性的高模数弹性体，从而允许它们在高和低的温度极限下操作。PTMEG和BDO也制造在标准热塑塑料挤压、锻造和模制设备上加工的热塑性聚氨基甲酸酯，并且特征为其突出的韧性和抗磨蚀性。由BDO产生的GBL提供了制造吡咯烷酮以及用于农用化学品市场的原料。吡咯烷酮用作用于增加包括例如电子行业和药物生产中的使用的萃取工艺的高性能溶剂。因此，本文中提供了根据本文中描述的方法产生的生物来源的BDO，和包含生物来源的BDO或使用生物来源的BDO获得的生物基产物。生物基产物可以包含聚合物、THF或THF衍生物或GBL或GBL衍生物；或生
物基产物可以包含聚合物、塑料、弹性纤维、聚氨基甲酸酯、聚酯、聚羟基烷酸酯、聚-4-HB、聚-4-HB的共聚物、聚(四亚甲基醚)二醇、聚氨基甲酸酯-聚脲共聚物、弹力纤维、弹性
烷、LycraTM或尼龙；或生物基产物可以包含聚对苯二甲酸亚丁酯(PBT)聚合物；或生物基产物可以包含PBT聚合物，其包含树脂、纤维、珠粒、颗粒、球粒、芯片、塑料、聚酯、热塑性聚酯、模制品、射出成型物品、射出成型部件、汽车零件、挤压树脂、电器零件和外壳，任选地其中生物基产物经加强或填充，例如玻璃填充或矿物质填充；或生物基产物是THF或THF衍生物，并且THF衍生物是聚四亚甲基醚二醇(PTMEG)、聚酯醚(COPE)或热塑性聚氨基甲酸酯或纤维；或生物基产物可以包含GBL或GBL衍生物并且GBL衍生物是吡咯烷酮。生物基产物
可以包含至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％生物来源的BDO。
生物基产物可以包含一部分所述生物来源的BDO作为重复单元。生物基产物可以是通过模制生物基产物而获得的模制产物。

[0044] BDO通过两条主要的石化途径以及工业操作中几条额外的途径产生。一条途径包含乙炔与甲醛反应，接着氢化。近年来，已经引入了包含丁烷或丁二烯氧化成顺丁烯二酸酐、接着氢化的BDO工艺。BDO几乎专门地作为中间物用来合成其它化学品和聚合物。因此，需要发展有效地产生工业量的BDO的方法。

[0045] 在许多工程化途径中，基于碳水化合物原料实现最大产物产率被不充足的还原当量或还原当量损失到副产物中所妨碍。甲醇是一种相对廉价的有机原料，其可以用于通过采用如图1中所示的一或多种甲醇代谢酶产生还原当量。通过一或多种MMP代谢甲醇所产生的还原当量接着可以用以供应葡萄糖到BDO产生途径，例如如图2中所示。

[0046] 每C mol合成还原发酵产物(例如BDO和4-HB)的微生物细胞底物的产物产率受碳水化合物原料中不充足的还原当量限制。还原当量或电子可以使用图1中描述的一或多种酶从甲醇取出。接着还原当量传到受体，例如氧化的铁氧化还原蛋白、氧化的苯醌、氧化的细胞色素、NAD(P)+、水或过氧化氢，以分别形成还原的铁氧化还原蛋白、还原的苯醌、还原的细胞色素、NAD(P)H或H2或水。还原的铁氧化还原蛋白、还原的苯醌和NAD(P)H特别适用，因为其可以用作各种伍德-永达尔途径(Wood-Ljungdahl pathway)、还原TCA循环或产物途径酶的氧化还原载剂。

[0047] 展示了来自甲醇的额外的氧化还原可用性如何可以提高还原产物(例如丁二酸酯、4-HB和BDO)的产率的特定实例。

[0048] 经由图2中所示的补充有氧化TCA循环(例如柠檬酸合酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶)反应的途径的BDO的最大理论产率是1.09mol/mol。

[0049] 1C6H12O6→1.09C4H10O2+1.64CO2+0.55H2O

[0050] 当糖和甲醇两种原料可用时，可以利用甲醇通过采用图1中所示的一或多种酶产生还原当量。可以利用从甲醇产生的还原当量来供应葡萄糖到BDO产生途径，例如如图2中所示。理论上，葡萄糖中的所有碳将守恒，因此引起在需氧或厌氧条件下每摩尔葡萄糖2mol BDO下从葡萄糖产生BDO的最大理论产量，如图2中所示：

[0051] 10CH3OH+3C6H12O6＝6C4H10O2+8H2O+4CO2

[0052] 以类似方式，使用图1和2中所示的反应，丁二酸酯和4-HB的最大理论产量可以到达每摩尔葡萄糖2mol。

[0053] C6H12O6+0.667CH3OH+1.333CO2→2C4H6O4+1.333H2O

[0054] C6H12O6+2CH3OH→2C4H8O3+2H2O

[0055] 在第一方面，本文中提供了一种具有MMP的NNOMO，其中所述生物体包含至少一种编码MMPE的外源性核酸。在某些实施例中，MMPE以足够增强甲醇存在下还原当量的可用性的量表达。在其它实施例中，MMPE以足够将甲醇转变成甲醛的量表达。在某些实施例中，MMP包含一或多种选自由以下各者组成的群组的酶：EM1；EM2；EM3；EM4；EM5；EM6；EM15；EM16；EM8；EM9；EM10；EM11；EM12；EM13；和EM14。此类生物体有利地允许还原当量的产生，还原当量接着可以为生物体所用，用于使用本文中提供的任一个途径产生BDO或4-HB。

[0056] 在某些实施例中，MMP包含1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O，或1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N和1O其任何组合，其中1A是EM1；1B是EM2；1C是EM3；1D是EM4；1E是EM5；1F是EM6；1G是EM15；1H是EM16；1I是EM8；1J是EM9；1K是EM10；1L是EM11；1M是EM12；1N是EM13；并且1O是EM14。在一些实施例中，1K是自发的。在其它实施例中，1K是EM10。在一些实施例中，1M是自发的。在其它实施例中，
1M是EM12。

[0057] 在一个实施例中，MMP包含1A。在另一个实施例中，MMP包含1B。在另一个实施例中，MMP包含1C。在又一个实施例中，MMP包含1D。在一个实施例中，MMP包含1E。在另一个实施例中，MMP包含1F。在另一个实施例中，MMP包含1G。在又一个实施例中，MMP包含1H。在一个实施例中，MMP包含1I。在另一个实施例中，MMP包含1J。在另一个实施例中，MMP包含1K。在又一个实施例中，MMP包含1L。在又一个实施例中，MMP包含1M。在另一个实施例中，MMP包含1N。在又一个实施例中，MMP包含1O。还涵盖1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、
1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N和1O两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种或十五种MMPE的任何组合。

[0058] 在一些实施例中，MMP是图1中描绘的MMP。

[0059] 在一个方面，本文中提供了一种具有MMP的NNOMO，其中所述生物体包含至少一种编码MMPE的外源性核酸，所述外源性核酸以足够增强甲醇存在下还原当量的可用性的量表达，其中所述MMP包含：(i)1A和1B；(ii)1J；或(iii)1J和1K。在一个实施例中，MMP包含1A和1B。在另一个实施例中，MMP包含1J。在一个实施例中，MMP包含1J和1K。在某
些实施例中，MMP包含1A、1B、1C、1D和1E。在一些实施例中，MMP包含1A、1B、1C、1D和1F。
在一些实施例中，MMP包含1J、1C、1D和1E。在一个实施例中，MMP包含1J、1C、1D和1F。在另一个实施例中，MMP包含1J和1L。在又一个实施例中，MMP包含1J、1M、1N和1O。在某些实施例中，MMP包含1J、1N和1O。在一些实施例中，MMP包含1J、1K、1C、1D和1E。在一个实施例中，MMP包含1J、1K、1C、1D和1F。在一些实施例中，1K是自发的。在其它实施例中，1K是EM10。在一些实施例中，1M是自发的。在其它实施例中，1M是EM12。

[0060] 在某些实施例中，MMP包含1I。在某些实施例中，MMP包含1A、1B、1C、1D、1E和1I。在一些实施例中，MMP包含1A、1B、1C、1D、1F和1I。在一些实施例中，MMP包含1J、1C、1D、
1E和1I。在一个实施例中，MMP包含1J、1C、1D、1F和1I。在另一个实施例中，MMP包含1J、
1L和1I。在又一个实施例中，MMP包含1J、1M、1N、1O和1I。在某些实施例中，MMP包含1J、
1N、1O和1I。在一些实施例中，MMP包含1J、1K、1C、1D、1E和1I。在一个实施例中，MMP包含1J、1K、1C、1D、1F和1I。在一些实施例中，1K是自发的。在其它实施例中，1K是EM10。在一些实施例中，1M是自发的。在其它实施例中，1M是EM12。

[0061] 在某些实施例中，MMP包含1G。在某些实施例中，MMP包含1A、1B、1C、1D、1E和1G。在一些实施例中，MMP包含1A、1B、1C、1D、1F和1G。在一些实施例中，MMP包含1J、1C、1D、
1E和1G。在一个实施例中，MMP包含1J、1C、1D、1F和1G。在另一个实施例中，MMP包含1J、
1L和1G。在又一个实施例中，MMP包含1J、1M、1N、1O和1G。在某些实施例中，MMP包含1J、
1N、1O和1G。在一些实施例中，MMP包含1J、1K、1C、1D、1E和1G。在一个实施例中，MMP包含1J、1K、1C、1D、1F和1G。在一些实施例中，1K是自发的。在其它实施例中，1K是EM10。在一些实施例中，1M是自发的。在其它实施例中，1M是EM12。

[0062] 在某些实施例中，MMP包含1G和1H。在某些实施例中，MMP包含1A、1B、1C、1D、1E、1G和1H。在一些实施例中，MMP包含1A、1B、1C、1D、1F、1G和1H。在一些实施例中，MMP包含1J、1C、1D、1E、1G和1H。在一个实施例中，MMP包含1J、1C、1D、1F、1G和1H。在另一个实施例中，MMP包含1J、1L、1G和1H。在又一个实施例中，MMP包含1J、1M、1N、1O、1G和1H。在某些实施例中，MMP包含1J、1N、1O、1G和1H。在一些实施例中，MMP包含1J、1K、1C、1D、1E、
1G和1H。在一个实施例中，MMP包含1J、1K、1C、1D、1F、1G和1H。在一些实施例中，1K是自发的。在其它实施例中，1K是EM10。在一些实施例中，1M是自发的。在其它实施例中，1M是EM12。

[0063] 在某些实施例中，5-羟基甲基谷胱甘肽从甲醛的形成是自发的(参见例如图1步骤M)。在一些实施例中，5-羟基甲基谷胱甘肽从甲醛的形成是由EM12催化的(参见例如图
1步骤M)。在某些实施例中，亚甲基-THF从甲醛的形成是自发的(参见例如图1步骤K)。
在某些实施例中，亚甲基-THF从甲醛的形成是由EM10催化的(参见例如图1步骤K)。

[0064] 在某些实施例中，生物体包含两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性核酸，每一种都编码MMPE。在某些实施例中，生物体包含两种外源性核酸，每一种都编码MMPE。在某些实施例中，生物体包含三种外源性核酸，每一种都编码MMPE。在某些实施例中，生物体包含四种外源性核酸，每一种都编码MMPE。在某些实施例中，生物体包含五种外源性核酸，每一种都编码MMPE。在某些实施例中，生物体包含六种外源性核酸，每一种都编码MMPE。在某些实施例中，生物体包含七种外源性核酸，每一种都编码MMPE。

[0065] 包含MMP并经工程化以包含MMPE(例如本文中提供的MMPE)的任何非天然存在的真核生物体可以经工程化以进一步包含一或多种BDOP酶(BDOPE)。

[0066] 在某些实施例中，NNOMO进一步包含BDOP，其中所述生物体包含至少一种编码BDOPE的外源性核酸，所述外源性核酸以足够产生BDO的量表达。在某些实施例中，BDOPE选自由以下各者组成的群组：EB1或EB2A；EB3；EB4；EB5；EB6；EB7；EB8；EB9；EB10；EB11或EB12；EB13；EB14和EB15。

[0067] 在一些实施例中，具有BDOP的NNOMO包括一组BDOPE。

[0068] 用于工程化从丁二酸酯和丁二酰基-CoA到例如BDO等各种产物的途径到微生物中的酶、基因和方法现为本领域中已知(参见例如美国公开案第2011/0201089号)。一
组BDOPE代表了一群可以将丁二酸酯转变成BDO的酶，如图2中所示。如本文中公开的从
MMP获得的其它还原当量在利用基于碳水化合物的原料时提高了所有这些产物的产率。举例来说，BDO可以从丁二酰基-CoA，经由先前公开的途径(参见例如布尔克(Burk)等人的
WO 2008/115840)产生。用于丁二酰基-CoA转变成BDO的示例性酶包括EB3(图2步骤
B)、EB4(图2步骤C)、EB5(图2步骤D)、EB6(图2步骤E)、EB7(图2步骤F)、EB8(图2
步骤G)、EB10(图1，步骤I)、EB11(图2步骤J)、EB12(图2步骤J)、EB14(图2步骤L)、
EB13(图2步骤K)和EB15(图2步骤M)。EB9(图2步骤H)可以另外适用于丁二酸酯直接
转变成BDOP中间物丁二酸半醛。

[0069] 在另一个方面，本文中提供了一种NNOMO，其包含(1)MMP，其中所述生物体包含至少一种编码MMPE的外源性核酸，所述外源性核酸呈足够提高甲醇存在下还原当量的可用性的量；和(2)BDOP，其包含至少一种编码BDOPE的外源性核酸，所述外源性核酸以足够产生BDO的量表达。在一个实施例中，至少一种编码MMPE的外源性核酸提高了甲醇存在下还原当量的可用性，呈足够增加由非天然的微生物生物体产生的BDO量的量。在一些实施例中，MMP包含上文或本文中别处所述的MMPE的各种组合中的任一者。

[0070] 在某些实施例中，(1)MMP包含：1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O，或1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O其任何组合，其中1A是EM1；1B是EM2；1C是EM3；1D是EM4；1E是EM5；1F是EM6；1G是EM15；1H是EM16；1I是EM8；1J
是EM9；1K是自发的或EM10；1L是EM11；1M是自发的或EM12；1N是EM13并且1O是EM14；
并且(2)BDOP包含2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2H、2I、2J、2K、2L或2M，或2A、2B、2C、2D、2E、2F、
2G、2H、2I、2J、2K、2L或2M的任何组合，其中2A是EB1或EB2A；2B是EB3；2C是EB4；2D是EB5；2E是EB6；2F是EB7；2G是EB8；2H是EB9；2I是EB10；2J是EB11或EB12；2K是EB13；
2L是EB14；并且2M是EB15。在一些实施例中，2A是EB1。在一些实施例中，2A是EB2A。在一些实施例中，2J是EB11。在一些实施例中，2J是EB12。在一些实施例中，1K是自发的。
在其它实施例中，1K是EM10。在一些实施例中，1M是自发的。在其它实施例中，1M是EM12。
在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0071] 在一个实施例中，BDOP包含2A。在另一个实施例中，BDOP包含2B。在一个实施例中，BDOP包含2C。在另一个实施例中，BDOP包含2D。在一个实施例中，BDOP包含2E。在又一个实施例中，BDOP包含2F。在一些实施例中，BDOP包含2G。在其它实施例中，BDOP包含2H。在另一个实施例中，BDOP包含2I。在一个实施例中，BDOP包含2J。在一个实施例中，BDOP包含2K。在另一个实施例中，BDOP包含2L。在一个实施例中，BDOP包含2M。还涵盖
2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2H、2I、2J、2K、2L和2M两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种或十三种BDOPE的任何组合。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0072] 在一些实施例中，MMP是图1中描绘的MMP并且BDOP是图2中描绘的BDOP。在某些实施例中，从甲醛形成5-羟基甲基谷胱甘肽是自发的(参见例如图1步骤M)。在一些实
施例中，从甲醛形成5-羟基甲基谷胱甘肽由EM 12催化(参见例如图1步骤M)。在某些实
施例中，从甲醛形成亚甲基-THF是自发的(参见例如图1步骤K)。在某些实施例中，从甲
醛形成亚甲基-THF由EM 10催化(参见例如图1步骤K)。

[0073] 根据图2将丁二酸酯转变成BDO的BDOPE的例示性组包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G；2A、2B、2C、2J、2F和2G；2A、2B、2C、2J和2M；2A、2B、2C、2D、2E和2M；2A、2B、2C、2K和2G；
2A、2B、2C、2D、2L和2G；2A、2I、2D、2E、2F和2G；2A、2I、2D、2E和2M；2A、2I、2J、2F和2G；2A、
2I、2J和2M；2A、2I、2K和2G；2A、2I、2D、2L和2G；2H、2C、2D、2E、2F和2G；2H、2C、2J、2F和
2G；2H、2C、2J和2M；2H、2C、2D、2E和2M；2H、2C、2K和2G；以及2H、2C、2D、2L和2G。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0074] 在一个实施例中，BDOP包含2B、2C、2D、2E、2F和2G。在另一个实施例中，BDOP包含2B、2C、2J、2F和2G。在另一个实施例中，BDOP包含2B、2C、2J和2M。在其它实施例中，BDOP包含2B、2C、2D、2E和2M。在一个实施例中，BDOP包含2B、2C、2K和2G。在另一个实施例中，BDOP包含2B、2C、2D、2L和2G。在另一个实施例中，BDOP包含2I、2D、2E、2F和2G。在又一个实施例中，BDOP包含2I、2D、2E和2M。在一个实施例中，BDOP包含2I、2J、2F和2G。在另一个实施例中，BDOP包含2I、2J和2M。在又一个实施例中，BDOP包含2I、2K和2G。在一个实施例中，BDOP包含2I、2D、2L和2G。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0075] 在某些实施例中，BDOP进一步包含2A。在一个实施例中，BDOP包含2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在另一个实施例中，BDOP包含2A、2B、2C、2J、2F和2G。在另一个实施例中，BDOP包含2A、2B、2C、2J和2M。在其它实施例中，BDOP包含2A、2B、2C、2D、2E和2M。在一个实施例中，BDOP包含2A、2B、2C、2K和2G。在另一个实施例中，BDOP包含2A、2B、2C、2D、2L和
2G。在另一个实施例中，BDOP包含2A、2I、2D、2E、2F和2G。在又一个实施例中，BDOP包含
2A、2I、2D、2E和2M。在一个实施例中，BDOP包含2A、2I、2J、2F和2G。在另一个实施例中，BDOP包含2A、2I、2J和2M。在又一个实施例中，BDOP包含2A、2I、2K和2G。在一个实施例中，BDOP包含2A、2I、2D、2L和2G。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0076] 在另一个实施例中，BDOP包含2H、2C、2D、2E、2F和2G。在另一个实施例中，BDOP包含2H、2C、2J、2F和2G。在又一个实施例中，BDOP包含2H、2C、2J和2M。在一个实施例中，BDOP包含2H、2C、2D、2E和2M。在另一个实施例中，BDOP包含2H、2C、2K和2G。在又一个实施例中，BDOP包含和2H、2C、2D、2L和2G。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0077] 在一个实施例中，(1)MMP包含：(i)1A和1B；(ii)1J；或(iii)1J和1K；并且(2)BDOP包含(a)2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2B、2C、2J、2F和2G；(c)2B、2C、2J和2M；(d)2B、2C、2D、2E和2M；(e)2B、2C、2K和2G；(f)2B、2C、2D、2L和2G；(g)2I、2D、2E、2F和2G；(h)2I、2D、
2E和2M；(i)2I、2J、2F和2G；(j)2I、2J和2M；(k)2I、2K和2G；或(l)2I、2D、2L和2G。在一些实施例中，1K是自发的。在其它实施例中，1K是EM10。在一些实施例中，1M是自发的。在其它实施例中，1M是EM12。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0078] 在另一个实施例中，(1)MMP包含：(i)1A和1B；(ii)1J；或(iii)1J和1K；并且(2)BDOP包含(a)2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2A、2B、2C、2J、2F和2G；(c)2A、2B、2C、2J和2M；(d)2A、2B、2C、2D、2E和2M；(e)2A、2B、2C、2K和2G；(f)2A、2B、2C、2D、2L和2G；(g)2A、2I、2D、
2E、2F和2G；(h)2A、2I、2D、2E和2M；(i)2A、2I、2J、2F和2G；(j)2A、2I、2J和2M；(k)2A、2I、
2K和2G；(l)2A、2I、2D、2L和2G；(m)2H、2C、2D、2E、2F和2G；(n)2H、2C、2J、2F和2G；(o)2H、
2C、2J和2M；(p)2H、2C、2D、2E和2M；(q)2H、2C、2K和2G；或(r)2H、2C、2D、2L和2G。在一些实施例中，1K是自发的。在其它实施例中，1K是EM10。在一些实施例中，1M是自发的。在其它实施例中，1M是EM12。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0079] 在一个实施例中，(1)MMP包含1A和1B；并且(2)BDOP包含(a)2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2B、2C、2J、2F和2G；(c)2B、2C、2J和2M；(d)2B、2C、2D、2E和2M；(e)2B、2C、2K和2G；(f)2B、2C、2D、2L和2G；(g)2I、2D、2E、2F和2G；(h)2I、2D、2E和2M；(i)2I、2J、2F和2G；
(j)2I、2J和2M；(k)2I、2K和2G；或(l)2I、2D、2L和2G。在一些实施例中，1K是自发的。在其它实施例中，1K是EM10。在一些实施例中，1M是自发的。在其它实施例中，1M是EM12。
在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0080] 在另一个实施例中，(1)MMP包含1A和1B；并且(2)BDOP包含(a)2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2A、2B、2C、2J、2F和2G；(c)2A、2B、2C、2J和2M；(d)2A、2B、2C、2D、2E和2M；
(e)2A、2B、2C、2K和2G；(f)2A、2B、2C、2D、2L和2G；(g)2A、2I、2D、2E、2F和2G；(h)2A、2I、2D、
2E和2M；(i)2A、2I、2J、2F和2G；(j)2A、2I、2J和2M；(k)2A、2I、2K和2G；(l)2A、2I、2D、2L和2G；(m)2H、2C、2D、2E、2F和2G；(n)2H、2C、2J、2F和2G；(o)2H、2C、2J和2M；(p)2H、2C、2D、
2E和2M；(q)2H、2C、2K和2G；或(r)2H、2C、2D、2L和2G。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0081] 在一个实施例中，(1)MMP包含1J；并且(2)BDOP包含(a)2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2B、2C、2J、2F 和 2G；(c)2B、2C、2J 和 2M；(d)2B、2C、2D、2E 和 2M；(e)2B、2C、2K 和 2G；
(f)2B、2C、2D、2L 和 2G；(g)2I、2D、2E、2F 和 2G；(h)2I、2D、2E 和 2M；(i)2I、2J、2F 和 2G；
(j)2I、2J和2M；(k)2I、2K和2G；或(l)2I、2D、2L和2G。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0082] 在另一个实施例中，(1)MMP包含1J；并且(2)BDOP包含(a)2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2A、2B、2C、2J、2F 和2G；(c)2A、2B、2C、2J和 2M；(d)2A、2B、2C、2D、2E 和2M；(e)2A、
2B、2C、2K和2G；(f)2A、2B、2C、2D、2L和2G；(g)2A、2I、2D、2E、2F和2G；(h)2A、2I、2D、2E和
2M；(i)2A、2I、2J、2F和2G；(j)2A、2I、2J和2M；(k)2A、2I、2K和2G；(l)2A、2I、2D、2L和2G；
(m)2H、2C、2D、2E、2F和2G；(n)2H、2C、2J、2F和2G；(o)2H、2C、2J和2M；(p)2H、2C、2D、2E和
2M；(q)2H、2C、2K和2G；或(r)2H、2C、2D、2L和2G。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0083] 在一个实施例中，(1)MMP包含1J和1K；并且(2)BDOP包含(a)2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2B、2C、2J、2F和2G；(c)2B、2C、2J和2M；(d)2B、2C、2D、2E和2M；(e)2B、2C、2K和2G；(f)2B、2C、2D、2L和2G；(g)2I、2D、2E、2F和2G；(h)2I、2D、2E和2M；(i)2I、2J、2F和2G；
(j)2I、2J和2M；(k)2I、2K和2G；或(l)2I、2D、2L和2G。在一些实施例中，1K是自发的。在其它实施例中，1K是EM10。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0084] 在一个实施例中，(1)MMP包含1J和1K；并且(2)BDOP包含(a)2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2A、2B、2C、2J、2F和2G；(c)2A、2B、2C、2J和2M；(d)2A、2B、2C、2D、2E和2M；(e)2A、2B、2C、2K和2G；(f)2A、2B、2C、2D、2L和2G；(g)2A、2I、2D、2E、2F和2G；(h)2A、2I、2D、2E和
2M；(i)2A、2I、2J、2F和2G；(j)2A、2I、2J和2M；(k)2A、2I、2K和2G；(l)2A、2I、2D、2L和2G；
(m)2H、2C、2D、2E、2F和2G；(n)2H、2C、2J、2F和2G；(o)2H、2C、2J和2M；(p)2H、2C、2D、2E和
2M；(q)2H、2C、2K和2G；或(r)2H、2C、2D、2L和2G。在一些实施例中，1K是自发的。在其它实施例中，1K是EM10。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0085] 在某些实施例中，(1)MMP包含1A、1B、1C、1D和1E；并且(2)BDOP包含(a)2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2B、2C、2J、2F和2G；(c)2B、2C、2J和2M；(d)2B、2C、2D、2E和2M；(e)2B、
2C、2K和2G；(f)2B、2C、2D、2L和2G；(g)2I、2D、2E、2F和2G；(h)2I、2D、2E和2M；(i)2I、2J、
2F和2G；(j)2I、2J和2M；(k)2I、2K和2G；或(l)2I、2D、2L和2G。在某些实施例中，MMP进一步包含1I。在一些实施例中，MMP进一步包含1G。在其它实施例中，MMP进一步包含1G
和1H。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0086] 在某些实施例中，(1)MMP包含1A、1B、1C、1D和1E；并且(2)BDOP包含(a)2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2A、2B、2C、2J、2F和2G；(c)2A、2B、2C、2J和2M；(d)2A、2B、2C、2D、2E和2M；(e)2A、2B、2C、2K和2G；(f)2A、2B、2C、2D、2L和2G；(g)2A、2I、2D、2E、2F和2G；(h)2A、
2I、2D、2E和2M；(i)2A、2I、2J、2F和2G；(j)2A、2I、2J和2M；(k)2A、2I、2K和2G；(l)2A、2I、
2D、2L和2G；(m)2H、2C、2D、2E、2F和2G；(n)2H、2C、2J、2F和2G；(o)2H、2C、2J和2M；(p)2H、
2C、2D、2E和2M；(q)2H、2C、2K和2G；或(r)2H、2C、2D、2L和2G。在某些实施例中，MMP进一步包含1I。在一些实施例中，MMP进一步包含1G。在其它实施例中，MMP进一步包含1G和
1H。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0087] 在一些实施例中，(1)MMP包含1A、1B、1C、1D和1F；并且(2)BDOP包含(a)2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2B、2C、2J、2F和2G；(c)2B、2C、2J和2M；(d)2B、2C、2D、2E和2M；(e)2B、
2C、2K和2G；(f)2B、2C、2D、2L和2G；(g)2I、2D、2E、2F和2G；(h)2I、2D、2E和2M；(i)2I、2J、
2F和2G；(j)2I、2J和2M；(k)2I、2K和2G；或(l)2I、2D、2L和2G。在某些实施例中，MMP进一步包含1I。在一些实施例中，MMP进一步包含IG。在其它实施例中，MMP进一步包含1G
和1H。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0088] 在一些实施例中，(1)MMP包含1A、1B、1C、1D和1F；并且(2)BDOP包含(a)2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2A、2B、2C、2J、2F和2G；(c)2A、2B、2C、2J和2M；(d)2A、2B、2C、2D、2E和2M；(e)2A、2B、2C、2K和2G；(f)2A、2B、2C、2D、2L和2G；(g)2A、2I、2D、2E、2F和2G；(h)2A、
2I、2D、2E和2M；(i)2A、2I、2J、2F和2G；(j)2A、2I、2J和2M；(k)2A、2I、2K和2G；(l)2A、2I、
2D、2L和2G；(m)2H、2C、2D、2E、2F和2G；(n)2H、2C、2J、2F和2G；(o)2H、2C、2J和2M；(p)2H、
2C、2D、2E和2M；(q)2H、2C、2K和2G；或(r)2H、2C、2D、2L和2G。在某些实施例中，MMP进一步包含1I。在一些实施例中，MMP进一步包含IG。在其它实施例中，MMP进一步包含1G和
1H。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0089] 在一些实施例中，(1)MMP包含1J、1C、1D和1E；并且(2)BDOP包含(a)2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2B、2C、2J、2F和2G；(c)2B、2C、2J和2M；(d)2B、2C、2D、2E和2M；(e)2B、2C、
2K和2G；(f)2B、2C、2D、2L和2G；(g)2I、2D、2E、2F和2G；(h)2I、2D、2E和2M；(i)2I、2J、2F和2G；(j)2I、2J和2M；(k)2I、2K和2G；或(l)2I、2D、2L和2G。在某些实施例中，MMP进一步包含1I。在一些实施例中，MMP进一步包含IG。在其它实施例中，MMP进一步包含1G和
1H。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0090] 在一些实施例中，(1)MMP包含1J、1C、1D和1E；并且(2)BDOP包含(a)2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2A、2B、2C、2J、2F和2G；(c)2A、2B、2C、2J和2M；(d)2A、2B、2C、2D、2E和
2M；(e)2A、2B、2C、2K 和2G；(f)2A、2B、2C、2D、2L和 2G；(g)2A、2I、2D、2E、2F 和2G；(h)2A、
2I、2D、2E和2M；(i)2A、2I、2J、2F和2G；(j)2A、2I、2J和2M；(k)2A、2I、2K和2G；(l)2A、2I、
2D、2L和2G；(m)2H、2C、2D、2E、2F和2G；(n)2H、2C、2J、2F和2G；(o)2H、2C、2J和2M；(p)2H、
2C、2D、2E和2M；(q)2H、2C、2K和2G；或(r)2H、2C、2D、2L和2G。在某些实施例中，MMP进一步包含1I。在一些实施例中，MMP进一步包含IG。在其它实施例中，MMP进一步包含1G和
1H。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0091] 在一个实施例中，(1)MMP包含1A、1B和1C；并且(2)BDOP包含(a)2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2B、2C、2J、2F和2G；(c)2B、2C、2J和2M；(d)2B、2C、2D、2E和2M；(e)2B、2C、2K和2G；(f)2B、2C、2D、2L和2G；(g)2I、2D、2E、2F和2G；(h)2I、2D、2E和2M；(i)2I、2J、2F和
2G；(j)2I、2J和2M；(k)2I、2K和2G；或(l)2I、2D、2L和2G。在一个实施例中，2J是EB11。
在另一个实施例中，2J是EB12。

[0092] 在一个实施例中，(1)MMP包含1A、1B和1C；并且(2)BDOP包含(a)2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2A、2B、2C、2J、2F和2G；(c)2A、2B、2C、2J和2M；(d)2A、2B、2C、2D、2E和2M；
(e)2A、2B、2C、2K和2G；(f)2A、2B、2C、2D、2L和2G；(g)2A、2I、2D、2E、2F和2G；(h)2A、2I、2D、
2E和2M；(i)2A、2I、2J、2F和2G；(j)2A、2I、2J和2M；(k)2A、2I、2K和2G；(l)2A、2I、2D、2L和2G；(m)2H、2C、2D、2E、2F和2G；(n)2H、2C、2J、2F和2G；(o)2H、2C、2J和2M；(p)2H、2C、2D、
2E和2M；(q)2H、2C、2K和2G；或(r)2H、2C、2D、2L和2G。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0093] 在又一个实施例中，(1)MMP包含1J、1M和1N；并且(2)BDOP包含(a)2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2B、2C、2J、2F和2G；(c)2B、2C、2J和2M；(d)2B、2C、2D、2E和2M；(e)2B、2C、
2K和2G；(f)2B、2C、2D、2L和2G；(g)2I、2D、2E、2F和2G；(h)2I、2D、2E和2M；(i)2I、2J、2F和2G；(j)2I、2J和2M；(k)2I、2K和2G；或(l)2I、2D、2L和2G。在一些实施例中，1M是自发的。在其它实施例中，1M是EM12。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0094] 在又一个实施例中，(1)MMP包含1J、1M和1N；并且(2)BDOP包含(a)2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2A、2B、2C、2J、2F和2G；(c)2A、2B、2C、2J和2M；(d)2A、2B、2C、2D、2E和2M；
(e)2A、2B、2C、2K和2G；(f)2A、2B、2C、2D、2L和2G；(g)2A、2I、2D、2E、2F和2G；(h)2A、2I、2D、
2E和2M；(i)2A、2I、2J、2F和2G；(j)2A、2I、2J和2M；(k)2A、2I、2K和2G；(l)2A、2I、2D、2L和2G；(m)2H、2C、2D、2E、2F和2G；(n)2H、2C、2J、2F和2G；(o)2H、2C、2J和2M；(p)2H、2C、2D、
2E和2M；(q)2H、2C、2K和2G；或(r)2H、2C、2D、2L和2G。在一些实施例中，1M是自发的。在其它实施例中，1M是EM12。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0095] 在一个实施例中，(1)MMP包含1J、1C、1D和1F；并且(2)BDOP包含(a)2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2B、2C、2J、2F和2G；(c)2B、2C、2J和2M；(d)2B、2C、2D、2E和2M；(e)2B、2C、
2K和2G；(f)2B、2C、2D、2L和2G；(g)2I、2D、2E、2F和2G；(h)2I、2D、2E和2M；(i)2I、2J、2F和2G；(j)2I、2J和2M；(k)2I、2K和2G；或(l)2I、2D、2L和2G。在某些实施例中，MMP进一步包含1I。在一些实施例中，MMP进一步包含IG。在其它实施例中，MMP进一步包含1G和
1H。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0096] 在一个实施例中，(1)MMP包含1J、1C、1D和1F；并且(2)BDOP包含(a)2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2A、2B、2C、2J、2F和2G；(c)2A、2B、2C、2J和2M；(d)2A、2B、2C、2D、2E和
2M；(e)2A、2B、2C、2K 和2G；(f)2A、2B、2C、2D、2L和 2G；(g)2A、2I、2D、2E、2F 和2G；(h)2A、
2I、2D、2E和2M；(i)2A、2I、2J、2F和2G；(j)2A、2I、2J和2M；(k)2A、2I、2K和2G；(l)2A、2I、
2D、2L和2G；(m)2H、2C、2D、2E、2F和2G；(n)2H、2C、2J、2F和2G；(o)2H、2C、2J和2M；(p)2H、
2C、2D、2E和2M；(q)2H、2C、2K和2G；或(r)2H、2C、2D、2L和2G。在某些实施例中，MMP进一步包含1I。在一些实施例中，MMP进一步包含IG。在其它实施例中，MMP进一步包含1G和
1H。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0097] 在另一个实施例中，(1)MMP包含1J和1L；并且(2)BDOP包含(a)2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2B、2C、2J、2F和2G；(c)2B、2C、2J和2M；(d)2B、2C、2D、2E和2M；(e)2B、2C、2K和2G；(f)2B、2C、2D、2L和2G；(g)2I、2D、2E、2F和2G；(h)2I、2D、2E和2M；(i)2I、2J、2F和2G；
(j)2I、2J和2M；(k)2I、2K和2G；或(l)2I、2D、2L和2G。在某些实施例中，MMP进一步包含
1I。在一些实施例中，MMP进一步包含1G。在其它实施例中，MMP进一步包含1G和1H。在
一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0098] 在另一个实施例中，(1)MMP包含1J和1L；并且(2)BDOP包含(a)2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2A、2B、2C、2J、2F和2G；(c)2A、2B、2C、2J和2M；(d)2A、2B、2C、2D、2E和2M；
(e)2A、2B、2C、2K和2G；(f)2A、2B、2C、2D、2L和2G；(g)2A、2I、2D、2E、2F和2G；(h)2A、2I、2D、
2E和2M；(i)2A、2I、2J、2F和2G；(j)2A、2I、2J和2M；(k)2A、2I、2K和2G；(l)2A、2I、2D、2L和2G；(m)2H、2C、2D、2E、2F和2G；(n)2H、2C、2J、2F和2G；(o)2H、2C、2J和2M；(p)2H、2C、2D、
2E和2M；(q)2H、2C、2K和2G；或(r)2H、2C、2D、2L和2G。在某些实施例中，MMP进一步包含
1I。在一些实施例中，MMP进一步包含IG。在其它实施例中，MMP进一步包含1G和1H。在
一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0099] 在又一个实施例中，(1)MMP包含1J、1M、1N和1O；并且(2)BDOP包含(a)2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2B、2C、2J、2F和2G；(c)2B、2C、2J和2M；(d)2B、2C、2D、2E和2M；(e)2B、2C、
2K和2G；(f)2B、2C、2D、2L和2G；(g)2I、2D、2E、2F和2G；(h)2I、2D、2E和2M；(i)2I、2J、2F和2G；(j)2I、2J和2M；(k)2I、2K和2G；或(l)2I、2D、2L和2G。在某些实施例中，MMP进一步包含1I。在一些实施例中，MMP进一步包含1G。在其它实施例中，MMP进一步包含1G和
1H。在一些实施例中，1M是自发的。在其它实施例中，1M是EM12。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0100] 在又一个实施例中，(1)MMP包含1J、1M、1N和1O；并且(2)BDOP包含(a)2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2A、2B、2C、2J、2F和2G；(c)2A、2B、2C、2J和2M；(d)2A、2B、2C、2D、2E和2M；(e)2A、2B、2C、2K和2G；(f)2A、2B、2C、2D、2L和2G；(g)2A、2I、2D、2E、2F和2G；(h)2A、
2I、2D、2E和2M；(i)2A、2I、2J、2F和2G；(j)2A、2I、2J和2M；(k)2A、2I、2K和2G；(l)2A、2I、
2D、2L和2G；(m)2H、2C、2D、2E、2F和2G；(n)2H、2C、2J、2F和2G；(o)2H、2C、2J和2M；(p)2H、
2C、2D、2E和2M；(q)2H、2C、2K和2G；或(r)2H、2C、2D、2L和2G。在某些实施例中，MMP进一步包含1I。在一些实施例中，MMP进一步包含1G。在其它实施例中，MMP进一步包含1G和
1H。在一些实施例中，1M是自发的。在其它实施例中，1M是EM12。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0101] 在某些实施例中，(1)MMP包含1J、1N和1O；并且(2)BDOP包含(a)2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2B、2C、2J、2F和2G；(c)2B、2C、2J和2M；(d)2B、2C、2D、2E和2M；(e)2B、2C、2K和2G；(f)2B、2C、2D、2L和2G；(g)2I、2D、2E、2F和2G；(h)2I、2D、2E和2M；(i)2I、2J、2F和2G；
(j)2I、2J和2M；(k)2I、2K和2G；或(l)2I、2D、2L和2G。在某些实施例中，MMP进一步包含
1I。在一些实施例中，MMP进一步包含1G。在其它实施例中，MMP进一步包含1G和1H。在
一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0102] 在某些实施例中，(1)MMP包含1J、1N和1O；并且(2)BDOP包含(a)2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2A、2B、2C、2J、2F和2G；(c)2A、2B、2C、2J和2M；(d)2A、2B、2C、2D、2E和2M；
(e)2A、2B、2C、2K和2G；(f)2A、2B、2C、2D、2L和2G；(g)2A、2I、2D、2E、2F和2G；(h)2A、2I、2D、
2E和2M；(i)2A、2I、2J、2F和2G；(j)2A、2I、2J和2M；(k)2A、2I、2K和2G；(l)2A、2I、2D、2L和2G；(m)2H、2C、2D、2E、2F和2G；(n)2H、2C、2J、2F和2G；(o)2H、2C、2J和2M；(p)2H、2C、2D、
2E和2M；(q)2H、2C、2K和2G；或(r)2H、2C、2D、2L和2G。在某些实施例中，MMP进一步包含
1I。在一些实施例中，MMP进一步包含1G。在其它实施例中，MMP进一步包含1G和1H。在
一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0103] 在一些实施例中，(1)MMP包含1J、1K、1C、1D和1E；并且(2)BDOP包含(a)2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2B、2C、2J、2F和2G；(c)2B、2C、2J和2M；(d)2B、2C、2D、2E和2M；(e)2B、
2C、2K和2G；(f)2B、2C、2D、2L和2G；(g)2I、2D、2E、2F和2G；(h)2I、2D、2E和2M；(i)2I、2J、
2F和2G；(j)2I、2J和2M；(k)2I、2K和2G；或(l)2I、2D、2L和2G。在某些实施例中，MMP进一步包含1I。在一些实施例中，MMP进一步包含1G。在其它实施例中，MMP进一步包含1G
和1H。在一些实施例中，1K是自发的。在其它实施例中，1K是EM10。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0104] 在一些实施例中，(1)MMP包含1J、1K、1C、1D和1E；并且(2)BDOP包含(a)2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2A、2B、2C、2J、2F和2G；(c)2A、2B、2C、2J和2M；(d)2A、2B、2C、2D、2E和2M；(e)2A、2B、2C、2K和2G；(f)2A、2B、2C、2D、2L和2G；(g)2A、2I、2D、2E、2F和2G；(h)2A、
2I、2D、2E和2M；(i)2A、2I、2J、2F和2G；(j)2A、2I、2J和2M；(k)2A、2I、2K和2G；(l)2A、2I、
2D、2L和2G；(m)2H、2C、2D、2E、2F和2G；(n)2H、2C、2J、2F和2G；(o)2H、2C、2J和2M；(p)2H、
2C、2D、2E和2M；(q)2H、2C、2K和2G；或(r)2H、2C、2D、2L和2G。在某些实施例中，MMP进一步包含1I。在一些实施例中，MMP进一步包含1G。在其它实施例中，MMP进一步包含1G和
1H。在一些实施例中，1K是自发的。在其它实施例中，1K是EM10。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0105] 在一个实施例中，(1)MMP包含1J、1K、1C、1D和1F；并且(2)BDOP包含(a)2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2B、2C、2J、2F和2G；(c)2B、2C、2J和2M；(d)2B、2C、2D、2E和2M；(e)2B、
2C、2K和2G；(f)2B、2C、2D、2L和2G；(g)2I、2D、2E、2F和2G；(h)2I、2D、2E和2M；(i)2I、2J、
2F和2G；(j)2I、2J和2M；(k)2I、2K和2G；或(l)2I、2D、2L和2G。在某些实施例中，MMP进一步包含1I。在一些实施例中，MMP进一步包含1G。在其它实施例中，MMP进一步包含1G
和1H。在一些实施例中，1K是自发的。在其它实施例中，1K是EM10。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0106] 在一个实施例中，(1)MMP包含1J、1K、1C、1D和1F；并且(2)BDOP包含(a)2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2A、2B、2C、2J、2F和2G；(c)2A、2B、2C、2J和2M；(d)2A、2B、2C、2D、2E和2M；(e)2A、2B、2C、2K和2G；(f)2A、2B、2C、2D、2L和2G；(g)2A、2I、2D、2E、2F和2G；(h)2A、
2I、2D、2E和2M；(i)2A、2I、2J、2F和2G；(j)2A、2I、2J和2M；(k)2A、2I、2K和2G；(l)2A、2I、
2D、2L和2G；(m)2H、2C、2D、2E、2F和2G；(n)2H、2C、2J、2F和2G；(o)2H、2C、2J和2M；(p)2H、
2C、2D、2E和2M；(q)2H、2C、2K和2G；或(r)2H、2C、2D、2L和2G。在某些实施例中，MMP进一步包含1I。在一些实施例中，MMP进一步包含1G。在其它实施例中，MMP进一步包含1G和
1H。在一些实施例中，1K是自发的。在其它实施例中，1K是EM10。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0107] 在一个实施例中，(1)MMP包含1A、1B和1C；并且(2)BDOP包含(a)2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2B、2C、2J、2F和2G；(c)2B、2C、2J和2M；(d)2B、2C、2D、2E和2M；(e)2B、2C、2K和2G；(f)2B、2C、2D、2L和2G；(g)2I、2D、2E、2F和2G；(h)2I、2D、2E和2M；(i)2I、2J、2F和
2G；(j)2I、2J和2M；(k)2I、2K和2G；或(l)2I、2D、2L和2G。在一个实施例中，2J是EB11。
在另一个实施例中，2J是EB12。

[0108] 在一个实施例中，(1)MMP包含1A、1B和1C；并且(2)BDOP包含(a)2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2A、2B、2C、2J、2F和2G；(c)2A、2B、2C、2J和2M；(d)2A、2B、2C、2D、2E和2M；
(e)2A、2B、2C、2K和2G；(f)2A、2B、2C、2D、2L和2G；(g)2A、2I、2D、2E、2F和2G；(h)2A、2I、2D、
2E和2M；(i)2A、2I、2J、2F和2G；(j)2A、2I、2J和2M；(k)2A、2I、2K和2G；(l)2A、2I、2D、2L和2G；(m)2H、2C、2D、2E、2F和2G；(n)2H、2C、2J、2F和2G；(o)2H、2C、2J和2M；(p)2H、2C、2D、
2E和2M；(q)2H、2C、2K和2G；或(r)2H、2C、2D、2L和2G。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0109] 在又一个实施例中，(1)MMP包含1J、1M和1N；并且(2)BDOP包含(a)2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2B、2C、2J、2F和2G；(c)2B、2C、2J和2M；(d)2B、2C、2D、2E和2M；(e)2B、2C、
2K和2G；(f)2B、2C、2D、2L和2G；(g)2I、2D、2E、2F和2G；(h)2I、2D、2E和2M；(i)2I、2J、2F和2G；(j)2I、2J和2M；(k)2I、2K和2G；或(l)2I、2D、2L和2G。在一些实施例中，1M是自发的。在其它实施例中，1M是EM12。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0110] 在又一个实施例中，(1)MMP包含1J、1M和1N；并且(2)BDOP包含(a)2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G；(b)2A、2B、2C、2J、2F和2G；(c)2A、2B、2C、2J和2M；(d)2A、2B、2C、2D、2E和2M；
(e)2A、2B、2C、2K和2G；(f)2A、2B、2C、2D、2L和2G；(g)2A、2I、2D、2E、2F和2G；(h)2A、2I、2D、
2E和2M；(i)2A、2I、2J、2F和2G；(j)2A、2I、2J和2M；(k)2A、2I、2K和2G；(l)2A、2I、2D、2L和2G；(m)2H、2C、2D、2E、2F和2G；(n)2H、2C、2J、2F和2G；(o)2H、2C、2J和2M；(p)2H、2C、2D、
2E和2M；(q)2H、2C、2K和2G；或(r)2H、2C、2D、2L和2G。在一些实施例中，1M是自发的。在其它实施例中，1M是EM12。在一个实施例中，2J是EB11。在另一个实施例中，2J是EB12。

[0111] 在一个实施例中，NNOMO包含(1)包含以下的MMP：1A和1B；1J；1J和1K；1A、1B、1C、1D和1E；1A、1B、1C、1D和1F；1J、1C、1D和1E；1J、1C、1D和1F；1J和1L；1J、1M、1N和1O；
1J、1N和1O；1J、1K、1C、1D和1E；1J、1K、1C、1D和1F；1I；1A、1B、1C、1D、1E和1I；1A、1B、1C、
1D、1F和1I；1J、1C、1D、1E和1I；1J、1C、1D、1F和1I；1J、1L和1I；1J、1M、1N、1O和1I；1J、
1N、1O和1I；1J、1K、1C、1D、1E和1I；1J、1K、1C、1D、1F和1I；1G；1A、1B、1C、1D、1E和1G；1A、
1B、1C、1D、1F和1G；1J、1C、1D、1E和1G；1J、1C、1D、1F和1G；1J、1L和1G；1J、1M、1N、1O和
1G；1J、1N、1O和1G；1J、1K、1C、1D、1E和1G；1J、1K、1C、1D、1F和1G；1G和1H；1A、1B、1C、1D、
1E、1G和1H；1A、1B、1C、1D、1F、1G和1H；1J、1C、1D、1E、1G和1H；1J、1C、1D、1F、1G和1H；1J、
1L、1G和1H；1J、1M、1N、1O、1G和1H；1J、1N、1O、1G和1H；1J、1K、1C、1D、1E、1G和1H；或1J、
1K、1C、1D、1F、1G和1H；以及(2)BDOP。在一些实施例中，1K是自发的。在其它实施例中，1K是EM10。在一些实施例中，1M是EM12。

[0112] 本文中提供的任何MMP可以与本文中提供的任何BDOP组合。

[0113] 本文中还提供了例示性途径，其利用由甲醇氧化(例如如图1步骤J中所提供)所产生的甲醛形成可以用于形成生物质的某些中心代谢途径的中间物。可以利用由甲醇氧化(例如如图1中所提供)产生的甲醛的一种例示性FAP展示于图3中，其包含通过EF1，
2+ 2+
使甲醛与D-核酮糖-5-磷酸缩合形成H6P(图3步骤A)。酶可以使用Mg 或Mn 达成最
大活性，不过其它金属离子也适用，并且甚至涵盖非金属离子依赖性机制。通过EF2，H6P转变为F6P(图3步骤B)。包含由甲醇氧化(例如如图1中提供)产生的甲醛解毒和同化的
另一例示性途径展示于图4中并通过DHA进行。EF3是一种特别的转酮醇酶，其首先将甘
油醛基从木酮糖-5-磷酸转移到甲醛，形成作为糖酵解中的中间物的DHA和G3P(图4步骤
A)。从DHA合酶获得的DHA接着通过DHA激酶进一步磷酸化，形成DHA磷酸酯(图4步骤
B)。DHAP可以同化到糖酵解和若干其它途径中。不是将甲醛转变成甲酸酯和排掉的CO2，图3和4中提供的途径展示碳被同化，进入最终产物中。

[0114] 因此，在一个实施例中，如本文中提供的具有单独或与BDOP组合的MMP的生物体进一步包含利用例如从甲醇氧化所获得的甲醛形成可以用于例如形成生物质的某些中心代谢途径的中间物的FAP。在一些实施例中，FAP包含3A或3B，其中3A是EF1并且3B是
EF2。在其它实施例中，FAP包含4A或4B，其中4A是EF3并且4B是EF4。

[0115] 在某些实施例中，本文中提供了一种具有MMP的NNOMO，其中所述生物体包含至少一种编码EM9(1J)的外源性核酸，所述外源性核酸以足够增强甲醇存在下还原当量的可用性的量表达和/或以足够将甲醇转变成甲醛的量表达。在一些实施例中，生物体包含至少一种编码EM9的外源性核酸，所述外源性核酸以足够增强甲醇存在下还原当量的可用性的量表达。在其它实施例中，生物体包含至少一种编码EM9的外源性核酸，所述外源性核酸以足够将甲醇转变成甲醛的量表达。在一些实施例中，微生物生物体进一步包含FAP。在某些实施例中，生物体进一步包含至少一种编码FAPE的外源性核酸，所述外源性核酸以足够产生可以例如用于形成生物质的糖酵解和/或代谢途径的中间物的量表达。在某些实施例中，FAPE选自由以下各者组成的群组：EF1(3A)、EF2(3B)、EF3(4A)和EF4(4B)。

[0116] 在一些实施例中，编码EM9的外源性核酸以足够在培养基中或细胞内产生甲醛的量大于或等于1μM、10μM、20μM或50μM或其范围的量表达。在其它实施例中，编码EM9的外源性核酸能够在培养基中或细胞内产生大于或等于1μM、10μM、20μM或50μM或其范围的甲醛的量。在一些实施例中，范围是1μM到50μM或更大。在其它实施例中，范围是10μM到50μM或更大。在其它实施例中，范围是20μM到50μM或更大。在其它实施例中，甲醛产生的量是50μM或更大。在特定实施例中，甲醛产生的量超过阴性对照，例如不包含外源性核酸的相同物种生物体，例如野生型微生物生物体或其对照微生物生物体，或与其相当。在某些实施例中，EM9选自本文中提供的那些酶，例如如实例I中例示(参见图1步骤J)。在某些实施例中，甲醛产生的量通过例如实例I中提供的分析(参见图1步
骤J)等全细胞分析或通过本文中提供或本领域中另外已知的另一分析测定。在某些实施
例中，全细胞中缺乏甲醛利用活性。

[0117] 在某些实施例中，编码EM9的外源性核酸以足够在培养基中或细胞内产生至少1X、2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、15X、20X、30X、40X、50X、100X或更多甲醛的量表达。在其它实施例中，编码EM9的外源性核酸能够在培养基中或细胞内产生至少1X、2X、3X、4X、
5X、6X、7X、8X、9X、10X、15X、20X、30X、40X、50X、100X或其范围的量的甲醛。在一些实施例中，范围是1X到100X。在其它实施例中，范围是2X到100X。在其它实施例中，范围是5X到
100X。在其它实施例中，范围是10X到100X。在其它实施例中，范围是50X到100X。在一
些实施例中，甲醛产生的量是至少20X。在其它实施例中，甲醛产生的量是至少50X。在特定实施例中，甲醛产生的量超过阴性对照，例如不包含外源性核酸的相同物种生物体，例如野生型微生物生物体或其对照微生物生物体，或与其相当。在某些实施例中，EM9选自本文中提供的那些酶，例如如实例I中例示(参见图1步骤J)。在某些实施例中，甲醛产生的量通过例如实例I中提供的分析(参见图1步骤J)等全细胞分析或通过本文中提供或本领
域中另外已知的另一分析测定。在某些实施例中，全细胞中缺乏甲醛利用活性。

[0118] 在一个方面，本文中提供了一种NNOMO，其包含(1)MMP，其中所述生物体包含至少一种编码MMPE的外源性核酸，所述外源性核酸呈足够增强甲醇存在下还原当量的可用性的量和/或以足够将甲醇转变成甲醛的量表达；和(2)FAP，其中所述生物体包含至少一种编码FAPE的外源性核酸，所述外源性核酸以足够产生糖酵解和/或可以例如用于形成生
物质的代谢途径的中间物的量表达。在一些实施例中，生物体包含至少一种编码EM9的外源性核酸，所述外源性核酸以足够增强甲醇存在下还原当量的可用性的量表达。在其它实施例中，生物体包含至少一种编码EM9的外源性核酸，所述外源性核酸以足够将甲醇转变成甲醛的量表达。在特定实施例中，MMP包含EM9(1J)。在某些实施例中，FAPE是3A，并且中间物是H6P、F6P或其组合。在其它实施例中，FAPE是3B，并且中间物是H6P、F6P或其组合。在其它实施例中，FAPE是3A和3B，并且中间物是H6P、F6P或其组合。在一些实施例
中，FAPE是3A，并且中间物是DHA、DHA磷酸酯或其组合。在其它实施例中，FAPE是4B，并且中间物是DHA、DHA磷酸酯或其组合。在其它实施例中，FAPE是4A和4B，并且中间物是
DHA、DHA磷酸酯或其组合。在一个实施例中，至少一种编码MMPE的外源性核酸在甲醇存在下足够增强还原当量的可用性并足够增加甲醛同化以增加非天然微生物生物体的BDO或
本文中描述的其它产物的产生。在一些实施例中，MMP包含上文或本文中其它地方所述的MMPE各种组合中的任一者。

[0119] 在某些实施例中，(1)MMP包含：1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O，或1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O其任何组合，其中1A是EM1；1B是EM2；1C是EM3；1D是EM4；1E是EM5；1F是EM6；1G是EM15；1H是EM16；1I是EM8；1J
是EM9；1K是自发的或EM10；1L是EM11；1M是自发的或EM12；1N是EM13并且1O是EM14；
并且(2)FAP包含3A、3B或其组合，其中3A是EF1并且3B是EF2。在一些实施例中，1K是
自发的。在其它实施例中，1K是EM10。在一些实施例中，1M是自发的。在其它实施例中，1M是EM12。在一些实施例中，中间物是H6P。在其它实施例中，中间物是F6P。在其它实施例中，中间物是H6P和F6P。

[0120] 在一个实施例中，FAP包含3A。在另一个实施例中，FAP包含3B。在一个实施例中，FAP包含3A和3B。

[0121] 在一些实施例中，MMP是图1中描绘的MMP和图3中描绘的FAP。根据图3将D-核酮糖-5-磷酸和甲醛转变成F6P(经由H6P)的一组例示性FAPE包括3A和3B。

[0122] 在一个特定实施例中，(1)MMP包含1J；并且(2)FAP包含3A和3B。在其它实施例中，(1)MMP包含1J和1K；并且(2)FAP包含3A和3B。在一些实施例中，(1)MMP包含1J、1C、
1D和1E；并且(2)FAP包含3A和3B。在一个实施例中，(1)MMP包含1J、1C、1D和1F；并且
(2)FAP包含3A和3B。在另一个实施例中，(1)MMP包含1J和1L；并且(2)FAP包含3A和
3B。在又一个实施例中，(1)MMP包含1J、1M、1N和1O；并且(2)FAP包含3A和3B。在某些
实施例中，(1)MMP包含1J、1N和1O；并且(2)FAP包含3A和3B。在一些实施例中，(1)MMP
包含1J、1K、1C、1D和1E；并且(2)FAP包含3A和3B。在一个实施例中，(1)MMP包含1J、1K、
1C、1D和1F；并且(2)FAP包含3A和3B。在一些实施例中，(1)MMP包含1J、1C、1D、1E和1I；
并且(2)FAP包含3A和3B。在一个实施例中，(1)MMP包含1J、1C、1D、1F和1I；并且(2)FAP包含3A和3B。在另一个实施例中，(1)MMP包含1J、1L和1I；并且(2)FAP包含3A和3B。
在又一个实施例中，(1)MMP包含1J、1M、1N、1O和1I；并且(2)FAP包含3A和3B。在某些实施例中，(1)MMP包含1J、1N、1O和1I；并且(2)FAP包含3A和3B。在一些实施例中，(1)MMP包含1J、1K、1C、1D、1E和1I；并且(2)FAP包含3A和3B。在一个实施例中，(1)MMP包含1J、
1K、1C、1D、1F和1I；并且(2)FAP包含3A和3B。在一些实施例中，(1)MMP包含1J、1C、1D、
1E和1G；并且(2)FAP包含3A和3B。在一个实施例中，(1)MMP包含1J、1C、1D、1F和1G；并且(2)FAP包含3A和3B。在另一个实施例中，(1)MMP包含1J、1L和1G；并且(2)FAP包含
3A和3B。在又一个实施例中，(1)MMP包含1J、1M、1N、1O和1G；并且(2)FAP包含3A和3B。
在某些实施例中，(1)MMP包含1J、1N、1O和1G；并且(2)FAP包含3A和3B。在一些实施例
中，(1)MMP包含1J、1K、1C、1D、1E和1G；并且(2)FAP包含3A和3B。在一个实施例中，(1)MMP包含1J、1K、1C、1D、1F和1G；并且(2)FAP包含3A和3B。在一些实施例中，(1)MMP包含
1J、1C、1D、1E、1G和1H；并且(2)FAP包含3A和3B。在一个实施例中，(1)MMP包含1J、1C、
1D、1F、1G和1H；并且(2)FAP包含3A和3B。在另一个实施例中，(1)MMP包含1J、1L、1G和
1H；并且(2)FAP包含3A和3B。在又一个实施例中，(1)MMP包含1J、1M、1N、1O、1G和1H；并且(2)FAP包含3A和3B。在某些实施例中，(1)MMP包含1J、1N、1O、1G和1H；并且(2)FAP
包含3A和3B。在一些实施例中，(1)MMP包含1J、1K、1C、1D、1E、1G和1H；并且(2)FAP包含
3A和3B。在一个实施例中，(1)MMP包含1J、1K、1C、1D、1F、1G和1H；并且(2)FAP包含3A和
3B。在一些实施例中，1K是自发的。在其它实施例中，1K是EM10。在一些实施例中，1M是自发的。在一些实施例中，中间物是H6P。在其它实施例中，中间物是F6P。在其它实施例中，中间物是H6P和F6P。

[0123] 在某些实施例中，(1)MMP包含：1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O，或1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O其任何组合，其中1A是EM1；1B是EM2；1C是EM3；1D是EM4；1E是EM5；1F是EM6；1G是EM15；1H是EM16、1I是EM8；1J
是EM9；1K是自发的或EM10；1L是EM11；1M是自发的或EM12；1N是EM13和1O是EM14；并
且(2)FAP包含4A、4B或其组合，其中4A是EF3并且4B是EF4。在一些实施例中，1K是自
发的。在其它实施例中，1K是EM10。在一些实施例中，1M是自发的。在其它实施例中，1M是EM12。在一些实施例中，中间物是DHA。在其它实施例中，中间物是DHA磷酸酯。在其它实施例中，中间物是DHA和DHA磷酸酯。

[0124] 在一个实施例中，FAP包含4A。在另一个实施例中，FAP包含4B。在一个实施例中，FAP包含4A和4B。

[0125] 在一些实施例中，MMP是图1中描绘的MMP和图4中描绘的FAP。根据图4将木酮糖-5-磷酸和甲醛转变成DHA磷酸酯(经由DHA)的一组例示性FAPE包括4A和4B。

[0126] 在一个特定实施例中，(1)MMP包含1J；并且(2)FAP包含4A和4B。在其它实施例中，(1)MMP包含1J和1K；并且(2)FAP包含4A和4B。在一些实施例中，(1)MMP包含1J、1C、
1D和1E；并且(2)FAP包含4A和4B。在一个实施例中，(1)MMP包含1J、1C、1D和1F；并且
(2)FAP包含4A和4B。在另一个实施例中，(1)MMP包含1J和1L；并且(2)FAP包含4A和
4B。在又一个实施例中，(1)MMP包含1J、1M、1N和1O；并且(2)FAP包含4A和4B。在某些
实施例中，(1)MMP包含1J、1N和1O；并且(2)FAP包含4A和4B。在一些实施例中，(1)MMP
包含1J、1K、1C、1D和1E；并且(2)FAP包含4A和4B。在一个实施例中，(1)MMP包含1J、1K、
1C、1D和1F；并且(2)FAP包含4A和4B。在一些实施例中，(1)MMP包含1J、1C、1D、1E和1I；
并且(2)FAP包含4A和4B。在一个实施例中，(1)MMP包含1J、1C、1D、1F和1I；并且(2)FAP包含4A和4B。在另一个实施例中，(1)MMP包含1J、1L和1I；并且(2)FAP包含4A和4B。
在又一个实施例中，(1)MMP包含1J、1M、1N、1O和1I；并且(2)FAP包含4A和4B。在某些实施例中，(1)MMP包含1J、1N、1O和1I；并且(2)FAP包含4A和4B。在一些实施例中，(1)MMP包含1J、1K、1C、1D、1E和1I；并且(2)FAP包含4A和4B。在一个实施例中，(1)MMP包含1J、
1K、1C、1D、1F和1I；并且(2)FAP包含4A和4B。在一些实施例中，(1)MMP包含1J、1C、1D、
1E和1G；并且(2)FAP包含4A和4B。在一个实施例中，(1)MMP包含1J、1C、1D、1F和1G；并且(2)FAP包含4A和4B。在另一个实施例中，(1)MMP包含1J、1L和1G；并且(2)FAP包含
4A和4B。在又一个实施例中，(1)MMP包含1J、1M、1N、1O和1G；并且(2)FAP包含4A和4B。
在某些实施例中，(1)MMP包含1J、1N、1O和1G；并且(2)FAP包含4A和4B。在一些实施例
中，(1)MMP包含1J、1K、1C、1D、1E和1G；并且(2)FAP包含4A和4B。在一个实施例中，(1)MMP包含1J、1K、1C、1D、1F和1G；并且(2)FAP包含4A和4B。在一些实施例中，(1)MMP包含
1J、1C、1D、1E、1G和1H；并且(2)FAP包含4A和4B。在一个实施例中，(1)MMP包含1J、1C、
1D、1F、1G和1H；并且(2)FAP包含4A和4B。在另一个实施例中，(1)MMP包含1J、1L、1G和
1H；并且(2)FAP包含4A和4B。在又一个实施例中，(1)MMP包含1J、1M、1N、1O、1G和1H；并且(2)FAP包含4A和4B。在某些实施例中，(1)MMP包含1J、1N、1O、1G和1H；并且(2)FAP
包含4A和4B。在一些实施例中，(1)MMP包含1J、1K、1C、1D、1E、1G和1H；并且(2)FAP包含
4A和4B。在一个实施例中，(1)MMP包含1J、1K、1C、1D、1F、1G和1H；并且(2)FAP包含4A和
4B。在一些实施例中，1K是自发的。在其它实施例中，1K是EM10。在一些实施例中，1M是自发的。在一些实施例中，中间物是DHA。在其它实施例中，中间物是DHA磷酸酯。在其它实施例中，中间物是DHA和DHA磷酸酯。

[0127] 本文中提供的任何MMP可以与本文中提供的任何FAP组合。另外，本文中提供的任何MMP可以与本文中提供的任何BDOP和任何甲醛途径组合。

[0128] 本文中还提供了产生甲醛的方法，其包含培养本文中提供的具有MMP的NNOMO。在一些实施例中，MMP包含1J。在某些实施例中，生物体在实质上厌氧培养基中培养。在特定实施例中，甲醛是BDO和本文中描述的其它产物的产生中消耗(同化)的一种中间物。

[0129] 本文中还提供了产生糖酵解和/或可以用于例如形成生物质的代谢途径的中间物的方法，其包含在足够产生中间物的条件和时段下培养如本文中提供的具有MMP和FAP
的NNOMO。在一些实施例中，中间物是H6P。在其它实施例中，中间物是F6P。在其它实施例中，中间物是H6P和F6P。在一些实施例中，中间物是DHA。在其它实施例中，中间物是DHA磷酸酯。在其它实施例中，中间物是DHA和DHA磷酸酯。在一些实施例中，MMP包含1J。在某些实施例中，生物体在实质上厌氧培养基中培养。此类生物质也可以用于产生本文中的其它地方所提供的任何产物，例如生物基产物的方法。

[0130] 在一些实施例中，生物体包含两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或更多种外源性核酸，每一种都编码BDOPE。在一些实施例中，生物体包含两种外源性核酸，每一种都编码BDOPE。在一些实施例中，生物体包含三种外源性核酸，每一种都编码BDOPE。在一些实施例中，生物体包含四种外源性核酸，每一种都编码BDOPE。在其它实施例中，生物体包含五种外源性核酸，每一种都编码BDOPE。在一些实施例中，生物体包含六种外源性核酸，每一种都编码BDOPE。在其它实施例中，生物体包含七种外源性核酸，每一种都编码BDOPE。在某些实施例中，生物体包含两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性核酸，每一种都编码BDOPE；并且生物体进一步包含两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性核酸，每一种都编码MMPE。在某些实施例中，生物体进一步包含两种外源性核酸，每一种都编码MMPE。在某些实施例中，生物体进一步包含三种外源性核酸，每一种都编码MMPE。在某些实施例中，生物体进一步包含进一步四种外源性核酸，每一种都编码MMPE。在某些实施例中，生物体进一步包含五种外源性核酸，每一种都编码MMPE。在某些实施例中，生物体进一步包含六种外源性核酸，每一种都编码MMPE。在某些实施例中，生物体进一步包含七种外源性核酸，每一种都编码MMPE。

[0131] 在一些实施例中，生物体包含两种或两种以上外源性核酸，每一种都编码FAPE。在一些实施例中，生物体包含两种外源性核酸，每一种都编码FAPE。在某些实施例中，生物体包含两种外源性核酸，每一种都编码FAPE；并且生物体进一步包含两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性核酸，每一种都编码MMPE。在某些实施例中，生物体进一步包含两种外源性核酸，每一种都编码MMPE。在某些实施例中，生物体进一步包含三种外源性核酸，每一种都编码MMPE。在某些实施例中，生物体进一步包含进一步四种外源性核酸，每一种都编码MMPE。在某些实施例中，生物体进一步包含五种外源性核酸，每一种都编码MMPE。在某些实施例中，生物体进一步包含六种外源性核酸，每一种都编码MMPE。在某些实施例中，生物体进一步包含七种外源性核酸，每一种都编码MMPE。

[0132] 在一些实施例中，至少一种编码MMPE的外源性核酸是异源核酸。在其它实施例中，至少一种编码BDOPE的外源性核酸是异源核酸。在其它实施例中，至少一种编码FAPE的外源性核酸是异源核酸。在某些实施例中，至少一种编码MMPE的外源性核酸是异源核酸，并且至少一种编码BDOPE的外源性核酸是异源核酸。在其它实施例中，至少一种编码MMPE的外源性核酸是异源核酸，并且至少一种编码FAPE的外源性核酸是异源核酸。

[0133] 在某些实施例中，生物体处于实质上厌氧培养基中。

[0134] 在一些实施例中，在本文中提供的某些NNOMO中由EM9产生的甲醛(图1步骤J)用于产生能量、氧化还原作用和/或形成生物质。两种此类途径展示于图3中。另外，
若干生物体使用称为“丝氨酸循环”的甲醛同化的替代途径。这些生物体包括亲甲基醇菌(methylotroph)、扭脱甲基杆菌AM1(Methylobacterium extorquens AM1)以及另一者嗜有机甲基杆菌(Methylobacterium organophilum)。此循环的净平衡是以2摩尔ATP和氧化
2摩尔NAD(P)H作为代价，将两摩尔的甲醛和1摩尔的CO2固定到1摩尔3-磷酸甘油酸中，
3-磷酸甘油酸是用于生物合成。

[0135] 在丝氨酸途径的第一反应中，甲醛与甘氨酸反应，形成丝氨酸。反应由丝氨酸羟基甲基转移酶(SHMT)催化，丝氨酸羟基甲基转移酶是一种使用四氢叶酸(THF)作为辅因子的酶。此导致5,10-亚甲基四氢叶酸形成。在反应期间，甲醛从5,10-亚甲基四氢叶酸转移到甘氨酸，形成L-丝氨酸。下一步中，丝氨酸用乙醛酸作为氨基受体由酶丝氨酸-乙醛酸转氨酶诱导转氨，产生羟基丙酮酸和甘氨酸。羟基丙酮酸由羟基丙酮酸还原酶还原成甘油酸酯。甘油酸2-激酶催化从ATP添加磷酸酯基以产生2-磷酸甘油酸酯。

[0136] 一些2-磷酸甘油酸酯由磷酸甘油酸变位酶转变成3-磷酸甘油酸酯，3-磷酸甘油酸酯是中心代谢途径的中间物并用于生物合成。其余的2-磷酸甘油酸酯由烯醇酶转变成
磷酸烯醇丙酮酸酯(PEP)。接着PEP羧化酶催化二氧化碳的固定以及PEP转变成草酰乙酸
酯，草酰乙酸酯由苹果酸脱氢酶(一种NAD连接的酶)还原成苹果酸酯。苹果酸酯由苹果酸硫激酶活化成苹果酰基辅酶A并由苹果酰基辅酶A裂合酶裂解成乙酰基CoA和乙醛酸。此
两种酶(苹果酸硫激酶和苹果酰基辅酶A裂合酶)以及羟基丙酮酸还原酶和甘油酸-2-激
酶独特地存在于含有丝氨酸途径的亲甲基醇菌中。

[0137] 在具有异柠檬酸裂合酶(乙醛酸循环的一种关键酶)的生物体中，乙酰基CoA由乙醛酸循环转变成乙醛酸。然而，如果酶丢失，那么其由另一未知的途径转变(德弗里斯等人,欧洲微生物学会联合会微生物学总览,6(1):57-101(1990)(deVries et al,FEMS
Microbiol Rev,6(1):57-101(1990)))。所得乙醛酸可以用作丝氨酸-乙醛酸转氨酶的底
物，再生甘氨酸并结束循环。

[0138] 应了解本文公开的如实例中所描述和图中例示的任何途径，包括图1、2、3和4的途径，可以用以产生NNOMO，NNOMO依照要求产生任何途径中间物或产物。此类中间物或产物的非限制性实例是4-HB和BDO。如本文所公开，此类产生中间物的微生物生物体可以与表达下游途径酶的另一微生物生物体组合使用，产生所希望的产物。然而，应了解产生BDOP中间物的非天然存在的生物体可以用以产生作为所希望的产物的中间物(例如4-羟基丁醛)。

[0139] 在某些实施例中，本文中提供的包含MMP和BDOP的NNOMO进一步包含一或多种基因破坏。在某些实施例中，一或多种基因破坏使生物体中BDO的产生增加。在其它实施例中，本文中提供的包含MMP和FAP的NNOMO进一步包含一或多种基因破坏。在一些实施例
中，基因破坏在编码参与所述微生物生物体天然产生乙醇、甘油、乙酸酯、乳酸酯、甲酸酯、CO2、氨基酸或其任何组合的蛋白质和/或酶的内源性基因中。在一个实施例中，基因破坏在编码参与乙醇天然产生的蛋白质和/或酶的内源性基因中。在另一个实施例中，基因破坏在编码参与甘油天然产生的蛋白质和/或酶的内源性基因中。在其它实施例中，基因破坏在编码参与乙酸酯天然产生的蛋白质和/或酶的内源性基因中。在另一个实施例中，基因破坏在编码参与乳酸酯天然产生的蛋白质和/或酶的内源性基因中。在一个实施例中，基因破坏在编码参与甲酸酯天然产生的蛋白质和/或酶的内源性基因中。在另一个实施例中，基因破坏在编码参与CO2天然产生的蛋白质和/或酶的内源性基因中。在其它实施例
中，基因破坏在编码参与所述微生物生物体天然产生氨基酸的蛋白质和/或酶的内源性基因中。在一些实施例中，蛋白质或酶是丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶、甘油脱氢酶、甘油-3-磷酸酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、乙酸激酶、磷酸转乙酰酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸:
苯醌氧化还原酶、丙酮酸甲酸裂合酶、醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸甲酸裂合酶-2-酮丁酸甲酸裂合酶、丙酮酸转运体、一元羧酸转运体、NADH脱氢酶、细胞色素氧化酶、丙酮酸激酶或其任何组合。在某些实施例中，一或多种基因破坏使生物体中甲醛的产生增加。在另一个实施例中，基因破坏在编码参与天然甲醛利用途径的蛋白质和/或酶的内源性基因中。在某些实施例中，生物体包含一种到二十五种基因破坏。在其它实施例中，生物体包含一种到二十种基因破坏。在一些实施例中，生物体包含一种到十五种基因破坏。在其它实施例中，生物体包含一种到十种基因破坏。在一些实施例中，生物体包含一种到五种基因破坏。在某些实施例中，生物体包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24或25种基因破坏或更多。

[0140] 在其它实施例中，本文中提供的包含MMP和BDOP的NNOMO进一步包含一或多种参与所述微生物生物体天然产生乙醇、甘油、乙酸酯、乳酸酯、甲酸酯、CO2和/或氨基酸的内源性蛋白质或酶，其中所述一或多种内源性蛋白质或酶具有减弱的蛋白质或酶活性和/或表达水平。在一些实施例中，本文中提供的包含MMP和FAP的NNOMO进一步包含一或多种参
与所述微生物生物体天然产生乙醇、甘油、乙酸酯、乳酸酯、甲酸酯、CO2和/或氨基酸的内源性蛋白质或酶，其中所述一或多种内源性蛋白质或酶具有减弱的蛋白质或酶活性和/或表达水平。在一个实施例中，内源性蛋白质或酶是丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶、甘油脱氢酶、甘油-3-磷酸酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、乙酸激酶、磷酸转乙酰酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸:苯醌氧化还原酶、丙酮酸甲酸裂合酶、醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸甲酸裂合酶-2-酮丁酸甲酸裂合酶、丙酮酸转运体、一元羧酸转运体、NADH脱氢酶、细胞色素氧化酶、丙酮酸激酶或其任何组合。

[0141] 与不含此类代谢改变的菌株相比，在适当的培养条件下，本文中提供的每一种非天然存在的改变例如在微生物生物体的指数生长期期间，增加BDO的产生并增强其水平。适当的条件包括例如本文公开的条件，包括例如具体碳源或反应物可用性和/或适应性进化等条件。

[0142] 在某些实施例中，本文中提供了具有遗传改变，例如增加例如BDO产生、例如BDO的生长偶合的产生的基因破坏的NNOMO。产物产生可以例如通过遗传改变如本文公开的细胞的代谢途径，与微生物的指数生长期专性关联。遗传改变可以增加所希望产物的产生，乃至使所希望的产物成为生长期期间的专性产物。适当的条件包括例如本文公开的条件，包括例如具体碳源或反应物可用性和/或适应性进化等条件。

[0143] 在本文中提供的传授内容和指导下，本领域的技术人员将了解为引入代谢改变，例如酶的减弱，可能需要破坏参与反应的一或多种酶的催化活性。或者，代谢改变可以包括破坏酶活性或最大活性所必需的调节蛋白或辅因子的表达。此外，酶反应所必需的辅因子的遗传损失也可以具有与破坏编码酶的基因相同的作用。破坏可以通过各种方法发生，包括例如编码基因的缺失或遗传改变并入编码基因序列中的一或多者中。目标是破坏的编码基因可以是编码与催化活性有关的酶的基因的一种、一些或所有。举例来说，在单一酶与目标催化活性相关的情况下，破坏可以通过减小或消除编码基因产物的催化活性的遗传改变发生。类似地，在单一酶是多聚体，包括异聚体的情况下，破坏可以通过减少或破坏所编码的基因产物的一个或所有亚单位的功能的遗传改变发生。活性破坏可以通过形成活性复合物所需的一或多个亚单位的结合活性损失，通过破坏多聚复合物的催化亚单位或通过两者来实现。还可以以多聚蛋白质缔合和活性的其它功能为目标以破坏代谢反应。此类其它功能是本领域的技术人员众所周知的。类似地，目标酶活性可以通过破坏修饰和/或活化目标酶的蛋白质或酶，例如主酶转变成全酶所需要的分子的表达来减少或消除。此外，可以破坏单一多肽或多聚复合物的一些或所有功能以减少或消除一或多种参与本文中提供的反应或代谢修饰的酶的催化活性。类似地，可以破坏一些或所有参与本文中提供的反应或代谢修饰的酶，只要目标反应减少或消除即可。

[0144] 在本文中提供的传授内容和指导下，本领域的技术人员还将了解酶反应可以通过减少或消除由共同基因和/或由所述基因的显示类似或实质上相同的活性的一或多种直系同源物编码的反应来破坏。共同基因与所有直系同源物两者的减少可以引起目标反应的任何催化活性的完全消除。然而，共同基因或一或多种直系同源物的破坏可以引起目标反应的催化活性足以促进生长与产物生物合成偶合的减少。本文中例示了编码各种代谢修饰的催化活性的共同基因以及其直系同源物。本领域的技术人员将了解破坏一些或所有编码目标代谢反应的酶的基因可以用本文中提供的方法实践并且并入NNOMO中以实现BDO的产
生或生长偶合的产物产生增加。

[0145] 在本文中提供的传授内容和指导下，本领域的技术人员还将了解酶活性或表达可以使用众所周知的方法减弱。如果减少引起酶活性降到途径发挥作用所需要的临界水平之下，那么减少酶或蛋白质的活性或量可以模拟基因完全的破坏。通过各种技术而非使用基因破坏来减少酶活性对于生物体的存活力来说可能是重要的。引起基因破坏的类似或
一致作用的减少酶活性的方法包括(但不限于)：减少基因转录或翻译；使mRNA、蛋白质
或催化RNA不稳定；以及使影响酶活性或动力学的基因突变(参见萨姆布鲁克等人,分子
克隆：实验室指南,第三版,冷泉港实验室,纽约(2001)(Sambrook et al.,Molecular
Cloning:A Laboratory Manual,Third Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New
York(2001))；和奥苏伯尔等人,现代分子生物学实验技术,约翰威立父子出版公司,马里
兰州巴尔的摩(1999)(Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999))。天然或强加的调节控制也可以实现酶减弱，包
括：启动子替换(参见王等人,分子生物学技术52(2):300-308(2012)(Wang et al.,Mol.
Biotechnol.52(2):300-308(2012))；转录因子的损失或改变(迪特里克,生物化学
年 评 79:563-590(2010)(Dietrick et al.,Annu.Rev.Biochem.79:563-590(2010))；
和斯利塞维奇等人,分子生物系统6(3):462-468(2010)(Simicevic et al.,Mol.
Biosyst.6(3):462-468(2010)))；引入抑制RNA或肽，例如siRNA、反义RNA、RNA或肽/小分子结合适体、核糖酶、人工适体酶和核糖开关(维兰德等人,方法56(3):351-357(2012)(Wieland et al.,Methods 56(3):351-357(2012))；欧苏利文,分析与生物分析化
学 372(1):44-48(2002)(O'Sullivan,Anal.Bioanal.Chem.372(1):44-48(2002))；
和李等人,生物技术新见14(5):505-511(2003)(Lee et al.,Curr.Opin.Biotechn
ol.14(5):505-511(2003)))；以及添加减少或破坏酶活性的药物或其它化学品，例如酶抑制剂、抗生素或目标特定的药物。

[0146] 本领域的技术人员还将了解并认识到酶的减弱可以在各种水平下进行。举例来说，在基因水平下，例如基因破坏等引起部分或完全无效表型的突变，或屏蔽基因产物的活性的引起上位遗传效应的突变(米克,自然教育1(1)(2008)(Miko,Nature Education
1(1)(2008))可以用于减弱酶。在基因表达水平下，用于减弱的方法包括：转录与例如
异丙硫基-β-半乳糖苷(IPTG)等内源性或外源性诱导物偶合，接着在产生阶段期间添
加少量的诱导物或无诱导物(多诺万等人,工业微生物学杂志16(3):145-154(1996)
(Donovan et al.,J.Ind.Microbiol.16(3):145-154(1996))；和汉森等人,当代微生物
学 36(6):341-347(1998)(Hansen et al.,Curr.Microbiol.36(6):341-347(1998)))；
引入或修饰基因的正性或负性调节剂；修饰整合有基因的真核染色体区域中组蛋
白乙酰化/脱乙酰基化(杨等人,遗传学与发育新见13(2):143-153(2003)(Yang
et al.,Curr.Opin.Genet.Dev.13(2):143-153(2003))和库尔德斯坦等人,分子细
胞 生 物 学 自 然 评 述 4(4):276-284(2003)(Kurdistani et al.,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.4(4):276-284(2003)))；引入易位以破坏启动子或调节基因(布雷卡斯坦-布
若森等人,法国科学院报告：生物学33(8-9):679-686(2011)(Bleykasten-Brosshans
et al.,C.R.Biol.33(8-9):679-686(2011))；和麦可等人,美国公共科学图书馆遗
传 学 8(2):e1002474(2012)(McCue et al.,PLoS Genet.8(2):e1002474(2012)))；易
位元件或启动子区域的取向翻转以便调节相邻基因的基因表达(王等人,遗传学
120(4):875-885(1988)(Wang et al.,Genetics120(4):875-885(1988))；海 伊 , 遗
传学年评37:3-29(2003)(Hayes,Annu.Rev.Genet.37:3-29(2003))；在二倍体生物体
中，缺失一个对偶基因引起杂合性损失(大学等人,突变研究/突变诱发的基本和分
子 机 制 600(1-2)177-183(2006)(Daigaku et al.,Mutation Research/Fundamental
and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 600(1-2)177-183(2006)))； 引 入
增加RNA降解的核酸(郝思利等人,细胞,136(4):763-776(2009)(Houseley et
al.,Cell,136(4):763-776(2009)))；或细菌中，例如引入转运信使RNA(tmRNA)标签，其可以引起RNA降解和核蛋白体失速(春原等人,RNA 10(3):378-386(2004)(Sunohara et
al.,RNA 10(3):378-386(2004))；和春原等人,生物化学杂志279:15368-15375(2004)
(Sunohara et al.,J.Biol.Chem.279:15368-15375(2004)))。在翻译水平下，减弱可
以包括：引入罕见密码子以限制翻译(安哥维,生物技术杂志6(6):650-659(2011)
(Angov,Biotechnol.J.6(6):650-659(2011)))；引入阻断翻译的RNA干扰分子(卡
思黛 乐 等人, 遗传 学 自然 评述 14(2):100-112(2013)(Castel et al.,Nat.Rev.
Genet.14(2):100-112(2013))；和川崎等人,分子治疗学新见7(2):125-131(2005)
(Kawasaki et al.,Curr.Opin.Mol.Ther.7(2):125-131(2005)))；修饰在编码序列外
部的区域，例如引入二级结构到未翻译区域(UTR)中以阻断翻译或降低翻译效率(林格
等人,美国公共图书馆计算生物学(1(7):e72(2005)(Ringnér et al.,PLoS Comput.
Biol.1(7):e72(2005)))；添加RNAase位点以求转录本迅速降解(帕斯奎纳里,遗传学
自然评述13(4):271-282(2012)(Pasquinelli,Nat.Rev.Genet.13(4):271-282(2012))；
和阿德里亚诺等人,欧洲微生物学会联合会微生物学评述34(5):883-932(2010)
(Arraiano et al.,FEMS Microbiol.Rev.34(5):883-932(2010)))；引 入 反 义RNA 寡
聚物或反义转录本(吉泽等人,生物科学前沿17:938-958(2012)(Nashizawa et
al.,Front.Biosci.17:938-958(2012)))；引入RNA或肽适体、核糖酶、人工适体酶、核
糖开关(维兰德等人,方法56(3):351-357(2012)；欧苏利文,分析与生物分析化学
372(1):44-48(2002)；和李等人,生物技术新见14(5):505-511(2003))；或引入包含
可以通过小分子存在或不存在控制而可以防止或减少翻译的RNA结构的翻译调节元件
(阿劳约等人,比较与功能性基因组学,文章ID 475731,第8页(2012)(Araujo et
al.,Comparative and Functional Genomics,Article ID475731,8pages(2012)))。 在
酶定位和/或存活力的水平下，酶减弱可以包括：添加降解标签以求更快的蛋白质翻
转(霍赫斯特拉塞尔,遗传学年评30:405-439(1996)(Hochstrasser,Annual Rev.
Genet.30:405-439(1996))；和元等人,美国公共科学图书馆综合8(4):e62529(2013)
(Yuan et al.,PLoS One8(4):e62529(2013)))；或添加引起酶分泌或定位到真核
细胞中亚细胞隔室的定位标签，其中酶不能与其正常底物反应(中井等人基因组学
14(4):897-911(1992)(Nakai et al.Genomics 14(4):897-911(1992))；和罗塞尔等人,细菌学杂志189(21)7581-7585(2007)(Russell et al.,J.Bact.189(21)7581-7585(2007))。
在翻译后调节水平下，酶减弱可以包括：增加已知抑制剂的细胞内浓度；或修饰翻译
后修饰位点(曼恩等人,自然生物技术21:255-261(2003)(Mann et al.,Nature
Biotech.21:255-261(2003)))。在酶活性的水平下，酶减弱可以包括：添加内源性或外源性抑制剂，例如酶抑制剂、抗生素或目标特定的药物，以减少酶活性；限制例如维生素B12等必需辅因子对需要所述辅因子的酶的可用性；螯合酶活性所需要的金属离子；或引入显性负突变。上述用于减弱的技术的适用性可以取决于既定宿主微生物生物体是原核还是真
核，并且应了解本领域的技术人员可以容易地确定对于既定宿主来说，什么是适当的技术。

[0147] 在一些实施例中，可以基于生长偶合的所希望产物形成，使用微需氧设计。为了检验此，可以通过在网络中可行的不同生物质形成速率下首先最大化并随后最小化产物产率来为每一策略构筑产生锥体。如果突变网络的所有可能表型的最右边界是单一点，那么意味着在网络中可能的最大生物质形成速率下存在独特的产物最适产率。在其它情况下，可行表型的最右边界是垂直线，指示接近最大生物质时，网络可以制造出在计算范围内的任何量的产物，包括在垂直线最低点的最低量。给予此类设计低优先级。

[0148] 通过本文公开的方法鉴别的BDO产生策略(例如OptKnock框架)一般基于其(i)理论产率和(ii)生长偶合的BDO形成特性来分等级。

[0149] 因此，本文中还提供了一种具有将BDO产生与生物体生长偶合的代谢修饰的NNOMO，其中所述代谢修饰包括破坏一或多种选自编码本文中提供的蛋白质和/或酶的基
因的基因。

[0150] 如果确定菌株设计未足够地增加BDO产生和/或将产物形成与生物质形成偶合，那么每一种菌株可以补充以额外的缺失。或者，在生长条件下不知具有显著活性的一些其它酶可以因适应性进化或随机的突变诱发而变得有活性。也可以敲除此类活性。然而，本文中提供的基因缺失允许构筑显示BDO高产率产生，包括生长偶合的BDO产生的菌株。

[0151] 在另一方面，本文中提供了一种产生BDO的方法，其包含在足够产生BDO的条件和时段下培养本文中提供的包含MMP和BDOP的任一NNOMO。在某些实施例中，生物体在实质上厌氧培养基中培养。

[0152] 本文中提供了产生BDO的方法，其包含在足够产生BDO的条件和时段下培养本文中提供的生物体。在一些实施例中，所述方法包含培养NNOMO足够产生BDO的时段，所
述NNOMO包含(1)MMP，其中所述生物体包含至少一种编码MMPE的外源性核酸，所述外源性核酸呈足够增强甲醇存在下还原当量的可用性的量；以及(2)BDOP，其包含至少一种编码BDOPE的外源性核酸，所述外源性核酸以足够产生BDO的量表达。

[0153] 在本文中提供的方法的某些实施例中，生物体进一步包含至少一种编码BDOPE的外源性核酸，所述外源性核酸以足够产生BDO的量表达。在一些实施例中，核酸是外源性核酸。在其它实施例中，核酸是内源性核酸。在一些实施例中，生物体进一步包含一或多种本文中提供的使生物体中BDO的产生增加的基因破坏。在某些实施例中，一或多种基因破坏在编码参与所述微生物生物体天然产生乙醇、甘油、乙酸酯、乳酸酯、甲酸酯、CO2和/或氨基酸的蛋白质或酶的内源性基因中发生。在其它实施例中，生物体进一步包含一或多种参与所述微生物生物体天然产生乙醇、甘油、乙酸酯、乳酸酯、甲酸酯、CO2和/或氨基酸的内源性蛋白质或酶，其中所述一或多种内源性蛋白质或酶具有减弱的蛋白质或酶活性和/或表达水平。在某些实施例中，生物体是瑰珀翠(Crabtree)阳性的真核生物体，并且生物体在包含葡萄糖的培养基中培养。在某些实施例中，生物体包含一种到二十五种基因破坏。在其它实施例中，生物体包含一种到二十种基因破坏。在一些实施例中，生物体包含一种到十五种基因破坏。在其它实施例中，生物体包含一种到十种基因破坏。在一些实施例中，生物体包含一种到五种基因破坏。在某些实施例中，生物体包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25种基因破坏或更多。

[0154] 在另一个实施例中，提供了一种具有BDOP、FAP和/或MMP的NNOMO，其中NNOMO包含至少一种编码将底物转变成产物的酶或蛋白质的外源性核酸。举例来说，图1中，1J的底物是甲醇，并且产物是甲醛；1L的底物是甲醛，并且产物是甲酸酯；等等。本领域的技术人员将了解这些仅仅是例示性的，并且本领域的技术人员基于本文中的传授内容可以容易地确定本文公开的适于产生所希望的产物并且适当的活性可用于将底物转变成产物的任何底物-产物对。因此，本文中提供了含有至少一种编码酶或蛋白质的外源性核酸的NNOMO，其中酶或蛋白质转变MMP(例如图1中所示)、BDOP(例如图2中所示)和/或FAP(例如图
3或4中所示)的底物和产物。

[0155] 虽然本文中一般描述的是含有BDOP、FAP和/或MMP的微生物生物体，但是应了解本文中还提供了包含至少一种编码BDO、甲醛同化和/或MMPE的外源性核酸的NNOMO，所述外源性核酸以足够产生BDOP、FAP和/或MMP中间物的中间物的量表达。举例来说，如本文公开，BDOP例示在图2中。因此，除含有产生BDO的BDOP的微生物生物体外，本文中还提供了一种包含至少一种编码BDOPE的外源性核酸的NNOMO，其中所述微生物生物体产生BDOP中间物，例如丁二酰-CoA、丁二酸半醛、4-HB、4-羟基丁酰基-磷酸、4-羟基丁酰基-CoA或
4-羟基丁醛。

[0156] 在一些实施例中，可以选择碳原料和其它细胞吸收来源，例如磷酸酯、氨、硫酸酯、氯化物和其它卤素，来改变BDO和/或4-HB或任何BDO和/或4-HB途径中间物中存在的原子的同位素分布。以上列举的各种碳原料和其它吸收来源将在本文中统一称为“吸收来源”。吸收来源可以为产物BDO和/或4-HB或BDO和/或4-HB途径中间物中存在的任何
原子或与BDO和/或4-HB途径岔开的反应中产生的副产物提供同位素富集。可以针对任
何目标原子，包括例如碳、氢、氧、氮、硫、磷、氯或其它卤素实现同位素富集。这也适用于MMP和FAP以及本文中提供的其中间物。

[0157] 在一些实施例中，吸收来源可以经选择以改变碳12、碳13和碳14比率。在一些实施例中，吸收来源可以经选择以改变氧16、氧17和氧18比率。在一些实施例中，吸收来源可以经选择以改变氢、氘和氚比率。在一些实施例中，吸收来源可以经选择以改变氮14和氮15比率。在一些实施例中，吸收来源可以经选择以改变硫32、硫33、硫34和硫35比率。在一些实施例中，吸收来源可以经选择以改变磷31、磷32和磷33比率。在一些实施例中，吸收来源可以经选择以改变氯35、氯36和氯37比率。

[0158] 在一些实施例中，目标原子的同位素比可以通过选择一或多种吸收来源变化到所希望的比率。吸收来源可以来源于如在自然界中发现的天然来源，或来源于人造来源，并且本领域的技术人员可以选择天然来源、人造来源或其组合，以实现目标原子所希望的同位素比。人造吸收来源的一个实例包括例如至少部分地来源于化学合成反应的吸收来源。此类同位素富集的吸收来源可以商业上购买或在实验室中制备和/或任选地与吸收来源的天然来源混合以实现所希望的同位素比。在一些实施例中，吸收来源的目标同位素比可以通过选择如在自然界中发现的吸收来源的所希望起源来获得。举例来说，如本文中论述，天然来源可以是基于生物的，来源于生物体或例如石油基产物或大气等来源或由其合成。在一些此类实施例中，碳的来源例如可以选自源自化石燃料的碳源，其可能相对缺乏碳14；
或环境或大气压的碳源，例如CO2，其可以具有比其来源于石油的对应物更大量的碳14。

[0159] 同位素富集容易通过质谱分析，使用本领域中已知的技术，例如稳定同位素比质谱分析(SIRMS)和通过核磁共振的位点特异性天然同位素分级分离(SNIF-NMR)评估。此类质谱技术可以与例如液相色谱法(LC)和/或高效液相色谱法(HPLC)等分离技术结合。

[0160] 在地球大气中不稳定的碳同位素碳14或放射性碳在1012个碳原子中占约1个并14
且具有约5700年的半衰期。碳储存在上层大气中通过包含宇宙射线和一般氮( N)的核反
应补充。化石燃料不含碳14，因为其很久以前就衰变。化石燃料的燃烧减少大气的碳14分数，所谓的“休斯效应”。

[0161] 测定化合物中原子的同位素比的方法是本领域的技术人员众所周知的。同位素富集容易通过质谱分析，使用本领域中已知的技术，例如加速质谱分析(AMS)、稳定同位素比质谱分析(SIRMS)和通过核磁共振的位点特异性天然同位素分级分离(SNIF-NMR)评估。此类质谱技术可以与例如液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)和/或气相色谱法等分离技术结合。

[0162] 在碳的情况下，在美国由美国材料试验协会(the American Society for Testing and Materials，ASTM)国际性组织发展了ASTM D6866作为使用放射性碳测定年龄，测定固体、液体和气体样品的生物基含量的一种标准化分析法。所述标准是基于使用放射性碳测定年龄测定产物的生物基含量。ASTM D6866于2004年首次出版，并且此标准的当前有效版本是ASTMD6866-11(2011年4月1日有效)。放射性碳测定年龄技术是本领域的技术人员众所周知的，包括本文中描述的那些技术。

[0163] 化合物的生物基含量通过碳14(14C)与碳12(12C)的比率估计。确切地说，现代分数(Fm)由表达式Fm＝(S-B)/(M-B)计算，其中B、S和M分别表示空白、样品和现代参考物的14 12 14 12
C/ C比率。现代分数是样品的 C/ C比率与“现代”的偏差的测量。现代定义为相对于
13
δ CVPDB＝-19千分率标准化的国家标准局(NBS)乙二酸I(即标准参考物质(SRM)4990b)
的放射性碳浓度(AD 1950)的95％(奥尔森,使用乙二酸作为标准,放射性碳变化和
绝对年代,第12届诺贝尔讨论会汇编,约翰威立父子公司,纽约(1970)(Olsson,The
use of Oxalic acid as a Standard.in,Radiocarbon Variations and Absolute
Chronology,Nobel Symposium,12th Proc.,John Wiley&Sons,New York(1970)))。例如
13
通过ASM测量的质谱分析结果使用国际一致定义的0.95乘以相对于δ CVPDB＝-19千分
-12
率标准化的NBS乙二酸I(SRM 4990b)的比放射性计算。此相当于1.176±0.010×10
14 12
的绝对(AD 1950) C/ C比率(卡伦等人,Arkiv Geofysik,4:465-471(1968)(Karlen et
al.,Arkiv Geofysik,4:465-471(1968)))。标准计算考虑一种同位素相对于另一种同位素
12 14 13
的差异吸收，例如生物系统中C 的吸收超过C13超过C ，并且这些校正反映为针对δ 校
正的Fm。

[0164] 乙二酸标准(SRM 4990b或HOx 1)由许多1955糖用甜菜制成。虽然制造1000lb，但是乙二酸标准不再可购得。乙二酸II标准(HOx 2；N.I.S.T名称SRM 4990C)由一批1977法国甜菜糖蜜制成。在二十世纪八十年代初，一组12个实验室测量两种标准的比率。乙二酸II对I的活性的比率是1.2933±0.001(加权平均数)。HOx II的同位素比是-17.8千
分率。ASTMD6866-11建议使用可用的乙二酸II标准SRM 4990C(Hox2)用于现代标准(参
见曼恩,放射性碳,25(2):519-527(1983)(Mann,Radiocarbon,25(2):519-527(1983))中
原始对比现行的乙二酸标准的讨论)。Fm＝0％表示物质中完全缺乏碳14原子，因此指示
化石(例如石油基)碳源。在针对来自核弹测试的碳14的1950后注射到大气中进行校正
后，Fm＝100％指示完全现代的碳源。如本文中描述，此类“现代”来源包括生物基来源。

[0165] 如ASTM D6866中所描述，现代碳的百分比(pMC)可能由于1950核试验程序的持续但减弱的作用而超过100％，如ASTM D6866-11中所描述，此程序引起碳14在大气中相当大量的富集。因为所有样品碳14活性是参考“炸弹前”标准，并且因为几乎所有新的生物基产物是在炸弹后环境中产生的，所以所有pMC值(在针对同位素分数校正后)必须乘以
0.95(到2010时止)以更好地反映样品真实的生物基含量。超过103％的生物基含量表明
已经发生分析误差，或者生物基碳的来源大于若干年。

[0166] ASTM D6866定量相对于物质的总有机物含量的生物基含量，并且不考虑无机碳和其它存在的非含碳物质。举例来说，基于ASTM D6866，含有50％淀粉基物质和50％水的产物将视为具有生物基含量＝100％(100％生物基的50％有机物含量)。在另一实例中，含有50％淀粉基物质、25％石油基和25％水的产物将具有生物基含量＝66.7％(75％有机物含量但仅仅50％的产物是基于生物的)。在另一实例中，含50％有机碳并且是石油基产物的产物将视为具有生物基含量＝0％(50％有机碳但来自化石来源)。因此，基于用于测定化合物或物质的生物基含量的众所周知的方法和已知的标准，本领域的技术人员可以容易地测定生物基含量和/或具有所希望的生物基含量的制备的下游产物。

[0167] 本领域中已知碳14测定年龄技术应用于定量物质的生物基含量(库瑞等人,医学研究中的核仪器和方法B,172:281-287(2000)(Currie et al.,Nuclear Instruments
and Methods in Physics Research B,172:281-287(2000)))。举例来说，碳14测定
年龄已经用于定量含有对苯二甲酸酯的物质中的生物基含量(科罗纳等人,绿色化
学 ,13:2543-2548(2011)(Colonna et al.,Green Chemistry,13:2543-2548(2011)))。
值得注意地，来源于可再生的1,3-丙二醇和源自石油的对苯二甲酸的聚对苯二甲酸亚丙
酯(PPT)聚合物引起Fm值接近30％(即因为3/11的聚合物碳来源于可再生的1,3-丙
二醇并且8/11来源于化石端员组分对苯二甲酸)(库瑞等人,上文,2000(Currie et
al.,supra,2000))。相比之下，来源于可再生的BDO与可再生的对苯二甲酸的聚对苯二
甲酸亚丁酯聚合物引起生物基含量超过90％(科罗纳等人,上文,2011(Colonna et
al.,supra,2011))。

[0168] 因此，在一些实施例中，提供了BDO和/或4-HB或其BDO和/或4-HB途径中间物，其具有反映大气碳(又称为环境碳)吸收来源的碳12、碳13和碳14比率。举例来说，
在一些方面，BDO和/或4-HB或其BDO和/或4-HB中间物可以具有至少10％、至少15％、
至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少
98％或多达100％的Fm值。在一些此类实施例中，吸收来源是CO2。在一些实施例中，提供了BDO和/或4-HB或其BDO和/或4-HB途径中间物，其具有反映石油基的碳吸收来源的
碳12、碳13和碳14比率。在此方面，BDO和/或4-HB或其BDO和/或4-HB中间物可以具
有少于95％、少于90％、少于85％、少于80％、少于75％、少于70％、少于65％、少于60％、少于55％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于2％或少于1％的Fm值。在一些实施例中，提供了BDO和/或4-HB或其BDO和/或4-HB途径中间物，其具有通过大气碳吸收来源与石油基的吸收
来源的组合获得的碳12、碳13和碳14比率。使用此类吸收来源的组合是一种可以改变碳
12、碳13和碳14比率的方式，并且相应的比率将反映吸收来源的比例。

[0169] 此外，本发明在某种程度上涉及如本文公开的生物产生的BDO和/或4-HB或其BDO和/或4-HB途径中间物，以及来源于其的产物，其中BDO和/或4-HB或其BDO和/或
4-HB途径中间物的碳12、碳13和碳14同位素比的值大致与环境中存在的CO2一样。举例
来说，在一些方面，提供了碳12比碳13比碳14同位素比的值大致与环境中存在的CO2或
本文公开的任何其它比率一样的生物来源的BDO和/或4-HB或其生物来源的BDO和/或
4-HB中间物。如本文公开，应了解产物的碳12比碳13比碳14同位素比的值可以大致与
环境中存在的CO2或本文公开的任何比率一样，其中产物是由如本文公开的生物来源的BDO和/或4-HB或其生物来源的BDO和/或4-HB中间物产生，其中生物来源的产物经化学修
饰以产生最终产物。如本文中描述，化学修饰BDO和/或4-HB或其中间物的生物来源的
产物以产生所希望的产物的方法是本领域的技术人员众所周知的。还提供了碳12比碳13
比碳14同位素比的值大致与环境中存在的CO2一样的塑料、弹性纤维、聚氨基甲酸酯、聚酯(包括聚羟基烷酸酯，例如聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)或其共聚物)、聚(四亚甲基醚)二醇
(PTMEG)(也称为PTMO、聚氧化四亚甲基)和聚氨基甲酸酯-聚脲共聚物(称为弹力纤维、
TM
弹性烷或Lycra )、尼龙等等，其中塑料、弹性纤维、聚氨基甲酸酯、聚酯(包括聚羟基烷酸酯，例如P4HB或其共聚物)、PTMEG和聚氨基甲酸酯-聚脲共聚物(称为弹力纤维、弹性烷
TM
或Lycra )、尼龙等等直接由如本文公开的生物来源的BDO和/或4-HB或其生物来源的BDO
和/或4-HB中间物产生或与其组合。

[0170] BDO和/或4-HB是用于商业和工业应用的化学品。此类应用的非限制性实例包括生产塑料、弹性纤维、聚氨基甲酸酯、聚酯(包括聚羟基烷酸酯，例如P4HB或其共聚物)、TM
PTMEG和聚氨基甲酸酯-聚脲共聚物(称为弹力纤维、弹性烷或Lycra )、尼龙等等。此外，BDO和/或4-HB也用作产生各类产品中的原材料，这些产品包括塑料、弹性纤维、聚氨基甲酸酯、聚酯(包括聚羟基烷酸酯，例如P4HB或其共聚物)、PTMEG和聚氨基甲酸酯-聚脲共
TM
聚物(称为弹力纤维、弹性烷或Lycra )、尼龙等等。因此，在一些实施例中，提供了生物基塑料、弹性纤维、聚氨基甲酸酯、聚酯(包括聚羟基烷酸酯，例如P4HB或其共聚物)、PTMEGTM
和聚氨基甲酸酯-聚脲共聚物(称为弹力纤维、弹性烷或Lycra )、尼龙等等，其包含由本文中提供的NNOMO产生或使用本文公开的方法产生的一或多种生物来源的BDO和/或4-HB
或其生物来源的BDO和/或4-HB中间物。

[0171] 如本文所用，术语“生物来源”意指来源于生物体或由生物体合成并且因为其可以由生物体产生而可以被视为可再生的资源。此类生物体，具体地说本文公开的本发明的微生物生物体可以利用原料或生物质，例如从农业、植物、细菌或动物来源获得的糖或碳水化合物。或者，生物体可以利用大气碳。如本文所用，术语“生物基”意指如上所述，完全或部分由本发明的生物来源的化合物构成的产物。生物基或生物来源的产物与石油来源的产物形成对比，其中此类产物来源于石油或石油化工原料或由其合成。

[0172] 在一些实施例中，本发明提供了包含生物来源的BDO和/或4-HB或其生物来源的BDO和/或4-HB中间物的塑料、弹性纤维、聚氨基甲酸酯、聚酯(包括聚羟基烷酸酯，
例如P4HB或其共聚物)、PTMEG和聚氨基甲酸酯-聚脲共聚物(称为弹力纤维、弹性烷或
TM
Lycra )、尼龙等等，其中生物来源的BDO和/或4-HB或其生物来源的BDO和/或4-HB中
间物包括用于产生塑料、弹性纤维、聚氨基甲酸酯、聚酯(包括聚羟基烷酸酯，例如P4HB或TM
其共聚物)、PTMEG和聚氨基甲酸酯-聚脲共聚物(称为弹力纤维、弹性烷或Lycra )、尼龙等等的所有或一部分BDO和/或4-HB或其BDO和/或4-HB中间物。因此，在一些方面，本
发明提供了生物基塑料、弹性纤维、聚氨基甲酸酯、聚酯(包括聚羟基烷酸酯，例如P4HB或TM
其共聚物)、PTMEG和聚氨基甲酸酯-聚脲共聚物(称为弹力纤维、弹性烷或Lycra )、尼龙等等，其包含至少2％、至少3％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少
95％、至少98％或100％生物来源的BDO和/或4-HB或其生物来源的BDO和/或4-HB中
间物。另外，在一些方面，本发明提供了生物基塑料、弹性纤维、聚氨基甲酸酯、聚酯(包括聚羟基烷酸酯，例如P4HB或其共聚物)、PTMEG和聚氨基甲酸酯-聚脲共聚物(称为弹力纤
TM
维、弹性烷或Lycra )、尼龙等等，其中用于其产生的BDO和/或4-HB或其BDO和/或4-HB
中间物是生物来源与石油来源的BDO和/或4-HB或其BDO和/或4-HB中间物的组合。举
例来说，生物基塑料、弹性纤维、聚氨基甲酸酯、聚酯(包括聚羟基烷酸酯，例如P4HB或其共TM
聚物)、PTMEG和聚氨基甲酸酯-聚脲共聚物(称为弹力纤维、弹性烷或Lycra )、尼龙等等可以使用50％生物来源的BDO和/或4-HB和50％石油来源的BDO和/或4-HB或其它所
希望的比率，例如60％/40％、70％/30％、80％/20％、90％/10％、95％/5％、100％/0％、
40％/60％、30％/70％、20％/80％、10％/90％的生物来源/石油来源的前驱体产生，只要至少一部分产物包含由本文公开的微生物生物体产生的生物来源的产物即可。应了解，使用本发明的生物来源的BDO和/或4-HB或其生物来源的BDO和/或4-HB中间物产生塑料、
弹性纤维、聚氨基甲酸酯、聚酯(包括聚羟基烷酸酯，例如P4HB或其共聚物)、PTMEG和聚氨TM
基甲酸酯-聚脲共聚物(称为弹力纤维、弹性烷或Lycra )、尼龙等等的方法是本领域众所周知的。

[0173] 在一个实施例中，产物是塑料。在一个实施例中，产物是弹性纤维。在一个实施例中，产物是聚氨基甲酸酯。在一个实施例中，产物是聚酯。在一个实施例中，产物是聚羟基烷酸酯。在一个实施例中，产物是聚4-HB。在一个实施例中，产物是聚4-HB的共聚物。在一个实施例中，产物是聚(四亚甲基醚)二醇。在一个实施例中，产物是聚氨基甲酸酯-聚脲共聚物。在一个实施例中，产物是弹力纤维。在一个实施例中，产物是弹性烷。在一个实TM施例中，产物是Lycra 。在一个实施例中，产物是尼龙。

[0174] 在一些实施例中，本文中提供了一种包含生物来源的BDO的培养基。在一些实施例中，生物来源的BDO是通过培养如本文中提供的具有MMP和BDOP的NNOMO产生。在某些实施例中，生物来源的BDO具有反映大气二氧化碳吸收来源的碳12、碳13和碳14同位素
比。在一个实施例中，培养基与具有MMP和BDOP的NNOMO分离。

[0175] 在其它实施例中，本文中提供了一种生物来源的BDO。在一些实施例中，生物来源的BDO是通过培养如本文中提供的具有MMP和BDOP的NNOMO产生。在某些实施例中，生物来源的BDO具有反映大气二氧化碳吸收来源的碳12、碳13和碳14同位素比。在一些实施
例中，生物来源的BDO具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的Fm值。
在某些实施例中，生物来源的BDO是培养基的组分。

[0176] 在某些实施例中，本文中提供了一种组合物，其包含本文中提供的生物来源的BDO，例如通过培养如本文中提供的具有MMP和BDOP的NNOMO产生的生物来源的BDO。在
一些实施例中，所述组合物进一步包含除所述生物来源的BDO以外的化合物。在某些实施例中，除所述生物来源的BDO以外的化合物是痕量的如本文中提供的具有MMP和BDOP的
NNOMO的细胞部分。

[0177] 在一些实施例中，本文中提供了一种生物基产物，其包含本文中提供的生物来源的BDO。在某些实施例中，生物基产物是塑料、弹性纤维、聚氨基甲酸酯、聚酯、聚羟基烷酸酯、聚-4-HB、聚-4-HB的共聚物、聚(四亚甲基醚)二醇、聚氨基甲酸酯-聚脲共聚物、弹TM力纤维、弹性烷、Lycra 、尼龙等等。在某些实施例中，生物基产物包含至少5％生物来源的BDO。在某些实施例中，生物基产物是(i)聚合物、THF或THF衍生物或GBL或GBL衍生
物；(ii)塑料、弹性纤维、聚氨基甲酸酯、聚酯、聚羟基烷酸酯、聚-4-HB、聚-4-HB的共聚物、TM
聚(四亚甲基醚)二醇、聚氨基甲酸酯-聚脲共聚物、弹力纤维、弹性烷、Lycra 或尼龙；
(iii)聚合物、树脂、纤维、珠粒、颗粒、球粒、芯片、塑料、聚酯、热塑性聚酯、模制品、射出成型物品、射出成型部件、汽车零件、挤压树脂、电器零件和外壳；并且任选地其中生物基产物经加强或填充，并且进一步其中生物基产物经玻璃加强或填充或矿物质加强或填充；(iv)聚合物，其中聚合物包含聚对苯二甲酸亚丁酯(PBT)；(v)聚合物，其中聚合物包含PBT并且生物基产物是树脂、纤维、珠粒、颗粒、球粒、芯片、塑料、聚酯、热塑性聚酯、模制品、射出成型物品、射出成型部件、汽车零件、挤压树脂、电器零件和外壳；并且任选地其中生物基产物经加强或填充，并且进一步其中生物基产物经玻璃加强或填充或矿物质加强或填充；(vi)THF或THF衍生物，并且THF衍生物是聚四亚甲基醚二醇(PTMEG)、聚酯醚(COPE)或热塑性
聚氨基甲酸酯；(viii)THF衍生物，其中THF衍生物包含纤维；或(ix)GBL或GBL衍生物，其中GBL衍生物是吡咯烷酮。在某些实施例中，生物基产物包含至少10％生物来源的BDO。在一些实施例中，生物基产物包含至少20％生物来源的BDO。在其它实施例中，生物基产物包含至少30％生物来源的BDO。在一些实施例中，生物基产物包含至少40％生物来源的BDO。
在其它实施例中，生物基产物包含至少50％生物来源的BDO。在一个实施例中，生物基产物包含一部分所述生物来源的BDO作为重复单元。在另一个实施例中，本文中提供了一种通过模制本文中提供的生物基产物而获得的模制产物。在其它实施例中，本文中提供了一种用于产生本文中提供的生物基产物的方法，其包含使所述生物来源的BDO与本身或产生所述生物基产物的反应中的另一化合物进行化学反应。在某些实施例中，本文中提供了一种包含生物来源的BDO或通过转变生物来源的BDO获得的聚合物。在其它实施例中，本文
中提供了一种用于产生聚合物的方法，其包含将生物来源的BDO化学上或酶促转变成聚合物。在其它实施例中，本文中提供了一种组合物，其包含生物来源的BDO或其细胞溶解产物或培养物上清液。

[0178] 在一些实施例中，本文中提供了一种包含生物来源的4-HB的培养基。在一些实施例中，生物来源的4-HB是通过培养如本文中提供的具有MMP和BDO和/或4-HB途径的
NNOMO产生。在某些实施例中，生物来源的4-HB具有反映大气二氧化碳吸收来源的碳12、碳13和碳14同位素比。在一个实施例中，培养基与具有MMP和BDO和/或4-HB途径的
NNOMO分离。

[0179] 在其它实施例中，本文中提供了一种生物来源的4-HB。在一些实施例中，生物来源的4-HB是通过培养如本文中提供的具有MMP和BDO和/或4-HB途径的NNOMO产生。在某些实施例中，生物来源的4-HB具有反映大气二氧化碳吸收来源的碳12、碳13和碳14同位
素比。在一些实施例中，生物来源的4-HB具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的Fm值。在某些实施例中，生物来源的4-HB是培养基的组分。

[0180] 在某些实施例中，本文中提供了一种组合物，其包含本文中提供的生物来源的4-HB，例如通过培养如本文中提供的具有MMP和BDO和/或4-HB途径的NNOMO产生的生物
来源的4-HB。在一些实施例中，所述组合物进一步包含除所述生物来源的4-HB以外的化合物。在某些实施例中，除所述生物来源的4-HB以外的化合物是痕量的如本文中提供的具有MMP和BDO和/或4-HB途径的NNOMO的细胞部分。

[0181] 在一些实施例中，本文中提供了一种生物基产物，其包含本文中提供的生物来源的4-HB。在某些实施例中，生物基产物是塑料、弹性纤维、聚氨基甲酸酯、聚羟基烷酸酯、聚4-HB、聚4-HB的共聚物、聚(四亚甲基醚)二醇、聚氨基甲酸酯-聚脲共聚物、弹力纤维、弹TM
性烷、Lycra 或尼龙。在某些实施例中，生物基产物包含至少5％生物来源的4-HB。在某些实施例中，生物基产物包含至少10％生物来源的4-HB。在一些实施例中，生物基产物包含至少20％生物来源的4-HB。在其它实施例中，生物基产物包含至少30％生物来源的4-HB。
在一些实施例中，生物基产物包含至少40％生物来源的4-HB。在其它实施例中，生物基产物包含至少50％生物来源的4-HB。在一个实施例中，生物基产物包含一部分所述生物来源的4-HB作为重复单元。在另一个实施例中，本文中提供了一种通过模制本文中提供的生物基产物而获得的模制产物。在其它实施例中，本文中提供了一种用于产生本文中提供的生物基产物的方法，其包含使所述生物来源的4-HB与本身或产生所述生物基产物的反应中
的另一化合物进行化学反应。

[0182] 本文中还提供了一种产生甲醛的方法，其包含在足够产生甲醛的条件和时段下培养本文中提供的NNOMO(例如包含编码EM9(1J)的外源性核酸)。在某些实施例中，甲醛被消耗以提供还原当量。在其它实施例中，甲醛被消耗以并入BDO中。在其它实施例中，甲醛被消耗以并入另一目标产物中。

[0183] 本文中还提供了一种产生糖酵解中间物和/或可以用于形成生物质的代谢途径的中间物的方法，其包含在足够产生所述中间物的条件和时段下培养本文中提供的
NNOMO(例如包含编码EM9(1J)的外源性核酸)。在一个实施例中，所述方法是产生糖酵解
中间物的方法。在其它实施例中，所述方法是产生可以用于形成生物质的代谢途径的中间物的方法。在某些实施例中，中间物被消耗以提供还原当量。在其它实施例中，中间物被消耗以并入BDO中。在其它实施例中，甲醛被消耗以并入另一目标产物中。

[0184] 本发明在本文中是在一般提及代谢反应、反应物或其产物下或在特定提及一或多种编码与所提及代谢反应、反应物或产物相关联或催化其的酶或与其相关联的蛋白质的核酸或基因下描述。除非本文中另外明确地陈述，否则本领域的技术人员将了解提及反应还构成提及反应的反应物和产物。类似地，除非本文中另外明确地陈述，提及反应物或产物还提及反应，并且提及任何这些代谢成分还提及编码催化所提及反应、反应物或产物的酶或与所提及反应、反应物或产物相关的蛋白质的基因。同样地，在代谢生物化学、酶学和基因组学的众所周知的领域下，本文中提及基因或编码核酸还构成了提及对应编码的酶和其催化的反应，或与反应相关联的蛋白质，以及反应的反应物和产物。

[0185] 经由生物合成模式，使用本发明的微生物生物体产生4-HB是特别有用的，因为其可以产生单体4-HB。本发明的NNOMO和其4-HB和BDO家族化合物的生物合成也是特别有用的，因为4-HB产物可以是(1)分泌的；(2)可以缺乏任何衍生作用，例如辅酶A；(3)避免生物合成期间的热力学变化；(4)允许BDO的直接生物合成；和(5)允许在酸性pH值培养
基中4-HB到γ-丁内酯(GBL)的自发化学转变。此后一特性也特别适用于例如BDO和/
或四氢呋喃(THF)等BDO家族化合物的有效化学合成或生物合成。

[0186] 微生物生物体一般缺乏合成4-HB的能力，因此本文公开的任何化合物都在BDO家族化合物内或为本领域的技术人员知道在BDO家族化合物内。此外，并不知晓具有所有必需代谢酶能力以从本文中描述的酶和例示的生物化学途径产生4-HB的生物体。更确切些，下文进一步描述的几种厌氧微生物可能例外，微生物具有使用4-HB作为底物，产生例如丁二酸酯的酶能力。相比之下，本发明的NNOMO可以产生BDO和/或4-HB作为产物。呈单体形式的4-HB的生物合成不仅仅特别适用于BDO家族化合物的化学合成，而且也允许BDO家
族化合物的进一步生物合成并避免完全化学合成程序。

[0187] 可以产生BDO和/或4-HB的本发明的NNOMO通过确保宿主微生物生物体包括本文中提供的至少一种BDO和/或4-HB生物合成途径的完全生物化学合成的功能能力来产
生。确保至少一种必需的BDO和/或4-HB生物合成途径赋予宿主微生物生物体以BDO和
/或4-HB生物合成能力。

[0188] 生物体和方法在本文中是在一般提及代谢反应、反应物或其产物下或在特定提及一或多种编码与所提及代谢反应、反应物或产物相关联或催化其的酶或与其相关联的蛋白质的核酸或基因下描述。除非本文中另外明确地陈述，否则本领域的技术人员将了解提及反应还构成提及反应的反应物和产物。类似地，除非本文中另外明确地陈述，否则提及反应物或产物还提及反应，并且提及任何这些代谢成分还提及编码催化所提及反应、反应物或产物的酶或与所提及反应、反应物或产物相关的蛋白质的基因。同样地，在代谢生物化学、酶学和基因组学的众所周知的领域下，本文中提及基因或编码核酸还构成了提及对应编码的酶和其催化的反应，或与反应相关联的蛋白质，以及反应的反应物和产物。

[0189] 本文中描述的NNOMO可以通过引入可表达的核酸产生，所述可表达的核酸编码参与一或多种甲醇代谢、甲醛同化和/或BDO生物合成途径的一或多种酶或蛋白质。取决于选择用于生物合成的宿主微生物生物体，可以表达用于一些或所有具体甲醇代谢、甲醛同化和/或BDO生物合成途径的核酸。举例来说，如果选择的宿主缺乏用于所希望的代谢、同化或生物合成途径的一或多种酶或蛋白质，那么用于缺乏的酶或蛋白质的可表达的核酸引入宿主中以随后进行外源性表达。或者，如果选择的宿主显示一些途径基因的内源性表达，但缺乏其它，那么需要缺乏酶或蛋白质的编码核酸以实现BDO生物合成和/或甲醇代谢。因此，本文中描述的NNOMO可以通过引入外源性酶或蛋白质活性产生以获得所希望的代谢途径或生物合成途径，和/或所希望的代谢途径或生物合成途径可以通过引入一或多种外源性酶或蛋白质活性获得，所述一或多种外源性酶或蛋白质活性连同一或多种内源性酶或蛋白质一起产生所希望的产物，例如BDO。

[0190] 宿主微生物生物体可以选自例如细菌、酵母、真菌或可用于或适于发酵工艺的各种其它微生物中的任一者，以及其中产生的NNOMO。例示性细菌包括选自以下各者的
任何物种：肠内菌目(Enterobacteriales)，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，包括埃希氏杆菌属(Escherichia)和克氏杆菌属(Klebsiella)；气单胞菌目(Aeromonadales)，
琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)，包括厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)；巴
斯德氏菌目(Pasteurellales)，巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)，包括放线杆菌属
(Actinobacillus)和曼氏杆菌属(Mannheimia)；根瘤菌目(Rhizobiales)，慢生根瘤菌
科(Bradyrhizobiaceae)，包括根瘤菌属(Rhizobium)；芽孢杆菌目(Bacillales)，芽孢
杆菌科(Bacillaceae)，包括芽孢杆菌属(Bacillus)；放线菌目(Actinomycetales)，棒
状杆菌科(Corynebacteriaceae)和链霉菌科(Streptomycetaceae)，分别包括棒状杆
菌属(Corynebacterium)和链霉菌属(Streptomyces)；红螺菌目(Rhodospirillales)，
醋杆菌科(Acetobacteraceae)，包括葡糖杆菌属(Gluconobacter)；鞘脂单胞菌
目(Sphingomonadales)，鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)，包括单胞发酵菌属
(Zymomonas)；乳杆菌目(Lactobacillales)，乳杆菌科(Lactobacillaceae)和链球菌科
(Streptococcaceae)，分别包括乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus)；梭菌目(Clostridiales)，梭菌科(Clostridiaceae)，梭菌属(Clostridium)；和假单胞菌目(Pseudomonadales)，假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，包括假单胞菌属(Pseudomonas)。
宿主细菌的非限制性物种包括大肠杆菌(Escherichia coli)、产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)、产 琥珀 酸厌 氧螺 菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、琥 珀
酸放线 杆菌(Actinobacillus succinogenes)、产琥 珀酸曼 氏杆菌 (Mannheimia
succiniciproducens)、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、运动单胞发酵菌(Zymomonas mobilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭菌
(Clostridium acetobutylicum)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。

[0191] 类似地，酵母或真菌物种的例示性物种包括选自以下各者的任何物种：酵母菌目(Saccharomycetales)，酵母菌科(Saccaromycetaceae)，包括酵母菌属(Saccharomyces)、克氏酵母属(Kluyveromyces)和毕赤氏酵母属(Pichia)；酵母菌目(Saccharomycetales)，德泊达酵母科(Dipodascaceae)，包括耶罗维亚酵母属(Yarrowia)；裂殖酵母目(Schizosaccharomycetales)，裂殖酵母科(Schizosaccaromycetaceae)，包括裂殖酵
母属(Schizosaccharomyces)；散囊菌目(Eurotiales)，发菌科(Trichocomaceae)，
包括曲霉属(Aspergillus)；和毛霉菌目(Mucorales)，毛霉菌科(Mucoraceae)，
包括根霉菌属(Rhizopus)。宿主酵母或真菌的非限制性物种包括酿酒酵母
(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克
氏酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克氏酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲
霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia
pastoris)、少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)、米根霉菌(Rhizobus oryzae)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)等等。大肠杆菌是一种特别有用的宿主生物体，因为其是适于基因工程的良好表征的微生物生物体。其它特别有用的宿主生物体包括酵母，例如酿酒酵母。应了解，任何适合的微生物宿主生物体都可以用于引入代谢和/或遗传修饰以产生所希望的产物。

[0192] 在一些实施例中，宿主微生物生物体可以是与野生型微生物生物体相比丁二酸酯(丁二酸)产生增加的重组微生物生物体。增加的丁二酸酯产生可以通过引入宿主微生物生物体基因和/或外源性核酸的一或多种基因破坏来产生。增加微生物生物体中丁二酸酯产生的方法是本领域众所周知的。举例来说，宿主微生物生物体可以是重组细菌，例如瘤胃细菌，其包括选自以下各者的一或多个基因中的基因破坏：乳酸脱氢酶基因(ldhA)、丙酮酸甲酸裂合酶基因(pfl)、磷酸转乙酰酶基因(pta)和乙酸激酶基因(ackA)，如2007年3月
8日公开的美国公开案2007-0054387，现美国专利7,470,530以及2009年8月13日公开的
美国公开案2009-0203095中所描述。举例来说，在一个方面，宿主微生物生物体可以包括编码ldhA、pta和ackA的基因中的基因破坏，而不破坏编码pfl的基因。因此，在一些方面，可以用作宿主微生物生物体的细菌包括(但不限于)曼氏杆菌属(例如曼氏杆菌属LPK、
曼氏杆菌属LPK4、曼氏杆菌属LPK7、曼氏杆菌属LPK(KCTC 10558BP)、产琥珀酸曼氏杆菌MBEL55E(KCTC 0769BP)、产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)、产琥珀酸曼氏杆菌ALK或产琥珀酸曼氏杆菌ALKt)、放线杆菌属(例如琥珀酸放线杆菌)、拟杆菌属(Bacteroides)、琥珀酸单胞菌属、琥珀酸弧菌属或厌氧螺菌属(例如产琥珀酸厌氧螺菌)。

[0193] 其它用于产生丁二酸酯产生增加的宿主微生物生物体的方法也是本领域中众所周知的。举例来说，宿主微生物生物体可以具有编码ldhA、pfl和磷酸烯醇丙酮酸羧化
酶(ppc)的基因中的基因破坏，或者/另外编码葡萄糖磷酸转移酶(ptsG)和丙酮酸激
酶(pykA和pykF)的基因中的基因破坏，或者/另外编码琥珀酸半醛脱氢酶(GabD)的
基因中的基因破坏，或者/另外引入或扩增编码与丁二酸酯转运有关的C4-二羧酸转运
蛋白(DctA)的核酸，如2010年12月30日公开的美国公开案2010-0330634中所描述。
因此，宿主微生物生物体可以包括内腔细菌、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)或埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌，尤其是菌株W3110GFA，如2009年3月19日公开的美国公开案2009-0075352中公开)。作为又一个实例，丁二酸
酯产生增加的宿主微生物生物体可以通过引入编码增加丁二酸酯产生的酶或蛋白质的外
源性核酸产生，描述于2007年2月22日公开的美国公开案2007-0042476、2007年2月22
日公开的美国公开案2007-0042477和2008年1月24日公开的美国公开案2008-0020436
中，这些公开案公开了编码苹果酸酶B(maeB)、反丁烯二酸水合酶C(fumC)、甲酸脱氢酶
D(fdhD)或甲酸脱氢酶E(fdhE)的核酸的引入。其它适用的宿主微生物生物体包括(但不
限于)可以使用甘油作为碳源产生丁二酸酯的微生物生物体，如WO 2009/048202中公开，或同时使用蔗糖和甘油作为碳源，通过削弱蔗糖对甘油的分解代谢抑制机制产生丁二酸酯的生物体，如EP 2612905中所描述。

[0194] 适用作本文中描述的途径和方法的宿主微生物生物体的具有高丁二酸酯产量的其它微生物包括国际公开案WO 2010/092155和WO 2009/024294以及2010年6月24日
公开的美国公开案2010-0159542中描述的那些菌株。举例来说，作为革兰氏阴性、兼性厌氧微生物、运动、多晶和常常接触酶和氧化酶阳性的巴斯德氏菌属菌株，特别是巴斯德氏菌属菌株DD1和其变异体是适合的宿主微生物生物体。巴斯德氏菌属菌株DD1是根据布达
佩斯条约(the Budapest Treaty)寄存在德国DSMZ(德国微生物菌种保藏中心(Deutsche
Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen,GmbH))下寄存编号为DSM18541的菌
株，并且最初从德国来源的母牛的瘤胃分离。改良的DD1变异体描述于WO 2010/092155
中，也是适合的宿主微生物生物体，并且包括但不限于LU15348(pfl基因缺失的DD1)；
LU15050(ldh基因缺失的DD1)；和LU15224(pfl和ldh基因都缺失的DD1)。其它细菌寄主
包括从牛瘤胃分离的属于曼氏杆菌属的产生丁二酸酯细菌，特别是产琥珀酸曼氏杆菌，和菌株产琥珀酸曼氏杆菌MBEL55E和其变异体。

[0195] 取决于选择的宿主微生物生物体的BDO生物合成、甲醇代谢和/或FAP成分，本文中提供的NNOMO将包括至少一种外源表达的编码BDO、甲醛同化和/或MMP的核酸和多达一或多个BDO生物合成途径、FAP和/或MMP的所有编码核酸。举例来说，BDO生物合成可
以在缺乏途径酶或蛋白质的宿主中通过对应编码核酸的外源性表达建立。在缺乏BDOP的
所有酶或蛋白质的宿主中，可以包括途径中所有酶或蛋白质的外源性表达，不过应了解可以表达途径的所有酶或蛋白质，即使宿主含有至少一种途径酶或蛋白质。举例来说，可以包括用于产生BDO的途径中所有酶或蛋白质的外源性表达。这也适用于本文中提供的MMP和
FAP。

[0196] 在本文中提供的传授内容和指导下，本领域的技术人员将了解，以可表达的形式引入的编码核酸的数目将至少与选择的宿主微生物生物体的BDOP、FAP和MMP缺乏数目类似。因此，本发明的NNOMO可以具有一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或多达所有编码构成本文公开的MMP、甲醛同化和/或BDO生物合成途径的酶或蛋白质的核酸。在一些实施例中，NNOMO也可以包括促进或最佳化BDO生物合成、甲醛同化和/或甲醇代谢或赋予宿主微生物生物体以其它有用功能的其它遗传修饰。一种此类其它功能可以包括例如加强一或多种BDOP前驱体，例如α-酮戊二酸酯、丁二酸酯、反丁烯二酸酯、草酰乙酸酯、磷酸烯醇丙酮酸酯或其任何组合的合成。

[0197] 一般来说，选择宿主微生物生物体，使得其产生BDOP的前驱体，呈天然产生的分子形式，或呈工程化产物形式，提供所希望前驱体重新产生或者增加由宿主微生物生物体天然产生的前驱体的产生。宿主生物体可以如本文公开，经工程化以增加前驱体的产生。另外，已经工程化以产生所希望的前驱体的微生物生物体可以用作宿主生物体并且经进一步工程化以表达BDOP的酶或蛋白质。

[0198] 在一些实施例中，本文中提供的NNOMO由含有合成BDO、同化甲醛和/或代谢甲醇的酶能力的宿主产生。在此特定实施例中，增加BDOP产物、FAP产物和/或MMP产物(例如还原当量和/或甲醛)的合成或累积，例如推动BDOP反应向产生BDO进行可为适用的。增
加的合成或累积可以通过例如过度表达编码上述BDO、甲醛同化和/或MMP酶或蛋白质中的一或多者的核酸来实现。过度表达BDOP、甲醛同化和/或MMP的酶和/或蛋白质可以例如
通过内源性基因的外源性表达或通过异源基因的外源性表达发生。因此，天然存在的生物体可以容易地产生为例如通过过度表达一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、多达所有编码BDO生物合成途径和/或MMP酶或蛋白质的核酸产生BDO的NNOMO。天然存在
的生物体也可以容易地产生为例如通过过度表达一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、多达所有编码FAP和/或MMP酶或蛋白质的核酸同化甲醛的NNOMO。另外，N可以通
过引起BDO生物合成、甲醛同化和/或甲醇代谢途径中酶活性增加的内源性基因的突变诱
发产生。

[0199] 在特别适用的实施例中，采用编码核酸的外源性表达。外源性表达赋予宿主和应用以定制表达和/或调节元件的能力，以实现通过使用者控制的所希望的表达水平。然而，在其它实施例中，也可以利用内源性表达，例如通过在连接于可诱导启动子或其它调节元件时去除负调节效应子或诱发基因启动子。因此，具有天然存在的可诱导启动子的内源性基因可以通过提供适当的诱发剂上调，或内源性基因的调节区域可以经工程化以并入可诱导的调节元件，由此在所希望的时间调节内源性基因的表达增加。类似地，可以包括可诱导的启动子作为外源性基因引入NNOMO中的调节元件。

[0200] 应了解，在本文中提供的方法中，一或多种外源性核酸中的任一者可以引入微生物生物体中，以产生本文中提供的NNOMO。可以引入核酸以便赋予微生物生物体以例如BDO生物合成、甲醛同化和/或甲醇代谢途径。或者，可以引入编码核酸以产生具有催化一些为赋予BDO生物合成、甲醛同化和/或甲醇代谢能力所需要的反应的生物合成能力的中间微生物生物体。举例来说，具有BDOP、FAP和/或MMP的NNOMO可以包含至少两种编码所希望
的酶或蛋白质的外源性核酸。因此，应了解生物合成途径、FAP和/或代谢途径的两种或两种以上酶或蛋白质的任何组合可以包括在本文中提供的NNOMO中。类似地，应了解，生物合成途径、FAP和/或代谢途径的三种或三种以上酶或蛋白质的任何组合可以依照要求包括
在本文中提供的NNOMO中，只要所希望的生物合成途径、FAP和/或代谢途径的酶或蛋白质的组合产生对应希望的产物即可。类似地，如本文公开的生物合成途径、FAP和/或MMP的四种或四种以上酶或蛋白质的任何组合可以依照要求包括在本文中提供的NNOMO中，只要所希望的生物合成途径、同化和/或代谢途径的酶或蛋白质的组合产生对应希望的产物即可。在特定实施例中，生物合成途径是BDO生物合成途径。

[0201] 除如本文中描述，甲醇代谢、甲醛同化和BDO生物合成外，所提供的NNOMO和方法也可以呈与彼此以及与本领域中众所周知的通过其它途径实现产物生物合成的其它微生物生物体和方法的各种组合利用。举例来说，除使用BDO生产者以外，产生BDO的一种替代方法是通过添加能够将BDOP中间物转变成BDO的另一微生物生物体。一种此类程序包括例如产生BDOP中间物的微生物生物体的发酵。接着BDOP中间物可以用作将BDOP中间物转
变成BDO的第二微生物生物体的底物。BDOP中间物可以直接添加到第二生物体的另一培养物，或BDOP中间物生产者的原始培养物可以通过例如细胞分离来从这些微生物生物体除
掉，接着随后可以利用第二生物体添加到发酵液以产生最终产物而没有中间纯化步骤。这也适用于本文中提供的MMP和FAP。

[0202] 在其它实施例中，本文中提供的NNOMO和方法可以装配在多种子途径中以实现例如BDO的生物合成。在这些实施例中，所希望的产物的生物合成途径可以分离成不同的微生物生物体，并且不同的微生物生物体可以共同培养以产生最终产物。在此类生物合成方案中，一种微生物生物体的产物是第二微生物生物体的底物，直到合成最终产物。举例来说，BDO的生物合成可以通过构筑含有将一种途径中间物转变成另一途径中间物或产物的生物合成途径的微生物生物体实现。或者，BDO也可以由微生物生物体，通过使用两种生物体在相同容器中共同培养或共同发酵，以生物合成方式产生，其中第一微生物生物体产生BDO中间物并且第二微生物生物体将中间物转变成BDO。这也适用于本文中提供的MMP和FAP。

[0203] 在本文中提供的传授内容和指导下，本领域的技术人员将了解，NNOMO和方法连同其它微生物生物体、具有子途径的其它NNOMO的共培养和本领域中众所周知的产生BDO和/或代谢甲醇的其它化学和/或生物化学程序的组合进行多种组合和置换。

[0204] BDO、甲醛同化或MMP酶或蛋白质的编码核酸的来源可以包括例如其中编码基因产物能够催化所提及反应的任何物种。此类物种包括原核与真核生物，包括(但不限于)：
细菌，包括古生菌(archaea)和真细菌(eubacteria)；和真核生物，包括酵母、植物、昆虫、动物和哺乳动物，包括人类。此类来源的例示性物种包括例如大肠杆菌、酿酒酵母、克氏酵母(Saccharomyceskluyveri)、博伊丁念珠菌(Candida boidinii)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium
beijerinckii)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、产
气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、肉毒
杆菌(Clostridium botulinum)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、破伤风
形梭菌(Clostridium tetanomorphum)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、丙酸梭
菌(Clostridium propionicum)、氨基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)、偏
端梭菌(Clostridium subterminale)、斯氏梭菌(Clostridium sticklandii)、罗尔
斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、结核分枝杆
菌(Mycobacterium tuberculosis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、
拟南芥(Arabidopsis thaliana)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、假单胞菌
属(Pseudomonas species)(包括绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞
菌(Pseudomonas putida)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、荧光假单胞菌
(Pseudomonas fluorescens))、智人(Homo sapiens)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、球形红细菌(Rhodobacter spaeroides)、布氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)、勤奋金属球菌(Metallosphaera sedula)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、嗜热光合绿曲菌(Chloroflexus aurantiacus)、卡斯特玫瑰弯 菌(Roseiflexus
castenholzii)、赤细菌属(Erythrobacter)、希蒙得木(Simmondsia chinensis)、不动杆菌属(Acinetobacter species)(包括醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)
和拜伊不动杆菌(Acinetobacter baylyi))、牙龈卟啉单胞菌、超嗜热广古菌硫化叶菌
(Sulfolobus tokodaii)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumonia)、产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)、纤细眼虫(Euglena gracilis)、
齿密螺旋体(Treponema denticola)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、海
栖热袍菌(Thermotoga maritima)、嗜盐杆菌(Halobacterium salinarum)、嗜热脂肪
地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、泉生古细菌(Aeropyrum pernix)、
野猪(Sus scrofa)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、谷氨酸棒状杆菌
(Corynebacterium glutamicum)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、乳
酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、嗜热链球
菌(Streptococcus thermophilus)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、念珠菌属
(Candida)、土曲霉(Aspergillus terreus)、戊糖片球菌(Pedicoccus pentosaceus)、
运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilus)、帕斯醋酸菌(Acetobacter pasteurians)、乳
酸克氏酵母(Kluyveromyces lactis)、巴克真细菌(Eubacterium barkeri)、卵形拟杆
菌(Bacteroides capillosus)、大肠厌氧菌(Anaerotruncus colihominis)、嗜热盐碱
厌氧菌(Natranaerobius thermophilusm)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、流
感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、灵杆菌(Serratia marcescens)、无丙二酸柠
檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)、核粒梭形
杆菌(Fusobacterium nuleatum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、海洋γ变形
菌(marine gamma proteobacterium)、产丁酸细菌(butyrate-producing bacterium)、
艾维诺卡氏菌(Nocardia iowensis)、鼻疽诺卡氏菌(Nocardia farcinica)、灰色链霉
菌(Streptomyces griseus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、嗜热葡糖
苷酶芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella
typhimurium)、弧菌霍乱(Vibrio cholera)、幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)、普通烟草(Nicotiana tabacum)、稻(Oryza sativa)、地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、反硝化无色杆菌(Achromobacter
denitrificans)、核 粒 梭 形 杆 菌(Fusobacterium nucleatum)、带 小 棒 链 霉 菌(Streptomyces clavuligenus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、小家鼠(Mus musculus)、克氏芽殖酵母(Lachancea kluyveri)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、施氏假单胞菌、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium
japonicum)、百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)、黄牛(Bos taurus)、粘毛烟草
(Nicotiana glutinosa)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、死 海 盐 盒 菌(Haloarcula marismortui)、嗜 气 火 棒 菌 (Pyrobaculum aerophilum)、包皮垢分支杆菌MC2155(Mycobacterium smegmatis MC2155)、鸟分枝杆菌亚种副结核K-10(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis K-10)、海鱼分枝杆菌M(Mycobacterium marinum M)、稍变冢村氏菌DSM 20162(Tsukamurella paurometabola DSM 20162)、蓝 菌PCC7001(Cyanobium PCC7001)、盘 基 网 柄 菌 AX4(Dictyostelium discoideum AX4)以及本文公开或可用作对应基因的原始生物体的其它例示性物种。

[0205] 在某些实施例中，BDO、甲醛同化或MMP酶或蛋白质的编码核酸的来源包括鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii Naval-82)、不动杆菌属ADP1(Acinetobacter
sp.ADP1)、不 动 杆 菌 属 菌 株M-1(Acinetobacter sp.strain M-1)、琥 珀 酸 放 线杆 菌 130Z(Actinobacillus succinogenes 130Z)、红 色 硫 黄 光 合 成 细 菌 DSM
180(Allochromatium vinosum DSM 180)、甲 醇 拟 无 枝 菌 酸 菌 (Amycolatopsis
methanolica)、拟南芥、极小阿托波氏菌DSM 20469(Atopobium parvulum DSM 20469)、维氏固氮菌DJ(Azotobacter vinelandii DJ)、嗜碱芽孢杆菌ATCC 27647(Bacillus
alcalophilus ATCC 27647)、产氮芽孢杆 菌LMG 9581(Bacillus azotoformans LMG
9581)、凝结芽孢杆菌36D1(Bacillus coagulans 36D1)、巨大芽孢杆菌(Bacillus
megaterium)、甲醇芽孢杆菌MGA3(Bacillus methanolicus MGA3)、甲醇芽孢杆菌
PB1(Bacillus methanolicus PB1)、甲 醇 芽 孢 杆 菌 PB-1(Bacillus methanolicus PB-1)、还原硒酸盐芽孢杆菌MLS10(Bacillus selenitireducens MLS10)、斯密氏
芽孢杆菌(Bacillus smithii)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、新洋葱伯克氏菌
(Burkholderia cenocepacia)、洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)、多噬伯克氏
菌(Burkholderia multivorans)、吡咯伯克氏菌(Burkholderia pyrrocinia)、稳定伯
克氏菌(Burkholderia stabilis)、泰国伯克氏菌E264(Burkholderia thailandensis
E264)、伯克氏菌Joshi_001(Burkholderiales bacterium Joshi_001)、产生丁酸细菌
L2-50(Butyrate-producing bacterium L2-50)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、白色念珠菌(Candida albicans)、博伊丁念珠菌(Candida boidinii)、甲基念珠菌
(Candida methylica)、高温嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)、高温嗜热
菌Z-2901(Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901)、柄杆菌属AP07(Caulobacter sp.AP07)、侵袭性绿曲菌DSM 9485(Chloroflexus aggregans DSM 9485)、嗜热光合
绿曲菌J-10-fl(Chloroflexus aurantiacus J-10-fl)、弗氏柠檬细菌(Citrobacter
freundii)、克氏柠檬酸杆菌ATCC BAA-895(Citrobacter koseri ATCC BAA-895)、杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)、梭菌属(Clostridium)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、丙酮丁醇梭菌ATCC 824(Clostridium acetobutylicum ATCC 824)、
食酸梭菌(Clostridium acidurici)、氨基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)、
天冬梭菌DSM15981(Clostridium asparagiforme DSM 15981)、拜氏梭菌(Clostridium
beijerinckii)、拜 氏 梭 菌 NCIMB 8052(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052)、
鲍氏梭菌ATCC BAA-613(Clostridium bolteae ATCC BAA-613)、食一氧化碳梭菌
P7(Clostridium carboxidivorans P7)、食 纤 维 梭 菌 (Clostridium cellulovorans
743B)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、海拉梭菌DSM 13275(Clostridium hiranonis DSM 13275)、海氏梭菌DSM 15053(Clostridium hylemonae DSM 15053)、克氏梭菌
(Clostridium kluyveri)、克氏梭菌DSM 555(Clostridium kluyveri DSM 555)、永达
尔梭菌(Clostridium ljungdahli)、永达尔梭菌DSM 13528(Clostridium ljungdahlii
DSM 13528)、甲基戊糖梭菌DSM5476(Clostridium methylpentosum DSM 5476)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、巴氏梭菌DSM 525(Clostridium pasteurianum DSM 525)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、产气荚膜梭菌ATCC 13124(Clostridium
perfringens ATCC 13124)、产气荚膜梭菌菌株13(Clostridium perfringens str.13)、植物发酵梭菌ISDg(Clostridium phytofermentans ISDg)、糖丁酸梭菌(Clostridium
saccharobutylicum)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、糖 乙 酸 多 丁 醇 梭 菌 N1-4(Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067(Corynebacterium
glutamicum ATCC 14067)、谷 氨 酸 棒 状 杆 菌 R(Corynebacterium glutamicum R)、棒状 杆 菌属U-96(Corynebacterium sp.U-96)、变 异棒 状 杆菌 (Corynebacterium
variabile)、钩虫贪铜菌N-1(Cupriavidus necator N-1)、蓝菌PCC7001、烯烃脱硫菌
AK-01(Desulfatibacillum alkenivorans AK-01)、哈氏脱硫菌(Desulfitobacterium
hafniense)、金 属 还 原 脱 硫 菌 DSM 15288(Desulfitobacterium metallireducens DSM 15288)、还 原 脱硫 菌MI-1(Desulfotomaculum reducens MI-1)、非 洲脱 硫 弧
菌菌株沃尔维斯湾(Desulfovibrio africanus str.Walvis Bay)、果糖脱硫弧菌
(Desulfovibrio fructosovorans JJ)、普通脱硫弧菌菌株黑登伯(Desulfovibrio
vulgaris str.Hildenborough)、普通脱硫弧菌菌株‘宫崎F’(Desulfovibrio vulgaris str.'Miyazaki F')、盘基网柄菌AX4、大肠杆菌、大肠杆菌K-12(Escherichia coli
K-12)、大 肠 杆 菌K-12MG1655(Escherichia coli K-12MG1655)、霍 氏 真 杆 菌 DSM
3353(Eubacterium hallii DSM 3353)、寒冷黄杆菌(Flavobacterium frigoris)、核
粒梭形 杆菌亚 种多 形ATCC 10953(Fusobacterium nucleatum subsp.polymorphum
ATCC 10953)、土芽孢杆菌属Y4.1MC1(Geobacillus sp.Y4.1MC1)、嗜热土芽 孢杆
菌 NG80-2(Geobacillus themodenitrificans NG80-2)、贝 氏 地 杆 菌 (Geobacter
bemidjiensis Bem)、硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)、硫还原地杆菌
PCA(Geobacter sulfurreducens PCA)、嗜热脂肪地芽孢杆菌DSM 2334(Geobacillus
stearothermophilus DSM 2334)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺
杆菌(Helicobacter pylori)、智人(Homo sapiens)、嗜热氢杆菌(Hydrogenobacter
thermophilus)、嗜热氢杆菌TK-6(Hydrogenobacter thermophilus TK-6)、反硝化生
丝微菌ATCC 51888(Hyphomicrobium denitrificans ATCC 51888)、札氏生丝微 菌
(Hyphomicrobium zavarzinii)、肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、肺炎克氏
杆菌亚种肺炎MGH 78578(Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae MGH 78578)、
短乳杆菌ATCC 367(Lactobacillus brevis ATCC 367)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc
mesenteroides)、纺缍形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)、百脉根根瘤菌MAFF303099(Mesorhizobium loti MAFF303099)、勤奋金属球菌、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、
噬乙酸甲烷八叠球菌C2A(Methanosarcina acetivorans C2A)、巴氏甲烷八叠球菌
(Methanosarcina barkeri)、马氏甲烷八叠球菌Tuc01(Methanosarcina mazei Tuc01)、海洋甲基细菌(Methylobacter marinus)、扭脱甲基杆菌、扭脱甲基杆菌AM1、荚膜甲基
球菌(Methylococcus capsulatas)、临氨甲基单胞菌(Methylomonas aminofaciens)、
热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、分枝杆菌属菌株JC1DSM 3803(Mycobacter
sp.strain JC1DSM 3803)、鸟分枝杆菌亚种副结核K-10(Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis K-10)、牛分枝杆菌BCG(Mycobacterium bovis BCG)、胃分枝杆菌
(Mycobacterium gastri)、海鱼分枝杆菌M、包皮垢分支杆菌、包皮垢分支杆菌MC2155、结核分枝杆菌、萨拉亚硝化短小杆菌BD31(Nitrosopumilus salaria BD31)、加尔加亚硝化球菌Ga9.2(Nitrososphaera gargensis Ga9.2)、鼻疽诺卡氏菌IFM 10152(Nocardia farcinica IFM 10152)、艾维诺卡氏菌(NRRL 5646属)、念珠藻属PCC 7120(Nostoc sp.PCC 7120)、安氏奥格菌(Ogataea angusta)、副多形性奥格菌DL-1(Ogataea parapolymorpha
DL-1)(多形汉森酵母DL-1(Hansenula polymorpha DL-1))、皮奥利亚类芽孢杆菌KCTC
3763(Paenibacillus peoriae KCTC 3763)、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、嗜压发光菌3TCK(Photobacterium profundum
3TCK)、植物发酵梭菌ISDg(Phytofermentans ISDg)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia
pastoris)、嗜苦古菌DSM9790(Picrophilus torridus DSM9790)、牙龈卟啉单胞菌、牙龈卟啉单胞菌W83(Porphyromonas gingivalis W83)、绿脓杆菌PA01(Pseudomonas aeruginosa PA01)、反硝化假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)、纳克假单胞菌(Pseudomonas
knackmussii)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、假单胞菌属(Pseudomonas sp)、丁香假单胞菌丁香致病变种B728a(Pseudomonas syringae pv.syringae B728a)、冰岛热棒菌DSM 4184(Pyrobaculum islandicum DSM 4184)、深海火球菌(Pyrococcus abyssi)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、掘越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii OT3)、罗尔
斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、罗尔斯通氏菌H16(Ralstonia eutropha H16)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、球形红细菌ATCC 17025(Rhodobacter sphaeroides ATCC17025)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、沼泽红假单胞菌CGA009(Rhodopseudomonas palustris CGA009)、沼泽红
假单胞菌DX-1(Rhodopseudomonas palustris DX-1)、深红红螺菌(Rhodospirillum
rubrum)、深红 红 螺 菌ATCC 11170(Rhodospirillum rubrum ATCC 11170)、卵 瘤 胃
球 菌ATCC 29174(Ruminococcus obeum ATCC 29174)、酿 酒 酵 母 (Saccharomyces
cerevisiae)、酿酒酵母S288c(Saccharomyces cerevisiae S288c)、肠道沙门氏菌
(Salmonella enterica)、肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌菌株LT2(Salmonella
enterica subsp.enterica serovar Typhimurium str.LT2)、鼠伤寒肠道沙门氏菌
(Salmonella enterica typhimurium)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、白蚁塞巴鲁德菌ATCC 33386(Sebaldella
termitidis ATCC 33386)、沙雷菌MR-1(Shewanella oneidensis MR-1)、苜蓿中华根瘤
菌1021(Sinorhizobium meliloti 1021)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰
色链霉菌亚种灰色NBRC 13350(Streptomyces griseus subsp.griseus NBRC 13350)、
高温酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocalarius)、硫磺矿硫化叶菌P-2(Sulfolobus
solfataricus P-2)、集胞藻属菌株PCC 6803(Synechocystis str.PCC 6803)、富马氧
化互营杆菌(Syntrophobacter fumaroxidans)、芳族陶厄氏菌(Thauera aromatica)、
热厌氧杆菌属X514(Thermoanaerobacter sp.X514)、柯氏超嗜热古菌(Thermococcus
kodakaraensis)、嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、嗜中性热变形菌(Thermoproteus neutrophilus)、海栖热袍菌、桃红荚硫菌(Thiocapsa roseopersicina)、奥氏甲苯单胞菌DSM 9187(Tolumonas auensis DSM
9187)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis G3)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、稍变冢村氏菌DSM 20162、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、哈氏弧菌ATCC BAA-1116(Vibrio
harveyi ATCC BAA-1116)、自养黄色杆菌Py2(Xanthobacter autotrophicus Py2)、耶尔森氏菌属中间物(Yersinia intermedia)或玉蜀黍(Zea mays)。

[0206] 然而，在现在超过550个物种的完全基因组序列(其中大半可得自例如NCBI等公共数据库)可获得下，包括395个微生物基因组和多种酵母、真菌、植物和哺乳动物基因组，相关或远缘物种中，包括例如已知基因的同源物、直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置换在内，编码一或多个基因的必需BDO或4-HB生物合成途径、甲醇代谢和/或甲醛同
化活性的基因的鉴别以及生物体之间的遗传改变的互换是本领域中常规和众所周知的。因此，允许本文中关于具体的生物体(例如大肠杆菌)描述的BDO或4-HB的生物合成、甲醇代谢和/或甲醛同化的代谢改变可以同样容易地应用于其它微生物，包括原核和真核生物。
在本文中提供的传授内容和指导下，本领域的技术人员将知道在一种生物体中例示的代谢改变可以同等应用于其它生物体。

[0207] 在一些情况下，例如当替代BDO生物合成、甲醛同化和/或MMP存在于无关的物种中时，BDO生物合成、甲醛同化和/或甲醇代谢可以通过例如来自无关的物种的催化类似但非一致代谢反应以替换提及反应的旁系同源物的外源性表达赋予宿主物种。因为代谢网络中的某些差异存在于不同生物体之间，所以本领域的技术人员将了解不同生物体之间的实际基因用途可以不同。然而，在本文中提供的传授内容和指导下，本领域的技术人员也将了解本文中提供的传授内容和方法可以使用对本文中例示的代谢改变的同源代谢改变在相关物种中构筑将合成BDO、同化甲醛和/或代谢甲醇的微生物生物体，而应用于所有微生物生物体。

[0208] 用于构筑和测试非天然存在的产生BDO的宿主的表达水平的方法可以例如通过本领域中众所周知的重组和检测方法进行。此类方法可以发现描述于例如萨姆布鲁克等
人,分子克隆：实验室指南,第三版,冷泉港实验室,纽约(2001)；和奥苏伯尔等人,现
代分子生物学实验技术,约翰威立父子出版公司,马里兰州巴尔的摩(1999)。

[0209] 参与甲醇代谢、甲醛同化和/或BDO产生的途径的外源性核酸序列可以使用本领域中众所周知的技术，包括(但不限于)结合、电穿孔、化学转化、转导、转染和超声波转化，稳定或短暂地引入宿主细胞中。对于大肠杆菌或其它原核细胞中的外源性表达，真核核酸的基因或cDNA中的一些核酸序列可以编码靶向信号，例如N末端粒线体或其它靶向信号，需要时，其可以在转化到原核宿主细胞前去除。举例来说，粒线体前导序列的去除引起大肠杆菌中表达的增加(霍夫迈斯特等人,生物化学杂志280:4329-4338(2005)(Hoffmeister
et al.,J.Biol.Chem.280:4329-4338(2005)))。对于酵母或其它真核细胞中的外源性表
达，基因可以在不添加前导序列下在细胞液中表达，或可以靶向粒线体或其它细胞器，或通过添加适合的靶向序列，例如适于宿主细胞的粒线体靶向或分泌信号，靶向分泌。因此，应了解为去除或包括靶向序列而对核酸序列的适当修饰可以并入外源性核酸序列中以赋予
合乎需要的特性。此外，基因可以用本领域中众所周知的技术进行密码子最佳化，以实现蛋白质的最佳化表达。

[0210] 表达载体可以经构筑以包括一或多种如本文中例示的BDO生物合成、甲醛同化和/或MMP编码核酸，其可操作地连接于在宿主生物体中具有功能性的表达控制序列。可应用于所提供的微生物宿主生物体的表达载体包括例如质体、噬菌体载体、病毒性载体、游离体和人造染色体，包括可操作用于稳定整合到宿主染色体中的载体和选择序列或标记物。另外，表达载体可以包括一或多种可选择的标记物基因和适当的表达控制序列。也可以包括例如提供对抗生素或毒素的抗性、补充营养缺陷不足或供应培养基中缺乏的关键养分的可选择的标记物基因。表达控制序列可以包括在本领域中众所周知的组成性和可诱导启动子、转录强化子、转录终止子等等。当两种或两种以上外源性编码核酸有待共同表达时，两种核酸可以插入例如到单一表达载体或分开的表达载体中。对于单一载体表达，编码核酸可以操作性地连接于一种共同的表达控制序列或连接于不同的表达控制序列，例如一种可诱导启动子和一种组成性启动子。参与代谢或合成途径的外源性核酸序列的转化可以使用本领域中众所周知的方法证实。此类方法包括例如核酸分析，例如mRNA的RNA印迹或聚合酶链反应(PCR)扩增；或用于表达基因产物的免疫印迹；或测试引入的核酸序列或其对应基因产物的表达的其它适合的分析法。本领域的技术人员了解，外源性核酸以足够产生所希望产物的量表达，并且进一步了解表达水平可以使用本领域中众所周知并且如本文公开的方法最佳化以获得足够的表达。

[0211] 适合的纯化和/或测试例如BDO产生的分析可以使用众所周知的方法进行。例如一式三份培养物等适合的重复培养物可以针对待测试的每个工程化菌株生长。举例来说，可以监测工程化产生宿主中产物和副产物的形成。最终产物和中间物以及其它有机化合物可以通过例如HPLC(高效液相色谱法)、GC-MS(气相色谱法-质谱分析)和LC-MS(液体色
谱法-质谱分析)或其它适合的分析法等方法使用本领域中众所周知的常规程序分析。发
酵液中产物的释放也可以用培养物上清液测试。副产物和残余葡萄糖可以通过HPLC，使用例如针对葡萄糖和醇的折光率检测器和针对有机酸的UV检测器(林等人,生物技术与生
物工程90:775-779(2005)(Lin et al.,Biotechnol.Bioeng.90:775-779(2005))，或本领域中众所周知的其它适合的分析和检测方法定量。来自外源性DNA序列的个别酶或蛋白质活性也可以使用本领域中众所周知的方法分析。甲醇脱氢酶活性的例示性分析(图1步骤
J)提供于实例I中。

[0212] BDO可以使用本领域中众所周知的各种方法与培养物中的其它组分分离。此类分离方法包括例如萃取程序以及包括连续液-液萃取、全蒸发、膜过滤、膜分离、逆渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取过滤、离子交换色谱法、空间排阻色谱法、吸附色谱法和超滤的方法。上述所有方法都是本领域众所周知的。

[0213] 本文中描述的任何NNOMO都可以培养，产生和/或分泌生物合成产物或其中间物。举例来说，BDO生产者可以培养用于BDO的生物合成产生。因此，在一些实施例中，提供了一种具有本文中描述的BDO、甲醛同化和/或MMP中间物的培养基。在一些方面，培养基也可以与本文中提供的产生BDO、甲醛同化和/或MMP中间物的NNOMO分离。用于分离微生物
生物体与培养基的方法是本领域众所周知的。例示性方法包括过滤、絮凝、沉淀、离心、沉降等等。

[0214] 在某些实施例中，举例来说，为了产生BDO，重组菌株在具有碳源和其它必需养分的培养基中培养。维持发酵罐中的厌氧条件有时是合乎需要的以降低整个工艺的成本并且可能是高度合乎需要的。此类条件可以例如通过首先将培养基充氮气，接着用隔膜和螺旋盖密封烧瓶来获得。对于在厌氧下未观测到生长的菌株，可以通过将隔膜穿孔，具有小孔用于有限通风，来施加微需氧或实质上厌氧条件。先前已经描述例示性厌氧条件并且是本领域中众所周知的。例示性需氧和厌氧条件描述于例如美国公开案第2009/0047719号中。发酵可以依分批、分批补料或连续的方式进行，如本文所公开。需要时，发酵也可以分两个阶段进行。第一阶段可以是需氧的，以允许高度生长，因此高产量，接着是高BDO产率的厌氧相。

[0215] 需要时，培养基的pH值可以通过如维持培养基在合乎需要的pH值下所需要，添加碱，例如NaOH或其它碱，或酸来维持在所希望的pH值，尤其是中性pH值下，例如约pH 7。生长速率可以通过使用分光光度计(600nm)测量光密度来测定，并且葡萄糖吸收速率通过监测随着时间推移碳源的耗尽来测定。

[0216] 生长培养基可以包括例如能够供应碳源到NNOMO的任何碳水化合物来源。此类来源包括例如糖，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉；或甘油，单独作为碳的唯一来源或与本文中描述或本领域中已知的其它碳源组合。在一个实施例中，碳源是糖。在一个实施例中，碳源是含糖生物质。在一些实施例中，糖是葡萄糖。在一个实施例中，糖是木糖。在另一个实施例中，糖是阿拉伯糖。在一个实施例中，糖是半乳糖。在另一个实施例中，糖是果糖。在其它实施例中，糖是蔗糖。在一个实施例中，糖是淀粉。在某些实施例中，碳源是甘油。在一些实施例中，碳源是粗甘油。在一个实施例中，碳源是未经处理的粗甘油。在其它实施例中，碳源是甘油和葡萄糖。在另一个实施例中，碳源是甲醇和甘油。在一个实施例中，碳源是二氧化碳。在一个实施例中，碳源是甲酸酯。在一个实施例中，碳源是甲烷。在一个实施例中，碳源是甲醇。在某些实施例中，甲醇单独作为碳的唯一来源使用或与本文中描述或本领域中已知的其它碳源组合使用。在一个特定实施例中，甲醇是仅有的(唯一的)碳源。在一个实施例中，碳源是化电产生的碳(参见例如廖等人(2012)科学335:1596(Liao et al.(2012)Science 335:1596))。在一个实施例中，化电产生的碳是甲醇。在一个实施例中，化电产生的碳是甲酸酯。在一个实施例中，化电产生的碳是甲酸酯和甲醇。在一个实施例中，碳源是碳水化合物和甲醇。在一个实施例中，碳源是糖和甲醇。在另一个实施例中，碳源是糖和甘油。在其它实施例中，碳源是糖和粗甘油。在其它实施例中，碳源是糖和未经处理的粗甘油。在一个实施例中，碳源是含糖生物质和甲醇。
在另一个实施例中，碳源是含糖生物质和甘油。在其它实施例中，碳源是含糖生物质和粗甘油。在其它实施例中，碳源是含糖生物质和未经处理的粗甘油。在一些实施例中，碳源是含糖生物质、甲醇和碳水化合物。碳水化合物的其它来源包括例如可再生的原料和生物质。
可以作为原料用于本文中提供的方法中的生物质的例示性类型包括纤维素生物质、半纤维素生物质和木质素原料或原料部分。此类生物质原料含有例如适用作碳源的碳水化合物底物，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。在本文中提供的传授内容和指导下，本领域的技术人员将了解，除以上例示的原料和生物质以外的可再生的原料和生物质也可以用于培养本文中提供的用于产生BDO和其它途径中间物的微生物生物体。

[0217] 在一个实施例中，碳源是甘油。在某些实施例中，甘油碳源是粗甘油或未经进一步处理的粗甘油。在另一个实施例中，碳源包含甘油或粗甘油，以及糖或含糖生物质，例如葡萄糖。在一个特定实施例中，发酵液中甘油的浓度通过馈入粗甘油或粗甘油与糖(例如葡萄糖)的混合物来维持。在某些实施例中，提供糖以供足够的菌株生长。在一些实施例中，糖(例如葡萄糖)以200:1到1:200的甘油与糖摩尔浓度比提供。在一些实施例中，糖(例如葡萄糖)以100:1到1:100的甘油与糖摩尔浓度比提供。在一些实施例中，糖(例如葡萄
糖)以100:1到5:1的甘油与糖摩尔浓度比提供。在一些实施例中，糖(例如葡萄糖)以
50:1到5:1的甘油与糖摩尔浓度比提供。在某些实施例中，糖(例如葡萄糖)以100:1的
甘油与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以90:1的甘油与糖摩尔浓
度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以80:1的甘油与糖摩尔浓度比提供。在一
个实施例中，糖(例如葡萄糖)以70:1的甘油与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖
(例如葡萄糖)以60:1的甘油与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)
以50:1的甘油与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以40:1的甘油
与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以30:1的甘油与糖摩尔浓度比
提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以20:1的甘油与糖摩尔浓度比提供。在一个实
施例中，糖(例如葡萄糖)以10:1的甘油与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例
如葡萄糖)以5:1的甘油与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以2:1
的甘油与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:1的甘油与糖摩尔浓度比提供。在某些实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:100的甘油与糖摩尔浓度比提供。在
一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:90的甘油与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，
糖(例如葡萄糖)以1:80的甘油与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄
糖)以1:70的甘油与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:60的
甘油与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:50的甘油与糖摩尔浓
度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:40的甘油与糖摩尔浓度比提供。在一
个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:30的甘油与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖
(例如葡萄糖)以1:20的甘油与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)
以1:10的甘油与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:5的甘油与
糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:2的甘油与糖摩尔浓度比提
供。在以上提供的比率的某些实施例中，糖是含糖生物质。在以上提供的比率的某些其它实施例中，甘油是粗甘油或未经进一步处理的粗甘油。在以上提供的比率的其它实施例中，糖是含糖生物质，并且甘油是粗甘油或未经进一步处理的粗甘油。

[0218] 粗甘油可以是在生物柴油产生中产生的副产物，并且可以未经任何进一步处理即用于发酵。生物柴油产生方式包括(1)化学方法，其中通过在酸或碱催化剂存在下的酯交换，植物油或动物油的甘油基经例如甲醇或乙醇等低碳醇取代，产生对应脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯；(2)生物方法，其中生物酶或细胞用以催化酯交换反应并且产生对应脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯；和(3)超临界方法，其中酯交换反应在没有任何催化剂的超临界溶剂系统中进行。粗甘油的化学组成可以随用于产生生物柴油的工艺、酯交换效率、生物柴油的回收效率、原料中的其它杂质和是否回收甲醇和催化剂而变。举例来说，从七个澳大利亚生物柴油厂商收集的十一种粗甘油的化学组成据报导甘油含量介于38％与96％范围中间，其中一些样品包括超过14％甲醇和29％灰分。在某些实施例中，粗甘油包含5％到99％甘油。在一些实施例中，粗甘油包含10％到90％甘油。在一些实施例中，粗甘油包含10％到
80％甘油。在一些实施例中，粗甘油包含10％到70％甘油。在一些实施例中，粗甘油包含
10％到60％甘油。在一些实施例中，粗甘油包含10％到50％甘油。在一些实施例中，粗甘油包含10％到40％甘油。在一些实施例中，粗甘油包含10％到30％甘油。在一些实施例
中，粗甘油包含10％到20％甘油。在一些实施例中，粗甘油包含80％到90％甘油。在一些实施例中，粗甘油包含70％到90％甘油。在一些实施例中，粗甘油包含60％到90％甘油。
在一些实施例中，粗甘油包含50％到90％甘油。在一些实施例中，粗甘油包含40％到90％甘油。在一些实施例中，粗甘油包含30％到90％甘油。在一些实施例中，粗甘油包含20％到90％甘油。在一些实施例中，粗甘油包含20％到40％甘油。在一些实施例中，粗甘油包含40％到60％甘油。在一些实施例中，粗甘油包含60％到80％甘油。在一些实施例中，粗甘油包含50％到70％甘油。在一个实施例中，甘油包含5％甘油。在一个实施例中，甘油包含10％甘油。在一个实施例中，甘油包含15％甘油。在一个实施例中，甘油包含20％甘油。在一个实施例中，甘油包含25％甘油。在一个实施例中，甘油包含30％甘油。在一个实施例中，甘油包含35％甘油。在一个实施例中，甘油包含40％甘油。在一个实施例中，甘油包含45％甘油。在一个实施例中，甘油包含50％甘油。在一个实施例中，甘油包含55％甘油。在一个实施例中，甘油包含60％甘油。在一个实施例中，甘油包含65％甘油。在一个实施例中，甘油包含70％甘油。在一个实施例中，甘油包含75％甘油。在一个实施例中，甘油包含80％甘油。在一个实施例中，甘油包含85％甘油。在一个实施例中，甘油包含90％甘油。在一个实施例中，甘油包含95％甘油。在一个实施例中，甘油包含99％甘油。

[0219] 在一个实施例中，碳源是甲醇或甲酸酯。在某些实施例中，甲醇用作本文中提供的FAP中的碳源。在一个实施例中，碳源是甲醇或甲酸酯。在其它实施例中，甲酸酯用作本文中提供的FAP中的碳源。在特定实施例中，甲醇用作单独或与本文中提供的产物途径组合的本文中提供的MMP中的碳源。在一个实施例中，碳源是甲醇。在另一个实施例中，碳源是甲酸酯。

[0220] 在一个实施例中，碳源包含甲醇和糖(例如葡萄糖)或含糖生物质。在另一个实施例中，碳源包含甲酸酯和糖(例如葡萄糖)或含糖生物质。在一个实施例中，碳源包含甲醇、甲酸酯和糖(例如葡萄糖)或含糖生物质。在特定实施例中，发酵馈料中甲醇或甲酸酯或两者作为与糖(例如葡萄糖)或含糖生物质的混合物提供。在某些实施例中，提供糖以
供足够的菌株生长。

[0221] 在某些实施例中，碳源包含甲醇和糖(例如葡萄糖)。在一些实施例中，糖(例如葡萄糖)以200:1到1:200的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在一些实施例中，糖(例如葡萄糖)以100:1到1:100的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在一些实施例中，糖(例如葡萄糖)以
100:1到5:1的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在一些实施例中，糖(例如葡萄糖)以50:1到
5:1的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在某些实施例中，糖(例如葡萄糖)以100:1的甲醇与
糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以90:1的甲醇与糖摩尔浓度比提
供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以80:1的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在一个实施
例中，糖(例如葡萄糖)以70:1的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如
葡萄糖)以60:1的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以50:1
的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以40:1的甲醇与糖摩尔
浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以30:1的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在
一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以20:1的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，
糖(例如葡萄糖)以10:1的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄
糖)以5:1的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以2:1的甲
醇与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:1的甲醇与糖摩尔浓度
比提供。在某些实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:100的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在一
个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:90的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖
(例如葡萄糖)以1:80的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)
以1:70的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:60的甲醇
与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:50的甲醇与糖摩尔浓度比
提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:40的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在一个实
施例中，糖(例如葡萄糖)以1:30的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例
如葡萄糖)以1:20的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以
1:10的甲醇与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:5的甲醇与糖
摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:2的甲醇与糖摩尔浓度比提供。
在以上提供的比率的某些实施例中，糖是含糖生物质。

[0222] 在某些实施例中，碳源包含甲酸酯和糖(例如葡萄糖)。在一些实施例中，糖(例如葡萄糖)以200:1到1:200的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一些实施例中，糖(例如葡萄糖)以100:1到1:100的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一些实施例中，糖(例如葡萄
糖)以100:1到5:1的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一些实施例中，糖(例如葡萄糖)以
50:1到5:1的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在某些实施例中，糖(例如葡萄糖)以100:1
的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以90:1的甲酸酯与糖
摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以80:1的甲酸酯与糖摩尔浓度比提
供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以70:1的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实
施例中，糖(例如葡萄糖)以60:1的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以50:1的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以
40:1的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以30:1的甲酸酯
与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以20:1的甲酸酯与糖摩尔浓度
比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以10:1的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一
个实施例中，糖(例如葡萄糖)以5:1的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以2:1的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)
以1:1的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在某些实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:100的甲
酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:90的甲酸酯与糖摩尔
浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:80的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。
在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:70的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例
中，糖(例如葡萄糖)以1:60的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:50的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:40
的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:30的甲酸酯与糖
摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:20的甲酸酯与糖摩尔浓度比提
供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:10的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实
施例中，糖(例如葡萄糖)以1:5的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例
如葡萄糖)以1:2的甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在以上提供的比率的某些实施例中，糖
是含糖生物质。

[0223] 在某些实施例中，碳源包含甲醇与甲酸酯的混合物和糖(例如葡萄糖)。在某些实施例中，提供糖以供足够的菌株生长。在一些实施例中，糖(例如葡萄糖)以200:1到
1:200的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一些实施例中，糖(例如葡萄糖)以100:1
到1:100的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一些实施例中，糖(例如葡萄糖)以
100:1到5:1的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一些实施例中，糖(例如葡萄糖)以
50:1到5:1的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在某些实施例中，糖(例如葡萄糖)以
100:1的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以90:1
的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以80:1的甲醇
和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以70:1的甲醇和甲酸
酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以60:1的甲醇和甲酸酯与糖
摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以50:1的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓
度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以40:1的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提
供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以30:1的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在
一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以20:1的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实
施例中，糖(例如葡萄糖)以10:1的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以5:1的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例
如葡萄糖)以2:1的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄
糖)以1:1的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在某些实施例中，糖(例如葡萄糖)以
1:100的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:90
的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:80的甲醇
和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:70的甲醇和甲酸
酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:60的甲醇和甲酸酯与糖
摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:50的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓
度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:40的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提
供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:30的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在
一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:20的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实
施例中，糖(例如葡萄糖)以1:10的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例如葡萄糖)以1:5的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在一个实施例中，糖(例
如葡萄糖)以1:2的甲醇和甲酸酯与糖摩尔浓度比提供。在以上提供的比率的某些实施例
中，糖是含糖生物质。

[0224] 在本文中提供的传授内容和指导下，本领域的技术人员将了解可以产生在例如碳水化合物等碳源上生长时分泌生物合成的化合物的NNOMO。此类化合物包括例如BDO和BDOP中的任何中间代谢物。所有需要的是在所需酶或蛋白质活性中的一或多者方面进行工程化，以实现所需化合物或中间物的生物合成，包括例如包括一些或所有BDO生物合成途径。因此，本文中提供了一种NNOMO，其在碳水化合物或其它碳源上生长时产生和/或分泌BDO，并且在碳水化合物或其它碳源上生长时产生和/或分泌BDOP中所示的任何中间代谢
物。本文中提供的产生BDO的微生物生物体可以引发从中间物的合成。这也适用于甲醛同化和MMP中的中间物。

[0225] 本文中提供的NNOMO使用如本文中例示的本领域中众所周知的方法构筑，从而以足够产生BDO的量外源性表达至少一种编码BDO和/或MMP酶或蛋白质的核酸。应了解微生物生物体在足够产生BDO的条件下培养。遵循本文中提供的传授内容和指导，NNOMO可
以实现BDO的生物合成，产生约0.1-500mM之间或更大的细胞内浓度。一般来说，BDO的细胞内浓度在约3-150mM之间，特别是约5-125mM之间，并且更特别是约8-100mM之间，包括约10mM、20mM、50mM、80mM或更多。每个这些例示性范围之间和之外的细胞内浓度也可以由本文中提供的NNOMO实现。

[0226] 在一些实施例中，培养条件包括厌氧或实质上厌氧生长或维持条件。先前已经描述了例示性厌氧条件并且是本领域中众所周知的。发酵工艺的例示性厌氧条件描述于本文中并且描述于例如美国公开案第2009/0047719号中。在NNOMO下可以采用任何这些条件以及本领域中众所周知的其它厌氧条件。在此类厌氧或实质上厌氧条件下，BDO生产者可以合成5-100mM或更多的细胞内浓度以及本文中例示的所有其它浓度下的BDO。应了解，即使以上描述是指细胞内浓度，BDO也可以在细胞内产生BDO，和/或分泌产物到培养基中。

[0227] 例示性发酵工艺包括(但不限于)分批补料发酵和分批分离；分批补料发酵和连续分离；以及连续发酵和连续分离。在一个例示性分批发酵方案中，产生生物体在适当尺寸的充以适当气体的生物反应器中生长。在厌氧条件下，培养物充以惰性气体或气体的组合，例如氮气、N2/CO2混合物、氩气、氦气等等。因为细胞生长并利用碳源，所以其它的碳源和/或其它养分以碳源和/或养分大致消耗平衡的速率馈入生物反应器中。生物反应器的温
度维持在所需温度下，一般在22-37℃范围内，但温度可以维持在更高或更低温度下，取决于产生生物体的生长特点和/或发酵工艺所需的条件。生长持续实现发酵罐中培养物所希望特征，例如细胞密度、产物浓度等等所需要的时段。在分批发酵工艺中，发酵的时段一般在若干小时到若干天范围内，例如8到24小时，或1、2、3、4或5天，或多达一周，取决于所需的培养条件。pH值可以依照要求控制或不控制，在此情况下不控制pH值的培养物将到操作结束时通常减少到pH 3-6。在培养期结束后，发酵罐内含物可以通过细胞分离装置，例如离心机、过滤装置等等，以去除细胞和细胞碎片。在所希望的产物在细胞内表达的情况下，细胞可以依照要求，在细胞与发酵液分离之前或之后，酶促或化学上溶解或破坏，以释放其它产物。发酵液可以转移到产物分离装置。通过本领域中用以将所需产物与稀水溶液分离的标准分离程序分离产物。此类方法包括(但不限于)使用与水不混溶的有机溶剂(例如
甲苯或其它适合的溶剂，包括(但不限于)乙醚、乙酸乙酯、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷、氯仿、苯、戊烷、己烷、庚烷、石油醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、二噁烷、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)等等)以提供产物的有机溶液的液-液萃取，适当时，标准蒸镏法等等，取决于发酵工艺的产物的化学特性。

[0228] 在一个例示性充分连续发酵方案中，产生生物体一般首先以分批模式生长，以实现所希望的细胞密度。当碳源和/或其它养分耗尽时，以所需的速率不断地供应相同组成的馈料培养基，并且以相同的速率取出发酵液体。在此类条件下，生物反应器中的产物浓度以及细胞密度一般保持恒定。发酵罐的温度维持在所需要的温度下，如以上所讨论。在连续发酵期期间，一般需要维持适合的pH值范围以求最佳化产生。pH值可以使用常规方法监测和维持，包括添加适合的酸或碱来维持所需的pH值范围。生物反应器连续操作长时间，一般至少一周到几周和多达一个月或更久，视情况和需要而定。定期监测发酵液和/或培养物，包括多达每天的取样，视需要而定，以保证产物浓度和/或细胞密度的一致。以连续模式，发酵罐内含物在供应新的馈料培养基时候恒定地去除。含有细胞、培养基和产物的排出流一般经受连续产物分离程序，去除或不去除细胞和细胞碎片，视需要而定。本领域中采用的连续分离方法可以用于将产物与稀水溶液分离，包括(但不限于)使用与水不混溶的有机溶剂(例如甲苯或其它适合的溶剂，包括(但不限于)乙醚、乙酸乙酯、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷、氯仿、苯、戊烷、己烷、庚烷、石油醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、二噁烷、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)等等)的连续液-液萃取、标准连续蒸镏法等等，或本领域中众所周知的其它方法。

[0229] 除本文公开的培养和发酵条件外，用于实现BDO生物合成的生长条件可以包括添加渗透保护物质到培养条件。在某些实施例中，本文中提供的NNOMO可以如本文中描述，在渗透保护物质存在下维持、培养或发酵。简单地说，渗透保护物质是指充当渗透物并帮助如本文中描述的微生物生物体经受住渗透应力的化合物。渗透保护物质包括(但不限于)甜菜碱、氨基酸和糖海藻糖。此类物质的非限制性实例是甘氨酸甜菜碱、果仁糖甜菜碱、二甲基噻亭、二甲基巯基丙酸内盐、3-二甲基巯基-2-甲基丙酸内盐、六氢吡啶甲酸、二甲基巯基乙酸内盐、胆碱、L-肉碱和四氢嘧啶。在一个方面，渗透保护物质是甘氨酸甜菜碱。本领域的技术人员应了解适于保护本文中描述的微生物生物体免受渗透应力伤害的渗透保护
物质的量和类型将取决于所使用的微生物生物体。培养条件中渗透保护物质的量可以是例如不超过约0.1mM、不超过约0.5mM、不超过约1.0mM、不超过约1.5mM、不超过约2.0mM、不超过约2.5mM、不超过约3.0mM、不超过约5.0mM、不超过约7.0mM、不超过约10mM、不超过约
50mM、不超过约100mM或不超过约500mM。

[0230] 培养条件可以包括例如液体培养程序以及发酵和其它大规模培养程序。如本文中描述，本文中提供的生物合成产物的特别有用的产率可以在厌氧或实质上厌氧培养条件下获得。

[0231] 如本文中描述，用于实现BDO以及其它途径中间物的生物合成的一种例示性生长条件包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施例中，所提供的NNOMO可以在厌氧或实质上厌氧条件下维持、培养或发酵。简单地说，厌氧条件是指缺少氧的环境。实质上厌氧条件包括例如培养、分批发酵或连续发酵，使得培养基中的溶解氧浓度保持在0与饱和的10％之间。实质上厌氧条件还包括细胞在维持少于1％氧的气氛的密封腔室内部的液体培养基中或固体琼脂上生长或休息。氧的百分比可以通过例如将培养物充以N2/CO2混合物或其它适合的非氧气体来维持。

[0232] 本文中描述的培养条件可以按比例增大并且连续生长用于制造BDO。例示性生长程序包括例如分批补料发酵和分批分离；分批补料发酵和连续分离；以及连续发酵和连续分离。所有这些工艺都是本领域中众所周知的。发酵程序特别适用于商业量的BDO的生物合成产生。一般来说并且如同不连续的培养程序一样，BDO的连续和/或近乎连续产生
将包括在足够维持和/或几乎维持生长在指数生长期的养分和培养基中培养本文中提供
的非天然存在的产生BDO的生物体。可以包括在此类条件下的连续培养，例如生长或培养
1天、2、3、4、5、6或7天或更多天。另外，连续培养可以包括1周、2、3、4或5周或更多周和长达若干个月的更长时间。或者，如果适于具体的应用，那么所提供的生物体可以培养数小时。应了解连续和/或近乎连续的培养条件也可以包括这些例示性时期中间的所有时间间隔。进一步了解培养本文中提供的NNOMO的时间是足够产生足够量的产物用于达成所希望的目的的时段。

[0233] 发酵程序是本领域中众所周知的。简单地说，用于BDO的生物合成产生的发酵可以按例如分批补料发酵和分批分离、分批补料发酵和连续分离或连续发酵和连续分离使用。分批和连续发酵程序的实例是本领域中众所周知的。

[0234] 除使用BDO生产者连续产生相当大量的BDO的以上发酵程序外，BDO生产者也可以例如同时经受化学合成程序，以将产物转变成其它化合物，或需要时，产物可以与发酵培养物分离并且继续经受化学和/或酶促转变，以将产物转变成其它化合物。

[0235] 为了产生更好的生产者，可以利用代谢模型化来最佳化生长条件。模型化也可以用以设计另外最佳化途径的利用的基因敲除(参见例如美国公开案第2002/0012939号、第2003/0224363号、第2004/0029149号、第2004/0072723号、第2003/0059792号、第
2002/0168654号和第2004/0009466号以及美国专利第7,127,379号)。模型化分析允许
可靠地预测代谢移向BDO的更有效产生对细胞生长的作用。

[0236] 一种用于鉴别和设计利于所希望产物的生物合成的代谢改变的计算法是OptKnock计算框架(伯格德等人,生物技术与生物工程84:647-657(2003)(Burgard et
al.,Biotechnol.Bioeng.84:647-657(2003)))。OptKnock是一种代谢模型化和模拟程序，其提出了产生过度产生目标产物的遗传稳定的微生物的基因缺失或破坏策略。确切地说，所述框架检查微生物的完全代谢和/或生物化学网络，从而提出推动所希望的生物化学物质变成细胞生长的专性副产物的基因操纵。通过将生物化学产生与细胞生长利用策略上放置的基因缺失或其它功能基因破坏偶合，在生物反应器中长时段后施加于工程化菌株上的生长选择压力由于强迫制的生长偶合的生物化学物质的产生而提高了性能。最后，当构筑基因缺失时，设计的菌株回复到其野生型状态的可能性可以忽略，因为通过OptKnock选择的基因完全从基因组去除。因此，此计算方法可以用于鉴别引起所希望产物的生物合成的替代途径，或者与NNOMO结合用于进一步最佳化所希望产物的生物合成。

[0237] 简单地说，OptKnock是本文中用以指用于模型化细胞代谢的计算法和系统的术语。OptKnock程序涉及将具体的约束并入流平衡分析(FBA)模型中的模型框架和方法。这些约束包括例如定性动力学信息、定性调节信息和/或DNA微阵列实验数据。OptKnock还
通过例如收紧利用流平衡模型获得的流边界并且随后探测在基因添加或缺失存在下代谢
网络的性能界限来计算各种代谢问题的解决方案。OptKnock计算框架允许构筑模型调配
物，这些模型调配物允许有效查询代谢网络的性能界限并提供了解决所得混合整数线性规划问题的方法。本文中称为OptKnock的代谢模型化和模拟方法描述于例如美国公开案第
2002/0168654号、国际专利申请案第PCT/US02/00660号和美国公开案第2009/0047719号
中。

[0238] 另一用于鉴别和设计利于产物的生物合成产生的代谢改变的计算法是称为Sim 的代谢模型化和模拟系统。此计算法和系统描述于例如美国公开案第
2003/0233218号和国际专利申请案第PCT/US03/18838号中。Sim 是一种计算系
统，其可以用于电脑产生网络模型并模拟通过生物系统的化学反应的质量、能量或电荷流以界定含有系统中化学反应的任何和所有可能功能性的解空间，由此确定生物系统所允许的活性的范围。此方法称为基于约束的模型化，因为解空间由例如所包括的反应的已知化学计量以及与通过反应的最大流相关联的反应热力学和容量约束等约束界定。可以询问由这些约束界定的空间以确定生物系统或其生物化学组分的表型能力和特性。

[0239] 这些计算方法与生物实体一致，因为生物系统是灵活的并且可以用许多不同的方式达到相同的结果。生物系统通过进化机制来设计，所述进化机制已经受所有生物系统必须面对的基本约束限制。因此，基于约束的模型化策略涵盖这些一般实体。此外，经由收紧约束对网络模型连续施加进一步限制的能力引起解空间的尺寸减小，由此增强了预测生理性能或表型的精确性。

[0240] 在本文中提供的传授内容和指导下，本领域的技术人员将能够应用各种计算框架用于代谢模型化和模拟，以设计和执行所需化合物在宿主微生物生物体中的生物合成。此类代谢模型化和模拟方法包括例如以上例示为Sim 和OptKnock的计算系统。为了说明，本文中描述一些关于用于模型化和模拟的OptKnock计算框架的方法。本领域的技术人员将知道如何使用OptKnock应用代谢改变的鉴别、设计和执行于本领域中众所周知
的任何此类其它代谢模型化和模拟计算框架和方法。

[0241] 上述方法将提供一组代谢反应进行破坏。此组内每个反应的消除或代谢修饰可以使所需产物作为生物体生长期期间的专性产物。因为已知反应，所以二值OptKnock问题的解决方案也将提供编码一或多种催化此组反应内每个反应的酶的相关基因。鉴别一组反应和其编码参与每个反应的酶的对应基因一般是自动化过程，通过反应与在酶与编码基因之间具有关系的反应数据库的相关性实现。

[0242] 一旦鉴别，待破坏以实现所需产物产生的此组反应在目标细胞或生物体中通过编码此组内每个代谢反应的至少一种基因的功能破坏执行。一种特别有用的实现反应组功能破坏的方式是通过每个编码基因的缺失。然而，在一些情况下，通过其它遗传异常破坏反应可能是有益的，所述遗传异常包括例如突变、例如启动子或调节因子的顺式结合位点等调节区域缺失或通过大量位置中的任一者上编码序列的截短。这些后面的引起少于基因组的全部缺失的异常可能例如在希望快速评估产物的偶合时或在很少会发生遗传回复时是适用的。

[0243] 为了鉴别上述二值OptKnock问题的其它有成果的解决方案，可以执行一种称为整数切割的最优化方法，所述解决方案引起可能产生生物合成，包括生长偶合的所需产
物的生物合成在内的其它组的破坏反应或代谢修饰。此方法通过迭代解决以上例示的
OptKnock问题并且在每个迭代下并入称为整数切割的额外约束来进行。整数切割约束有
效地防止解决程序选择在使产物生物合成与生长专性偶合的任何先前的迭代中鉴别的准
确相同的反应组。举例来说，如果先前鉴别的生长偶合的代谢修饰说明反应1、2和3用于破坏，那么以下约束防止在随后解决方案中同时考虑相同的反应。整数切割方法是本领
域中众所周知的并且可以发现描述于例如伯格德等人,生物技术进展17:791-797(2001)
(Burgard et al.,Biotechnol.Prog.17:791-797(2001).)中。如同本文中关于与用于代谢模型化和模拟的OptKnock计算框架组合使用所描述的所有方法一样，也可以在本领域中
众所周知的其它计算框架，包括例如Sim 下应用减少迭代计算分析中冗余的整数
切割方法。

[0244] 本文中例示的方法允许构筑以生物合成方式产生所需产物，包括目标生物化学产物的产生与经工程化以具有所鉴别的遗传改变的细胞或生物体的生长的专性偶合
的细胞和生物体。因此，本文中描述的计算方法允许鉴别和实现通过选自OptKnock或
Sim 的电脑方法鉴别的代谢修饰。代谢修饰组可以包括例如添加一或多种生物合
成途径酶和/或一或多种代谢反应的功能破坏，包括例如通过基因缺失来破坏。

[0245] 如以上所讨论，OptKnock方法是在突变微生物网络在经受长期生长选择时可以向其通过计算预测的最大生长表型进化的前提上发展的。换句话说，所述方法影响生物体在选择压力下自我最佳化的能力。OptKnock框架允许详尽列举基于网络化学计量迫使生物化学物质产生与细胞生长之间发生偶合的基因缺失组合。最佳基因/反应敲除的鉴别需要选择活性反应组，使得所得网络的最佳生长解决方案过度产生相关生物化学物质的二值最佳化问题的解决方案(伯格德等人,生物技术与生物工程84:647-657(2003)(Burgard et
al.,Biotechnol.Bioeng.84:647-657(2003)))。

[0246] 大肠杆菌代谢的一个电脑化学计量模型可以用以鉴别如先前例示和例如美国公开案第2002/0012939号、第2003/0224363号、第2004/0029149号、第2004/0072723号、第
2003/0059792号、第2002/0168654号和第2004/0009466号中以及美国专利第7,127,379
号中描述的代谢途径的基本基因。如本文所公开，OptKnock数学框架可以应用于对准引起生长偶合的所需产物的产生的基因缺失。此外，二值OptKnock问题的解决方案仅仅提供了一组缺失。为了列举所有有意义的解决方案，即引起生长偶合的产生形成的所有组的敲除，可以执行称为整数切割的最佳化技术。此需要迭代解决OptKnock问题并且在每个迭代下
并入称为整数切割的额外约束，如以上所讨论。

[0247] 如本文所公开，编码BDOP、FAP和/或MMP的所需活性的核酸可以引入宿主生物体中。在一些情况下，可能需要修饰BDO、甲醛同化或MMP酶或蛋白质的活性以增加BDO、甲醛和/或还原当量的产生。举例来说，已知的增加蛋白质或酶活性的突变可以引入编码核酸分子中。另外，最佳化方法可以用于增加酶或蛋白质的活性和/或减少抑制活性，例如减少负调节剂的活性。

[0248] 一种此类最佳化方法是定向进化。定向进化是一种有效的方法，其包含引入靶向特定基因的突变以改良和/或改变酶的特性。改良和/或改变的酶可以通过发
展和执行灵敏的高通过量筛选分析来鉴别，这些分析允许自动屏蔽许多酶变异体(例
4
如>10)。通常进行重复数轮的突变诱发和筛选，以提供具有最佳化特性的酶。还已经
发展了可以有助于鉴别用于突变诱发的基因区域的计算算法，并且可以显著地减少需
要产生和筛选的酶变异体的数目。已经发展了许多定向进化技术(评论参见希伯特等
人,生物分子工程22:11-19(2005)(Hibbert et al.,Biomol.Eng.22:11-19(2005)；豪
斯玛和拉伦德,药学与生物技术行业中的生物催化第717-742页(2007),帕特尔(编
辑),CRC出版社(Huisman and Lalonde,In Biocatalysis in the pharmaceutical and
biotechnology industries pgs.717-742(2007),Patel(ed.),CRC Press)；欧藤和夸克
斯.生物分子工程22:1-9(2005)(Otten and Quax.Biomol.Eng.22:1-9(2005)；和钱等
人,应用生物化学与生物技术143:212-223(2007)(Sen et al.,Appl Biochem.Biotechnol
143:212-223(2007)))，其有效地产生各种变异体文库，并且这些方法已经成功地应用于在许多酶类别上改良各类特性。已经通过定向进化技术改良和/或改变的酶特性包括例如：
针对非天然底物的转变的选择性/特异性；针对稳固的高温处理的温度稳定性；针对在较低或较高pH值条件下进行生物处理的pH值稳定性；底物或产物耐受性，以便可以实现高产物滴度；结合(Km)，包括加宽底物结合以包括非天然底物；抑制(Ki)，以去除产物、底物或关键中间物的抑制；活性(kcat)，以增加酶反应速率从而实现所需流；表达水平，以增加蛋白质产率和总途径流；针对在需氧条件下空气敏感性酶的操作的氧稳定性；和针对在氧缺乏下的需氧酶的操作的厌氧活性。

[0249] 已经发展了大量的例示性方法用于靶向特定酶的所需特性的基因的突变诱发和多样化。此类方法是本领域的技术人员众所周知的。任何这些方法都可以用于改变
和/或最佳化BDOPE或蛋白质的活性。此类方法包括(但不限于)：EpPCR，其通过降低
PCR反应中DNA聚合酶的保真度来引入随机点突变(普里查德等人,理论生物学期刊
234:497-509(2005)(Pritchard et al.,J.Theor.Biol.234:497-509(2005)))；易错滚环扩增(epRCA)，其类似于epPCR，除了整环质体用作模板并且使用在最后2个核苷酸上具
有抗核酸外切酶的硫代磷酸酯键的随机6聚体扩增质体，接着转化到其中质体在串联重
复序列上再成环的细胞中(藤井等人,核酸研究32:e145(2004)(Fujii et al.,Nucleic
Acids Res.32:e145(2004))；和藤井等人,自然实验手册1:2493-2497(2006)(Fujii
et al.,Nat.Protoc.1:2493-2497(2006)))；DNA或家族改组，其通常包含用例如Dnase
I或EndoV等核酸酶消化两种或两种以上变异基因以产生一池随机片段，这些随机片
段通过在DNA聚合酶存在下循环的退火和延伸来重新装配以产生嵌合基因文库(斯
特姆,美国国家科学院院刊91:10747-10751(1994)(Stemmer,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.91:10747-10751(1994))；和斯特姆,自然370:389-391(1994)(Stemmer,Nature
370:389-391(1994)))；交错延伸(StEP)，其需要模板引发，接着重复循环的2步PCR
以及变性和非常短持续时间的退火/延伸(短到5分钟)(赵等人,自然生物技术
16:258-261(1998)(Zhao et al.,Nat.Biotechnol.16:258-261(1998)))；随机引发重组
(RPR)，其中随机序列引物用以产生许多与模板的不同区段互补的短DNA片段(邵等人,核
酸研究26:681-683(1998)(Shao et al.,Nucleic Acids Res.26:681-683(1998)))。

[0250] 其它方法包括：异源双链重组，其中线性化质体DNA用以形成通过错误配合修复来修复的异源双链(沃尔科夫等人,核酸研究27:e18(1999)(Volkov et al,Nucleic
Acids Res.27:e18(1999))；和沃尔科夫等人,酶学方法328:456-463(2000)(Volkov et
al.,Methods Enzymol.328:456-463(2000)))；暂时模板上的随机嵌合生长(RACHITT)，
其采用单链DNA(ssDNA)的Dnase I断裂和尺寸分级分离(科科等人,自然生物技
术 19:354-359(2001)(Coco et al.,Nat.Biotechnol.19:354-359(2001)))；在 截 短
模板上的重组延伸(RETT)，其需要在用作一池模板的单向ssDNA片段存在下单向生长
链从引物进行模板切换(李等人,分子催化杂志26:119-129(2003)(Lee et al.,J.
Molec.Catalysis 26:119-129(2003))；简并寡核苷酸基因改组(DOGS)，其中简并引物
用以控制分子之间的重组(伯奎斯特和吉布斯,分子生物学方法352:191-204(2007)
(Bergquist and Gibbs,Methods Mol.Biol.352:191-204(2007))；伯奎斯特等人,生
物分子工程22:63-72(2005)(Bergquist et al.,Biomol.Eng.22:63-72(2005))；吉布
斯等人,基因271:13-20(2001)(Gibbs et al.,Gene 271:13-20(2001)))；用于产生
杂交酶的递增截短法(ITCHY)，其产生具有相关基因或基因片段的1个碱基对缺失的组
合文库(奥斯德梅耶等人,美国国家科学院院刊96:3562-3567(1999)(Ostermeier et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:3562-3567(1999))；和奥斯德梅耶等人,自然生物技术 17:1205-1209(1999)(Ostermeier et al.,Nat.Biotechnol.17:1205-1209(1999)))；
用于产生杂交酶的硫代递增截短法(THIO-ITCHY)，其类似于ITCHY，除了硫代磷酸酯
dNTP用以产生截短(卢茨等人,核酸研究29:E16(2001)(Lutz et al.,Nucleic Acids
Res.29:E16(2001)))；SCRATCHY，其将用于基因重组的两种方法ITCHY与DNA改组组合
(卢茨等人,美国国家科学院院刊98:11248-11253(2001)(Lutz et al.,Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.98:11248-11253(2001)))；随机漂移突变诱发(RNDM)，其中经由epPCR
制造的突变后面有针对保持可用活性的突变的筛选/选择(伯奎斯特等人,生物分子工
程22:63-72(2005)(Bergquist et al.,Biomol.Eng.22:63-72(2005)))；序列饱和突变
诱发(SeSaM)，一种使用硫代磷酸核苷酸的随机并入和裂解产生一池随机长度片段的随机突变诱发方法，一池随机长度片段用作模板以在“普适”碱基(例如肌苷)存在下延伸，
并且含有肌苷的互补链的复制得到随机的碱基并入，并且因此突变诱发(王等人,生物
技术杂志3:74-82(2008)(Wong et al.,Biotechnol.J.3:74-82(2008)；王等人,核酸研
究32:e26(2004)(Wong et al.,Nucleic Acids Res.32:e26(2004))；和王等人,分析生
物化学341:187-189(2005)(Wong et al.,Anal.Biochem.341:187-189(2005)))；合成改
组，其使用被设计成能编码“目标中所有遗传多样性”的重叠寡核苷酸并且允许改组子代具有很高的多样性(内斯等人,自然生物技术20:1251-1255(2002)(Ness et al.,Nat.
Biotechnol.20:1251-1255(2002))；核苷酸交换和切除技术NexT，其利用dUTP并入、接着先后用尿嘧啶DNA糖基化酶与哌啶处理以进行终点DNA断裂的组合(马勒等人,核酸研究
33:e117(2005)(Muller et al.,Nucleic Acids Res.33:e117(2005)))。

[0251] 其它方法包括不依赖于序列同源性的蛋白质重组(SHIPREC)，其中连接子用以促进两种远缘或无关基因之间的融合，并且在两种基因之间产生一系列嵌合体，产生单一交叉杂交物的文库(西伯特等人,自然生物技术19:456-460(2001)(Sieber et al.,Nat.TM TM
Biotechnol.19:456-460(2001)))；基因位点饱和突变诱发 (GSSM )，其中起始物质包括含有插入物和两种引物的超卷曲双链DNA(dsDNA)质体，引物在突变所需位点简并(克雷兹等人,酶学方法.388:3-11(2004)(Kretz et al.,Methods Enzymol.388:3-11(2004)))；
组合卡匣突变诱发(CCM)，其包含短寡核苷酸卡匣的使用以用大量可能的氨基酸序列改变替换有限区域(瑞达尔-奥尔森等人酶学方法.208:564-586(1991)(Reidhaar-Olson et
al.Methods Enzymol.208:564-586(1991))；和瑞达尔-奥尔森等人科学241:53-57(1988)(Reidhaar-Olson et al.Science 241:53-57(1988)))；组合多卡匣突变诱发(CMCM)，
其基本上类似于CCM并且使用高突变率的epPCR鉴别热点和热区，接着通过CMCM延伸，
以覆盖蛋白质序列空间的界定区域(雷茨等人,应用化学国际版40:3589-3591(2001)
(Reetz et al.,Angew.Chem.Int.Ed Engl.40:3589-3591(2001)))；突变菌株技术，其中条件性ts突变质体利用mutD5基因，mutD5基因编码DNA聚合酶III的突变亚单位，以
允许在选择期间随机和自然突变频率从20增加到4000X，并且在不需要选择时阻断有害
突变的累积(塞利弗诺娃等人,应用与环境微生物学67:3645-3649(2001)(Selifonova
et al.,Appl.Environ.Microbiol.67:3645-3649(2001))；洛琪等人,分子生物学杂志
260:359-3680(1996)(Low et al.,J.Mol.Biol.260:359-3680(1996)))。

[0252] 其它例示性方法包括穿透突变诱发(LTM)，其为一种多维的突变诱发方法，评估和最佳化所选择的氨基酸的组合突变(拉杰帕尔等人,美国国
家 科 学 院 院 刊 102:8466-8471(2005)(Rajpal et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.102:8466-8471(2005)))；基因重装配，其为一种DNA改组方法，可以一次应用于
多个基因或产生单一基因大的嵌合体文库(多个突变)(由维莱尼姆公司(Verenium
TM TM
Corporation)供应的可调基因重装配 (TGR )技术)；电脑蛋白质设计自动化(PDA)，
其为一种最佳化算法，锚定具有特定折叠的在结构上界定的蛋白质主链，并且搜索用于可以稳定化折叠和总蛋白质能量学的氨基酸取代的序列空间，并且一般对具有已知三维结
构的蛋白质最有效(海伊等人,美国国家科学院院刊99:15926-15931(2002)(Hayes et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:15926-15931(2002)))；和迭代饱和突变诱发(ISM)，其包含使用结构/功能的知识来选择酶改良的可能位点，使用例如斯曲杰(Stratagene)
QUIKCHANGE(斯曲杰；加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego CA))等突变诱发方法在选择位
点进行饱和突变诱发、针对所需特性筛选/选择和使用改良克隆，在另一位点重新开始，并且继续重复，直到实现所需活性(雷茨等人,自然实验手册2:891-903(2007)(Reetz et
al.,Nat.Protoc.2:891-903(2007))；和雷茨等人,应用化学国际版45:7745-7751(2006)
(Reetz等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.45:7745-7751(2006)))。

[0253] 任何上述用于突变诱发的方法可以单独或以任何组合使用。另外，定向进化方法中的任一者或组合可以结合如本文中描述的适应性进化技术使用。

[0254] BDO(或4-HB)可以在微生物生物体培养期间的任何时间点，例如在连续和/或近乎连续培养期中收获或分离，如本文所公开。一般来说，微生物维持在连续和/或近乎连续生长期时间越长，可以产生的BDO的量比例越大。

[0255] 因此，另外提供了一种用于产生BDO的方法，其包括培养如本文公开的具有一或多种基因破坏的非天然存在的微生物生物体。破坏可以发生一或多种基因中，所述基因编码增加BDO产生，包括在基因破坏减少或消除酶活性时任选地偶合BDO产生与微生物的生长的酶。举例来说，破坏可以赋予非天然的微生物生物体以稳定的生长偶合的BDO产生。

[0256] 在一些实施例中，基因破坏可以包括完全基因缺失。在一些实施例中，其它破坏基因的方法包括例如通过省略或添加寡核苷酸或通过使基因不能操作的突变来移码。然而，由于其赋予非天然存在的生物体以稳定性，所以本领域的技术人员将认识到基因缺失的优点，防止回复到其中基因破坏未发生的亲本表型。具体地说，基因破坏选自如本文公开的基因集合。

[0257] 一旦由基因集合针对增加BDO产生的破坏进行计算预测，可以构筑、进化和测试菌株。基因破坏，包括基因缺失，通过本领域中众所周知的方法引入宿主生物体中。一种特别有用的基因破坏的方法是通过如本文公开的同源重组。

[0258] 工程化菌株可以通过测量生长速率、底物吸收速率和/或产物/副产物分泌速率来表征。培养物可以生长并且用作在指数生长期间进行测量的新鲜分批培养物的接种物。
生长速率可以通过使用分光光度计(A600)测量光密度来确定。培养物上清液中葡萄糖和
其它有机酸副产物的浓度可以通过众所周知的方法，例如HPLC、GC-MS或其它众所周知的适于分析所需产物的分析法测定，如本文公开，并且用于计算吸收和分泌速率。

[0259] 含有基因破坏的菌株可以显示次最佳的生长速率，直到其代谢网络已经调整到其遗漏的功能。为了帮助此调整，菌株可以适应性进化。通过使菌株进行适应性进化，细胞生长速率变成主要的选择压力并且突变细胞不得不再分配其代谢流以增加其生长速
率。近来已经证明若干大肠杆菌突变体的此代谢程序重排，所述大肠杆菌突变体已经在各种底物上适应性进化，到达通过电脑模型推理预测的生长速率(方和帕尔森,自然遗传
学36:1056-1058(2004)(Fong and Palsson,Nat.Genet.36:1056-1058(2004)))。由适应
性进化产生的生长改良可以伴随有BDO产生的速率增加。菌株一般重复进行适应性进化，平行操作，以解释可能由宿主生物体显示的进化模式的差异(方和帕尔森,自然遗传学
36:1056-1058(2004)(Fong and Palsson,Nat.Genet.36:1056-1058(2004))；方等人,细菌学杂志185:6400-6408(2003)(Fong et al.,J.Bacteriol.185:6400-6408(2003))；伊瓦拉等人,自然420:186-189(2002)(Ibarra et al.,Nature 420:186-189(2002)))，此可能产生一种具有优于其它菌株的产生质量的菌株。进化可以进行一段时间，通常2-6周，取决于所获得的生长速率改良。一般说来，一旦获得稳定的表型，就停止进化。

[0260] 在适应性进化过程后，再次通过测量生长速率、底物吸收速率和/或产物/副产物分泌速率来表征新菌株。通过绘制实际生长和产物产率相对于来自代谢模型化的产生迹线的曲线，将这些结果与理论预测相比。选择最成功的设计/进化组合以进一步进行，并用实验室规模的分批和连续发酵表征。例如OptKnock方法等本文公开的方法背后的生长偶合的生物化学物质产生概念也应该产生遗传稳定的过度生产者。因此，培养物以连续模式维持长时间，例如一个月或更长时间，以评估长期稳定性。可以周期性取样以确保维持产率和生产力。

[0261] 适应性进化是一种有效的技术，其可以用于增加突变或工程化微生物菌株的生长速率，或在非自然环境条件下生长的野生型菌株的生长速率。其尤其适用于经由例
如OptKnock等方法设计的菌株，引起生长偶合的产物形成。因此，向最佳生长菌株进化
也将间接地最佳化产生。大肠杆菌K-12MG1655的独特菌株是通过基因敲除和适应性
进化产生的(方和帕尔森,自然遗传学36:1056-1058(2004)(Fong and Palsson,Nat.
Genet.36:1056-1058(2004)))。在此工作中，所有适应性进化的培养物通过在到达固定相前分批培养物连续传代到新鲜培养基中而维持在延长的指数生长，因此使得生长速率作为主要的选择压力。敲除的菌株在补充有不同碳底物(每个敲除菌株四种)的基本培养基上
构筑和进化。进化培养一式两份或一式三份进行，假定总共50个进化敲除菌株。进化培养物维持在指数生长，直到到达稳定的生长速率。在50个检查案例中的38个中，计算预测准确(10％内)地预测敲除菌株的进化后生长速率。此外，OptKnock设计与适应性进化的组
合已经产生改良的乳酸产生菌株。(方等人,生物技术与生物工程91:643-648(2005)(Fong et al.,Biotechnol.Bioeng.91:643-648(2005)))。类似的方法可以应用于本文公开的菌株并且应用于各种宿主菌株。

[0262] 存在大量的发展技术用于进行适应性进化。本文公开了例示性方法。在一些实施例中，本文中提供的NNOMO的最佳化包括利用适应性进化技术增加BDO产生和/或所产生菌株的稳定性。

[0263] 连续的培养包含小体积的生长培养物重复转移到含有新鲜生长培养基的大得多的容器。当培养的生物体已经在新容器中生长到饱和时，重复此过程。此方法已
经用于在文献中在实验中实现维持培养的最长示例(伦斯基和特拉维斯,美国国家
科 学 院 院 刊 91:6808-6814(1994)(Lenski and Travisano,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
91:6808-6814(1994)))，这些实验清楚地证明在数年时期内繁殖速率的一致改良。典型地，培养物转移通常在指数生长期期间进行，因此每天准确地计算转移体积以维持在接下来24小时时期指数生长。手动连续稀释是廉价的并且易于并行。

[0264] 在连续培养中，恒化器中细胞的生长表示其中保持很高分数的细胞群体的稀释极端情况。当培养物生长和变得饱和时，小比例的生长培养物经新鲜培养基置换，使得培养物以接近于其最大群体尺寸不断地生长。恒化器已经用于证明短时间的繁殖率快速改良(达克豪兹,酶学方法613-631(1993)(Dykhuizen,Methods Enzymol.613-631(1993)))。
虽然认识到这些装置的潜在适用性，但传统的恒化器不能维持长时间的针对增加繁殖率
的选择，此归因于抵抗稀释的(静态的)变异体的无意选择。这些变异体能够通过粘附
恒化器的表面来抵抗稀释，并且通过这样做，在竞争中胜过不太粘附的个体，包括具有较高繁殖率的个体，因此避开装置的预期目的(查奥和拉姆斯德尔,普通微生物学杂志
20:132-138(1985)(Chao and Ramsdell,J.Gen.Microbiol 20:132-138(1985)))。一种克服此缺点的可能方式是实现具有两个生长室的装置，其定期进行短暂的杀菌期，如先前所描述(莫里哀和穆兹尔(Marliere and Mutzel)美国专利第6,686,194号)。

[0265] EvolugatorTM是一种连续培养装置，由艾鲁加特有限公司(佛罗里达州的盖恩斯维尔(Gainesville,FL))发展，并且显示比传统的进化技术显著节约时间和工作(德
克雷西等人,应用分子生物学与生物技术77:489-496(2007)(de Crecy et al.,Appl.
Microbiol.Biotechnol.77:489-496(2007)))。细胞通过在达到固定相前分批培养物
连续传代到新鲜培养基而维持在延长指数生长。通过自动化光密度测量和液体处理，
TM
Evolugator 可以使用大的培养物体积高速进行串行转移，因此接近细胞拟合进化中恒化器的效率。举例来说，缺乏翻译装置组分并且已经严重妨碍生长的不动杆菌属ADP1的突
变体在200代中进化到野生型生长速率的80％。然而，与将细胞维持在单一容器中的恒化器形成对比，此机器通过在一卷管道的再分区域中从一个“反应器”移到下一个反应器来操作，因此消除了针对壁生长的任何选择。转移体积是可调整的，并且通常设置为约50％。此装置的一个缺点是其是大型并且高成本的，因此并联操作大量的进化不实际。此外，气体添加未良好管理，并且在现行设备配置下未维持严格的厌氧条件。然而，此为一种适应性进化产生菌株的替代方法。

[0266] 本申请案中，已经提及各种公开案。这些公开案的公开，包括GenBank和GI编号公开案，以全文引用的方式并入本申请案中以更充分地描述本发明相关的目前工艺水平。虽然本发明已经参考以上提供的实例描述，但应了解可以在不脱离本发明的精神下进行各种修改。

[0267] 应了解，不实质上影响本发明的各种实施例的活性的修改也包括在本文中提供的本发明的定义内。因此，以下实例意图展示而不是限制本发明。

[0268] 4.实例

[0269] 4.1实例I-经由MMP产生还原当量

[0270] 例示性MMP提供于图1中。

[0271] 图1步骤A-甲醇甲基转移酶(EM1)

[0272] 表示为MtaA、MtaB和MtaC的3-甲基转移酶蛋白质的复合物执行所希 望的 EM1活 性(萨 奥 等 人,欧 洲 生 物 化 学杂 志 243:670-677(1997)(Sauer
et al.,Eur.J.Biochem.243:670-677(1997))；奈 都和罗 格斯戴尔,细 菌学杂 志
183:3276-3281(2001)(Naidu and Ragsdale,J.Bacteriol.183:3276-3281(2001))； 塔
伦特和克日茨基,生物化学杂志276:4485-4493(2001)(Tallant and Krzycki,J.Biol.
Chem.276:4485-4493(2001))；塔伦特和克日茨基,细菌学杂志179:6902-6911(1997)
(Tallant and Krzycki,J.Bacteriol.179:6902-6911(1997))；塔伦特和克日茨基,细菌学杂志178:1295-1301(1996)(Tallant and Krzycki,J.Bacteriol.178:1295-1301(1996))；
罗格斯戴尔,生物化学和分子生物学评论39:165-195(2004)(Ragsdale,S.W.,Crit.Rev.
Biochem.Mol.Biol.39:165-195(2004))。

[0273] MtaB是一种可以催化甲基从甲醇转移到MtaC(一种类咕啉蛋白)的锌蛋白。编码MtaB和MtaC的例示性基因可以在例如巴氏甲烷八叠球菌(梅德等人,细菌
学 杂 志 188:7922-7931(2006)(Maeder et al.,J.Bacteriol.188:7922-7931(2006)))
和噬乙酸甲烷八叠球菌(加拉甘等人,基因组研究12:532-542(2002)(Galagan et
al.,Genome Res.12:532-542(2002)))以及产乙酸菌热醋穆尔氏菌(达斯等人,蛋白质
67:167-176(2007)(Das et al.,Proteins 67:167-176(2007)))等产甲烷古生菌中发现。
一般说来，MtaB和MtaC基因在染色体上彼此相邻，因为其活性是紧密地相互依赖的。巴氏甲烷八叠球菌、噬乙酸甲烷八叠球菌和热醋穆尔氏菌中各种MtaB和MtaC编码基因的蛋白
质序列可以通过其以下GenBank寄存编号鉴别。

[0274]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
MtaB1 YP_304299 73668284 巴氏甲烷八叠球菌
MtaC1 YP_304298 73668283 巴氏甲烷八叠球菌
MtaB2 YP_307082 73671067 巴氏甲烷八叠球菌
MtaC2 YP_307081 73671066 巴氏甲烷八叠球菌
MtaB3 YP_304612 73668597 巴氏甲烷八叠球菌
MtaC3 YP_304611 73668596 巴氏甲烷八叠球菌
MtaB1 NP_615421 20089346 噬乙酸甲烷八叠球菌
MtaB1 NP_615422 20089347 噬乙酸甲烷八叠球菌
MtaB2 NP_619254 20093179 噬乙酸甲烷八叠球菌
MtaC2 NP_619253 20093178 噬乙酸甲烷八叠球菌
MtaB3 NP_616549 20090474 噬乙酸甲烷八叠球菌
MtaC3 NP_616550 20090475 噬乙酸甲烷八叠球菌
MtaB YP_430066 83590057 热醋穆尔氏菌
MtaC YP_430065 83590056 热醋穆尔氏菌
MtaA YP_430064 83590056 热醋穆尔氏菌

[0275] 来自巴氏甲烷八叠球菌的MtaB1和MtaC1基因YP_304299和YP_304298克隆到大肠杆菌中并测序(萨奥等人,欧洲生物化学杂志243:670-677(1997))。也
可获得此甲醇-钴胺素甲基转移酶复合物的晶体结构(海格曼等人,美国国家
科 学 院 院 刊 103:18917-18922(2006)(Hagemeier et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.103:18917-18922(2006)))。巴氏甲烷八叠球菌中的MtaB基因YP_307082和
YP_304612通过与YP_304299的序列同源性鉴别。一般说来，同源性搜索是一种有效鉴别
EM1的方式，因为MtaB编码基因展示几乎不与作用于例如三甲胺、二甲胺、甲胺或二甲硫醚等替代底物的甲基转移酶类似。基于与MtaB基因的接近度以及与YP_304298的同源性，
鉴别MtaC基因YP_307081和YP_304611。来自噬乙酸甲烷八叠球菌的三组MtaB和MtaC
基因已经在遗传学上、生理学上和生物化学上表征(普里切特和梅特卡夫,分子微生物学
56:1183-1194(2005)(Pritchett and Metcalf,Mol.Microbiol.56:1183-1194(2005)))。
缺乏所述组中的两组的突变菌株能够在甲醇上生长，而缺乏所有三组MtaB和MtaC基因
组的菌株无法在甲醇上生长。此表明每一组基因都在甲醇利用中起作用。基于与产甲
烷MtaB基因的同源性以及通过与已经结晶的诱发甲醇的类咕啉蛋白质MtaC的相邻染
色体接近度，鉴别热醋穆尔氏菌MtaB基因(周等人,晶体学报F辑.生物晶体结构通
讯 61:537-540(2005)(Zhou et al.,Acta Crystallogr.Sect.F.Struct.Biol.Cyrst.
Commun.61:537-540(2005))，并且进一步通过北方杂合(Northern hybridization)
和 蛋 白 质 印 迹 (达 斯 等 人 ,蛋 白 质 67:167-176(2007)(Das et al.,Proteins
67:167-176(2007)))表征。

[0276] MtaA是催化甲基从MtaC转移到产甲烷生物中的辅酶M或者产乙酸菌中的甲基四氢叶酸的锌蛋白。MtaA也可以利用甲钴胺作为甲基供体。编码MtaA的例示性基因可以在
例如巴氏甲烷八叠球菌(梅德等人,细菌学杂志188:7922-7931(2006))和噬乙酸甲烷八
叠球菌(加拉甘等人,基因组研究12:532-542(2002))以及产乙酸菌热醋穆尔氏菌(达斯
等人,蛋白质67:167-176(2007))等产甲烷古生菌中发现。一般说来，催化甲基从CH3-MtaC转移的MtaA蛋白质很难在生物信息学上鉴别，因为其共享与其它类咕啉蛋白质甲基转移
酶的类似性并且取向不接近染色体上的MtaB和MtaC基因。然而，已经表征大量的MtaA编
码基因。巴氏甲烷八叠球菌和噬乙酸甲烷八叠球菌中这些基因的蛋白质序列可以通过以下GenBank寄存编号鉴别。

[0277]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
MtaA YP_304602 73668587 巴氏甲烷八叠球菌
MtaA1 NP_619241 20093166 噬乙酸甲烷八叠球菌
MtaA2 NP_616548 20090473 噬乙酸甲烷八叠球菌

[0278] 来自巴氏甲烷八叠球菌的MtaA基因YP_304602在大肠杆菌中克隆、测序并功能上过度表达(哈姆斯和陶尔,欧洲生物化学杂志235:653-659(1996)(Harms and
Thauer,Eur.J.Biochem.235:653-659(1996)))。在噬乙酸甲烷八叠球菌中，MtaA1需要在甲醇上生长，而MtaA2可有可无，即使在MtaA2突变体中从甲醇产生甲烷减少(博斯等人,细
菌学杂志190:4017-4026(2008)(Bose et al.,J.Bacteriol.190:4017-4026(2008)))。巴氏甲烷八叠球菌和噬乙酸甲烷八叠球菌中存在多种其它MtaA同源物，其虽然至今尚未表
征，但也可以催化类咕啉蛋白甲基转移酶活性。

[0279] 热醋穆尔氏菌中推定MtaA编码基因通过其与所表征的产甲烷MtaA基因的序列类似性鉴别。确切地说，三种热醋穆尔氏菌基因展示与来自巴氏甲烷八叠球菌的YP_304602的高度同源性(>30％序列一致性)。假定甲基四氢叶酸和辅酶M分别在产甲烷生物和产乙
酸菌中的作用类似，不同于天然地催化甲基从CH3-MtaC转移到辅酶M的产甲烷MtaA蛋白
质，热醋穆尔氏菌MtaA很可能转移甲基到甲基四氢叶酸。来自热醋穆尔氏菌的推定MtaA
编码基因的蛋白质序列可以通过以下GenBank寄存编号鉴别。

[0280]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
MtaA YP_430937 83590928 热醋穆尔氏菌
MtaA YP_431175 83591166 热醋穆尔氏菌
MtaA YP_430935 83590926 热醋穆尔氏菌
MtaA YP_430064 83590056 热醋穆尔氏菌

[0281] 图1步骤B亚甲基四氢叶酸还原酶(EM2)

[0282] 甲基-THF转变成亚甲基四氢叶酸是由EM2催化。在热醋穆尔氏菌中，此酶对氧敏感并含有铁-硫簇(克拉克和永达尔,生物化学杂志259:10845-10849(1984)
(Clark and Ljungdahl,J.Biol.Chem.259:10845-10849(1984)))。 此 酶 通 过 大 肠
杆菌中metF(谢泼德等人,细菌学杂志181:718-725(1999)(Sheppard et al.,J.
Bacteriol.181:718-725(1999)))和高温嗜热菌中的CHY_1233(吴等人,美国科学公共
图书馆遗传学1:e65(2005)(Wu et al.,PLoS Genet.1:e65(2005)))编码。热醋穆尔氏
菌基因和其高温嗜热菌对应物位于CODH/ACS基因簇附近，由推定的氢化酶和杂二硫醚还
原酶基因分开。以下列出了在生物信息学上发现的一些其它候选基因。在伍氏醋酸杆菌
(Acetobacterium woodii)中，metF与Rnf复合物通过RnfC2偶合(普林等人,美国科学
公共图书馆综合7:e33439(Poehlein et al,PLoS One.7:e33439))。通过blast搜索，在其它生物体中发现RnfC的同源物。已知Rnf复合物是一种可逆的复合物(富克斯(2011)微
生物学年评65:631-658(Fuchs(2011)Annu.Rev.Microbiol.65:631-658)。

[0283]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Moth_1191 YP_430048.1 83590039 热醋穆尔氏菌
Moth_1192 YP_430049.1 83590040 热醋穆尔氏菌
metF NP_418376.1 16131779 大肠杆菌
CHY_1233 YP_360071.1 78044792 高温嗜热菌
CLJU_c37610 YP_003781889.1 300856905 永达尔梭菌DSM 13528
DesfrDRAFT_3717 ZP_07335241.1 303248996 果糖脱硫弧菌JJ
CcarbDRAFT_2950 ZP_05392950.1 255526026 食一氧化碳梭菌P7
Ccel74_010100023124 ZP_07633513.1 307691067 食纤维梭菌743B
Cphy_3110 YP_001560205.1 160881237 植物发酵梭菌ISDg

[0284]

[0285] 图1步骤C和D-亚甲基四氢叶酸脱氢酶(EM3)、次甲基四氢叶酸环水解酶(EM4)

[0286] 在热醋穆尔氏菌、大肠杆菌和高温嗜热菌中，EM4和EM3分别通过Moth_1516、folD和CHY_1878的双功能基因产物进行(皮尔斯等人,环境微生物学10:2550-2573(2008)(Pierce et al.,Environ.Microbiol.10:2550-2573(2008))；吴 等 人 , 美 国 科 学
公共图书馆遗传学1:e65(2005)(Wu et al.,PLoSGenet.1:e65(2005))；达瑞和拉
比 诺兹 ,生 物 化 学 杂志 266:23953-23958(1991)(D'Ari and Rabinowitz,J.Biol.
Chem.266:23953-23958(1991)))。同源物存在于食一氧化碳梭菌P7中。若干其它生物体
也编码此双官能蛋白质，如以下列表。

[0287]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Moth_1516 YP_430368.1 83590359 热醋穆尔氏菌
folD NP_415062.1 16128513 大肠杆菌
CHY_1878 YP_360698.1 78044829 高温嗜热菌
CcarbDRAFT_2948 ZP_05392948.1 255526024 食一氧化碳梭菌P7
folD ADK16789.1 300437022 永达尔梭菌DSM 13528
folD-2 NP_951919.1 39995968 硫还原地杆菌PCA
folD YP_725874.1 113867385 罗尔斯通氏菌H16
folD NP_348702.1 15895353 丙酮丁醇梭菌ATCC 824
folD YP_696506.1 110800457 产气荚膜梭菌
MGA3_09460 EIJ83438.1 387591119 甲醇芽孢杆菌MGA3
PB1_14689 ZP_10132349.1 387929672 甲醇芽孢杆菌PB1

[0288] 图1步骤E-甲酰四氢叶酸脱甲酰酶(EM5)

[0289] 此酶催化10-甲酰基四氢叶酸(甲酰基-THF)水解成THF和甲酸酯。大肠杆菌中，此酶由purU编码并且已经过度产生、纯化和表征(纳吉等人,细菌学杂志
3:1292-1298(1995)(Nagy,et al.,J.Bacteriol.3:1292-1298(1995)))。 同 源 物 存 在于棒状杆菌属U-96(铃木等人,生物科学、生物技术与生物化学69(5):952-956(2005)
(Suzuki,et al.,Biosci.Biotechnol.Biochem.69(5):952-956(2005)))、谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067、肠道沙门氏菌和若干其它生物体中。

[0290]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
purU AAC74314.1 1787483 大肠杆菌K-12MG1655
purU BAD97821.1 63002616 棒状杆菌属U-96
purU EHE84645.1 354511740 谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067
purU NP_460715.1 16765100 肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌菌株LT2

[0291] 图1步骤F-甲酰四氢叶酸合成酶(EM6)

[0292] 甲酰四氢叶酸合成酶以一个ATP作为代价，将甲酸酯接合到四氢叶酸。此反应由热醋穆尔氏菌中的Moth_0109(奥布赖恩等人,实验补充26:249-262(1976)
(O'brien et al.,Experientia Suppl.26:249-262(1976))；洛弗尔等人,微生物学
档 案 149:280-285(1988)(Lovell et al.,Arch.Microbiol.149:280-285(1988))；
洛 弗 尔 等 人 , 生 物 化 学 29:5687-5694(1990)(Lovell et al.,Biochemistry
29:5687-5694(1990)))、食酸梭菌中的FHS(怀特黑德和拉比诺兹,细菌学杂志
167:203-209(1986)(Whitehead and Rabinowitz,J.Bacteriol.167:203-209(1986))；怀特黑德和拉比诺兹,细菌学杂志170:3255-3261(1988)(Whitehead and Rabinowitz,J.
Bacteriol.170:3255-3261(1988)))和高温嗜热菌中的CHY_2385(吴等人,美国科学公共
图书馆遗传学1:e65(2005))的基因产物催化。同源物存在于食一氧化碳梭菌P7中。此酶
在如下所列的若干其它生物体中发现。

[0293]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Moth_0109 YP_428991.1 83588982 热醋穆尔氏菌
CHY_2385 YP_361182.1 78045024 高温嗜热菌
FHS P13419.1 120562 食酸梭菌
CcarbDRAFT_1913 ZP_05391913.1 255524966 食一氧化碳梭菌P7
CcarbDRAFT_2946 ZP_05392946.1 255526022 食一氧化碳梭菌P7
Dhaf_0555 ACL18622.1 219536883 哈氏脱硫菌
fhs YP_001393842.1 153953077 克氏梭菌DSM 555
fhs YP_003781893.1 300856909 永达尔梭菌DSM 13528
MGA3_08300 EIJ83208.1 387590889 甲醇芽孢杆菌MGA3
PB1_13509 ZP_10132113.1 387929436 甲醇芽孢杆菌PB1

[0294] 图1步骤G-甲酸氢裂合酶(EM15)

[0295] EM15酶可以用以将甲酸酯转变成二氧化碳和氢。一种例示性EM15酶可以在大肠杆菌中发现。大肠杆菌EM15由氢化酶3和甲酸脱氢酶-H组成(梅达等人,应用
微生物学与生物技术77:879-890(2007)(Maeda et al.,Appl Microbiol Biotechnol
77:879-890(2007)))。其由fhlA的基因产物活化(梅达等人,应用微生物学与生物技术
77:879-890(2007))。微量元素硒、镍和钼添加到发酵液已经展示增强EM15活性(索伊尼
等人,微生物细胞工厂7:26(2008)(Soini et al.,Microb.Cell Fact.7:26(2008)))。以
下展示各种氢化酶3、EM8和转录活化基因。

[0296]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
hycA NP_417205 16130632 大肠杆菌K-12MG1655
hycB NP_417204 16130631 大肠杆菌K-12MG1655
hycC NP_417203 16130630 大肠杆菌K-12MG1655
hycD NP_417202 16130629 大肠杆菌K-12MG1655
hycE NP_417201 16130628 大肠杆菌K-12MG1655
hycF NP_417200 16130627 大肠杆菌K-12MG1655
hycG NP_417199 16130626 大肠杆菌K-12MG1655
hycH NP_417198 16130625 大肠杆菌K-12MG1655
hycI NP_417197 16130624 大肠杆菌K-12MG1655
fdhF NP_418503 16131905 大肠杆菌K-12MG1655
fhlA NP_417211 16130638 大肠杆菌K-12MG1655

[0297] EM15酶也存在于超嗜热古菌(hyperthermophilic archaeon)嗜热高温球菌(塔卡克斯等人,BMC微生物学8:88(2008)(Takacs et al.,BMC.Microbiol8:88(2008)))中。

[0298]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
mhyC ABW05543 157954626
mhyD ABW05544 157954627 嗜热高温球菌
mhyE ABW05545 157954628 嗜热高温球菌
myhF ABW05546 157954629 嗜热高温球菌
myhG ABW05547 157954630 嗜热高温球菌
myhH ABW05548 157954631 嗜热高温球菌
fdhA AAB94932 2746736 嗜热高温球菌
fdhB AAB94931 157954625 嗜热高温球菌

[0299] 其它的EM15系统已经在鼠伤寒沙门氏菌、肺炎克雷白杆菌、深红红螺菌、甲酸甲烷杆菌中发现(瓦尔达尔-萨拉等人,微生物生物技术1:107-125(2008)(Vardar-Scharaet al.,Microbial Biotechnology 1:107-125(2008)))。

[0300] 图1步骤H-氢化酶(EM16)

[0301] 氢化酶可以将氢气转变成质子并且将电子转移到受体，例如铁氧化还原蛋白、NAD+或NADP+。罗尔斯通氏菌H16使用氢作为能源，以氧作为末端电子受
体。其膜结合的吸收[NiFe]-氢化酶是“耐O2”的EM16(克拉克奈尔等人,美国
国 家 科 学 院 院 刊 ,106(49)20681-20686(2009)(Cracknell,et al.Proc Nat Acad Sci,106(49)20681-20686(2009)))，其在细胞周质上定向并且经由b型细胞色素连接到呼吸链(施林克和施莱格尔,生物化学与生物物理学学报,567,315-324(1979)(Schink and
Schlegel,Biochim.Biophys.Acta,567,315-324(1979))；伯恩哈德等人,欧洲生物化学杂志248,179-186(1997)(Bernhard et al.,Eur.J.Biochem.248,179-186(1997)))。罗尔斯通氏菌还含有耐O2的可溶性EM16，由Hox操纵子编码，Hox操纵子是细胞质的并且以氢作
为代价，直接还原NAD+(施耐德和施莱格尔,生物化学与生物物理学学报452,66-80(1976)(Schneider and Schlegel,Biochim.Biophys.Acta 452,66-80(1976))；伯格多夫,细菌学杂志187(9)3122-3132(2005)(Burgdorf,J.Bact.187(9)3122-3132(2005)))。可溶性EM16酶另外存在于若干其它生物体，包括硫还原地杆菌(库皮,微生物学151,1239-1254(2005)(Coppi,Microbiology 151,1239-1254(2005)))、集胞藻属菌株PCC 6803(杰默,生物化
学杂志,284(52),36462-36472(2009)(Germer,J.Biol.Chem.,284(52),36462-36472(200
9)))和桃红荚硫菌(莱赫利,应用与环境微生物学70(2)722-728(2004)(Rakhely,Appl.
Environ.Microbiol.70(2)722-728(2004)))。集胞藻属酶能够由氢产生NADPH。与单
独Hox基因的表达相比，Hox操纵子从集胞藻属菌株PCC 6803和由Hyp操纵子编码的
辅助基因从念珠藻属PCC 7120的过度表达都使EM16活性增加(杰默,生物化学杂志
284(52),36462-36472(2009)(Germer,J.Biol.Chem.284(52),36462-36472(2009)))。

[0302]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
HoxF NP_942727.1 38637753 罗尔斯通氏菌H16
HoxU NP_942728.1 38637754 罗尔斯通氏菌H16
HoxY NP_942729.1 38637755 罗尔斯通氏菌H16
HoxH NP_942730.1 38637756 罗尔斯通氏菌H16
HoxW NP_942731.1 38637757 罗尔斯通氏菌H16
HoxI NP_942732.1 38637758 罗尔斯通氏菌H16
HoxE NP_953767.1 39997816 硫还原地杆菌
HoxF NP_953766.1 39997815 硫还原地杆菌
HoxU NP_953765.1 39997814 硫还原地杆菌
HoxY NP_953764.1 39997813 硫还原地杆菌
HoxH NP_953763.1 39997812 硫还原地杆菌
GSU2717 NP_953762.1 39997811 硫还原地杆菌
HoxE NP_441418.1 16330690 集胞藻属菌株PCC 6803
HoxF NP_441417.1 16330689 集胞藻属菌株PCC 6803
未知功能 NP_441416.1 16330688 集胞藻属菌株PCC 6803
HoxU NP_441415.1 16330687 集胞藻属菌株PCC 6803
HoxY NP_441414.1 16330686 集胞藻属菌株PCC 6803
未知功能 NP_441413.1 16330685 集胞藻属菌株PCC 6803
未知功能 NP_441412.1 16330684 集胞藻属菌株PCC 6803
HoxH NP_441411.1 16330683 集胞藻属菌株PCC 6803

[0303]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
HypF NP_484737.1 17228189 念珠藻属PCC 7120
HypC NP_484738.1 17228190 念珠藻属PCC 7120
HypD NP_484739.1 17228191 念珠藻属PCC 7120
未知功能 NP_484740.1 17228192 念珠藻属PCC 7120
HypE NP_484741.1 17228193 念珠藻属PCC 7120
HypA NP_484742.1 17228194 念珠藻属PCC 7120
HypB NP_484743.1 17228195 念珠藻属PCC 7120
Hox1E AAP50519.1 37787351 桃红荚硫菌
Hox1F AAP50520.1 37787352 桃红荚硫菌
Hox1U AAP50521.1 37787353 桃红荚硫菌
Hox1Y AAP50522.1 37787354 桃红荚硫菌
Hox1H AAP50523.1 37787355 桃红荚硫菌

[0304] 大肠杆菌和其它肠细菌的基因组编码多达四种EM16酶 (索沃斯 , 安 东 尼· 范· 列 文 虎 克 66:57-88(1994)(Sawers,G.,Antonie Van
Leeuwenhoek66:57-88(1994))；索沃斯等人,细菌学杂志164:1324-1331(1985)(Sawers
et al.,J Bacteriol.164:1324-1331(1985))；索沃斯和伯克斯,欧洲生物化学杂志
156:265-275(1986)(Sawers and Boxer,Eur.J Biochem.156:265-275(1986))；索沃斯等人,细菌学杂志168:398-404(1986)(Sawers et al.,J Bacteriol.168:398-404(1986)))。
假定酶活性的多样性，大肠杆菌或另一宿主生物体可以提供足够的EM16活性以使进入的
分子氢分裂并且减少对应受体。大肠杆菌的内源性氢裂合酶包括氢化酶3、使用铁氧化
还原蛋白作为受体的膜结合的酶复合物和还使用铁氧化还原蛋白受体的氢化酶4。氢化
酶3和4分别由hyc和hyf基因簇编码。大肠杆菌中的EM16活性还取决于对应蛋白质与
EM16复合物装配相关的hyp基因的表达(雅各比等人,微生物学档案158:444-451(1992)
(Jacobi et al.,Arch.Microbiol 158:444-451(1992))；拉格拉贾等人,细菌学杂志
190:1447-1458(2008)(Rangarajan et al.,J Bacteriol.190:1447-1458(2008)))。热醋穆尔氏菌和永达尔梭菌EM16适合于缺乏足够的内源性EM16活性的宿主。热醋穆尔氏菌
和永达尔梭菌可以用CO2作为唯一碳源生长，指示还原当量从H2取出以能够经由伍德-永
达尔途径进行乙酰基-CoA合成(德雷克,细菌学杂志150:702-709(1982)(Drake,H.L.,
JBacteriol.150:702-709(1982))；德雷克和丹尼尔,微生物学研究155:869-883(2004)
(Drake and Daniel,Res Microbiol 155:869-883(2004))；凯勒姆和德雷克,细菌学杂志
160:466-469(1984)(Kellum and Drake,JBacteriol.160:466-469(1984)))。热醋穆尔氏菌具有来自大肠杆菌的若干hyp、hyc和hyf基因的同源物。由这些基因编码的这些蛋白质序列通过以下GenBank寄存编号鉴别。另外，编码EM16功能性的若干基因簇存在于热醋穆尔氏菌和永达尔梭菌中(参见例如US 2012/0003652)。

[0305]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
HypA NP_417206 16130633 大肠杆菌
HypB NP_417207 16130634 大肠杆菌
HypC NP_417208 16130635 大肠杆菌
HypD NP_417209 16130636 大肠杆菌
HypE NP_417210 226524740 大肠杆菌
HypF NP_417192 16130619 大肠杆菌
HycA NP_417205 16130632 大肠杆菌
HycB NP_417204 16130631 大肠杆菌
HycC NP_417203 16130630 大肠杆菌
HycD NP_417202 16130629 大肠杆菌
HycE NP_417201 16130628 大肠杆菌
HycF NP_417200 16130627 大肠杆菌
HycG NP_417199 16130626 大肠杆菌
HycH NP_417198 16130625 大肠杆菌
HycI NP_417197 16130624 大肠杆菌
HyfA NP_416976 90111444 大肠杆菌
HyfB NP_416977 16130407 大肠杆菌
HyfC NP_416978 90111445 大肠杆菌
HyfD NP_416979 16130409 大肠杆菌
HyfE NP_416980 16130410 大肠杆菌
HyfF NP_416981 16130411 大肠杆菌
HyfG NP_416982 16130412 大肠杆菌
HyfH NP_416983 16130413 大肠杆菌
HyfI NP_416984 16130414 大肠杆菌
HyfJ NP_416985 90111446 大肠杆菌
HyfR NP_416986 90111447 大肠杆菌

[0306] 下文展示基因与大肠杆菌EM16基因同源的热醋穆尔氏菌中的蛋白质。

[0307]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Moth_2175 YP_431007 83590998 热醋穆尔氏菌
Moth_2176 YP_431008 83590999 热醋穆尔氏菌
Moth_2177 YP_431009 83591000 热醋穆尔氏菌
Moth_2178 YP_431010 83591001 热醋穆尔氏菌
Moth_2179 YP_431011 83591002 热醋穆尔氏菌
Moth_2180 YP_431012 83591003 热醋穆尔氏菌
Moth_2181 YP_431013 83591004 热醋穆尔氏菌
Moth_2182 YP_431014 83591005 热醋穆尔氏菌
Moth_2183 YP_431015 83591006 热醋穆尔氏菌
Moth_2184 YP_431016 83591007 热醋穆尔氏菌
Moth_2185 YP_431017 83591008 热醋穆尔氏菌
Moth_2186 YP_431018 83591009 热醋穆尔氏菌
Moth_2187 YP_431019 83591010 热醋穆尔氏菌
Moth_2188 YP_431020 83591011 热醋穆尔氏菌
Moth_2189 YP_431021 83591012 热醋穆尔氏菌
Moth_2190 YP_431022 83591013 热醋穆尔氏菌
Moth_2191 YP_431023 83591014 热醋穆尔氏菌
Moth_2192 YP_431024 83591015 热醋穆尔氏菌
Moth_0439 YP_429313 83589304 热醋穆尔氏菌
Moth_0440 YP_429314 83589305 热醋穆尔氏菌
Moth_0441 YP_429315 83589306 热醋穆尔氏菌
Moth_0442 YP_429316 83589307 热醋穆尔氏菌
Moth_0809 YP_429670 83589661 热醋穆尔氏菌
Moth_0810 YP_429671 83589662 热醋穆尔氏菌
Moth_0811 YP_429672 83589663 热醋穆尔氏菌
Moth_0812 YP_429673 83589664 热醋穆尔氏菌
Moth_0814 YP_429674 83589665 热醋穆尔氏菌
Moth_0815 YP_429675 83589666 热醋穆尔氏菌
Moth_0816 YP_429676 83589667 热醋穆尔氏菌
Moth_1193 YP_430050 83590041 热醋穆尔氏菌
Moth_1194 YP_430051 83590042 热醋穆尔氏菌
Moth_1195 YP_430052 83590043 热醋穆尔氏菌
Moth_1196 YP_430053 83590044 热醋穆尔氏菌
Moth_1717 YP_430562 83590553 热醋穆尔氏菌
Moth_1718 YP_430563 83590554 热醋穆尔氏菌
Moth_1719 YP_430564 83590555 热醋穆尔氏菌
Moth_1883 YP_430726 83590717 热醋穆尔氏菌
Moth_1884 YP_430727 83590718 热醋穆尔氏菌
Moth_1885 YP_430728 83590719 热醋穆尔氏菌
Moth_1886 YP_430729 83590720 热醋穆尔氏菌
Moth_1887 YP_430730 83590721 热醋穆尔氏菌
Moth_1888 YP_430731 83590722 热醋穆尔氏菌
Moth_1452 YP_430305 83590296 热醋穆尔氏菌
Moth_1453 YP_430306 83590297 热醋穆尔氏菌
Moth_1454 YP_430307 83590298 热醋穆尔氏菌

[0308]

[0309] 下文展示来自永达尔梭菌的编码EM16酶的基因。

[0310]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
CLJU_c20290 ADK15091.1 300435324 永达尔梭菌
CLJU_c07030 ADK13773.1 300434006 永达尔梭菌
CLJU_c07040 ADK13774.1 300434007 永达尔梭菌
CLJU_c07050 ADK13775.1 300434008 永达尔梭菌
CLJU_c07060 ADK13776.1 300434009 永达尔梭菌
CLJU_c07070 ADK13777.1 300434010 永达尔梭菌
CLJU_c07080 ADK13778.1 300434011 永达尔梭菌
CLJU_c14730 ADK14541.1 300434774 永达尔梭菌
CLJU_c14720 ADK14540.1 300434773 永达尔梭菌
CLJU_c14710 ADK14539.1 300434772 永达尔梭菌
CLJU_c14700 ADK14538.1 300434771 永达尔梭菌
CLJU_c28670 ADK15915.1 300436148 永达尔梭菌
CLJU_c28660 ADK15914.1 300436147 永达尔梭菌
CLJU_c28650 ADK15913.1 300436146 永达尔梭菌
CLJU_c28640 ADK15912.1 300436145 永达尔梭菌

[0311] 在一些情况下，EM16编码基因位于CODH附近。在深红红螺菌中，编码的CODH/氢化酶蛋白质形成膜结合的酶复合物，其已经被指示为其中呈质子梯度形式的能量由CO和H2O转变成CO2和H2产生的位点(福克斯等人,细菌学杂志178:6200-6208(1996)(Fox et
al.,J Bacteriol.178:6200-6208(1996)))。已经基于与深红红螺菌CODH/氢化酶基因簇
的类似性，提出高温嗜热菌的CODH-I和其相邻的基因催化类似的功能作用(吴等人,美国
科学公共图书馆遗传学1:e65(2005))。还展示当连接于电极时高温嗜热菌CODH-I显示强
烈的CO氧化和CO2还原活性(帕金等人,美国化学会志129:10328-10329(2007)(Parkin
et al.,J Am.Chem.Soc.129:10328-10329(2007)))。

[0312]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
CooL AAC45118 1515468 深红红螺菌

[0313]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
CooX AAC45119 1515469 深红红螺菌
CooU AAC45120 1515470 深红红螺菌
CooH AAC45121 1498746 深红红螺菌
CooF AAC45122 1498747 深红红螺菌
CODH(CooS) AAC45123 1498748 深红红螺菌
CooC AAC45124 1498749 深红红螺菌
CooT AAC45125 1498750 深红红螺菌
CooJ AAC45126 1498751 深红红螺菌
CODH-I(CooS-I) YP_360644 78043418 高温嗜热菌
CooF YP_360645 78044791 高温嗜热菌
HypA YP_360646 78044340 高温嗜热菌
CooH YP_360647 78043871 高温嗜热菌
CooU YP_360648 78044023 高温嗜热菌
CooX YP_360649 78043124 高温嗜热菌
CooL YP_360650 78043938 高温嗜热菌
CooK YP_360651 78044700 高温嗜热菌
CooM YP_360652 78043942 高温嗜热菌
CooC YP_360654.178043296 高温嗜热菌
CooA-1 YP_360655.178044021 高温嗜热菌

[0314] 一些EM16和CODH酶转移电子到铁氧化还原蛋白。铁氧化还原蛋白是小的酸性蛋白，其含有一或多个在低还原电位下用作细胞内电子载体的铁-硫簇。还原的铁氧化还+
原蛋贡献电子到Fe依赖性的酶，例如铁氧化还原蛋白-NADP氧化还原酶、丙酮酸:铁氧化
还原蛋白氧化还原酶(PFOR)和2-氧代戊二酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶(OFOR)。嗜
热氢杆菌基因fdx1编码[4Fe-4S]类型铁氧化还原蛋白，此铁氧化还原蛋白为分别OFOR
和PFOR的2-氧代戊二酸酯和丙酮酸酯的可逆羧化作用所需(山本等人,极端微生物
14:79-85(2010)(Yamamoto et al.,Extremophiles 14:79-85(2010)))。与硫磺矿硫化
叶菌2-氧代酸:铁氧化还原蛋白还原酶相关联的铁氧化还原蛋白是单体二簇[3Fe-4S]
[4Fe-4S]类型铁氧化还原蛋白(帕克等人2006(Park et al.2006))。虽然与此蛋白质
相关联的基因尚未完全测序，但是N末端结构域与来自硫磺矿硫化叶菌的zfx铁氧化还
原蛋白共享93％同源性。大肠杆菌基因组编码未知生理功能的可溶性铁氧化还原蛋白
fdx。一些证据指示此蛋白质可以在铁-硫簇装配中起作用(高桥和中村,1999(Takahashi and Nakamura,1999))。其它的铁氧化还原蛋白已经在幽门螺杆菌(穆霍帕德耶等人
2003(Mukhopadhyay et al.2003))和空肠弯曲杆菌(凡弗利特等人2001(van Vliet et
al. 2001))中表征。来自巴氏梭菌的2Fe-2S铁氧化还原蛋白已经在大肠杆菌中克隆和表
达(藤永和迈尔, 生物化学和生物物理研究通讯, 192(3): (1993)(Fujinaga and Meyer, Biochemical and Biophysical Research Communications,192(3): (1993)))。预测例如热醋穆尔氏菌、 食一氧化碳梭菌P7、 永达尔梭菌和深红红螺菌等产乙酸细菌编码若干铁氧化还原蛋白，在下文中列出。

[0315]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
fdx1 BAE02673.1 68163284 嗜热氢杆菌
M11214.1 AAA83524.1 144806 巴氏梭菌
Zfx AAY79867.1 68566938 高温酸热硫化叶菌
Fdx AAC75578.1 1788874 大肠杆菌
hp_0277 AAD07340.1 2313367 幽门螺杆菌
fdxA CAL34484.1 112359698 空肠弯曲杆菌
Moth_0061 ABC18400.1 83571848 热醋穆尔氏菌
Moth_1200 ABC19514.1 83572962 热醋穆尔氏菌
Moth_1888 ABC20188.1 83573636 热醋穆尔氏菌
Moth_2112 ABC20404.1 83573852 热醋穆尔氏菌
Moth_1037 ABC19351.1 83572799 热醋穆尔氏菌
CcarbDRAFT_4383 ZP_05394383.1 255527515 食一氧化碳梭菌P7
CcarbDRAFT_2958 ZP_05392958.1 255526034 食一氧化碳梭菌P7
CcarbDRAFT_2281 ZP_05392281.1 255525342 食一氧化碳梭菌P7
CcarbDRAFT_5296 ZP_05395295.1 255528511 食一氧化碳梭菌P7
CcarbDRAFT_1615 ZP_05391615.1 255524662 食一氧化碳梭菌P7
CcarbDRAFT_1304 ZP_05391304.1 255524347 食一氧化碳梭菌P7
cooF AAG29808.1 11095245 高温嗜热菌
fdxN CAA35699.1 46143 荚膜红细菌
Rru_A2264 ABC23064.1 83576513 深红红螺菌
Rru_A1916 ABC22716.1 83576165 深红红螺菌
Rru_A2026 ABC22826.1 83576275 深红红螺菌
cooF AAC45122.1 1498747 深红红螺菌
fdxN AAA26460.1 152605 深红红螺菌
Alvin_2884 ADC63789.1 288897953 红色硫黄光合成细菌DSM 180
Fdx YP_002801146.1 226946073 维氏固氮菌DJ
CKL_3790 YP_001397146.1 153956381 克氏梭菌DSM 555
fer1 NP_949965.1 39937689 沼泽红假单胞菌CGA009
Fdx CAA12251.1 3724172 芳族陶厄氏菌
CHY_2405 YP_361202.1 78044690 高温嗜热菌
Fer YP_359966.1 78045103 高温嗜热菌
Fer AAC83945.1 1146198 枯草杆菌
fdx1 NP_249053.1 15595559 绿脓杆菌PA01

[0316]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
yfhL AP_003148.1 89109368 大肠杆菌K-12
CLJU_c00930 ADK13195.1 300433428 永达尔梭菌
CLJU_c00010 ADK13115.1 300433348 永达尔梭菌
CLJU_c01820 ADK13272.1 300433505 永达尔梭菌
CLJU_c17980 ADK14861.1 300435094 永达尔梭菌
CLJU_c17970 ADK14860.1 300435093 永达尔梭菌
CLJU_c22510 ADK15311.1 300435544 永达尔梭菌
CLJU_c26680 ADK15726.1 300435959 永达尔梭菌
CLJU_c29400 ADK15988.1 300436221 永达尔梭菌

[0317] 铁氧化还原蛋白氧化还原酶将电子从铁氧化还原蛋白或黄素氧化还原蛋白转移到NAD(P)H。两种催化电子从还原的铁氧化还原蛋白可逆转移到NAD(P)+的酶是铁氧化还
原蛋白:NAD+氧化还原酶(EC 1.18.1.3)和铁氧化还原蛋白:NADP+氧化还原酶(FNR，EC
1.18.1.2)。铁氧化还原蛋白:NADP+氧化还原酶(FNR，EC 1.18.1.2)具有非共价结合的
FAD辅因子，促进电子从NADPH可逆转移到低电位的受体，例如铁氧化还原蛋白或黄素氧化还原蛋白(布拉斯科夫斯基等人,欧洲生物化学杂志123:563-569(1982)(Blaschkowski
et al.,Eur.J.Biochem.123:563-569(1982))；藤井等人,1977(Fujii et al.,1977))。由HP1164(fqrB)编码的幽门螺杆菌FNR与丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶(PFOR)的
活性偶合，导致NADPH依赖于丙酮酸的产生(圣等人2007(St et al.2007))。类似的酶
在空肠弯曲杆菌中发现(圣莫里斯等人,细菌学杂志189:4764-4773(2007)(St Maurice
et al.,J.Bacteriol.189:4764-4773(2007)))。铁氧化还原蛋白:NADP+氧化还原酶在
大肠杆菌基因组中由fpr编码(班奇炉等人1993(Bianchi et al.1993))。铁氧化还原
蛋白:NAD+氧化还原酶利用还原的铁氧化还原蛋白从NAD+产生NADH。在包括大肠杆菌
在内的若干生物体中，此酶是多功能加双氧酶复合物的一种组分。由hcaD编码的大肠
杆菌的铁氧化还原蛋白:NAD+氧化还原酶是与芳族酸利用有关的3-苯基丙酸酯加双氧
酶系统的一种组分(迪亚斯等人1998(Diaz et al.1998))。虽然尚未指示具有此活性
的基因，但在嗜热氢杆菌的细胞提取物中检测到NADH:铁氧化还原蛋白还原酶活性(尹
等人2006(Yoon et al.2006))。其它的铁氧化还原蛋白:NAD(P)+氧化原酶已经在食一
氧化碳梭菌P7中诠释。克氏梭菌的由nfnAB编码的NADP依赖性的还原铁氧化还原蛋
白:NADP氧化还原酶用两当量的NADPH催化铁氧化原蛋白和NAD+的伴随还原(王等人,
细菌学杂志192:5115-5123(2010)(Wang et al,J Bacteriol 192:5115-5123(2010)))。
最后，节约能源的膜相关Rnf类型蛋白质(塞多夫等人,美国国家科学院院刊
105:2128-2133(2008)(Seedorf et al,PNAS 105:2128-2133(2008))；和赫尔曼,细菌学杂志190:784-791(2008)(Herrmann,J.Bacteriol 190:784-791(2008)))提供了一种从还原
的铁氧化还原蛋白产生NADH或NADPH的方式。

[0318]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
fqrB NP_207955.1 15645778 幽门螺杆菌
fqrB YP_001482096.1 157414840 空肠弯曲杆菌
RPA3954 CAE29395.1 39650872 沼泽红假单胞菌
Fpr BAH29712.1 225320633 嗜热氢杆菌
yumC NP_391091.2 255767736 枯草杆菌
Fpr P28861.4 399486 大肠杆菌
hcaD AAC75595.1 1788892 大肠杆菌
LOC100282643 NP_001149023.1 226497434 玉米
NfnA YP_001393861.1 153953096 克氏梭菌
NfnB YP_001393862.1 153953097 克氏梭菌
CcarbDRAFT_2639 ZP_05392639.1 255525707 食一氧化碳梭菌P7
CcarbDRAFT_2638 ZP_05392638.1 255525706 食一氧化碳梭菌P7
CcarbDRAFT_2636 ZP_05392636.1 255525704 食一氧化碳梭菌P7
CcarbDRAFT_5060 ZP_05395060.1 255528241 食一氧化碳梭菌P7
CcarbDRAFT_2450 ZP_05392450.1 255525514 食一氧化碳梭菌P7
CcarbDRAFT_1084 ZP_05391084.1 255524124 食一氧化碳梭菌P7
RnfC EDK33306.1 146346770 克氏梭菌
RnfD EDK33307.1 146346771 克氏梭菌
RnfG EDK33308.1 146346772 克氏梭菌
RnfE EDK33309.1 146346773 克氏梭菌
RnfA EDK33310.1 146346774 克氏梭菌
RnfB EDK33311.1 146346775 克氏梭菌
CLJU_c11410(RnfB) ADK14209.1 300434442 永达尔梭菌
CLJU_c11400(RnfA) ADK14208.1 300434441 永达尔梭菌
CLJU_c11390(RnfE) ADK14207.1 300434440 永达尔梭菌
CLJU_c11380(RnfG) ADK14206.1 300434439 永达尔梭菌
CLJU_c11370(RnfD) ADK14205.1 300434438 永达尔梭菌
CLJU_c11360(RnfC) ADK14204.1 300434437 永达尔梭菌
MOTH_1518(NfnA) YP_430370.1 83590361 热醋穆尔氏菌
MOTH_1517(NfnB) YP_430369.1 83590360 热醋穆尔氏菌
CHY_1992(NfnA) YP_360811.1 78045020 高温嗜热菌
CHY_1993(NfnB) YP_360812.1 78044266 高温嗜热菌
CLJU_c37220(NfnAB) YP_003781850.1 300856866 永达尔梭菌

[0319] 图1步骤I-甲酸脱氢酶(EM8)

[0320] 甲酸脱氢酶(FDH；EM8)催化电子从甲酸酯可逆转移到受体。具有FDH活性的酶利用各种电子载体，例如NADH(EC 1.2.1.2)、NADPH(EC1.2.1.43)、醌醇(EC 1.1.5.6)、细胞色素(EC 1.2.2.3)和EM16(EC 1.1.99.33)。FDH酶已经从热醋穆尔氏菌表征
(安德里森和永达尔,细菌学杂志116:867-873(1973)(Andreesen and Ljungdahl,J
Bacteriol 116:867-873(1973))；李等人,细菌学杂志92:405-412(1966)(Li et al.,J
Bacteriol92:405-412(1966))；山本等人,生物化学杂志258:1826-1832(1983)(Yamamoto et al.,J Biol Chem.258:1826-1832(1983)))。基因座Moth_2312负责编码EM8的α
亚单位，而β亚单位由Moth_2314编码(皮尔斯等人,环境微生物学(2008)(Pierce
et al.,Environ Microbiol(2008)))。另一组编码倾向于还原CO2的EM8活性的基因
由富马氧化互营杆菌中的Sfum_2703到Sfum_2706编码(德伯克等人,欧洲生物化学
杂 志 270:2476-2485(2003)(de Bok et al.,Eur J Biochem.270:2476-2485(2003))；
雷 达 等 人,美 国 国 家 科 学 院 院 刊 105:10654-10658(2008)(Reda et al.,PNAS
105:10654-10658(2008)))。假设执行相同的功能的类似组的基因由高温嗜热菌中
的CHY_0731、CHY_0732和CHY_0733编码(吴等人,美国科学公共图书馆遗传学
1:e65(2005))。还在包括食一氧化碳梭菌P7、甲醇芽孢杆菌、稳定伯克氏菌、热醋穆尔氏菌ATCC 39073、博伊丁念珠菌、甲基念珠菌和酿酒酵母S288c在内的其它生物体中发现EM8。
来自罗尔斯通氏菌的可溶性EM8还原NAD+(fdsG、-B、-A、-C、-D)(欧和鲍温,1998(Oh and Bowien,1998))。

[0321] 已经鉴别出与NAD相比，对作为辅因子的NADP具有较高特异性的若干EM8酶。此酶已经被视为NADP依赖性的甲酸脱氢酶并且已经从洋葱伯克氏菌复合物的5个物种报导。
在多噬伯克氏菌、稳定伯克氏菌、吡咯伯克氏菌和新洋葱伯克氏菌的多个菌株中测试和验证其(哈琼杰特等人,酶与微生物技术,46:557-561(2010)(Hatrongjit et al.,Enzyme
and Microbial Tech.,46:557-561(2010)))。来自稳定伯克氏菌的酶已经表征并且报导酶针对甲酸酯、NADP和NAD的表观Km分别是55.5mM、0.16mM和1.43mM。可以使用寄存在例如NCBI、JGI和宏基因组数据库等公共数据库中的蛋白质的序列同源性鉴别更多候选基因。

[0322]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Moth_2312 YP_431142 148283121 热醋穆尔氏菌
Moth_2314 YP_431144 83591135 热醋穆尔氏菌
Sfum_2703 YP_846816.1 116750129 富马氧化互营杆菌
Sfum_2704 YP_846817.1 116750130 富马氧化互营杆菌
Sfum_2705 YP_846818.1 116750131 富马氧化互营杆菌
Sfum_2706 YP_846819.1 116750132 富马氧化互营杆菌
CHY_0731 YP_359585.1 78044572 高温嗜热菌
CHY_0732 YP_359586.1 78044500 高温嗜热菌
CHY_0733 YP_359587.1 78044647 高温嗜热菌
CcarbDRAFT_0901 ZP_05390901.1 255523938 食一氧化碳梭菌P7
CcarbDRAFT_4380 ZP_05394380.1 255527512 食一氧化碳梭菌P7
fdhA，MGA3_06625 EIJ82879.1 387590560 甲醇芽孢杆菌MGA3
fdhA，PB1_11719 ZP_10131761.1 387929084 甲醇芽孢杆菌PB1
fdhD，MGA3_06630 EIJ82880.1 387590561 甲醇芽孢杆菌MGA3
fdhD，PB1_11724 ZP_10131762.1 387929085 甲醇芽孢杆菌PB1
fdh ACF35003.1 194220249 稳定伯克氏菌
fdh ACF35004.1 194220251 吡咯伯克氏菌
fdh ACF35002.1 194220247 新洋葱伯克氏菌
fdh ACF35001.1 194220245 多噬伯克氏菌
fdh ACF35000.1 194220243 洋葱伯克氏菌
FDH1 AAC49766.1 2276465 博伊丁念珠菌
fdh CAA57036.1 1181204 甲基念珠菌
FDH2 P0CF35.1 294956522 酿酒酵母S288c
FDH1 NP_015033.1 6324964 酿酒酵母S288c
fdsG YP_725156.1 113866667 罗尔斯通氏菌
fdsB YP_725157.1 113866668 罗尔斯通氏菌
fdsA YP_725158.1 113866669 罗尔斯通氏菌
fdsC YP_725159.1 113866670 罗尔斯通氏菌
fdsD YP_725160.1 113866671 罗尔斯通氏菌

[0323]

[0324] 图1步骤J-甲醇脱氢酶(EM9)

[0325] NAD+依赖性的EM9酶(EC 1.1.1.244)催化甲醇和NAD+转变成甲醛和NADH。具有此活性的酶首先在甲醇芽孢杆菌中表征(赫格赛特等人,应用与环境微生物
学,78(15):5170-5181(2012)(Heggeset,et al.,Applied and Environmental Microbiology,78(15):5170–5181(2012)))。此酶依赖于锌和镁，并且酶的活性由act编码的活化酶增强(克鲁斯特曼等人,生物化学杂志277:34785-92(2002)(Kloosterman et al,J Biol
Chem 277:34785-92(2002)))。act是Nudix水解酶。若干这些候选者已经鉴别并展示在
甲醇上具有活性。其它的NAD(P)+依赖性的酶可以通过序列同源性鉴别。利用不同的电
子受体的EM9酶也是本领域中已知的。实例包括细胞色素依赖性的酶，例如亲甲基醇菌扭脱甲基杆菌的mxaIF(纳恩等人,核酸研究16:7722(1988)(Nunn et al,Nucl Acid Res
16:7722(1988)))。例如荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatis)等甲烷营养菌的EM9
酶在与甲烷单加氧酶的复合物中起作用(麦隆诺瓦等人,生物化学45:11905-14(2006)
(Myronova et al.,Biochem45:11905-14(2006)))。甲醇也可以通过例如博伊丁念珠菌
的甲醇氧化酶(EC1.1.3.13)等醇氧化酶氧化成甲醛(酒井等人,基因114:67-73(1992)
(Sakai et al.,Gene 114:67-73(1992)))。

[0326]

[0327]

[0328]

[0329] 发展体内分析以测定甲醇脱氢酶的活性。此分析依赖于甲醛(HCHO)的检测，因此测量酶的促进活性(氧化甲醇)。为此，使用Lamba Red重组酶技术产生包含BDOP和缺乏frmA、frmB、frmR的菌株(达森克和华纳,美国国家科学院院刊,697(12):6640-5(2000)
(Datsenko and Wanner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,697(12):6640-5(2000))。表达甲醇脱氢酶的质体转化到菌株，接着在LB培养基+抗生素中在37℃下在震荡下生长到饱和。用空载体转化菌株用作阴性对照。培养物通过O.D.调整，接着用M9培养基+0.5％葡萄糖+抗
生素1:10稀释并且在37℃下在震荡下培养6-8小时，直到晚期对数期。甲醇添加到2％v/
v并且培养物在震荡下在37℃下进一步培育30分钟。培养物减速离心并针对产生的甲醛
使用DETECTX甲醛检测试剂盒(美国密歇根州安娜堡的爱博分析公司(Arbor Assays；Ann Arbor,MI))，根据制造商的说明书分析上清液。frmA、frmB、frmR的缺失消除了天然的甲醛利用途径，此途径能够形成可以用于检测NNOMO中的甲醇脱氢酶活性的甲醛。

[0330] 若干酶的活性使用上述分析测量。四个独立实验的结果提供于以下表1中。

[0331] 表1：展示包含表达甲醇脱氢酶的质体的各种NNOMO的甲醛(HCHO)产生的体内分析结果

[0332]

[0333] 图1步骤K-自发或甲醛活化酶(EM10)

[0334] 甲醛和THF转变成亚甲基四氢叶酸可以自发地发生。此反应的速率也可能由EM10增强。已经在扭脱甲基杆菌AM1中鉴别甲醛活化酶(Fae；EM10)，其催化甲醛和四氢甲烷蝶呤缩合成亚甲基四氢甲烷蝶呤(沃霍特等人,细菌学杂志,182(23),6645-6650(2000)
(Vorholt,et al.,J.Bacteriol.,182(23),6645-6650(2000)))。可能类似的酶存在或可以经工程化以催化甲醛和四氢叶酸缩合成亚甲基四氢叶酸。同源物存在于若干生物体中，包括自养黄色杆菌Py2和反硝化生丝微菌ATCC 51888。

[0335]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
MexAM1_META1p1766 Q9FA38.3 17366061 扭脱甲基杆菌AM1
Xaut_0032 YP_001414948.1 154243990 自养黄色杆菌Py2
Hden_1474 YP_003755607.1 300022996 反硝化生丝微菌ATCC 51888

[0336] 图1步骤L-甲醛脱氢酶(EM11)

[0337] 甲醛氧化成甲酸酯由EM11催化。NAD+依赖性的EM11酶由恶臭假单胞菌的fdhA编码(伊托等人,细菌学杂志176:2483-2491(1994)(Ito et al,J Bacteriol
176:2483-2491(1994)))。其它的EM11酶包括来自札氏生丝微菌的NAD+和谷胱甘肽无关
的EM11(杰罗姆等人,应用微生物学与生物技术77:779-88(2007)(Jerome et al,Appl
Microbiol Biotechnol 77:779-88(2007)))、巴斯德毕赤氏酵母的谷胱甘肽依赖性的
EM11(松加等人,基因330:39-47(2004)(Sunga et al,Gene 330:39-47(2004)))和海
洋甲基细菌的NAD(P)+依赖性的EM11(斯皮尔等人,欧洲微生物学会联合会微生物学快
报,121(3):349-55(1994)(Speer et al,FEMS Microbiol Lett,121(3):349-55(1994)))。

[0338]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
fdhA P46154.3 1169603 恶臭假单胞菌
faoA CAC85637.1 19912992 札氏生丝微菌
Fld1 CCA39112.1 328352714 巴斯德毕赤氏酵母
fdh P47734.2 221222447 海洋甲基细菌

[0339] 除上列的EM11酶外，用于将甲醛转变成甲酸酯的替代酶和途径是本领域中已知的。举例来说，许多生物体采用谷胱甘肽依赖性的甲醛氧化途径，其中甲醛经由中间物
S-羟基甲基谷胱甘肽和S-甲酰谷胱甘肽以三步骤转变成甲酸酯(沃霍特等人,细菌学杂
志182:6645-50(2000)(Vorholt et al,J Bacteriol 182:6645-50(2000)))。此途径的酶是EM12(EC 4.4.1.22)、EM13(EC 1.1.1.284)和EM14(EC 3.1.2.12)。

[0340] 图1步骤M-自发或S-(羟基甲基)谷胱甘肽合酶(EM12)

[0341] 虽然甲醛转变成S-羟基甲基谷胱甘肽可以在谷胱甘肽存在下自发地发生，但古恩里奇(Goenrich)等人(古恩里奇等人,生物化学杂志277(5)；3069-72(2002)
(Goenrich,et al.,J Biol Chem 277(5)；3069-72(2002)))已经展示来自脱氮副球菌的酶可以加速此自发的缩合反应。催化甲醛和谷胱甘肽转变的酶经纯化并且命名为谷胱甘肽依赖性的甲醛活化酶(Gfa)。其编码基因命名为gfa，位于EM13基因的直接上游，EM13催化
S-羟基甲基谷胱甘肽的随后氧化。球形红细菌、苜蓿中华根瘤菌和百脉根根瘤菌中也存在于与来自脱氮副球菌的Gfa具有序列一致性的推定蛋白质。

[0342]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Gfa Q51669.3 38257308 脱氮副球菌
Gfa ABP71667.1 145557054 球形红细菌ATCC 17025
Gfa Q92WX6.1 38257348 苜蓿中华根瘤菌1021
Gfa Q98LU4.2 38257349 百脉根根瘤菌MAFF303099

[0343] 图1步骤N-谷胱甘肽依赖性的甲醛脱氢酶(EM13)

[0344] EM13(GS-FDH)属于类别III醇脱氢酶家族。谷胱甘肽和甲醛非酶促组合，形成羟基甲基谷胱甘肽，其为GS-FDH催化反应的真正底物。产物S-甲酰谷胱甘肽进一步代谢成甲酸。

[0345]

[0346]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
frmA YP_488650.1 388476464 大肠杆菌K-12MG1655
SFA1 NP_010113.1 6320033 酿酒酵母S288c
flhA AAC44551.1 1002865 脱氮副球菌
adhI AAB09774.1 986949 球形红细菌

[0347] 图1步骤O-S-甲酰谷胱甘肽水解酶(EM14)

[0348] EM14是在细菌、植物和动物中发现的谷胱甘肽硫醇酯酶。其催化S-甲酰谷胱甘肽转变成甲酸酯和谷胱甘肽。脱氮副球菌的fghA基因位于与gfa和flhA相同的操纵子中，gfa和flhA两种基因与此生物体中甲醛氧化成甲酸酯相关。在大肠杆菌中，FrmB在具有
FrmR和FrmA的操纵子中编码，FrmR和FrmA是与甲醛氧化相关的蛋白质。大肠杆菌的YeiG
是一种混杂的丝氨酸水解酶；其最高比放射性是伴随底物S-甲酰谷胱甘肽。

[0349]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
frmB NP_414889.1 16128340 大肠杆菌K-12MG1655
yeiG AAC75215.1 1788477 大肠杆菌K-12MG1655
fghA AAC44554.1 1002868 脱氮副球菌

[0350] 4.2实例II-使用甲醇增强碳水化合物的1,4丁二醇的产率

[0351] 用于增强还原当量的可用性的例示性MMP提供于图2中。

[0352] 图2步骤A-丁二酰基-CoA转移酶(EB1)或丁二酰基-CoA合成酶(EB2A)(或丁二酰基-CoA连接酶)

[0353] 丁二酸酯转变成丁二酰基-CoA是由EB1或EB2A(连接酶)催化。EB1酶包括克氏梭菌的cat1和大肠杆菌的ygfH(塞多夫等人,美国国家科学院院刊105:2128-2133(2008)
(Seedorf et al.,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A105:2128-2133(2008))；索林等人,细菌学杂志.178:871-880(1996)(Sohling et al.,J Bacteriol.178:871-880(1996))；哈勒等
人,生物化学,39(16)4622-4629(Haller et al.,Biochemistry,39(16)4622-4629))。同
源物可以在例如杨氏柠檬酸杆菌ATCC 29220、肠道沙门氏菌亚种亚利桑那血清变型和耶尔森氏菌属中间物ATCC 29909中发现。丁二酰基-CoA:3:氧代酸-CoA转移酶采用丁二酸
酯作为CoA受体。此酶由恶臭假单胞菌中的pcaI和pcaJ编码(卡查贝克等人,细菌学
杂志.184:207-215(2002)(Kaschabek et al.,JBacteriol.184:207-215(2002)))。类似
的酶在不动杆菌属ADP1(考沃克等人,基因146:23-30(1994)(Kowalchuk et al.,Gene
146:23-30(1994)))、天蓝链霉菌和纳克假单胞菌(以前是B13属)(戈贝尔等人,细
菌 学 杂 志 .184:216-223(2002)(Gobel et al.,J Bacteriol.184:216-223(2002))；
卡 查 贝 克 等 人 , 细 菌 学 杂 志 .184:207-215(2002)(Kaschabek et al.,J
Bacteriol.184:207-215(2002)))中发现。其它丁二酰基-CoA:3:氧代酸-CoA转移
酶已经在幽门螺杆菌(考瑟斯-赛拉兹等人,生物化学杂志272:25659-25667(1997)
(Corthesy-Theulaz et al.,J Biol.Chem.272:25659-25667(1997)))、枯 草 杆菌( 斯
托尔斯等人,蛋白表达与纯化53:396-403(2007)(Stols et al.,Protein Expr.
Purif.53:396-403(2007)))和智人(弗考等人,基因组学68:144-151(2000)(Fukao,T.,et al.,Genomics 68:144-151(2000))；田 中等 人,分 子 人类 生 殖学 8:16-23(2002)
(Tanaka,H.,et al.,Mol Hum Reprod 8:16-23(2002)))中表征。下文概述与这些基因相关的GenBank信息。

[0354]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
cat1 P38946.1 729048 克氏梭菌
ygfH NP_417395.1 16130821 大肠杆菌
CIT292_04485 ZP_03838384.1 227334728 杨氏柠檬酸杆菌
SARI_04582 YP_001573497.1 161506385 肠道沙门氏菌
yinte0001_14430 ZP_04635364.1 238791727 耶尔森氏菌属中间物
pcaI 24985644 AAN69545.1 恶臭假单胞菌
pcaJ 26990657 NP_746082.1 恶臭假单胞菌
pcaI 50084858 YP_046368.1 不动杆菌属ADP1
pcaJ 141776 AAC37147.1 不动杆菌属ADP1
pcaI 21224997 NP_630776.1 天蓝链霉菌
pcaJ 21224996 NP_630775.1 天蓝链霉菌
catI 75404583 Q8VPF3 纳克假单胞菌
catJ 75404582 Q8VPF2 纳克假单胞菌
HPAG1_0676 108563101 YP_627417 幽门螺杆菌
HPAG1_0677 108563102 YP_627418 幽门螺杆菌
ScoA 16080950 NP_391778 枯草杆菌
ScoB 16080949 NP_391777 枯草杆菌
OXCT1 NP_000427 4557817 智人
OXCT2 NP_071403 11545841 智人

[0355] EB2A又称丁二酰基-CoA连接酶，由大肠杆菌的sucCD和酿酒酵母的LSC1和LSC2基因编码。这些酶在体内可逆的反应中催化在伴随着消耗一个ATP下从丁二酸酯形成
丁二酰基-CoA(巴克等人,生物化学24:6245-6252(1985)(Buck et al.,Biochemistry
24:6245-6252(1985)))。

[0356]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
sucC NP_415256.1 16128703 大肠杆菌
sucD AAC73823.1 1786949 大肠杆菌
LSC1 NP_014785 6324716 酿酒酵母

[0357]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
LSC2 NP_011760 6321683 酿酒酵母

[0358] 图2步骤B-丁二酰基-CoA还原酶(形成醛)(EB3)

[0359] 具有丁二酰基-CoA还原酶活性的酶由克氏梭菌的sucD(索林,细菌学杂志 178:871-880(1996)(Sohling,J.Bacteriol.178:871-880(1996))) 和 牙 龈 卟 啉
单胞菌的sucD(田中,细菌学杂志182:4704-4710(2000)(Takahashi,J.Bacteriol
182:4704-4710(2000)))编码。其它丁二酰基-CoA还原酶参与例如勤奋金属球菌(伯格
等人,科学318:1782-1786(2007)(Berg et al.,Science318:1782-1786(2007)))和嗜
中性热变形菌(拉莫斯-维拉等人,细菌学杂志,191:4286-4297(2009)(Ramos-Vera et
al.,J Bacteriol,191:4286-4297(2009)))等耐热古生菌的3-羟基丙酸/4-HB循环。由
Msed_0709编码的勤奋金属球菌

[0360] 酶严格地依赖于NADPH，并且还具有丙二酰基-CoA还原酶活性。嗜中性热变形菌酶在NADPH和NADH下都是活性的。

[0361]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Msed_0709 YP_001190808.1 146303492 勤奋金属球菌
Tneu_0421 ACB39369.1 170934108 嗜中性热变形菌
sucD P38947.1 172046062 克氏梭菌
sucD NP_904963.1 34540484 牙龈卟啉单胞菌

[0362] 图2步骤C-4-羟基丁酸脱氢酶(EB4)

[0363] 显示EB4活性(EC 1.1.1.61)的酶已经在罗尔斯通氏菌(布拉沃等人,法庭科学杂志49:379-387(2004)(Bravo et al.,J.Forensic Sci.49:379-387(2004)))、克氏梭菌(沃尔夫和基尼利,蛋白表达与纯化6:206-212(1995)(Wolff and Kenealy,Protein
Expr.Purif.6:206-212(1995)))和拟南芥(布雷特克鲁兹等人,生物化学杂志
278:41552-41556(2003)(Breitkreuz et al.,J.Biol.Chem.278:41552-41556(2003)))中表征。其它EB4酶在牙龈卟啉单胞菌和未培养细菌的gbd中发现。这些基因的寄存编号列
在以下表中。

[0364]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
4hbd YP_726053.1 113867564 罗尔斯通氏菌H16
4hbd L21902.1 146348486 克氏梭菌DSM 555
4hbd Q94B07 75249805 拟南芥
4-hBd NP_904964.1 34540485 牙龈卟啉单胞菌W83
gbd AF148264.1 5916168 未培养细菌

[0365] 图2步骤D-羟基丁酸激酶

[0366] 4-HB活化成4-羟基丁酰基-磷酸酯由EB5催化。EC类别2.7.2中的磷酸转移酶将羧酸转化成膦酸，同时一个ATP发生水解。适于催化此反应的酶包括丁酸激酶、乙酸激酶、天冬氨酸激酶和γ-谷氨酰激酶。在丙酮丁醇梭菌中产酸期间丁酸激酶执行丁酰基-磷酸酯到丁酸酯的可逆转变(卡瑞等人,应用与环境微生物学56:1576-1583(1990)(Cary et al.,Appl.Environ.Microbiol.56:1576-1583(1990)))。此酶由两种buk基因产物中的任
一者编码(黄等人,分子微生物学与生物技术杂志2:33-38(2000)(Huang et al.,J.Mol.
Microbiol.Biotechnol.2:33-38(2000)))。其它丁酸激酶在丁酸梭菌(C.butyricum)、拜氏梭菌和破伤风形梭菌中发现(图瓦隆和沃尔夫,细菌学杂志86:112-117(1963)(Twarog
and Wolfe,J.Bacteriol.86:112-117(1963)))。相关酶，来自海栖热袍菌的异丁酸激酶，也在大肠杆菌中表达并结晶(刁等人,晶体学报D：生物结晶学59:1100-1102(2003)(Diao
et al.,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.59:1100-1102(2003))；刁和哈森,细菌学杂志191:2521-2529(2009)(Diao and Hasson,J.Bacteriol.191:2521-2529(2009)))。
天冬氨酸激酶催化天冬氨酸酯依赖于ATP的磷酸化并参与若干氨基酸的合成。大肠
杆菌中由lysC编码的天冬氨酸激酶III酶具有广泛的底物范围，并且已经阐明与底
物特异性相关的催化残基(肯和沃拉,生物化学与生物物理学档案335:73-81(1996)
(Keng and Viola,Arch.Biochem.Biophys.335:73-81(1996)))。大肠杆菌中两种其它
激酶也是优良的候选者：乙酸激酶和γ-谷氨酰激酶。除乙酸酯外，由ackA(斯卡思特
和西尔弗斯坦,生物化学杂志251:6775-6783(1976)(Skarstedt and Silverstein,J.
Biol.Chem.251:6775-6783(1976)))编码的大肠杆菌乙酸激酶还使丙酸酯磷酸
化(海斯林格等人,分子微生物学27:477-492(1998)(Hesslinger et al.,Mol.
Microbiol.27:477-492(1998)))。由proB(史密斯等人,细菌学杂志157:545-551(1984)
(Smith et al.,J.Bacteriol.157:545-551(1984)))编码的大肠杆菌γ-谷氨酰激酶使谷
氨酸酯的γ碳酸基磷酸化。

[0367]基因 寄存编号 GI编号 生物体
buk1 NP_349675 15896326 丙酮丁醇梭菌
buk2 Q97II1 20137415 丙酮丁醇梭菌
buk2 Q9X278.1 6685256 海栖热袍菌
lysC NP_418448.1 16131850 大肠杆菌
ackA NP_416799.1 16130231 大肠杆菌
proB NP_414777.1 16128228 大肠杆菌
buk YP_001307350.1 150015096 拜氏梭菌
buk2 YP_001311072.1 150018818 拜氏梭菌

[0368] 图2步骤E-转磷酸-4-羟基丁酰酶(EB6)

[0369] EB6催化4-羟基丁酰基从磷酸酯转移到辅酶A。适于催化此反应的酰基转移酶包括磷酸转乙酰酶和磷酸转丁酰酶。来自大肠杆菌的pta基因编码可以将乙酰基-磷
酸酯转变成乙酰基-CoA的酶(铃木,生物化学与生物物理学学报191:559-569(1969)
(Suzuki,Biochim.Biophys.Acta 191:559-569(1969)))。此酶也可以利用丙酰基-CoA代替乙酰基-CoA(海斯林格等人,分子微生物学27:477-492(1998)(Hesslinger et al.,Mol.
Microbiol.27:477-492(1998)))。类似地，来自丙酮丁醇梭菌的ptb基因编码可以将丁
酰基-CoA转变成丁酰基-磷酸酯的酶(沃尔特等人,基因134:107-111(1993)(Walter
et al.,Gene 134:107-111(1993))；黄等人,分子微生物学杂志l 2:33-38(2000)(Huang et al.,J Mol.Microbiol.Biotechno.l 2:33-38(2000)))。其它的ptb基因可以在梭菌
生物体、产生丁酸的细菌L2-50(路易等人,细菌学杂志186:2099-2106(2004)(Louis et
al.,J.Bacteriol.186:2099-2106(2004)))和巨大芽孢杆菌(巴斯克斯等人,当前微生物
学42:345-349(2001)(Vazquez et al.,Curr.Microbiol.42:345-349(2001)))中发现。

[0370]基因 寄存编号 GI编号 生物体
pta NP_416800.1 16130232 大肠杆菌
ptb NP_349676 15896327 丙酮丁醇梭菌
ptb YP_001307349.1 150015095 拜氏梭菌
ptb AAR19757.1 38425288 产生丁酸的细菌L2-50
ptb CAC07932.1 10046659 巨大芽孢杆菌

[0371] 图2步骤F-4-羟基丁酰基-CoA还原酶(形成醛)(EB7)

[0372] 4-羟基丁酰基-CoA还原酶催化4-羟基丁酰基-CoA还原成其对应醛。若干酰基-CoA脱氢酶能够催化此活性。克氏梭菌和牙龈卟啉单胞菌的丁二酸半醛脱氢酶(SucD)
在参考文献(WO/2008/115840)中展示将4-羟基丁酰基-CoA转变成4-羟基丁醛作为产
生1,4-丁二醇的途径的一部分。许多丁醛脱氢酶也对4-羟基丁醛有活性，包括糖乙酸多
丁醇梭菌的bld和假单胞菌属的bphG(帕洛斯基等人,细菌学杂志175:377-385(1993)
(Powlowski et al.,J.Bacteriol.175:377-385(1993)))。又一个候选者是来自拜氏梭
菌的ald基因(托斯,应用与环境微生物学65:4973-4980(1999)(Toth,Appl.Environ.
Microbiol.65:4973-4980(1999)))。此基因非常类似于eutE，eutE编码鼠伤寒沙门氏菌
和大肠杆菌的乙醛脱氢酶(托斯,应用与环境微生物学65:4973-4980(1999)(Toth,Appl.
Environ.Microbiol.65:4973-4980(1999)))。以下鉴别这些和其它的具有4-羟基丁酰
基-CoA还原酶活性的蛋白质。

[0373]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
sucD P38947.1 172046062 克氏梭菌
sucD NP_904963.1 34540484 牙龈卟啉单胞菌
bld AAP42563.1 31075383 糖乙酸多丁醇梭菌
bphG BAA03892.1 425213 假单胞菌属
Ald AAT66436 49473535 拜氏梭菌
eutE AAA80209 687645 鼠伤寒沙门氏菌
eutE P77445 2498347 大肠杆菌
ald YP_001310903.1 150018649 拜氏梭菌NCIMB 8052
Ald ZP_03778292.1 225569267 海氏梭菌DSM 15053
Ald ZP_03705305.1 225016072 甲基戊糖梭菌DSM 5476
Ald ZP_03715465.1 225026273 霍氏真杆菌DSM 3353
Ald ZP_01962381.1 153809713 卵瘤胃球菌ATCC 29174
Ald YP_003701164.1 297585384 还原硒酸盐芽孢杆菌MLS10
Ald AAP42563.1 31075383 糖乙酸多丁醇梭菌N1-4
Ald YP_795711.1 116334184 短乳杆菌ATCC 367
Ald YP_002434126.1 218782808 烯烃脱硫菌AK-01
Ald YP_001558295.1 160879327 植物发酵梭菌ISDg
Ald ZP_02089671.1 160942363 鲍氏梭菌ATCC BAA-613
Ald ZP_01222600.1 90414628 嗜压发光菌3TCK
Ald YP_001452373.1 157145054 克氏柠檬酸杆菌ATCC BAA-895
Ald NP_460996.1 16765381 鼠伤寒肠道沙门氏菌
Ald YP_003307836.1 269119659 白蚁塞巴鲁德菌ATCC 33386
Ald ZP_04969437.1 254302079 核粒梭形杆菌亚种多形ATCC
10953
Ald YP_002892893.1 237808453 奥氏甲苯单胞菌DSM 9187
Ald YP_426002.1 83592250 深红红螺菌ATCC 11170

[0374]

[0375] 图2步骤G-1,4-丁二醇脱氢酶(EB8)

[0376] EB8催化4-羟基丁醛还原成1,4-丁二醇。编码此活性的例示性基因包括不动杆菌属菌株M-1的alrA(塔尼等人,应用与环境微生物学66:5231-5235(2000)(Tani et
al.,Appl.Environ.Microbiol.66:5231-5235(2000)))、来自大肠杆菌的yqhD和fucO(舒
尔兹巴赫等人,分子生物学杂志342:489-502(2004)(Sulzenbacher et al.,J Mol Biol
342:489-502(2004)))和来自丙酮丁醇梭菌的bdh I和bdh II(沃尔特等人,细菌学杂志
174:7149-7158(1992)(Walter et al,J.Bacteriol 174:7149-7158(1992)))。其它的EB8酶由糖乙酸多丁醇梭菌中的bdh和拜氏梭菌中的Cbei_1722、Cbei_2181和Cbei_2421编
码。这些和其

[0377] 它的具有1,4-丁二醇活性的酶列在以下表中。

[0378]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
alrA BAB12273.1 9967138 不动杆菌属菌株M-1
ADH2 NP_014032.1 6323961 酿酒酵母
fucO NP_417279.1 16130706 大肠杆菌
yqhD NP_417484.1 16130909 大肠杆菌
bdhI NP_349892.1 15896543 丙酮丁醇梭菌
bdhII NP_349891.1 15896542 丙酮丁醇梭菌
bdh BAF45463.1 124221917 糖乙酸多丁醇梭菌
Cbei_1722 YP_001308850 150016596 拜氏梭菌
Cbei_2181 YP_001309304 150017050 拜氏梭菌
Cbei_2421 YP_001309535 150017281 拜氏梭菌
14bdh AAC76047.1 1789386 大肠杆菌K-12MG1655
14bdh YP_001309304.1 150017050 拜氏梭菌NCIMB 8052
14bdh P13604.1 113352 糖乙酸多丁醇梭菌
14bdh ZP_03760651.1 225405462 天冬梭菌DSM 15981
14bdh ZP_02083621.1 160936248 鲍氏梭菌ATCC BAA-613
14bdh YP_003845251.1 302876618 食纤维梭菌743B
14bdh ZP_03294286.1 210624270 海拉梭菌DSM 13275
14bdh ZP_03705769.1 225016577 甲基戊糖梭菌DSM 5476
14bdh YP_003179160.1 257783943 极小阿托波氏菌DSM
20469
14bdh YP_002893476.1 237809036 奥氏甲苯单胞菌DSM
9187
14bdh ZP_05394983.1 255528157 食一氧化碳梭菌P7

[0379]

[0380] 图2步骤H-丁二酸还原酶(EB9)

[0381] 丁二酸直接还原成丁二酸半醛由羧酸还原酶催化。用于催化此转化的例示性酶描述如下(参见图2步骤K)。

[0382] 图2步骤I-丁二酰基-CoA还原酶(形成醇)(EB10)

[0383] EB10酶是将丁二酰基-CoA转变成4-HB的双官能氧化还原酶。下述的EB15酶候选者(图2步骤M)也适于催化丁二酰基-CoA的还原。

[0384] 图2步骤J-4-羟基丁酰基-CoA转移酶(EB11)或4-羟基丁酰基-CoA合成酶(EB12)

[0385] 4-HB转变成4-羟基丁酰基-CoA由辅酶A转移酶或合成酶催化。EB11酶包括克氏梭菌的cat1、cat2和cat3的基因产物(塞多夫等人,美国国家
科 学 院 院 刊 105:2128-2133(2008)(Seedorf et al.,Proc.Natl.Acad.Sci
U.S.A105:2128-2133(2008))；索林等人,细菌学杂志.178:871-880(1996)(Sohling
et al.,J Bacteriol.178:871-880(1996)))。类似的CoA转移酶活性也存在于阴道
毛滴虫、布氏锥虫、氨基丁酸梭菌和牙龈卟啉单胞菌中(瑞伐雷等人,生物化学杂志
279:45337-45346(2004)(Riviere et al.,J.Biol.Chem.279:45337-45346(2004))； 凡
格瑞斯文等人,生物化学杂志283:1411-1418(2008)(van Grinsven et al.,J.Biol.
Chem.283:1411-1418(2008)))。

[0386]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
cat1 P38946.1 729048 克氏梭菌
cat2 P38942.2 172046066 克氏梭菌
cat3 EDK35586.1 146349050 克氏梭菌
TVAG_395550 XP_001330176 123975034 阴道毛滴虫G3
Tb11.02.0290 XP_828352 71754875 布氏锥虫
cat2 CAB60036.1 6249316 氨基丁酸梭菌
cat2 NP_906037.1 34541558 牙龈卟啉单胞菌W83

[0387] 4HB-CoA合成酶催化4-HB依赖于ATP的转变成4-羟基丁酰基-CoA。形成AMP的4-HB-CoA合成酶在经由二羧酸酯/羟基丁酸酯循环或3-羟基丙酸酯/4-HB循环同
化碳的生物体中发现。具有此活性的酶已经在嗜中性热变形菌和勤奋金属球菌中表征
(拉莫斯-维拉等人,细菌学杂志192:5329-40(2010)(Ramos-Vera et al,J Bacteriol
192:5329-40(2010))；伯 格 等 人 , 科 学 318:1782-6(2007)(Berg et al,Science
318:1782-6(2007)))。其它可以通过序列同源性推断。形成ADP的辅酶A合成酶，例如
EB2A，也是适合的候选者。

[0388]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Tneu_0420 ACB39368.1 170934107 嗜中性热变形菌
Caur_0002 YP_001633649.1 163845605 嗜热光合绿曲菌J-10-fl
Cagg_3790 YP_002465062 219850629 侵袭性绿曲菌DSM 9485
acs YP_003431745 288817398 嗜热氢杆菌TK-6
Pisl_0250 YP_929773.1 119871766 冰岛热棒菌DSM 4184
Msed_1422 ABP95580.1 145702438 勤奋金属球菌

[0389] 图2步骤K-4-羟基丁酸还原酶(EB13)

[0390] 4-HB还原成4-羟基丁醛由羧酸还原酶(CAR)催化。此类酶在艾维诺卡氏菌中发现。羧酸还原酶催化羧酸依赖于ATP和NADPH的还原成其对应醛(万布曼尼
恩等人,生物化学杂 志282:478-485(2007)(Venkitasubramanian et al.,J.Biol.
Chem.282:478-485(2007)))。由car编码的艾维诺卡氏菌酶在大肠杆菌中克隆并在功能
上表达(万布曼尼恩等人,生物化学杂志282:478-485(2007)(Venkitasubramanian et
al.,J.Biol.Chem.282:478-485(2007)))。npt基因产物的表达经由转录后修饰提高了酶
的活性。npt基因编码将非活性主酶转变成活性的全酶的特定的磷酸泛酰巯基乙胺转移
酶(PPTase)。此酶的天然底物是香草酸，并且酶显示广泛接受芳香族和脂肪族底物，包括
4-HB(万布曼尼恩等人,药学与生物技术行业中的生物催化,帕特尔编辑,第15章,第
425-440页,CRC出版有限公司,美国佛罗里达州博卡拉顿市(2006)(Venkitasubramanian
et al.,in Biocatalysis in the Pharmaceutical and Biotechnology Industires,ed.R.N.Patel,Chapter 15,pp.425-440,CRC Press LLC,Boca Raton,FL.(2006)))。

[0391]基因名称 GI编号 GenBank ID 生物体
Car 40796035 AAR91681.1 艾维诺卡氏菌(NRRL 5646属)
Npt 114848891 ABI83656.1 艾维诺卡氏菌(NRRL 5646属)

[0392] 可以基于序列同源性鉴别其它的car和npt基因。

[0393]

[0394] 在灰色链霉菌中发现的其它CAR酶由griC和griD基因编码。相信此酶将3-氨基-4-羟基苯甲酸转变成3-氨基-4-羟基苯甲醛，因为griC或者griD的缺
失引起细胞外3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸(3-氨基-4-羟基苯甲酸代谢的一种支
路产物)的累积(铃木等人,抗菌素杂志60(6):380-387(2007)(Suzuki,et al.,J.
Antibiot.60(6):380-387(2007)))。griC和griD与SGR_665(一种序列类似于艾维诺卡氏
菌npt的酶)的共同表达可能是有益的。

[0395]基因名称 GI编号 GenBank ID 生物体
griC 182438036 YP_001825755.1 灰色链霉菌亚种灰色NBRC 13350
Grid 182438037 YP_001825756.1 灰色链霉菌亚种灰色NBRC 13350

[0396] 具有类似特性的酶，α-氨基己二酸还原酶(AAR，EC 1.2.1.31)参与一些真菌物种中的赖氨酸生物合成途径。此酶天然地将α-氨基己二酸还原成α-氨基己二酸半
醛。首先通过ATP依赖的腺嘌呤核苷酸的形成活化羧基，然后腺嘌呤核苷酸被NAD(P)H还
原，得到醛和AMP。如CAR一样，此酶利用镁并需要由PPTase活化。AAR的候选酶和其对
应的PPTase在酿酒酵母(莫里斯等人,基因98:141-145(1991)(Morris et al.,Gene
98:141-145(1991)))、白色念珠菌(郭等人,分子遗传学与基因组学269:271-279(2003)
(Guo et al.,Mol.Genet.Genomics 269:271-279(2003)))和粟酒裂殖酵母(福特等
人,当前遗传学28:131-137(1995)(Ford et al.,Curr.Genet.28:131-137(1995)))中
发现。来自粟酒裂殖酵母的AAR在大肠杆菌中表达时显示显著的活性(郭等人,酵母
21:1279-1288(2004)(Guo et al.,Yeast 21:1279-1288(2004)))。来自产黄青霉的AAR接受S-羧甲基-L-半胱氨酸作为替代底物，但不与己二酸酯、L-谷氨酸酯或二氨基庚二酸
酯反应(伊哈鲁维亚等人,生物化学杂志278:8250-8256(2003)(Hijarrubia et al.,J.
Biol.Chem.278:8250-8256(2003)))。编码产黄青霉PPTase的基因迄今为止尚未鉴别。

[0397]基因名称 GI编号 GenBank ID 生物体
LYS2 171867 AAA34747.1 酿酒酵母
LYS5 1708896 P50113.1 酿酒酵母
LYS2 2853226 AAC02241.1 白色念珠菌
LYS5 28136195 AAO26020.1 白色念珠菌
Lys1p 13124791 P40976.3 粟酒裂殖酵母
Lys7p 1723561 Q10474.1 粟酒裂殖酵母
Lys2 3282044 CAA74300.1 产黄青霉

[0398] 图2步骤L-4-羟基丁酰基-磷酸还原酶(EB14)

[0399] EB14催化4-羟基丁酰基磷酸酯还原成4-羟基丁醛。催化此转化的酶迄今为止尚未鉴别。然而，类似的酶包括EC类别1.2.1中的磷酸还原酶。例示性膦酸还
原酶包括G3P脱氢酶(EC 1.2.1.12)、天冬氨酸-半醛脱氢酶(EC1.2.1.11)、乙酰基
谷氨酰基磷酸还原酶(EC 1.2.1.38)和谷氨酸-5-半醛脱氢酶(EC 1.2.1.-)。天冬
氨酸半醛脱氢酶(ASD，EC 1.2.1.11)催化NADPH依赖的4-天冬氨酰磷酸还原成天
冬氨酸-4-半醛。ASD参与氨基酸生物合成并且近来已经作为抗菌目标来研究(哈
德 菲 德 等 人 ,生 物 化 学 40:14475-14483(2001)(Hadfield et al.,Biochemistry
40:14475-14483(2001)))。已经解决了大肠杆菌ASD结构(哈德菲德等人,分子生物
学杂志289:991-1002(1999)(Hadfield et al.,J Mol.Biol.289:991-1002(1999)))并
且已经展示酶接受替代底物β-3-甲基天冬氨酰磷酸酯(山穆斯等人,分子生物学杂
志 259:15331-15339(1984)(Shames et al.,J Biol.Chem.259:15331-15339(1984)))。
流感嗜血杆菌酶已经成为酶工程研究的目标以改变活性位点上底物结合亲和力(布
兰可等 人,晶体学 报D：生 物结晶 学60:1388-1395(2004)(Blanco et al.,Acta
Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.60:1388-1395(2004))；布 兰 可 等 人 ,晶 体 学
报D：生 物结 晶学 60:1808-1815(2004)(Blanco et al.,Acta Crystallogr.D.Biol.
Crystallogr.60:1808-1815(2004)))。其它ASD候选者在结核分枝杆菌(沙法尼
等人,应用微生物学杂志98:832-838(2005)(Shafiani et al.,J Appl Microbiol
98:832-838(2005)))、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)(费恩勒等人,分子生
物学杂志353:1055-1068(2005)(Faehnle et al.,J Mol.Biol.353:1055-1068(2005)))
和传染性微生物霍乱弧菌和幽门螺杆菌(摩尔等人,蛋白表达与纯化25:189-194(2002)
(Moore et al.,Protein Expr.Purif.25:189-194(2002)))中发现。相关候选酶是乙酰
基谷氨酰磷酸还原酶(EC 1.2.1.38)，其为在酿酒酵母(鲍威尔等人,欧洲生物化学杂志
270:1014-1024(2003)(Pauwels et al.,Eur.J Biochem.270:1014-1024(2003)))、枯草杆菌(欧瑞利等人,微生物学140(Pt 5):1023-1025(1994)(O'Reilly et al.,Microbiology
140(Pt 5):1023-1025(1994)))、大肠杆菌(帕尔索等人,基因68:275-283(1988)(Parsot et al.,Gene.68:275-283(1988)))和其它生物体中发现的天然地将乙酰基谷氨酰磷酸酯
还原成乙酰谷氨酸-5-半醛的酶。大肠杆菌的其它磷酸还原酶包括甘油醛3-磷酸脱氢
酶(gapA(布里兰特等人,欧洲生物化学杂志150:61-66(1985)(Branlant et al.,Eur.
J.Biochem.150:61-66(1985)))和谷氨酸-5-半醛脱氢酶(proA(史密斯等人,细菌学
杂志157:545-551(1984)(Smith et al.,J.Bacteriol.157:545-551(1984)))。来自鼠
伤寒沙门氏菌(玛汉等人,细菌学杂志156:1249-1262(1983)(Mahan et al.,JBacte
riol.156:1249-1262(1983)))和空肠弯曲杆菌(路易等人,分子遗传学与基因组学
240:29-35(1993)(Louie et al.,Mol.Gen.Genet.240:29-35(1993)))的编码谷氨酸-5-半醛脱氢酶的基因在大肠杆菌中克隆并表达。

[0400]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
asd NP_417891.1 16131307 大肠杆菌
asd YP_248335.1 68249223 流感嗜血杆菌酶
asd AAB49996 1899206 结核分枝杆菌
VC2036 NP_231670 15642038 霍乱弧菌
asd YP_002301787.1 210135348 幽门螺杆菌
ARG5,6 NP_010992.1 6320913 酿酒酵母
argC NP_389001.1 16078184 枯草杆菌
argC NP_418393.1 16131796 大肠杆菌
gapA P0A9B2.2 71159358 大肠杆菌
proA NP_414778.1 16128229 大肠杆菌
proA NP_459319.1 16763704 鼠伤寒沙门氏菌
proA P53000.2 9087222 空肠弯曲杆菌

[0401] 图2步骤M-4-羟基丁酰基-CoA还原酶(形成醇)(EB15)

[0402] EB15酶是将4-羟基丁酰基-CoA转变成1,4-丁二醇的双官能氧化还原酶。具有此活性的酶包括来自大肠杆菌的adhE、来自丙酮丁醇梭菌的adhE2(方丹等人,细菌
学杂志184:821-830(2002)(Fontaine et al.,J.Bacteriol.184:821-830(2002)))和由
bdh I和bdh II编码的丙酮丁醇梭菌酶(沃尔特等人,细菌学杂志174:7149-7158(1992)
(Walter,et al.,J.Bacteriol.174:7149-7158(1992)))。除将乙酰基-CoA还原成乙
醇外，由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶已经展示将支链化合物异丁醛氧化成异丁酰
基-CoA(风早等人,普通与应用微生物学杂志18:43-55(1972)(Kazahaya et al.,J.Gen.
Appl.Microbiol.18:43-55(1972))；顾等人,生物技术通讯,27:505-510(2005)(Koo et
al.,Biotechnol Lett,27:505-510(2005)))。

[0403]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
adhE NP_415757.1 16129202 大肠杆菌
adhE2 AAK09379.1 12958626 丙酮丁醇梭菌
bdhI NP_349892.1 15896543 丙酮丁醇梭菌
bdhII NP_349891.1 15896542 丙酮丁醇梭菌
adhE AAV66076.1 55818563 肠膜明串珠菌
adhE NP_781989.1 28211045 破伤风杆菌
adhE NP_563447.1 18311513 产气荚膜梭菌
adhE YP_001089483.1 126700586 艰难梭菌

[0404] 4.3实例III-使用由甲醇氧化产生的甲醛形成用于形成生物质的主要代谢途径的中间物的方法

[0405] 本文中提供了例示性途径，其利用由甲醇氧化(参见例如图1步骤J)所产生的甲醛形成可以用于形成生物质的某些主要代谢途径的中间物。用于增强还原当量的可用性以及从甲醇产生甲醛的例示性MMP(步骤J)提供于图1中。

[0406] 可以利用由甲醇氧化(例如如图1中所提供)产生的甲醛的一种例示性途径展示于图3中，其包含通过EF1，使甲醛与D-核酮糖-5-磷酸缩合形成H6P(图3步骤A)。酶可
2+ 2+
以使用Mg 或Mn 以求最大活性，不过其它金属离子适用，并且甚至涵盖非金属离子依赖性的机制。H6P通过EF2转变为F6P(图3步骤B)。

[0407] 包含由甲醇氧化产生的甲醛解毒和同化(例如如图1中提供)的另一例示性途径展示于图4中并且通过DHA进行。EF3是一种特别的转酮醇酶，其首先将甘油醛基从木酮
糖-5-磷酸转移到甲醛，形成DHA和G3P，G3P是糖酵解中的一种中间物(图4步骤A)。从
DHA合酶获得的DHA接着通过DHA激酶进一步磷酸化，形成DHA磷酸酯(图4步骤B)。DHAP
可以同化到糖酵解和若干其它途径中。

[0408] 图3步骤A和B-己酮糖-6-磷酸合酶(EF1)(步骤A)和6-磷酸-3-己酮糖异构酶(EF2)(步骤B)

[0409] EF1和EF2酶都在若干生物体中发现，包括其中其已经纯化的甲烷营养菌和亲甲基醇菌(卡托等人,2006,生物科学、生物技术与生物化学70(1):10-21(Kato et
al.,2006,BioSci Biotechnol Biochem.70(1):10-21))。另外，已经在例如枯草杆
菌等异养生物中报导这些酶，其中报导这些酶与甲醛解毒有关(三井等人,2003,AEM
69(10):6128-32(Mitsui et al.,2003,AEM69(10):6128-32)；安田等人,1999.细菌学杂志
181(23):7154-60(Yasueda et al.,1999.J Bac 181(23):7154-60))。来自甲基营养菌胃分枝杆菌MB19的这两种酶的基因已经融合并且具有hps-phi构筑体的大肠杆菌菌株展示
更有效的甲醛利用(奥里雅等人,2007,应用微生物学与生物技术76:439-445(Orita et
al.,2007,Appl Microbiol Biotechnol.76:439-445))。在一些生物体中，这两种酶天然地以双官能的融合型式形态存在。

[0410] H6P合酶的例示性候选基因是：

[0411]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Hps AAR39392.1 40074227 甲醇芽孢杆菌MGA3
Hps EIJ81375.1 387589055 甲醇芽孢杆菌PB1
RmpA BAA83096.1 5706381 临氨甲基单胞菌
RmpA BAA90546.1 6899861 胃分枝杆菌
YckG BAA08980.1 1805418 枯草杆菌

[0412] EF2的例示性候选基因是：

[0413]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Phi AAR39393.1 40074228 甲醇芽孢杆菌MGA3
Phi EIJ81376.1 387589056 甲醇芽孢杆菌PB1
Phi BAA83098.1 5706383 临氨甲基单胞菌
RmpB BAA90545.1 6899860 胃分枝杆菌

[0414] 其中这两个功能已经融合到单一开放阅读框架中的酶的候选物包括以下。

[0415]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
PH1938 NP_143767.1 14591680 掘越氏火球菌OT3
PF0220 NP_577949.1 18976592 激烈火球菌
TK0475 YP_182888.1 57640410 柯氏超嗜热古菌
NP_127388.1 14521911 深海火球菌
MCA2738 YP_115138.1 53803128 荚膜甲基球菌

[0416] 图4步骤A-二羟基丙酮合酶(EF3)

[0417] 包含由甲醇氧化产生的甲醛解毒和同化(例如如图1中提供)的另一例示性途径展示于图4中并且通过DHA进行。EF3是一种特别的转酮醇酶，其首先将甘油醛基从木酮
糖-5-磷酸转移到甲醛，形成DHA和G3P，G3P是糖酵解中的一种中间物(图4步骤A)。从
DHA合酶获得的DHA接着通过DHA激酶进一步磷酸化，形成DHA磷酸酯(图4步骤B)。DHAP
可以同化到糖酵解和若干其它途径中。

[0418] 博伊丁念珠菌中的EF3酶使用焦磷酸硫胺素和Mg2+作为辅因子并且定位在过氧物酶体中。还发现来自甲醇生长的羧基细菌分枝杆菌属菌株JC1DSM 3803的酶具有DHA
合酶和激酶活性(罗等人,1997,细菌学杂志179(19):6041-7(Ro et al.,1997,JBac
179(19):6041-7))。来自此生物体的DHA合酶也具有与来自博伊丁梭菌的酶类似的辅因子需求。甲醛和5-磷酸木酮糖的Km据报导分别为1.86mM和33.3μM。仅仅除结核分枝杆菌
外，若干其它分枝杆菌都可以使用甲醇作为碳和能量的唯一来源并且据报导使用EF3(帕
特等人,2003,细菌学杂志185(1):142-7(Part et al.,2003,JBac185(1):142-7))。

[0419]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
DAS1 AAC83349.1 3978466 博伊丁念珠菌
HPODL_2613 EFW95760.1 320581540 副多形性奥格菌DL-1(多形汉森酵母DL-1)
AAG12171.2 18497328 分枝杆菌属菌株JC1DSM 3803

[0420] 图4步骤B-二羟基丙酮(DHA)合酶

[0421] 从DHA合酶获得的DHA通过DHA激酶进一步磷酸化，形成DHA磷酸酯。DHAP可以同化到糖酵解和若干其它途径中。EF4已经从安氏奥格菌纯化到均质(比斯曲,1983,Bio
khimiia,48(10):1611-6(Bystrkh,1983,Biokhimiia,48(10):1611-6))。使DHA磷酸化并
在较小程度上使甘油醛磷酸化的酶是139kDa的同二聚蛋白质。ATP是酶优选的磷酸酯基
供体。当使用ITP、GTP、CTP和UTP时，活性降低到约30％。在例如肺炎克雷白杆菌和弗
氏柠檬细菌等若干生物体中(丹尼尔等人,1995,细菌学杂志177(15):4392-40(Daniel
et al.,1995,JBac 177(15):4392-40))，DHA作为甘油氧化的结果而形成并且通过激
酶转变为DHAP，肺炎克雷白杆菌的DHA激酶已经表征(乔纳森等人,1984,细菌学杂志
160(1):55-60(Jonathan et al,1984,JBac 160(1):55-60))。其对DHA具有很大特异
性，Km为4μM，并且对ATP具有两种表观Km值，一者在25到35μM，并且另一者在200到
300μM。DHA也可以通过甘油激酶磷酸化，但来自肺炎克雷白杆菌的DHA激酶在几个方面
不同于甘油激酶。虽然两种酶都可以使DHA磷酸化，但DHA激酶不使甘油磷酸化，其也不被果糖-1,6-二磷酸抑制。在酿酒酵母中，DHA激酶(I和II)与挽救细胞以免受DHA有毒影
响有关(莫林等人,2003,生物化学杂志17；278(3):1415-23(Molin et al.,2003,J Biol Chem.17；278(3):1415-23))。

[0422] 在大肠杆菌中，DHA激酶由DhaK、DhaL和DhaM三个亚单位构成，并且其功能类似磷酸转移酶系统(PTS)，因为其利用磷酸烯醇丙酮酸酯作为磷酰基供体(古奈特
等人,2001,欧洲分子生物学学会杂志20(10):2480-6(Gutknecht et al.,2001,EMBO
J.20(10):2480-6))。其不同之处在于不参与转运。磷酸化反应需要存在PTS系统的EI
和HPr蛋白质。DhaM亚单位在多个位点磷酸化。DhaK含有底物结合位点(加西亚-亚
里 斯 等 人 ,2004,43(41):13037-45(Garcia-Alles et al.,2004,43(41):13037-45)；
斯 博 尔 德 等 人 ,2003,美 国 国 家 科 学 院 院 刊 100(14):8188-92(Siebold et al.,2003,PNAS.100(14):8188-92))。大肠杆菌酶的DHA的KM据报导为6μM。K亚单位类
似于弗氏柠檬细菌和真核生物的ATP依赖性的EF4的N末端半部。

[0423] 此步骤的例示性DHA激酶候选基因是：

[0424]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
DAK1 P54838.1 1706391 酿酒酵母S288c
DAK2 P43550.1 1169289 酿酒酵母S288c
D186_20916 ZP_16280678.1 421847542 弗氏柠檬细菌
DAK2 ZP_18488498.1 425085405 肺炎克雷白杆菌
DAK AAC27705.1 3171001 安氏奥格菌
DhaK NP_415718.6 162135900 大肠杆菌
DhaL NP_415717.1 16129162 大肠杆菌
DhaM NP_415716.4 226524708 大肠杆菌

[0425] 4.4实例IV-用于处理厌氧培养物的方法

[0426] 此实例描述用于处理厌氧培养物的方法。

[0427] A.厌氧腔室和条件.例示性厌氧腔室可以购得(参见例如加利福尼亚州霍桑的真空大气公司(Vacuum Atmospheres Company,Hawthorne CA)；马萨诸塞州纽伯里波特的麦布劳恩公司(MBraun,Newburyport MA))。条件包括1ppm或更小的O2浓度和1atm纯N2。
在一个实例中，使用3个氧涤气器/催化剂再生器，并且腔室包括O2电极(例如加利福尼
亚州工业区特尔戴恩公司(Teledyne；City of Industry CA))。几乎所有的物品和试剂在打开内室门前都在腔室气塞中循环四次。在引入腔室前体积>5mL的试剂充以纯N2。手套
每年改变两次并且当腔室显示对含氧量的改变日益滞后的反应时定期再生催化剂容器。腔室压力通过由螺线管启动的单向阀控制。此特征允许将腔室压力设定在高于周围环境的水平下，以允许极小的管通过放气阀转移。

[0428] 厌氧腔室实现了一致极低并且为高度氧敏感的厌氧条件所需的O2水平。然而，细胞的生长和处理通常不需要此类保护措施。在替代性厌氧腔室配置中，铂或钯可以用作催化剂，其在混合物中需要一些氢气。代替使用螺线管阀，放压可以通过鼓泡器控制。代替使用基于仪器的O2监测，可以使用试验条代替。

[0429] B.厌氧微生物学.血清或培养基瓶子装配有厚橡皮塞并且铝盖用以密封瓶子。例如Terrific Broth等培养基以常规方式制造，并且分配到适当尺寸的血清瓶中。瓶子充以氮气，历时约30分钟的适度鼓泡。此从培养基去除了大部分氧，并且此步骤后，每个瓶子用橡皮塞(例如贝尔克20mm隔塞；新泽西州瓦恩兰的贝尔克公司(Bellco,Vineland,NJ))盖上并且螺旋密封(贝尔克20mm)。接着使用缓慢的(液体)排气循环将培养基瓶进行高
压釜处理。至少有时针可以刺穿塞，以在高压釜处理期间提供排气；一旦从高压釜去除，立即需要去除针。无菌培养基具有例如缓冲液或抗生素等剩余培养基组分，经由注射器和针添加。在添加还原剂前，瓶子用氮气(或CO，取决于用途)平衡30-60分钟。添加还原剂，例如100×150mM硫化钠、200mM半胱氨酸盐酸盐。此通过以下进行：称重硫化钠到干燥烧
杯和半胱氨酸到血清瓶中，将两者带到厌氧腔室，硫化钠溶解于厌氧水中，接着添加此到血清瓶中的半胱氨酸。瓶子立刻塞住，因为在与半胱氨酸接触时硫化钠溶解产生硫化氢气体。
当注射到培养物中时，注射过滤器用以将溶液杀菌。其它组分通过注射器针头添加，例如B12(10μM氰钴胺素)、氯化镍(NiCl2，20μM最终浓度，在腔室中厌氧水中制备40mM原液，并且通过高压釜处理或通过使用注射过滤器在注射到培养物中时杀菌)和硫酸亚铁铵(所
需最终浓度是100μM-在腔室中在厌氧水中制成100-1000x原液并且通过高压釜处理或通
过使用注射过滤器在注射到培养物时杀菌)。为了促进厌氧条件下更快的生长，1升瓶子接种厌氧生长的50mL预培养物。通过添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)到0.2mM的
最终浓度来诱发载体中的pA1-lacO1启动子，并且进行约3小时。

[0430] 大型培养物可以在较大的瓶子中使用连续的气体添加同时鼓泡来生长。在添加培养基后具有金属鼓泡器的橡皮塞置于瓶子中并且充以氮气30分钟或更长时间，接着组装瓶子的其余部分。每个瓶子放在一起，使得无菌过滤器将杀菌在瓶子中鼓泡的气体并且瓶子上的软管可用小的C形夹压缩。培养基和细胞用磁性搅拌棒搅拌。一旦添加了所有的培养基组分和细胞，瓶子就在室内空气中培育箱中培育，但连续的氮气充到瓶子中。

[0431] 本申请案中，已经提及各种公开案。这些公开案的公开，包括GenBank和GI编号公开案，以全文引用的方式并入本申请案中以更充分地描述本发明所属的目前工艺水平。虽然本发明已经参考以上提供的实例和实施例描述，但应了解可以在不脱离本发明的精神下进行各种修改。