원생동물 중 참게 인자 C 단백질의 재조합 생산을 위한 방법

원생동물 중 참게 인자 C 단백질의 재조합 생산을 위한 방법{Method for recombinant production of horseshoe crab Factor C protein in protozoa}

본 발명은 인자 C 단백질을 발현하는 기생성 원생동물을 사용한, 참게로부터 인자 C 단백질의 재조합 생산을 위한 신규한 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 참게 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 기생성 원생동물 숙주 세포, 및 상기 세포가 상기 참게 인자 C 단백질을 발현하는 조건에서 상기 기생성 원생동물 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 인자 C 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 상기 신규한 방법에 의해 제조된 재조합 인자 C 단백질, 및 그의 내독소의 검출 및/또는 제거에서의 용도를 제공한다.

리포폴리사카리드 (LPS)로도 알려진, 내독소는 그램-음성 박테리아 세포막의 내부 성분이고 그램-음성 박테리아 패혈증 동안 일어나는 독성 효과의 모든 것은 아니지만 많은 것의 원인이다.

그램-음성 박테리아로부터 유래된 LPS는 참게의 변형세포(amoebocyte)가 응집하고 탈과립하도록 유도한다. 아마, LPS-유도 응고 캐스캐이드 (LPS-induced coagulation)는 그램-음성 박테리아에 의한 침습에 대하여 참게에 의해 사용되는 중요한 방어 기작을 나타낸다. 리물루스 변형세포 용해물 (Limulus amoebocyte lysate: LAL) 테스트로 구성되는 상기 변형세포 용해물은 수십년 동안 용액 중 미량의 내독소 (LPS)의 농도를 검출하는 도구로 사용되었다. 참게에서의 응집의 분자 기작이 확립되고 이는 프로테아제 캐스캐이드를 포함한다. 이 캐스캐이드는 3종류의 세린 프로테아제 지모겐 (zymogen), 인자 C, 인자 B, 응고촉진 (proclotting) 효소, 및 하나의 응고가능한 단백질, 코아굴로겐 (coagulogen)에 기초한다. 응고 캐스캐이드의 초기 활성자인, 인자 C는 LPS에 반응하는 바이오센서로서 기능한다. 인자 C가 LPS에 의해 “활성화(activated)”되면, 생성된 활성 모이어티는 인자 B를 활성화하고 합성 트리펩티드 기질을 가수분해하는 능력을 갖는다.

인자 C 활성은 약학적 산물 등의 품질 제어에 사용된 내독소의 펨토그램 수준을 위한 매우 민감한 분석의 기초이다. 따라서 내독소의 검출에서 인자 C의 중요성은 내독소의 검출의 민감도에서의 계절 변동과 같은 통상적인 변형세포 용해물에 의한 인식된 결점을 완화하여야 하는 대안적 공급원으로서 재조합 인자 C (rFC)의 발현을 초래하였다.

내독소 특이적 분석을 위하여, 인자 C 단백질이 정제되고 클로닝되었다. LPS에 의한 활성화 후, 재조합 인자 C는 분석 혼합물에 존재하는 합성 기질에 작동하여 그에 의하여 검출가능한 신호를 생성하고, 주어진 샘플 중 LPS의 존재를 나타낸다. 구체적으로, 형광성 기질은 샘플 중 내독소 농도의 비율로 형광 신호를 생성한다. 인자 C 단백질은 내독소-특이적 분석에서의 적용을 위해 정제하고 클로닝되었다.

Nakamura et al. (1986, Eur. J. Biochem. 154:511-521)는 참게 타키플레우스 트리텐타투스( Tachypleus tridentatus )로부터 유래된 천연 인자 C 단백질의 분리 및 특성을 기재한다. 타키플레우스 트리텐타투스 ( T. tridentatus ) 로부터 유래된 인자 C 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 Muta et al. (1991, J. Biol. Chem. 266:6554-6561)에서 공개된다. 참게 카르시노스코르피우스 로툰디카우다 (Carcinoscorpius rotundicauda)로부터 유래된 인자 C 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 Ding et al. (1995, Molecular Marine Biology and Biotechnology 4:90-103)에서 공개된다.

이. 콜라이 ( E. coli )에서의 C. 로툰디카우다 로부터 유래된 인자 C의 재조합 발현은 Roopashree et al. (1995, Biochem. Mol. Biol. Intl. 35:841-849)에 기재되어 있다. 여기서, 108 kDa 프로효소 및 78 kDa 및 52 kDa의 활성화된 형태의 발현이 면역검출에 의해 보였다.

효모 피치아 파스토리 스 ( Pichia pastoris )에서의 C. 로툰디카우다 로부터 유래된 인자 C 단백질의 재조합 발현은 Ding et al. (1996, US patent 5,858,706)에 기재된다. 사카로마이세스 세레비지애 에서의 C. 로툰디카우다 로부터 유래된 인자 C 단백질의 재조합 발현은 Roopashree et al. (1997, Biotechnology Letters 19:1147-1150)에 기재된다.

포유동물 COS-1 세포에서 C. 로툰디카우다 로부터 유래된 인자 C 단백질의 재조합 발현은 Roopashree et al. (1997, Biotechnology Letters 19:357-361)에 기재된다. 여기서, 인자 C 단백질이 발현되었고 132 kDa, 130 kDa 및 63 kDa의 분자량을 갖는 단백질 밴드가 검출되었다. 상기 단백질은 분비되지 않고, 가용성이 아니고, 활성적이 아니지만, 다소 불용성이고 세포 파쇄 분획물과 결합되어 있다.

곤충 세포 (안정하게 형질주입된 Sf9 세포) 중 C. 로툰디카우다 로부터 유래된 인자 C 단백질의 재조합 발현이 Wang et al. (2001, Biotechnology Letters 23:71-76)에 기재된다. 여기서, 인자 C 단백질은 132 kDa의 분자량을 갖고 상청액에 분비되며, 이는 단백질의 글리코실화를 나타낸다. 수득된 인자 C는 이런 면에서 기능적으로 활성적이고 내독소 (LPS)에 결합할 수 있다. 그러나, 효소적으로 활성적인 프로테아제로의 전환은 보이지 않았다. 곤충 세포 중 C. 로툰디카우다 로부터 유래된 인자 C 단백질의 재조합 발현이 Wang et al. (2002, J. Biol. Chem. 277:36363-736372)에 또한 기재된다. 여기서, 인자 C는 클로닝되고 드로소필라 S2 ( Drosophila S2) 세포로 형질주입되고 글리코실화된 가용성 단백질로 발현되고, 이는 배양 상청액으로 분비되었다. 상기 재조합 인자 C 단백질은 LPS에 결합할 수 있지만, 효소적으로 활성적 프로테아제로서 되기 위해 절단되지 않았다. 곤충 세포 중 C. 로툰디카우다 로부터 유래된 인자 C 단백질의 재조합 발현은 Sf9 세포에서 발현을 위한 바쿨로바이러스 시스템을 이용하는 미국 제6,645,724호에 더 기재되어 있다.

인자 C 단백질은 복합적 진핵생물 단백질이고, 이는 활성 프로테아제가 되기 위한 여러 전환 단계 및 제 2차적 변형을 필요로 한다. 원핵생물( 예 , 이. 콜라이 )에서의 재조합 발현은 글리코실화, H-쇄 및 L-쇄로의 절단 및 정확한 디술피드 결합 형성을 제공하지 않는다. 간단한 진핵생물 발현계( 예 , 효모) 에서의 세포질 발현은 LPS에 결합할 수 있지만 LPS 결합 후 활성화되지 않은 인자 C를 제공하고, 즉 , 지모겐 형태로부터 활성 프로테아제로의 전환이 없다. 발현을 위해 효모 세포 ( 피치아 ( Pichia ) 또는 사카로마이세스 )를 사용하는 경우, 분비된 단백질로서 재조합 인자 C를 수득하는 것이 가능하지 않다. 또한 포유동물 세포주에서의 발현은 활성 분비된 단백질을 제공하지 않았다. 또한, 안정하게 형질전환된 곤충 세포에서의 발현은 LPS에 결합할 수 있는 분비된 단백질을 제공하였다. 그러나, LPS에 의한 활성화가 이 시스템에서 보이지 않았다. 최종적으로 바쿨로바이러스 발현계 시스템을를 사용한 곤충 세포에서의 발현은 LPS에 결합할 수 있고, LPS 결합 후 활성 세린프ㄴ로테아제 지모겐으로 전환된, 분비된 인자 C 단백질을 제공하였다.

이제까지 얻은 모든 실험으로부터 곤충 세포에서의 활성 인자 C 단백질의 발현에 성공한 전문가에 의해“원핵생물 또는 단순한 진핵생물 발현계 보다 곤충 세포에서의 발현이 충분한 생물학적 활성을 갖는 rFC를 생산하기에 적절하다. 또한, 참게 및 곤충은 동일한 문, 절지동물(Arthropoda)에 속하고, 따라서 곤충 세포는 이의 생리학 및 생화학에서 효모 세포보다 참게의 세포와 더 근접하게 닮는다. 따라서, 곤충 세포에서 생산된 rFC는 참게로부터 정제된 단백질과 더 근접하게 닮고 LPS에 의해 활성화된 세린 프로테아제 활성을 갖는 생활성을 보유할 수 있다”(WO 99/15676 2 페이지, “Summary of the Invention”참조)는 것이 결론되었다.

그 시점 이후로, WO 99/15676의 공개 이후 13년 이상, 활성 인자 C 단백질의 재조합 생산에 관하여 추가적 시도가 수행되지 않았다. 명백하게, 다양한 숙주계에서의 재조합 발현으로부터 수년에 걸쳐 수득된 결과를 고려하여, WO 99/15676에서의 분야에서의 최고 전문가에 의해 제공된 명백한 평가를 고려하여, 곤충 숙주 세포 중 바쿨로바이러스 발현계는 활성 인자 C 단백질의 재조합 생산을 위한 금 같은 기준 (gold standard)으로 간주되었다.

본 발명은 인자 C (Factor C) 단백질을 발현하는 기생성 원생동물을 사용하여, 참게 (horseshoe crab)로부터 유래된 인자 C 단백질의 재조합 제조를 위한 신규한 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 참게 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 기생성 원생동물 숙주 세포, 및 상기 세포가 상기 참게 인자 C 단백질을 발현하는 조건에서 상기 기생성 원생동물 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 인자 C 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 신규한 방법에 의해 생산된 재조합 인자 C 단백질, 및 그의 내독소의 검출 및/또는 제거에서의 용도를 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 양태는:

[1] 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 것을 특징으로 하는 기생성 원생동물.

[2] 상기 폴리뉴클레오티드는 핵산 분자, 바람직하게는 벡터에 의해 포함되어, 상기 기생성 원생동물 숙주 세포로 도입되는 것인, [1]의 기생성 원생동물

[3] 상기 기생성 원생동물은 트리파노소마티다 목의 구성원인 것인, [1] 또는 [2]의 기생성 원생동물 .

[4] 상기 기생성 원생동물은 레이슈마니아 ( Leishmania ) 속의 구성원인 것인, [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 기생성 원생동물.

[5] 상기 기생성 원생동물은 레이슈마니아 타렌톨라에 ( Leishmania tarentolae )인 것인, [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 기생성 원생동물.

[6] 상기 폴리뉴클레오티드는 리물루스 폴리페무스 ( Limulus polyphemus), 카 르시노스코르피우스 로툰디카우다 ( Carcinoscorpius rotundicauda ), 타키플레우스 트리텐타투스 , 또는 타키플레우스 기가스 ( Tachypleus gigas )로부터 유래된 인자 C 단백질을 코딩하는 것인, [1] 내지 [5] 중 어느 하나의 기생성 원생동물.

[7] 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 인자 C 단백질을 코딩하는 것인, [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 기생성 원생동물.

[8] (a) [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 기생성 원생동물을 상기 세포가 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 인자 C 단백질을 발현하는 조건 하에 배양하는 단계; 및 (b) 세포 배양물로부터 단계 (a)에서 생산된 인자 C 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 인자 C 단백질을 생산하는 방법.

[9] 상기 인자 C 단백질은 세포 배양 배지에 축적(accumulate)되는 것인, [7] 또는 [8]의 방법.

[10] 생산된 인자 C 단백질은 내독소에 결합시에 세린 프로테아제 활성을 나타내는 것인, [8] 또는 [9]의 방법.

[11] [8]의 방법에 의해 수득가능한 인자 C 단백질.

[12] 내독소 검출을 위한 방법 또는 내독소 제거를 위한 방법에서의, [8] 내지 [10] 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 인자 C 단백질의 용도.

[13] 내독소 검출을 위한 방법 또는 내독소 제거를 위한 방법에서의 [11]의 인자 C 단백질의 용도.

[14] [8] 내지 [10] 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 인자 C 단백질, 또는 [11]의 인자 C 단백질을 포함하는, 내독소 검출 또는 내독소 제거를 위한 분석(assay) 또는 키트.

[15] (a) 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자, 바람직하게는 벡터를 기생성 원생동물, 바람직하게는 목 트리파노소마티다 의 기생성 원생동물 , 더 바람직하게는 속 레이슈마니아 의 구성원, 가장 바람직하게는 레이슈마니아 타렌톨라에 에 도입하는 단계; 및 (b) 상기 인자 C 단백질을 발현하는 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 숙주 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 인자 C 단백질을 생산하는 기생성 원생동물 숙주 세포를 생성하는 방법.

[16] 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 핵산 분자, 바람직하게는 벡터에 의해 포함되어 상기 기생성 원생동물 숙주 세포로 도입되는 것인, [15]의 방법에 의해 수득가능한 기생성 원생동물 숙주 세포.

도 1은 rFC 농도에 의존한 37 ℃에서의 15분 기질 전환 후 LPS-활성화된 재조합 인자 C (rFC) 샘플의 측정된 rfu 값의 플롯(plot)을 보여준다. 비활성의 계산을 위해 사용된 rFC 농도가 표시된다.

참게로부터 유래된 인자 C는 내독소의 검출 및 제거에서의 용도가 잘 확립되어 있다. 통상적인 변형세포 용해물, 참게로부터 유래된 혈액 세포 (변형세포)의 수성 추출물에 대한 대안적 공급원으로서 재조합 발현에 의해 인자 C를 생산하는 과거의 시도가 수행되었다. 인자 C의 재조합 발현에서의 해당 기술분야에서의 많은 시도는 다양한 숙주 세포에서 생산된 재조합 인자 C는 내독소 검출 방법에서의 사용을 위해 요구되는 생물학적 활성을 보이지 않았기 때문에 실패하였다. 해당 기술분야에 적용된 숙주 세포는 원핵생물 세포, 단순한 진핵생물 세포 및 더 높은 진핵생물 세포이었고, 수년의 집중적 연구 후 해당 분야에서의 전문가에 의해 진핵생물 또는 단순한 원핵생물 발현계에서 보다 곤충 세포에서의 발현이 완전한 생물학적 활성을 갖는 rFC를 생산하기에 적합하다는 것으로 결론지었다. 이와 관련하여, 참게와 곤충은 동일한 문, 절지동물에 속하고 따라서 곤충 세포는 이의 생리학 및 생화학에서 효모 세포보다 참게의 세포에 더 근접하게 닮을 수 있다는 것이 해당 분야의 전문가에 의해 설명되었다. 따라서, 곤충 세포에서 생산된 rFC는 참게로부터 정제된 단백질과 더 근접하게 닮고 LPS에 의해 활성화된 세린 프로테아제 활성을 갖는 생물활성(bioactivity)을 보유할 수 있다.

본 발명은 인자 C 단백질을 발현하는 기생성 원생동물을 사용한, 참게로부터 유래된 인자 C 단백질의 재조합 생산을 위한 신규한 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 참게로부터 유래된 이종성 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 기생성 원생동물 숙주 세포, 및 상기 세포가 재조합 인자 C 단백질을 발현하는 조건에서 상기 기생성 원생동물을 배양하는 단계를 포함하는, 참게로부터 유래된 재조합 인자 C 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 신규한 방법에 의해 생산된 재조합 인자 C 단백질 및 내독소의 검출 및/또는 제거에서의 이의 용도를 제공한다.

원생동물은 단순한 단세포 진핵생물 유기체이다. 본 명세서에서 상술한 방와 같이, 해당 기술분야는 성공적으로 활성 인자 C 단백질을 생산하는 단순한 단세포 발현계를 사용하는 것으로부터 멀리 이끌어지기(lead away) 때문에 본 발명의 주제는 숙련된 자에게 자명하지 않다. 또한, 원생동물의 기본적 샤프론 시스템이 20개 이상의 디술피드 결합은 상기 인자 C 단백질을 수득하기 위해 적절히 연결되어야만 한다는 것을 고려하면, 재조합 인자 C의 정확한 폴딩을 위하여 제공하는 것은 놀라라웠다. 본 발명의 원생동물 숙주 세포는 재조합 참게 인자 C를 제공하고, 이는 프리-프로-효소(pre-pro-enzyme) 및 상기 프로-효소(pro-enzyme)의 중쇄 (H) 및 경쇄 (L)로 구성된 활성 프로테아제로의 정확한 절단을 가능하게 한다는 것을 통상의 기술자가 예상할 수 없을 것이다. 또한, 재조합 참게 인자 C 단백질의 발현을 위해 본 발명에 의해 제공된 원생동물의 용도는 하기 장점을 갖는다:

우선, 인자 C 단백질의 재조합 생산을 위한 곤충 세포의 사용은 비싸고 특별한 배양 배지가 요구되는 사실로 인해 높은 비용과 관련되는 반면, 장치 및 배양 조건이 박테리아의 발효와 유사하여 요구되는 배지가 싸기 때문에, 원생동물의 사용은 싸다. 또한, 원생동물의 배양물이 상대적으로 빨리 성장하고 (신속한 성장 시간) 스케일-업이 용이하다. 또한, 일단 클로닝되면, 재조합 발현 숙주는 안정하고 감염성 바이러스 스톡(stock)의 연속적 제조를 필요로 하지 않는다. 본 발명의 원생동물 배양에서 생산된 재조합 인자 C 단백질은 우수한 수율 및 가용성 형태로 분비되는 것으로 보이고, 배양물 상청액으로부터 용이하게 정제될 수 있다. 구체적으로, 인자 C의 오직 하나의 활성 형태가 분해 산물 없이 상기 상청액으로부터 정제된다. 발현된 재조합 단백질은 안정하고 지모겐(zymogen) 형태를 보호하기 위해 첨가제가 요구되지 않는다는 것이 유의된다.

숙주 세포

본 발명은 이종성 (heterologous) 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 것을 특징으로 하는 기생성 원생동물을 제공한다. 본 발명에 의해 제공되는 기생성 원생동물은 참게로부터 유래된 인자 C의 재조합 생산을 위해 사용된다. 따라서, 본 발명은 참게 인자 C의 재조합 생산을 위한 기생성 원생동물 숙주 세포를 제공하고, 상기 기생성 원생동물 숙주 세포는 이종성 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 것을 특징으로 한다.

참게 인자 C의 재조합 생산을 위한 본 발명의 숙주 세포는 기생성 원생동물 숙주 세포이다. 바람직하게는, 상기 기생성 원생동물 숙주 세포는 동원핵편모충류 (kinetoplastid) 기생성 원생동물 숙주 세포이다. 이들 숙주세포의 일반적 분류학상 특성은 고밀도 질량의 핵외 DNA를 갖는 단일 미토콘드리아라는 것이다. 상기 DNA를 포함한 미토콘드리아의 영역은 “동원질체 (kinetoplast)”로 명칭된다. 작은 서브유닛 rRNA- 및 보존된 단백질-기반 계통발생(phylogeny)은 5개의 목으로의 동원핵편모충류의 구분을 뒷받침한다: 프로키네토플라스티다 (Prokinetoplastida), 네오보도니다 (Neobodonid), 파라보도니다 (Parabodonida), 유보도니다 (Eubodonida), 및 트리파노소마티다 (Trypanosomatida). 따라서, 본 발명의 동원핵편모충류 기생성 원생동물은 기생성 프로키네토플라스티다, 네오보도니다, 파라보도니다, 유보도니다, 또는 트리파노소마티다가 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 동원핵편모충류 기생성 원생동물은 기생성 트리파노소마티드 ( 즉 , 기생성 트리파노소마티다)이다. 트리파노소마티드의 모든 구성원은 기생성이기 때문에, 단순히 용어 "트리파노소마티드 (trypanosomatids)"가 기생성 트리파노소마티드 ( 즉 , 기생성 트리파노소마티다)를 기재하기 위해 본 명세서에 사용된다.

트리파노소마티드는 크리티디아 ( Crithidia ) , 렙토모나스 ( Leptomonas ) , 및 블라스토크리티디아 ( Blastocrithidia )와 같은 단일기원의 속, 및 레이슈마니아 및 트리파노소마 와 같은 복세대 속으로 구성된다. 본 발명에서, 바람직한 동원핵편모충류 기생성 원생동물은 복세대 트리파노소마티드 ( 즉 , 목 트리파노소마티다의 복세대 구성원)이다. 더 바람직하게는, 본 발명의 숙주 세포는 속 레이슈마니아 의 구성원이다. 더욱 더 바람직하게는, 본 발명의 숙주 세포는 레이슈마니아 메이져 또는 레이슈마니아 타렌톨라에 다. 본 발명에서, 가장 바람직한 숙주 세포는 레이슈마니아 타렌톨라에 다.

다양한 구체예에서, 본 발명의 숙주 세포는 속 트리파노소마 ( Trypanosoma )의 구성원이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 숙주 세포는 종 트리파노소마 브루세이 ( Trypanosoma brucei ) 및 트리파노소마 테일레리 ( Trypanosoma theileri )로부터 선택된다 .

비록 트리파노솜(trypanosome)은 인간 및 동물 질병의 중요한 원인이지만, 많은 종은 비-병원성이다. 본 발명의 트리파노소마티드 원생동물은 바람직하게는 비병원성 동원핵편모충류 기생성 원생동물 (비병원성 동원핵편모충류 (non-pathogenic Kinetoplastidae)), 더 바람직하게는 비병원성 트리파노소마티드 원생동물 (비병원성 트리파노소마티다 (non-pathogenic Trypanosomatidae)), 더욱 더 바람직하게는 비병원성 레이슈마니아 이다. 동원핵편모충류의 바람직한 비병원성 종은 레이슈마니아 타 렌톨라에 , 크리티디아 파스키쿨레이트 ( Crithidia fasciculata ), 왈라세이나 인콘스탄스 ( Wallaceina inconstans ) (이전에 프로테오모나스 인콘스탄스 ( Proteomonas inconstans )), 렙토모나스 콜로스 ( Leptomonas collos ), 렙토모나스 종 ( Leptomonas sp.) 및 렙토모나스 세이모우리 ( Leptomonas seymouri )를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 가장 바람직한 비병원성 원생동물은 레이슈마니아 타렌톨라에 이다.

다양한 구체예에서, 본 발명의 기생성 원생동물 숙주 세포는 약화된 즉 , 이들의 병원성이 약화된, 바람직하게는 유전적으로 약화된 병원성 원생동물 숙주 세포이다. 병원균을 약화시키는 하나의 시도는 표적화된 유전자 결실이다. 따라서, 유전적으로 약화된 트리파노소마티드 기생동물 ( 즉 , 트리파노소마티드 기생성 원생동물)은 선택된 유전자( 예 , 독성 인자를 코딩하는 유전자)의 결실에 의해 수득될 수 있다. 유전자 결실은 이 기생동물이 상기 세포에 인공적으로 도입된 내재적 DNA 서열과 외래 DNA 서열간의 상동 재조합을 받을 수 있다는 사실의 장점을 갖는다. 본 발명에 사용된 약화된 기생성 원생동물, 바람직하게는 약화된 트리파노소마티드 기생동물은 약화된 독성, 구체적으로 인간에 대한 약화된 독성을 갖는다. “비 병원성 동원핵편모충류 (non pathogenic Kinetoplastidae)” 또는 “비-병원성 트리파노소마티드 (non-pathogenic Trypanosomatidae)”와 같은 용어가 전술한 종에 포함된 유기체/숙주를 지칭하고, 대안적 분류 계획에서의 종을 포함하고, 하지만 이는 앞서 정의된 동일한 형태 및 배양 특성 또는 특징을 가지고, “비 병원성 동원핵편모충류”및 “비-병원성 트리파노소마티드”의 동의어일 수 있다는 것이 명세서 및 청구항을 통해 이해될 것이다.

본 명세서에서 사용된, 용어 비병원성은 인간에게 비병원성 의미를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다양한 구체예에서, "비병원성 (non pathogenic)"은 생물안전도(Biosafety Level) 1에 대한 문의에서 유기체의 분류에 의해 정의된다.

다양한 구체예에서, 원생동물 숙주 세포는 선별 마커, 바람직하게는 선별 마커 유전자를 포함한다.

발현계

본 발명은 참게로부터 유래된 이종성 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 원생동물 숙주 세포를 제공한다. 본 명세서에서 사용된, 이종성 단백질은 숙주 세포에 천연이 아닌 단백질을 의미한다. 본 발명의 원생동물 숙주 세포는 참게 인자 C 단백질의 재조합 생산을 위한 발현계를 나타낸다. 따라서, 본 발명은 기생성 원생동물 숙주 세포를 포함하는 발현계 및 참게로부터 유래된 이종성 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 참게로부터 유래된 이종성 인자 C 단백질의 발현을 위한 발현계의 용도를 제공한다. 다양한 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 발현계는 별개 수단으로서 숙주 세포 및 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 본 발명에 의해 제공된 발현계는 이종성 참게 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이미 갖는 기생성 원생동물 숙주 세포를 포함하는 것이 바람직하다.

다양한 구체예에서, 이종성 참게 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 숙주 세포에서 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시할 수 있는, 적절한 적절한 프로모터 서열 및, 적절한 경우, 전사-후 신호 서열에 작동적으로 연결된다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 동원핵편모충류 기생성 원생동물의 활성적으로 전사된 유전자의 프로모터이다. 더 바람직하게는, 상기 프로모터는 트리파노소마티다 목의 구성원의 활성적으로 전사된 유전자의 프로모터, 더욱 더 바람직하게는 레이슈마니아 속의 구성원의 활성적으로 전사된 유전자의 프로모터이고, 가장 바람직하게는 상기 프로모터는 레이슈마니아 타렌톨라에 의 유전자의 활성적으로 전사된 유전자의 프로모터이다.

다양한 구체예에서, 상기 프로모터는 강한 전사 개시 (strongly transcription initiating) 이종성 프로모터이다.

본 발명에 사용된 참게 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이종성 폴리뉴클레오티드, 구체적으로 이종성 참게 인자 C 단백질을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드이다. 본 명세서에 사용된, 이종성 폴리뉴클레오티드는 상기 숙주 세포에 천연적이지(native) 않은 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다양한 구체예에서, 본 발명에 사용된 이종성 폴리뉴클레오티드의 전사는 혼입되고 발현된 억제자 유전자와 연결된 억제자-반응 요소에 의해 조절된다.

다양한 구체예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피는 본 발명의 원생동물 숙주 세포의 활성적으로 전사된 유전자 클러스터에 위치된다. 바람직하게는, 상기 활성적으로 전사된 유전자 클러스터는 rRNA 유전자 클러스터이다.

다양한 구체예에서, 상기 이종성 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동원핵편모충류 기생성 원생동물의 활성적으로 전사된 유전자의 5' 및 3' UTR (비번역 또는 비-번역된 영역)의 옆에 배치된다. 바람직하게는, 상기 이종성 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 트리파노소마티다 목의 구성원의 활성적으로 전사된 유전자의 5' 및 3' UTR, 더 바람직하게는 레이슈마니아 속의 구성원의 활성적으로 전사된 유전자의 5' 및 3' UTR, 및 더욱 더 바람직하게는 레이슈마니아 타렌톨라에 의 활성적으로 전사된 유전자의 5' 및 3' UTR의 옆에 배치된다.

다양한 구체예에서 이종성 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 동원핵편모충류 기생성 원생동물의 활성적으로 전사된 유전자의 효율적 분비, 스플라이싱 및/또는 폴리아데닐화를 위해 제공되는, 하나 이상의 신호 서열 옆에 배치되고, 즉 , 상기 신호 서열은 동원핵편모충류 기생성 원생동물의 활성적으로 전사된 유전자의 신호 서열이다. 바람직하게는, 상기 이종성 인자 C 단백질은 트리파노소마티다 목의 구성원의 활성적으로 전사된 유전자의 하나 이상의 신호 서열, 더 바람직하게는 속 레이슈마니아 의 구성원의 활성적으로 전사된 유전자의 하나 이상의 신호 서열, 및 더욱 더 바람직하게는 레이슈마니아 타렌톨라에 의 활성적으로 전사된 유전자의 하나 이상의 신호 서열의 옆에 배치된다.

다양한 구체예에서, 상기 이종성 인자 C 단백질은 레이슈마니아 멕시카나 ( mexicana )의 산 포스파타제로부터 유래된 신호 서열의 옆에 배치된다 (Wiese et al. 1995, EMBO J. 14:1067-1074).

다양한 구체예에서, 본 발명의 발현계는 프로테아제, 독소 및 많은 양의 기타 숙주 세포의 내생적으로 합성되고 분비된 단백질의 생산이 실질적으로 없다.

인자 C 핵산 및 아미노산 서열 및 이의 변이체

본 발명에 사용된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 인자 C 단백질은 이종성 인자 C 단백질이다. 본 발명에 사용된 폴리뉴클레오티드는 인자 C를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 이는 참게로부터 유래된 인자 C 같은 효소 활성을 보인다. 본 발명의 범위는 자연 공급원 (natural source)에서 발견된 아미노산 서열, 즉 , 참게로부터 수득가능한 인자 C의 아미노산 서열을 갖는 인자 C를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 용도, 및 본 명세서에 기재된 인자 C 아미노산 서열의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 용도를 포괄한다. 또한 본 발명의 범위는 자연 공급원에서 발견된 인자 C 핵산 서열, 즉 , 참게로부터 수득가능한 인자 C 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 용도, 및 본 명세서에 기재된 변이체 인자 C 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 용도를 포괄한다. 임의의 사건에서, 본 발명에 사용된 폴리뉴클레오티드는 인자 C 단백질을 코딩하고, 이는 내독소와의 활성화로 인자 C-유사 효소 활성을 보여준다. "인자 C-유사 효소 활성 (Factor C-like enzymatic activity) "의 정의는 본 명세서에 제공된다.

다양한 구체예에서, 인자 C 단백질을 코딩하는 본 발명에 사용된 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 따른 기생성 원생동물 숙주 세포에서 이러한 변형된 폴리뉴클레오티드의 발현으로부터 수득된 인자 C 단백질은 내독소, 키모트립신 (구체적으로 α-키모트립신) 또는 지질 A에 의한 활성화 후 인자 C-유사 효소 활성을 보이는 조건부로, 하나 이상의 핵산의 삽입, 결실, 추가, 및/또는 치환에 의해 변형된다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 사용된 폴리뉴클레오티드는 타키플레우스 트리텐타투스 또는 타키플레우스 기가스 로부터 유래된 인자 C를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 다양한 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 카르시노스코르피우스 로툰디카우다 로부터 유래된 인자 C를 코딩한다. 다양한 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 리물루스 폴리페무스 로부터 유래된 인자 C를 코딩한다. 다양한 구체예에서, 본 발명에 사용된 폴리뉴클레오티드는 서열 목록의 서열번호 1 또는 3에 보이는 핵산 서열을 포함한다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 사용된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 75% 이상 동일하고, 인자 C-유사 효소 활성을 보이는 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 85% 이상 또는 95% 이상의 동일성을 보이고, 인자 C-유사 효소 활성을 보이는 폴리펩티드를 코딩한다. 더 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 96% 이상 또는 97% 이상의 동일성을 보이고, 인자 C-유사 효소 활성을 보이는 폴리펩티드를 코딩한다. 훨씬 더 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 보이고, 인자 C-유사 효소 활성을 보이는 폴리펩티드를 코딩한다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 사용된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 아미노산 서열과 75% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖고, 인자 C-유사 효소 활성을 보이는 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 아미노산 서열과 85% 이상 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖고, 인자 C-유사 효소 활성을 보이는 폴리펩티드를 코딩한다. 더 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 아미노산 서열과 96% 이상 또는 97% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖고, 인자 C-유사 효소 활성을 보이는 폴리펩티드를 코딩한다. 더욱 더 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 아미노산 서열과 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖고, 인자 C-유사 효소 활성을 보이는 폴리펩티드를 코딩한다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 사용된 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 하나와 엄격한 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드이고, 상기 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 인자 C-유사 활성을 보이는 폴리펩티드를 코딩한다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 사용된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 75% 이상 동일하고, 인자 C-유사 효소 활성을 보이는 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직하게는, 본 발명에 사용된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 85% 이상 또는 95% 이상 동일하고, 인자 C-유사 효소 활성을 보이는 폴리펩티드를 코딩한다. 더 바람직하게는, 본 발명에 사용된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 96% 이상 또는 97% 이상 동일하고, 인자 C-유사 효소 활성을 보이는 폴리펩티드를 코딩한다. 더욱 더 바람직하게는, 본 발명에 사용된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 98% 이상 또는 99% 이상 동일하고, 인자 C-유사 효소 활성을 보이는 폴리펩티드를 코딩한다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 사용된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 75% 이상 동일하고, 인자 C-유사 효소 활성을 보이는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열의 일부분을 포함하고, 상기 부분은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 단편, 유사체 또는 기능적 유도체를 코딩하고, 상기 단편, 유사체 또는 기능적 유도체는 인자 C-유사 효소 활성을 보인다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 85% 이상 또는 95% 이상 동일하고, 인자 C-유사 효소 활성을 보이는 폴리펩티드를 코딩하고 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열의 부분을 포함하고, 상기 부분은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 단편, 유사체 또는 기능적 유도체를 코딩하고, 상기 단편, 유사체 또는 기능적 유도체는 인자 C-유사 효소 활성을 보인다. 가장 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 96% 이상 또는 97% 이상 동일하고, 인자 C-유사 효소 활성을 보이는 폴리펩티드를 코딩하고 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열의 부분을 포함하고, 상기 부분은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 단편, 유사체 또는 기능적 유도체를 코딩하고, 상기 단편, 유사체 또는 기능적 유도체는 인자 C-유사 효소 활성을 보인다. 더욱 더 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 98% 이상 또는 99% 이상 동일하고, 인자 C-유사 효소 활성을 보이는 폴리펩티드를 코딩하고 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열의 부분을 포함하고, 상기 부분은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 단편, 유사체 또는 기능적 유도체를 코딩하고, 상기 단편, 유사체 또는 기능적 유도체는 인자 C-유사 효소 활성을 보인다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 사용된 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드의 전장의 보체(complement)이고, 이는 본 명세서에 기재되고, 본 발명에서 사용될 수 있고, 상기 보체 폴리뉴클레오티드는 인자 C-유사 효소 활성을 보이는 폴리펩티드르를 코딩한다.

본 발명은 구체적으로 WO 99/15676에 기재된 참게 카르시노스코르피우스 로툰디카우다 로부터 유래된 인자 C를 코딩하는 핵산 서열의 용도를 포괄한다. 구체적으로, 본 발명은 WO 99/15676의 서열번호 1 및 서열번호 3에 나타난 대표적 뉴클레오티드 서열의 용도를 참조로서 포함한다. 또한, WO 99/15676의 서열번호 1 및 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타내는 WO 99/15676의 서열번호 2 및 4의 아미노산 서열의 용도는 참조로서 본 발명에 명시적으로 포함된다.

WO 99/15676의 서열번호 1 내지 4의 서열은 본 명세서의 서열 목록의 서열번호 1 내지 4에 해당하지 않는다. 참조가 서열번호 1 내지 4의 서열에 대하여 본 발명에 이루어진 경우, 본 명세서의 서열 목록의 서열번호 1 내지 4의 서열이 의미된다. 대조적으로, WO 99/15676의 서열번호 1 내지 4의 서열은 이전의 단락에 보이는 바와 같이, WO 99/15676에 대한 명백한 참조에 의해 본 명세서에 기재된다.

본 발명의 범위는 본 발명에 기재된 폴리뉴클레오티드 및 핵산 분자에 의해 코딩된 인자 C 폴리펩티드의 재조합 생산을 포괄한다. 물론, 본 발명의 범위는 또한 이러한 생산 방법으로부터 수득된 재조합 인자 C 폴리펩티드를 포괄한다.

다양한 구체예에서, 본 발명의 인자 C 단백질의 아미노산 서열은 본 발명에 따른 기생성 원생동물 숙주에서의 재조합 발현 후 이러한 변형된 아미노산 서열을 갖는 인자 C 단백질은 내독소, 키모트립신 또는 지질 A로 활성화 후 인자 C-유사 효소 활성을 보인다는 조건부로, 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 첨가, 및/또는 치환에 의해 변형된다.

이전 문장에서 용어 "하나 이상의 아미노산 잔기 (one or more amino acid residue)"의 의미는 상기 인자 C 단백질의 3차원 구조체에서의 아미노산 잔기의 위치 및 상기 아미노산 잔기의 종류에 따라 다양하다. 더 구체적으로, 상기 용어는 바람직하게는 1 내지 20개의 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산 잔기, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산 잔기, 및 훨씬 더 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 잔기를 의미한다. 다양한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산의 상술된 삽입, 결실, 첨가, 및/또는 치환은 내독소, 키모트립신 또는 지질 A에 의해 형성된 지모겐의 활성화 후 상기 인자 C 단백질의 효소 활성을 유지하는 보존적 돌연변이 (conservative mutation)이다. 예시적 보존적 돌연변이는 보존적 치환이다. 보존적 치환은, 예를 들면 , 상기 치환 부위가 방향성 아미노산인 경우, Phe, Trp, 및 Tyr 중에서; 상기 치환 부위가 소수성 아미노산인 경우, Leu, Ile, 및 Val 중에서; 상기 치환 부위가 극성 아미노산인 경우, Gln 및 Asn 사이에서; 상기 치환 분위가 염기성 아미노산인 경우, Lys, Arg, 및 His 중에서; 상기 치환 부위가 산성 아미노산인 경우, Asp 및 Glu 사이에서; 상기 치환 부위가 히드록실기를 갖는 아미노산인 경우, Ser 및 Thr 사이에서; 치환이 상호간에 일어나는 치환이 일어나는 돌연변이다. 보존적 치환으로 간주되는 치환의 예는 구체적으로 Ala에 대한 Ser 또는 Thr의 치환, Arg에 대한 Gln, His, 또는 Lys 치환, Asn에 대한 Glu, Gln, Lys, His, 또는 Asp의 치환, Asp에 대한 Asn, Glu, 또는 Gln의 치환, Cys에 대한 Ser 또는 Ala의 치환, Gln에 대한 Asn, Glu, Lys, His, Asp, 또는 Arg의 치환, Glu에 대한 Gly, Asn, Gln, Lys, 또는 Asp의 치환, Gly에 대한 Pro의 치환, His에 대한 Asn, Lys, Gln, Arg, 또는 Tyr의 치환, lle에 대한 Leu, Met, Val, 또는 Phe의 치환, Leu에 대한 lle, Met, Val, 또는 Phe의 치환, Lys에 대한 Asn, Glu, Gln, His, 또는 Arg의 치환, Met에 대한 lle, Leu, Val, 또는 Phe의 치환, Phe에 대한 Trp, Tyr, Met, lle, 또는 Leu의 치환, Ser에 대한 Thr 또는 Ala의 치환, Thr에 대한 Ser 또는 Ala의 치환, Trp에 대한 Phe 또는 Tyr의 치환, Tyr에 대한 His, Phe, 또는 Trp의 치환, 및 Val에 대한 Met, lle, 또는 Leu의 치환을 포함한다.

본 발명은 서열번호 2 또는 4의 아미노산 서열에서 상술된 삽입, 결실, 첨가, 및/또는 치환을 포괄한다.

상술된 삽입, 결실, 첨가, 및/또는 치환은 또한 참게 중에서 상기 인자 C 유전자가 유래된 각각의 균주 또는 종에서의 차이로 인해 자연적으로 발생하는 돌연변이를 포괄한다. 또한, 상술된 삽입, 결실, 첨가, 및/또는 치환은 또한 각각의 숙주 세포에서 인자 C 단백질의 재조합 발현의 과정에서 자연적으로 발생하는 돌연변이를 포괄한다.

다양한 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C 단백질은 타키플레우스 트리텐타투스 또는 타키플레우스 기가스 로부터 유래된 인자 C의 아미노산 서열을 갖는다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C 단백질은 카르시노스코르피우스 로툰디카우다 로부터 유래된 인자 C의 아미노산 서열을 갖는다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C 단백질은 리물루스 폴리페무스 로부터 유래된 인자 C의 아미노산 서열을 갖는다. 다양한 구체예에서, 본 발명에 의해 생산된 인자 C 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 사용된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 유사체 또는 기능적 유도체를 코딩하고, 상기 단편, 유사체 또는 기능적 유도체는 인자 C-유사 효소 활성을 보인다. 본 발명은 상기 단편, 유사체 또는 기능적 유도체가 내독소, 키모트립신 또는 지질 A로 활성화 후 인자 C-유사 활성을 보이는 한, 본 명세서에 기재된 인자 C 폴리펩티드의 단편, 유사체 및/또는 기능적 유도체를 포괄한다.

본 발명에 따른 참게 인자 C의 재조합 생산의 경우, 상기 기생성 원생동물은 참게로부터 유래된 재조합 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 본 발명에 사용된 참게로부터 유래된 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이종성 폴리뉴클레오티드, 더 구체적으로 참게로부터 유래된 이종성 인자 C 단백질을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드이다.

명료성의 목적을 위해, 본 명세서에 기재된 변이체는 참게 인자 C-유사 효소 활성을 보이는 사실의 관점에서 최대한, 본 명세서에 기재된 참게 인자 C 단백질의 변이체는 참게 인자 C 단백질로 여전히 간주된다.

인자 C-유사 효소 활성

지모겐(zymogen) (또는 프로효소(proenzyme)은 효소의 전구체이다. 지모겐은 때때로 효소의 불활성 전구체로 불리지만, 상기 지모겐은 (상이한 인자로 인해) 그의 활성을 잃어버리는 의미에서 "불활성적 (inactive)"이지만, 오히려 활성 효소가 되기 위해 활성화될 것을 필요로 하는 분자이다.

참게로부터 유래된 인자 C는 미량 수준의 내독소를 마주칠 때까지 지모겐을 남아있는다. 내독소 (또는 키모트립신 또는 지질 A)에 의한 활성화 후, 참게 인자 C는 완전한(full) 효소 활성을 명백하게 보이고, 이는 합성 인자 C 기질을 가수분해함으로써 ( 예 , 내독소에 대하여 분석될 샘플 중에서) 내독소의 존재를 나타내고, 상기 가수분해는 측정가능한/검출가능한 산물을 형성한다. 본 발명의 재조합 인자 C (rFC)는 그의 천연 공급원으로부터 지모겐 유사 인자 C로서 생산된다. 또한, 본 발명의 rFC는 또한 미량의 수준의 내독소와 마주칠 때까지 지모겐으로 유지된다. 내독소 (또는 키모트립신 또는 지질 A)에 의한 활성화 후, 본 발명의 rFC는 그의 천연 공급원으로부터 유래된 충분한 참게 인자와 같은 효소 활성을 명백하게 보인다.

앞서 관점에서, 단지 명백성의 목적을 위해, “인자 C-유사 효소 활성 (Factor C-like enzymatic activity)”은 활성화된 형태를 위해 측정된 참게로부터 유래된 인자 C의 효소 활성을 의미하는 것이 유의된다. 즉, “인자 C-유사 효소 활성”은 내독소, 키모트립신 또는 지질 A에 의해 활성화된 참게 인자 C의 효소 활성을 의미한다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 재조합 인자 C 단백질이 인자 C-유사 효소 활성을 갖거나 보이는 것으로 본 명세서에 기재되는 경우, 활성화된 지모겐의 효소 활성이 의미되는 것은 명백하다. 즉, 본 명세서에서 사용된 “참게로부터 유래된 인자 C의 효소 활성 (enzymatic activity of Factor C from a horseshoe crab)”은 “참게로부터 유래된 활성화된 인자 C의 효소 활성 (enzymatic activity of activated Factor C from a horseshoe crab)” 또는 “참게로부터 유래된 활성화된 인자 C 지모겐의 효소 활성 (enzymatic activity of activated Factor C zymogen from a horseshoe crab)”을 의미한다.

다양한 구체예에서, 용어 "본 발명의 (재조합) 인자 C "와 "본 발명의 지모겐 (재조합) 인자 C "는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 방법으로부터 직접적으로 수득된 rFC가 상기 인자 C 효소의 전구체인 경우, 본 발명의 지모겐 rFC는 그것이 (상이한 인자로 인해) 그의 활성을 잃은 점에서 “불활성 (inactive)”이지 않다. 오히려 본 발명의 지모겐 rFC는 활성 효소가 되기 위해 활성화될 필요가 있는 분자이다.

참게로부터 유래된 인자 C의 효소 활성은 구체적으로 가수분해 활성, 더 구체적으로 단백질 가수분해 활성, 및 훨씬 더 구체적으로 세린 프로테아제 활성이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 인자 C-유사 활성은 구체적으로 참게 인자 C-유사 가수분해 활성, 더 구체적으로 참게 인자 C-유사 단백질 가수분해 활성, 및 훨씬 더 구체적으로 참게 인자 C-유사 세린 프로테아제 활성을 의미한다.

참게 인자 C 단백질의 효소 활성은 예를 들면, 발색성 또는 형광성 분석법에 의해 측정될 수 있다. 구체적으로, 상기 참게 인자의 효소 활성은 활성화된 인자 C에 의해 인자 C 기질의 절단/가수분해로 인해 생성되는, 예를 들면, 검출가능한 발색성 또는 형광성 신호로 확인될 수 있다. 인자 C 활성을 검출하기 위한 적절한 분석이 해당 기술분야에 기재되어 있고, 통상의 기술자는 주어진 인자 C 단백질의 효소 활성을 검출/측정하는 분석법을 수행하는데 어려움이 갖지 않을 것이다. 인자 C에 대한 기질은 또한 해당 기술분야에 기재되어 있고 이용가능하다. 본 발명의 범위는 발색성 펩티딜-pNA 기질 및 형광성 펩티딜-AMC, 펩티딜-AFC, 및 펩티딜-MCA 기질을 포함하나 이에 한정되지 않는, 발색성 및 형광성 인자 C 기질의 용도를 포괄한다. 예시적 인자 C 기질은 Nt-Boc-DPR-AMC, Nt-Boc-VPR-MCA, Nt-Boc-VPR-AMC, Mu-VPR-AFC 및 Boc-VPR-pNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 의해 생산된 rFC는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 참게 인자 C의 효소 활성, 더 구체적으로 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 참게 인자 C의 가수분해 활성, 더욱 더 구체적으로 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 참게 인자 C의 단백질 가수분해 활성, 및 훨신 더 구체적으로 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 참게 인자 C의 세린 프로테아제 활성을 보인다.

인자 C로부터 유래된 2-쇄(two-chain) 지모겐

지모겐 형태에서의 참게의 인자 C는 중쇄 (H) 및 경쇄 (L) (소위 2-쇄 형태)를 포함하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 재조합 인자 C는 또한 2-쇄 지모겐 형태로 생산된다. 구체적으로, 본 발명에 의해 제공된 방법으로부터 수득된 지모겐 인자 C는 또한 H쇄 및 L쇄를 포함한다. 따라서, 용어 "본 발명의 인자 C" 및 "본 발명의 지모겐 인자 C"는 위에서 본 명세서에서 기재된 바와 같이 상호교환적으로 사용될 수 있다. 대안적으로, "본 발명의 지모겐 (재조합) 인자 C"는 "본 발명의 프로효소 (재조합) 인자 C"로 명명될 수 있다. 임의의 경우에, 본 발명의 방법으로부터 직접적으로 수득된 재조합 인자 C는 중쇄 (H) 및 경쇄 (L)를 포함하는 2-쇄 지모겐 형태를 특징으로 한다.

1차 아미노산 서열에 기초하여 계산된 서열번호 4의 인자 C 단백질의 분자량은 110 kDa (109.7 kDa)이다. 본 발명의 범위는 본 발명의 재조합 인자 C가 변형된 1차 아미노산 서열, 예, N-말단 또는 C-말단에서의 절단 (truncation)를 갖는, 구체예를 포괄한다. 이러한 경우 1차 서열에 기초하여 계산된 분자량은 변화된다. 따라서, 1차 아미노산 서열에 기초하여 계산하면, 본 발명의 범위는 90 내지 130 kDa 범위의 분자량, 바람직하게는 95 내지 125 kDa 범위의 분자량, 더 바람직하게는 100 내지 120 kDa 범위의 분자량, 및 훨씬 더 바람직하게는 105 내지 115 kDa 범위의 분자량을 갖는 재조합 인자 C 단백질을 포괄한다. 훨씬 더 바람직하게는, 본 발명의 재조합 인자 C 단백질은 1차 아미노산 서열에 기초하여 계산된, 108 내지 112 kDa의 범위의 분자량을 갖는다.

놀랍게도, SDS-PAGE에 의해 결정된 인자 C의 지모겐 형태의 분자량은 1차 아미노산 서열의 기초하여 계산된 분자량보다 더 낮은 것으로 나타났다. 구체적으로, 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 인자 C의 지모겐 형태는 비-환원 조건에서 SDS-PAGE에 의해 결정된 102 kDa의 분자량을 갖는다. 또한, 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 인자 C의 지모겐 형태는 H-쇄에 대하여 결정된 69 kDa의 분자량, 및 L-쇄에 대하여 결정된 37 kDa의 분자량으로부터 초래된, 환원 조건에서 SDS-PAGE에 의해 결정된 106 kDa의 분자량 (글리코실화 포함)을 갖는다. 따라서, 본 발명은 비환원 조건에서 SDS-PAGE에 의해 결정된 약 102 kDa의 분자량을 갖는 재조합 인자 C 단백질, 및 환원 조건에서 SDS-PAGE에 의해 결정된 약 106 kDa의 분자량 (글리코실화 포함)의 분자량을 갖는 재조합 인자 C 단백질을 포괄한다.

내독소, 키모트립신 또는 지질 A (인자 C의 활성화된 형태로의 자가촉매 전환)의 존재하에 인자 C의 활성화 후, L쇄에서 절단이 일어나고, 2개의 신규한 단편, B쇄 및 A쇄의 발생을 가져온다. 따라서, 본 발명의 재조합 인자 C는 내독소, 키모트립신 또는 지질 A (인자 C의 활성화된 형태로의 자가촉매 전환)에 의한 본 발명의 방법으로부터 직접적으로 수득된 지모겐 형태의 활성화가 지모겐 인자 C의 L쇄의 절단으로 인한 B쇄 및 A쇄를 포함하는 활성화된 인자 C를 추가적 특징으로 한다.

벡터 및 플라스미드

다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 이종성 참게 인자 C 단백지을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 핵산 분자, 바람직하게는 벡터로 구성되고, 이는 상기 기생성 원생동물 숙주 세포에 도입된다. 즉, 다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 이종성 참게 인자 C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터 또는 플라스미드에 혼입된다. 다양한 구체예에서, 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드가 사용된다. 다양한 구체예에서, 상기 벡터 또는 플라스미드는 선형 벡터 또는 선형 플라스미드이다. 다양한 추가적 구체예에서, 상기 벡터 또는 플라스미드는 원형 벡터 또는 원형 플라스미드이다.

본 발명은 본 발명에 사용된 이종성 폴리뉴클레오티드, 즉, 참게로부터 유래된 이종성 인자 C 단백질을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 플라스미드를 제공한다. 다양한 구체예에서, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드는 동원핵편모충류 기생성 원생동물의 활성으로 전사된 유전자의 5′및 3′UTR (비해석 (untranslated) 또는 비-해석(non-translated) 영역)의 옆에 배치된다. 바람직하게는, 상기 이종성 인자 C 단백질을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드는 목 트리파노소마티다 의 구성원의 활성으로 전사된 유전자의 5′및 3′UTR, 더 바람직하게는 속 레이슈마니아의 구성원의 활성으로 전사된 유전자의 5′및 3′UTR, 및 훨씬 더 바람직하게는 레이슈마니아 타렌톨라에 의 활성으로 전사된 유전자의 5′및 3′UTR의 옆에 배치된다.

다양한 구체예에서, 본 발명의 벡터 또는 플라스미드는 이종성 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치한 프로모터를 포함한다.

다양한 구체예에서, 본 발명의 벡터 또는 플라스미드는 5′및 3′UTR에 더하여, 이종성 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치한 프로모터를 포함한다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 벡터 또는 플라스미드는 상기 원생동물 숙주 세포에서의 상기 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현으로부터 초래되는 상기 이종성 인자 C 단백질의 효율적 분비, 스플라이싱 및/또는 폴리아데닐화를 위한 하나 이상의 신호 서열을 포함한다. 다양한 구체예에서, 상기 신호 서열은 동원핵편모충류 기생성 원생동물로부터 유래된다. 바람직하게는, 상기 신호 서열은 목 트리파노소마티다 의 구성원, 더 바람직하게는 속 레이슈마니아 의 구성원, 및 훨씬 더 바람직하게는 레이슈마니아 타렌톨라에 로부터 유래된다.

가장 바람직하게는, 상기 신호 서열은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는다. 상기 신호 서열, 구체적으로 서열번호 5의 신호 서열의 단편 및/또는 기능적 유도체와 같은 변이체가 본 명세서에 개시된다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 벡터 또는 플라스미드는 하나 이상의 선별 마커 유전자를 포함한다.

본 발명은 이종성 인자 C 단백질을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드의 본 발명의 원생동물 숙주 세포로의 전달을 위한, 본 발명에 의해 제공된 벡터 또는 플라스미드의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 상기 전달은 원생동물 숙주 세포로의 형질주입이다.

본 발명의 범위는 본 명세서에 기재된 발현계에서 본 발명의 의해 제공된 벡터 또는 플라스미드의 용도를 포괄한다.

숙주 세포 종의 형질주입은 1-100 ㎍의 DNA 범위의 양을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 선별은 항생제 선별을 위한 적절한 플레이팅 기법 및 조건, 또는 희석 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 형질주입 효율은 선택된 종에 따라 넓게 다양하고, 레이슈마니아 종에 대하여 가장 높다.

다양한 구체예에서, 단일 세포는 여러 발현 구조체를 포함하고 및/또는 유지할 수 있다. 바람직하게는, 여러 발현 구조체 모두는 상이한 선별 마커를 갖는다. 발현의 수준은 선택된 숙주 및 구조체에 유의성 있게 의존한다. 발현의 수준은 규모의 낮은 끝에 있음에도 불구하고, 총 세포 단백질의 1% 이하의 재조합 단백질을 생성할 수 있는 에피솜 플라스미드와 함께, 선택된 숙주 및 구조체에 의존하여 유의성 있게 변한다.

본 명세서에 제공된 실험 결과는 동원핵편모충류 트리파노소마 숙주 세포가 재조합 이종성 참게 인자 C 단백질을 발현할 수 있고, 이는 내독소, 키모트립신 또는 지질 A에 의해 활성화되어 활성 효소가 될 수 있다는 것을 명백하게 보여준다. 이 능력이 목 트리파노소마티다 (동원핵편모충류 트리파노소마)의 구성원에 한정되지 않고, 전체로서 동원핵편모충류 기생성 원생동물의 특징이라는 것이 이해된다. 통상의 기술자는 속 레이슈마니아 의 구성원 외에 동원핵편모충류 트리파노소마가 이종성 인자 C의 재조합 발현을 위해 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.

다양한 구체예에서, 본 발명의 벡터 또는 플라스미드는 본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C 단백질과 융합될 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 추가적으로 포함한다. 이들 구체예는 본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C 단백질의 융합 단백질 또는 키메릭 단백질의 생산을 위해 제공한다.

본 발명의 범위는 하나 이상의 재조합 인자 C 단백질을 코딩하는, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 플라스미드를 포괄한다.

인자 C를 생산하는 방법

본 발명은 참게로부터 유래된 인자 C를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 기생성 원생동물의 세포가 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 인자 C를 발현하는 조건 하에 본 발명의 기생성 원생동물의 세포를 배양하는 단계, 및 (b) 세포 배양물로부터 단계 (a)에서 생산된 인자 C를 회수하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 참게 인자 C를 생산하는 방법에 사용되는 세포는 본 명세서에 기재된 숙주 세포이다. 따라서, 본 발명에 따른 참게 인자 C를 생산하는 방법에 사용된 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 참게 인자 C를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이 명백하다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 참게 인자 C를 생산하는 방법은 본 발명의 벡터 또는 플라스미드를 갖는 기생성 원생동물 숙주 세포의 형질주입의 단계를 포함한다. 분명히, 이러한 단계는 이러한 재조합 인자 C가 발현되는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계에 선행한다. 바람직하게는, 상기 기생성 원생동물 숙주 세포는 동원핵편모충류 기생성 원생동물 숙주 세포이다. 더 바람직하게는, 상기 동원핵편모충류 기생성 원생동물 숙주 세포는 복세대(digenetic) 트리파노소마티드 ( 즉 , 트리파노소마티다 목의 복세대 구성원)이다. 더욱 더 바람직하게는, 상기 기생성 원생동물 숙주 세포는 트리파노소마티다 목의 세포이다. 더욱 더 바람직하게는, 상기 기생성 원생동물 숙주 세포는 속 레이슈마니아 의 세포이다 . 가장 바람직하게는, 상기 기생성 원생동물 숙주 세포는 레이슈마니아 타렌톨라에 이다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 숙주 세포 또는 발현계에서 참게 인자 C 단백질을 생산하는 방법은 본 발명의 안정하게 형질주입된 숙주 세포를 구성적 이종성 유전자 발현을 위한 선별 배지에서 배양하는 단계를 포함하고, 상기 안정하게 형질주입된 숙주 세포는 (a) 선별 마커의 유전자를 코딩하는 DNA 서열 및 (b) 활성적으로 전사된 유전자와 작동적으로 연결되고 이에 통합된 참게 인자 C 단백질을 코딩하는 이종성 DNA 서열을 포함한다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 숙주 세포 또는 발현계에서의 참게 인자 C 단백질을 생산하는 방법은 본 발명의 안정하게 형질주입된 숙주 세포를 구성적 이종성 유전자 발현을 위한 선별 배지에서 배양하는 단계를 포함하고, 상기 안정하게 형질주입된 숙주 세포는 (a) 선별 마커 유전자를 코딩하는 DNA 서열 및 (b) 활성 프로모터를 갖는 에피솜으로 유지된(episomally maintained) 플라스미드 DNA와 작동적으로 연결된 참게 인자 C 단백질을 코딩하는 이종성 DNA 서열을 포함한다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 숙주 세포 또는 발현계에서 참게 인자 C 단백질을 생산하는 방법은 본 발명의 안정하게 형질주입된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 안정하게 형질주입된 숙주 세포는 (a) 활성으로 전사된 유전자 클러스터에 통합된, 이종성 RNA 폴리머라제를 코딩하는 DNA 서열, (b) 활성으로 전사된 유전자 클러스터에 통합된 선별 마커를 코딩하는 DNA 서열, (c) 활성으로 전사된 유전자 클러스터에 통합된 전사 억제자 유전자를 코딩하는 DNA 서열, 및 (d) 이종성 RNA 폴리머라제 프로모터 및 억제자 반응 요소의 앞에 있는(preface) 참게 인자 C 단백질을 코딩하는 이종성 DNA 서열을 포함하고, 상기 안정하게 형질주입된 숙주 세포는 선별 마커와 함께 배양되고 상기 이종성 유전자의 발현은 이종성 억제자의 저해제로 유도된다.

본 발명의 범위는 상기 재조합 참게 인자 C가 상기 숙주 세포 내에 축적되는, 본 발명에 따른 인자 C를 생산하는 방법의 구체예를 포괄한다. 또한 본 발명의 범위는 상기 재조합 참게 인자 C가 발현된 단백질의 분비로 인해 상기 세포 배양 배지에 축적되는 본 발명에 따른 인자 C를 생산하는 방법의 구체예를 포괄한다. 따라서, 다양한 구체예에서, 세포 배양물로부터 단계 (a)에서 생산된 인자 C를 회수하는 단계는 발현된 인자 C 단백질이 축적된 상기 숙주 세포로부터 인자 C의 회수를 의미한다. 상기 발현된 인자 C 단백질이 축적된 상기 숙주 세포로부터 인자 C의 회수는 숙주 세포의 용해(lysis)의 단계를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 세포 용해의 예시적 기법은 초음파처리, 프렌치 프레스(French press), 및 효소 용해를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 발현된 인자 C 단백질이 축적된 숙주 세포로부터의 인자 C의 회수는 상기 숙주 세포의 용해 후 발현된 인자 C 단백질의 추출의 별개의 단계를 포함할 수 있다.

또 다른 다양한 구체예에서, 상기 세포 배양물로부터 단계 (a)에서 생산된 인자 C를 회수하는 단계는 인자 C가 발현된 단백질의 분비로 인해 세포 배양 배지에 축적된 세포 배양 지로부터 인자 C의 회수를 포함한다. 인자 C 단백질이 발현된 단백질의 분비로 인해 축적된 세포 배양 배지로부터 인자 C의 회수는 상기 세포 배양 배지로부터 발현된 인자 C 단백질의 추출의 별개의 단계를 더 포함할 수 있다.

다양한 구체예에서, 상기 세포 배양물로부터 단계 (a)에서 생산된 인자 C를 회수하는 단계는 상기 숙주 세포 및 상기 세포 배양 배지로부터 동시에 인자 C의 회수를 의미한다. 본 명세서에서 상기 인자 C의 회수의 단계는 상기 숙주 세포의 용해의 단계를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

다양한 구체예에서, 상술된 인자 C 단백질을 회수하는 단계는 세포 배양물, 구체적으로 숙주 세포 및 세포 배양 배지, 각각으로부터 인자 C 단백질을 단리하는 단계로 간주될 수 있다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 방법으로부터 직접적으로 수득된 인자 C는 내독소 검출 및/또는 내독소 제거에 직접적으로 적용가능한 정제된 인자 C로 고려될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 인자 C를 생산하기 위한 방법은 상기 생산 방법으로부터 직접적으로 수득된 인자 C를 정제하는 별개의 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 인자 C를 생산하는 방법은 크로마토그래피 수단으로 인자 C를 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 예시적 크로마토그래피 수단은 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 명백하게, 크로마토그래피 수단으로 인자 C 단백질을 정제하는 이러한 별개의 단계는 상술된 바와 같이 상기 인자 C 단백질을 회수/단리의 단계에 따르는 것을 의미한다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 인자 C를 생산하는 방법은 상기 인자 C 단백질의 회수 후 수득된 인자 C 단백질을 농축시키고 및/또는 안정화시키는 단계를 포함할 수 있다. 다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 인자 C를 생산하는 방법은 크로마토그래피 수단에 의한 인자 C 단백질의 정제 후 수득된 인자 C 단백질을 농축시키고 및/또는 안정화시키는 단계를 포함할 수 있다. 인자 C 단백질을 안정화시키는 단계는 단백질 안정화제의 사용을 포함할 수 있다. 예시적 단백질 안정화제는 환원제, 높은 1가 및 2가 염 농도, 소수성 첨가제, 양친매성 첨가제, 및 글리세롤을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다양한 구체예에서, 인자 C 단백질을 농축시키는 단계는 상기 생산 방법으로부터 초래된 배양 상청액의 농축을 포함하고, 즉 , 상기 농축 단계는 상술된 회수/단리의 단계 이전에 수행된다. 다양한 기타 구체예에서, 인자 C 단백질을 농축시키는 단계는 앞서 본 명세서에 기재된 인자 C 단백질의 회수/단리의 단계를 수행한 후 수득되는 상기 인자 C 단백질 용액의 농축을 포함하고, 즉, 상기 농축 단계는 상술된 회수/단리의 단계 이후에 수행된다. 인자 C 단백질을 농축시키는 수단 및 방법은 여과, 크로마토그래피 포획 및 용출, 및 동결건조를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 방법에 의해 생산된 참게의 인자 C 단백질은 실시예 4에 기재된 바와 같이, 내독소 또는 키모트립신에 결합 후 촉매작용으로 활성이 되는 것을 보여주었다. 이렇게 생산된 인자 C가 인자 C-유사 효소 활성을 갖는 생활성을 보유한다는 사실은 앞서 본 명세서에 기재된 바와 같이 해당 기술분야에서 다양한 숙주 세포에서의 촉매작용으로 활성인 인자 C를 생산하는 많은 시도는 실패하였기 때문에, 본 발명에 의해 제공된 재조합 인자 C의 기술적 특징을 특징으로 한다. 본 발명자들은 원생동물 숙주 세포 중 참게로부터 유래된 인자 C의 재조합 생산이 내독소 (또는 키모트립신 또는 지질 A)에 의한 활성화 후 촉매작용으로 활성인 인자 C 단백질을 제공한다는 것을 놀랍게도 확인하였다. 원핵생물 및 저급 진핵생물 중 촉매작용으로 활성인 인자 C 단백질의 생산이 촉매작용으로 활성적 인자를 제공하지 않고, 고급 진핵생물 발현계는 효모와 같은 원핵생물 또는 단순한 진핵생물 발현계 보다 충분한 생물학적 활성을 갖는 rFC를 생산하는데 사용되는 것에 따른 선행기술에서의 교시로부터 이는 기대할 수 없었다. 배경기술 섹션에서 기재된 바와 같이, 곤충 세포의 성공적 사용은 곤충세포가 이의 생리학 및 생화학에서 효모 세포보다 참게의 세포를 더 근접하게 닮은 지식과 관련한 이 교시를 초래하였다. 따라서, 이는 해당 기술분야에서 상기 재조합 인자 C가 천연 공급원 즉, 참게로부터 정제된 단백질과 더 근접하게 닮은 세포에서 생산되는 것이고, 내독소에 의한 활성화 후 세린 프로테아제 활성을 갖는 생활성을 보유하는 것이 고려되었다.

본 발명의 범위는 본 명세서에 기재된 재조합 인자 C를 생산하는 수단 및 방법에 기초한 발효기 배양에서 재조합 참게 인자 C의 생산을 포괄한다. 또한 본 발명의 범위는 본 명세서에 기재된 재조합 인자 C를 생산하는 수단 및 방법에 기초한 산업 규모에서의 재조합 참게 인자 C의 발효 생산을 포괄한다. 본 발명의 범위는 실험실-규모 발효기 및 산업 규모 발효기를 포함하는, 임의의 종류의 발효기의 용도를 포괄한다. 본 발명에 따른 발효 생산에서, 탄소 공급원(들)의 농도는 바람직하게는 배양 동안에 제어된다. 본 발명에 따른 배양기 생산에서, 탄소 공급원의 농도는 실질적으로 부작용이 재조합 인자 C 단백질의 생산성에 유발되지 않도록 하는 농축까지 배양 동안 바람직하게는 제어도니다.

본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C

본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C는 천연 공급원에서 확인되는, 즉 , 참게로부터 수득가능한 인자 C의 아미노산 서열을 갖는 인자 C 단백질, 및 본 명세서에 기재된 이의 변이체를 포괄한다. 유사하게, 본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C는 천연 공급원에서 확인되는, 즉 , 참게로부터 수득가능한 인자 C를 코딩하는 핵산 서열과 동일한 핵산 서열에 의해 코딩되는 인자 C 단백질, 및 본 명세서에 기재된 이의 변이체를 포괄한다. 임의의 경우에, 본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C 단백질은 내독소 (또는 키모트립신 또는 지질 A)로 활성화 후 인자 C-유사 효소 활성을 보인다.

본 발명에서, 용어 "본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C (Factor C produced by a method of the present invention)"는 "본 발명의 방법으로부터 수득된 (또는 수득가능한) 인자 C (Factor C obtained (or obtainable) from a method of the present invention)"을 포괄한다. 상기 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다.

원생동물 숙주 세포, 구체적으로 속 레이슈마니아 의 세포가 예인 트리파노소마티드 숙주 세포 ( 즉 , 목 트리파노소마티다의 숙주 세포)에서의 참게로부터 유래된 인자 C의 생산은 인자 C의 특이적 글리코실화를 위해 제공하고, 이는 원생생물 유기체, 효모, 및 곤충 세포와 같은 고도의 진핵생물 발현계에서의 인자 C의 발현에 의해 제공된 글리코실화 패턴과 다르다. 본 발명의 방법으로부터 수득된 인자 C는 해당 기술분야에서 기재된 방법으로부터 수득된 인자 C 단백질과 구조적으로 다르다. 따라서, 본 발명에 의해 제공된 인자 C를 생산하는 방법은 선행기술에 기재된 인자 C에 대하여 자체로 신규한 것인 산물, 즉 , 재조합 인자 C 를 위해 제공한다. 본 발명은 따라서 본 발명에 따른 참게 인자 C를 생산하는 방법에 의해 수득가능한 신규한 인자 C 단백질을 제공한다.

본 명세서에 사용된, "수득가능한 (obtainable) "에 대한 동등한 용어는 용어 "수득된 (obtained) " 또는 "직접적으로 수득된 (directly obtained)"으로 나타낸다.

바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C는 타키플레우스 트리텐타투스 로부터 유래된 인자 C의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖고, 더 바람직하게는 본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C는 서열번호 4의 아미노산을 포함한다. 타키플레우스 트리텐타투스 로부터 유래된 인자 C의 재조합 생산은 이전에 기재되어 있지 않다. 구체적으로 기생성 원생동물 숙주, 구체적으로 속 레이슈마니아 의 세포로 예시된 트리파노소마티드 숙주 세포 ( 즉 , 목 트리파노소마티다의 숙주 세포)에서의 타키플레우스 트리텐타투스 로부터 유래된 인자 C의 생산은 이전에 기재되어 있지 않았다.

본 발명의 재조합 인자 C 단백질은 상기 재조합 인자 C 단백질을 포함하거나 발현하는 본 발명의 원생동물 숙주 세포로부터 용해, 크로마토그래피, 여과, 및 원심분리를 포함하나 이에 한정되지 않는 해당 기술분야에서 알려진 기법에 의해 단리되고 정제될 수 있다. 이들은 발현된 단백질이 상기 세포 배양 배지에 분비되고 축적된 경우 상기 세포 배양 배지로부터 본 발명의 재조합 인자 C의 단리 및 정제에 대해 적용된다. 앞서 본 명세서에 설명된 바와 같이, 다양한 구체예에서, 본 발명의 방법으로부터 직접적으로 수득된, 즉 크로마토그래피 수단으로 인자 C의 특이적 정제의 적용 없는 인자 C는 정제된 인자 C로 간주될 수 있다. 구체적으로, 인자 C의 특정 적용에 대하여 상기 단백질은 크로마토그래피 수단을 포함하는 별개의 정제 단계를 수행하지 않고, 숙주 세포 (상기 인자 C 단백질이 세포내 축적되는 경우) 또는 세포 배양 배지 (상기 인자 C 단백질이 상기 세포 배양 배지에 분비되는 경우)로부터 단리될 수 있다. 다양한 구체예에서, 분비되고 축적된 인자 C 단백질을 포함하는 세포 배양 배지는 내독소 검출 또는 내독소 제거의 특정 적용에 사용될 수 있다. 본 발명의 범위는 인자 C를 포함하는 세포 배양 배지의 용도를 포괄하고, 상기 세포 배양 배지는 농축되었고 및/또는 상기 세포 배양 배지 중 인자 C 단백질은 상기 세포 배양 배지의 적용 이전에 안정화되었다. 상기 세포 배양 배지를 농축하는 수단 및 방법은 여과, 크로마토그래피 포획 및 용출, 동결건조를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 세포 배양 배지에 포함된 인자 C 단백질은 단백질 안정화제의 용도를 포함할 수 있다. 예시적 단백질 안정화제는 환원제, 높은 1가 및 2가 염 농도, 소수성 첨가제, 양친매성 첨가제 및 글리세롤을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 의해 생산된, 단리된 및/또는 정제된 재조합 인자 C 단백질은 표지된다. 바람직하게는, 상기 표지는 효소 표지, 방사선동위원소, 형광 표지, 및 비오틴으로 구성된 군으로부터 선택된다.

면역글로불린 (IgG)의 불변 도메인의 부분과 결합되어, 본 발명에 의해 제공되는 키메라 인자 C를 초래하는, 본 발명의 방법에 의해 생산된 재조합 인자 C는 본 발명에 또한 포괄된다. 이들 융합 단백질은 본 발명의 방법에 따라 제공된 인자 C의 단리 및/또는 정제를 용이하게 할 수 있다.

본 발명의 범위는 본 발명의 인자 C 단백질을 생산하는 방법에 의해 생산될 수 있는, 재조합 인자 C의 융합 단백질을 포괄한다.

본 발명은 본 발명의 방법에 따라 생산된 인자 C 및 하나 이상의 이종성 단백질을 포함하는 키메라 단백질을 또한 제공한다.

앞서 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 재조합 인자 C는 미량 수준의 내독소의 존재에 의해 유도가능한 지모겐 (또는 프로효소)로서 생산된다. 구체적으로, 본 발명의 방법에 의해 수득된 인자 C는 (자가-)촉매반응으로 내독소의 존재에서 활성 형태로 전환된다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C는 상기 생산된 인자 C를 예를 들면, DMSO, 2-프로판올, 또는 프로테아제 억제제, 및, 선택적으로, 킬레이트제와 같은 안정화제와 접촉하여, 내독소에 의한 활성화 및 상기 L 쇄의 자가촉매 분해로부터 보호될 수 있다. 발현 후 상기 인자 C 단백질이 본 발명에 따른 원생동물 숙주 세포에 세포내 축적되는 경우, 상기 접촉은 DMSO 및, 선택적으로 킬레이트제의 존재에서 상기 숙주 세포를 용해하여 수행될 수 있다. 본 발명의 인자 C 단백질이 상기 세포 배양 배지로 분비되는 경우, 상기 접촉은 상기 인자 C 단백질을 단리 및/또는 더 정제하기 이전에, DMSO, 선택적으로 킬레이트제를 상기 세포 배양 배지에 첨가하여 수행될 수 있다. 물론, 다양한 구체예에서 상기 접촉은 단리 및/또는 더 정제한 이후에, DMSO, 선택적으로 킬레이트제를 상기 세포 배양 배지에 첨가하여 수행될 수 있다. 기본적으로 DMSO는 단리 및/또는 정제 방법 동안에 사용되는 용액에 첨가될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 인자 C의 훨씬 더 큰 보호가 킬레이트 2가 금속 이온에 효과적인 시약을 단리/정제 용액에 첨가하여 달성된다.

다양한 구체예에서, 본 발명의 인자 C 단백질은 본 발명에 따른 원생동물 숙주 세포에 세포내 축적된다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 인자 C 단백질은 본 발명에 따른 원생동물 숙주 세포 배양물의 세포 배양 배지에 축적된다. 상기 세포 배양 배지 중 인자 C 단백질의 축적은 일반적으로 발현된 단백질의 발현 때문이다. 그러나, 또한 본 발명의 범위는 상기 인자 C 단백질의 상기 세포 배양 배지에서의 축적이 상기 숙주 세포의 용해에 기인하고, 상기 인자 C 단백질이 우선 세포 내에 축적되는 구체예를 포괄한다. 인자 C 단백질의 발현 및 세포 내 축적 후 수행된 세포 용해에 대한 예시적 기법은 초음파처리, 프렌치 프레스, 및 효소 용해를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

친화성 태그는 단백질에 붙여지고 이들은 친화성 기법을 사용하여 미가공 생물학적 공급원으로부터 정제될 수 있다. 본 발명의 범위는 본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C를 포괄하고, 상기 생산된 인자 C는 정제를 위한 친화성 태그를 포함한다. 이러한 정제 태그는 HIS, CBP, CYD (covalent yet dissociable NorpD 펩티드), Strep II, FLAG, 및 HPC (단백질 C의 중쇄) 아미노산 및 펩티드 태그, 및 GST 및 MBP 단백질 융합 태그를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

또한 본 발명은 화학적 태그를 갖는 본 발명에 의해 생산된 인자 C 단백질을 포함한다. 예시적 화학적 태그는 스트렙타비딘-아가로스 또는 스트렙타비딘-비드에 단단한(tight) 결합에 의한 정제를 위해 제공하는 비오틴이다. 본 발명의 인자 C의 비오티닐화는 또한 표면에 상기 인자 C의 고정화를 위해 비오티닐화된 인자 C를 포함한다. 상기 비오틴 태그는 그에 결합하는 아비딘(또한 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘)을 갖는 칼럼과 함께 친화성 크로마토그래피에 사용될 수 있다. 상기 비오틴 태그는 또한 효소 리포터 ( 예 , 호스래디시 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 알칼린 포스파타제) 또는 형광 프로브와 같은 항-비오틴 항체 또는 아비딘/스트렙타비딘-태그된 검출 전략을 통한 인자 C의 검출에 사용될 수 있다. 이는 ELISA 분석을 포함하나 이에 한정되지 않는 면역분석 방법에 유용할 수 있다.

정제된 인자 C

본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 인자 C를 제공한다. 본 발명에 따른 방법으로부터 수득된 인자 C는 크로마토그래피 수단에 의한 별개의 정제 없이 내독소 검출 또는 내독소 제거의 방법에 직접적으로 적용될 수 있다. 따라서, 이미 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 방법으로부터 직접적으로 수득된 인자 C는 따라서 정제된 인자 C로 간주될 수 있다. 또한 본 발명은 크로마토그래피 수단으로 추가 정제되는 인자 C를 포괄하고, 즉 , 본 발명에 따른 방법에 의해 생산되거나 본 발명에 따른 방법으로부터 직접적으로 수득된 인자 C가 크로마토그래피 수단으로 더 정제된다. 크로마토그래피 수단의 적용은 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피를 포함하는 이에 한정되지 않는다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 정제된 인자 C는 단리되고, 농축되고 및/또는 안정화된 인자 C를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 단리된 인자 C는 본 발명에 따른 인자 C를 생산하는 원생동물 숙주 세포를 배양하여 수득된 세포 배양물 또는 세포 배양 배지로부터 단리된 인자 C이다. 농축된 인자 C는 본 발명에 따른 인자 C를 생산하는 원생동물 숙주 세포의 배양으로부터 수득된 세포 배양물 또는 세포 배양 배지로부터 농축된 인자 C를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 인자를 농축하는 수단 및 방법은 여과, 크로마토그래피 포획 및 용출, 및 동결건조를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 안정화된 인자 C는 단백질 안정화제에 의해 안정화된 인자 C를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적 단백질 안정화제는 환원제, 높은 1가 및 2가 염 농도, 소수성 첨가제, 양친매성 첨가제 및 글리세롤을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 정제된 인자 C는 다른 단백질 및 핵산과 같은 벌크 불순물의 대부분으로부터 정제된 인자 C를 의미하는 중간 정제된(intermediately purified) 인자 C를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 정제된 인자 C는 임의의 잔여 미량 불순물 또는 이와 밀접하게 관련된 물질로부터 정제된 인자 C를 의미하는 높은 순도 인자 C를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 의해 제공되거나, 본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C는 75% 이상 또는 80% 이상의 순도를 갖고, 즉 , 인자 C는 총 단백질의 75% 이상 또는 80% 이상을 구성한다. 다양한 구체예에서, 본 발명에 의해 제공되거나 본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C는 85% 이상 또는 90% 이상의 순도를 갖고, 즉 , 인자 C는 총 단백질의 85% 이상 또는 90% 이상을 구성한다. 다양한 구체예에서, 본 발명에 의해 제공되거나 본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C는 95% 이상 또는 96% 이상의 순도를 갖고, 즉 , 인자 C는 총 단백질의 95% 이상 또는 96% 이상을 구성한다. 다양한 구체예에서, 본 발명에 의해 제공되거나 본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C는 95% 이상 또는 96% 이상의 순도를 갖고, 즉 , 인자 C는 총 단백질의 95% 이상 또는 96% 이상을 구성한다. 다양한 구체예에서, 본 발명에 의해 제공되거나 본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C는 97% 이상 또는 98% 이상의 순도를 갖고, 즉 , 인자 C는 총 단백질의 97% 이상 또는 98% 이상을 구성한다. 다양한 구체예에서, 본 발명에 의해 제공되거나 본 발명의 방법에 의해 생산된 인자 C는 99% 이상 또는 심지어 100%의 순도를 갖고, 즉 , 인자 C는 총 단백질의 99% 이상 또는 심지어 100%를 구성한다.

항체

본 발명은 또한 본 발명에 의해 제공되거나 본 발명의 방법으로부터 수득된 인자 C 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 전장 (full-length) 인자 C에 특이적으로 결합한다.

다양한 구체예에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다중클론 항체, 키메라 항체, Fab 단편, F(ab') ₂ 단편, 및 scFv 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 표지된다. 바람직하게는, 상기 표지는 효소 표지, 방사성동위원소, 형광성 표지, 및 비오틴으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 인자 C 단백질은 본 발명에 의해 제공된 다중클론 및 단일클론 항체를 올리는데 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 해당 기술분야에서 이용가능하고 통상의 기술자에게 알려진 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다.

항체 단편의 활성이 변형되지 않은 항체 또는 항체 단편에 비하여 유의성있게 변형되거나 손상되지 않은 경우, 다른 서열에 부착되거나 아닌, 본 발명에 의해 제공된 항체 단편은 또한 특정 영역 또는 특이적 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 치환, 또는 기타 선택된 변형을 포함할 수 있다. 이들 변형은 디술피드 결합에 아미노산을 제거/첨가할 수 있는 것과 같은 일부 추가 특성을 제공할 수 있다. 임의의 경우, 본 발명에 따른 항체 단편은 동족 항원에의 특이적 결합과 같은 생활성 특성을 가져야 한다.

본 발명의 항체 또는 항체 단편의 기능적 또는 활성 영역은 단백질의 특이적 영역의 돌연변이유발, 및 뒤이어 발현 및 발현된 폴리펩티드의 테스트로 동정될 수 있다. 이러한 방법은 해당 기술분야에서 숙련된 전문가에게 용이하게 명백하고 상기 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 핵산의 부위-특이적 돌연변이유발을 포함할 수 있다.

조성물 및 용액

본 발명은 본 발명의 방법에 따라 생산된 재조합 인자 C 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 본 발명의 벡터 또는 플라스미드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 본 발명에 따른 기생성 원생동물 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 융합 단백질 또는 키메라 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 진단 조성물이다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 내독소를 검출, 바람직하게는 샘플 중 내독소를 검출하는 조성물이다. 다양한 구체예에서, 상기 샘플은 환경적 샘플이다. 다양한 구체예에서, 상기 샘플은 생물학적 샘플이다. 다양한 구체예에서, 상기 샘플은 테스트 샘플, 바람직하게는 생물학적 또는 환경적 테스트 샘플이다. 바람직하게는, 상기 생물학적 샘플 또는 생물학적 테스트 샘플은 포유동물로부터 수득된 생물학적 샘플 또는 생물학적 테스트 샘플이다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이다. 본 발명의 범위는 개, 고양이, 돼지, 말, 새, 및 파충류를 포함하나 이에 한정되지 않는 동물로부터 수득된 샘플 중 내독소 검출을 포괄한다.

본 발명은 본 발명의 인자 C 단백질을 포함하는, 용액, 바람직하게는 진단 용액을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따라 생산된 재조합 인자 C를 포함하는, 내독소를 제거하기 위한 용액을 제공한다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 생산되거나 본 발명의 방법으로부터 수득된 인자 C는 내독소를 측정/검출하는 시약(내독소-측정/검출 시약)으로 명명될 수 있다. 다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 생산되거나 본 발명의 방법으로부터 수득된 인자 C는 내독소 제거를 위한 시약(내독소-제거 시약)으로 명명될 수 있다.

본 발명의 인자 C를 포함하는, 본 발명의 조성물 및 용액은 본 발명의 방법에 의해 생산된 재조합 인자 C 외에 성분을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 시약은 검출을 위한 인자 C 기질을 더 포함할 수 있고, 상기 시약은 내독소의 측정/검출을 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 인자 C-함유 조성물 및 용액은 또한 예를 들면 , pH-버퍼제 및/또는 염, 바람직하게는 킬레이팅 염을 포함할 수 있다. pH-버퍼제의 예는 HEPES 버퍼, MES 버퍼, 및 Tris 버퍼를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 알코올, 에스테르, 케톤, 및 아미드와 같은 유기 용매는 또한 본 발명의 조성물 및 용액에 포함될 수 있다.

본 발명의 내독소-측정/검출제 및/또는 내독소-제거제는 고체 형태, 액체 형태, 및 겔 형태를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의적 형태로 제제화될 수 있다. 첨가제는 비히클, 결합제, 붕해제, 윤활제, 안정화제, 교취제, 및 휘석제, 및 용매와 같은 제제 담체로 사용될 수 있다.

다양한 구체예에서, 본 발명의 재조합 인자 C를 포함하는, 본 발명의 조성물 및 용액은 추가로 계면활성제를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 생산되거나 본 발명의 방법으로부터 수득된 참게 인자 C 단백질, 및 계면활성제를 포함하는, 내독소를 검출하는 시약을 제공한다. 다양한 구체예에서, 상기 계면활성제는 양쪽성 계면활성제이다. 다양한 기타 구체예에서, 상기 계면활성제는 음이온 계면활성제 또는 양이온 계면활성제이다. 다양한 기타 구체예에서, 상기 계면활성제는 비-이온성 계면활성제이다. 바람직하게는, 상기 계면활성제는 ZWITTERGENT 3-14, 트리톤 X-100, 트리톤 X-114, 옥틸-베타-D-티오글루코시드, Genapol C-100, Tween 20, 및 Tween 80으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 계면활성제는 본 발명의 조성물 또는 용액에 0.001 내지 0.5%의 농도, 더 바람직하게는 0.001 내지 0.025%의 농도, 더욱 더 바람직하게는 0.001 내지 0.01%의 농도로 존재한다. 다양한 구체예에서, 상기 계면활성제는 본 발명의 조성물 또는 용액에 0.004 내지 0.006%의 농도로 존재한다.

본 발명의 인자 C 단백질은 자체로서 내독소를 측정/검출하기 위해 사용될 수 있거나, 물, 생리적 염수, 버퍼 등에 희석, 분산, 또는 용해된 후 사용될 수 있다. "자체로서 인자 C 단백질 (Factor C protein as it is)"은 본 발명의 방법으로부터 수득된 단리, 농축 및/또는 정제 인자 C를 포함하는, 본 발명의 방법으로부터 직접적으로 수득된 인자 C 단백질의 형태를 포괄한다. 또한 본 발명의 범위는 크로마토그래피 수단으로 정제된 후 수득된 "자체로서 인자 C 단백질"을 포괄한다.

내독소 검출하는 방법

본 발명에 의해 제공된 재조합 인자 C는 내독소의 고속 대량 스크린을 위한 내독소 진단 분석의 기반을 형성한다. 내독소-활성화된 재조합 인자 C 지모겐은 합성 기질을 촉매작용으로 가수분해하여 측정가능한 산물을 형성하여, 내독소를 정량하게 한다.

본 발명은 내독소 검출을 위한 방법에서, 본 발명에 따른 인자 C를 생산하기 위한 방법에 의해 생산된 인자 C 단백질의 용도를 제공한다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 인자 C는 내독소 (LPS) 또는 지질 A의 존재에 대하여 분석될 샘플, 바람직하게는 테스트 샘플을 본 발명에 따른 재조합 인자 C와 접촉하는 단계, 및 상기 재조합 인자 C의 효소 활성 ( 즉 , 세린 프로테아제 활성)을 측정하는 단계를 포함하는 내독소 검출을 위한 방법에 사용된다. 상기 재조합 인자 C의 효소 활성은 내독소 또는 지질 A, 또는 참게의 인자 C에 결합하는 것으로 해당 기술분야에 알려진 기타 내독소의 결합으로 인한 이의 활성을 반영한다. 상기 인자 C 효소 활성 (구체적으로 세린 프로테아제 활성)은 해당 기술분야에서 알려진 방법에 의해 알맞게 측정되지만, 바람직하게는 발색성 또는 형광성 방법으로 측정된다. 이러한 방법은 재조합 인자 C의 프로테아제 활성에 의한 인자 C 기질의 절단으로부터 초래되는 생산물의 형성을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 측정은 기질의 절단으로부터 초래되는, 색상 (발색성 기질의 경우) 또는 형광 방출 (형광성 기질의 경우)의 변화에 기초한다. 본 발명의 범위는 발색성 펩티딜-pNA 기질 및 형광성 펩티딜-AMC, 펩티딜-AFC, 및 펩티딜-MCA 기질을 포함하나 이에 한정되지 않는, 발색성 및 형광성 인자 C 기질의 용도를 포괄한다. 이러한 발색성 또는 형광성 분석을 위한 바람직한 기질은 Nt-Boc-VPR-MCA, Nt-Boc-VPR-AMC, Mu-VPR-AFC and Boc-VPR-pNA이다.

또한 본 발명의 구체예는 샘플, 바람직하게는 테스트 샘플 중 내독소 또는 지질 A의 존재를 분석하기 위한 면역 방법을 포함한다. 본 발명의 이들 방법은 항체의 재조합 인자 C에의 특이적 결합, 및 뒤이어 인자 C-항체 복합체의 검출 및/또는 정량에 기초한다. 바람직한 구체예에서, 분석될 샘플은 내독소 또는 지질 A에 특이적으로 결합하는 고정화된 항체와 접촉된다. 고정화된 리간드 ( 즉 , 고정화된 내독소 또는 지질 A)는 그 후 본 발명에 따른 재조합 인자 C와 접촉되고, 고정화된 재조합 인자 C (rFC)를 가져온다. 고정화된 rFC는 그 후 고정화된 rFC에 특이적으로 결합하는 제2 항체와 결합된다. 제2 항체에 결합된 rFC를 포함하는 고정화된 복합체의 존재 및/또는 양은 그 후 해당 기술분야에서 알려진 기법, 예를 들면, 제2 항체에 특이적으로 결합하는 제3 항체를 적용하거나, 예를 들면, 항체의 Fc 부분을 통해 결정될 수 있다. 대안적 구체예에서, 제2 항체를 적용하는 대신, 고정화된 rFC의 효소 활성이 측정된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 내독소 또는 지질 A와 본 발명의 rFC의 특이적 결합은 상업적으로 입수가능한 분석, 예, BIA코어 ^TM 분석 (Pharmacia Biotech)에서 사용된다. 이러한 기기의 기질 플레이트에 rFC를 고정화하여, 샘플 중 내독소 또는 지질 A의 존재가 검출될 수 있다. 통상의 기술자는 샘플 중 내독소의 주어진 로딩(load)에 대하여 고정화될 rFC의 양을 최적화할 수 있다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 내독소를 검출하기 위한 방법은 테스트 샘플, 바람직하게는 포유동물로부터 수득된 테스트 샘플에 수행된다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이다. 본 발명의 범위는 또한 개, 고양이, 돼지, 말, 새, 및 파충류를 포함하지만 이에 한정되지 않는 동물로부터 수득된 테스트 샘플 중 내독소 검출을 포괄한다.

다양한 구체예에서, 내독소 검출을 위한 본 발명의 방법은 내독소-선택적, 미리-코팅된 고체 지지체의 용도를 포함한다. 구체적으로, 내독소 (LPS)의 선택적 포획은 LPS의 내부 코어 부분 ( 즉 , 내부 코어 올리고사카리드) 또는 지질 A 부분에 관한 파지-유도 수용체 단백질 (phage-derived receptor protein)을 사용하여 달성된다. 지질 A 부분과 함께, LPS의 내부 코어 구조체는 고도로 보존된 구조체이다. 외부 코어 구조체는 약간 가변적이고 O-항원은 고도로 이종성이다. 바람직하게는, 본 발명에 사용될 파지-유도된 수용체 단백질은 내독소의 보존된 영역에 대하여 고-친화성 및 고-친화도를 보인다. 상기 파지-유도 수용체 단백질에 결합된 내독소의 고도로 보존된 영역은 코어 영역 및 지질 A를 포괄한다. 따라서, 상기 파지-유도 수용체 단백질은 내부 코어 영역 (즉, 내부 코어 올리고사카리드) 및/또는 지질 A에 결합한다. 다양한 구체예에서, 상기 파지-유도 수용체 단백질은 박테이로파지 다리 단백질, 다리를 갖는 박테리오파지의 박테리오파지 머리 단백질, 또는 다리가 없는 박테리오파지의 박테리오파지 코트 단백질이다. 바람직하게는, 상기 파지-유도 수용체 단백질은 박테리오파지 꼬리 단백질이다. 바람직하게는, 상기 박테리오파지 꼬리 단백질은 짧은 박테리오파지 꼬리 섬유의 단백질이다. 다양한 구체예에서, 상기 짧은 박테리오파지 꼬리 섬유는 K3, T2, T4, Ox2, RB32-33, AR1, PP01 및 RB69로부터 선택된다. 다양한 구체예에서, 상기 박테리오파지 꼬리 단백질은 본 발명에 따른 내독소의 검출을 위해 변형된다. 다양한 구체예에서, 상기 박테리오파지 꼬리 단백질은 활성 단백질과 커플링될 수 있다.

상기 파지-유도 수용체 단백질로 예비-코팅된 고체 지지체에 샘플 내독소 (LPS)의 결합 후, 원래 샘플 매트릭스가 세척되어서, 검출 반응을 잠재적으로 간섭하는 성분을 제거한다. 그 이후, 내독소는 인자 C와 인자 C 기질의 반응을 포함하는 방법에서 본 발명의 인자 C에 의해 검출된다. 다양한 구체예에서, 상기 기질은 발색성 또는 형광성 기질이다.

다양한 구체예에서, 파지-유도 수용체 단백질로 예비-코팅될 고체 지지체는 미세역가 플레이트, 비드 (예, 실리카 비드 또는 유기 폴리머 비드), 포일 또는 멤브레인이다. 따라서, 내독소-선택적, 예비-코팅 고체 지지체의 용도를 포함하는 내독소 검출을 위한 본 발명의 방법은 3개의 단계를 포함한다: 제1 단계는 샘플 내독소 (즉, 샘플 중 포함된 내독소)의 LPS의 보존된 코어 영역에 대한 높은-친화성 및 높은 특이성을 보이는 파지-유도 수용체 단백질로 예비-코팅된 고체 지지체에의 결합을 포함한다. 상기 제1 단계는 샘플 내독소의 고정화를 위해 제공한다. 제2 단계는 원래 샘플 매트릭스를 세척하기 위한 세척 단계이다. 제3 단계는 본 발명의 인자 C 단백질에 의한 고정화된 내독소의 검출을 포함한다. 상기 제3 단계는 인자 C와 검출가능한 신호를 가져오는 인자 C를 위한 기질과의 반응을 포함한다. 다양한 구체예에서, 상기 인자 C 기질은 고정화된 내독소가 인자 C 단백질과 접촉된 후 첨가된다. 다양한 구체예에서, 상기 인자 C 기질은 인자 C 단백질이 첨가되기 이전에 분석에 이미 첨가된다. 이 3-단계 분석 형태의 특이적 기술적 효과는 이는 0.05 EU/ml로부터 500 EU/ml까지의 검출 범위를 갖는다는 것이다. 또한, 이 분석 형태는 확립된 동종성 검출 방법에 대하여 명백한 장점을 보인다: 예, β-글루칸, 프로테아제 또는 인지질에 의해 유도된 더 적은 허위-양성 결과, 샘플의 제어 구성에 의해 유발된 더 적은 허위-음성 결과, 더 적은 재검사를 필요로 하는 무효한(invalid) 결과, 복합체 샘플에서의 적은 간섭, 따라서 더 높은 민감도 및 넓은 동적 범위.

본 발명에 의해 제공된 상기 3-단계 형태는 혈액, 혈청 및 혈장과 같은 인간 체액에서의 내독소의 검출에 특히 유용하다. 바람직하게는, 상술된 3-단계 분석은 임상 생물학적 샘플을 분석하기 위한 것이다. 상기 분석은 환자에 직접적으로 적용되지 않지만, 환자로부터 수득된 테스트 샘플에 대신 적용된다.

다양한 구체예에서, 본 발명은 (i) 분석될 샘플과 본 발명의 내독소-검출 시약을 접촉하여 상기 테스트 샘플과 상기 내독소-검출 시약의 혼합물을 형성하는 단계, (ii) 인자 C 기질을 상기 혼합물에 첨가하고, 상기 인자 C 기질의 절단은 검출가능한 신호를 생성하는 단계, 및 (iii) 검출가능한 신호의 존재 여부에 대하여 상기 혼합물을 분석하고, 내독소를 포함하지 않는 대조군 샘플에 비하여 증가된 상기 검출가능한 신호의 양은 상기 테스트 샘플 중 내독소의 존재를 가리키는 것인 단계를 포함하는, 샘플 중 내독소를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 의해 제공된 내독소 분석에서, 상기 인자 C 기질은 바람직하게는 발색성 또는 형광성 인자 C 기질이다. 다양한 구체예에서, 상기 인자 C 기질은 발색성 펩티딜-pNA 기질이다. 다양한 다른 구체예에서, 상기 인자 C 기질은 형광성 펩티딜-AMC, 펩티딜-AFC, 또는 펩티딜-MCA 기질이다. 또한 예시적 인자 C 기질은 Nt-Boc-DPR-AMC, Nt-Boc-VPR-AMC, Mu-VPR-AFC 및 Boc-VPR-pNA를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

다양한 구체예에서, 본 발명은, (i) 분석될 샘플을 본 발명의 내독소-검출 시약 및 인자 C 기질과 접촉하여 테스트 샘플, 내독소-검출 시약과 인자 C 기질의 혼합물을 형성하고, 상기 인자 C 기질의 절단은 검출가능한 신호를 생성하는 것인 단계, 및 (ii) 상기 검출가능한 신호의 존재 또는 부재로 상기 혼합물을 분석하고, 내독소를 포함하지 않는 대조군 샘플에 비하여 증가된 검출가능한 신호의 양은 상기 테스트 샘플 중 내독소의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하는, 샘플 중 내독소를 검출하는 방법을 제공한다

또한 본 발명은 (i) 분석될 샘플을 내독소 (LPS)에 특이적으로 결합하거나 지질 A에 특이적으로 결합하는 고정화된 항체와 접촉하여, 상기 항체와 상기 샘플 중 내독소 간의 복합체를 형성하는 단계, (ii) 상기 복합체를 본 발명의 방법에 의해 생산된 재조합 인자 C와 접촉하여 상기 항체, 내독소 및 재조합 인자 C를 포함하는 고정화된 복합체를 형성하는 단계, (iii) (ii)의 상기 고정화된 복합체를 상기 재조합 인자 C에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉하는 단계, 및 (iv) 상기 재조합 인자 C에 특이적으로 결합하는 상기 항체의 양을 정량하는 단계를 포함하는, 샘플 중 내독소를 검출하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명에서, "내독소 검출을 위한 방법" 또는 "내독소를 검출하는 방법"은 용어 "내독소를 위한 분석"과 함께 상호교환적으로 사용될 수 있다.

내독소를 제거하는 방법

본 발명은 내독소를 제거하기 위한 방법에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 인자 C 단백질의 용도를 제공한다. 이러한 방법에서 본 발명의 인자 C의 용도는 물, 버퍼, 및 세포 배양 배지로부터 내독소의 제거를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 내독소를 제거하기 위한 방법에서 본 발명의 인자 C의 용도에 존재하는 다양한 기타 구체예는 생물학적 및 비-생물학적 제제, 바람직하게는 생물학적 제제, 더 바람직하게는 동물 시험, 세포 배양, 이식, 줄기 세포 기법, 세포 분류, 및 기타 포유동물 세포 치료를 위한 생물학적 제제로부터의 내독소의 제거를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 내독소를 제거하기 위한 방법에서 본 발명의 인자 C의 용도에 속하는 다양한 추가 구체예는 의료 장치, 의료 기기, 화장품, 식품 및 음료로부터 내독소의 제거를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 인자 C는 내독소-없는 제제, 구체적으로 내독소-없는 생물학적 및 비-생물학적 제제를 생산하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 생물학적 제제, 예를 들면, 단백질, 항체, 백신, 핵산, 버퍼 및/또는 다양한 기타 물질로부터 내독소 (LPS)의 제거를 위한 방법에서의 인자 C의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 생물학적 제제는 액체 생물학적 제제, 더 바람직하게는 수용성 생물학적 제제이다. 액체 또는 수용성 생물학적 제제는 액체 또는 수용성 생물학적 용액, 또는 액체 또는 수성 생물학적 조성물로 간주될 수 있다.

본 발명의 다양한 구체예에서, 용어 "생물학적 제제 (biological preparation)", "생물학적 용액 (biological solution)"및 "생물학적 조성물 (biological composition)"은 상호교환적으로 사용될 수 있다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 내독소를 제거하는 방법은 고체 지지체에 고정화된 본 발명의 인자 C의 용도를 포함한다. 바람직하게는, 상기 고체 지지체는 크로마토그래피 수지이다. 본 발명에 따라 내독소를 제거하는 방법은 중력 유동 (gravity flow) 또는 완전하게 자동화된 액체 크로마토그래피 시스템에 의한 칼럼 또는 배치 모드에서 사용될 수 있다.

생물학적 제제로부터 내독소의 제거는 약학적 용도의 생물학적 산물이 인간에게 투여 가능하도록 내독소가 충분히 없어야 한다는 사실을 고려하는 경우 특히 중요하다. 따라서, 본 발명은 내독소-없는 제제를 생산하기 위한 방법에서 본 발명의 인자 C의 용도, 구체적으로 약제학적 용도를 위한 내독소-없는 제제를 제공한다. 약학적 용도를 위한 생물학적 산물을 포함하는 제제는 직접적으로 약학적 방법으로부터 초래될 수 있고, 즉, 상기 제제는 약학적 방법 제제이다. 따라서, 다양한 구체예에서, 본 발명은 상기 약학적 방법 제제를 본 발명의 재조합 인자 C로 처리하는 단계를 포함하는 약학적 방법 제제로부터 내독소를 제거하는 방법을 제공한다. 이러한 약학적 방법 제제는 약학적 약물 또는 백신 물질을 포함할 수 있다. 다양한 구체예에서, 약학적 약물 또는 백신 물질은 폴리펩티드, 바람직하게는 글리코단백질을 포함한다. 다양한 구체예에서, 약학적 약물 또는 백신 물질은 백신 항원이다.

바람직하게는, 본 발명에 다른 약제학적 방법 제제는 액체 약학적 방법 제제, 더 바람직하게는 수성 약학적 방법 제제이다. 본 발명의 다양한 구체예에서, 용어 "약학적 방법 제제 (pharmaceutical process preparation)" 및 "약학적 방법 조성물 (pharmaceutical process composition)"은 상호교환적으로 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 범위는 임의의 종류의 샘플에 본 발명에 따른 내독소를 제거하는 방법을 수행하는 단계를 포괄한다. 구체적으로, 본 발명은 (i) 본 발명의 방법에 의해 생산되거나 상기 방법으로부터 수득된 고정화된 재조합 인자 C를 상기 샘플과 접촉하여, 상기 샘플 중 내독소 또는 지질 A가 상기 고정화된 재조합 인자 C에 결합하는 단계, 및 (ii) 상기 내독소 또는 지질 A가 결합된 상기 고정화된 재조합 인자 C를 상기 샘플로부터 분리하는 단계를 포함하는, 샘플로부터 내독소 또는 지질 A를 제거하는 방법을 제공한다.

샘플

내독소의 정량적 측정을 포함하는 적용에서, 알려진 농도를 갖는 내독소 기준 샘플이 검출을 위한 기질의 반응 정도 (예, 색상, 형광 방출 등의 정도) 및 내독소 수준에 상응하는 데이터를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이는 수득된 상관관계 데이터에 기초한 본 발명에 따라 분석될 샘플에 존재하는 내독소의 정량을 가능하게 한다.

본 발명에 따른 내독소의 검출 및/또는 제거의 대상이 될 샘플은 구체적으로 한정되지 않고, 그 예는 물 샘플, 버퍼 샘플, 및 세포 배양 배지로부터의 샘플을 포함한다. 다양한 구체예에서, 상기 샘플은 테스트 샘플이다. 다양한 구체예에서, 상기 샘플은 본 명세서에 기재된 생물학적 제제의 테스트 샘플이다. 다양한 구체예에서, 상기 샘플은 본 명세서에 기재된 의료 장치, 의료 기기, 화장품, 식품 및 음료로부터 테스트 샘플을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 내독소 검출 및/또는 제거의 대상이 될 샘플은 포유동물로부터 수득된 테스트 샘플이다. 바람직하게는, 포유동물로부터 수득된 테스트 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플 또는 타액 샘플을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이다. 다양한 구체예에서, 따라서 상기 테스트 샘플은 인간 혈액 샘플, 인간 혈청 샘플, 또는 인간 타액 샘플, 바람직하게는 인간 혈액 샘플이다.

다양한 구체예에서, 내독소의 검출 및/또는 제거의 대상이 될 테스트 샘플은 하기 중 하나로부터 수득된 테스트 샘플이다: 의료용 수(medical water), 약학적, 주입 (infusion) 용액, 혈액 제제. 바람직하게는, 상기 혈액 제제는 포유동물, 더 바람직하게는 인간으로부터 수득된다. 다양한 구체예에서 상기 테스트 샘플은 환경 샘플이다.

다양한 구체예에서, 본 발명에 따른 내독소의 검출 및/또는 제거의 대상이 되는 샘플은 예를 들면, 단백질, 항체, 백신, 핵산, 버퍼 및/또는 다양한 기타 물질의 생물학적 제제로부터 유래된 샘플을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다양한 기타 구체예에서, 본 발명에 따른 내독소의 검출 및/또는 제거의 대상이 되는 샘플은 본 명세서에 기재된 약학적 방법 제제로부터 유래된 샘플을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

분석 및 키트

앞서 본 명세서에 기재된 바와 같이, "내독소 검출을 위한 방법" 또는 "내독소를 검출하는 방법"과 같은 용어는 "엔도톡신을 위한 분석"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 내독소 검출을 위한 방법에 따른 본 발명의 방법에 의해 생산된 재조합 인자 C의 적용을 포함하는 내독소를 위한 분석을 제공한다. 기본적으로, 본 발명에 따른 내독소를 위한 분석은 본 발명에 따른 내독소 검출을 위한 방법과 동일한 방법 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 인자 C, 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 인자 C를 포함하는 내독소 검출을 위한 키트를 제공한다. 바람직하게는, 상기 키트는 본 발명의 내독소를 위한 분석 또는 내독소 검출을 위한 방법을 위한 지시를 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 지시는 매뉴얼의 형태로 존재한다.

다양한 구체예에서, 상기 키트는 내독소 검출의 감도를 증가시키는 계면활성제를 더 포함한다. 상기 계면활성제 및 상기 인자 C 단백질은 별개 용기에 키트에 존재할 수 있다.

다양한 구체예에서, 상기 키트는 본 명세서에 기재된 본 발명의 재조합 인자 C 및 계면활성제를 포함하는 본 발명의 조성물 또는 용액을 갖는 하나의 용기를 포함한다.

다양한 구체예에서, 상기 키트에 포함된 계면활성제는 양쪽성 계면활성제이다. 다양한 기타 구체예에서, 상기 계면활성제는 음이온성 계면활성제 또는 양이온성 계면활성제이다. 다양한 기타 구체예에서, 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제이다. 바람직하게는, 상기 계면활성제는 ZWITTERGENT 3-14, 트리톤 X-100, 트리톤 X-114, 옥틸-베타-D-티오글루코시드, Genapol C-100, Tween 20, 및 Tween 80으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 계면활성제는 상기 키트에 0.001 내지 0.5%의 농도, 더 바람직하게는 0.001 내지 0.025%의 농도, 훨씬 더 바람직하게는 0.001 내지 0.01%의 농도로 존재한다. 다양한 구체예에서, 상기 계면활성제는 상기 키트에 0.004 내지 0.006%의 농도로 존재한다. 이는 본 발명의 재조합 인자 C 및 상기 계면활성제를 모두 포함하는 본 발명의 별개 용기 또는 조성물 또는 용액에 계면활성제의 존재를 포함한다.

다양한 구체예에서, 상기 계면활성제를 포함하는 용기는 상기 계면활성제에 더하여 버퍼를 포함하는 용기이다.

다양한 구체예에서, 상기 키트는 인자 C 기질을 더 포함한다. 구체적으로, 활성화된 인자 C의 가수분해 활성에 의한 인자 C 기질의 절단 ( 즉 , 본 명세서에 기재된 내독소 또는 지질 A의 존재에서 자가-촉매 활성화)은 검출가능한 신호를 생성한다. 바람직하게는, 상기 키트는 발색성 및/또는 형광성 인자 C 기질을 포함한다. 다양한 구체예에서, 상기 인자 C 기질은 발색성 펩티딜-pNA 기질이다. 다양한 기타 구체예에서, 상기 인자 C 기질은 형광성 펩티딜-AMC, 펩티딜-AFC, 또는 펩티딜-MCA 기질이다. 추가적 예시적 인자 C 기질은 Nt-Boc-DPR-AMC, Nt-Boc-VPR-AMC, Nt-Boc-VPR-MCA, Mu-VPR-AFC 및 Boc-VPR-pNA를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

재조합 인자 C를 생산하는 기생성 원생동물 숙주 세포를 생성하는 방법

본 발명은 (a) 이종성 참게 인자 C를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자, 바람직하게는 벡터 또는 플라스미드를 기생성 원생동물 숙주 세포에 도입하는 단계, 및 (b) 상기 인자 C 단백질을 발현하는 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 숙주 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 재조합 인자 C 단백질을 생산하는 기생성 원생동물 숙주 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 또한, 상기 기생성 원생동물 숙주 세포는 바람직하게는 동원핵편모충류 기생성 원생동물 숙주 세포이다. 더 바람직하게는, 상기 동원핵편모충류 기생성 원생동물 숙주 세포는 복세대 트리파노소마티드 (즉, 목 트리파노소마티다의 복세대 구성원). 더욱 더 바람직하게는, 상기 기생성 원생동물 숙주 세포는 목 트리파노소마티다의 세포이다. 훨씬 더 바람직하게는, 상기 기생성 원생동물 숙주 세포는 속 레이슈마니아 의 세포이다 . 가장 바람직하게는, 상기 기생성 원생동물 숙주 세포는 레이슈마니아 타렌톨라에 이다.

또한 본 발명은 상술된 재조합 인자 C 단백질을 생산하는 기생성 원생동물 숙주 세포를 생성하는 방법에 의해 수득가능한 기생성 원생동물 숙주세포를 제공하고, 상기 기생성 원생동물 숙주 세포는 이종성 참게 인자 C를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 핵산 분자, 바람직하게는 벡터 또는 플라스미드에 의해 포함되고, 상기 기생성 원생동물 숙주 세포로 도입된다. 바람직하게는, 상기 기생성 원생동물 숙주 세포는 본 발명에 따른 벡터 또는 플라스미드, 즉 , 이종성 참게 인자 C 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 플라스미드를 포함한다. 또한, 상기 기생성 원생동물 숙주 세포는 바람직하게는 동원핵편모충류 기생성 원생동물 숙주 세포이다. 더 바람직하게는, 상기 동원핵편모충류 기생성 원생동물 숙주 세포는 복세대 트리파노소마티드 ( 즉 , 목 트리파노소마티다의 복세대 구성원)이다. 더욱 더 바람직하게는, 상기 기생성 원생동물 숙주 세포는 목 트리파노소마티다의 세포이다. 훨씬 더 바람직하게는, 상기 기생성 원생동물 숙주 세포는 속 레이슈마니아 의 세포이다 . 가장 바람직하게는, 상기 기생성 원생동물 숙주 세포는 레이슈마니아 타렌톨라에 이다.

세포주

본 발명은 또한 개시된 벡터 및/또는 플라스미드에 의해 수득가능한 안정하게 형질주입된 세포주를 제공한다. 바람직하게는, 상기 형질주입된 세포주는 동원핵편모충류 기생성 원생동물 세포의 안정한 형질주입으로부터 수득된 세포주이다. 더 바람직하게는, 상기 형질주입된 세포주는 목 트리파노소마티다의 안정한 형질주입으로부터 수득된 세포주이다. 더 바람직하게는, 상기 형질주입된 세포주는 속 레이슈마니아 의 세포의 안정한 형질주입으로부터 수득된 세포주이다 . 더욱 더 바람직하게는, 상기 형질주입된 세포주는 종 레이슈마니아 타렌톨라에 의 세포의 안정한 형질주입으로부터 수득된 세포주이다.

기타 일반적 정의

일반적으로, 본 명세서에 본 발명의 방법에 따라 생산된 인자 C, 또는 “본 발명의 방법에 따라 수득된 인자 C (Factor C obtained according to a method of the present invention)”, 또는 “본 발명의 인자 (Factor C of the present invention)”에 대한 참조가 본 명세서에 이루어지고, 이러한 참조는 인자 C-유사 효소 활성, 즉, 본 명세서에 기재된 참게로부터 유래된 인자 C와 같은 효소 활성을 갖는 본 발명의 상기 인자 C의 단편, 유사체 또는 기능적 유도체를 포함한다.

본 발명에서, "서열 동일성의 백분율(%) (percentage (%) of sequence identity)"은 비교창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 결정되고, 상기 비교 창에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 부분은 2개의 서열의 최적 정렬에 대한 (첨가 또는 결실을 포함하지 않는) 기준 서열에 비하여 첨가 또는 결실 ( 즉 , 갭)을 포함할 수 있다. 상기 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하고 일치된 위치의 수를 수득하고, 일치된 위치의 수를 비교의 창에서의 위치의 총 수로 나누어, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하여 결정한다. 둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서, 용어 “동일한 (identical)” 또는 백분율 “동일성 (identity)”은 비교창 또는 하기 서열 비교 알고리즘 또는 매뉴얼 정렬 및 가시적 검사의 하나를 사용하여 측정된 명명된 영역에 걸쳐 최대 상응도를 위해 비교하고 정렬하는 경우, 동일하거나 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 서브-서열을 지칭한다. 이러한 서열은 그 후 “실질적으로 동일한 (substantially identical)”이라고 불리운다. 또한 이 정의는 테스트 서열의 보체(complement)를 지칭한다. 선택적으로, 상기 동일성은 약 50개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 길이의 영역에 걸쳐, 또는 더 바람직하게는 75-100개의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 길이의 영역에 걸쳐 존재한다.

서열 비교를 위해, 일반적으로 하나의 서열은 기준 서열로 작동하고, 테스트 서열과 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 테스트 및 기준 서열이 컴퓨터에 들어가고, 서브서열 좌표(coordinate)가 명명되고, 필요하다면, 및 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 명명된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 대안적 파라미터가 명명될 수 있다. 상기 서열 비교 알고리즘은 그 후 상기 프로그램 파라미터에 기초하여, 기준 서열에 대하여 테스트 서열에 대한 백분율 서열 동일성을 계산한다.

용어 핵산 분자과 핵산 서열은 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본 명세서에 논의된 바와 같이, 본 발명의 단백질 및 폴리펩티드의 많은 변이체가 존재한다. 단백질 변이체 및 유도체는 해당 기술분야에서의 통상의 기술자에게 잘 이해되고 아미노산 서열 변형을 포함할 수 있다. 예를 들면, 아미노산 서열 변형은 3개의 클래스 중 하나로 나뉜다: 치환, 삽입 또는 결실 변이체. 삽입은 단일 또는 복수의 아미노산 잔기의 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합 및 내부서열 삽입을 포함한다. 결실은 단백질 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기의 제거를 특징으로 한다. 일반적으로, 약 2 내지 6개의 잔기 이하가 본 발명에 따른 단백질 분자에서 하나의 부위에서 결실된다. 이들 변이체는 보통 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 DNA에서의 뉴클레오티드의 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 제조되어, 상기 변이체를 코딩하는 DNA를 생산하고, 그 이후 본 발명에 따른 재조합 세포 배양에서 DNA를 발현한다.

알려진 서열을 갖는 DNA에서의 소정의 부위에서의 치환 돌연변이를 제조하는 기법은 해당 기술분야에서 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 아미노산 치환은 일반적으로 단일 잔기이나, 한번에 다수의 다른 위치에 일어날 수 있고; 결실은 약 1 내지 30개의 잔기의 범위일 것이다. 결실 또는 삽입은 바람직하게는 인접한 쌍, 즉 , 2개의 잔기의 결실 또는 2개의 잔기의 삽입에서 제조된다. 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합은 최종 구조체에 도달하기 위해 조합될 수 있다. 상기 변이체는 서열을 해독틀로부터 벗어나 위치하지 않아야 하고 바람직하게는 제2 mRNA 구조체를 형성하는 보완 영역을 형성하지 않을 것이다. 치환 변이체는 하나 이상의 아미노산이 제거되고 다른 아미노산 잔기가 그 자리로 삽입되어 보존적 치환이 수득된 것이다. 보존적 치환의 의미는 해당 기술분야에서 통상의 기술자에게 잘 알려져있다.

특정 번역-후 변형은 발현된 폴리펩티드에서의 본 발명의 재조합 숙주 세포의 작용의 결과이다. 글루타미닐 및 아스파라긴 잔기는 자주 번역-후에 대응하는 글루타밀 및 아스파릴 잔기로 탈아미드화된다(deamidate). 대안적으로, 이들 잔기는 온건한 산성 조건에서 탈아미드화된다. 기타 번역-후 번형은 프롤린 및 라이신의 히드록실화, 세린 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 o-아민기의 메틸화, N-말단 아민의 아세틸화, 일부 예에서, C-말단 카르복실의 아미드화를 포함한다. 이러한 번역-후 변형은 또한 본 발명에 의해 고려된다.

용어 "단백질 (protein)" 및 "폴리펩티드 (polypeptide)"는 본 발명에 상호교환적으로 사용된다. 용어 "인자 C 단백질(들)" 및 "인자 C 폴리펩티드(들)"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 특정 구체예가 본 명세서에 기재되는 경우, 상세한 설명의 대응하는 단락/글 구절은 상세한 설명에 기재된 수단 및/또는 방법을 변함없이 참조를 한다. 이러한 맥락에서, “본 발명에 따른 (according to the present invention)”, “본 발명의 (of the present invention)” 및 “본 발명에 의해 제공된 (provided by the present invention)”이 사용된다. 이는 본 발명의 특정 구체예가 특정 단락 또는 특정 구절에 기재되는 것을 의미하고, 참조는 “본 발명에 따른” 또는 “본 발명의” 수단 및/또는 방법에 대하여 이루어지고, 이는 본 상세한 설명에 기재된다. 특정 구체예가 기재된 경우, 이러한 참조는 특정 구체예에 대한 모든 수단 및/또는 방법을 포함하는 것으로 의도되고, 이는 본 상세한 설명에 기재되고, 본 발명에 의해 제공되고 따라서 본 발명의 범위의 부분을 형성한다. 예를 들면, 특정 구체예의 기재가 “본 발명에 따른” 또는 “본 발명의”, 또는 “본 발명에 의해 제공된”을 지칭한다면, 이는 상세한 설명에 기재되고, 본 발명에 의해 제공되고 따라서 본 발명의 범위의 일부분을 형성하는 모든 인자 C 단백질이 특정 구체예에 적용가능하다는 것이 의도된다. 이는 예를 들면, 본 발명에 따른 인자 C 단백질의 단편 및 변이체에 구체적으로 적용되고, 이는 본 발명에서 정의되고, 출원 문장을 통해 기재된 다양한 구체예에 적용가능하다.

앞서 원칙은 "본 발명에 따르면 (according to the present invention)", "본 발명의 (of the present invention)" 및/또는 "본 발명에 의해 제공된 (provided by the present invention)"와 같은 용어를 사용하여 모든 구체예에 적용된다. 이는 본 명세서에 기재된 각각의 구체예가 본 발명의 모든 수단 및/또는 방법을 구체적으로 언급할 수 있지 않다는 것을 말하지 않고 갈 수 있다고, 이는 상세한 설명에 이미 정의되고, 이는 출원 본문에 기재된 다양한 구체예에 적용가능하다. 그렇지 않으면, 각각의 특허 출원은 수백의 기재 페이지를 포함할 것이다.

또한, "다양한 구체예에서 (in various embodiment) " 및 "다양한 기타/추가 구체예에서 (in various other/further embodiment) "는 명백하게 "본 발명의 다양한 구체예에서 (in various embodiments of the present invention) " 및 "본 발명의 다양한 기타/추가 구체예에서 (in various other/further embodiments of the present invention) "를 의미한다.

본 발명은 하기 실시예로 예를 들고, 이는 오직 예시적 속성이고 본 발명의 범위를 임의의 방식 또는 임의의 범위로 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

실시예

실시예 1: 발현 벡터로 인자 C 유전자의 클로닝 및 E. coli DH5 α의 형질전환

발현 벡터로의 인자 C 유전자의 클로닝을 위한 개시점은 타키플레우스 트리텐타투스 로부터 유래된 인자 C 서열이었다 (NCBI Accession Number P28175.1; therein reference 1: Muta et al. 1991, J. Biol. Chem. 266(10):6554-6561). 기탁번호 P28175.1로 보이는 T. 트리텐타투스 로부터 유래된 야생형 인자 C 단백질의 아미노산 서열은 1,019 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 단백질의 발현 및 분비 후 절단되는 선도 서열은 25 아미노산 잔기의 길이를 갖는다 (Accession Number P28175.1에서 보이는 아미노산 서열의 잔기 1-25). 상기 선도 서열이 없는 T. 트리텐타투스 로부터 유래된 야생형 인자 C 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2로 나타낸다. 서열번호 2로 나타낸 T. 트리텐타투스 로부터 유래된 야생형 인자 C 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1로 나타낸다.

서열번호 1의 T. 트리텐타투스 서열은 레이슈마니아 에서의 발현을 위해 코돈-최적화되었다. 생성된 코돈-최적화 서열은 서열번호 3으로 나타낸다. 서열번호 3의 코돈-최적화 튜클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열번호 4로 나타낸다. 코돈-최적화는 원래의 야생형 인자 C 단백질의 아미노산 서열의 변형을 초래하지 않는다. 따라서, 서열번호 4의 아미노산 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열과 동일하다.

서열번호 3의 코돈-최적화 서열을 발현 벡터로 클로닝하고, 결과적으로 수득된 플라스미드를 뒤이어 E. coli DH5α로 형질전환하였다.

실시예 2: 레이슈마니아 의 형질주입 및 클론의 선별

형질주입을 위한 발현 벡터의 제조

레이슈마니아 숙주 세포-특이적 발현 벡터를 제조하였고, 이는 레이슈마니아 숙주 세포에서 표적 단백질의 분비 발현을 위한 신호 펩티드 서열 및 서열번호 3의 코돈-최적화 서열을 포함한다. 레이슈마니아 타렌톨라에 로부터 유래된 분비 신호 펩티드 서열의 아미노산 서열은 서열번호 5로 나타낸다. 레이슈마니아 선도 서열은 당백질의 발현 및 분비 후 절단된다.

레이슈마니아 세포의 형질주입

전기천공에 의한 레이슈마니아 의 형질주입을 포함하는, 다양한 범위의 트리파노소마티드의 안정한 DNA 형질주입이 해당 기술분야에 기재되어 있다 (Beverly and Clayton 1993, Methods Mol. Biol. 21:333-348; Coburn et al. 1991, Mol. Biochem. Parasitol. 46: 169-179). 본 명세서에서, 레이슈마니아 세포의 배양 및 형질주입을 형질주입을 위한 고전압 프로토콜을 적용하여 수행하였다 (Jena Bioscience GmbH, Jena, Germany). 구체적으로, 예비-배양으로부터 수득된 레이슈마니아 세포 ( 레이슈마니아 타렌톨라에 )를 약 6 x 10 ⁷ 세포/ml의 세포 농도에 도달할 때까지(OD 1.4) 배양하였다. 이는 세포가 생명유지에 필수적이고 방울 같은 형상 (drop-like shpae)이라는 것을 현미경으로 확인하였다. 예냉된 세포를 (얼음에) 0.1 - 5 ㎍ 형질전환 DNA를 갖는 튜브에 첨가하고, 혼합하고 전기천공 큐벳에 이동하였다 (얼음). 이는 펄스제어기를 갖는 진펄서(genepulser)를 사용하여 펄스 사이에 (펄스 시간 ca. 0.3 msec.) 10 초로 2번 1,500 V, 25 μF에서 펄스되었다. 상기 큐벳을 10분 동안 얼음에 다시 놓고, 전기천공된 세포를 환기된 조직 배양 플라스크로 옮기고, 정적 현탁 배양으로서 26 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다 (약 20 시간, OD 0.3-0.4).

클론의 선별

클론의 선별을 선택적 항생제로 보충된 고체 배지에 플레이팅하여 수행하였다. 단일 클론을 그 후 선택적 배지에 확장시켰다. 이것을 위하여, 10개까지 클론을 배양 플라스크에 10 ml 각각 배양하였다. 이들 배양물을 평가를 위해 사용하였다.

게놈 DNA을 단리하고 재조합 인자 C 유전자의 삽입을 상기 재조합 인자 C 유전자에 대하여 특이적인 올리고뉴클레오티드를 사용한 PCR에 의해 확인하였다.

유전자 발현을 발현의 유도를 위해 10 ㎍/ml 테트라시클린을 포함하는 신선한 배지에서 배양물을 1:10으로 희석하여 분석하였다. 배양을 26℃에서 어둠에서 3-4일 동안 성장시켰다. 세포를 수집하였다 (3,000 x g , 4℃, 10분). 상기 상청액 중 단백질을 트리클로로아세트산 (trichloroactic acid: TCA) 침전물로 농축하고 SDS-PAGE로 분석하였다.

실시예 3: 재조합 인자 C 단백질의 발현 및 정제

트리파노소마티드 원생동물, 구체적으로 레이슈마니아 에서의 재조합 단백질 발현은 해당 기술분야에 기재된다 (Breitling et al. 2002, Protein Expression and Purification 25:209-218; Basile and Peticca 2009, Mol. Biotechnol. 43:273-278). 본 명세서에서, 발현을 위한 레이슈마니아 의 배양 및 조작 및 인자 C 단백질의 정제를 Jena Bioscience GmbH, Jena, Germany에 의해 제공된 유전자 발현 키트를 사용하여 수행하였다.

3.1 생산 균주의 유지

생산 균주를 어둠에서 26 ℃에서 배양 플라스크에서 10 ml 부피로 배양하였다. 균주를 삽입된 유전자의 선별을 위해 모든 첨가제 및 항생제를 포함하는 신선한 배양 배지에 매 2 - 3일 연속적으로 1:20 또는 1:50으로 희석하였다.

3달 후, 배양된 균주를 폐기하고 새로운 배양을 신선한 글리세롤 스톡으로부터 시작하였다.

3.2 발현

예비-배양을 신선한 배지에서 생산 균주를 1:50으로 희석하고 2-3일 동안 어둠에서 26 ℃ 에서 배양 플라스크에서 인큐베이트하여 설정하였다.

Erlenmeyer 플라스크 중 발현의 유도를 위해 테트라시클린을 포함하는 1.5 l의 배양 배지를 예비-배양의 30 ml에 접종하였다. 발현은 어둠에서 23 ℃에서 일어나고 68 -72 시간 동안 105 rpm으로 흔들었다. 상기 배지 중 글로코스의 농도가 650 mg/L 미만으로 감소된 경우, 헤민 및 글루코스를 첨가하고 상기 배양을 추가 86-72 시간 동안 인큐베이트하였다.

세포를 수집하였다 (4000 x g , 4℃, 30 분). 상기 상청액을 -20℃에서 동결하거나 재조합 인자 C의 정제로서 직접적으로 사용하였다.

3.3 정제

3.3.1 양이온 교환 크로마토그래피

발현물로부터의 상청액을 직접적으로 사용하거나 온화하게 (gently) 해동시켰다. 2 mM EDTA를 첨가한 후, 5.0 내지 5.5의 pH 및 < 5.5 mS/cm의 전도도에 도달할 때까지 상청액을 20 mM 포타슘 아세테이트, 2 mM EDTA pH 5로 희석하였다.

정제를 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 수행하였다. SP650M 칼럼을 평형 버퍼로서 25 mM 포타슘 아세테이트, 2 mM EDTA pH 5, 및 용출 버퍼로서 25 mM 포타슘 아세테이트, 2 mM EDTA, 1 M 포타슘 클로리드 pH 5와 함께 사용하였다.

상청액의 업로딩 (uploading) 후, 칼럼을 우선 평형 버퍼로 세척하고, 그 후 10% 용출 버퍼로 세척하였다. 용출은 50% 용출 버퍼에서 일어난다.

3.3.2 단백질 분석

단백질을 포함하는 분획물을 농도 및 순도에 관해 겔 여과 및 SDS PAGE로 분석하였다.

겔 여과의 경우, 각각의 분획물의 50 ㎕를 0.75 ml/min으로 TSK3000 PW 칼럼에 로딩하였다. 흡수는 220 nm에서 하였다. rFC는 7.4 +/- 0.4 분의 보유 시간으로 피크 최대에서 용출한다.

하기 기준을 충족하는 분획물만 모았다(pool):

1) 6.4 +/- 0.4 분의 보유 시간을 갖는 피크의 피크 면적은 rFC 피크 면적의 10%를 넘지 않아야 한다.

2) 10.3 +/- 0.5 분의 보유 시간을 갖는 피크의 피크 면적은 rFC 피크 면적의 350%를 넘지 않아야 한다.

3) 10.3 +/- 0.5 분의 보유 시간을 갖는 rFC 피크와 피크간의 최소는 9분 내지 10분 사이에 놓어야 하고, 상기 최소의 흡수 값은 rFC 피크의 최대의 흡수 값의 30%를 넘지 않아야 한다.

각각의 분획물 중 rFC의 농도를 rFC 표준 곡선의 도움으로 피크 면적으로 결정하였다. 최종 풀의 농도는 50 ㎍/ml rFC이어야 한다.

3.3.3 투석

1 mM PMSF를 rFC 풀에 첨가하고 상온에서 4시간 동안 인큐베이트하였다. 그 이후 0.1 % Pluronic ^® F-127을 첨가하고 용액을 5 mM 포타슘 아세테이트, 100 mM 포타슘 클로리드, 0.1 % Pluronic ^® F-127, 0.05 mM EDTA pH 5의 5리터에 대하여 4℃에서 희석하였다. 투석을 각각 12시간 동안 3회 수행하였다.

제3 투석 후, rFC 용액을 원심분리하고 (4000 x g , 4℃, 1 시간) 상청액을 5 mM 포타슘 아세테이트, 100 mM 포타슘 클로리드, 0.1 % Pluronic ^® F-127, 0.05 mM EDTA pH 5의 5리터에 대하여 4℃에서 12시간 이상 동안 다시 희석하였다.

3.3.4 저장

투석된 rFC 용액을 멸균 여과하고, 농도를 겔 여과에 에희 결정하고 순도를 SDS 겔로 결정하였다. 상기 용액을 4 ℃에서 저장하였다.

실시예 4: 레이슈마니아 에서 생산된 인자 C 단백질의 비활성의 결정

인자 C의 비활성을 Ding et al. 1993 (Biochimica et Biophysica Acta 1202:149-156)에 기재된 분석에 따라 결정하였다. 이 문헌을 상기 분석을 위해 미국 특허 제5,712,144호에 인용하였고, 참게 C. 로툰디카우다 로부터 단리된 인자 C 단백질의 비활성을 결정하기 위해 사용하였다.

구체적으로, 제1 희석 연속물(serise)을 LPS가 첨가된 반응 버퍼 중 레이슈 마니아 에서 생산된 인자 C 단백질을 희석하여 제조하엿다. 반응 버퍼는 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 및 50 mM MgCl ₂ 를 포함하고, 내독소-없는 초순수 물을 사용하여 제조하였다. LPS를 LPS 스톡 용액(내독소-없는 초순수 물에 용해된 LPS)으로부터의 반응 버퍼에 첨가하였다.

미세역가(microtiter) 플레이트를 제조된 희석물에 로딩하고 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이트하였다. 그 이후, 인자 C 단백질에 대한 기질을 상기 웰에 첨가하고 뒤이어 37 ℃에서 15분 동안 상기 미세역가 플레이트를 배양하였다. 사용된 기질은 Boc-Val-Pro-Arg-AMC이었고, 이는 인자 C 단백질을 위한 형광성 기질이다. Boc-VPR-AMC를 내독소-없는 초순수 물에 용해하고 기질 용액을 제조하고, 이를 상기 기질 용액의 희석을 제조하기 위해 사용하고, 이를 분석에 적용하였다.

얼음 같은 (glacial) 아세트산의 첨가에 의해 반응을 멈춘 후 형광 (RFU)을 측정하였다. 15분 기질 전환 (turnover) 후 37 ℃에서 측정된 rfu 값은 하기 표 1에 요약된다.

표 1: 15 분 기질 전환 후 37 ℃에서 측정된 rfu 값

표 1은 백그라운드(background) rfu 값의 뺄셈 이후 백그라운드보다 더 높은 신호를 갖는 LPS-활성화된 rFC 샘플의 rfu 값을 보여준다.

도 1은 rFC 농도에 의존한 37 ℃에서의 15분 기질 전환 후 측정된 rfu 값의 플롯(plot)을 보여준다. 형광소 (AMC)의 특이적 형광은 기재된 실험 조건에서 6,667 rfu/nmol으로 결정되었다.

rFC 비활성의 계산을 위해, 0.331 ㎍/ml의 rFC 농도를 사용하였다. 이는 미세역가 플레이트 중 웰 당 0.0662 ㎍의 rFC에 해당한다. 이에 따르면, 4,360 rfu/(15 min x 0.0662 ㎍ rFC)를 측정하엿다. 이는 290.67 rfu/(min x 0.0662 ㎍ rFC)에 해당한다. 이는 차례로 4,390,735 rfu/(min x mg rFC)에 해당한다. 이는 추가로 658 nmol/(min x mg rFC)에 해당하고, 차례로 0.658 μmol/(min x mg rFC)에 해당한다.

Ding et al. (1993)에 따르면, 1 단위는 37℃에서 분당 가수분해된 AMC의 μmol로 정의된다. 이 정의 및 앞서 계산에 따르면, 재조합 인자 C는 기재된 분석 조건에서 0.658 Units/mg 단백질의 비활성을 갖는다. 또한 동일한 비활성을 인자 C 단백질의 활성화에 대하여 키모트립신을 사용하는 경우 확인하였다 (데이터 미도시).

분석 셋업으로부터 명백하게 되어, 비활성을 LPS에 의해 활성화된 인자 C 단백질을 사용하여 결정하였다. 따라서, 이 실험은 레이슈마니아 에서 생산된 인자 C가 LPS에 의해 활성화되고, 활성화된 인자 C 단백질이 효소적으로 활성이고, 즉 , 가수분해 활성을 나타낸다는 것을 보인다.

실시예 5: 비-환원 조건 및 환원 조건 하에 SDS-PAGE에서 인자 C 단백질의 분자량의 결정

레이슈마니아 에서 생산된 인자 C 단백질의 분자량을 비-환원 및 환원 조건에서 결정하였다(SDS-PAGE). 50 ㎕의 환원된 rFC 샘플 및 비환원된 rFC 샘플 및 20 ㎕ 분자량 기준을 10 track VarioGel (4-12%)에 로딩하였다. 전기영동을 수직 겔 전기영동 쳄버에서 수행한 후, 상기 겔을 제조자의 프로토콜에 따라 바로 사용할 수 있는 (ready-to-use) PageBlue ^TM 단백질 염색 용액 (Fermentas)으로 염색하였다.

Rf 값을 단백질 밴드의 이동 거리(cm)를 겔 앞 (gel front)으로부터 전체 이동 거리(cm)로 나누어 계산하였다. 마커 단백질의 Rf 값을 상기 마커 단백질의 분자량에 대하여 도시하였다. 결과적으로 수득된 곡선을 로그 피팅 알고리즘 (logarithmic fitting algorithm)으로 피팅하였다. 각각 비환원 및 환원 조건에서 정제된 인자 C 단백질의 분자량을 형성된 표준 곡선 피팅 등식에 기초하여 계산하였다. 상기 등식에 따르면, 하기 분자량을 인자 C에 대하여 계산하였다:

표 2: 비환원 및 환원 SDS PAGE 운영 (running) 조건에서의 정제된 인자 C의 Rf 값

2-쇄 형태의 인자 C 단백질은 비환원 조건 (rFC ox)에서 SDS-PAGE에 의해 결정된 102 kDa의 분자량을 갖는다. 환원 조건에서, 69 kDa의 분자량이 H-쇄 (rFC red 1)으로 결정되고, 37 kDa의 분자량이 L-쇄 (rFC red 2)으로 결정되었다. 환원 조건(rFC red 1 + rFC red 2)에서 H-쇄 및 L-쇄의 분자량은 106 kDa (글리코실화 포함)으로 합쳐진다.

<110> MicroCoat Biotechnologie GmbH <120> Novel method for recombinant production of horseshoe crab Factor C protein <130> PCT82127FZ210pau <150> US 61/734,002 <151> 2012-12-06 <150> EP12195742.7 <151> 2012-12-05 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2982 <212> DNA <213> Tachypleus tridentatus <400> 1 agaggagtag atctgggctt gtgtgatgaa acgaggttcg agtgtaagtg tggagatcca 60 ggctatgtgt tcaacgtccc tatgaaacaa tgcacgtact tctatcgatg gaggccttat 120 tgtaaaccat gtgatgacct ggaggctaag gacatttgtc caaagtacaa acgatgtcaa 180 gagtgtaagg ctggtcttga tagttgtgtt acttgtccac ctaacaaata tggtacttgg 240 tgtagcggtg aatgtcaatg taagaatgga ggtatctgtg accagaggac aggagcttgt 300 acctgtcgtg acagatatga aggagcgcac tgtgaaattc tcaaaggttg tcctcttctt 360 ccatcggatt ctcaagttca ggaagtcaga aacccaccag ataatcccca aactattgac 420 tacagctgtt caccagggtt caagcttaaa ggcgtggcac gaattagctg tctcccaaat 480 ggacagtgga gtagctttcc acccaaatgt attcgagaat gtgccaaggt ttcatctcca 540 gaacacggga aagtgaatgc tcctagtggc aatatgatag aaggggctac tttacggt tc 600 tcatgtgata gtccctacta cttgattggt caagaaacat taacctgcca gggtaatggt 660 cagtggagtg gacaaatacc acaatgtaag aagttggtct tctgtcctga ccttgatcct 720 gtaaaccatg ctgaacacca ggttaaaatt ggtgtggaac aaaaatatgg tcagtttcct 780 caaggcactg aagtgaccta tacgtgttcg ggtaactact tcttgatggg ttttaacacc 840 ttaaaatgta accctgatgg gtcctggtca ggatcacagc catcctgtgt taaagtggca 900 gacagagagg tcgactgtga cagtaaagct gtagacttct tggatgatgt tggtgaacct 960 gtcaggatcc actgtcctgc tggctgttct ttgacagctg gtactgtgtg gggtacagcc 1020 atataccacg aactttcctc agtgtgtcgt gcagccatcc atgctggcaa gcttccaaac 1080 tctggagggg cggtgcatgt agtgaacaat ggcccctact cggactttct gggtagtgac 1140 ctgaatggga taaaatcgga agagttgaag tctcttgccc gcagttttcg atttgattat 1200 gtcagttcat ccacagcagg tagatcagga tgtcctgatg gatggtttga ggtagaagag 1260 aactgtgtgt acgttacatc aaaacagaga gcctgggaaa gagctcaagg tgtgtgtacc 1320 aatatggctg ctcgtcttgc tgtgctagac aaagatctaa ttccgagttc cttgactgag 1380 actctacgag ggaaagggtt aacaaccaca tggataggat tgcacagact agatgctgag 1440 aagcc ctttg tttgggagct aatggatcgt agtaatgtgg ttctgaatga taacctaaca 1500 ttctgggcct ctggcgaacc tggaaatgaa actaactgtg tatatctgga catccgagat 1560 cagctgcagc ctgtgtggaa aaccaagtca tgttttcagc cctcaagctt tgcttgcatg 1620 atggatttgt cagacagaaa taaagccaaa tgcgatgacc ctggaccact ggaaaatgga 1680 cacgccacac ttcatggaca aagtattgat gggttctatg ctggttcttc tataaggtac 1740 agctgtgagg ttctccacta cctcagtgga actgagaccg taacttgtac aacaaatggc 1800 acatggagtg ctcctaaacc tcgatgtatc aaagtcatca cctgccaaaa ccctcctgta 1860 ccatcatatg gttctgtgga aatcaaaccc ccaagtcgga caaactcgat cagtcgtgtt 1920 gggtcacctt tcttgaggtt gccacggtta cccctcccat tagccagagc agccaaacct 1980 cctccaaaac ctagatcctc acaaccctct actgtggact tggcttctaa agttaaacta 2040 cctgaaggtc attaccgggt agggtctcga gccatttaca cgtgcgagtc gagatactac 2100 gaactacttg gatctcaagg cagaagatgt gactctaatg gaaactggag tggtcggccc 2160 gctagctgta ttccagtttg tggacggtca gactctcctc gttctccttt catctggaat 2220 gggaattcta cagaaatagg tcagtggccg tggcaggcag gaatctctcg atggcttgca 2280 gaccacaata tgtggtttct ccagtgtgga ggatccctat tgaatgagaa atggatcgtc 2340 actgctgccc actgtgtcac ctactctgct actgctgaga taattgatcc cagtcagttt 2400 aaaatctatc tgggcaagta ctaccgtgat gacagtagag acgatgacta cgtacaagta 2460 agagaggctc tcgagatcca cgtaaatcct aactacgacc ccggcaatct caactttgac 2520 atagccctaa ttcaactgaa aactcctgtt actttgacaa cacgagtcca accaatctgt 2580 ctgcctactg acatcacaac aagagaacac ttgaaggagg gaacattagc agtggtgaca 2640 ggttggggtt tgaatgaaaa caacacatat tcagagatga ttcaacaagc tgtgctacct 2700 gttgttgcag caagcacctg tgaagagggg tacaaggaag cagacttacc actgacagta 2760 acagagaaca tgttctgtgc aggttacaag aagggacgtt atgatgcctg cagtggggac 2820 agtggaggac cattagtgtt tgctgatgat tcccgtaccg aaaggcggtg ggtcttggaa 2880 gggattgtca gctggggcag tcccagtgga tgtggcaagg ctaaccagta tgggggcttc 2940 actaaagtta acgtttttct atcatggatt aggcagttca tt 2982 <210> 2 <211> 994 <212> PRT <213> Tachypleus tridentatus <400> 2 Arg Gly Val Asp Leu Gly Leu Cys Asp Glu Thr Arg Phe Glu Cys Lys 1 5 10 15 Cys Gly Asp Pro Gly Tyr Val Phe Asn Val Pro Met Lys Gln Cys Thr 20 25 30 Tyr Phe Tyr Arg Trp Arg Pro Tyr Cys Lys Pro Cys Asp Asp Leu Glu 35 40 45 Ala Lys Asp Ile Cys Pro Lys Tyr Lys Arg Cys Gln Glu Cys Lys Ala 50 55 60 Gly Leu Asp Ser Cys Val Thr Cys Pro Pro Asn Lys Tyr Gly Thr Trp 65 70 75 80 Cys Ser Gly Glu Cys Gln Cys Lys Asn Gly Gly Ile Cys Asp Gln Arg 85 90 95 Thr Gly Ala Cys Thr Cys Arg Asp Arg Tyr Glu Gly Ala His Cys Glu 100 105 110 Ile Leu Lys Gly Cys Pro Leu Leu Pro Ser Asp Ser Gln Val Gln Glu 115 120 125 Val Arg Asn Pro Pro Asp Asn Pro Gln Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Ser 130 135 140 Pro Gly Phe Lys Leu Lys Gly Val Ala Arg Ile Ser Cys Leu Pro Asn 145 150 155 160 Gly Gln Trp Ser Ser Phe Pro Pro Lys Cys Ile Arg Glu Cys Ala Lys 165 170 175 Val Ser Ser Pro Glu His Gly Lys Val Asn Ala Pro Ser Gly Asn Met 180 185 190 Ile Glu Gly Ala Thr Leu Arg Phe Ser Cys Asp Ser Pro Tyr Tyr Leu 195 200 205 Ile Gly Gln Glu Thr Leu Thr Cys Gln Gly Asn Gly Gln Trp Ser Gly 210 215 220 Gln Ile Pro Gln Cys Lys Lys Leu Val Phe Cys Pro Asp Leu Asp Pro 225 230 235 240 Val Asn His Ala Glu His Gln Val Lys Ile Gly Val Glu Gln Lys Tyr 245 250 255 Gly Gln Phe Pro Gln Gly Thr Glu Val Thr Tyr Thr Cys Ser Gly Asn 260 265 270 Tyr Phe Leu Met Gly Phe Asn Thr Leu Lys Cys Asn Pro Asp Gly Ser 275 280 285 Trp Ser Gly Ser Gln Pro Ser Cys Val Lys Val Ala Asp Arg Glu Val 290 295 300 Asp Cys Asp Ser Lys Ala Val Asp Phe Leu Asp Asp Val Gly Glu Pro 305 310 315 320 Val Arg Ile His Cys Pro Ala Gly Cys Ser Leu Thr Ala Gly Thr Val 325 330 335 Trp Gly Thr Ala Ile Tyr His Glu Leu Ser Ser Val Cys Arg Ala Ala 340 345 350 Ile His Ala Gly Lys Leu Pro Asn Ser Gly Gly Ala Val His Val Val 355 360 365 Asn Asn Gly Pro Tyr Ser Asp Phe Leu Gly Ser Asp Leu Asn Gly Ile 370 375 380 Lys Ser Glu Glu Leu Lys Ser Leu Ala Arg Ser Phe Arg Phe Asp Tyr 385 390 395 400 Val Ser Ser Ser Thr Ala Gly Arg Ser Gly Cys Pro Asp Gly Trp Phe 405 410 415 Glu Val Glu Glu Asn Cys Val Tyr Val Thr Ser Lys Gln Arg Ala Trp 420 425 430 Glu Arg Ala Gln Gly Val Cys Thr Asn Met Ala Ala Arg Leu Ala Val 435 440 445 Leu Asp Lys Asp Leu Ile Pro Ser Ser Leu Thr Glu Thr Leu Arg Gly 450 455 460 Lys Gly Leu Thr Thr Thr Trp Ile Gly Leu His Arg Leu Asp Ala Glu 465 470 475 480 Lys Pro Phe Val Trp Glu Leu Met Asp Arg Ser Asn Val Val Leu Asn 485 490 495 Asp Asn Leu Thr Phe Trp Ala Ser Gly Glu Pro Gly Asn Glu Thr Asn 500 505 510 Cys Val Tyr Leu Asp Ile Arg Asp Gln Leu Gln Pro Val Trp Lys Thr 515 520 525 Lys Ser Cys Phe Gln Pro Ser Ser Phe Ala Cys Met Met Asp Leu Ser 530 535 540 Asp Arg Asn Lys Ala Lys Cys Asp Asp Pro Gly Pro Leu Glu Asn Gly 545 550 555 560 His Ala Thr Leu His Gly Gln Ser Ile Asp Gly Phe Tyr Ala Gly Ser 565 570 575 Ser Ile Arg Tyr Ser Cys Glu Val Leu His Tyr Leu Ser Gly Thr Glu 580 585 590 Thr Val Thr Cys Thr Thr Asn Gly Thr Trp Ser Ala Pro Lys Pro Arg 595 600 605 Cys Ile Lys Val Ile Thr Cys Gln Asn Pro Pro Val Pro Ser Tyr Gly 610 615 620 Ser Val Glu Ile Lys Pro Pro Ser Arg Thr Asn Ser Ile Ser Arg Val 625 630 635 640 Gly Ser Pro Phe Leu Arg Leu Pro Arg Leu Pro Leu Pro Leu Ala Arg 645 650 655 Ala Ala Lys Pro Pro Pro Lys Pro Arg Ser Ser Gln Pro Ser Thr Val 660 665 670 Asp Leu Ala Ser Lys Val Lys Leu Pro Glu Gly His Tyr Arg Val Gly 675 680 685 Ser Arg Ala Ile Tyr Thr Cys Glu Ser Arg Tyr Tyr Glu Leu Leu Gly 690 695 700 Ser Gln Gly Arg Arg Cys Asp Ser Asn Gly Asn Trp Ser Gly Arg Pro 705 710 715 720 Ala Ser Cys Ile Pro Val Cys Gly Arg Ser Asp Ser Pro Arg Ser Pro 725 730 735 Phe Ile Trp Asn Gly Asn Ser Thr Glu Ile Gly Gln Trp Pro Trp Gln 740 745 750 Ala Gly Ile Ser Arg Trp Leu Ala Asp His Asn Met Trp Phe Leu Gln 755 760 765 Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His 770 775 780 Cys Val Thr Tyr Ser Ala Thr Ala Glu Ile Ile Asp Pro Ser Gln Phe 785 790 795 800 Lys Ile Tyr Leu Gly Lys Tyr Tyr Arg Asp Asp Ser Arg Asp Asp Asp 805 810 815 Tyr Val Gln Val Arg Glu Ala Leu Glu Ile His Val Asn Pro Asn Tyr 820 825 830 Asp Pro Gly Asn Leu Asn Phe Asp Ile Ala Leu Ile Gln Leu Lys Thr 835 840 845 Pro Val Thr Leu Thr Thr Arg Val Gln Pro Ile Cys Leu Pro Thr Asp 850 855 860 Ile Thr Thr Arg Glu His Leu Lys Glu Gly Thr Leu Ala Val Val Thr 865 870 875 880 Gly Trp Gly Leu Asn Glu Asn Asn Thr Tyr Ser Glu Met Ile Gln Gln 885 890 895 Ala Val Leu Pro Val Val Ala Ala Ser Thr Cys Glu Glu Gly Tyr Lys 900 905 910 Glu Ala Asp Leu Pro Leu Thr Val Thr Glu Asn Met Phe Cys Ala Gly 915 920 925 Tyr Lys Lys Gly Arg Tyr Asp Ala Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro 930 935 940 Leu Val Phe Ala Asp Asp Ser Arg Thr Glu Arg Arg Trp Val Leu Glu 945 950 955 960 Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Pro Ser Gly Cys Gly Lys Ala Asn Gln 965 970 975 Tyr Gly Gly Phe Thr Lys Val Asn Val Phe Leu Ser Trp Ile Arg Gln 980 985 990 Phe Ile <210> 3 <211> 2982 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of synthetic Factor C gene (nucleotide sequence of Factor C from Tachypleus tridentatus codon optimized for expression in Leishmania) <400> 3 aggggtgtgg acctgggcct gtgcgacgag acccgcttcg agtgcaagtg cggcgacccg 60 ggctacgtgt tcaacgtgcc gatgaagcag tgcacgtact tctaccgctg gcgcccgtac 120 tgcaagccgt gcgacgacct ggaggcgaag gacatctgcc cgaagtacaa gcgctgccag 180 gagtgcaagg cgggcctgga cagctgcgtg acgtgcccgc cgaacaagta cggcacgtgg 240 tgcagcggcg agtgccagtg caagaacggt ggcatctgcg atcagcgcac gggcgcgtgc 300 acatgccgcg atcgctacga gggcgcgcac tgcgagatcc tgaagggctg cccgctgctg 360 ccgagcgaca gccaggtgca ggaggtgcgc aacccgccgg acaacccgca gacgatcgac 420 tactcgtgca gccccggctt caagctcaag ggcgtggcgc gcatcagctg cctcccgaac 480 ggtcagtggt cgagcttccc gccgaagtgc atccgcgagt gcgcgaaggt gagcagcccg 540 gagcacggca aggtgaacgc gccgagcggc aacatgatcg agggcgcgac gctgcgcttc 600 agctgcgaca gcccgtacta cctgatcggc caggagaccc tgacctgcca gggcaacggc 660 cagtggagcg gccagatccc gcagtgcaag aagctggtct tctgcccgga cctggacccg 720 gtgaaccacg cggagcacca ggtgaagatc ggcgtggagc agaagtacgg ccagttcccg 780 cagggcacgg aggtgacgta cacgtgcagc ggcaactact tcctgatggg cttcaacacg 840 ctgaagtgca acccggacgg tagctggtcg ggcagccagc cgtcctgcgt gaaggtggcg 900 gaccgcgagg tggactgcga cagcaaggcg gtggacttcc tggacgacgt gggcgagccg 960 gtgcgcatcc actg cccggc tggctgcagc ctgacagcgg gcacggtgtg gggcacggcg 1020 atctaccacg agctgtcgag cgtgtgccgc gctgcgatcc acgcgggcaa gctgccgaac 1080 agcggcggtg cggtgcacgt ggtgaacaac ggcccgtaca gcgacttcct gggcagcgac 1140 ctgaacggca tcaagagcga ggagctgaag agcctggccc gcagcttccg cttcgactac 1200 gtgagcagca gcacggctgg tcgcagcggc tgcccggacg gctggttcga ggtggaggag 1260 aactgcgtct acgtcacgag caagcagcgc gcgtgggagc gcgcgcaggg cgtgtgcacg 1320 aacatggcgg ctcgcctggc cgtgctggac aaggacctga tcccgagcag cctgacggag 1380 accctgcgcg gcaagggcct gacgacgacg tggatcggcc tgcaccgcct ggacgcggag 1440 aagccgttcg tgtgggagct gatggaccgc agcaacgtgg tgctgaacga caacctgacg 1500 ttctgggcga gcggcgagcc gggcaacgag accaactgcg tgtacctgga catccgcgac 1560 cagctgcagc cggtgtggaa gacgaagagc tgcttccagc cgagctcctt cgcgtgcatg 1620 atggacctga gcgaccgcaa caaggcgaag tgcgacgacc cgggtccgct ggagaacggc 1680 cacgcgacgc tgcacggcca gagcatcgac ggcttctacg cgggcagcag catccgctac 1740 agctgcgagg tgctgcacta cctgagcggc acggagaccg tgacgtgcac gacgaacggc 1800 acgtggtccg cgccgaagcc gcgctgcatc aaggtgatca cgtgccagaa cccgccggtg 1860 ccgagctacg gcagcgtgga gatcaagccg ccgtcgcgca cgaactcgat tagccgcgtg 1920 ggctcgccgt tcctgcgtct gccacgcctc ccactgccgc tggctcgtgc ggccaagccg 1980 ccaccgaagc cacgcagcag ccagccgagc acggtggacc tggccagcaa ggtgaagctg 2040 ccggagggcc actaccgcgt gggctcgcgc gcgatctaca cgtgcgagag ccgctactac 2100 gagctgctgg gcagccaggg tcgtcgctgc gacagcaacg gcaactggag cggtcgcccg 2160 gctagctgca tcccggtgtg cggtcgcagc gactccccgc gctcgccgtt catctggaac 2220 ggcaacagca cggagatcgg tcagtggccc tggcaggcgg gcatcagccg ctggctggcc 2280 gaccacaaca tgtggttcct ccagtgcggc ggcagcctgc tgaacgagaa gtggattgtg 2340 acggcggctc actgcgtgac gtactcggcg acggccgaga tcatcgaccc gagccagttc 2400 aagatctacc tgggcaagta ctaccgcgac gacagccgcg acgacgacta cgtgcaggtg 2460 cgcgaggcgc tggagatcca cgtgaacccg aactacgacc cgggcaacct gaacttcgat 2520 atcgcgctga tccagctcaa gacgccggtg acgctgacga cgcgcgtgca gccgatctgc 2580 ctgccgacgg acatcacgac gcgcgagcac ctgaaggagg gcacgctggc cgtcgtgacg 2640 ggctggggcc tgaacgagaa caaca cgtac agcgagatga tccagcaggc ggtgctgccg 2700 gtggtggcgg cgagcacgtg cgaggagggc tacaaggagg cggacctgcc gctgacggtg 2760 acggagaaca tgttctgcgc gggctacaag aagggccgct acgacgcctg cagcggtgac 2820 agcggcggtc cgctggtgtt cgcggacgac agccgcacgg agcgccgctg ggtgctggag 2880 ggcatcgtga gctggggcag cccgagcggt tgcggcaagg cgaaccagta cggcggcttc 2940 acgaaggtga acgtgttcct cagctggatc cgccagttta tc 2982 <210> 4 <211> 994 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of synthetic Factor C protein (amino acid sequence encoded by the codon optimized nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3) <400> 4 Arg Gly Val Asp Leu Gly Leu Cys Asp Glu Thr Arg Phe Glu Cys Lys 1 5 10 15 Cys Gly Asp Pro Gly Tyr Val Phe Asn Val Pro Met Lys Gln Cys Thr 20 25 30 Tyr Phe Tyr Arg Trp Arg Pro Tyr Cys Lys Pro Cys Asp Asp Leu Glu 35 40 45 Ala Lys Asp Ile Cys Pro Lys Tyr Lys Arg Cys Gln Glu Cys Lys Ala 50 55 60 Gly Leu Asp Ser Cys Val Thr Cys Pro Pro Asn Lys Tyr Gly Thr Trp 65 70 75 80 Cys Ser Gly Glu Cys Gln Cys Lys Asn Gl y Gly Ile Cys Asp Gln Arg 85 90 95 Thr Gly Ala Cys Thr Cys Arg Asp Arg Tyr Glu Gly Ala His Cys Glu 100 105 110 Ile Leu Lys Gly Cys Pro Leu Leu Pro Ser Asp Ser Gln Val Gln Glu 115 120 125 Val Arg Asn Pro Pro Asp Asn Pro Gln Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Ser 130 135 140 Pro Gly Phe Lys Leu Lys Gly Val Ala Arg Ile Ser Cys Leu Pro Asn 145 150 155 160 Gly Gln Trp Ser Ser Phe Pro Pro Lys Cys Ile Arg Glu Cys Ala Lys 165 170 175 Val Ser Ser Pro Glu His Gly Lys Val Asn Ala Pro Ser Gly Asn Met 180 185 190 Ile Glu Gly Ala Thr Leu Arg Phe Ser Cys Asp Ser Pro Tyr Tyr Leu 195 200 205 Ile Gly Gln Glu Thr Leu Thr Cys Gln Gly Asn Gly Gln Trp Ser Gly 210 215 220 Gln Ile Pro Gln Cys Lys Lys Leu Val Phe Cys Pro Asp Leu Asp Pro 225 230 235 240 Val Asn His Ala Glu His Gln Val Lys Ile Gly Val Glu Gln Lys Tyr 245 250 255 Gly Gln Phe Pro Gln Gly Thr Glu Val Thr Tyr Thr Cys Ser Gly Asn 260 265 270 Tyr Phe Leu Met Gly Phe Asn Thr Leu Lys Cys Asn Pro Asp Gly Ser 275 280 285 Trp Ser Gly Ser Gln Pro Ser Cys Val Lys Val A la Asp Arg Glu Val 290 295 300 Asp Cys Asp Ser Lys Ala Val Asp Phe Leu Asp Asp Val Gly Glu Pro 305 310 315 320 Val Arg Ile His Cys Pro Ala Gly Cys Ser Leu Thr Ala Gly Thr Val 325 330 335 Trp Gly Thr Ala Ile Tyr His Glu Leu Ser Ser Val Cys Arg Ala Ala 340 345 350 Ile His Ala Gly Lys Leu Pro Asn Ser Gly Gly Ala Val His Val Val 355 360 365 Asn Asn Gly Pro Tyr Ser Asp Phe Leu Gly Ser Asp Leu Asn Gly Ile 370 375 380 Lys Ser Glu Glu Leu Lys Ser Leu Ala Arg Ser Phe Arg Phe Asp Tyr 385 390 395 400 Val Ser Ser Ser Thr Ala Gly Arg Ser Gly Cys Pro Asp Gly Trp Phe 405 410 415 Glu Val Glu Glu Asn Cys Val Tyr Val Thr Ser Lys Gln Arg Ala Trp 420 425 430 Glu Arg Ala Gln Gly Val Cys Thr Asn Met Ala Ala Arg Leu Ala Val 435 440 445 Leu Asp Lys Asp Leu Ile Pro Ser Ser Leu Thr Glu Thr Leu Arg Gly 450 455 460 Lys Gly Leu Thr Thr Thr Trp Ile Gly Leu His Arg Leu Asp Ala Glu 465 470 475 480 Lys Pro Phe Val Trp Glu Leu Met Asp Arg Ser Asn Val Val Leu Asn 485 490 495 Asp Asn Leu Thr Phe Trp Ala Ser Gly Glu Pro G ly Asn Glu Thr Asn 500 505 510 Cys Val Tyr Leu Asp Ile Arg Asp Gln Leu Gln Pro Val Trp Lys Thr 515 520 525 Lys Ser Cys Phe Gln Pro Ser Ser Phe Ala Cys Met Met Asp Leu Ser 530 535 540 Asp Arg Asn Lys Ala Lys Cys Asp Asp Pro Gly Pro Leu Glu Asn Gly 545 550 555 560 His Ala Thr Leu His Gly Gln Ser Ile Asp Gly Phe Tyr Ala Gly Ser 565 570 575 Ser Ile Arg Tyr Ser Cys Glu Val Leu His Tyr Leu Ser Gly Thr Glu 580 585 590 Thr Val Thr Cys Thr Thr Asn Gly Thr Trp Ser Ala Pro Lys Pro Arg 595 600 605 Cys Ile Lys Val Ile Thr Cys Gln Asn Pro Pro Val Pro Ser Tyr Gly 610 615 620 Ser Val Glu Ile Lys Pro Pro Ser Arg Thr Asn Ser Ile Ser Arg Val 625 630 635 640 Gly Ser Pro Phe Leu Arg Leu Pro Arg Leu Pro Leu Pro Leu Ala Arg 645 650 655 Ala Ala Lys Pro Pro Pro Lys Pro Arg Ser Ser Gln Pro Ser Thr Val 660 665 670 Asp Leu Ala Ser Lys Val Lys Leu Pro Glu Gly His Tyr Arg Val Gly 675 680 685 Ser Arg Ala Ile Tyr Thr Cys Glu Ser Arg Tyr Tyr Glu Leu Leu Gly 690 695 700 Ser Gln Gly Arg Arg Cys Asp Ser Asn Gly Asn Trp S er Gly Arg Pro 705 710 715 720 Ala Ser Cys Ile Pro Val Cys Gly Arg Ser Asp Ser Pro Arg Ser Pro 725 730 735 Phe Ile Trp Asn Gly Asn Ser Thr Glu Ile Gly Gln Trp Pro Trp Gln 740 745 750 Ala Gly Ile Ser Arg Trp Leu Ala Asp His Asn Met Trp Phe Leu Gln 755 760 765 Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His 770 775 780 Cys Val Thr Tyr Ser Ala Thr Ala Glu Ile Ile Asp Pro Ser Gln Phe 785 790 795 800 Lys Ile Tyr Leu Gly Lys Tyr Tyr Arg Asp Asp Ser Arg Asp Asp Asp 805 810 815 Tyr Val Gln Val Arg Glu Ala Leu Glu Ile His Val Asn Pro Asn Tyr 820 825 830 Asp Pro Gly Asn Leu Asn Phe Asp Ile Ala Leu Ile Gln Leu Lys Thr 835 840 845 Pro Val Thr Leu Thr Thr Arg Val Gln Pro Ile Cys Leu Pro Thr Asp 850 855 860 Ile Thr Thr Arg Glu His Leu Lys Glu Gly Thr Leu Ala Val Val Thr 865 870 875 880 Gly Trp Gly Leu Asn Glu Asn Asn Thr Tyr Ser Glu Met Ile Gln Gln 885 890 895 Ala Val Leu Pro Val Val Ala Ala Ser Thr Cys Glu Glu Gly Tyr Lys 900 905 910 Glu Ala Asp Leu Pro Leu Thr Val Thr Glu Asn Met P he Cys Ala Gly 915 920 925 Tyr Lys Lys Gly Arg Tyr Asp Ala Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro 930 935 940 Leu Val Phe Ala Asp Asp Ser Arg Thr Glu Arg Arg Trp Val Leu Glu 945 950 955 960 Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Pro Ser Gly Cys Gly Lys Ala Asn Gln 965 970 975 Tyr Gly Gly Phe Thr Lys Val Asn Val Phe Leu Ser Trp Ile Arg Gln 980 985 990 Phe Ile <210> 5 <211> 23 <212> PRT <213> Leishmania tarentolae <400> 5 Met Ala Ser Arg Leu Val Arg Val Leu Ala Ala Ala Met Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Ala Val Ser Val Asp Ala 20