链球菌C5a肽酶疫苗 |
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| 申请号 | CN99814192.5 | 申请日 | 1999-12-03 | 公开(公告)号 | CN1329669A | 公开(公告)日 | 2002-01-02 |
| 申请人 | 明尼苏达大学董事会; | 发明人 | 保罗·帕特里克·克利里; 德博拉·K·斯塔夫斯林; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种用于抗β－溶血链球菌集群或感染的新型 疫苗 。这种疫苗包含一种具有免疫原量的链球菌C5a肽酶的突变体(SCP),同时也提供了一种通过使用此种疫苗保护易感的 哺乳动物 抗β－溶血链球菌集群或感染的方法,并对无酶活性的SCP和编码SCP蛋白多聚核糖核基酸也进行了披露。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种包含了免疫原量的链球菌C5a肽酶(SCP)疫苗，其中的SCP 是野生型SCP的突变体，其含量与一种生理上可以接受的无毒性赋形剂 组合，可以有效的免疫易感哺乳动物抗β-溶血性链球菌。 |
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| 说明书全文 | 发明背景有数种不同的β-溶血性链球菌属已经被鉴定。酿脓链球菌 (Streptococcus pyogene)，也称为A群链球菌，是人体一种常见的细菌性 病原体。它基本上是一种儿童疾病，在人体中引发许多感染性疾病，包 括咽炎、脓疱病和败血症。感染之后，在人体中可能发生自身免疫性并 发症，例如风湿病和急性肾小球性肾炎。该病原体还能引起严重的急性 疾病例如猩红热，坏死性筋膜炎以及中毒性休克。 由A群链球菌引起的咽喉痛，通常称为链球菌咽炎(strep throat)，一 般在医疗实践中至少占全部门诊的16％，这取决于季节因素。参阅 Hope-Simpson，E.，“小人群中的一项研究，咽喉中的酿脓链球菌 (Streptococcus pyogene)，1962-1975”，剑桥卫生学杂志(J.Hyg.Camb.)， 87：109-129(1981)。此属链球菌还是坏死性筋膜炎相关性中毒性休克最近 在北美洲和其它四大洲重现的原因。参阅Stevens，D.L.，“侵入性A群 链球菌感染”，临床传染病学(Clin.Infect.Dis.)，14：2-13(1992)。同时 也暗示C群和G群链球菌还引起链球菌咽炎(strep throat)并偶尔引起中毒 性休克。Hope-Simpson，E.，“小人群中的一项研究，咽喉中的酿脓链球 菌，1962-1975”，剑桥卫生学杂志(J.Hyg.Camb.)，87：109-129(1981)。 B群链球菌，又称为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，引起新 生儿败血症和脑膜炎。参阅T.R.Martin等，“类型特异性多糖包膜对于 B群链球菌从幼儿期及成年期大鼠的肺中清除的效应”，传染病学杂志(J. Infect.Dis.)，165：306-314(1992)。通常成年雌性阴道粘膜菌群的成员在 分娩期间感染以后，有0.1-0.5/1000的新生儿发展成严重的疾病。尽管B 群链球菌感染有高死亡率，但对致病机制却懂得很少。参阅Martin，T.R.， 等，“类型特异性多糖包膜对于B群链球菌从幼儿期及成年期大鼠肺中被 清除的效应”，传染病学杂志(J.Infect.Dis.)，165：306-314(1992)。 链球菌感染目前用抗体疗法治疗。然而，25-30％的接受治疗者有复 发可能和/或在粘膜分泌液中流出此生物体，到目前为止还没有方法可以 预防链球菌感染。历史上，链球菌疫苗开发的热点是细菌细胞表面M蛋 白。参阅Bessen，D.，等“用对应于M蛋白保守性表位的合成肽进行鼻内 免疫对A群链球菌在粘膜的集群的影响”，感染与免疫(Infect.Immun.). 56：2666-2672(1988)和Bronze，M.S.，等，“小鼠局部给药A群链球菌疫 苗引起的保护性免疫”，免疫学杂志(Journal of Immunology).141：2767- 2770(1988)。 两个主要的问题将会限制M蛋白疫苗的使用、销售，也可能限制美 国食品与药品监督局的批准。首先，酿脓链球菌存在超过80种不同的M 血清型，并不断出现新的血清型。参阅Fischetti，VA.，等，“链球菌M 蛋白：分子设计和生物行为”，临床微生物学评论(Clin.Microbiol. Rev.)，2：285-314(1989)。因此，用一种血清型特异性M蛋白接种将不能 有效地防御其它的血清型。第二个问题涉及M蛋白疫苗的安全性。M蛋 白有20多个区域含有与人体组织特别是心脏组织具有免疫交叉反应性的 抗原表位。M蛋白的N-末端在序列和抗原特异性方面高度可变。为了获 得广泛的抗A群链球菌感染的保护作用，在疫苗中必须包括代表该可变 序列的超过80种不同的肽。新的M蛋白突变体将继续产生，这就必须 进行链球菌性疾病的监测并改变疫苗组成。相反地，M蛋白的羧基端在 序列上是保守的。然而，M蛋白的这个区域含有与人心脏组织具有免疫 交叉反应性的氨基酸序列。M蛋白的这个性质被认为能解释风湿热相关 性心脏瓣膜损伤。参阅P.Fenderson等，“原肌球蛋白与A群链球菌M 蛋白共有的免疫表位”，免疫学杂志(J.Immunol.)142：2475-248 (1989)。在早期的一项试验当中，1979年接种过M蛋白的儿童，其风湿 热及相关的心脏瓣膜损伤的发病率升高了10倍。参阅Massell，B.F.，等， “链球菌免疫接种后的风湿热”，美国医学会杂志(JAMA)，207：1115- 1119(1969)。 被考虑用于开发疫苗的其它蛋白是红斑毒素、酿脓链球菌外毒素A 和酿脓链球菌外毒素B。参阅Lee，P.K.，等，“A群酿脓链球菌外毒素在 中毒性休克综合症样疾病动物模型中的定量及毒性”，临床微生物学杂 志(J.Clin.Microb.)，27：1890-1892(1989)。针对这些蛋白质的免疫力能够 预防致死性的中毒性休克症状，但也许不能预防链球菌在宿主体内集 群。 因此，仍然不断需要一种预防或改善链球菌感染的有效手段。更明 确地，存在开发对于预防或改善链球菌在宿主组织内集群从而降低strep throat及脓包病发病率的疫苗有用的组合物的需要。后遗症例如风湿热、 急性肾小球性肾炎、脓血症、中毒性休克和坏死性筋膜炎的消除，将是 减少此生物体急性感染和携带的一个直接结果；还存在开发对于预防或 改善由各种β-溶血性链球菌即A、B、C和G群所引起的感染的疫苗有 用的组合物的需要。 本发明概述 本发明提供免疫易感哺乳动物抗β-溶血性链球菌有效的一种疫苗和 数种免疫方法。易感哺乳动物可能是人或家蓄，例如狗、奶牛、猪或 马。这种免疫能够预防、改善或减轻β-溶血性链球菌在哺乳动物体内集 群的发病率。此疫苗含有一个具有免疫性的量的链球菌C5a肽酶(SCP)， 其中SCP是一种与生理上可以接受的、无毒性的赋形剂组合的、野生型 SCP的突变体。 SCP的“突变体”是一条与天然SCP不完全相同的多肽或寡肽 SCP。这样一种SCP突变体可以通过插入、缺失或取代一个或多个氨基 酸从而改变氨基酸序列而获得。此蛋白的氨基酸序列经过修饰，例如取 代，产生一条多肽，其性质与天然多肽比较基本相同或得到改善。这种 取代可能是一种保守取代。“保守取代”是指用另一种具有相似的侧链 的氨基酸取代一种氨基酸。保守取代是利用氨基酸在电荷或侧链的大小 这些方面(选择地，在侧链内化学基团的大小、电荷或种类这些方面)变化 最小的氨基酸所进行的，从而使整个肽保留其空间构象而其生物活性被 改变的取代。例如，常见的保守取代可能是Asp取代Glu、Asn或Gln； His取代Lys、Arg或Phe；Asn取代Gln、Asp或Glu和Ser取代Cys、 Thr或Gly。常用丙氨酸来取代其它氨基酸。20种必需氨基酸可以做如下 分类：具有非极性侧链的氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨 酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；具有不带电荷的极性侧链 的氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和 谷氨酰胺；带有酸性侧链的天冬氨酸和谷氨酸；带有碱性侧链的赖氨 酸、精氨酸和组氨酸。参阅L.Stryer，生物化学，第2版 (Biochemistry，2nd ed.)14-15页；Lehninger，生物化学(Biochemistry)， 73-75页。 氨基酸的改变是通过改变对应的核酸序列的密码子来实现的。已知 为了修饰或改进抗原性或免疫原性，在利用特定氨基酸取代多肽结构中 其它的氨基酸的基础上，可以获得这样的肽。例如，通过选择氨基酸的 取代，可以给予多肽一个小的构象变化，这引起活性增加或免疫应答增 强。选择地，特定多肽的氨基酸取代可被用来提供随后又被连接到其它 分子上从而提供保留了对其它目的有用的足够的启始肽抗原性质的肽-分 子接合物的残基。 人们在赋予多肽30种相互作用的生物功能时可利用氨基酸的水疗指 数，其中，发现特定的氨基酸可被取代为其它具有相似水疗指数的氨基 酸并仍然保留相似的生物活性。选择地，相似氨基酸的取代可在亲水性 基础上进行，特别在计划将所要产生的多肽的预期的生物功能用于免疫 实施方案的地方。“蛋白”的最大局部平均亲水性受其邻近氨基酸的亲 水性的支配，与其免疫原性相关。参阅美国专利4,554,101号。因此，可 以注意到取代可在分配给各氨基酸亲水性的基础上进行。 无论是使用亲水性指数还是使用水疗指数，它们都是给每一个氨基 酸分配一个数值，都优选在这些数值为±2时进行氨基酸的取代，特别 优选数值为±1，那些数值在±0.5以内的取代是最优选的取代。 SCP突变体包括至少7个氨基酸残基，优选地大约100-1500个残 基，更加优选大约300-1200个残基，甚至更加优选大约500-1180个残 基。其中，SCP突变体与对应的天然SCP氨基酸序列比较至少具有 50％，优选至少约80％，更加优选至少90％，但是小于100％的毗邻氨基 酸序列同源性或一致性。 突变体SCP多肽的氨基酸序列基本上对应于天然SCP多肽的氨基酸 序列。正如这里所使用的“基本上对应于”是指一个将引起与天然SCP 所产生的应答基本相同的保护性免疫应答的多肽序列。这样一种应答可 能是天然SCP所产生的应答水平的至少60％，甚至可能是天然SCP所产 生的应答水平的至少80％。对一种组合物或疫苗的免疫应答是指在宿主 内细胞和/或抗体介导的对于感兴趣多肽或疫苗的免疫应答的形成。通 常，这样一种应答包括产生抗体的个体、B细胞、辅助T细胞、抑制性 T细胞和/或明确针对被包括在感兴趣的组合物或疫苗内的抗原或各种抗 原的细胞毒性T细胞。 此SCP可能是A群链球菌(SCPA)、B群链球菌(SCPB)、C群链球菌 (SCPC)或G群链球菌(SCPG)SCP的突变体。 本发明的突变体可以包括没有出现在对应的天然SCP中的氨基酸残 基或与对应的天然SCP有关的缺失。突变体还可以是与相应的天然SCP 比较，被截短了的长蛋白“片段”，也就是说，仅仅是全长蛋白质的一 部分。例如，突变体SCP与天然SCP的差别可能在于它没有细胞壁插 入。SCP突变体还包括含有至少一个D-型氨基酸的肽。 疫苗的SCP突变体可以表达自一种分离的编码突变体SCP的DNA 序列。例如，突变体SCP天然SCP的差异可能在于其不含有信号序列或 细胞壁插入。DNA可编码特异性缝隙或催化结构域。特别是DNA可编 码催化结构域的130、193、295或512位氨基酸残基，或特异性缝隙的 260、261、262、415、416或417位氨基酸残基或者在这些残基上编码 修饰。特别是DNA可编码SCPA49D130A、SCPA49H193A、 SCPA49N295A、SCPA49S512A、SCPA1D130A、SCPA1H193A、 SCPAIN295A、SCPA1S512A、SCPBD130A、SCPBH193A、 SCPBN295A、SCPBS512A或△SCPA49。对于以上清单， SCPA49H193A是指A群链球菌血清型49的一种SCP，其中，第193位 残基处His残基被Ala代替。此疫苗的SCP可缺乏酶的C5ase或肽酶活 性。此疫苗可能还含有一种免疫佐剂。此疫苗可以用来预防A群链球 菌、B群链球菌、C群链球菌或G群链球菌的感染。此疫苗还包括一种 具有免疫原性的被接合或连接到一种有免疫原性的肽上或有免疫原性的 多糖上的重组链球菌C5ase肽酶。“重组”定义为一种利用遗传工程的 方法产生的肽或核酸。术语“蛋白质”，“肽”或者“多肽”在此可以相 互交换地使用。 链球菌C5a肽酶疫苗能通过皮下或肌肉注射给药。选择地，此疫苗 可以口服或鼻内接种给药。 本发明进一步提供分离和纯化的SCP肽，其中，SCP是野生型SCP 的突变体及被分离、纯化的编码突变体SCP的多聚核苷酸。例如，SCP 可包括催化结构域的130、193、295或512位氨基酸残基，或特异性缝 隙的260、261、262、415、416或417位氨基酸残基。此SCP可以是 SCPA49D130A、SCPA49H193A、SCPA49N295A、SCPA49S512A、 SCPA1D130A、SCPA1H193A、SCPA1N295A、SCPA1S512A、 SCPBD130A、SCPBH193A、SCPBN295A、SCPBS512A或△SCPA49。 附图简述 图1.β-溶血性链球菌C5a肽酶的结构。D表示天冬氨酸残基；H 表示组氨酸；S表示丝氨酸；L表示亮氨酸；P表示脯氨酸；T表示苏氨 酸；而N表示天冬酰胺。R1、R-2、R3和R4表示重复序列。数字表示 氨基酸残基在肽酶中的位置。 图2.A群链球菌血清型49的SCP的氨基酸序列(序列号1)、A群链 球菌血清型12的SCP的氨基酸序列(第2号序列)、B群链球菌的SCP的 氨基酸序列(第3号序列)和A群链球菌血清型1的SCP的氨基酸序列(序 列号23)的成线法(比较)。除了所指出的氨基酸位点以外，这些序列完全 相同。三角形()表示预测的信号肽酶切割位点。预测位于酶活性位点的 氨基酸用星号标记。氨基酸序列的缺失用点表示，并框起来。星号(*)表 示催化结构域的氨基酸残基。 图3.SCP插入和缺失突变体的构建。黑框表示被缺失区域。 图4.单色荧光激活细胞分选仪分析。荧光数据通过在多型核白细胞 上(PMNs)的阀门控制行分析。设定第二种阀门来计数由第一个阀门定义 的高染色细胞。气囊用1×106CFU接种。 图5.鼻内感染后野生型和SCPA血清型M49链球菌的持留。 图6.鼻内感染后A群链球菌血清型M6各种SCPA突变体在小鼠体 内集群的能力的比较。比较接种了2×107CFU M6链球菌的BALB/c小 鼠(每试验组十只)。每天在含有链霉素的血琼脂平板上培养喉拭子。如果 平板含有一个β-溶血性菌落，就认定小鼠为阳性。数据利用β2检验进 行统计学分析。 图7.△SCPA49的构建和免疫程序。 图8.兔抗体中和与不同血清型相关的SPCA活性。第1条是一个阳 性对照，且含有rhC5a，在接触PMNs之前rhC5a不预先温育。第10条 是缺乏rhC5a的一个对照。完整而无损伤的细菌，预先与正常的兔血清 完整温育(第2条，M1 90-131；第4条，M6 UAB200；第6条，M 12 CS24；第8条，M49 CS 101)或者预先与兔抗-SCPA49血清温育(第3条， MI 90-131；第5条，M6 UAB200；第7条，M12 CS24；第9条，M49 CS101) 后，与20βl5βM rhG5a温育45分钟。残留rhC5a利用其活化PMNs粘 附到被BSA包被的微量滴定板的小孔上的能力来测定。粘着的PMNs 用结晶紫染色。 图9.用纯化的△SCPA49蛋白鼻内免疫小鼠以后的血清IgG和分泌 型IgA应答。血清和唾液的SCPA49特异性IgG水平利用间接酶联免役 法测定。将每只小鼠血清用PBS稀释到1∶2,560；唾液用PBS稀释到 1∶2。图9A显示sIgA试验结果；图9B显示IgG试验结果。 图10.链球菌血清型M49在免疫和未免疫过的CD1雌性小鼠体内集 群的能力的比较。每一试验组含有13只鼻内感染2×108CFU(i.n.)的小 鼠。数据利用β2检验进行统计学分析。图10A和图10B显示重复试验 的结果。 图11.野生型和突变体SCP结合多克隆抗体的竞争性ELISA比较。 铺板的抗原是重组的野生型SCPA49(100ng/孔)。竞争的抗原用图例显 示。 图12.SCPA1、SCPA49和SCPB结合多克隆抗体的竞争性ELISA 比较。平板抗原是重组的野生型SCPA49(100ng/孔)。竞争性抗原用图例 显示。本图所描述的在试验中使用的SCPA1和SCPA49包括Asn32到 His1139。根据Chmouryguina，I等，“A群和B群链球菌C5a肽酶基因的 保守性”，传染与免疫(Infect.Immun.)，64：2387-2390(1996)，制备在本 图中被描述的实验中所用的SCPB。 本发明详述 第一条重要的抗病原体感染的防线是吞噬性多型核白细胞(PMNs)和 单核细胞在感染部位的聚积。这些细胞的吸引作用是由趋化性攻击例如 宿主因子或由侵入的生物体所分泌的因子所介导。在哺乳动物上，C5a 化学引诱剂对于炎症应答的刺激是关键的。C5a是一种74个残基的、由 第5补体成分断裂产生的的糖肽。吞噬细胞直接对C5a梯度应答，并在 感染部位聚积。C5a可能是炎症期间最直接的吞噬细胞引诱剂。正如 PMNs浸润炎症性坏死一样，它们分泌其它的趋化因子例如IL8，这些因 子进一步强化炎症应答。 正如C5a是在局部所产生的一样，链球菌C5a肽酶(SCP)是一种定位 于致病性链球菌细胞表面并在此处破坏C5a的蛋白水解酶。SCP在PMN 结合位点处(位于C5a His67-Lys68残基之间)特异性地切割C5a趋化因子， 去除C5a最靠近C-末端的7个残基。PMN结合位点的切割将会消除趋 化性信号。参阅Cleary，P.，等，“链球菌C5a肽酶是一种高度特异的内 肽酶”，传染与免疫(Infect.Immun.)，60：52 19-5223(1992)；Wexler，D. E.，等，“A群链球菌C5a活化剂的作用机制”，美国国家科学院院刊 (Proc.Natl.Acad.Sci USA)，82：8144-8148(1985)。 A群链球菌的SCP是一种枯草杆菌蛋白酶一样丝氨酸蛋白酶，分子量 为124,814道尔顿，具有许多革兰氏阳性细菌的常见表面蛋白的细胞壁 铆定基序。C5a肽酶的结构在图1给出。酿脓链球菌的链球菌C5a肽酶 基因的完整核苷酸序列已经被公开。参阅Chen，C.和Cleary，P.，“酿脓链 球菌的链球菌C5a肽酶基因的完整核苷酸序列”，生物化学杂志(J.Biol. Chem.)，265：3161-3167(1990)。与枯草杆菌蛋白酶相反，SCP的底物特异 性非常窄。考虑到其催化结构域的显著的相似性，这样的窄的底物特异 性是令人惊讶的。参阅Cleary，P.，等，“链球菌C5a肽酶是一种高度特 异性的内肽酶”，传染与免疫(Infect.Immun.)，60：52 19-5223(1992)。与 电荷转移有关的残基是位于结合口袋两边的残基是保守的(残基)。然而， SCP的其余的氨基酸序列与枯草杆菌蛋白酶的(其余氨基酸序列)无关。已 经发现A群链球菌有超过40种血清型产生SCP蛋白或者具有该基因。 参阅Cleary，P.，等，“趋化作用的一种链球菌性灭活剂：A群链球菌特 异的一个新毒性因子”，链球菌和链球菌性疾病的新进展(Recent Advances in Streptococci and Streptococcal Disease)179-180页(S.Kotami and Y.Shiokawa编著；Reedbooks Ltd.，Berkshire，England；1984)； Podbielski，A.，等，“A群链球菌virR49基因控制四个vir调节子结构基 因的表达”，传染与免疫(Infect.Immun.)，63：9-20(1995)。 SCP催化结构域，或者说活性位点包括电荷转移系统和特异性缝 隙。电荷转移系统，也称为催化结构域，含有Asp130、His193、Asn295及 Ser512残基(图1和2)。修饰，也就是说，缺失、插入或取代这些氨基酸 中的任何一个，将使此酶失活。在另一方面，预测特异性缝隙是由 Ser260、Phe261、Gly262、Ile415、Tyr416和Asp417形成的。通过取代这些氨 基酸而进行的修饰可能改变此酶的底物特异性或完全消除蛋白水解活 性。通过删除这些氨基酸而进行的修饰可能也会使此酶失活。催化结构 域依赖于蛋白质在成熟的酶折叠成活性状态时所产生的三级结构。该结 构不是由氨基酸残基的连续线性排列所形成的。选择地，修饰还可能减 少SCP突变体和底物的结合。结合可能减少50％，70％或者甚至80％。 与B群链球菌相关的C5a肽酶也已被鉴定。参阅Hill，H.R.，等， “B群链球菌抑制第五补体成分的趋化活性”，免疫学杂志(J. Immunol.)，141：3551-3556(1988)。ScpB的限制性图谱和核苷酸序列的 完成显示scpB与scpB的相似性为97-98％。请参见图2。A群链球菌血 清型49、A群链球菌血清型12、B群链球菌和A群链球菌血清型1(分别 为序列号1，序列号2，序列号3，序列号23)的SCP的氨基酸序列的比 较。代表B群链球菌的全部血清型的超过30种的菌株，都携带scpB基 因。参阅Cleary P.P.，等“B群和A群链球菌C5a肽酶基因之间的相似 性”，传染与免疫(Infect.Immun.)，60：4239-4244(1992)；Suvorov AN.， 等，“B群链球菌C5a肽酶基因”，链球菌、乳球菌和肠球菌的遗传学 与分子生物学(Genetics and Molecular Biology of Streptococci Lactococci and Enterococci)230-232页(G.Dunny，P.Cleary and L.McKay(ed.)； American Society for Microbiology，Washington，D.C.；1991)。 G群和C群链球菌的人体分离物还具有scpA-样基因。已经显示一 些G群菌株在它们的表面表达C5a特异性蛋白酶活性。参阅Cleary，P.P.， 等，“人的有毒性的G群链球菌菌株表达一种与A群链球菌所产生的酶 相似的C5a肽酶”，传染与免疫(Infect.Immun.)，59：2305-2310 (1991)。所以，A群、B群、C群和G群链球菌的全部血清型(＞80)都产 生SCP酶。 SCP通过抑制吞噬性白细胞流入感染部位来帮助链球菌在一个潜在 的感染部位例如鼻咽粘膜集群。这阻碍宿主对链球菌最初的清除。利用 蛋白酶结构基因上具有明确突变的菌株，检查了SCP对炎症、C5a白细 胞趋化作用以及链球菌的毒性的影响。利用靶向质粒插入以及利用含有 明确确定的内部缺失的scpA取代野生型基因，构建了SCP突变体。各 突变体缺乏C5a蛋白酶活性，并且不抑制人或小鼠的PMNs对C5a的体 外趋化应答。 小鼠结缔组织气囊模型被用来确定SCP阻碍吞噬细胞的流入和链球 菌从感染部位清除。通过用一个25-规格的针头在小鼠背部皮下注射小量 的空气和PBS(其中含有链球菌或不含有链球菌)来产生小鼠结缔组织气囊 模型。参阅Boyle，M.D.P.等，“体内白细胞趋化作用的测量”，酶学 方法(Meth.Enzymol.)，162：101：115(1988)。在实验结束后，小鼠被脱颈 处死。从动物切取气囊，在缓冲液中使气囊匀浆。气囊模型的一个好处 就是气囊可维持膨胀数天且不会发炎，除非注射一种激发剂。因而，注 射的细菌和因此发生的炎症应答在感染的短时期间是局部性的。 修饰气囊模型与野生型SCP+和SCP-链球菌(也就是说，携带一个突 变的无功能形式的SCP的A群链球菌)，并且分析感染早期的细胞浸 润。在血琼脂平板上化验组织悬液的活链球菌，并利用荧光细胞分选技 术(FACS)分析细胞浸润。在FACS分析中，悬液中各单细胞用特异性荧 光单克隆抗体标记。将部分被标记的细胞注射到FAC-Scan流式细胞计 数器上或荧光细胞分选仪上，基于它们特有的荧光计数细胞。使用气囊 模型进行的实验显示SCP+链球菌比SCP-链球菌的毒性更高。 进行一项研究测量人的血清和唾液中抗-SCP的人源抗体包括IgG和 IgA的产生。参阅O′Connor，SP，等，“人对链球菌C5a肽酶的抗体应 答”，传染病杂志(J.Infect.Dis.)，163：109-16(1991)。通常，未感染的年 幼儿童缺乏SCP抗体。相反地，健康的成年人的多数血清和唾液标本具 有可测量的抗-SCP的IgG和SCP-特异性分泌型IgA(抗-SCP的sIgA)水 平。链球菌性咽炎患者的急性期及康复期成对血清，拥有显著高于健康 个体血清的抗-SCP IgG水平。含有高浓度抗-SCP免疫球蛋白的血清能够 中和SCP活性。从最近患过链球菌性咽炎的儿童所采集的＞90％的唾液标 本的抗体检测，表明儿童能产生抗体应答。 即使是通过在天然链球菌的感染应答中产生抗-SCP IgG和IgA抗体 的人类受试者，仍然不知道抗-SCP的免疫球蛋白是否能提供任何抗感染 保护。更进一步地，不知道SCP蛋白是否能作为一种抗β-溶血性链球菌 集群或者感染的疫苗。首先，进行一项研究检查在鼻咽部位集群中的 SCP作用。用活的A群链球菌鼻内感染后，每日取咽喉培养物达10 天。比较野生型和等基因的SCP-缺陷型突变体在此10天期间在咽喉部 位持留的能力。正如预测的一样，链球菌的SCP-缺陷型突变体被更快地 从鼻咽部位清除。 相同的鼻内小鼠模型被用来试验SCP诱导预防集群的免疫力的能 力。一个突变体形式的在编码Thr63的核苷酸处开始的重组的scpA19基 因被克隆。此突变体被称为△SCPA49，长度为2908 bp(见下面的实施例 4)。利用亲和层析从E.coli重组体纯化突变体的SCP蛋白。皮内免疫此 蛋白制剂(所产生)的兔血清体外中和SCP活性。在5周时期内，给小鼠 鼻内给药此纯化蛋白(40μg)。免疫的小鼠在1-2天内清除链球菌；然 而，未免疫小鼠的咽喉培养物维持阳性达10天。在三组用三个独立的 SCP蛋白制剂接种的小鼠中重复此试验。 进行进一步的试验确定用单一抗原免疫动物是否能预防数种血清型 的集群。△SCPA49被克隆到一个表达载体上，并在E.coli中表达。亲和 纯化的突变体△SCPA49蛋白在小鼠和兔中证明是高度免疫原性的。虽 然纯化的突变体△SCPA49免疫原缺乏酶的活性，但它诱导高滴度的能 体外中和与M1、M6、M12及M49链球菌相关的肽酶活性的兔抗体。这 证明抗-肽酶的抗体缺乏血清型特异性。然后用纯化的突变体△SCPA49 鼻内免疫四组小鼠，而且各组均用一种不同血清型的A群链球菌攻击。 用△SCPA49蛋白免疫小鼠攻击了显著水平的特异性唾液sIgA和血清 IgG抗体，并且降低野生型M1、M2、M6、M11和M49链球菌集群的 潜力。这些试验确定用C5a肽酶疫苗免疫有效预防在鼻咽部位的集群。 还进行试验从M1 OF-菌株和OF+菌株开发突变体SCPs。因为有活 性的SCP可能对身体有害，所以突变体蛋白缺乏酶活性是重要的。用那 些预期将使此酶失活的氨基酸取代催化活性所必需的氨基酸。 同时确定了突变体蛋白的两个性质。首先，利用PMN粘附试验测定 了野生型蛋白和突变体蛋白的比活。这些试验显示，被取代的氨基酸使 得酶的活性降低了超过90％。第二，还比较了突变体蛋白和野生型蛋白 结合针对此野生型酶的抗体的能力。为此目的，使用了竞争性ELISA试 验。结果显示氨基酸取代不改变抗体结合突变体蛋白的能力。 所有早期的保护研究已通过鼻内给药无佐剂的亲和纯化的△SCPA49 蛋白来进行。然而，肌肉或皮下(SQ)注射抗原在历史上是一种优选的、 更加公认的疫苗投药方法。因此，已进行试验测试△SCPA与单磷脂 A(MPL)及明矾(AlPO4)的皮下注射是否诱导保护性免疫应答，以及当A 群链球菌的攻击菌株与SCPA疫苗来源不同时此应答是否降低集群。利 用咽喉培养物或通过被解剖的鼻组织的取样，测定免疫过的小鼠从口-鼻 咽粘膜清除链球菌的能力。 与鼻组织相关的链球菌的数量和预期的一样，随时间的延长而减 少，在用SCPA抗原免疫过的小鼠中这种减少更快更完全。这些结果证 明了单一SCPA抗原能够诱导抗异种血清型的保护作用。保护作用由中 和细菌表面的肽酶活性的抗体提供。这增加了链球菌在粘膜组织沉积以 后数小时内，吞噬细胞的流入。吞噬细胞快速清除链球菌，这被假定为 能够预防细菌此后的增殖和持留。因此，SCPA抗原与佐剂的皮下注射 一贯诱导强烈的抗体应答。 本发明提供一种用以保护哺乳动物抗β-溶血性链球菌集群或感染的 疫苗。在本发明的一个实施方案中，突变体C5a肽酶可以在一种药理上 接受的赋形剂中投递给哺乳动物。本发明中的疫苗还可以包括有效量的 已知能增强免疫应答的免疫佐剂。 可将SCP接合或连接到另一个肽或多糖上。例如，可以利用本领域 公知的又被称为“载体”的有免疫原性的蛋白。有用的有免疫原性的蛋 白包括钥孔血蓝素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白、人血清白 蛋白、人丙种球蛋白、鸡免疫球蛋白G和牛丙种球蛋白。有用的免疫原 性的多糖包括A群链球菌的多糖、B群链球菌的C-多糖，或者肺炎链球 菌(Streptococcus pnuemoniae)或B群链球菌的荚膜多糖。选择地，可将其 它用做疫苗的病原体的多糖或蛋白接合或连接到SCP上，或者与SCP混 合。 本发明进一步提供了被分离和纯化的核酸分子，例如DNA分子， 包括一段预先选择的编码链球菌C5a肽酶之至少一部分的核酸片段，也 就是说，它们编码SCP或其在此所述的一个突变体，例如 SCPA49S512A、SCPA49D130A、SCPA49N295A、SCPA1S512A、 SCPA1D130A、SCPA1N295A、△SCPA49、SCPBS512A、 SCPBD130A、SCPBH193A或SCPBN295A，或这些突变体之任何组合。 例如，本发明还提供一种表达盒，这种表达盒包括了一段预先选择的编 码RNA分子的DNA片段，所编码的RNA分子与内源的或天然的 SCPmRNA—的全部或一部分基本相同(意义)。此表达盒中预先选择的 DNA片段在操作上被连接到一个启动子上。正如这里所使用的一样，序 列“基本相同”的意思是两个核酸序列彼此之间拥有至少约65％，优选 约70％，更优选约90％，甚至更优选约98％的毗邻核酸序列一致性。优 选地，预先选择的DNA片段在杂交条件下，优选在严谨的杂交条件下， 与编码对应的天然SCP的核酸分子杂交。 正如这里所使用的一样，“基本上纯”的意思是目的物质是存在的 主要物质(也就是说，按摩尔计算，目的物质比组合物中其它任何物质存 在的量都要大)，而且优选地，一种基本上被纯化了的部分是一种组合 物，其中，目的物质至少占存在的全部大分子物质的50％(按摩尔计 算)。通常，一种基本上纯的组合物占存在于此组合物的全部大分子物质 的约80％以上，更加优选超过约85％，约90％，约95％，以及约99％。 最优选地，目的物质被纯化到真正的同质性(利用常规的检测方法在此组 合物中检测不到)，其中，组合物主要包括单一大分子物质。 正如这里所使用的一样，术语“重组核酸”或“预先选择的核 酸”，例如“重组DNA序列或片段”或“预先选择的DNA序列或片 段”，指一种从任何合适来源衍生或分离而来的，随后可发生体外化学 改变，从而使其序列不是天然存在的、或者与天然存在的序列一致但是 其所处的位置与其在未转化过外源DNA的基因组内所处的位置不同的核 酸，例如DNA。一个从一种来源“衍生”而来的预先选择的DNA的例 子，是一种被鉴定为特定生物体内有用片段，随后化学合成的基本上纯 的DNA序列。这种从一种来源“分离”而来的DNA的例子，是一种利 用化学手段，例如利用限制性内切核酸酶，从所说的来源切除或去除， 从而使其可通过遗传工程的方法被进一步操作，例如扩增，供本发明使 用的有用的DNA序列。 从限制酶消化产物回收或分离特定DNA片段，包括利用聚丙烯酰胺 或琼脂糖凝胶电泳进行消化产物的分离、通过将其迁移率与具有已知分 子量的DNA片段标记物的迁移率做比较对感兴趣的片段进行的鉴定、切 除含有预期片段的凝胶部分，以及凝胶与DNA的分离。请参见Lawn 等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，9，6103(1981)及Goeddel等，核酸 研究(Nucleic Acids Res.)，8，4057(1980)。因此，“预先选择的DNA”包 括全合成的DNA序列、半合成的DNA序列、从生物来源分离的DNA 序列，和从RNA衍生而来的DNA序列，以及它们的混合物。 正如这里所使用的，谈到与RNA分子相关的术语“衍生的”指此 RNA分子与特定的DNA分子具有互补的序列一致性。 编码SCP的氨基酸序列突变体的核酸分子，通过本领域中公知的多 种方法来制备。这些方法包括，但是不限定在从天然来源分离(对于天然 存在的氨基酸序列突变体而言)或者通过寡聚核苷酸介导的(定点)突变、 PCR突变，以及早期制备的SCP突变体或非突变体形式SCP的盒式突变 来制备。 肠胃外给药突变体SCP免疫个体，通常是用一种合适的赋形剂经肌 肉或皮下注射(给药)。然而，其它的给药方式，例如口腔投递或鼻内投 递，也是可以接受的。疫苗配方在赋形剂中含有一个有效量的活性成 分。此有效量足以预防、改善或减少β-溶血性链球菌在靶哺乳动物中集 群的发病率。此有效量可由本领域中的熟练人员很容易地确定。活性成 分，典型地，占此组合物的大约1％到大约95％(w/w)，如果合适的话或 者甚至更高或更低。将要给药的量取决于各种因素，例如考虑免疫的动 物或人的个体年龄、体重和身体状况。这个量还取决于此动物的免疫系 统合成抗体的能力以及所期望的保护程度。有效的剂量，可由本领域中 具有普通技能的人员，通过确定剂量应答曲线的常规试验很容易地确 定。通过单次或多次给药SCP免疫个体。维持对于链球菌的免疫状态可 能必须多次给药。 鼻内用药配方可以包括既不引起对鼻粘膜的刺激也不妨碍纤毛功能 的赋形剂。稀释液，例如水、盐水溶液或能够用于本发明目的的其它公 知物质。鼻内用药配方还可含有防腐剂例如，氯代丁醇及氯化苄烷铵， 但是不限定于。可以有一种表面活性剂来提高腻粘膜对所研究的蛋白的 吸收。 口服液体制剂可以是这样的形式，例如水性或油性悬浮液、溶液、 乳剂、糖浆剂或酏剂，或者是以干燥的在使用之前需要用水或其它合适 的赋形剂重新组合的片剂或产品给出。这样的液体制剂可含有常规的添 加剂，例如悬浮剂、乳化剂、非水赋形剂(可包括食用油)或防腐剂。 为了制备疫苗，被纯化的SCP可以被分离、冻干及稳定化。然后可 将此SCP肽调整到一个合适的浓度，选择性地与一种合适的疫苗佐剂组 合，并包装供使用。合适的佐剂，包括但是不限定于：表面活性剂，例 如十六烷基胺、十八烷基胺、溶血卵磷脂、溴化二甲基二十八烷基铵、 N，N-二十八烷基-N′-N-双(2-羟乙基-丙烷二胺)、甲氧基十六-甘油，复合 多元醇及聚阴离子，例如吡喃、硫酸右旋糖酐、多聚肌苷酸多聚胞苷 酸、聚丙烯酸、卡巴浦尔；肽，例如胞壁酰基二肽、单磷脂、二甲基甘 油(aimethylglycine)、特夫素、油类乳剂、明矾和它们的混合物。其它 潜在的佐剂包括E.coli热不稳定毒素的或霍乱毒素的B肽亚基。参阅 McGhee，J.R.，等，“论疫苗开发”，血液学研究(Sem.Hematol.)，30：3- 15(1993)。最后，可把有免疫原性的产物掺入到脂质体用于疫苗配方，或 接合到各种蛋白上，例如匙孔血蓝蛋白(KLH)或人血清白蛋白(HSA)或 其它聚合物。 SCP用来免疫哺乳动物抗集群的用途，提供了超过其它疫苗候选者 的优势。通过接种单一蛋白进行的集群或感染的预防，将不仅减少极其 常见的链球菌咽炎(strep throat)及脓疱病问题的发病率，而且还将消除其 后遗症，例如风湿热、肾小球性肾炎、脓毒病、中毒性休克和坏死性筋 膜炎。用下面的实施例旨在说明本发明，而不是来限定本发明。 实施例1 scpA49和scpA6的插入和缺失突变体的构建和体外分析 a)细菌的菌株和培养条件。酿脓链球菌(S.pyogenes)菌株CS101是 血清型M49和血清不透明性阳性(OF+)的菌株。CS159是一种具有一个 贯穿M基因簇和scpA的缺失的临床分离物。从菌株CS101自然产生的 链霉素抗性的衍生菌株，被命名为CS101sm，将固相培养的链球菌在含 有链霉素(200ìg/ml)的tryptose血琼脂上铺平板以进行选择。链球菌菌株 CS210和CS463分别是OF+、II类、血清型M2和M11菌株自然产生的 链霉素抗性菌株。链球菌菌株90-131和UAB200分别是A群链球菌的 OF-、I类、血清型M1和M6的人类的分离物。 CS101∷pG+host5是具有被整合到染色体中位于scpA和emm基因簇 之外的一个未知位点的pG+host5的菌株CS101。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株ER1821(购自New England Biolabs，Inc.Beverly，MA)被用做 自杀性载体质粒pG+host5的接受者。质粒pG+host5获自Appligene，Inc. Pleasanton，CA。链球菌培养于添加了2％新蛋白胨或1％酵母提取物的 Todd-Hewitt肉汤或在含有5％羊血的tryptose琼脂上铺平板。E.coli菌株 ER1821，含有质粒pG+host5，在含有红霉素(300μg/ml)的LB肉汤培养 基中培养。含有质粒pG+host5的链球菌在含有1％酵母提取物(THY)、1 μg/ml红霉素(Erm)的Todd-Hewitt肉汤中培养。 SCP泛指β-溶血性链球菌的链球菌C5a肽酶。SCPA1、SCPA12、 SCPA49、SCPA6分别是从A群链球菌M血清型1、12、49和6菌株得 到的特异性肽酶。术语scpA指编码A群链球菌SCP的基因。ScpA1、 scpA12、scpA6和scpA49是编码SCPA1、SCPA12、SCPA49和SCPA6 肽酶的基因。SCPB和scpB指B群链球菌的肽酶和基因。SCPA49(第1 序列号)，SCPA12(第2序列号)，SCPA1(第23序列号)和SCPB(第3序列 号)的氨基酸序列在图2中给出。 b)scpA49插入突变体的构建。利用质粒插入和基因替换方法构建 ScpA49的定义明确的插入突变体。一个内部scpA49 BglII和BamH I片 段，既插入的靶，被连接到热敏感性穿梭载体pG+host5上形成质粒 pG∷scpA1.2并且转化进E.coli ER1821(图3)。pG+host5载体含有在39℃ 有活性的E.coli复制启动子，这是一种温度敏感型革兰氏阳性菌复制启 动子(在链球菌中在30℃下有活性，在39℃下失去活性)，此载体还含 有一个供选择用的红霉素抗性基因。高温迫使质粒通过同源重组以102- 103的频率整合到A群链球菌的染色体DNA中。 重组的质粒DNA pG∷scpA1.2经电穿孔导入CS101受体细胞。在 30℃下在含有1μg/ml红霉素繁荣THY-琼脂平板上选择转化体。由质粒 插入物和染色体scpA49之间重组引起的染色体整合体，在39℃下利用 红霉素抗性来选择。分析了两个插入突变体M14和Ml6。菌株M14和 M16的EmrS回复突变体通过在无抗生素的THY中在30℃下传代，最后 在无Erm选择的条件下于37℃铺平板来获得。丢失此质粒的克隆被分离 出来，从而证明突变的表型是由此质粒插入到scpA49中所产生的，而不 是由自然产生的无关突变所产生的。 c)scpA6插入突变体的构建。如用上在(b)部分所描述的方法，构建 scpA6插入突变体AK1.4。重组的质粒DNA，pG∷scpAl.2，含有scpA基 因的一个内部BglII-HindmIII片段。此质粒经电穿孔转化进UAB200受体 细胞，转化体在37℃下在含有红霉素的THY琼脂上选择。由质粒插入 物和染色体scpA6之间的重组所产生的pG∷scpAl.2的一个染色体整合 体，菌株AK1.4，通过在39℃下在含有红霉素的琼脂培养基中培养来进 行选择。通过用scpA做探针进行Surthern印迹以及用对此质粒特异的一 个M13通用引物(5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′)(第6号序列)和对 GAS的染色体scpA6特异的一个scpA For835引物(5′- AAGGACGACACATTGCGTA-3′)(第7号序列)，来证明此插入。 d)将一个明确缺失导入scpA(图3)。构建一个在scpA49内部含有明 确缺失的突变菌株，从而消除scpA49内的插入所具有的极性并减少下游 基因表达的可能性，这些未知的基因可能也有助于此生物体的毒性。首 先，scpA BglII-HindIII片段中的明确的缺失是利用内外(inside-out)PCR 产生，所用的引物1为(5′-GGGGGGGAATTCGTAGCGGGTATCATG GGAC-3′)第4号序列及所用引物2为(5′-GGGGGGGAATTCGGG TGCTGCAATATCTGGC-3′)第5号序列。下面划线的核苷酸分别对应 于坐标2398和2322的scpA序列，而粗体的核苷酸对应于一个EcoRI限 制性识别位点。选择引物，在scpA基因中产生符合阅读框的缺失。这些 引物按相反的方向复制质粒DNA，并且限定缺失的边界。参阅Innis， MA.，等，eds.，PCR操作规程：方法和应用指导(PCR Protocols A Guide to Methods and Applications)，Academic Press，1990。质粒pG∷scpA1.2 DNA被用做模板。 扩增产物用EcoR I消化并连接到质粒pG+host5上。所产生的质粒 pG∷△scpA1.1在scpA内部含有一个76bp的缺失。这个符合阅读框的缺 失去除了25个氨基酸，包括形成预测的丝氨酸蛋白酶催化中心之部分的 丝氨酸。参阅Chen，C.，和Cleary，P.，“酿脓链球菌的链球菌C5a肽酶基 因的完整核苷酸序列”，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，265：3161-3167 (1990)。在缺失位点产生了一个EcoRV位点。测定与此缺失重叠的DNA 的序列，以确认缺失的边界。 含有缺失的质粒pG∷△scpA1.1被转化进E.coli ER1821中。选择 ErmR克隆，此后利用小量制备的EcoR I限制酶消化的质粒DNA筛选 合适的scpA缺失。缺失的精确边界用DNA测序确定。质粒pG∷△ scpA1.1如上所述经电穿孔导入菌株CS101sm，此后在39℃下在Erm中 培养以筛选整合体。利用高温选择，将此质粒整合入M49菌株 CS101sm。利用PCR确定插入位置。CS101sm(pG∷△scpA1.1)在低温下 不加红霉素选择的条件下，高频率地引起由于插入所产生的重复的scpA 序列之间的重组所导致的通过随机缺失或者甚至通过切除而丢失了此质 粒所产生的回复突变体的分离。鉴定了两个缺失突变体，MJ2-5和MJ3- 15，并对其做进一步研究。通过质粒pG∷△scpA1.1的重组性切除而留下 的染色体缺失，利用PCR以及与EcoRV消化过的DNA之间的Southern 杂交确定。 e)突变对SCP的体外效应。利用Western印迹和PMNs粘附试验确 定插入和缺失对于SCP抗原的表达和肽酶活性的所发挥的效应。链球菌 在100ml THY中在37℃下温育过夜。培养小团用5ml冷的0.2M乙酸 钠(pH5.2)洗涤2次，然后用TE-蔗糖缓冲液(20％蔗糖10mM Tris，1 mM EDTA，pH7.0)和40ìl溶变菌素悬浮。此混合物在37℃下转动培养2 小时，然后4500rpm离心5分钟。上清中含有蛋白酶抑制剂，即100 mM苯甲基磺酰氯(PMSF)。如同Laemmli，U.K.，“T4噬菌体头部组装期 间结构蛋白的切割”，自然(Nature)227：680-685(1970)所描述的一样，进 行电泳和Western印迹。用于在Western印迹和菌落印迹上检测SCP蛋 白的初次应答抗血清，通过给兔免疫被纯化的重组SCP蛋白来制备。这 种结合，利用抗兔抗体碱性磷酸酶接合物来检测。 C5a肽酶活性利用PMN粘附试验来测量。参阅Booth，S.A.等，“氨 苯砜抑制整合素-介导的嗜中性粒细胞粘附功能”，皮肤病学研究杂志(J. Invest Dermatol.)98：135-140(1992)。将C5a(Sigma，St.Louis，MO)和链 球菌提取物或纯化的酶温育后，残留的C5a能够激活PMNs使其变得粘 附到BSA包被的小孔上。第一，微量滴定板小孔用含有0.5％BSA的 PBS包被，并在37℃下温育1小时。人的PMNs通过在Ficoll Hypaque (Sigma，St.Louis，MO)上面离心来分离。40μl完好无损的链球菌或蛋白 提取物与20μl浓度为5μM C5a、1％葡萄糖和0.1％CaCI的340μl PBS在37℃下温育45分钟。用PBS洗涤被BSA包被的孔，并将悬浮好 的PMNs和残留的C5a加入各孔。在37℃和7％CO2下将此混合物温育 45分钟。最后，洗涤各孔去除不粘附的PMNs。粘附的PMNs用结晶紫 染色，并在ELISA读数器上读取OD570nm。光密度与残留C5a的量成比 例，或相反地与SCP活性的量成比例。 利用SCPA特异的血清进行Westen印迹来分析来源于亲本及突变体 培养物细胞表面蛋白的变溶菌素提取物。证明突变体缺乏SCPA。突变 体AK1.4和MJ3-15的提取物不与抗-SCPA血清反应。在来自野生型菌 株CS101和UAB2000的提取物中没有观察到预期大小的SCPA蛋白。 通过比较突变体菌株AK1.4和MJ3-15破坏rhC5a的能力，证明它们不能 产生C5a肽酶活性。将被分离的PMNs暴露于rhC5a，诱导它们使其变 得粘附被BSA包被的微量滴定板。与链球菌或被纯化的SCPA温育，特 异地切割rhC5a，并改变其活化PMNs的潜力。应答了残留rhC5a并结合 到被BSA包被的小孔上的PMNs被染色，然后用分光光度法测量。 rhC5a与亲本培养物UAB200和CS101温育，破坏了rhC5a，这分别使 PMNs粘附被抑制了58.8％和54.5％。与SCPA突变体相反，AK1.4和 MJ3-15，不改变rhC5a或PMNs对BSA包被孔的粘附(表1)。这个试验 证明了Western印迹，并显示SCPA-培养物缺乏其它可能降解rhC5a的 蛋白酶。 表1.野生型及突变体菌株的吞噬试验和PMN粘附试验 菌株 性状 克隆形成 增加倍数 C5a抑制 单位(cfu/ml) (cfu/ml) PMN粘附 的百分数* 时间＝0h 时间＝3h UAB200 M6+，SCPA+ 1.8×103 7.2×104 40 58.8 Ak1.4 M6+，SCPA- 1.2×103 4.5×104 37.5 0 CS101 M49+，SCPA+ 1.0×104 4.9×105 49 54.5 MJ3-15 M49+，SCPA- 1.5×104 2.1×105 14 0 *抑制百分数＝1[(C5a单独活化的PMN的OD570nm—预先与细菌温育过的C5a活化的 PMN的OD570nm)/C5a单独活化的PMN的OD570nm]×100％。 虽然并不预期M蛋白表达会受scpA突变的影响，但仍然进行试验 以评估SCPA的突变体链球菌是否仍然表达M蛋白并具有抗吞噬作用的 能力。在3小时温育期间，链球菌在新鲜的人血液中的生长，表明了其 表面具有抗吞噬作用的M蛋白。参阅R.C.Lancefield，“具有共同的R 抗原的A群链球菌分化成三种血清型，与杀菌试验特别有关”，实验医 学杂志(J.Exp.Med.)，106，525-685页(1957)。正如所期望的一样，亲本链 球菌UAB200和CS101分别增加了40和49倍(表1)。M+SCPA-培 养物，菌株AK1.4和MJ3-15，分别增加了37.5和14倍，这证明scpA 突变对于M蛋白表达或对于在人全血中对吞噬的抵抗作用几乎没有影 响。两个突变体在血液中转动培养生长稍微变坏，这是可重现的，也是 没有预料到的。突变体和亲本培养物在人血浆中的生长速率没有差别。 可能是SCPA的失活使得C5a在转动的血液中积聚，而这依次又活化了 PMNs。活化的PMNs的吞噬能力更强，并更能杀死M+链球菌。当利用 抗-M49和抗-M6抗血清进行Western印迹对其进行分析时，表面蛋白提 取物含有M6和M49抗原，这证明了SCPA突变不改变M蛋白的表达。 实施例2 SCP延迟吞噬细胞的募集以及链球菌从皮下感染部位的清除 为了核实SCP能使C5a失活，如上面实施例1中所述的方法，构建 scpA49的插入和缺失突变体。当插入或缺失被导入scpA49时，突变体 SCP不能破坏C5a-活化的PMNs对微量滴定板的粘附。 使用一种动物模型测试scpA49的突变对毒性的影响，在这里链球菌 仍然位于局部，而且炎症细胞的流入也能进行分析。为了试验这个假 设，即SCP很早就发挥功能从而妨碍此生物体的清除，比较了接种结缔 组织气囊之后刚好4小时的时候SCP+和SCP-链球菌的命运。而且还确 定了在短暂的感染期间直后链球菌向淋巴结和脾的扩散。 从Charles River Breeding Laboratory，Wilmington，MA获取的CD1 雄性远交系小鼠用于全部试验。用25-标准尺寸的针头在小鼠背部注射 0.9ml空气和0.1ml用PBS稀释的A群链球菌，产生一个结缔组织气 囊。在一些试验中，SCP+CS101∷pG+host5被用做阳性对照。在其它试 验中菌株CS101sm被用做阳性对照。感染后4小时，用断颈法无痛地处 死小鼠。在被指出的地方，从动物切取所有四个腹股沟淋巴结、脾和气 囊，在PBS中匀浆。在含有1μg/ml红霉素或200μg/ml链霉素的血琼 脂平板上分析了组织悬液的活细胞克隆形成单位(CFU)。 在一项预备试验中，将气囊固定在载玻片上，用赖特染剂(Wright’s stain)染色，并进行显微镜检查。虽然用本方法来计数粒细胞是不可靠 的，但是在被固定的组织中，残留的SCP-链球菌似乎显著地小于野生型 链球菌。为了测量这个差异，进行了附加试验。在PBS中研磨气囊，并 使其通过单丝网(TETKO Co.New York)，来制备分散的气囊细胞群。 300×g离心5分钟使细胞形成小团，用FACS缓冲液(Hank’s平衡 盐溶液，无酚红，0.1％NaN3，1.0％BSA第V组分)重新悬浮为5×106/ml。 细胞(1.0×106)直接用1μg FITC抗-小鼠Mac-I染色，或者间接地用1 μg连接有抗-小鼠Gr-1的生物素，然后又用1μg用荧光素或FITC标记 的链亲和素染色。单克隆抗体，Mac-I和Gr-I，获自Pharmingen，Inc. CA.。将被标记的细胞固定在1.0％多聚甲醛中。使用FAC-SCAN流式细 胞计数器和Consort 32软件(Becton Dickinson)生成荧光曲线。用Ficoll Hypaque密度梯度离心从全血中纯化小鼠PMNs，并以此作为标准来确 定混合(细胞)群中的PMNs。为了测量被特异性标记的细胞，测定了每一 种抗体标记的平均荧光，并且设定好闸门从而强烈地反映被标记的细 胞。对照，包括了没有被标记的细胞，以及仅对链亲和素FITC暴露过的 细胞。 下面进行了两个试验。第一个比较了scpA49插入突变体M16和 SCP+亲本培养物，菌株CS101。第二个比较了scpA49缺失突变体 MJ3-15及其亲本，菌株CS101sm。在两个试验中(表2)，被匀浆的接种 了SCP-链球菌的小鼠气囊在4小时后都比接种了野生型链球菌的气囊含 有更少数量的链球菌。第一个试验显示出两倍的降低，而第二个试验显 示四倍的降低。利用非成对t检验，分别在P＜0.05 and P＜0.001的水平 上，这些差异是在统计上是显著的。还观察到在8只小鼠中7只小鼠及 8只小鼠中6只小鼠的脾脏匀浆中发现野生型SCP+链球菌；但是，SCP -突变体却很少在脾中发现。反之对淋巴结匀浆亦正确。用SCP链球菌 感染的16只小鼠中有10只小鼠的淋巴结有链球菌定居；但是用野生型 链球菌感染的16只小鼠中仅有4只小鼠的淋巴结含有活的链球菌。利用 Fisher′s exact test证明，这个差异在P＜0.05的水平上具有统计学显著 性。 表2：在气囊感染4小时之后SCP+和SCP-链球菌的分布 菌株 小鼠数量a 阳性培养的数量 匀浆的气囊c 脾b 淋巴结 CS101pG(SCp+) 8 7 2 1.3×108±2.2×107 M16(SCP-) 8 0 5 6.0×107±1.3×107 CS101Sm(SCp+) 8 6 2 1.6×108±2.6×107 MJ3-15(SCP-) 8 1 5 3.7×107±1.5×107 a每一之小鼠接种3×108CFU的固相链球菌。 b对于每一个试验，依据Fisher′s exact test，从脾分离SCP+链球菌的频率的差异相对 于SCP-链球菌是统计学显著的(P＜0.05)的。 c依据unpaired t test，对于每一个试验，菌株CS101pG(SCp+)及M16(SCP-)及MJ3- 15(SCP-)(P＜0.05)，从匀浆的气囊(平均值±SEMs)分离的CFU的差异是显著的。 链球菌更快地从气囊清除引起更强的PMNs募集。所有的细胞群， Mac-1阳性颗粒细胞的百分数(Springer，G.等，“Mac-1：利用单克隆抗 体鉴定的巨噬细胞分化抗原”，欧洲免疫学杂志(Eur J.Immunol.)9：30 1- 306(1979))，及Gr-I阳性多形核嗜中性粒细胞(PMN)的百分数(通过单色 FACS分析，比较了气囊中“多形核嗜中性粒细胞杀伤真菌的免疫活 化：体外测定小鼠细胞和芽生菌体的研究”，Brummer，F.等，白细胞生 物学杂志(J.Leuko.Bio.)36：505-520(1984))。Clark，J.M.，“一种新的 定量小鼠细胞免疫的方法”，网状内皮组织协会杂志(J.Reticuloendothel. Soc.)25：255-267(1979)。简单地说，在FACS分析中悬液中的单细胞被特 异性荧光单克隆抗体标记。部分被标记的细胞被注射到基于特有的荧光 计数细胞的FAC-Scan流式细胞计数器或流式细胞分选仪上。 感染了SCP-缺失突变体的气囊含有两倍于接种了SCP+链球菌的 气囊炎性细胞(图4)。接种量增加一百倍没有改变这种差异。用1×106 SCP-细胞，菌株MJ3-15，感染的气囊含有的Gr-l阳性细胞的比接种 SCP+培养的气囊的三倍还多。在用SCP+链球菌接种的气囊中，约6％的 细胞是PMNs，而21％的细胞是其它种类的Mac-1粒细胞，包括 PMNs。相反地，用SCP-链球菌接种的气囊主要含有PMNs。Gr-1阳 性细胞的数量等于或大于Mac-1阳性细胞的数量。设定流式细胞计数器 的阀门，从而仅测量高度染色的粒细胞。其余没被任何抗体染色的70- 80％的细胞可能要么是低度染色的粒细胞、红细胞，要么是淋巴细胞。 在赖特氏染色的气囊的制备物中，用显微镜观察了大量的淋巴细胞。 从脾脏匀浆出现的链球菌SCP+克隆被高度包裹，且与水滴相似。相 反地，从淋巴结产生的少数SCP-菌落，更象接种物。它们是非粘液样或 中等粘液样克隆。这些数据暗示在感染后4小时内，M+SCP+的被包膜 的链球菌能够适应、繁殖和侵入血流。突变体和野生型链球菌的不同运 输情况，可能是因为在对SCP-细菌的应答中有更强有力的吞噬细胞流 入。巨噬细胞和/或皮肤树突状细胞可能更快地吞入SCP-链球菌并将它 们递送到淋巴结。突变体链球菌相对于野生型链球菌减少，这是一个意 外的发现，因为SCP-链球菌是M+的、并能在体外抵抗人嗜中性粒细 胞的吞噬。 实施例3 SCP是小鼠鼻咽集群所必需的 给小鼠鼻内接种，从而评价野生型(SCP+)和SCP-链球菌集群鼻咽的 相对能力。链霉素抗性的M49菌株CS101和缺失突变体MJ3-15被用于 这些试验。为了避免可能对小鼠有毒性，培养物不用小鼠来检查通过， 而且变异体的选择不再依赖M蛋白和/或在动物体中持留的SCP。 攻击链球菌菌株(1×108-9×108CFU)的16小时培养物，在含有 20％正常兔血清中培养，并用10μl PBS重新悬浮，用其给25g雌性 CD1(Charles River Breeding Laboratories，Inc.，Wilmington，M.A.)或Balb/c 小鼠(Sasco，Omaha NE)鼻内给药。通过在血琼脂平板上对培养物的稀释 进行铺平板，来测定活菌计数。接种后每天从被麻醉的小鼠采集喉拭 子，采集6到10天，并在含有200μg/ml链霉素的血琼脂平板上划线。 37℃温育过夜后，计数平板上β-溶血性克隆的数量。所有的攻击菌株都 用链霉素抗性标记以与可能持留于正常菌群的β-溶血性链球菌相区分。 在含有链霉素的血琼脂平板上培养喉拭子。出现一个β-溶血性克隆即被 定为阳性培养物。 给CD1远交系小鼠鼻内接种2×108固相CFU。每日从被麻醉的小 鼠的鼻咽取拭子，连续取8-10天，并在含有链霉素的平板上划线。SCP+ 和SCP-之间的差异在第一天是明显的，然而，统计上显著的差异直到第 3和4天才观察到(图5)。到第4天9/18的用M+SCP+链球菌感染的小鼠 产生阳性的喉培养物，尽管用M+SCP+菌株感染的小鼠仅有2/18在其咽 喉保留链球菌。18只小鼠中有4只死于SCP+链球菌感染。没有小鼠在感 染SCP-细菌后死于感染。血琼脂平板上克隆的数量也是与SCP-链球菌 被更快地清除相一致的。例如，在第3天有7只小鼠的培养含有＞100 SCP+CFU，尽管只有1只接种了SCP-链球菌的小鼠含有100CFU。 因为M49链球菌更常与皮肤感染相关，所以用一种M6菌株，一种 更常与咽喉感染相关的血清型，重复上面的试验。利用M6菌株 UAB200以及先前在实施例1中所述的策略，构建一种插入突变体，菌 株AK1.4。菌株AK1.4也比野生型M6菌株培养被更快地从鼻咽部清除 (图6)。以上的试验证明，A群链球菌依赖于SCP在小鼠鼻咽中持留。以 上试验中使用的全部SCP-变异体都是M+的，也就是说，它们能抵抗人 的新鲜血液的吞噬作用。然而，它们被从鼻咽粘膜清除。 实施例4 用纯化的重组SCPA49给小鼠鼻内免疫阻断鼻内攻击后的集群 a)编码Thr63到His1031的重组疫苗△SCPA49的构建(图2和图7)。 从CS101 M49 A群链球菌(△SCPA49)克隆了一个对应于截短形式的 scpA49基因的PCR片段。利用一个开始于1033位核苷酸的正向引物和 一个开始于3941位核苷酸的反向引物扩增此片段(编号对应于Chen，C.， 和Cleary，P.，“酿脓链球菌的链球菌C5a肽酶基因的完整核苷酸序 列”，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，265：3161-3167(1990)中的编号)。将 此片段连接到Pharmacia Inc.的pGex-4T-1高表达载体上谷胱苷肽转移酶 基因的凝血酶结合位点。此质粒含有重组的scpA片段，被命名为 pJC6，已经依据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定在美国典型菌种保 藏中心(American Type Culture Collection，Rockville，MD)保藏，并且指定 了ATCC登记号为98225。 利用一个含有BamH I识别序列(5′-CCCCCCGGATCCA CCAAAACCCCACAAACTC-3′)(第8号序列)的scpA49正向引物和一个 scpA49反向引物(5′-GAGTGGCCCTCCAATAGC-3′)(第9号序列)，扩 增△SCPA49，即scpA 49的一个2908bp长的片段。从所产生的PCR 产物中删除了编码SCPA蛋白信号肽和膜铆定区的序列。PCR产物用 BamHI消化，并连接到Pharmacia Inc.(Piscataway，NJ)的pGEX-4T-1高 效表达载体中谷胱苷肽转移酶基因的凝血酶识别位点上BamH I和Sma I限制酶切位点处。重组质粒被转化进E.coli.DH5α。在谷胱苷肽 Sepharose 4B柱上通过亲合层析纯化了一个转化体E.coli.(pJC6)的△ SCPA49融合蛋白。表达来自一个E.coli.克隆的转移酶-SCP融合蛋白， 并在谷胱苷肽Sepharose 4b柱上进行亲合层析将其纯化。全部方法均由 生产商描述(Pharmacia)。通过凝血酶消化从此杂合蛋白中切除△ SCPA49。凝血酶通过在苯脒Sepharose 6B柱(Pharrnacia)上层析而从被洗 脱的SCP中去除。用凝血酶消化以后，在苯脒Sepharose 6B柱 (Pharrnacia)上层析，从而去除凝血酶。表达和纯化的方法由生产商描 述。利用SDS-PAGE和Western印迹证明，亲合纯化的蛋白是纯的。利 用PMN粘附试验(如上在实施例1中所述)测试时发现，亲合纯化的截短 的△SCPA49蛋白缺乏肽酶活性。在兔中制备针对纯化的△SCPA49的超 免疫抗血清。 b)免疫和攻击方案。给四周龄远交系CD1雌性小鼠的每一个鼻孔给 药20μg亲合纯化的溶于10μl PBS的△SCPA49而对其进行免疫。小 鼠在交替的日子中被免疫3次，并在第3次免疫后三周之内再次加强免 疫。在休息两周后，小鼠被再次加强免疫。参阅D.Bessen等，“用对应 于M蛋白保守表位的合成肽鼻内免疫对A群链球菌粘膜集群的影响”， 传染与免疫(Infect.Immun.)，56，2666-2672页(1988)。对照小鼠仅接受 PBS。感染之前，通过酶联免疫试验(ELISA)测定所有用△SCPA49蛋白 免疫的小鼠，发现在其血清和唾液中有高滴度的抗△SCPA49蛋白的抗 体。A群链球菌，菌株CS101(2.0×108CFU)，CS210(3.6×108CFU)， CS463(7.8×108CFU)，90-131(3.4×108CFU)，及UAB200(9.6×108CFU) 被用来在最后一次疫苗激发剂之后7天攻击小鼠。依据美国国立卫生研 究院(National Institutes of Health)的指导方针进行动物研究。 c)样品采集及ELISA。从免疫后被麻醉的动物采集血液和唾液样 品。如前所述，所有的血清都通过ELISA测试SCPA49抗体的存在。参 阅S.P.O′Connor等，“人对链球菌C5a肽酶的抗体应答”，传染病杂志(J. Infect.Dis.)，161，109-116页(1990)。通过加入500ng溶于0.05M碳酸氢 盐缓冲液(pH 9.6)的SCPA49蛋白，使纯化的SCPA49蛋白结合到微量滴 定板的小孔上。在4℃下温育过夜之后洗涤各孔，然后用溶于PBS的 0.5％BSA封闭各孔1小时。通过皮下注射100μl 0.1％匹鲁卡品 (Sigma)溶液刺激唾液分泌。采集唾液样本，并Eppendorf小型离心机在 14,000rpm自旋5分钟。通过ELISA测试上清抗△SCPA49的分泌型IgA 的存在。ELISA滴度代表OD405≥0.1的单个血清和唾液的最高稀释 度。 d)对于△SCPA49的抗体应答的评价。本发明用纯化的△SCPA49 免疫兔对△SCPA49亚基疫苗的免疫原性进行了评价。通过ELISA测 定，发现兔产生了高水平的抗△SCPA49蛋白抗体。虽然纯化的△ SCPA49免疫原缺乏有功能的活性，兔超免疫抗血清能够体外中和纯化 的野生型SCPA49酶的肽酶活性。而且，没有稀释的兔抗△SCPA49蛋 白抗血清能够中和与不同血清型相关的C5a肽酶活性(图8)。与完整的 M1、M6和M12链球菌相关C5a肽酶活性被此抗血清抑制，这证明抗△ SCPA49蛋白的抗体缺乏血清特异性。 同样，从10只免疫小鼠和10只对照小鼠采集血清和唾液样本，从 而评价△SCPA49蛋白经过鼻内途径不加佐剂给药时其免疫原性。与用 PBS免疫的对照小鼠(图9)做比较，用纯化的△SCPA49蛋白免疫的小鼠 在其血清中产生了高滴度的△SCPA49特异性IgG。针对△SCPA49的血 清IgG滴度范围在1∶10,240到1∶20,480。相反地，在血清中没能检测到 对照小鼠的△SCPA49特异的IgG。用纯化的△SCPA49蛋白免疫的小 鼠，相对于对照小鼠，也显示出△SCPA49特异性唾液sIgA的显著增 加。在被免疫过的小鼠的唾液中，特异性sIgA滴度大于1∶16。相反地， 在对照小鼠的唾液中，不能检测到针对△SCPA49的sIgA。在分别稀释 1/2560的血清和稀释1/2的唾液中，IgG和IgA的相对浓度显示于图9。 这些结果证明，纯化的△SCPA49蛋白鼻内给药时是一种有效诱导小鼠 特异性全身及分泌型抗体应答的免疫原。 e)疫苗△SCPA49对于链球菌从被感染的小鼠中清除的影响。进行 试验从而确定用C5a肽酶免疫是否会增强链球菌从鼻咽清除。含有高水 平的抗-SCPA抗体的兔和人超免疫血清都能体外中和SCPA活性。S.P. O′Connor等，“人对链球菌C5a肽酶的抗体应答”，传染病杂志(J． Infect.Dis.)，161，109-116页(1990)。SCPA能显著地帮助口腔粘膜集群的 事实暗示，用纯化的△SCPA49给小鼠免疫能减少链球菌在鼻咽colonize 的能力。用亲合纯化的遗传上被灭活的SCPA免疫小鼠，从而测试这种 可能性。截短的蛋白，△SCPA49，不加佐剂或载体地鼻内给药。用野生 型M+SCPA+链球菌接种过的小鼠的咽部集群，与那些使用以纯化的△ SCPA49蛋白的两种不同制剂接种过的小鼠进行的三个独立试验中用 PBS免疫过的那些结果显著不同(表3及表4；图10)。接种10天后， 13只用△SCPA49蛋白免疫过的小鼠中仅有一只是链球菌培养阳性的(表 4；图10)。相反地，未接种的对照的30-58％保持培养阳性6天，并且 有一些在感染7天后仍然是阳性的。血琼脂平板上-溶血性、链霉素抗 性克隆的数量，也说明了用△SCPA49接种的小鼠和对照之间的显著差 异。不同组中被免疫的小鼠从其鼻咽清除血清型M49链球菌比未免疫的 对照显著地更快。 表3.用PBS或在E.coliDH5α中表达的SCP鼻内接种小鼠， 鼻内攻击以后咽喉的链球菌培养(接种以后的CFU) 攻击后天数 小鼠 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PBSCT-II 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 77 ＞200 150 4 11 3 0 51 97 53 4 9 ＞200＞200 3 11 3 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 4 6 45 47 3＞200 29 ＞200 83 70 7 15 194＞200 9 172 10 5 3 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 32 4 4 0 0 0 0 0 0 10 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13 127 4 0 0 0 0 0 0 0 0 阳性 数量 8 6 5 5 4 4 2 3 2 2 SCPAD-II 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 21 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 阳性 数量 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 表4.用PBS或在E.coliDH5α中表达的SCP鼻内接种小鼠， 鼻内攻击以后咽喉的链球菌培养(接种以后的CFU) 小鼠* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PBSCT-I 1 112 143 85 16 0 0 0 0 0 0 2 127 27 18 89 3 7 7 7 70 3 3 ＞200 ＞200 ＞200 ＞200＞200 ＞200＞200 108＞200 66 4 31 200 4 2 0 0 0 0 0 0 5 4 0 0 3 3 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 ＞200 ＞200 120 125 91 145＞200＞200＞200 166 8 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 37 ＞200 194 16＞200 47＞200 101＞200 ＞200 阳性 数量 8 6 6 7 5 4 4 4 4 4 SCPAD-I 1 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 105 41 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 9 0 11 0 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 19 0 0 5 57 0 0 21 91 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 阳性 数量 7 2 1 0 1 1 0 0 1 1 *小鼠接种两次，因为第一次接种时细菌的剂量太低。 最后，检查了一种血清型的SCP是否会免疫动物抗其它血清型的感 染。有超过80种不同的血清型的A群链球菌。一种有效的疫苗应该预 防不止一种链球菌血清型的感染。利用链球菌OF+血清型M2和M11与 OF-血清型M1和M6，产生抗集群的交叉保护。针对血清型M49链球菌 的△SCPA49蛋白的兔血清，中和与数种血清型相关的肽酶活性，这个 事实暗示，用单个亚基疫苗免疫可能减少或消除那些血清型的集群。为 了探究这种可能性，如上所述，通过用亲合纯化的△SCPA49蛋白鼻内 接种免疫分成四组的20只小鼠。对照小鼠接受PBS。在用链球菌攻击以 前，分析从随机选择的免疫及对照小鼠中采集的血清及唾液样品的抗- SCPA抗体。所有受试的被免疫小鼠，都产生了强烈的血清抗体应答以 及可以测量的唾液抗体应答。用△SCPA49蛋白免疫过的小鼠的全部4 种血清型的菌株的咽部集群，相对于未免疫的对照得到了降低。接种后 第3天和第5天差异最显著(表5)。 表5.免疫保护性是 血清型非依赖型的 接种后 接种后 第三天 第五天 非免疫的 免疫 非免疫的 免疫 (阳性/总数)％ (阳性/总数)％ (阳性/总数)％ (阳性/总数)％ M2 10/19 52. 2/19*10. 3/19 15.8 1/19 5.2 6 5 M11 17/20 85 11/20* 55 8/20 40 2/20* 10 M1 16/19 84. 11/19 57. 7/19 37 2/19* 10. 2 9 5 M6 14/20 70 12/19 63 8/20 40 4/19 21. 2 1 +指培养阳性小鼠。 *在免疫或未免疫的小鼠之间的差异在统计上是显著的(P＜0.05).P值通过X2分析来计算 在用血清型M2、M11和M1菌株接种的免疫及对照小鼠之间，观察 到统计上显著的差异。然而，OF+血清型M2和M11更有效地被免疫过 的小鼠清除，而不是OF-菌株M1和M6更有效地被免疫过的小鼠清 除。被免疫过的小鼠的M1链球菌的集群，相对于对照被显著的降低 了。仅有10.5％的被免疫过的小鼠到感染后第5天是培养阳性的。相反 地，37％的对照是此种菌株培养阳性的。虽然被免疫过的小鼠似乎更快 地清除M6链球菌，但是这种差异在统计上是不显著的。正如以前试验 中一样，从被接种的小鼠采集的样品的血琼脂平板-溶血性链球菌克隆 的数量显著地少于从对照动物采集的样品的血琼脂平板-溶血性链球菌 克隆的数量。因此，△SCPA49蛋白是一种提供抗其它链球菌血清型交 叉保护的有效疫苗。 实施例5 SCPA49的定点突变 A群链球菌血清型能分为两个大类，OF+和OF-菌株。后者更常与风 湿热及中毒性休克相关，而OF+菌株是脓疱病及急性肾小球性肾炎常见 的一种原因。虽然各类SCPA蛋白有95-98％相同，但是对其免疫应答 可能稍微不同。这种担忧促使了平行开发M1 OF-菌株及M49 OF+菌株的 已经被确定的变异体SCPAs的努力。使用预期将使此酶灭活的那些氨基 酸，替换催化活性所必需的氨基酸(图1)。SCPA49的N和C-末端氨基 酸边界，被表达的pGEX-4T-l亚克隆，分别是Asn32和His1139(图1和 8)。SCPA49蛋白的Ser512(SCPA49S512A)、Asn295(SCPA49N295A)及 Asp130(SCPA49D130A)被Ala取代，而Asn295(SCPA49N295R)被Arg取 代(Deborah Stafslien，Ms.Thesis，University of Minnesota)。 用来将突变导入链球菌菌株CS101 scpA49基因的方法，是定点突变 “巨型引物(megaprimer)”方法。Bank，S.，“巨型引物PCR体外定点突 变”，见：分子生物学方法57卷：体外突变程序(Methods in Molecular Biology，Vol.57：In Vitro Mutagenesis Protocols)，Humana Press，Inc. Totowa，NJ(1996)。使用引物scpFor940(5′-CCCCCCGGATCCAA TACTGTGACAGAAGACACTCC-3′)，第10号序列，和scpmutrev1883 (5′-TTTCTGGAACTAGTATGTCTGCGCC-3′)，第11号序列号，扩增一段 1450bp双链PCR产物，引进丝氨酸突变。第一个PCR产物，即一个 “巨型引物”，使用Qiagen Qiaquick Gel Extraction Kit进行纯化，然后 用于第二个不对称PCR反应以扩增含有预期突变的3.3kb scpA49基 因。进行5个循环的变性(93℃，1分钟)后延长(72℃，5分钟)，加入反 向引物scpRev4263，(3′-CCCCCCCTCGAGATGTAAACGATTTGTATCC TTGTCATTAG-3′)第12号序列。72℃下第5次循环期间，以1mM的 浓度加入反向引物。通过25次循环(94℃1分钟，58℃2分钟，72℃2-3.5 分钟)扩增。除了没加正向引物以及巨型引物以每100μl反应4-6μg的浓 度加入以外，反应物浓度与以前的部分所描述的一样。此方法产生变异 蛋白SCPA49S512A(见下表6)。 用与上述几乎相同的方式构建天冬氨酸和天冬酰胺变异体，分别使 用反向引物scpnzutrev717 (5′-CAGTGATTGATGCTGGTTTTGATAA- 3′)，第13号序列号及scpnzutrev1214(5′-AGCTACTATCAGCACCAG- 3′)，第14号序列号，构建311bp和805bp巨型引物。引物 scpmnutrev717被用来产生突变蛋白SCPA49D130A，而引物scpmutrev 1214被用来产生突变蛋白SCPA49N295A(见下表6)。然而，在Qiaquick 纯化之后，用0.1U绿豆核酸酶(每4μg DNA)处理巨型引物，并在30℃ 温育10分钟。利用酚/氯仿提取除去核酸酶，利用乙醇沉淀从水相中回 收巨型引物。将小团重新悬浮于80μl无菌双蒸水，并将其中37μl用于每 100μl不对称PCP反应。随后按前所述，将突变的基因克隆到pGEX 4T-1 中。使用35S-标记的dATP及测序酶试剂盒(Sepuenase kit)，或者使用自 动荧光测序法(automated fluorescent sequencig)在明尼苏达大学微化学中 心(University of Minnesota Microchemical Facility)进行突变体测序。 表6：突变蛋白的氨基酸序列比较 127 132 291 297 508 514 876 883 Wild-type SCPA49 AVIDAG TSAGNDS LSGTSGT STLGSRF SCP S512A49 AVIDAG TSAGNDS LSGTAGT STLGSRF SCP D130A49 AVIAAG TSAGNDS LSGTSGT STLGSRF SCP N295A49 AVIDAG TSAGADS LSGTSGT STLGSRF 这项工作以前是利用E.coli表达载体pGEX 4T-1过度表达作为 GST融合蛋白的突变体SCPA。根据GST基因融合系统手册(GST Gene Fusion System Handbook)(Pharmacia)中提供的标准程序纯化重组的 SCPA。如上所述，SCPA蛋白抗原通过亲合层析方法被纯化。 实施例6 SCPA1及SCPB突变体的构建 利用PCR按以下的方式从酿脓链球菌(菌株90-226)的M1的血清型 扩增野生型scpA1基因。设计引物，使得完整基因仅有一个片段被表 达。此片段对应于成熟蛋白的起点并恰好在细胞壁结合结构域残基Asn32 到Asp1038之前终止(图2)。正向引物5′-CCCCCCGAATTCATTACTGTG ACAGAAGACACTCCTGC-3′(第15号序列)退火开始于第940号碱基 (编号对应于Chen，C.，和Cleary，P.，“酿脓链球菌的链球菌C5a肽酶基因 的完整核苷酸序列”，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，265：3161-3167(1990) 的编号)。相反的，反向PCR引物，5′-CCCCCCGGATTCTTATT GTTCTGGTTTATTAGA GTGGCC-3′(第16号序列)恰好在DNA重复区 域上游第3954号碱基处退火。预测此蛋白的这个重复区域是通过细胞壁 肽聚糖、并在此后附着到细胞壁肽聚糖的部分。各引物的斜体区域是已 经加到酿脓链球菌序列上从而使克隆过程得以进行的附加序列。正向引 物的下划线区域掺入一个EcoR I限制性酶切位点，而反向引物的下划线 区域掺入一个BamH I限制性酶切位点。反向引物还在基因的阅读框中 掺入一个终止翻译的终止密码子(TAA)。 所产生的对应于碱基940-3954的PCR产物被克隆进一个中间载体 pCR2.1中(Invitrogen，Inc.)，并被转化进E.coli Top10F细胞内(Invitrogen， Inc.)。用EcoR I和BamH I对一个合适转化体的质粒DNA进行限制性 酶切割。含有scpA1的片段的3018碱基长片段依据标准程序进行凝胶纯 化，并连接到用同样的酶进行限制性酶切的表达载体pTrc99a(Pharmacia) 上。连接产物被转化进E.coli.DH5á细胞，并选择含有预期质粒构建的转 化体。所产生的质粒中scpA1的PCR片段被置于Shine-Dalgamo序列及 ATG启始密码子之后，并处于可被别乳糖类似物IPTG诱导的trc启动子 的转录控制之下。 依据C.L.Fisher和G.K.Pei，“基于PCR的定点突变方法的修 改”，生物技术(BioTechniques)，23：570-574(1997)所描述的程序，构建 野生型scpA1的定点遗传突变体。通过与枯草杆菌蛋白酶一样丝氨酸蛋白 酶家族的序列比较，预测了SCPA1内对于蛋白酶活性起重要作用的合适 的氨基酸残基。Siezen，R.J.，等，“枯草杆菌酶(subtilases)，枯草杆菌蛋 白酶-样丝氨酸蛋白酶家族的同源性模拟及蛋白质工程策略”，蛋白质工 程(Protein Engineering)，4：719-737(1991)；Chen，C.，和Cleary，P.，“酿脓链 球菌的链球菌C5a肽酶基因的完整核苷酸序列”，生物化学杂志(J.Biol. Chem.)，265：3161-3167(1990)。在此家族内保守的三个氨基酸残基，参 与了活性位点的形成。在SCPA1中，这些对应于Asp130、His193、和 Ser512。设计了三组非重叠寡聚核苷酸用于通过PCR改变这些氨基酸残基 中每一个残基。设计了这些寡聚核苷酸，彼此远离地扩增DNA相反链。 在各组引物中，引物5′端将含有编码这些被用于突变的氨基酸中的一个 氨基酸的密码子，此密码子将被改变，从而使其编码一个丙氨酸。这三 组引物列举如下；斜体部分是被改变的密码子。 D130A： 正向引物(第17号序列) 5′-ATTGCTGCTGGTTTTGATAAAAATCATGAAGCG-3′ GAT密码子变为GCT，对应的天冬氨酸变为丙氨酸。 反向引物(第18号序列号) 5′-CACTGCAACAACAGTCCC-3′ H193A： 正向引物(第9号序列) 5′-GAGGCCGGCACACACGTG-3′ CAC密码子变为GCC，对应的组氨酸变为丙氨酸。 反向引物(第20号序列) 5′-TTGATCGACAGCGGTTTTACC-3′ S512A： 正向引物(第21号序列1) 5′-ACTGCTATGTCTGCTCCATTAG-3′ ACT密码子变成GCT，对应的丝氨酸变为丙氨酸。 反向引物(第22号序列) 5′-TCCAGAAAGTTTGGCATACTTGTTGTTAGCC 将这些PCR引物组用于三个独立反应：模板DNA是pLP6O5，含有 野生型scpA1序列。PCR产物随后自身连接并转化进E.coli.Top10F (Invitrogen，Inc.)。筛选具有合适大小和限制性模式的转化体。S512A突 变体的序列变化破坏了一个特有的Spe I限制性酶切位点，从而使此突 变能直接通过限制性分析进行鉴定。所有潜在的突变体都通过DNA测序 来确定。随后，将D130A突变与S512A突变组合，利用此蛋白的这两 个区域之间特有的Pst I位点形成一个双链突变体。最后的变化是，通过 将突变的scpA1基因移到一个先前已被改变的含有卡那霉素基因的 pTRC99a载体(Pharmacia，Inc.)上，使抗生素选择从青霉素变为卡那霉 素。 使用以上所描述的制备SCPA1突变株所用的方法，构建了一个 SCPB蛋白突变体。从B群链球菌(IIva+型)克隆了野生型SCPB基因。 实施例7 突变蛋白的分析 从各突变体构建体表达的蛋白用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分 析，预测此蛋白的大小是121kD。然而，此酶羧基端的富含脯氨酸的跨 细胞壁结构域使此蛋白在SDS-PAGE期间的迁移稍微慢一点，所以，用 SDS-PAGE确定的表观分子量是130kD。因为有活性的SCP可能对宿主 有害，所以突变蛋白缺少酶活性是很重要的。此为突变蛋白的两种性 质。在表7中比较了利用PMN粘附试验测定的野生型和突变体蛋白的比 活。这些试验说明，被取代的氨基酸使酶的活性降低了超过90％。 表7：PMN粘附试验测定突变型蛋白酶活性 蛋白 活性(U/mg*10-3) 野生型 170 SCPA49D130A ＜20 SCPA49N295A ＜20 SCPA49S512A ＜20 还比较了突变体蛋白与野生型蛋白结合抗野生型酶的抗体的能力。 为此目的使用了竞争性ELISA试验。竞争性ELISAs测量可溶抗原对抗 体结合固定化抗原的抑制。将恒定量的野生型抗原结合到微量滴定板的 小孔上。同时加入恒定量的抗体和变化量的可溶性的竞争性抗原。用抑 制百分数对抗原浓度曲线的斜率来估计可溶性抗原对抗体相对结合力。 虽然不知道抗血清中抗-SCPA的准确浓度因而不能计算结合常数，但是 对数种蛋白的相对结合力做了比较(图11)。因为抑制百分数对浓度曲线 的斜率对于野生型和突变体蛋白是一样的，所以得出结论：氨基酸残基 取代不改变抗体结合突变体蛋白的能力。 同时也测定重组的SCPA1、SCPA49及SCPB蛋白能同样好地结合 抗-SCPA的抗体(图12)。在此试验中平板抗原是SCPA49，而抗体是兔 抗-SCPA49。此抗体对这些抗原的亲和力由这些曲线显示是高度相似 的。这些结果显示M49 OF+和M1 OF-A群链球菌及B群链球菌的 SCPA蛋白关于抗体识别是相同的，并且可以在一种疫苗制剂中相互交 换地使用。 实施例8 SCPA抗原的皮下(SQ)给药在小鼠中诱导保护作用 所有早期的保护研究都是通过鼻内无佐剂地给药亲合纯化的 SCPA49蛋白。抗原肌肉及皮下注射在历史上是优选的，更为人们所接 受的疫苗投药方法。因此，进行试验测试SCPA和MPL/明矾的皮下注射 是否诱导保护性免疫应答，以及当A群链球菌的攻击菌株与SCPA疫苗 的来源血清型不同时那种应答是否减少集群。通过喉培养或通过取样所 切割鼻组织来评价被免疫的小鼠从口鼻咽粘膜清除链球菌的能力。代表 性喉培养物数据列于表8。 表8：小鼠皮下接种 疫苗a 激发细菌b 克隆化百分数c 对照小鼠 SCPA-免疫小鼠 SCPA49S512A OF+M49 64％(3) 36％ △SCPA49 OF+M49 64％(3) 20％ △SCPA49 OF-M1 33％(5) 8％ SCPA1S512A OF-M49 23％(5) 8％ a疫苗含有10μg与佐剂MPL及明矾混合的所示抗原。各实验组含 有13-20小鼠。对照小鼠用破伤风类毒素与相同的佐剂混合后免 疫。 b小鼠通过鼻内接种感染。 c通过喉培养物评定集群。括号中的数字显示培养物被采集的天数。 通过皮下注射三种不同形式的SCPA抗原中的每一种抗原而进行免 疫的小鼠诱导了适度的保护作用。用△SCPA49免疫保护小鼠抗OF-Ml 和OF+M49菌株。SCPA49S512A SCPA1S512A被选择用于随后的研 究。 通过一个更加定量的试验评价了链球菌鼻内攻击后的持留。此方法 包括在感染后不同时间处死小鼠，切取鼻组织(NT)，随后分析鼻组织的 活链球菌(CFU)。在缓冲液中将标准量的NT匀浆，并通过活菌计数测定 每毫克组织的CFU数量。 用SCPA49S512A、SCPA1S512A或破伤风类毒素皮下免疫三组小 鼠。所有疫苗都与以前一样与佐剂MPL/明矾混合。小鼠接受了四次5 ì g 蛋白抗原的注射，接着在最后一次注射后接受两周攻击。用OF+M49菌 株CS101攻击后16小时收获了鼻组织。每毫克组织的CFU几何平均值 由表9表明。 表9：每毫克鼻组织的CFU集合平均值 疫苗抗原 16小时a 破伤风 571b SCPA49S512A 2.27 SCPA1S512A 1.60 a.小鼠鼻内感染之后获取鼻组织的时间。 b.数值是对数值。 与鼻组织相关的链球菌数量正如预期的一样随时间下降，在用 SCPA免疫的小鼠中这种下降更快也更完全。已经用SCPA免疫过的所 有组小鼠都保留了比对照组小鼠少的链球菌。在此试验中用 SCPA1S512A进行的免疫是非常有效的，它诱导了一个交叉的保护应 答，因为攻击菌株CS101是OF+M49而疫苗蛋白SCPA1S512A的来源 是OF-M1菌株。这些结果证明，一个单一的SCPA能诱导抗异种血清 型的保护作用。保护作用由中和细菌表面的肽酶活性的抗体提供。这增 加了链球菌在粘膜组织沉积以后的数小时内吞噬细胞的流入。假设，链 球菌被吞噬细胞快速清除将预防细菌随后的增殖和持留。当用ELISA进 行分析时，小鼠一律有1∶32,000或更大的IgG滴度，显示SCPA抗原和 佐剂皮下注射一贯地诱导强烈的抗体应答。 实施例9 B群链球菌的C5a肽酶在序列上几乎与A群链球菌 M12及M49完全相同 B群链球菌C5a肽酶(SCPB)基因被克隆、测序，并与A群链球菌 M12及M49比较。使用对应于部分scpA12序列的引物，使用以上所描 述的方法，通过PCR扩增完整的scpB基因。SCPB基因编码一种 3450bp的开放阅读框(ORF)，它特定编码了一个长1150氨基酸、分子量 为126,237的蛋白。SCPB的氨基酸序列如图2所示。ScpB的核苷酸序 列及其推定的氨基酸序列与M12及M49 A群链球菌之间做比较，显示 高度相似性，分别是98％和97％。ScpB含有一个50bp的缺失，此缺失 与C-末端重复区域中的两个相重叠，并且相对于scpA12基因有数个其 它的小差异。这些序列的成线法比较显示，scpA12在系统发育上实际上 是与scpB更近，而不是和scpA 49更近。三十个代表血清型III，III/R，II， Ia/c，NT/c，NT/c/R1的菌株，携带了一个scpB拷贝。 使用表达载体pGEX-4T-1质粒(ATCC登记号98225)在E.coli中表达 重组的SCP，并且显示，重组的SCP与从亲本B群链球菌菌株78-471 (II a＋b型)提取的酶完全相同。Western印迹分析显示，重组的SCP与以 前从B群链球菌纯化的C5ase酶完全相同。 这里所引用的所有公开、专利及专利文件都并入本发明一起考虑， 即使有些是单独引用的。本发明所描述的关于各种特定的和优选的实施 方案和技术，应该理解为在此基础上做出许多变化和修改却仍然不超出 本发明之范围。 本发明是1996年1月22日递交的美国专利申请号为08/589,756的 部分继续申请(continuation-in-part)。同时参阅USSN 08/589,756并将部 分内容加入本发明。 <110>明尼苏达大学董事会 <120>链球菌C5a肽酶疫苗 <130>600.450W0l <150>US 09/206,898 <151>1998-12-07 <150>US 08/589,756 <151>1996-01-22 <160>23 <170>FastSEQ for Windows Version 3.0 <210>1 <211>1164 <212>蛋白质 <213>酿脓链球菌 <400>1 Leu Arg Lys Lys Gln Lys Leu Pro Phe Asp Lys Leu Ala Ile Ala Leu 1 5 10 15 Met Ser Thr Ser Ile Leu Leu Asn Ala Gln Ser Asp Ile Lys Ala Asn 20 25 30 Thr Val Thr Glu Asp Thr Pro Ala Thr Glu Gln Ala Val Glu Thr Pro 35 40 45 Gln Pro Thr Thr Val Ser Glu Glu Val Pro Ser Ser Lys Glu Thr Lys 50 55 60 Thr Pro Gln Thr Pro Asp Asp Ala Glu Glu Thr Val Ala Asp Asp Ala 65 70 75 80 Asn Asp Leu Ala Pro Gln Ala Pro Ala Lys Thr Pro Asp Thr Ser Ala 85 90 95 Thr Ser Lys Ala Thr Ile Arg Asp Leu Asn Asp Pro Ser Gln Val Lys 100 105 110 Thr Leu Gln Glu Lys Ala Gly Lys Gly Ala Gly Thr Val Val Ala Val 115 120 125 Ile Asp Ala Gly Phe Asp Lys Asn His Glu Ala Trp Arg Leu Thr Asp 130 135 140 Lys Ala Lys Ala Arg Tyr Gln Ser Lys Glu Asp Leu Glu Lys Ala Lys 145 150 155 160 Lys Glu His Gly Ile Thr Tyr Gly Glu Trp Val Asn Asp Lys Val Ala 165 170 175 Tyr Tyr His Asp Tyr Ser 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