聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶及其制备方法和应用 |
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| 申请号 | CN201510499115.4 | 申请日 | 2015-08-14 | 公开(公告)号 | CN105087530A | 公开(公告)日 | 2015-11-25 |
| 申请人 | 扬州艾迪生物科技有限公司; | 发明人 | 苗丕渠; 韩大雄; 厉道娟; 耿春晨; 王筱蒙; 池正昌; 沈小宁; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供一种聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶及其制备方法和应用。本发明采用聚乙二醇（PEG）修饰低分子量尿激酶（LMW-UK），聚乙二醇与LMW-UK的N-末端通过共价键方式连接，获得LMW-UK的聚乙二醇修饰产物。修饰产物均一性好、分离纯化工艺简单、活性回收率高，同时，显著延长了体内 半衰期 ，具有有效 治疗 高 纤维 蛋白原血症和 预防 动脉粥样硬化（AS）、血栓栓塞并发症、糖尿病血管并发症、糖尿病肾病等功效。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶，其特征在于：由聚乙二醇和低分子量尿激酶以共价键连接，低分子量尿激酶的N-末端通过共价键连接聚乙二醇。 |
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| 说明书全文 | 聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶及其制备方法和应用技术领域背景技术[0002] 尿激酶（Urokinase，简写为UK）是由人肾合成人尿释放的一种血纤溶酶原激活剂（Plasminogen Activator），也称双链尿激酶型纤溶酶原激活剂（tcu-PA），是尿激酶原（pro-UK，也称单链尿激酶型纤溶酶原激活剂，scu-PA）在纤溶酶、胰蛋白酶和激肽释放酶等158 159 158 159 作用下，Lys -Ile 间的肽键断裂后形成的有激活纤溶酶原功能的酶。由于Lys -Ile 148 279 间的肽键断裂后形成的A链和B链仍通过二硫键Cys -Cys 连接，分子量与Pro-UK相同，故称为高分子量尿激酶（High-Molecular-Weight Urokinase, HMW-UK），分子量约为54000 135 136 道尔顿。纤溶酶继续水解HWK-UK，在Lys -Lys 断裂失去EGF-like区和Kringle区，成为低分子量尿激酶（Low-Molecular-Weight Urokinase, LMW-UK），分子量约为33000道尔顿。尿激酶是临床上重要的溶栓药物，广泛用于心脑血管和外周血管等处血栓性疾病的治疗，但由于低分子量尿激酶缺乏纤维蛋白特异性，容易引起系统性出血等副反应，临床使用受到限制，因此，药典要求尿激酶原料药中HMW-UK比例需大于90%，在尿激酶纯化过程中需要去除低分子量尿激酶。 [0003] 高分子量尿激酶与低分子量尿激酶的溶栓作用机制有所不同，它们本身并不直接用于血块本身，而是首先激活体内的纤溶酶原，成为有活性的纤溶酶，纤溶酶降解纤维蛋白凝块，亦能降解血循环中的纤维蛋白原、凝血因子Ⅴ和凝血因子Ⅷ等，使其分解成可溶性多肽，高分子量的尿激酶能特异结合病变的组织，但低分子量尿激酶没有特异性识别功能。在用于提取纯化尿激酶的粗品中，LMW-UK 的比例高达30%，目前在医药研发中没有得到充分利用，本专利将着重开发其溶解纤维蛋白原的功能，开发有效治疗高纤维蛋白原血症的药物。 [0004] 纤维蛋白原(Fibrinogen, Fg)又称凝血因子Ⅰ，是由人肝细胞合成并分泌的一种糖基化蛋白，是促进血小板聚集的最主要的血液蛋白质，80%存在于血浆中，正常血浆含量为2～4 g/L。目前研究大都将空腹血浆纤维蛋白原水平>4.0g/L者称为高纤维蛋白原血症(Hyperfibrinogenemia)。在各种病理状态下，血浆纤维蛋白原的异常升高会增加血液黏度、促进血小板聚集、参与调控与炎症细胞、内皮细胞以及其他蛋白质的结合，通过改变血液流变学、损伤血管内皮、介导炎症反应以及参与血栓形成等多种途径参与机体多种疾病的病理过程。大量研究表明，血浆纤维蛋白原水平升高是动脉粥样硬化（AS）、血栓栓塞并发症和糖尿病血管并发症的重要危险因素，在糖尿病肾病的发生和发展上也起重要作用，严格控制这些危险因素是预防和延缓血管并发症发生和发展的重要措施。 [0005] 目前，对于高纤维蛋白原血症患者，临床治疗方案主要有：①应用抗血栓药物如阿司匹林或氯吡格雷来治疗高纤维蛋白原血症；②采用降纤酶等纤维蛋白溶解剂、tPA等降纤制剂来降低纤维蛋白原水平；③采用低分子肝素治疗，但只能短期用于高危病人；④对于严重的高纤维蛋白原血症，常采用体外血浆脂类过滤器治疗，JX-DELP体外脂类过滤器降脂治疗，有效的降低甘油三脂、脂肪肝、高粘血、高脂血等，安全可控。但是，以上的这些治疗方法都存在一定的缺陷和局限性，研究发现阿司匹林或氯吡格雷等药物在治疗糖尿病并发的高纤维蛋白血症的过程中，患者易出现过敏、梗死和出血等副反应；而在一些兴奋性毒素诱导的神经元死亡模型和卒中模型中，tPA会促进神经元死亡，还会增加脑出血的风险；降纤酶类药物由于来源问题，免疫原性较高，副作用较大。因此，开发长效、高效且免疫原性低的降纤药物，对延缓高纤维蛋白原血症相关疾病的发生发展，降低这些疾病的发病和死亡风险有着重要意义。 [0006] 尿激酶，尤其是低分子量尿激酶，能够有效、快速的激活纤溶酶原，降解血浆中高水平的纤维蛋白原，是治疗高纤维蛋白原血症、动脉粥样硬化（AS）、血栓栓塞并发症和糖尿病血管并发症的潜在治疗药物。它能有效激活纤溶酶原，使其转变为具有活性的纤溶酶，进而作用于血栓中的纤维蛋白原，使其转变为纤维蛋白及多肽而溶栓。也能直接作用于纤维蛋白原α链，释放α链物质，使血凝块分解为多肽，多肽物质在血液中被清除。而且，尿激酶是从人尿中提取，免疫原性低，但低分子量尿激酶药物存在半衰期短、稳定性不高等缺点，研究者都在积极探索提高这些药物药效的有效途径，其中聚乙二醇修饰被认为的一种行之有效的方法。 [0007] 聚乙二醇修饰蛋白质技术已广泛应用于生物医药领域，迄今聚乙二醇修饰蛋白质和其他化合物至少有四十余种。FDA已批准的PEG修饰产品有：聚乙二醇化腺苷脱氨酶、聚乙二醇化天冬酰胺酶、聚乙二醇化干扰素、聚乙二醇化粒细胞集落刺激因子等。 [0008] 聚乙二醇（PEG）是中性、无毒、无免疫原性、有良好生物相容性的高分子聚合物，具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，当耦连到药物分子表面时，可改变其生物分配行为和溶解性，产生空间屏障，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中被快速消除。因此，将蛋白多肽类药物进行PEG修饰，可以提高药物在体内的稳定性，以改善体内半衰期。 [0009] 蛋白质多肽的PEG化通常以其分子中的氨基、羧基和巯基等官能团为活性位点选择相应类型的PEG进行修饰。氨基修饰是最为常用的PEG修饰方法，早期PEG修饰主要针对赖氨酸的α或ε氨基，这类修饰剂反应所需要条件较为温和，对药物稳定性影响相对较小。但其反应选择性低、交联度不均一、副产物多、键结合不稳定且PEG自身杂质干扰较为严重，使蛋白的分离纯化和鉴定很困难，不利于工业化生产，因而逐渐被新一代PEG所替代。新一代PEG修饰位点更加明确，典型代表是mPEG-丙醛，经研究发现，醛基和伯胺通过Schiff碱，形成一个稳定的伯胺，在pH值相对较低时，N末端的α氨基与醛基有很高的选择性。相对于随机修饰，定点修饰能够针对特定基团或专一位点进行修饰，有利于保持蛋白质药物的活性，产物易于表征，产品质量更容易控制，已成为PEG修饰蛋白质药物的研究热点。 发明内容[0011] 为实现上述目的，本发明聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶采用的技术方案是：一种聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶，由聚乙二醇和低分子量尿激酶以共价键连接，低分子量尿激酶的N-末端通过共价键连接聚乙二醇。 [0012] 聚乙二醇分子通过共价键连接低分子量尿激酶分子亚基构成。 [0015] 单甲氧基聚乙二醇分子为直链型或分支型。 [0016] 单甲氧基聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇醛。 [0017] 所述的聚乙二醇分子量为5kDa~60kDa。作为优选，所述的聚乙二醇分子量为5kDa~40kDa。作为再优选，所述的聚乙二醇分子量为20kDa~40kDa。 [0018] 所述的低分子量尿激酶是天然提取的低分子量尿激酶或通过基因工程技术获得的重组的低分子量尿激酶。作为优选，所述的低分子量尿激酶是从健康人尿液中提取、纯化获得。 [0019] 本发明还提供一种聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶的制备方法，该方法步骤简单，易于实现，适合工业化生产。 [0020] 为实现上述目的，本发明聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶的制备方法采用技术方案是：一种所述的聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶的制备方法，包括以下步骤： （1）配制修饰反应缓冲液，离子强度为10~500mmol/L，pH值为4~9; （2）低分子量尿激酶与活化聚乙二醇在步骤（1）提供的条件反应2~48小时，反应温度为4~60℃； （3）经步骤（2）反应得到的修饰产物经阳离子离子交换层析进行分离纯化，洗脱收集所述的聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶洗脱峰，经浓缩后得到所述的聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶。 [0021] 步骤（3）中，（a）阳离子层析凝胶为SP-Sepharose Fast Flow、CM-Sepharose Fast Flow、SP-High Performance或Mono-S，优选SP-Sepharose Fast Flow；（b）调节样品溶液的pH值和电导，用已经平衡好的SP柱上样，再用平衡液冲洗；(c)继续用冲洗液进行冲洗，收集冲洗峰；(d)最后用洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰。 [0023] 步骤（b）中，调节样品溶液的pH值为4.0~8.0，电导1~10mS/cm。优选条件pH5.5，电导5mS/cm。 [0024] 步骤（c）为冲洗步骤，使用pH4.0~8.0，0.01~0.2M醋酸盐缓冲液，含有0.05M~0.3M氯化钠。优选0.1M醋酸盐缓冲液，含有0.05M氯化钠，pH5.5进行冲洗。 [0025] 步骤（d）为洗脱步骤，使用pH4.0~8.0，0.01~0.2M醋酸盐缓冲液，含有0~1.0M氯化钠。优选0.1M醋酸盐缓冲液，加入0.1M氯化钠，pH5.5进行洗脱。 [0026] 步骤（b）中，收集上样和平衡穿透，主要含有未参与修饰的游离的PEG-ALD；步骤（c）中，收集冲洗液，主要含有未参与修饰的低分子量尿激酶； 步骤（d）中，收集洗脱液，主要含有PEG-ALD修饰后的低分子量尿激酶化合物。 [0028] 作为优选，上述的聚乙二醇与低分子量尿激酶发生共价结合反应的摩尔比例为1~50。作为再优选，所述的聚乙二醇与低分子量尿激酶发生共价结合反应的摩尔比例为 3~25。 [0029] 作为优选，上述的聚乙二醇与低分子量尿激酶发生共价结合反应的修饰反应缓冲液pH值为5~7。 [0030] 作为优选，所述的聚乙二醇与低分子量尿激酶发生共价结合反应的温度为4~37℃。 [0031] 作为优选，所述的聚乙二醇与低分子量尿激酶发生共价结合反应的反应时间为4~24小时。 [0032] 作为优选，上述的聚乙二醇与低分子量尿激酶发生共价结合反应采用NaCNBH3作为催化剂。 [0033] 作为优选，上述的阳离子层析凝胶为SP-Sepharose Fast Flow、CM-Sepharose Fast Flow、SP-High Performance或Mono-S。 [0034] 本发明还提供了聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶的应用。本发明获得的聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶具有长效、高效和低免疫原性等长效制剂的特征，为制备治疗高纤维蛋白原血症和预防动脉粥样硬化（AS）、血栓栓塞并发症、糖尿病血管并发症、糖尿病肾病等疾病的长效制剂奠定了基础。 [0035] 一种聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶的用途，用于制备治疗高纤维蛋白原血症和预防动脉粥样硬化、血栓栓塞并发症、糖尿病血管并发症、糖尿病肾病的药物。 [0036] 本发明还提供了一种治疗高纤维蛋白原血症的药物。 [0037] 一种治疗高纤维蛋白原血症的药物，其含有聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶作为有效成分。 [0038] 本发明还提供了一种预防动脉粥样硬化、血栓栓塞并发症的药物。 [0039] 一种预防动脉粥样硬化、血栓栓塞并发症的药物，其含有聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶作为有效成分。 [0040] 本发明还提供了一种预防糖尿病血管并发症、糖尿病肾病的药物。 [0041] 一种预防糖尿病血管并发症、糖尿病肾病的药物，其含有聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶作为有效成分。 [0042] 本发明与现有技术相比，具有以下优点：本发明采用对低分子量尿激酶的N-末端选择性高的修饰方法，即活化的聚乙二醇和低分子量尿激酶的N-末端通过共价键的方式连接，是产物的均一性和稳定性得到大大提高，容易纯化，纯化产物的活性能够得到较好地保留。修饰后的产物显著提高了稳定性、延长了体内半衰期、并减轻了副作用、增加了作用特异性。聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶能够用于治疗高纤维蛋白原血症和预防动脉粥样硬化（AS）、血栓栓塞并发症、糖尿病血管并发症、糖尿病肾病等疾病。聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶作为有效成分的药物能够有效治疗高纤维蛋白原血症和预防动脉粥样硬化（AS）、血栓栓塞并发症、糖尿病血管并发症、糖尿病肾病等疾病的功效。聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶的制备方法，该方法步骤简单，易于实现，适合工业化生产。 附图说明 [0043] 图1是采用SP-Sepharose Fast Flow层析柱对mPEG-ALD-20K修饰后的LMW-UK进行纯化后的SDS-PAGE电泳图。 [0044] 图2是纯化前mPEG-ALD-20K修饰LMW-UK样品的反相色谱图。 [0045] 图3是纯化后mPEG-ALD-20K修饰LMW-UK样品的反相色谱图。 [0046] 图4是mPEG-ALD-20K与LMW-UK反应混合物的MALDI-TOF MS检测结果图。 [0047] 图5是 mPEG-ALD-20K偶联蛋白和LMW-UK原蛋白大鼠静脉给药后的血药浓度随时间变化图。 具体实施方式[0048] 下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。 [0049] 如图1，泳道1：为mPEG-ALD-20K对LMW-UK修饰后的样品；泳道4：为0.1M醋酸盐+0.1M NaCl，pH5.5缓冲液洗脱制备的ALD-20K-LMW-UK纯蛋白；泳道7：蛋白Marker。 [0050] 如图2和图3所示，图2为纯化前mPEG-ALD-20K修饰蛋白，是未修饰的LMW-UK与mPEG-ALD-20K修饰的LMW-UK的混合物，可以看出修饰率高于50%。图3为纯化后mPEG-ALD-20K修饰蛋白，反相检测结果显示修饰蛋白呈单一吸收峰，单修饰产物纯度在95%以上。 [0051] 如图4，mPEG-ALD-20K与LMW-UK反应混合物的MALDI-TOF MS检测结果图，检测结果发现，混合物中含有未修饰的LMW-UK和修饰后的ALD-20K-LMW-UK蛋白，修饰蛋白的分子量约为53kDa，与预期相符。 [0052] 如图5，通过同位素标记示踪法对LMW-UK及ALD-20K-LMW-UK的药代动力学进行检测。实验结果显示，与未修饰的LMW-UK相比，ALD-20K-LMW-UK的血药浓度降低较为缓慢，半衰期明显增长，且AUC显著增高，血浆清除速度明显下降。 [0053] 1、聚乙二醇醛对低分子量尿激酶的修饰：（1）用10~100mM，pH5.0~7.0的磷酸盐缓冲溶液将高纯度低分子量尿激酶（LMW-UK）冻干粉配制成1~30mg/ml的溶液，优选50mM、pH6.5的磷酸盐缓冲溶液溶解；优选的LMW-UK反应浓度为1~10mg/ml。 [0054] （2）按摩尔比LMW-UK：PEG-醛：还原剂=1 : 3~25 : 30~250在4~37℃的条件下反应4~24小时；优选的反应比例为LMW-UK：PEG：还原剂=1 : 20 : 200，PEG-醛优选PEG-丙醛（PEG-ALD），分子量20kDa；优选的反应温度为25℃，反应时间优选为12小时，优选的还原剂为NaCNBH3。 [0055] 2、聚乙二醇修饰的低分子量尿激酶的分离纯化：（a）选用离子交换层析，优选SP-Sepharose Fast Flow； （b）调节样品溶液的pH值和电导，用已经平衡好的SP柱上样，再用平衡液冲洗； （c）继续用冲洗液进行冲洗，收集冲洗峰； （d） 最后用洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰。 [0056] 步骤（b）中，SP层析柱平衡液为0.01~0.2M醋酸盐缓冲液（pH4.0~8.0），氯化钠浓度为0~0.2M氯化钠，优选0.1M醋酸盐缓冲液，氯化钠浓度为0M、pH5.5。 [0057] 步骤（b）中，调节样品溶液的pH值为4.0~8.0，电导1~10mS/cm；优选条件pH5.5，电导5mS/cm。 [0058] 步骤（c）为冲洗步骤，使用pH4.0~8.0，0.01~0.2M醋酸盐缓冲液，含有0.05M~0.3M氯化钠，优选0.1M醋酸盐缓冲液，含有0.05M氯化钠，pH5.5进行冲洗。 [0059] 步骤（d）为洗脱步骤，使用pH4.0~8.0，0.01~0.2M醋酸盐缓冲液，含有0~1.0M氯化钠，优选0.1M醋酸盐缓冲液，加入0.1M氯化钠，pH5.5进行洗脱。 [0060] 步骤（b）中，收集上样和平衡穿透，主要含有未参与修饰的游离的PEG-ALD。 [0061] 步骤（c）中，收集冲洗液，主要含有未参与修饰的低分子量尿激酶。 [0062] 步骤（d）中，收集洗脱液，主要含有PEG-ALD修饰后的低分子量尿激酶化合物。 [0063] 实施例1：单甲氧基聚乙二醇丙醛（mPEG-ALD）对低分子量尿激酶（LMW-UK）N-末端修饰条件的选择反应pH值的选择：各称取0.5mg LMW-UK干粉分别溶解于0.5ml pH值为5.0、5.5、6.0、 6.5、7.0的50mM PB缓冲溶液中，再各加入mPEG-ALD-20K固体12.12mg，使修饰摩尔比为 1:20，溶解，混匀，于室温反应过夜后终止反应，SDS-PAGE比较修饰率，确定最优修饰pH值。 [0064] 结果表明：在这些修饰条件下均能得到聚乙二醇修饰的LMW-UK，其中pH值为6.5时修饰率最高。 [0065] 修饰剂分子量的选择：取4份pH6.5溶解的1mg/ml的LMW-UK各0.5ml，再分别加入mPEG-ALD-10K、mPEG-ALD-20K、mPEG-ALD-30K、mPEG-ALD-40K固体6.06mg、12.12mg、18.18mg、24.24mg，使修饰摩尔比均为1:20，溶解，混匀，于室温反应过夜后终止反应，SDS-PAGE比较修饰率，确定修饰剂的最佳分子量。 [0066] 结果表明：四种不同分子量的PEG-ALD均能修饰上LMW-UK，其中PEG-ALD-20K的修饰率最高。 [0067] 反应温度的选择：取三份pH6.5 PB溶解的1mg/ml的LMW-UK 0.5ml，再分别加入mPEG-ALD-20K固体12.12mg，溶解，混匀，然后分别置于4℃、25℃、37℃反应过夜后终止反应，SDS-PAGE比较修饰率，确定最佳修饰温度。 [0068] 结果表明：在这些温度下都能得到聚乙二醇修饰的LMW-UK，其中25℃的修饰率最高。 [0069] LMW-UK同mPEG-ALD-20K反应摩尔比的选择：各取0.5ml溶解于pH6.5 磷酸盐缓冲液的LMW-UK （1mg/ml） 5份，分别加入mPEG-ALD-20K固体1.82mg、3.03mg、6.06mg、12.12mg、30.30mg（相当于mPEG-ALD-20K同LMW-UK的摩尔比在为3:1、5:1、10:1、20:1、 50:1），溶解，混匀，反应过夜后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。 [0070] 结果表明：在这些修饰比例下都能得到聚乙二醇修饰的LMW-UK，当mPEG-ALD-20K同LMW-UK的摩尔比在20:1时修饰率已达到最高，进一步增加mPEG-ALD-20K的量修饰率也没有明显增加。 [0071] 实施例2：制备单甲氧基聚乙二醇丙醛-20K（mPEG-ALD-20K）修饰的LMW-UK用50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液溶解LMW-UK冻干粉以配制成为1~30mg/ml的溶液，分别用PEG-ALD-10K，PEG-ALD-20K，PEG-ALD-30K，PEG-ALD-40K（购自北京键凯科技有限公司），按照摩尔比LMW-UK：PEG：还原剂=1 : 20 : 200进行反应，在25℃反应12h后加入1M甘氨酸终止反应。制备得到4种修饰产物ALD-10K-LMW-UK（偶联物1），ALD-20K-LMW-UK（偶联物2），ALD-30K-LMW-UK（偶联物3），ALD-40K-LMW-UK（偶联物4）。通过C18分析柱和SDS-PAGE电泳检测，偶联物1、偶联物2、偶联物3、偶联物4的修饰率分别为55%、52%、45%、30%。ALD-20K-LMW-UK（偶联物2）的SDS-PAGE电泳检测结果见附图1。 [0072] 实施例3：单甲氧基聚乙二醇丙醛-20K（mPEG-ALD-20K）修饰的LMW-UK的分离纯化（1）色谱法去除未反应的PEG-ALD 色谱法条件：SP弱阳离子交换柱（购自GE公司，SP Sephrose Fast Flow），A液：100mM的醋酸盐缓冲液（pH5.5），B液：含有1M氯化钠的100mM的醋酸盐缓冲液（pH5.5），流速3ml/min，检测波长为280nm。 [0073] 平衡：A液冲洗至流出液pH值和电导与A液一致。 [0074] 上样：上述修饰反应物用0.5M的醋酸调节至pH5.5，结合至SP弱阳离子交换柱。 [0075] 冲洗：A液+5%B液冲洗8个柱体积，收集冲洗液。 [0076] （2）色谱法纯化ALD-20K-LMW-UK偶联物色谱条件：上述步骤的A液+5%B液冲洗后，用含有0.1M氯化钠的100mM的醋酸盐缓冲液（pH5.5）进行冲洗，收集冲洗液，流速为3ml/min，检测波长为280nm。 [0077] 纯化后的修饰蛋白通过SDS-PAGE及反相高效液相检测纯度，SDS-PAGE电泳检测结果见附图1。 [0078] 实施例4：单甲氧基聚乙二醇丙醛-20K（mPEG-ALD-20K）修饰的LMW-UK的纯度检测对实施例2中mPEG-ALD-20K与LMW-UK的反应混合物、实施例3中纯化后收集的 ALD-20K-LMW-UK纯品进行高效液相色谱分析。色谱条件如下：色谱柱为Agilent ZDRBAX 300SB-C18柱（4.6×250mm，5μm），用含0.1%（v/v）TFA水溶液（A流动相）和含0.1%（v/v）TFA的乙腈（B流动相）进行梯度洗脱。0~40min，20%~50%B，随后平衡10min后再进下一个样。流速为0.5ml/min，检测波长为280nm，进样量为40μl，柱温为室温。检测结果如附图2所示，结果表明修饰后混合物中单修饰的ALD-20K-LWM-UK比例大于50%；纯化后的修饰蛋白呈单一吸收峰，单修饰产物纯度在95%以上。 [0079] 实施例5：单甲氧基聚乙二醇丙醛-20K（mPEG-ALD-20K）修饰的LMW-UK的分子量鉴定将实施例2中mPEG-ALD-20K与LMW-UK的反应混合物浓缩、除盐后溶于5%乙腈， 0.22μm滤膜过滤。取样品溶液和等体积的α-氰基-4-羟基肉桂酸的饱和溶液（溶剂为0.1%甲酸溶液）混合均匀，点样，待样品吹干后进行测定。4700型基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱（MALDI-TOF MS，AB，美国）采取线性正离子工作模式，以 337nm的氮原子激光激发样品，每个样品至少激发60次，检测正电荷离子的产生，测定ALD-20K-LMW-UK的分子量，检测结果见附图3所示。 [0080] 实施例6: 单甲氧基聚乙二醇丙醛-20K（mPEG-ALD-20K）修饰的LMW-UK的体外生物活性测定采用气泡法对mPEG-ALD-20K修饰前后的LMW-UK的酶活效价进行测定。试剂溶液的配制及供试品效价的测定按《中国药典》2010年版二部尿激酶效价测定法进行，结果如下式计算： 尿激酶效价=（供试品单位数每毫升单位数×稀释倍数）/取样量 检测结果显示，mPEG-ALD-20K修饰后的LMW-UK的酶活效价与未修饰的LMW-UK酶活效价相比，没有明显降低，活性保留率在80%以上。 [0081] 实施例7：单甲氧基聚乙二醇丙醛-20K（mPEG-ALD-20K）修饰的LMW-UK的药代动力学检测125 本实施例采用 I同位素标记示踪法对mPEG-ALD-20K修饰前后的LMW-UK的体内血 药浓度进行了研究。其中，为了减少大鼠甲状腺对标记药物的吸收，实验前约8h腹腔注射 1%KI（国药集团）溶液1ml饱和大鼠的甲状腺。将大鼠随机分为LMW-LUK、ALD-20K-LMW-LUK组，每组8只，雌雄各半。 [0083] （2）用苦味酸在大鼠身上按照编号规则进行编号，称重。用大鼠固定器固定后，由尾静脉注射给药。给药后立即放开大鼠，自由活动，自由饮水和喂食。 [0084] （3）分别于给药后0.1h、0.2h、0.5h、2h、4h、8h、16h、24h、36h、60h、72h从眼眶取血约0.2ml。并加入EDTA抗凝。 [0086] （5）放射性活度测量完毕后回收血浆，HPLC分离未降解的蛋白原性药物。药时曲线如图5所示。 [0087] （6）实验结果表明，上述药物的药动学模型属于二房室模型。mPEG-ALD-20K偶联蛋白与LMW-LUK相比，半衰期明显延长，并且药时曲线下面积（AUC）有了显著提高。 [0088] 本发明采用mPEG-醛对低分子量尿激酶进行N-末端定点修饰，修饰产物均一、质量容易控制、结构稳定、活性保留较高，且能有效延长蛋白的半衰期，保持或增强其溶栓效力，提高其特异性，减少出血等不良反应，更适合临床使用。可用于治疗高纤维蛋白原血症和预防动脉粥样硬化（AS）、血栓栓塞并发症、糖尿病血管并发症、糖尿病肾病等疾病的长效药物的开发。 |
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