因子VII融合多肽 |
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| 申请号 | CN201180007544.5 | 申请日 | 2011-01-27 | 公开(公告)号 | CN102753575A | 公开(公告)日 | 2012-10-24 |
| 申请人 | 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司; | 发明人 | E.珀森; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及具有延长的 半衰期 的因子VII(FVII)融合多肽，其中所述FVII多肽可被激活或处于活化型。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种多肽，所述多肽包含因子VII (FVII)或因子VIIa (FVIIa)多肽或其同源物和 |
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| 说明书全文 | 因子VII融合多肽[0002] FVII是由肝脏产生的糖蛋白。FVII的活化型叫做FVIIa，在凝血中具有重要的作用。凝血过程是由于若干胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶之间的级联相互作用实现的。这些酶中的大多数被合成为无活性的前体酶原，在限制性蛋白水解期间酶原经过切割产生其活化型。 [0003] 具体而言，FVII被激活为FVIIa，FVIIa结合组织因子，其为在某些细胞的膜上组成型表达的脂蛋白。已知包括FXa和FIXa在内的某些蛋白酶引起FVII激活为FVIIa。FVII的激活涉及通过蛋白酶剪切Arg (152)和Ile (153)之间的肽键将单链的FVII转化为双链活化型(FVIIa)。Ile (153)和Asp (343)之间盐桥的形成驱使从酶原样到活化型的FVIIa转化。 [0004] 当血管遭到破坏时，组织因子暴露于血液和循环中的FVIIa。随后已结合的组织因子与FVIIa分别使因子IX (FIX)和因子X (FX)激活，形成FIXa和FXa。 [0006] 尽管由于因子FVIIa的半衰期较短，利用因子VIIa进行预防在目前很麻烦并且昂贵，但是治疗血友病的最佳方式仍是预防性的。为了将因子VIIa的血浆浓度在要求时间期间内保持高于阈值水平，需要重复给药。 [0007] 开发了经修饰的FVII多肽，试图解决半衰期短的问题。例如，WO2006/018204中阐述通过在FVII多肽序列的140到152氨基酸之间插入来自FX或者FIX的激活肽来进行修饰的FVII多肽。然而，在WO2006/018204中阐述的该修饰多肽不能被激活为FVIIa。 [0008] 因此，仍然需要用于在保留FVII被激活为FVIIa的能力的同时增加FVII和FVIIa的半衰期的方法。 [0009] 本发明人确证通过将来自FX或者来自FIX的活化肽序列加到FVII多肽的某个位置，产生了可被激活为FVIIa的融合FVII多肽，其中未激活的FVII多肽和活化FVII多肽(FVIIa)均具有延长的半衰期。 [0010] 本发明第一方面涉及包含FVII或FVIIa多肽或其同源物和FX或FIX活化肽或其同源物的多肽，其中FX或FIX活化肽在FVII或FVIIa多肽的C-末端融合。 [0011] FVII/FVIIa多肽和FX/FIX活化肽的同源物是生物学活性同源物。FVII/FVIIa多肽同源物和活化肽同源物的“生物学活性”在以下定义。 [0012] 本文所用术语“FVII多肽”，指未激活的成熟FVII多肽。 [0013] 本文所用 术语“FVIIa多肽”，指FVII 多肽的活化 型，即FVII多肽 在Arg152-Ile153处的单个肽键断裂导致通过二硫键连接在一起的两条多肽链的形成。因此，FVIIa多肽与FVII多肽具有相同的序列，但是FVIIa多肽由两条多肽链而不是一条链形成。 [0014] 可将本发明的FVII或FVIIa多肽截短，然后在截短的多肽的C-末端融合FX或FIX活化肽。 [0015] 本文所用术语“截短的FVII或FVIIa多肽”，包括这样的FVII或FVIIa多肽，其不包含在野生型或同源FVII或FVIIa多肽的C末端的起始1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基。本发明截短的FVII或FVIIa多肽具有生物学活性。 [0016] 亦可延长本发明FVII或FVIIa多肽，然后在延长多肽的C-末端融合FX或FIX活化肽。本文所用术语“延长的FVII或FVIIa多肽”，包括这样的FVII或者FVIIa多肽，其另外包含在野生型或同源的FVII或FVIIa多肽的C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸残基。本发明延长的FVII或FVIIa多肽具有生物学活性。 [0017] 本发明FVII和FVIIa融合多肽分别与野生型FVII多肽和/或野生型FVIIa多肽相比具有延长的半衰期。 [0018] “FIX活化肽”或“FX活化肽”，指当成熟的FIX或FX多肽分别从其无活性型(酶原)转化为其活性型时自成熟肽释放的肽。 [0019] 可将FIX和FX活化肽截短。术语“截短的FIX肽”和“截短的FX肽”分别包括这样的FIX肽或FX肽，其不包含在野生型或同源FIX或FX活化肽的C-末端和/或N-末端存在的起始1、2、3、4、5或6个氨基酸残基。截短的FIX或FX活化肽具有生物学活性。 [0020] 亦可延长本发明FX或FIX活化肽。本文所用术语“延长的FX或FIX活化肽”包括这样的FX或FIX活化肽，其包含在野生型或同源活化肽的N-末端和/或C-末端的另外 1、2、3、4、5、6或更多个氨基酸残基。延长的FVII或FVIIa多肽具有生物学活性。 [0021] 野生型FVII多肽和野生型FVIIa多肽的序列如SEQ ID NO:1所示。该序列代表无前导序列的成熟FVII或FVIIa多肽。 [0022] SEQ ID NO:1中的三字母表示“GLA”意即4-羧基谷氨酸(γ-羧基谷氨酸)。 [0023] 野生型FIX活化肽的序列在SEQ ID NO:2中阐述。野生型FX活化肽的序列在SEQ ID NO:3中阐述。 [0024] 在本发明的一个实施方案中，本发明涉及这样的多肽，其包含SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列的第1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个到397、398、399、400、401、402、403、404、405或406个残基或其同源物，所述活化肽包含SEQ ID NO:2所述氨基酸序列的第1、2、3、4、5或6个到30、21、32、33、34或35个残基或其同源物，或SEQ ID NO:3所述氨基酸序列的第1、2、3、4、5或6个到47、48、49、50、51或52个残基或其同源物。 [0025] 因此，本发明包括以下多肽序列，其为以SEQ ID NO:1的第1、2、3、4、5、6、7、8、9或10位残基中的任一个开始并以SEQ ID NO:1的第397、398、399、400、401、402、403、404或 405位残基中的任一个结束的多肽序列，其在C末端与活化肽融合，所述活化肽以SEQ ID NO:2的第1、2、3、4、5或6位残基中的任一个开始并以SEQ ID NO:2的第30、31、32、33、34或35位残基中的任一个结束或以SEQ ID NO:3的第1、2、3、4、5或6位残基中的任一个开始并以SEQ ID NO:3的第47、48、49、50、51或52位残基中的任一个结束。 [0026] 本文术语“多肽”概括性地指通过肽键连接在一起的多个氨基酸残基。它与肽、寡肽、寡聚物或蛋白质可互换使用并意思相同，并包括糖蛋白及其衍生物。术语“多肽”还意欲包括同源物，其中所述同源物与参考蛋白保持相同(或更高)的生物学活性。 [0027] 在本发明中，FVII或FVIIa多肽的同源物与在SEQ ID NO:1中所述的野生型FVII或FVIIa多肽具有相同或更高生物学活性。在本文中，术语同源物包括变体。 [0028] 野生型FVIIa的生物学活性是该多肽将其底物FX转变为活性FXa的能力。当本发明多肽是FVII多肽时，在可测定其生物学活性之前必须首先将其激活为FVIIa。 [0029] FVIIa多肽的生物学活性可用如下的“体外蛋白水解测定”来确定：在含有0.1 M NaCl、5 mM CaCl2和1 mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的100微升50 mM Hepes (pH 7.4)中，将因子VIIa (10 nM)和因子X (0.8 μM)于微滴板中孵育15分钟。然后通过加入含有0.1 M NaCl、20 mM EDTA和1 mg/ml牛血清白蛋白的50微升50 mM Hepes (pH 7.4)来终止FX切割。通过加入终浓度为0.5 mM的显色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-对硝 基苯胺(S-2765，Chromogenix，瑞典)来测量产生的FXa的量。在SpectraMax (TM)340读板仪(Molecular Devices, USA)中连续测量其在405 nm处的吸光度。将在10分钟期间显现的吸光度减去不含FVIIa的空白孔的吸光度后，用于计算同源FVIIa和野生型因子FVIIa (如SEQ ID NO:1中所述)的蛋白水解活性的比率： 比率=(A405 nm因子VIIa同源物)/(A405 nm SEQ ID NO:1中所述的因子VIIa多肽) 在本测试中，将高于0.8 (任选包括约为或高于1、1.25和1.5)的比率定义为本发明 生物活性多肽。 [0030] 在一个实施方案中，本发明的FVII或FVIIa多肽延伸至与SEQ ID NO:1中定义的野生型FVII或FVIIa多肽具有至少80%同源性的氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述序列可与SEQ ID NO:1中的野生型FVII或FVIIa多肽氨基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.4%或99.5%的同源性/同一性。 [0031] 众所周知，氨基酸水平的同源性一般是就氨基酸的相似性或同一性而言。 [0032] 可通过目测和数学计算来测定序列同源性百分比。用可公开获得的计算机软件例如BLAST或ALIGEN，可以以多种方式来实现用于测定氨基酸序列同一性百分比目的的比对。例如，可用XBLAST程序来进行蛋白质检索，以获得与本发明蛋白分子同源的氨基酸序列。本领域技术人员可确定用于测量比对的合适的参数，包括在所比较的序列全长范围内的最大比对所需的任何算法。 [0033] 本发明FVIIa多肽的同源物与SEQ ID NO:1的野生型FVIIa多肽具有相同或更高的生物学活性。一旦FVII多肽被激活为FVIIa多肽，则本发明FVII多肽的同源物与 SEQ ID NO:1的野生型FVIIa多肽具有相同或更高的生物学活性。本发明变体多肽包括在US2006/0166915、WO02/077218、US2003/0100075、US2003/0130191和WO2004/029090中公开的所有变体多肽序列，这些公开内容通过引用全部并入本文。 [0034] 在一个实施方案中，本发明FIX或FX活化肽延伸至分别与SEQ ID NO:2或NO:3中的野生型FIX或FX活化肽有至少80%同源性的氨基酸序列。在另外的实施方案中，所述序列与所述野生型FIX或FX活化肽氨基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%、99.4%或99.5%的同源性/同一性。 [0035] 在本发明背景下FIX或FX活化肽的生物活性，是提高本发明融合多肽的血浆半衰期高于添加活化肽之前FVII或FVIIa多肽血浆半衰期的能力。融合蛋白半衰期比添加活化肽之前的FVII或FVIIa多肽半衰期长大约或超过5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、100%或200%。 [0036] 术语血浆“半衰期”是指使对于特定蛋白而言，仅剩余初始蛋白库(protein pool)的50%所花的时间。半衰期可通过ELISA测量。 [0037] 本发明FVII或FVIIa多肽或FIX或FX肽的同源物可为：(i)其中一个或更多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取代的多肽，且所述取代的氨基酸残基可由或可不由遗传密码编码；或(ii)其中一个或更多个氨基酸残基包括取代基的多肽。 [0038] 优选具有以上定义的多肽氨基酸序列的同源物，其中若干个例如5-10、1-5、1-3、2、1或没有氨基酸残基以任意组合被取代、缺失或添加。其中尤其优选沉默取代、缺失和添加，其不改变本发明蛋白的性质和活性。在这方面还尤其优选保守取代。 [0039] 因此，氨基酸甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸(含有脂肪族侧链的氨基酸)经常可以彼此取代。其中可能的取代优选用甘氨酸和丙氨酸来相互取代(因为它们有相对短的侧链)和用缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸相互取代(因为它们有较大的疏水脂肪族侧链)。可经常彼此取代的其它氨基酸包括：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(含有芳香族侧链的氨基酸)；赖氨酸、精氨酸和组氨酸(含有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(含有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(含有酰胺侧链的氨基酸)；半胱氨酸和甲硫氨酸(含有含硫侧链的氨基酸)。 [0040] 这种类型的取代通常被称为“保守”或“半保守”氨基酸取代。 [0041] 亦可相对于用于以上提及的融合多肽的氨基酸序列进行氨基酸缺失。因此，例如，对多肽的活性没有实质影响或至少不会消除所述活性的氨基酸可缺失。所述缺失可为有利的，因为可降低多肽的全长和分子量但同时保持活性。这可使特定目的所需的多肽的量降低—例如可降低剂量水平。 [0042] 亦可相对于以上融合多肽的序列来进行氨基酸插入。可实施插入以改变本发明的物质的性质(例如有助于鉴定、纯化或表达，其如以上关于融合多肽所解释的)。 [0043] 可用任何适当的技术例如通过用定向诱变来使相对于以上a)中所给的序列发生氨基酸变化。 [0044] 应该了解，可用天然存在的或非天然存在的氨基酸来进行本发明范围内的氨基酸取代或插入。不管使用的是天然还是合成的氨基酸，优选只存在L-氨基酸。 [0045] 在本发明又一实施方案中，本发明FVII或FVIIa多肽延伸至相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列包含一个或更多个取代的同源物，其中所述取代为用选自以下位置的任何一个或更多个氨基酸取代：对应于SEQ ID NO:1氨基酸位置的第172、173、175、176、177、196、197、198、199、200、203、235、237、238、239、240、286、287、288、289、290、291、292、293、294、 295、297、299、319、320、321、327、341、363、364、365、366、367、370或373位。 [0046] 本文所用术语“任何一个或更多个氨基酸”是指与SEQ ID NO:1中氨基酸不同的一个或更多个氨基酸。这包括但不限于可由多核苷酸编码的氨基酸。在一个实施方案中，不同的氨基酸呈天然的L-型，可由多核苷酸编码，具体实例是L-半胱氨酸(Cys)。 [0048] 在以下实施方案中，关于SEQ ID NO:1的氨基酸取代如下：字母代表在SEQ ID NO:1位置中天然存在的氨基酸，后面的数字代表在SEQ ID NO:1中的位置。 [0049] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少G237被选自Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Thr或Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0050] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少T238被选自Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys或Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0051] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少T239被选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys或Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0052] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少Q286被选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、His、Lys、Arg、Cys、Thr或Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0053] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少L287被选自Gly、Ala、Val、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Thr或Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0054] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少L288被选自Gly、Ala、Val、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Thr或Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0055] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少D289被选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Ser或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0056] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少R290被选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Cys、Thr或Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0057] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少A292被选自Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Thr或Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0058] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少T293被选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys或Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0059] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少A294被选自Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Thr或Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0060] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少L295被选自Gly、Ala、Val、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Thr或Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0061] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少L297被选自Gly、Ala、Val、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Thr或Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0062] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少V299被选自Gly、Ala、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Thr或Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0063] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少M327被选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Ser或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0064] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少K341被选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Arg、Cys、Ser或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0065] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少S363被选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0066] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少W364被选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Thr或Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0067] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少G365被选自Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Thr或Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0068] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少Q366被选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、His、Lys、Arg、Cys、Thr或Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0069] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少Q366被选自Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、His、Lys、Arg、Cys、Thr或Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0070] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少V172被选自Gly、Ala、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Ser或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0071] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少N173被选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Ser或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0072] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少A175被选自Gly、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Ser、Val或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0073] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少Q176被选自Gly、Ala、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、His、Lys、Arg、Cys、Ser、Val或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0074] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少L177被选自Gly、Ala、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Ser、Val或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0075] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少D196被选自Gly、Ala、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Ser、Val或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0076] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少K197被选自Gly、Ala、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Arg、Cys、Ser、Val或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0077] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少I198被选自Gly、Ala、Leu、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Ser、Val或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0078] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少K199被选自Gly、Ala、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Arg、Cys、Ser、Val或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0079] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少N200被选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Ser或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0080] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少N203被选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Ser或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0081] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少V235被选自Gly、Ala、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Ser或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0082] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少N240被选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Ser或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0083] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少D319被选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Ser或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0084] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少S320被选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0085] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少P321被选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Ser或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0086] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少G367被选自Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys、Ser或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0087] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少T370被选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Cys或Ser的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0088] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少H373被选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Trp、Tyr、Asp、Asn、Glu、Gln、Lys、Arg、Cys、Ser或Thr的任何一个或更多个氨基酸取代。 [0089] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少i) L287被选自Thr或Ser的氨基酸取代，ii) A294被选自Thr或Ser的氨基酸取代，和iii) M298被Lys取代。 [0090] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少i) L287被选自Thr或Ser的氨基酸取代，ii) A294被选自Thr或Ser的氨基酸取代，iii) M298被Lys取代，和iv) E296被选自Ile、Leu、Thr或Val的氨基酸取代。 [0091] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少i) L287被选自Thr或Ser的氨基酸取代，ii) A294被选自Thr或Ser的氨基酸取代，iii) M298被Lys取代，和iv) V185被选自Asp或Glu的氨基酸取代。 [0092] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为同源物，其中至少i) L287被选自Thr或Ser的氨基酸取代，ii) A294被选自Thr或Ser的氨基酸取代，iii) M298被Lys取代，和iv) E296被选自Ile、Leu、Thr或Val的氨基酸取代，和v) V158被选自Asp或Glu的氨基酸取代。 [0093] 关于SEQ ID NO:1，以下阐述的用于氨基酸取代的术语如下：第一个字母代表在SEQ ID NO:1位置中天然存在的氨基酸。后面的数字代表在SEQ ID NO:1中的位置。第二个字母代表取代天然氨基酸的不同的氨基酸。实例为K197A-FVII，其中SEQ ID NO:1中197位置的赖氨酸被丙氨酸取代。 [0094] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽为选自以下的多肽：。 [0095] 本 发 明 的 FVIIa 多 肽 另 外 的 取 代 实 例 包 括 但 不 限于 ： K143N/N145T/R315N/V317T；和所述氨基酸序列中从233Thr到240Asn的取代、添加或 缺失；所述氨基酸序列中从304Arg到329Cys的取代、添加或缺失；和所述氨基酸序列中从 153Ile到233Arg的取代、添加或缺失。 [0096] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中在蛋白酶结构域中剩余位置中的至少一个氨基酸被任一其它氨基酸取代。“剩余位置”意即其中氨基酸尚未被不同的氨基酸取代的SEQ ID NO:1蛋白酶结构域中的任何位置。 [0097] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中在蛋白酶结构域剩余位置中的最多20个另外的氨基酸被任一其它氨基酸取代。 [0098] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中对应于选自SEQ ID NO:1的157-170位氨基酸的至少一个氨基酸被任一其它氨基酸取代。 [0099] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中对应于选自SEQ ID NO:1的290-305位氨基酸的至少一个氨基酸被任一其它氨基酸取代。 [0100] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中至少R304被选自Tyr、Phe、Leu或Met的氨基酸取代。 [0101] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中对应于选自SEQ ID NO:1的306-312位氨基酸的至少一个氨基酸被任一其它氨基酸取代。 [0102] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中至少M306被选自Asp或Asn的氨基酸取代。 [0103] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中至少D309被选自Ser或Thr的氨基酸取代。 [0104] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中对应于选自SEQ ID NO:1的330-339位氨基酸的至少一个氨基酸被任一其它氨基酸取代。 [0105] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中至少A274被任一其它氨基酸取代。 [0106] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中至少A274被选自Met、Leu、Lys或Arg的氨基酸取代。 [0107] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中至少K157被选自Gly、Val、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp或Glu的氨基酸取代。 [0108] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中至少K337被选自Ala、Gly、Val、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp或Glu的氨基酸取代。 [0109] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中至少D334被选自Gly或Glu的氨基酸取代。 [0110] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中至少S336被选自Gly或Glu的氨基酸取代。 [0111] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中至少V158被选自Ser、Thr、Asn、Gln、Asp或Glu的氨基酸取代。 [0112] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中至少E296被选自Arg、Lys、Ile、Leu、Thr或Val的氨基酸取代。 [0113] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中至少M298被选自Lys、Arg、Gln或Asn的氨基酸取代。 [0114] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中至少L305被选自Val、Tyr或Ile的氨基酸取代。 [0115] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中至少S314被选自Gly、Lys、Gln或Glu的氨基酸取代。 [0116] 在本发明又一实施方案中，因子VII或VIIa多肽是这样的同源物，其中至少F374被选自Pro或Tyr的氨基酸取代。 [0117] 在本发明又一实施方案中，所述同源物进一步包含在N末端Gla结构域(与SEQ ID NO:1的1-37位置对应的氨基酸)的一个或更多个氨基酸取代，藉此提供具有对膜磷脂显著更高的亲和力的因子VIIa多肽，例如具有组织因子的细胞的膜磷脂或血小板的膜磷脂，藉此产生改进了促凝血作用的因子VII多肽同源物。因此，上文直接提到的因子VIIa多肽同源物，除了任何任选的氨基酸变化外，还在N末端GLA结构域具有至少一个氨基酸被取代。在一个实施方案中，选自4、8、10、11、28、32、33、34或35位置(参考SEQ ID NO:1)的一个或更多个氨基酸被不同的氨基酸取代。在一个实施方案中，选自10或32位(参考SEQ ID NO:1)的位置的一个或更多个氨基酸被不同的氨基酸取代。被引入到上述位置的优选氨基酸实例是：10位氨基酸Pro被Gln、Arg、His、Gln、Asn或Lys取代；和/或32位的氨基酸Lys被Glu、Gln或Asn取代。 [0118] 基于不同的磷脂亲和力和维生素K依赖性血浆蛋白序列，亦可取代GLA结构域中的其它氨基酸。 [0119] 术语“N-末端GLA结构域”意即因子VII的氨基酸序列的1-37。 [0120] 三字母表示“GLA”意即4-羧基谷氨酸(γ-羧基谷氨酸)。 [0121] 术语“蛋白酶结构域”意即因子VII (因子VIIa的重链)的氨基酸序列的153-406。 [0122] 本发明多肽可包含翻译后修饰，尤其是以下修饰：10γ-羧化、位于N-末端的谷氨酸残基，1β-羟化天冬氨酸残基和2 N-糖基化天冬酰胺残基。 [0123] 在一个实施方案中，本发明多肽是分离的。 [0124] 本文用于阐述本文所公开的多种多肽的术语“分离的”，是指这样的多肽，其已经从其自然环境的组分中鉴定和分离和/或回收。 [0125] 在又一实施方案中，本发明多肽是重组多肽。 [0126] 本文中的术语“融合多肽”概括性地指通过化学手段或通过经由蛋白合成的肽键或通过两者而连接在一起的一个或更多个多肽序列。 [0127] 本发明的第二方面涉及核酸序列，例如，编码本发明多肽的RNA序列或DNA序列。 [0128] 本发明的核酸序列可用于生产本发明多肽。 [0129] 本发明核酸序列可另外包含控制核酸表达的启动子或其它调控序列。业已鉴定控制核酸序列表达的启动子和其它调控序列，并为本领域所知。可不必利用整个启动子或其它调控序列。可仅仅需要最小的必需调控元件，事实上，可将所述元件用于构建嵌合序列或其它启动子。当然，基本要求是保留组织和/或时间特异性。启动子可以是任何适合的已知启动子，例如人巨细胞病毒(CMV)启动子，CMV即时早期启动子，HSV胸苷激酶，早期和晚期SV40启动子或逆转录病毒LTR的启动子，例如劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子和金属硫蛋白(metallothionine)启动子，例如小鼠金属硫蛋白-I启动子。启动子可包含就启动子活性而言所包含的最小量(minimum) (例如不含增强子元件的TATA元件)，例如CMV启动子的最小序列。 [0130] 当调控序列功能性涉及DNA序列时，将核苷酸序列可操作地连接(operablylinked)。因而，如果启动子核苷酸序列控制DNA序列的转录，则该启动子核苷酸序列与该DNA序列可操作地连接。 [0131] 可采用聚合酶链式反应(PCR)程序来分离和扩增编码所期需的蛋白序列的DNA序列。采用确定所期需DNA序列末端的寡核苷酸为5'和3'引物。所述寡核苷酸可另外含有限制性内切酶识别位点，以方便扩增的DNA序列插入到表达载体中。在以下文献中阐述了PCR技术：Saiki等，Science 239:487 (1988)；Recombinant DNA Methodology，Wu等编辑, Academic Press, Inc., San Diego (1989), 第189-196页；和PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis 等编辑, Academic Press, Inc.(1990)。 [0132] 本发明第三方面涉及包含本发明第二方面的核酸序列的载体。 [0133] 本发明亦提供含有编码本发明多肽的DNA的重组克隆和表达载体。 [0134] 本发明第四方面涉及包含本发明第二方面的核酸序列或本发明第三方面的载体的宿主细胞。 [0135] 可将包含本发明核酸序列的载体和宿主细胞用于制备由核酸序列编码的本发明多肽。 [0136] 本发明的载体尤其可包括染色体载体、附加型载体和病毒衍生的载体，例如，源自以下的载体：细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、诸如杆状病毒、乳多空病毒(例如SV40)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录病毒等病毒；源自其组合的载体，例如源自质粒和噬菌体遗传元件(例如粘粒和噬菌粒)的载体。一般而言，任何适合保持、增殖或表达核酸以在宿主中表达多肽的载体可在这方面用于表达。 [0137] 本发明第五方面延伸至产生FVII融合多肽的方法，所述方法包括在促使多肽表达的条件下培养本发明第四方面的宿主细胞，并从培养物中回收表达的多肽。 [0138] 在又一实施方案中，产生本发明FVII融合多肽的方法进一步包括纯化所述表达的多肽的步骤。在再一实施方案中，纯化步骤包括使多肽的残基152和残基153位之间的肽键断裂，形成通过二硫键连接的两条多肽链，即激活所述多肽以形成FVIIa多肽。可通过用一种或更多种蛋白酶将FVII多肽蛋白水解性转化为活性双链形式来实现该步骤。 [0139] 在优选实施方案中，将重组FVII以其单链形式分泌至培养基中，然后在色谱纯化过程期间通过自身催化经蛋白水解转化为活性双链形式FVIIa。 [0140] 亦可自天然存在的细胞中纯化FVII和FVIIa，并将其与FIX或FX活化肽序列融合。 [0141] 可通过任何适合的技术来实现本发明多肽的表达、分离和纯化，所述技术包括但不限于以下：可采用任何适合的表达系统。可将复制起点和选择基因引入到用于生产本发明多肽 的表达载体中，所述复制起点在所期需宿主细胞中赋予复制能力，并且通过所述选择基因鉴定转化体。此外，可将编码合适信号肽(天然的或异源的)的序列引入表达载体中。例如，可引入编码FVII、FIX、凝血酶原、蛋白C或蛋白S的前原前导序列(pre-pro leader sequence)的序列。信号肽(分泌前导序列)的DNA序列可与本发明的核酸序列符合读框 地融合，以便DNA起始转录，并将mRNA翻译为包含该信号肽的融合多肽。在预期的宿主细胞中有功能的信号肽促进多肽的胞外分泌。翻译过程中信号肽从多肽切割，但是允许多肽从细胞中分泌。 [0142] 适合表达本发明多肽的宿主细胞包括能够产生翻译后多肽的任何细胞，包括酵母、真菌、昆虫和高等真核细胞。哺乳动物细胞，尤其是人胚肾(HEK)、中国仓鼠卵巢(CHO)或幼仓鼠肾(BHK)细胞，尤其优选用作宿主细胞。在例如Pouwels等. Cloning Vectors: A Laboratory Manual (克隆载体：实验手册), Elsevier, New York, (1986) (ISBN0444904018)中阐述了与哺乳动物细胞和酵母宿主一起使用的适当的克隆和表达载体。 [0143] 也可以采用哺乳动物源的建立细胞系，例如CHO (例如ATCC CCL 61)、COS-1 (例如ATCC CRL 1650)和HEK293 (例如ATCC CRL 1573)细胞系。在优选实施方案中，使用HEK-293F细胞系。 [0144] 业已阐述将DNA引入哺乳动物细胞的已建立方法(Kaufman, R. J., LargeScale Mammalian Cell Culture (大规模哺乳动物细胞培养), 1990, 第15-69页)。可使用用市购试剂例如Lipofectamine或Lipofectamine 2000脂质试剂(Gibco/BRL)或 Lipofectamine-plus脂质试剂的另外方案来转染细胞(Felgner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1987)。此外，可使用电穿孔用常规程序来转染哺乳动物细胞，例如用Sambrook等 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆：实验室 手册),第2版，第1-3卷, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中的常规 程序。可用本领域已知方法来选择稳定的转化体，例如对细胞毒性药物的抗性。Kaufman 等, Meth. in Enzymology 185:487-511, 1990阐述了几种选择方案，例如二氢叶酸还原酶(DHFR)抗性。可引入到表达载体的可选择标记的其它实例包括赋予对诸如G418 (遗传霉素(Geneticin))和潮霉素B等抗生素抗性的cDNA。可基于对这些化合物的抗性来筛选含有载体的细胞。 [0145] 可使用来自哺乳动物表达载体且表现出改进异源基因表达的另外的控制序列。例如，源自CHO细胞的表达增强序列元件(EASE) (Morris等, Animal Cell Technology (动物细胞技术), 1997, 第529-534页)。 [0146] 亦可使用酵母宿主细胞，优选来自酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(S. cerevisiae))。亦可采用其它属的酵母，例如毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)。酵母载体常常含有来自2 μ酵母质粒的复制起点序列、自主复制序列(ARS)、启动子区域、多聚腺苷化序列、转录终止序列和可选择的标记基因。 [0147] 用于酵母载体的合适启动子序列尤其包括金属硫蛋白启动子、3-磷酸甘油酸酯激酶(Hitzeman等, J. Biol. Chem. 255:2073, 1980)或其它糖酵解酶(Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968；和Holland等, Biochem. 17:4900, 1978)的启动子，所述其它糖酵解酶例如烯醇酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、葡萄糖激酶。 [0148] 可采用酵母α-因子前导序列来指导多肽的分泌。通常将α-因子前导序列插入到启动子序列和结构基因序列之间。参见例如Kurjan等, Cell 30:933, 1982和Bitter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984。本领域技术人员已知适合于促进重组多肽自酵母宿主分泌的其它先导序列。可靠近3’端修饰前导序列以含有一个或更多个限制酶切位点。这将促进前导序列与结构基因的融合。 [0149] 本领域技术人员已知酵母转化方案。由Hinnen等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA75:1929, 1978阐述了一种这样的方案。 [0150] 可用动物或植物转基因技术制备本发明FVII和/或FVIIa多肽。 [0151] 例如，可在雌性哺乳动物宿主的乳腺中产生本发明多肽。这在US2006/0166915中进一步讨论，所述内容通过引用并入本文。 [0152] 亦可采用在转基因植物中生产。表达可以全面化或定向至特定的器官，例如块茎(参见例如Hiatt, Nature 344:469-479 (1990))。 [0153] 就任何类型的宿主细胞而言，其如技术人员所知，用于纯化重组多肽的程序将视诸如使用的宿主细胞的类型和重组多肽是否分泌到培养基中等因素而改变。 [0154] 一般而言，重组多肽如果不分泌，则可从宿主细胞中分离；或如果可溶并分泌，则可从培养基或上清液中分离，接着进行一次或更多次的浓缩、盐析、离子交换、疏水相互作用、亲和纯化或尺寸排阻色谱步骤。 [0155] 关于实现这些步骤的具体方式，首先用市购蛋白浓缩滤器例如MilliporePellicon超滤装置来浓缩培养液。浓缩步骤后，将浓缩物施用于纯化基质，例如凝胶过滤介质。 [0156] 或者，可采用阴离子交换树脂，例如，具有侧链二乙基氨基乙基(DEAE)基团的基质或基底(substrate)。基质可为丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或在蛋白纯化中常用的其它类型。或者，可采用阳离子交换步骤。此外，可采用色谱聚焦步骤。或者，可采用疏水作用色谱步骤。适合的基质可为与树脂结合的苯基或辛基部分。此外，可采用具有选择性结合重组蛋白的基质的亲和色谱。采用的所述树脂的实例是凝集素柱、染料柱和金属螯合柱。最后，可采用使用非极性RP-HPLC介质(即硅胶或具有侧链甲基、辛基、辛基癸基或其它脂肪族基团的聚合物树脂)的一个或更多个反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤来进一步纯化多肽。上述纯化步骤中的一些或全部的各种组合众所周知，并可用于提供分离和纯化的重组蛋白。 [0158] 利用包含FVII多肽结合蛋白的亲和柱来亲和纯化表达的多肽也是可能的，所述FVII多肽结合蛋白例如针对FVII多肽而产生的单克隆抗体，例如F1A2抗体。这些多肽可用常规技术从亲和柱去掉，例如用高盐洗脱缓冲液然后在低盐缓冲液中透析，或根据所用的亲和基质通过改变pH或其它组分来去掉，或用天然存在的亲和部分底物(substrate)来竞争性去掉，所述底物例如衍生自本发明的多肽。 [0159] 可基本上纯化(至基本上同质)本发明的FVII和FVIIa融合多肽，其如由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析时的单一蛋白条带所显示。纯化至基本上纯意指纯化到超过90%同质，包括95%以上同质。可通过银染、考马斯亮蓝染色或(如果蛋白经放射标记)通过放射自显影来显现蛋白条带。 [0160] 技术人员应认识到，用于纯化表达的多肽的程序会根据诸如所采用的宿主细胞类型和多肽是否是胞内形式、膜结合形式的或从宿主细胞分泌的可溶形式等因素而改变。 [0161] 本发明第六方面涉及包含本发明FVII多肽和/或FVIIa多肽的药物组合物。 [0162] 本发明药物组合物可包含本发明融合FVII多肽。在本实施方案中，FVII在给药后即在体内被激活为FVIIa，其与通常导致FVII被激活为FVIIa的过程一致，例如FXa、FXIIa、FIXa、FVIIa、FVII-激活酶(FSAP)和凝血酶。另外或作为备选，本发明药物组合物可包含本发明融合FVIIa多肽，并因此在将该多肽给予受试者之前已被激活。 [0163] 依照本发明使用的药物组合物除活性成分(即FVII或FVIIa)之外，还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲稳定剂或本领域技术人员熟知的其它材料。所述材料应该无毒，不应该干扰活性成分的功效。载体或其它材料的明确性质将取决于给药途径。在优选实施方案中，组合物为可注射组合物。 [0165] 就静脉内注射而言，活性成分应呈无热原并具有适当pH、等渗性和稳定性的胃肠外可接受水溶液形式。本领域有关技术人员完全能够用例如等渗溶媒(例如氯化钠注射液、林格注射液、林格乳酸盐注射液)制备适当的溶液。若需要可包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。液体药物组合物通常包含诸如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油等液体载体。可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二醇类，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。 [0166] 组合物亦可呈微球体、脂质体、其它微粒递送系统或用于给予包括血液在内的某些组织的持续释放制剂形式。持续释放载体的适当实例包括呈共享制品(shared article)形式的半渗透性聚合物基质，例如栓剂或微囊剂。可植入的或微囊持续释放基质包括聚交酯(美国专利号3, 773,919；EP-A-0058481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等, Biopolymers 22 (1): 547-556, 1985)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或乙烯乙酸乙烯酯(Langer等, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277, 1981和Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982)。 [0167] 优选以“治疗有效量”将组合物/多肽给予个体，这足以显示对个体的益处。 [0168] 本发明第七方面涉及用于医学的本发明FVII和/或FVIIa多肽。在医学上的用途包括任何出血障碍，所述出血障碍以在出血中显现的细胞或分子起因的先天性、后天性或诱导性的任何缺陷来反映。在一个实施方案中，本发明FVII和/或FVIIa多肽用于治疗凝血缺陷(blood clotting deficiency)，例如A型血友病、B型血友病、FXI缺陷或FVII缺陷，以及用于治疗过多或不必要的出血，包括手术出血或其它组织损伤出血，或由于血小板功能缺陷、血小板减少症或血管性血友病(von Willebrand disease)引起的出血。 [0169] 本发明第八方面涉及本发明FVII和/或FVIIa多肽用于制备用于治疗凝血缺陷或用于治疗过多或不必要的出血(所有皆如以上关于本发明第七方面所述)的药物中的用途。 [0170] 本发明第九方面涉及治疗与凝血缺陷相关的病况的方法，或用于治疗过多或不必要的出血(所有皆如以上关于本发明第七方面所述)的方法，所述方法包括给予受试者本发明FVII和/或FVIIa多肽。 [0171] 本文所用术语“治疗”指可有益于人或非人动物的任何疗法。在一个实施方案中，所述人或非人动物需要所述治疗。 [0172] 更具体地说，治疗包括“治疗性的”和“预防性的”，并以其最广泛的范围来考虑这些治疗类型。因此，治疗性和预防性治疗包括改善特定病况症状，或预防或在其它方面降低出现特定病况的风险。可认为术语“预防性的”是减轻特定病况的严重性或预防其发作。“预防性”也包括预防之前诊断患有特定病况的患者的病况复发。“预防性”不一定意味着受试者最终不会感染疾病病况。“治疗性”也可减轻现有病况的严重性，不一定暗示受试者被治疗至完全康复。 [0173] 可单独给予本发明FVII和FVIIa产物，但优选作为本发明第六方面的药物组合物的部分给予。 [0174] 可将本发明FVII和FVIIa产物给予需要治疗或可能受益于经由任何合适途径的所述治疗的患者。优选途径是静脉内。 [0175] 实际给药量、给药速率和时间-疗程将取决于所治疗疾病的性质和严重性以及待给予的FVII和FVIIa形式的准确性质。治疗处方例如关于剂量等的决定最终在普通从业者和其他医学医师的责任和自行判定范围内，通常要考虑待治疗的病症、个体患者的病况、递送位点、给药方法和从业者所知的其它因素。 [0176] 例如，在一个实施方案中，对于70 kg的受试者作为负荷剂量和维持剂量，本发明因子VII多肽的适当剂量在约0.05 mg/天-500 mg/天、优选约1 mg-200 mg/天、更优选约10 mg-约175 mg/天范围内，这取决于受试者体重和病况的严重性。 [0177] 在预防性应用中，将含有本发明因子VII多肽的组合物给予对疾病状态或损伤易感或在其它方面有疾病状态或损伤风险的受试者，以增强受试者自身的凝血能力。将所述量定义为“预防有效剂量”。在预防性应用中，准确量再一次取决于受试者健康状态和体重，但是对70 kg的受试者，剂量通常为约0.05 mg-约500 mg/天的范围，对70 kg的受试者更常见的是约1.0 mg-约200 mg/天。 [0178] 可用由治疗医师选择的剂量水平和模式来实施组合物的单次或多次给予。对于需要每天维持水平的能走动受试者，可通过用例如便携式泵系统持续输注来给予因子VII变体。 [0179] 可例如借助喷雾、灌注、双气囊导管、支架(stent)、引入到人造血管或支架中、用于包被气囊导管的水凝胶或其它已完全建立的方法，来实施本发明因子VII多肽的局部递送，例如局部施用。在任何情况下，药物组合物应该提供足以有效治疗受试者的因子VII多肽的量。 [0180] 除非另外定义，否则本文所用所有技术和科学术语具有本发明领域技术人员通常理解的含义。 [0181] 本发明的第二和随后方面的优选特征是关于第一方面在细节上的必要修正。 [0182] 现将通过参考以下实施例和附图来进一步阐述本发明，提供所述实施例和附图仅为了阐明目的，不能理解为限制本发明。参考一些附图，其中：图1：纯化的FVII和FVII变体。还原型SDS-PAGE显示FVII (泳道1)、FVII_C (泳道 2)、FVII_IX (泳道3)、FVII_X (泳道4)、FVII_XHC (泳道5)、FVII_XTTAA (泳道6)、FVII_XNNAA (泳道7)、FVII_X30-52 (泳道8)和FVII_X1-34 (泳道9)。FVII_XHC是具有与C末端融合的FX活化肽的FVII融合多肽。 [0183] 图2：具有不同活化肽的FVII变体的药代动力学概况(profile)。静脉内给予0.5-1mg/kg FVII、FVII_C、FVII_IX和FVII_X (均值，n=1-3)后，作为时间函数的FVII抗原。 [0184] 图3：FX活化肽及其变体对FVII半衰期的影响。(A)静脉内给予小鼠1mg/kg FX、FVII_X、FXai和FVII (均值，n=1-2)后，作为时间函数的FVII或FX抗原血浆浓度。(B)静脉内给予1mg/kg FVII_X和FVII_XHC (均值，n=1-2)后，作为时间函数的FVII抗原血浆浓度。(C)FVII_X、FVII_X1-34和FVII_X30-52和(D)FVII_X、FVII_XNNAA和FVII_XTTAA (均值, n=2-3)图4：具有在151和153残基间插入的FX活化肽的未激活变体。变体与250 nM FIXa 孵育20小时，确定未被激活，因为变体仍作为单条带泳动(run) (左泳道)。分子标记显示于右泳道，与变体条带相邻的条带显示70 kDa的质量。 [0185] 图5：FVII_XHC变体的激活以及酶活性。将FVII_XHC和FVII与80 nM FIXa孵育，在不同时间点(0-8小时)分析。板A和B分别显示FVII和FVII_XHC的考马斯染色的 SDS-PAGE，其在还原条件下泳动。通过测量小显色底物S-2288的转换率(turnover)来测定FVII (C)和FVII_XHC (D)的酰胺分解活性。将FX用作底物来评估FVII (E)和FVII_ XHC (F) (均值, n=2)的蛋白水解活性。 [0186] 图6：FVIIa和FVIIa_XHC的药代动力学概况。静脉内给予小鼠1mg/kg FVIIa和FVIIa_XHC后，作为时间函数的FVIIa抗原的平均血浆浓度(均值，n=2-3)。实施例 [0187] 材料和方法试剂 16 将野生型FVII表达质粒pLN174 用作模板用于克隆FVII突变体。将质粒pKSLN123 (由Dr. Katrine S. Larsen, Novo Nordisk A/S赠送)用作模版用于FX活化肽的PCR。 [0188] 变体的构建通过重叠延伸PCR构建了FVII变体FVII-X，其包括在Gly-151和Ile-153之间取代 FVII的Arg-152的FX活化肽。在第一PCR反应中，引物对A和B用于扩增FVII轻链，引 物C和D扩增待插入的活化肽，引物E和F扩增FVII重链。在该研究中使用的所有引物和 FVII变体的序列分别参见表1和2。因此用Expand High Fidelity PCR系统(Roche)实 施PCR反应：在94℃的4分钟加热步骤后，94℃15秒、55℃ 30秒和72℃ 2分钟的30个 循环，接着72℃下7分钟的延伸时间。将纯化的PCR产物AB和CD用作第二PCR反应的模 板，如第一进行，且引物对A和D用于扩增FVII轻链和插入。随后在第三PCR反应中，用引物对A和F将ABCD和EF产物用作模板，其中退火温度从55℃升高至65℃，产生完整的产 物。用NheI和NotI限制酶消化构建体，并连接至pCI-neo载体(Promega, Madison, WI, USA)。 [0189] 对于在FVII的C-末端含有FX活化肽的FVII_XHC变体，用引物对A和B_XHC来扩增FVII，用引物C_XHC和D_ XHC来扩增FX的活化肽，接着第二PCR用引物A和D_ XHC产生完整构建体，其它如上面所述。引物见表1。 [0190] 蛋白制备用FreeStyle 293表达系统(Invitrogen)按照手册在HEK-293F细胞中瞬时表达所有 的FVII变体，包括野生型FVII。在转染后96小时，通过离心去掉细胞，上清液于-80℃保 2+ 存直至使用。通过亲和色谱用与琼脂糖偶联的Ca 依赖性抗FVII单克隆抗体F1A2纯化 17 表达的蛋白。 简言之，将上清液制备成350 mM NaCl、10 mM CaCl2、pH 7，上样到用50 mM HEPES 、100 mM NaCl、10 mM CaCl2、pH 7.5平衡的柱上。用50 mM HEPES、2 M NaCl、10 mM CaCl2、pH 7.5洗涤柱子，接着用50 mM HEPES 、100 mM NaCl、10 mM EDTA、pH 7.5洗脱。洗脱后，加入15 mM CaCl2，将蛋白溶液存于-80℃。通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE (图1)评估蛋白的纯度，估测所有制备物皆超过95%同质性。 [0191] 药代动力学将体重大约25 g的雄性NMRI小鼠(Taconic M&B, Denmark)在Novo Nordisk A/ S,Måløv动物设备中在标准条件下(12/12小时光/暗循环、21℃、60%相对湿度、随意喂水喂食)适应至少7天。依照丹麦司法部的丹麦动物实验委员会的方针实施研究。除FVII_C (0.5 mg/kg)外，皆以单次静脉内推注尾静脉给予小鼠1 mg/kg剂量，按照先前所述的稀疏采样设计获得血液，包括每只小鼠3个血样和每个时间点2或3只小鼠。在给予FVII和FXai后t = 0.08、 0.25、0.5、1、2、3、4、5和7 小时时和给予所有其它研究蛋白后t=0.08、 0.25、0.5、1、3、7、17、24和30 小时时，为采集血样用异氟烷/O2/N2O麻醉小鼠，并用毛细玻璃管在眼眶丛(orbital plexus)采得4小滴血液。立即将血液(45 μL)转移到5 μL 0.13 M柠檬酸三钠溶液中，并用0.01 M磷酸钠缓冲液、0.145 M NaCl、0.05 %吐温20、1% BSA、pH 7.6稀释5倍，接着于室温以4000 g离心5分钟。收集代表稀释血浆的上清液，置于干冰上，于-80℃储存直至借助FVII或FVIIa ELISA分析。简言之，通过FVII-ELISA (DakoCytomatio, Dako, Ejby, Denmark)测定FVII抗原浓度。如厂商所述用过氧化 物酶作为标记酶实施该双位点单克隆免疫酶测定。通过用自Haemochrom Diagnostica (Frederiksberg, Denmark)市购的改良的试剂盒的FX-ELISA来测定FX抗原浓度。简言 之，将稀释的血浆样品在包被有特异性针对FX的多克隆抗体的微孔中孵育。洗涤步骤后加入与过氧化物偶联的多克隆FX抗体。洗涤步骤后，在H2O2存在下引入底物(TMB)并且显色。 用硫酸终止反应，显色的量直接与测试样品中FX浓度成正比。对于初次研究，通过非房室法(WinNonlin Pro version 4.1 (Pharsight corporation, Mountain View, CA, USA))来估测终末半衰期。对于第二次研究，用群体方法(population approach)来估测药物动力学参数，其使用通过1-或2-房室FOCE方法(NON-MEM version VI)的非线性混合效应 21 建模 。通过指数误差模型对个体间差异进行建模，并将个体内差异建模为比例误差模型。 通过预测的图像分析与所观察到的浓度比较、通过加权残差与预测的浓度比较并通过客观数值的比较，来评估拟合的质量。 [0192] 变体的激活及活性在FVII变体是否可被激活的初次评估中，将其以1 μM在50 mM HEPES 、100 mM NaCl、 10 mM CaCl2、pH 7.4中于环境温度与250 nM FIXa孵育20小时、100 nM FXa孵育2小时、 75 nM FXIa孵育2.5小时，或与100 nM FVIIa连同75 nM脂质化的(lapidated) TF孵育 20小时。在还原条件下于SDS-PAGE运行中分析样品。将野生型FVII用作阳性对照，并在所有所述条件下将其完全激活。 [0193] 通过将2μM 的FVII或FVII _XHC与8 0 nM FIXa在50 mM HEPES 、100 mM NaCl、10 mM CaCl2、0.01%吐温-80、pH 7.4中于环境温度下孵育，来更详细地研究FVII_XHC。在 0、0.25、0.5、1、2、4和8小时取样，在还原条件下通过SDS-PAGE分析酰胺分解和蛋白水解酶活性。用动力学微板读数仪(SpectraMax 384Plus, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)在405 nm处监测发色底物的水解作用。通过将来自活化混合物的12.5 nM FVII /FVII_XHC与50 nM sTF和1 mM S-2288孵育，来测量酰胺分解活性。通过将100 nM FVII/FVII_XHC 加500 nM sTF与150 nM FX孵育10分钟，来测量蛋白水解活性，此后用过量的EDTA结束反应，通过加入S-2765 (终浓度为0.5 mM)来测量FXa活性。通过自体活化来制备用于药物动力学分析的FVIIaXHC。 [0194] 结果含有活化肽的FVII变体的激活和比活 为了将FVII转化为其活化型FVIIa，需要水解Arg-152和Ile-153之间的单个肽键， 这是除了一种FVII变体(除了其中活化肽位于FVII的C-末端的FVII_XHC)外在所有变体 中活化肽结束的位置。因此，重要的问题是变体是否仍然可被激活并具有任何生物学功能。 最初，用酶FVIIa、FIXa和FXa (所有都是FVII的生理激活子)来测试FVII变体活化。将FVII变体与高浓度的激活子进行长时间的孵育，该时间比足以完全激活FVII的时间更长(详情参见材料与方法)。通过还原性SDS-PAGE测定样品，其中激活的蛋白出现代表重链(携带FVII_XHC的C-末端活化肽)和轻链(携带所有其它变体的C-末端活化肽)的两条 带。在C-末端含有FX活化肽的FVII_XHC变体，是唯一的易于用FVIIA、FIXa和FXa激活 的变体。在所有其它情况下，除了FVII_IX，变体不可能被激活到可检测范围。图4阐明尝试活化FVII变体的不成功的结果，所述变体在FVII多肽的151和153残基之间插入FX活 化肽(在与FIXa孵育20小时后)。变体条带(图4左泳道)与图5B中0时的变体FVII_ XHC在相同迁移率下泳动，即其代表未切割的完整的FVII变体。相反，FVII_XHC变体(即在C-末端有活化肽的变体)在与80nM FIXa孵育4小时后完全被激活(见图5B)。与野生型 的FVII比较，FVII_IX的激活也非常慢，只有在用过量FVIIa处理时才能看到。 [0195] 更详细地研究了FVII_XHC的活化。发现当FVII_XHC与FIXa (图5A-B)或FXa (未显示)孵育时，显示出与野生型FVII没有区别的体外活化动力学。在相同的平行实验中，将活化的FVII_XHC与活化的FVII的催化活性增长(图5C-F)进行了比较。使用显色底物S-2288，活化的FVII_XHC显示出几乎相同的酰胺分解活性(图5C-D)。此外，与FVIIa相比较，虽然在比活上有明显的降低，但是FVIIa_XHC能够激活生理底物FX (图5E-F)。 [0196] 如下测定PK数据。将1 mg/kg的所列出化合物给予NMRL小鼠。数据在表3中列出。Comp显示药动学模型中估测的房室值。Cl是清除率，V1是中央室，V2是外周室，t1/2α是分布半衰期，t1/2/β是处置/终端半衰期，MRT是平均滞留时间。 [0197] 根据图6中所示的数据，FVIIa_XHC和FVIIa的终末半衰期分别估测为4.2小时和1.6小时，MRT值分别为4.8和1.6小时。 [0198] 表1. PCR引物序列表 2. 当前研究所用蛋白的阐述 表 3. 估测的PK参数 序列信息 SEQ ID NO:1 成熟FVII/FVIIa多肽的氨基酸序列 SEQ ID NO:2 FIX活化肽的氨基酸序列 SEQ ID NO:3 FX活化肽的氨基酸序列 |
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