经过修饰的因子IX多肽及其用途 |
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| 申请号 | CN201080043135.6 | 申请日 | 2010-08-02 | 公开(公告)号 | CN102573890A | 公开(公告)日 | 2012-07-11 |
| 申请人 | 拜耳医药保健有限公司; | 发明人 | A.布鲁克斯; C.帕特尔; 蒋晓乔; U.格里赞; H.阿佩勒; 王俊; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及经过修饰的因子IX多肽诸如具有一或多处 氨 基酸替代的因子IX多肽。本发明还涉及用于生成经过修饰的因子IX多肽的方法，及使用经过修饰的因子IX多肽，例如， 治疗 罹患血友病B的患者的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种因子IX多肽，其包含通过引入一或多处氨基酸替代经过修饰的氨基酸序列。 |
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| 说明书全文 | 经过修饰的因子IX多肽及其用途[0001] 对相关申请的介绍 [0003] 本申请涉及经过修饰的因子IX多肽，例如，展现升高的比活性的因子IX多肽和聚合物缀合的因子IX多肽。本申请还涉及用于生成经过修饰的因子IX多肽及其缀合物(conjugate)的方法，及使用经过修饰的因子IX多肽，例如，治疗罹患血友病B的患者的方法。 [0004] 发明背景 [0005] 血友病B影响1/34,500名男性，而且是由编码凝固因子IX(FIX)的基因中导致血液中FIX蛋白低或检测不到的各种遗传缺陷引起的(Kurachi，et al.，Hematol.Oncol.Clin.North Am.6：991-997，1992；Lillicrap，Haemophilia 4：350-357，1998)。FIX水平不足导致凝固缺陷和源自出血失控的症状。血友病B通过静脉内输注血浆衍生的或重组的FIX蛋白来有效治疗，或是停止已经开始的出血或是防止出血发生(预防)(Dargaud，et al.，Expert Opin.Biol.Ther.7：651-663；Giangrande，Expert Opin.Pharmacother.6：1517-1524，2005)。有效预防要求维持最低FIX谷水平为正常水平的约1％(Giangrande，Expert Opin.Pharmacother.6：1517-1524，2005)。由于天然FIX(血浆衍生的或重组的)的半衰期是大约18至24小时，FIX水平在推注后3至4天内下降至不到正常水平的1％，这就必须平均每三天重复注射以实现有效预防(Giangrande，Expert Opin.Pharmacother.6： 1517-1524，2005)。这样频繁的静脉内注射对患者成问题，而且对实现有效预防成障碍(Petrini，Haemophilia 13Suppl 2：16-22，2007)，尤其在孩子中。比活性升高的FIX蛋白具有延长保护持续时间的潜力，因此具有显著的医学好处。 [0006] 发明概述 [0007] 本申请提供FIX多肽(也称作经过修饰的FIX多肽，FIX突变蛋白，或FIX变体)，其包含经过修饰以改善FIX比活性的氨基酸序列。在一些实施方案中，引入了一或多处氨基酸替代。在一些实施方案中，该多肽具有凝固活性。在一些实施方案中，该经过修饰的FIX多肽可包含氨基酸残基85，86，87，338，和410处的至少一处替代。 [0008] 该经过修饰的FIX多肽可通过引入一或多处氨基酸替代，例如，用任何氨基酸替代来生成。例示性实施方案包括如下的FIX多肽，其包含一或多处替代诸如，但不限于： [0009] (a)D85F；D85G；D85H；D85I；D85M；D85N；D85R；D85S；D85W；D85Y；V86A；V86D；V86E；V86G；V86H；V86I；V86L；V86M；V86N；V86P；V86Q；V86R；V86S；V86T；T87F；T87I； T87K；T87M；T87R；T87V；T87W；R338A；R338F；R338I；R338L；R338M；R338S；R338T；R338V； R338W；E410N；E410Q； [0010] (b)D85W和T87R；D85F和T87I；D85W和T87W；D85R和T85R；D85I和T87R；D85Y和T87F；D85I和T87M；D85F和T87R；D85F和T87V；D85R和T87K；D85H和T87I；D85I和T87I；D85Y和T87K；D85S和T87R；D85Y和T87R；D85G和T87K；D85H和T87W；D85H和T87K；D85F和T87K；D85H和T87V；D85M和T87I；D85H和T87M；R338A和E410N；R338A和E410Q； [0011] (c)D85W，V86A，和T87R；D85F，V86A，和T87I；D85W，V86A，和T87W；D85R，V86A，和T85R；D85I，V86A，和T87R；D85Y，V86A，和T87F；D85I，V86A，和T87M；D85F，V86A，和T87R；D85F，V86A，和T87V；D85R，V86A，和T87K；D85H，V86A，和T87I；D85I，V86A，和T87I；D85Y，V86A，和T87K；D85S，V86A，和T87R；D85Y，V86A，和T87R；D85G，V86A，和T87K；D85H，V86A，和T87W；D85H，V86A，和T87K；D85F，V86A，和T87K；D85H，V86A，和T87V；D85M，V86A，和T87I； D85H，V86A，和T87M； [0012] (d)D85W，V86A，T87R，和R338A；D85F，V86A，T87I，和R338A；D85W，V86A，T87W，和R338A；D85R，V86A，T85R，和R338A；D85I，V86A，T87R，和R338A；D85Y，V86A，T87F，和R338A；D85I，V86A，T87M，和R338A；D85F，V86A，T87R，和R338A；D85F，V86A，T87V，和R338A；D85R，V86A，T87K，和R338A；D85H，V86A，T87I，和R338A；D85I，V86A，T87I，和R338A；D85Y，V86A，T87K，和R338A；D85S，V86A，T87R，和R338A；D85Y，V86A，T87R，和R338A；D85G，V86A，T87K，和R338A；D85H，V86A，T87W，和R338A；D85H，V86A，T87K，和R338A；D85F，V86A，T87K，和R338A；D85H，V86A，T87V，和R338A；D85M，V86A，T87I，和R338A；D85H，V86A，T87M，和R338A； [0013] (e)D85W，V86A，T87R，R338A，和E410N；D85F，V86A，T87I，R338A，和E410N；D85W，V86A，T87W，R338A，和E410N；D85R，V86A，T85R，R338A，和E410N；D85I，V86A，T87R，R338A，和E410N；D85Y，V86A，T87F，R338A，和E410N；D85I，V86A，T87M，R338A，和E410N；D85F，V86A，T87R，R338A，和E410N；D85F，V86A，T87V，R338A，和E410N；D85R，V86A，T87K，R338A，和E410N；D85H，V86A，T87I，R338A，和E410N；D85I，V86A，T87I，R338A，和E410N；D85Y，V86A，T87K，R338A，和E410N；D85S，V86A，T87R，R338A，和E410N；D85Y，V86A，T87R，R338A，和E410N；D85G，V86A，T87K，R338A，和E410N；D85H，V86A，T87W，R338A，和E410N；D85H，V86A，T87K，R338A，和E410N；D85F，V86A，T87K，R338A，和E410N；D85H，V86A，T87V，R338A，和E410N；D85M，V86A，T87I，R338A，和E410N；D85H，V86A，T87M，R338A，和E410N；D85W，V86A，T87R，R338A，和E410Q；D85F，V86A，T87I，R338A，和E410Q；D85W，V86A，T87W，R338A，和E410Q；D85R，V86A，T85R，R338A，和E410Q；D85I，V86A，T87R，R338A，和E410Q；D85Y，V86A，T87F，R338A，和E410Q；D85I，V86A，T87M，R338A，和E410Q；D85F，V86A，T87R，R338A，和E410Q；D85F，V86A，T87V，R338A，和E410Q；D85R，V86A，T87K，R338A，和E410Q；D85H，V86A，T87I，R338A，和E410Q；D85I，V86A，T87I，R338A，和E410Q；D85Y，V86A，T87K，R338A，和E410Q；D85S，V86A，T87R，R338A，和E410Q；D85Y，V86A，T87R，R338A，和E410Q；D85G，V86A，T87K，R338A，和E410Q；D85H，V86A，T87W，R338A，和E410Q；D85H，V86A，T87K，R338A，和E410Q；D85F，V86A，T87K，R338A，和E410Q；D85H，V86A，T87V，R338A，和E410Q；D85M，V86A，T87I，R338A，和E410Q；D85H，V86A，T87M，R338A，和E410Q；及其任意组合。 [0014] 本发明还提供FIX多肽缀合物，其包含经过修饰以改善FIX比活性的氨基酸序列和共价附着至该FIX多肽的一或多个聚合物模块。在一些实施方案中，该聚合物模块共价附着至该FIX多肽上的糖模块，其中该糖模块在哺乳动物细胞中表达期间天然附着至该肽。 [0015] 本申请还提供药物制备物，其包含经过修饰的FIX多肽和药学可接受载体。 [0016] 本申请还提供用于治疗血友病B的方法，其包括对有所需要的受试者施用治疗有效量的本文所述药物制备物。 [0017] 本申请还提供编码经过修饰的多肽的DNA序列，以及经过该DNA序列转染的真核宿主细胞。 [0018] 本申请还提供用于生产经过修饰的FIX多肽的方法，其包括(i)通过引入一或多处氨基酸替代修饰该多肽的氨基酸序列；(ii)在，例如，哺乳动物细胞系中表达该多肽；并(iii)纯化该多肽。 [0019] 本申请还提供缀合物，其包含a)包含通过引入一或多处氨基酸替代经过修饰的氨基酸序列的因子IX多肽，其中至少一处氨基酸替代位于残基338；b)附着至所述一或多个糖基化位点的一或多糖模块；和c)共价附着至一或多个糖模块的一或多个聚合物模块。 [0020] 本申请还提供用于改善聚合物模块对多肽的缀合的方法，其包括：a)提供具有一或多个糖基化位点的多肽，其中该糖基化位点包含一或多个唾液酸；b)氧化所述多肽的所述唾液酸；c)提供催化剂；并d)将包含氨基-氧官能团的聚合物模块共价附着至所述氧化后的唾液酸。 [0022] 图1描绘一幅图，显示正常大鼠中glycoPEG化FIX-R338A，FIX-R338A和重组野生型FIX的剂量标准化药动学概况。 [0023] 图2描绘一幅图，显示血友病B小鼠中glycoPEG化FIX-R338A，FIX-R338A和rFIX的药动学概况。 [0024] 图3描绘一幅图，显示静脉内注射rFIX，FIX-R338A或glycoPEG化FIX-R338A后血友病B小鼠的血浆中的FIX活性。 [0025] 图4显示一项通过SDS-PAGE对有和无催化剂的情况中PEG化反应的时间过程分析。 [0026] 发明详述 [0027] 本发明提供包括一或多处氨基酸替代的FIX多肽。例如，经过修饰的FIX多肽可包含氨基酸残基85，86，87，338，和410处的至少一处替代。经过修饰的FIX多肽可具有升高的比活性，这会提供，例如，血友病B患者中延长的针对出血的保护时间。经过修饰的FIX多肽会以比当前可用的野生型FIX蛋白疗法可能的次数少的FIX注射使血友病B患者能够实现针对出血的保护。 [0028] 活化后的因子VII(FVII)通过与因对血管壁的损害而暴露的组织因子(TF)形成复合物来启动正常止血过程。该复合物随后活化FIX；活性形式称作FIXa。FIX的活化肽通过因子XIa(FXIa)或组织因子(TF)/因子VIIa复合物在两个位点处的蛋白水解切割被切除以生成催化活性分子，因子IXa(FIXa)。FIXa和因子VIIIa(FVIIIa)将FX转变成因子Xa(FXa)，其继而将凝血酶原转变成凝血酶。凝血酶然后将纤维蛋白原转变成纤维蛋白，导致纤维蛋白凝块形成。 [0029] 野生型FIX具有众多翻译后修饰，已经提出其中一些在体内药动学概况中发挥作用。一旦生成，FIX应保留酶活性并与FVIII，FXI，和FX相互作用以成为血友病B的有效治疗。引入替代氨基酸不应扰乱这些相互作用和功能。本申请部分地提供对FIX的修饰，其有可能导致升高的比活性及最低限度的功能扰乱。通过以较低的蛋白质水平赋予功效，增强FIX比活性的改变可补偿凝固活性的潜在损失而且还潜在延长经过修饰的分子的功效。 [0030] 经过修饰的FIX多肽 [0031] 本发明提供包含一或多处氨基酸替代的FIX多肽，就是，经过修饰的FIX多肽。如本文中使用的，“因子IX”指FIX蛋白，其是内在凝固途径的一个成员且对于血液凝固是必须的。要理解，此定义包括天然以及重组形式的FIX蛋白。除非另有规定或指明，如本文中使用的，FIX意指在其在凝固中的正常作用中的任何功能性人FIX蛋白分子，包括其任何片段、类似物、变体、和衍生物。术语“片段”，“衍生物”，“类似物”，“突变蛋白”，和“变体”在涉及本申请的多肽时意指该多肽保留实质性相同生物学功能或活性的片段，衍生物，类似物，突变蛋白，和变体。 [0032] FIX多肽的非限制性例子包括FIX，FIXa，和FIX具有FIX活性的截短形式。任何前述维持至少一定程度FIX活性的生物学活性片段，删除变体，替代变体，或添加变体也可充当FIX多肽。在一些实施方案中，FIX多肽可包含与SEQ ID NO：1至少约70，80，90，或95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，经过修饰的FIX多肽是生物学活性的。生物学活性可，例如，通过本文所述凝固测定法来测定。 [0033] 经过修饰的FIX多肽可含有保守氨基酸替代。保守替代在本领域中认定为用一种氨基酸替代具有相似特性的另一种氨基酸，而且包括，例如，丙氨酸变成丝氨酸；精氨酸变成赖氨酸；天冬酰胺变成谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变成谷氨酸；半胱氨酸变成丝氨酸；谷氨酰胺变成天冬酰胺；谷氨酸变成天冬氨酸；甘氨酸变成脯氨酸；组氨酸变成天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变成亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变成缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变成精氨酸；甲硫氨酸变成亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变成酪氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变成苏氨酸；苏氨酸变成丝氨酸；色氨酸变成酪氨酸；酪氨酸变成色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸变成异亮氨酸或亮氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的FIX多肽包含1-30， 1-20，或1-10处保守氨基酸替代。 [0034] 特定氨基酸的单字母缩写，其对应氨基酸，和三字母缩写如下：A，丙氨酸(Ala)；C，半胱氨酸(Cys)；D，天冬氨酸(Asp)；E，谷氨酸(Glu)；F，苯丙氨酸(Phe)；G，甘氨酸(Gly)；H，组氨酸(His)；I，异亮氨酸(Ile)；K，赖氨酸(Lys)；L，亮氨酸(Leu)；M，甲硫氨酸(Met)；N，天冬酰胺(Asn)；P，脯氨酸(Pro)；Q，谷氨酰胺(Gln)；R，精氨酸(Arg)；S，丝氨酸(Ser)；T，苏氨酸(Thr)；V，缬氨酸(Val)；W，色氨酸(Trp)；Y，酪氨酸(Tyr)；和正亮氨酸(Nle)。 [0035] 经过修饰的FIX多肽还可糖基化。多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接指碳水化合物模块(moiety)附着至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列Asn-X-Ser和Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸，是碳水化合物模块酶促附着至Asn侧链的识别序列。如此，多肽中这些三肽序列任一的存在产生潜在的N-连接糖基化位点。一种例示性N-连接糖基化位点可表述如下X1-Asn-X2-X3-X4；其中X1任选是Asp，Val，Glu，Gly，或Ile；X2是除Pro外的任何氨基酸；X3是Ser或Thr；且X4任选是Val，Glu，Gly，Gln，或Ile。N-连接糖基化位点添加至FIX多肽通过改变氨基酸序列，使得一或多个上文所述三肽序列得到引入来实现。 [0036] O-连接糖基化指糖N-乙酰基半乳糖胺，半乳糖，或木糖之一附着至羟基氨基酸，最常见附着至丝氨酸或苏氨酸，尽管附着至5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸也是可能的。O-连接糖基化位点添加至FIX多肽可通过改变氨基酸序列，使得一或多个Ser或Thr残基得到引入来实现。 [0037] 糖基化位点可，例如，通过删除一或多个氨基酸残基，一或多个内源FIX氨基酸残基用另一氨基酸替代，或添加一或多个氨基酸残基来引入。氨基酸残基的添加可以在天然FIX分子的两个已有氨基酸残基之间或在N-或C-末端。 [0038] 所用氨基酸替代术语学如下。第一个字母代表人FIX的一个位置处天然存在的氨基酸残基。后面的数字代表成熟人FIX氨基酸序列(SEQ ID NO：1)中的位置。第二个字母代表替代(替换/置换/取代)天然氨基酸的不同氨基酸。例如，V86A表示SEQ ID NO：1位置86处的Val残基用Ala残基替换。 [0039] 本文中所用FIX残基编号系统指天然人FIX蛋白的，其中残基1代表成熟FIX多肽在切除信号序列和前肽(propeptide)二者之后的第一个氨基酸。天然或野生型FIX指SEQ ID NO：1所示全长成熟人FIX分子。 [0040] 可能想要与对照多肽比较具有一或多处氨基酸替代的经过修饰的FIX多肽的特性。比较的特性包括，例如，溶解度，活性，血浆半衰期，和结合特性。为比较选择最适宜的对照多肽在本领域技术人员的见识之内。在一些实施方案中，对照多肽可以除一或多处氨基酸替代外与经过修饰的多肽相同。例示性多肽包括野生型FIX多肽和包含一或多处活化替代，诸如R338A和/或V86A的FIX多肽。 [0041] 本发明的一个方面提供经过修饰的FIX多肽，其具有与对照多肽相比升高的比活性。可能想要增强的比活性来降低实现治疗效果所需给药频率。因而，在某些实施方案中，FIX多肽具有相对于对照蛋白升高约20，30，40，60，80，100，150，200，300，400，500，600，700，800，900，或1000％的比活性。 [0042] 如本文中将多肽药物施用于患者的语境中使用的，术语“半衰期”定义为患者中药物的血浆浓度降低一半所需时间。用于药动学分析和测定半衰期和体内稳定性的方法对于本领域技术人员会是熟悉的。详情可见于Kenneth，et al.，Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists和Peters，et al.，Pharmacokinetc analysis：A Practical Approach(1996)。还可参考“Pharmacokinetics”，M Gibaldi&D Perron，published by Marcel Dekker，2nd Rev.edition(1982)，其记载药动学参数诸如t-α和t-β半衰期和曲线下面积(AUC)。 [0043] 经过修饰的FIX多肽的活性可描述为绝对值，诸如以单位计，或相对于对照多肽的活性的百分比。FIX比活性可定义为在凝固级联中发挥功能，经与活化后的血小板上的FVIIIa相互作用诱导FXa形成，或支持血液凝块形成的能力。活性可在体外通过诸如凝块分析等技术，如记载于，例如，McCarthy，et al.，(Thromb.Haemost.87：824-830，2002)，和本领域技术人员知道的其它技术来评估。活性也可在体内使用数种动物系之一来评估，所述动物系故意以血友病B的遗传突变育种，使得自此类系生成的动物FIX缺陷的。此类系可得自多种来源诸如，但不限于，Division ofLaboratories and Research，New York Department of Public Health，Albany，N.Y.和Department of Pathology，University ofNorth Carolina，Chapel Hill，N.C。这两种来源，例如，提供罹患犬血友病B的犬。或者，FIX缺陷小鼠也是可得的(Sabatino，et al.，Blood 104：2767-2774，2005)。为了测试FIX活性，将测试多肽注射入患病动物，做一小切口并与健康对照比较出血时间。 [0044] 人野生型FIX具有200个单位每mg左右的比活性。FIX的一个单位定义为1毫升正常(合并的)人血浆中存在的FIX的量(对应于100％的FIX水平)。在一些实施方案中，经过修饰的FIX多肽可具有至少约200个单位，300个单位，400个单位，500个单位，或更多每mg FIX多肽的比活性。在一些实施方案中，经过修饰的FIX多肽可具有至少约500个单位，600个单位，700个单位，750个单位或更多每mg FIX多肽的比活性。在一些实施方案中，FIX的比活性可使用APTT或活化部分促凝血酶原激酶时间测定法(记载于，例如，Proctor，et al.，Am.J.Clin.Pathol.36：212，1961)来测量。 [0045] 当在细胞，诸如肝或肾细胞中表达时，FIX多肽可由细胞机制合成，经历翻译后修饰，并然后由细胞分泌入胞外环境。自细胞分泌的FIX多肽的量因此依赖于蛋白质翻译和胞外分泌这两种过程。在一些实施方案中，经过修饰的FIX多肽可以相对于对照蛋白质分泌的量降低不超过约10，20，30，40，50，60，70，或80％量分泌。例如，经过修饰的FIX多肽可以相对于对照FIX多肽降低不超过约80％的量分泌，如果经过修饰的多肽以与对照相比至少约20％的量分泌的话。FIX多肽分泌的量可，例如，通过使用任何公知方法测定胞外环境中的蛋白质水平来测量。用于蛋白质定量的传统方法包括2-D凝胶电泳，质谱术，和抗体结合。用于测定生物学样品中蛋白质水平的例示性方法包括基于抗体的技术，诸如免疫印迹(Western印迹)，免疫组织学测定法，酶联免疫吸附测定法(ELISA)，或放射免疫测定法(RIA)。 [0046] 在一些实施方案中，经过修饰的FIX多肽以相对于对照蛋白质与FVIII，FXI，或FX中至少一种的相互作用降低不超过约40，50，60，70，或80％的水平与FVIII，FXI，或FX中至少一种相互作用。例如，经过修饰的FIX多肽可以相对于对照FIX多肽降低不超过约80％的水平与FVIII，FXI，或FX中至少一种相互作用，如果经过修饰的多肽以与对照相比至少约20％的水平与FVIII，FXI，或FX中至少一种相互作用的话。FIX对凝固级联其它成员的结合可通过本领域技术人员知道的任何方法来测定，包括例如，Chang，et al.，(J.Biol.Chem.273：12089-12094，1998)中记载的方法。 [0047] 本申请部分提供包含一或多处氨基酸替代的FIX多肽。在一些实施方案中，提供包含选自下组的一或多处替代的FIX多肽：D85F；D85G；D85H；D85I；D85M；D85N；D85R；D85S；D85W；D85Y；V86A；V86D；V86E；V86G；V86H；V86I；V86L；V86M；V86N；V86P；V86Q； V86R；V86S；V86T；T87F；T87I；T87K；T87M；T87R；T87V；T87W；R338A；R338F；R338I；R338L； R338M；R338S；R338T；R338V；R338W；E410N；E410Q；或其任意组合。 [0048] 在一些实施方案中，提供包含选自下组的一或多处替代的FIX多肽：D85W和T87R；D85F和T87I；D85W和T87W；D85R和T85R；D85I和T87R；D85Y和T87F；D85I和T87M；D85F和T87R；D85F和T87V；D85R和T87K；D85H和T87I；D85I和T87I；D85Y和T87K；D85S和T87R；D85Y和T87R；D85G和T87K；D85H和T87W；D85H和T87K；D85F和T87K；D85H和T87V； D85M和T87I；D85H和T87M；R338A和E410N；R338A和E410Q；或其任意组合 [0049] 在一些实施方案中，提供包含选自下组的一或多处替代的FIX多肽：D85W，V86A，和T87R；D85F，V86A，和T87I；D85W，V86A，和T87W；D85R，V86A，和T85R；D85I，V86A，和T87R；D85Y，V86A，和T87F；D85I，V86A，和T87M；D85F，V86A，和T87R；D85F，V86A，和T87V；D85R，V86A，和T87K；D85H，V86A，和T87I；D85I，V86A，和T87I；D85Y，V86A，和T87K；D85S，V86A，和T87R；D85Y，V86A，和T87R；D85G，V86A，和T87K；D85H，V86A，和T87W；D85H，V86A，和T87K； D85F，V86A，和T87K；D85H，V86A，和T87V；D85M，V86A，和T87I；D85H，V86A，和T87M；或其任意组合 [0050] 在一些实施方案中，提供包含选自下组的一或多处替代的FIX多肽：D85W，V86A，T87R，和R338A；D85F，V86A，T87I，和R338A；D85W，V86A，T87W，和R338A；D85R，V86A，T85R，和R338A；D85I，V86A，T87R，和R338A；D85Y，V86A，T87F，和R338A；D85I，V86A，T87M，和R338A；D85F，V86A，T87R，和R338A；D85F，V86A，T87V，和R338A；D85R，V86A，T87K，和R338A；D85H，V86A，T87I，和R338A；D85I，V86A，T87I，和R338A；D85Y，V86A，T87K，和R338A；D85S，V86A，T87R，和R338A；D85Y，V86A，T87R，和R338A；D85G，V86A，T87K，和R338A；D85H，V86A，T87W，和R338A；D85H，V86A，T87K，和R338A；D85F，V86A，T87K，和R338A；D85H，V86A，T87V，和R338A；D85M，V86A，T87I，和R338A；D85H，V86A，T87M，和R338A；或其任意组合。 [0051] 在一些实施方案中，提供包含选自下组的一或多处替代的FIX多肽：D85W，V86A，T87R，R338A，和 E410N；D85F，V86A，T87I，R338A，和 E410N；D85W，V86A，T87W，R338A，和E410N；D85R，V86A，T85R，R338A，和E410N；D85I，V86A，T87R，R338A，和E410N；D85Y，V86A，T87F，R338A，和E410N；D85I，V86A，T87M，R338A，和E410N；D85F，V86A，T87R，R338A，和E410N；D85F，V86A，T87V，R338A，和E410N；D85R，V86A，T87K，R338A，和E410N；D85H，V86A，T87I，R338A，和E410N；D85I，V86A，T87I，R338A，和E410N；D85Y，V86A，T87K，R338A，和E410N；D85S，V86A，T87R，R338A，和E410N；D85Y，V86A，T87R，R338A，和E410N；D85G，V86A，T87K，R338A，和E410N；D85H，V86A，T87W，R338A，和E410N；D85H，V86A，T87K，R338A，和E410N；D85F，V86A，T87K，R338A，和E410N；D85H，V86A，T87V，R338A，和E410N；D85M，V86A，T87I，R338A，和E410N；D85H，V86A，T87M，R338A，和E410N；D85W，V86A，T87R，R338A，和E410Q；D85F，V86A，T87I，R338A，和E410Q；D85W，V86A，T87W，R338A，和E410Q；D85R，V86A，T85R，R338A，和E410Q；D85I，V86A，T87R，R338A，和E410Q；D85Y，V86A，T87F，R338A，和E410Q；D85I，V86A，T87M，R338A，和E410Q；D85F，V86A，T87R，R338A，和E410Q；D85F，V86A，T87V，R338A，和E410Q；D85R，V86A，T87K，R338A，和E410Q；D85H，V86A，T87I，R338A，和E410Q；D85I，V86A，T87I，R338A，和E410Q；D85Y，V86A，T87K，R338A，和E410Q；D85S，V86A，T87R，R338A，和E410Q；D85Y，V86A，T87R，R338A，和E410Q；D85G，V86A，T87K，R338A，和E410Q；D85H，V86A，T87W，R338A，和E410Q；D85H，V86A，T87K，R338A，和E410Q；D85F，V86A，T87K，R338A，和E410Q；D85H，V86A，T87V，R338A，和E410Q；D85M，V86A，T87I，R338A，和E410Q；D85H，V86A，T87M，R338A，和E410Q；及其任意组合。 [0052] 在一些实施方案中，提供包含选自下组的一或多处替代的FIX多肽： [0053] (a)D85F；D85G；D85H；D85I；D85M；D85N；D85R；D85S；D85W；D85Y；V86A；V86D；V86E；V86G；V86H；V86I；V86L；V86M；V86N；V86P；V86Q；V86R；V86S；V86T；T87F；T87I； T87K；T87M；T87R；T87V；T87W；R338A；R338F；R338I；R338L；R338M；R338S；R338T；R338V； R338W；E410N；E410Q； [0054] (b)D85W和T87R；D85F和T87I；D85W和T87W；D85R和T85R；D85I和T87R；D85Y和T87F；D85I和T87M；D85F和T87R；D85F和T87V；D85R和T87K；D85H和T87I；D85I和T87I；D85Y和T87K；D85S和T87R；D85Y和T87R；D85G和T87K；D85H和T87W；D85H和T87K；D85F和T87K；D85H和T87V；D85M和T87I；D85H和T87M； [0055] (c)D85W，V86A，和T87R；D85F，V86A，和T87I；D85W，V86A，和T87W；D85R，V86A，和T85R；D85I，V86A，和T87R；D85Y，V86A，和T87F；D85I，V86A，和T87M；D85F，V86A，和T87R；D85F，V86A，和T87V；D85R，V86A，和T87K；D85H，V86A，和T87I；D85I，V86A，和T87I；D85Y，V86A，和T87K；D85S，V86A，和T87R；D85Y，V86A，和T87R；D85G，V86A，和T87K；D85H，V86A，和T87W；D85H，V86A，和T87K；D85F，V86A，和T87K；D85H，V86A，和T87V；D85M，V86A，和T87I； D85H，V86A，和T87M；R338A和E410N；R338A和E410Q； [0056] (d)D85W，V86A，T87R，和R338A；D85F，V86A，T87I，和R338A；D85W，V86A，T87W，和R338A；D85R，V86A，T85R，和R338A；D85I，V86A，T87R，和R338A；D85Y，V86A，T87F，和R338A；D85I，V86A，T87M，和R338A；D85F，V86A，T87R，和R338A；D85F，V86A，T87V，和R338A；D85R，V86A，T87K，和R338A；D85H，V86A，T87I，和R338A；D85I，V86A，T87I，和R338A；D85Y，V86A，T87K，和R338A；D85S，V86A，T87R，和R338A；D85Y，V86A，T87R，和R338A；D85G，V86A，T87K，和R338A；D85H，V86A，T87W，和R338A；D85H，V86A，T87K，和R338A；D85F，V86A，T87K，和R338A；D85H，V86A，T87V，和R338A；D85M，V86A，T87I，和R338A；D85H，V86A，T87M，和R338A； [0057] (e)D85W，V86A，T87R，R338A，和E410N；D85F，V86A，T87I，R338A，和E410N；D85W，V86A，T87W，R338A，和E410N；D85R，V86A，T85R，R338A，和E410N；D85I，V86A，T87R，R338A，和E410N；D85Y，V86A，T87F，R338A，和E410N；D85I，V86A，T87M，R338A，和E410N；D85F，V86A，T87R，R338A，和E410N；D85F，V86A，T87V，R338A，和E410N；D85R，V86A，T87K，R338A，和E410N；D85H，V86A，T87I，R338A，和E410N；D85I，V86A，T87I，R338A，和E410N；D85Y，V86A，T87K，R338A，和E410N；D85S，V86A，T87R，R338A，和E410N；D85Y，V86A，T87R，R338A，和E410N；D85G，V86A，T87K，R338A，和E410N；D85H，V86A，T87W，R338A，和E410N；D85H，V86A，T87K，R338A，和E410N；D85F，V86A，T87K，R338A，和E410N；D85H，V86A，T87V，R338A，和E410N；D85M，V86A，T87I，R338A，和E410N；D85H，V86A，T87M，R338A，和E410N；D85W，V86A，T87R，R338A，和E410Q；D85F，V86A，T87I，R338A，和E410Q；D85W，V86A，T87W，R338A，和E410Q；D85R，V86A，T85R，R338A，和E410Q；D85I，V86A，T87R，R338A，和E410Q；D85Y，V86A，T87F，R338A，和E410Q；D85I，V86A，T87M，R338A，和E410Q；D85F，V86A，T87R，R338A，和E410Q；D85F，V86A，T87V，R338A，和E410Q；D85R，V86A，T87K，R338A，和E410Q；D85H，V86A，T87I，R338A，和E410Q；D85I，V86A，T87I，R338A，和E410Q；D85Y，V86A，T87K，R338A，和E410Q；D85S，V86A，T87R，R338A，和E410Q；D85Y，V86A，T87R，R338A，和E410Q；D85G，V86A，T87K，R338A，和E410Q；D85H，V86A，T87W，R338A，和E410Q；D85H，V86A，T87K，R338A，和E410Q；D85F，V86A，T87K，R338A，和E410Q；D85H，V86A，T87V，R338A，和E410Q；D85M，V86A，T87I，R338A，和E410Q；D85H，V86A，T87M，R338A，和E410Q；及其任意组合。 [0058] 本发明的又一个方面提供具有升高的比活性的FIX多肽。在一些实施方案中，多肽可具有至少约200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1400，1600，1800，2000，4000，6000，8000，或更多单位每mg多肽的比活性。比活性可如先前所述测定，诸如，例如，使用APTT测定法。这些多肽可用作治疗剂，特别是在罹患血友病B的患者中。这些多肽可包含别的替代或修饰，诸如本文所述糖基化位点。 [0059] 本发明的一个方面提供经过修饰的因子IX多肽，其包含下述氨基酸序列： [0060] YNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGD [0061] QCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELX85X86X87CNIKNGRC [0062] EQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTR [0063] AETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQ [0064] VVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTE [0065] QKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNS YVTPICIADKEYTN [0066] IFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLX338STKFTIYN [0067] NMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKY [0068] GIYTKVSRYVNWIKX410KTKLT(SEQ ID NO：2)； [0069] 其中X85选自D，F，G，H，I，M，N，R，S，W，和Y； [0070] 其中X86选自A，D，E，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，和V； [0071] 其中X87选自F，I，K，M，R，T，V，和W； [0072] 其中X338选自A，F，I，L，M，R，S，T，V，和W； [0073] 其中X410选自E，N，和Q。 [0074] 引入至少一处氨基酸替代是至少一个X位置处的替代的结果。在一些实施方案中，经过修饰的多肽另外包含约1-30，1-20，或1-10个连续氨基酸变化且维持FIX活性。在一些实施方案中，经过修饰的多肽与SEQ ID NO：1至少约80，85，90，95，或99％相同(同一性)且维持FIX活性。 [0075] 经过修饰的FIX多肽的生成 [0076] 氨基酸序列改变可通过多种技术来实现，诸如，例如，通过以位点特异性诱变修饰对应核酸序列。用于位点特异性诱变的技术是本领域公知的且记载于，例如，Zoller，et al.，(DNA3：479-488，1984)或Horton，et al.，(Gene 77：61-68，1989，pp.61-68)。如此，使用FIX的核苷酸和氨基酸序列，可进入选定的改变。类似地，使用特异性引物通过聚合酶链式反应制备DNA构建物的规程是本领域技术人员公知的(参见，例如，PCR Protocols，1990，Academic Press，San Diego，California，USA)。 [0077] 编码FIX多肽的核酸构建物也可通过已建立的标准方法合成制备，例如，Beaucage，et al.，(Gene Amplif.Anal.3：1-26，1983)记载的亚磷酰胺法。依照亚磷酰胺法，合成寡核苷酸(例如，在自动DNA合成仪中)，纯化，退火，连接，并在合适载体中克隆。 编码FIX多肽的DNA序列也可通过聚合酶链式反应使用特异性引物来制备，例如，记载于美国专利No.4,683,202；或Saiki，et al.，(Science 239：487-491，1988)。另外，核酸构建物可以是合成起源和基因组起源的混合，合成起源和cDNA起源的混合，或基因组起源和cDNA起源的混合，通过依照标准技术连接与完整核酸构建物的各个部分对应的合成，基因组，或cDNA起源的片段来制备(在恰当时)。 [0078] 编码FIX多肽的DNA序列可使用重组DNA规程插入重组载体中。载体的选择常常会依赖于载体要导入的宿主。载体可以是自主复制载体或整合载体。自主复制载体作为染色体外实体存在，而且它的复制不依赖染色体复制，例如，质粒。整合载体指整合入宿主细胞基因组中的载体，而且与它所整合的染色体一起复制。 [0079] 载体可以是表达载体，其中编码经过修饰的FIX的DNA序列与DNA的转录，翻译，或加工所需别的区段，诸如启动子，终止子，和聚腺苷酸化位点可操作连接。一般地，表达载体可衍生自质粒或病毒DNA，或者可含有二者的元件。术语“可操作连接”指示各区段的排列使得它们协调发挥功能以实现它们的预定目的，例如，转录在启动子中启动并穿过编码多肽的DNA序列前进。 [0080] 表达FIX多肽中使用的表达载体可包含能够指导克隆的基因或cDNA转录的启动子。启动子可以是在选定的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，而且可以衍生自编码对宿主细胞而言同源或异源的蛋白质的基因。 [0081] 适合于在哺乳动物细胞中指导编码FIX多肽的DNA转录的启动子的例子是，例如，SV40启动子(Subramani，et al.，Mol.Cell Biol.1：854-864，1981)，MT-I(金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter，et al.，Science 222：809-814，1983)，CMV启动子(Boshart，et al.，Cell 41：521-530，1985)，或腺病毒2主要晚期启动子(Kaufman et al.，，Mol.Cell Biol，2：1304-1319，1982)。 [0082] 编码FIX多肽的DNA序列也可，在必要时，可操作连接合适的终止子，诸如人生长激素终止子(Palmiter，et al.，Science 222：809-814，1983)或TPIl(Alber et al.，J.MoI.Appl.Gen.1：419-434，1982) 或 ADH3(McKnight，et al.，EMBO J.4：2093-2099，1985)终止子。表达载体也可含有位于插入位点下游的聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸化信号包括来自SV40的早期或晚期聚腺苷酸化信号，来自腺病毒5EIb区的聚腺苷酸化信号，人生长激素基因终止子(DeNoto，et al.，Nucl.Acids Res.9：3719-3730，1981)，或来自人FIX基因的聚腺苷酸化信号。表达载体也可包括增强子序列，诸如SV40增强子。 [0083] 为了引导本发明的FIX多肽入宿主细胞的分泌途径，可使用天然FIX分泌信号序列。或者，可以在重组载体中提供分泌信号序列(也称作前导序列，前原序列，或前序列)。分泌信号序列可以正确的读码框连接编码FIX类似物的DNA序列。分泌信号序列通常位于编码肽的DNA序列的5’。例示性信号序列包括，例如，MPIF-1信号序列和司腺钙蛋白信号序列。 [0084] 用于连接编码FIX多肽的DNA序列，启动子，和任选的终止子和/或分泌信号序列及将它们插入含有复制必需信息的合适载体中的规程，是本领域技术人员公知的(参见，例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，1989)。 [0085] 转染哺乳动物细胞和表达导入细胞中的DNA序列的方法记载于，例如，Kaufman，et al.，(J.Mol.Biol.159：601-621，1982)；Southern，et al.，(J.Mol.Appl.Genet.1：327-341，1982)；Loyter，et al.，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：422-426，1982)；Wigler，et al.，(Cell 14：725-731，1978)；Corsaro，et al.，(Somatic Cell Genetics 7： 603-616，1981)，Graham，et al.，(Virology 52：456-467，1973)；和Neumann，et al.，(EMBO J.1：841-845，1982)。克隆的DNA序列可通过，例如，脂转染，DEAE-右旋糖酐介导的转染，显微注射，原生质体融合，磷酸钙沉淀，逆转录病毒投递，电穿孔，声穿孔，激光辐照，磁转染，天然转化，和生物射弹转化导入培养的哺乳动物细胞中(参见，例如，Mehier-Humbert，et al.，Adv.Drug Deliv.Rev.57：733-753，2005)。为了鉴定和选择表达外源DNA的细胞，一般将赋予可选择表型的基因(选择标志)与感兴趣基因或cDNA一起导入细胞中。选择标志包括，例如，赋予对药物诸如新霉素，嘌呤霉素，潮霉素，和甲氨蝶呤的抗性的基因。选择标志可以是可扩增的选择标志，其允许标志和外源DNA在序列相连接时扩增。例示性可扩增选择标志包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和腺苷脱氨酶。选择合适的选择标志在本领域技术人员的见识之内(参见，例如，美国专利No.5,238,820)。 [0086] 在细胞经DNA转染之后，在适宜的生长培养基培养细胞以表达感兴趣基因。如本文中使用的，术语“适宜的生长培养基”意指含有营养物和细胞生长和活性FIX多肽表达所需其它成分的培养基。 [0087] 培养基一般包括，例如，碳源，氮源，必需氨基酸，必需糖，维生素，盐，磷脂，蛋白质，和生长因子，而且在维生素K依赖性蛋白质诸如FIX的情况中，还可提供维生素K。然后应用药物选择来选择以稳定方式表达选择标志的细胞的生长。对于经可扩增选择标志转染的细胞，可提高药物浓度以选择克隆的序列的拷贝数的增多，由此提高表达水平。然后对稳定转染细胞的克隆筛选FIX多肽的表达。 [0088] 本发明中使用的哺乳动物细胞系的例子是COS-1(ATCC CRL 1650)，幼仓鼠肾(BHK)，HKB11细胞(Cho，et al.，J.Biomed.Sci，9：631-638，2002)，和HEK-293(ATCC CRL1573；Graham，et al.，J.Gen.Virol.36：59-72，1977)细胞系。另外，多种其它细胞系可用于本发明之内，包括大鼠Hep I(大鼠肝瘤；ATCC CRL 1600)，大鼠Hep II(大鼠肝瘤；ATCC CRL 1548)，TCMK-1(ATCC CCL 139)，Hep-G2(ATCC HB 8065)，NCTC 1469(ATCC CCL 9.1)，CHO-K1(ATCC CCL 61)，和CHO-DUKX细胞(Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，1980)。 [0089] FIX多肽可以自细胞培养液回收，而且然后可以通过本领域已知的多种规程来纯化，包括，但不限于，层析(例如，离子交换，亲和，疏水，层析聚焦，和大小排阻)，电泳规程(例如，制备性等电聚焦(IEF)，差异溶解性(例如，硫酸铵沉淀))，提取(参见，例如，Protein Purification，Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)，或其各种组合。在一个例示性实施方案中，多肽可以通过抗FIX抗体柱上的亲和层析来纯化。别的纯化可以通过常规化学纯化手段来实现，诸如高效液相层析。其它纯化方法是本领域已知的，而且可以应用于经过修饰的FIX多肽的纯化(参见，例如，Scopes，R.，Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.，1982)。 [0090] 一般地，“纯化的”应当指已经进行过分级以清除各种其它成分，而且基本上保留其表达的生物学活性的蛋白质或肽组合物。在使用术语“实质性纯化的”(substantially purified)的情况中，这种表述应当指如下的组合物，其中蛋白质或肽构成该组合物的主要成分，诸如占该组合物中蛋白质的约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，约95％，约99％，或更多。 [0091] 本领域技术人员知道用于定量多肽纯化程度的多种方法。这些包括，例如，测定活性级分的比活性，或通过SDS/PAGE分析来评估级分内多肽的量。用于评估级分纯度的一种例示性方法是计算级分的比活性，将该活性与初始提取物的比活性比较，并如此计算纯度，本文中通过“纯化倍数”来评估。用于代表活性量的实际单位，当然，会依赖于特定测定技术。 [0092] 在一些实施方案中，在组织培养细胞中重组表达FIX多肽，而且糖基化是宿主细胞，诸如哺乳动物细胞的正常翻译后细胞功能的结果。在其它情况中，细胞经过遗传工程改造以表达酶和期望多肽的组合，使得细胞内发生期望糖模块添加至表达的多肽。或者，糖基化可经由化学或酶促修饰来实现(参见，例如，Lee，et al.，J.Biol.Chem.264：13848-13855，1989)。本领域建议了多种方法来定制多肽的糖基化样式(参见，例如，WO 99/22764；WO98/58964；WO 99/54342；美国公 开No.2008/0050772；和美国专 利No.5,047,335)。 [0093] 聚合物缀合 [0094] 经过修饰的FIX多肽可进一步包含一或多个聚合物缀合位点，其可用于附着聚合物模块。在一些实施方案中，FIX多肽可缀合至生物相容的聚合物。可选择生物相容的聚合物来提供期望的药动学改善。例如，可选择聚合物的身份、大小、和结构以改善具有FIX活性的多肽的循环半衰期或降低多肽的抗原性且没有不可接受的活性降低。 [0095] 经过修饰的FIX多肽可包括一或多个糖模块，其天然地在哺乳动物中在exoression期间附着至该肽。在一些实施方案中，糖模块可充当用于附着聚合物模块的缀合位点。在一些实施方案中，聚合物模块可使用各种接头或连接化学附着至糖模块。例如，聚合物模块可通过腙连接或氨基-氧连接缀合至糖模块。 [0096] 在本发明中有用的聚合物的例子包括但不限于聚(烯二醇)(poly(alkylene glycols))诸如聚乙二醇(PEG)，聚(丙二醇)(“PPG”)，乙二醇和丙二醇的共聚物等等，聚(乙氧基化多元醇)，聚(烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(羟基烃基甲基丙烯酰胺)，聚(羟基烃基甲基丙烯酸酯)，聚(糖)，聚(α-羟基酸)，聚(乙烯醇)，聚磷腈，聚 唑啉，聚(N-丙烯酰吗啉)，聚唾液酸，羟乙基淀粉(HES)，聚氧化乙烯，烃基-聚氧化乙烯，二聚氧化乙烯，聚氧化烯的共聚物或嵌段共聚物，聚(乙二醇-共-丙二醇)，聚(N-2-(羟基丙基)甲基丙烯酰胺)，和右旋糖酐(poly(propylene glycol)(“PPG”)，copolymers of ethylene glycol and propylene glycol and the like，poly(oxyethylated polyol)，poly(olefinic alcohol)，poly(vinylpyrrolidone)，poly(hydroxyalkylmethacrylamide)，poly(hydroxyalkylmethacrylate)，poly(saccharides)，poly(alpha-hydroxy acid)，poly(vinyl alcohol)，polyphosphazene，polyoxazoline，poly(N-acryloylmorpholine)，polysialic acid，hydroxyethyl starch(HES)，polyethylene oxide，alkyl-polyethylene oxides，bispolyethylene oxides，co-polymers or block co-polymers of polyalkyene oxides，poly(ethylene glycol-co-propylene glycol)，poly(N-2-(hydroxyproply)methyacrylamide)，and dextran)。 [0097] 聚合物不限于特定结构，而且可以是线性的(例如，烃氧基PEG或双功能PEG)，或非线性的诸如分支的，分叉的，多臂的(例如，附着至多元醇核心的PEG)，和树状的。此外，聚合物的内部结构可以以任意数目的不同样式组织，而且可以选自下组：均聚物，交替共聚物，随机共聚物，嵌段共聚物，交替三聚物，随机三聚物，和嵌段三聚物。 [0098] PEG和其它水溶性聚合物(即，聚合试剂)可以用适合偶联至FIX多肽上期望位点的合适活化基团来活化。如此，聚合试剂会拥有用于与FIX多肽反应的反应性基团。代表性聚合试剂和用于将这些聚合物缀合至活性模块的方法是本领域已知，而且进一步记载于Zalipsky，et al.，(“Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides”in Polyethylene Glycol Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications，J.M.Harris，Plenus Press，New York(1992))， 及 Zalipsky(Adv.Drug Rev.16：157-182，1995)。 [0099] 聚合物的重量平均分子量可以为约100道尔顿至约150,000道尔顿。例示性范围，然而，包括大于约5,000道尔顿至约100,000道尔顿的范围中的，约6,000道尔顿至约90,000道尔顿的范围中的，约10,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围中的，大于约10,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围中的，约20,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围中的，约53,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围中的，约25,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围中的，约29,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围中的，约35,000道尔顿至约 120,000道尔顿的范围中的，和约40,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围中的重量平均分子量。 [0100] 生物相容聚合物的例示性重量平均分子量包括约100道尔顿，约200道尔顿，约300道尔顿，约400道尔顿，约500道尔顿，约600道尔顿，约700道尔顿，约750道尔顿，约 800道尔顿，约900道尔顿，约1,000道尔顿，约1,500道尔顿，约2,000道尔顿，约2,200道尔顿，约2,500道尔顿，约3,000道尔顿，约4,000道尔顿，约4,400道尔顿，约4,500道尔顿，约5,000道尔顿，约5,500道尔顿，约6,000道尔顿，约7,000道尔顿，约7,500道尔顿，约8,000道尔顿，约9,000道尔顿，约10,000道尔顿，约11,000道尔顿，约12,000道尔顿，约13,000道尔顿，约14,000道尔顿，约15,000道尔顿，约20,000道尔顿，约22,500道尔顿，约25,000道尔顿，约30,000道尔顿，约35,000道尔顿，约40,000道尔顿，约45,000道尔顿，约50,000道尔顿，约55,000道尔顿，约60,000道尔顿，约65,000道尔顿，约70,000道尔顿，和约75,000道尔顿。也可使用具有任何前述总分子量的前述分支型式的生物相容聚合物(例如，由两个20,000道尔顿聚合物构成的分支40,000道尔顿聚合物)。 [0101] 在一些实施方案中，聚合物是PEG。PEG是公知的，水溶性聚合物，其是商品化的或可以依照本领域公知方法通过乙二醇的开环聚合来制备(Sandler and Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York，Vol.3，pages 138-161)。术语“PEG”广义用于涵盖任何聚乙二醇分子，不管大小或PEG末端处的修饰，而且可以以下式表示：X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH，其中n是20至2300且X是H或末端修饰，例如，C1-4烃基。PEG可含有别的化学基团，其是结合反应必需的，其源自该分子的化学合成，或起该分子各部分的最佳距离的间隔物的作用。另外，此类PEG可以由连接到一起的一或多个PEG侧链组成。具有超过一个PEG链的PEG称作多臂或分支PEG。分支PEG可，例如，通过将聚氧化乙烯添加至各种多元醇包括甘油，季戊四醇，和山梨醇来制备。例如，四臂分支PEG可以自季戊四醇和氧化乙烯制备。分支PEG的例子记载于，例如，欧洲已公布申请No.473084A和美国专利No.5,932,462。一种形式的PEG包括经赖氨酸的伯氨基连接的两个PEG侧链(PEG2)(Monfardini，et al.，Bioconjugate Chem.6：62-69，1995)。 [0102] 在一个实施方案中，聚合物可以是末端加帽聚合物，就是，具有至少一个用相对惰性基团，诸如低级C1-6烃氧基，尽管也可使用羟基加帽的末端的聚合物。当聚合物是PEG时，例如，可使用甲氧基-PEG(通常称作mPEG)，其是PEG的一种线性形式，其中聚合物的一个末端具有甲氧基(--OCH3)，而另一个末端是羟基或可任选化学修饰的其它官能团。 [0103] 多臂或分支PEG分子，诸如美国专利No.5,932,462中记载的那些，也可用作PEG聚合物。另外，PEG可包含分叉PEG(参见，例如，PCT公开号WO1999/45964，披露了能够用于本发明的一或多个实施方案的多种分叉PEG结构)。将Z官能团连接至分支碳原子的原子链充当系链基团，而且可以包含，例如，烃基链，醚链，酯链，酰胺链，及其组合。 [0104] PEG聚合物也可含有沿着PEG的长度而非在PEG链的末端共价附着的悬挂PEG分子，其具有反应性基团，诸如羧基。悬挂的反应性基团可直接或经由间隔物模块，诸如亚烃基附着至PEG。 [0105] 为了实现聚合物分子对多肽的共价附着，聚合物分子的羟基端基必须以活化后的形式提供，就是，反应性官能团(其例子包括伯氨基，酰肼(HZ)，硫醇基，琥珀酸酯(SUC)，琥珀酰亚氨基琥珀酸酯(SS)，琥珀酰亚氨基琥珀酰胺(SSA)，琥珀酰亚氨基丙酸酯(SPA)，琥珀酰亚氨基丁酸酯(SBA)，琥珀酰亚氨基羧甲酯(SCM)，苯并三唑碳酸酯(BTC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，醛，硝基苯基碳酸酯(NPC)，和tresylate(TRES))。适当活化的聚合物分子是商品化的，例如，NOF，Japan；Nektar Therapeutics，Inc.，Huntsville，Ala.；PolyMASC Pharmaceuticals plc，UK；或SunBio Corporation，Anyang City，South Korea。或者，聚合物分子可通过本领域已知的常规方法来活化(参见，例如，WO 90/13540)。适合于在本发明中使用的活化后的线性或分支聚合物分子的具体例子是商品化的，例如，NOF，Japan；Nektar Therapeutics，Inc.，Huntsville，Ala。活化后的PEG聚合物的具体例子包括下述线性PEG：NHS-PEG，SPA-PEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG，SCM-PEG，NOR-PEG，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，OPSS-PEG，IODO-PEG，和MAL-PEG，和分支PEG，诸如PEG2-NHS，PEG2-MAL，和，例如，美国专利No.5,932,462和美国专利No.5,643,575中披露的那些，通过述及将二者收入本文。 [0106] 在一个实施方案中，聚合物具有硫氢基反应性模块，其可与FIX多肽上的游离半胱氨酸反应以形成共价连接。此类硫氢基反应性模块包括硫醇，triflate，tresylate，氮丙啶，环氧乙烷，S-吡啶基，或马来酰亚胺模块。另外，下述出版物，通过述及收入本文，披露了有用的聚合物分子和/或PEG化化学：美国专利No.6,113,906；7,199,223；5,824,778；5,476,653；4,902,502；5,281,698；5,122,614；5,219,564；5,736,625；5,473,034； 5,516,673；5,629,384；5,382,657；WO 97/32607；WO 92/16555；WO 94/04193；WO 94/14758；WO 94/17039；WO 94/18247；WO 94/28024；WO 95/00162；WO 95/11924； WO95/13090；WO 95/33490；WO 96/00080；WO 97/18832；WO 98/41562；WO 98/48837； WO 99/32134；WO 99/32139；WO 99/32140；WO 96/40791；WO 98/32466；WO 95/06058； WO 97/03106；WO 96/21469；WO 95/13312；WO 98/05363；WO 96/41813；WO 96/07670； EP809996；EP921131；EP605963；EP510356；EP400472；EP183503；EP154316；EP229108； EP402378；和EP439508。 [0107] 对于半胱氨酸残基的PEG化，可以在PEG化之前用还原剂，诸如二硫苏糖醇(DDT)处理多肽。随后可以通过任何便利方法，诸如通过脱盐来清除还原剂。PEG对 半胱氨酸残基的缀合通常在pH 6-9的合适缓冲液中于4℃至25℃变化的温度发生长 至约16小时的时段。用于偶联至半胱氨酸残基的活化后的PEG聚合物的例子包括， 例如，下述线性和分支PEG：乙烯基砜-PEG(PEG-VS)，诸如乙烯基砜-mPEG(mPEG-VS)； 正吡啶基-二硫化物-PEG(PEG-OPSS)，诸如正吡啶基-二硫化物-mPEG(MPEG-OPSS)； 和马来酰亚胺-PEG(PEG-MAL)，诸如马来酰亚胺-mPEG(mPEG-MAL)和分支马来酰亚 胺-mPEG2(mPEG2-MAL)。 [0108] 在一个实施方案中，具有一或多个引入的聚合物缀合位点的FIX多肽可在细胞中表达，细胞在含有半胱氨酸的细胞培养基中培养，半胱氨酸通过形成二硫键对该多肽的半胱氨酸残基“加帽”。为了将聚合物缀合物添加至FIX多肽，半胱氨酸帽可通过温和还原以释放该帽来消除，然后添加半胱氨酸特异性聚合物试剂。 [0109] 本申请还提供用于制备聚合物缀合的FIX多肽的方法，包括将聚合物缀合位点，就是，半胱氨酸残基引入编码FIX多肽的核苷酸序列；表达该突变核苷酸序列以生成包含引入的聚合物缀合位点的多肽；纯化该多肽；使该多肽与已经活化以与多肽在还原的半胱氨酸残基处反应的生物相容聚合物反应，使得缀合物形成；并纯化该缀合物。在另一个实施方案中，本发明提供用于FIX多肽突变蛋白的定点PEG化的方法，包括：(a)表达包含引入的聚合物缀合位点，就是，在FIX多肽的暴露表面上引入的半胱氨酸残基的FIX多肽，其中该半胱氨酸是加帽的；(b)使该FIX多肽与还原剂在温和还原该引入的半胱氨酸并释放该帽的条件下接触；(c)自该FIX多肽消除该帽和该还原剂；并(d)在消除该还原剂后至少约5，15，或30分钟之后，在使得PEG化FIX多肽生成的条件下用包含硫氢基偶联模块的PEG处理该FIX多肽。PEG的硫氢基偶联模块选自下组：硫醇，triflate，tresylate，氮丙啶，环氧乙烷，S-吡啶基，和马来酰亚胺模块。 [0110] 下文描述一种生成PEG化FIX多肽的例示性方法。将约1μM纯化的包含引入的非天然半胱氨酸残基的FIX多肽用还原剂诸如0.7mM Tris(2-羧乙基)膦(TCEP)或0.07mM二硫苏糖醇(DTT)于4℃温和还原30分钟以释放“帽”。通过大小排阻层析(SEC)法诸如穿过旋转柱运行样品与“帽”一起清除还原剂以容许二硫化物再形成同时留下引入的半胱氨酸处于游离和还原状态。清除还原剂之后至少30分钟，将FIX多肽用至少10倍摩尔过量的大小范围5至85kD的PEG-马来酰亚胺于4℃处理至少1小时。 [0111] FIX的聚合物缀合可通过本领域技术人员知道的任何方法来评估。例如，聚合物缀合FIX可通过还原性6％Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶上的电泳来分析。电泳后，凝胶可以用考马斯蓝以鉴定所有蛋白质或进行标准Western印迹方案，以鉴定与未缀合FIX多肽相比的条带分子量位移。对PEG特异性的碘化钡染色可用于确认分子量有位移的条带包含PEG化蛋白质。聚合物缀合之前和之后的FIX多肽也可通过基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱术来分析，以测定聚合物缀合的程度和效率。 [0112] 在一些实施方案中，聚合物缀合可发生于通过糖基化附着的一或多个糖模块。此类聚合物缀合的方法是本领域已知的，而且记载于例如WO94/05332，US2009/0081188和US5,621,039，通过述及而收录它们。在聚合物是PEG的情况中，它通常也称作glycoPEG化。 [0113] 在一些实施方案中，通过US 5,621,039在提供的化学附着进行的聚合物缀合可通过添加催化剂来改善。在一些实施方案中，催化剂是化学催化剂。例如，化学催化剂可以是苯胺，其可用于提高糖上的游离醛和氨基之间的反应的效率。在其它实施方案中，其它合适的化学催化剂可以是苯胺衍生物诸如o-Cl-，p-Cl-，o-CH3O-，p-CH3O-，和p-CH3-苯胺。 [0114] 在一些实施方案中，聚合物缀合可发生于FIX中的天然发生糖基化位点。野生型因子IX具有两个N-连接糖基化位点，其含有因子IX的总唾液酸含量的约80％。这两个N-连接位点(N157和N167)都位于活化肽内，活化肽在凝固级联的扩展期间在两个位点(R145-Ala146)和(R180-V181)处切割以生成催化活性FIXa分子。 [0115] 在FIX中的天然发生糖基化位点处的聚合物缀合之外，可能想要在位于FIX蛋白的不同域中的备选位点处缀合聚合物。这可如下来实现，首先消除位置N157和N167处的天然发生N-连接糖基化位点，通过例如将N157变成A157和将N167变成A167进行，其次在该分子中的别处引入新的功能性N-连接糖基化位点，例如在催化域或两个EGF域之一中。此类新的功能性N-连接糖基化位点先前披露于PCT US2009/040813。 [0116] 药物组合物 [0117] 基于用于测定哺乳动物中上文鉴定的状况的治疗功效的公知测定法，及通过将这些结果与用于治疗这些状况的已知药物的结果比较，可容易地为每种期望适应证的治疗确定本发明多肽的有效剂量。这些状况之一的治疗中要施用的活性组分的量可依据诸如采用的特定多肽和剂量单位，施用的模式，治疗的时段，所治疗患者的年龄和性别，及所治疗状况的性质和程度等考量而广泛变化。 [0118] 本申请部分提供包含本文所述具有一或多处氨基酸替代的FIX多肽的组合物。该组合物可适合于体内施用，而且是没有热原的。该组合物还可包含药学可接受载体。短语“药学或药理学可接受”指当施用于动物或人时不产生不利的，变应性的，或其它不良反应的分子实体和组合物。如本文中使用的，“药学可接受载体”包括任何和所有溶剂，分散介质，涂层，抗细菌和抗真菌剂，等张和吸收延迟剂，等等。此类介质和药剂对药学活性物质的使用是本领域公知的。也可将补充性活性组分掺入该组合物中。 [0119] 本发明的组合物包括经典药物制备物。依照本发明的这些组合物的施用可经由任何常规路径。药物组合物可通过任何常规方法导入受试者中，例如，通过静脉内，皮内，肌肉内，皮下，或经皮投递。治疗可以由单剂或一段时间里的多剂组成。 [0121] 适合于注射使用的药学形式包括无菌水溶液或分散体和用于临场制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉剂。该形式应当是无菌的，而且流动性的程度应当容易进行注射。它在制造和贮存条件下应当是稳定的，而且应当针对微生物，诸如细菌和真菌的污染作用进行防腐。载体可以是溶剂或分散介质，其含有，例如，水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇，和液体聚乙二醇，等等)，蔗糖，L-组氨酸，聚山梨酯80，或其合适混合物。对微生物作用的预防可以由各种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，酚，山梨酸，硫柳汞，等等产生。可注射组合物可包括等张剂，例如，糖或氯化钠。可注射组合物的延迟吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂来产生。 [0122] 无菌可注射溶液可通过在根据需要具有上文所列各种其它组分的适宜溶剂中中掺入所需量的活性化合物(例如，FIX多肽)，接着过滤除菌来制备。 [0123] 一般地，分散体可通过将各种经过灭菌的活性组合掺入含有基础分散介质和来自上文所列的所需其它组分的无菌媒介中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况中，制备方法包括，例如，真空-干燥和冷冻-干燥技术，其自先前无菌过滤的溶液产生活性组分加任何别的期望组分的粉末。 [0124] 组合物也可包括抗微生物剂以防止或阻止微生物生长。适合于本发明的抗微生物剂的非限制性例子包括苯扎氯铵，苄索氯铵，苯甲醇，西吡氯铵，氯丁醇，酚，苯乙醇，硝酸苯汞，硫柳汞，及其组合。 [0125] 组合物中也可以存在抗氧化剂。抗氧化剂可用于防止氧化，由此防止z制备物的变质。适合于在本发明中使用的抗氧化剂包括，例如，抗坏血酸棕榈酸酯，丁羟茴醚，丁羟甲苯，次磷酸，硫代甘油，没食子酸丙酯，亚硫酸氢钠，甲醛次硫酸钠，偏亚硫酸氢钠，及其组合。 [0126] 表面活性剂可作为赋形剂存在。例示性表面活性剂包括：聚山梨酯诸如-20(聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯)和 -80(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)和 Pluronics诸如F68和F88(二者均可购自BASF，Mount Olive，N.J.)；山梨聚糖酯；脂质诸如磷脂诸如卵磷脂和其它磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，脂肪酸和脂肪酯；类固醇诸如胆固醇；和螯合剂诸如EDTA，锌和其它此类合适阳离子。 [0127] 酸或碱可以作为赋形剂存在于组合物中。可使用的酸的非限制性例子包括氢氯酸，乙酸，磷酸，柠檬酸，苹果酸，乳酸，甲酸，三氯乙酸，硝酸，高氯酸，磷酸，硫酸，富马酸，及其组合。合适的碱的例子包括，但不限于，氢氧化钠，乙酸钠，氢氧化铵，氢氧化钾，乙酸铵，乙酸钾，磷酸钠，磷酸钾，柠檬酸钠，甲酸钠，硫酸钠，硫酸钾，富马酸钾，及其组合。 [0128] 组合物中任何各种赋形剂的量可以随赋形剂的活性和组合物的具体需要而变化。典型地，任何各赋形剂的最佳量可以经由例行实验来确定，就是，通过制备含有不同量的赋形剂(范围从低到高)的组合物，检查稳定性和其它参数，然后确定获得最佳性能且没有显著不良效应的范围。一般地，赋形剂可以以约1％至约99％(以重量计)，约5％至约 98％(以重量计)，约15至约95％(以赋形剂的重量计)的量，以小于30％(以重量计) 的浓度存在于组合物中。这些前述制药学赋形剂连同其它赋形剂记载于“Remington：The Science&Practice of Pharmacy”，19ed.，Williams&Williams，(1995)；“Physician′s Desk Reference”，52ed.，Medical Economics，Montvale，N.J.(1998)；及 Kibbe，A.H.，Handbook of Pharmaceutical Excipients，3 Edition，American Pharmaceutical Association，Washington，D.C.，2000。 [0129] 在配制后，可以以与剂量配制剂相容的方式及以诸如治疗有效量施用溶液。“治疗有效量”在本文中用于指在血流中或在靶组织中提供期望水平的多肽需要的多肽量。精确量会取决于众多因子，例如，具体的FIX多肽，治疗性组合物的成分和物理特征，预定的患者群体，投递的模式，患者个体考量，等等，而且可以由本领域技术人员基于本文中提供的信息容易地确定。 [0130] 可以以多种剂量形式容易地施用配制剂，诸如可注射溶液，等等。对于例如水溶液中的胃肠外施用，溶液应当在必要时适当缓冲，而且液体稀释剂应当首先用足够盐水或葡萄糖使得其等张。这些特定水溶液尤其适合于静脉内，肌肉内，皮下和腹膜内施用。 [0131] FIX的剂量通常表述成单位。一个单位的FIX每kg体重可将血浆水平升高0.01U/ml，就是，1％。其它方面健康的患者具有一个单位的FIX每ml血浆，就是，100％。血友病B的温和病例定义为FIX血浆浓度介于6-60％之间，中等病例介于1-5％之间，而严重病例，其占血友病B病例的约一半，具有低于1％FIX。预防性处理或轻微出血的处理通常要求将FIX水平提高至介于15-30％之间。中等出血的处理通常要求将水平提高至介于30-50％之间，而严重外伤的处理可要求将水平提高至50至100％。提高患者的血液水平需要的总单位数可如下确定：1.0U/kg x体重(kg)x期望百分比升高(％正常)。胃肠外施用可用初始推注，接着连续输注以维持药物产品的治疗循环水平来进行。在一些实施方案中，可施用15至150U/kg FIX多肽。本领域普通技术人员会容易地优化有效剂量和施用方案，如通过优良医学实践和患者个体的临床状况确定的。 [0132] 给药频率会取决于药剂的药动学参数和施用的路径。可以由本领域技术人员根据施用的路径和期望的剂量来确定最佳药物配制剂(参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，20thedition，2000，通过述及收入本文)。此类配制剂可影响物理状态，稳定性，体内释放速率，和施用的药剂的体内清除速率。根据施用的路径，可根据体重，体表面积，或器官大小来计算合适的剂量。由本领域普通技术人员在无需过度实验的情况中，尤其是根据本文中公开的剂量信息和测定法，以及在动物或人临床试验中观察到的药动学数据，例行进行确定适宜治疗剂量所必需的对计算的进一步改进。例示性给药进度表包括，但不限于，一天施用五次，一天四次，一天三次，一天两次，一天一次，一周三次，一周两次，一周一次，一月两次，一月一次，及其任意组合。 [0133] 适宜剂量可经由使用用于测定血液凝固水平的已确立的测定法联合相关剂量响应数据来确定。最终剂量方案可以由主治医师考虑改变药物的作用的因素来确定，例如，药物的比活性，损害的严重性，和患者的响应性，患者的年龄，状况，体重，性别和食谱，任何感染的严重性，施用的时间，和其它临床因素。 [0134] 例示性用途 [0135] 本文所述组合物可用于治疗与FIX的功能缺陷或FIX的缺陷诸如FIX体内半衰期缩短，FIX结合特性改变，FIX的遗传缺陷，和FIX血浆浓度降低有关的任何出血病症。FIX的遗传缺陷包括，例如，编码FIX的核苷酸序列中碱基的删除，添加，和/或替代。在一个实施方案中，出血病症可以是血友病B。此类出血病症的症状包括，例如，严重鼻衄，口粘膜出血，关节积血，血肿，持续血尿，胃肠出血，腹膜后出血，舌/咽后出血，颅内出血，和外伤相关出血。 [0136] 本发明的组合物可用于预防性应用。在一些实施方案中，经过修饰的FIX多肽可施用于对疾病状态或损伤易感或以其它方式处于疾病状态或损伤风险的受试者以增强受试者自身的凝固能力。这样的量可定义为“预防有效剂量”。为预防而施用经过修饰的FIX多肽包括如下的情况，其中罹患血友病B的患者将要经历手术，并且在手术前1至4个小时之间施用该多肽。另外，该多肽适合于用作针对不受控制的出血的预防剂，任选在没有罹患血友病的患者中。如此，例如，该多肽可在手术之前施用于处于不受控制的出血风险的患者。 [0137] 本文所述多肽，材料，组合物，和方法旨在作为本发明的代表性实施例，而且会理解，本发明的方法不限于实施例的范围。本领域技术人员会认识到可以在所公开的多肽，材料，组合物和方法有变化的情况中实施本发明，而且认为此类变化在本发明的范围内。 [0138] 呈现下述实施例以例示本文所述发明，但是不应解释为以任何方式限制本发明的范围。实施例 [0139] 为了能更好地理解本发明，列出下述实施例。这些实施例仅仅为了例示的目的，而且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。通过述及完整收录本文中提及的所有出版物。 [0140] 实施例1：人因子IXcDNA的克隆 [0141] 根据公开的cDNA序列(NM_000133)设计与人FIX cDNA编码区5’和3’端处的库列互补的一对PCR引物。5’引物(FIXF1；ATCATAAGCTTGCCACCATGCAGCGCGTGAACATG(SEQ ID NO：3)，FIX的起始密码子以粗体显示)含有FIX编码区的头18个核苷酸，包括共有Kozak序列(标有下划线)后面的ATG起始密码子和HindIII限制性位点。3’引物(FIXR3，ATCATAAGCTTGATTAGTTAGTGAGAGGCCCTG)(SEQ ID NO：4)含有FIX序列中位于FIX编码区末端3’45个核苷酸的22个核苷酸，前面有HindIII位点。使用这些引物和高保真校正聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)自正常人肝(Stratagene，San Diego，CA)扩增cDNA第一条链导致人FIX cDNA预期大小(1464bp)的单一条带。用HindIII消化之后，将PCR产物凝胶纯化，然后克隆入质粒pEAKflcmv的HindIII位点中。通过限制性消化来鉴定其中FIX cDNA以相对于载体中的CMV启动子正向取向插入的克隆。对数个克隆的插入物实施双链DNA测序，而且衍生序列与FIX序列的比对证明了cDNA编码成熟蛋白的氨基酸148处为苏氨酸的人FIX。将此质粒命名为pEAKflcmv-FIX。 [0142] 实施例2：经过修饰的因子IX多肽的生成 [0143] 为了改变人FIX序列内的各个氨基酸，使用QuickchangeTM引物设计程序TM (Stratagene，San Diego，CA)设计一对引物。采用Quickchange II XL定点诱变试剂盒(Stratagene，San Diego，CA)依照制造商的指令使用这些引物在pEAKflcmv-FIX质粒中生成突变。通过完整FIX编码区的DNA测序来鉴定含有期望突变的克隆。用于创建突变的有义链寡核苷酸的序列显示于表1。 [0144] 表1 [0145] [0146] [0147] [0148] [0149] [0150] 实施例3：HKB11细胞中因子IX多肽的表达 [0151] 为了确定具有改变的蛋白质序列的FIX基因是否能自哺乳动物细胞表达和分泌及确定这些替代对FIX凝固活性的影响，将编码这些FIX变体的表达质粒转染入HKB11细胞中。HKB11是一种通过融合HEK293细胞和B细胞淋巴瘤生成的人细胞系。 [0152] HKB11细胞在悬浮培养中在轨道摇床(100-125rpm)上在CO2(5％)温箱中于37℃在补充有10ng/mL可溶性维生素K3的无血清培养基(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中培养并维持于介于0.25和1.5x106个细胞/mL之间的密度。 [0153] 用于转染的细胞通过以1000rpm离心5分钟来收集，然后在FreeStyleTM293表达6 培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中以1.1x 10 个细胞/mL重悬浮。将细胞在6孔板中接种(4.6mL/孔)并在轨道摇床(125rpm)上在37℃ CO2温箱中温育。对于每个孔，将 5μg质粒DNA与0.2mL Opti- I培养基(Invitrogen)混合。对于每个孔，将7μL TM 293fectin 试剂(Invitrogen)与0.2mL Opti- I培养基温和混合并于室温温育5 TM 分钟。将稀释的293fectin 添加至稀释的DNA溶液，温和混合，于室温温育20-30分钟，然 6 后添加至每个接种有5x10 个(4.6mL)HKB11细胞的孔。然后将细胞在轨道摇床(125rpm)上在CO2温箱中于37℃温育3天，之后通过以1000rpm离心5分钟来沉淀细胞，收集上清液并保存于4℃。 [0154] 实施例4：BHK21细胞中因子IX多肽的表达 [0155] 为了确定具有改变的蛋白质序列的FIX基因是否能自哺乳动物细胞表达和分泌及确定这些替代对FIX凝固活性的影响，将编码这些FIX变体的表达质粒转染入HKB21细胞中。 [0156] HKB21细胞在悬浮培养中在轨道摇床(100-125rpm)上在CO2(5％)温箱中于37℃在补充有10ng/ml可溶性维生素K3的专有无血清培养基(Menadione，Sigma)中培养并维6 持于介于0.25和1.5x10 个细胞/mL之间的密度。 [0157] 用于转染的细胞通过以1000rpm离心5分钟来收集，然后以1.1x106个细胞/mL重悬浮。 [0158] 将细胞在6孔板中接种(4.6mL/孔)并在轨道摇床(125rpm)上在37℃CO2温箱中温育。对于每个孔，将5μg质粒DNA与0.2mL Opti-MEM I培养基(Invitrogen)混合。 对于每个孔，将7μL 293Fectin试剂(Invitrogen)与0.2mLOpti-MEM I培养基温和混合并于室温温育5分钟。将稀释的293Fectin添加至稀释的DNA溶液，温和混合，于室温温育 6 20-30分钟，然后添加至每个接种有5x10 个(4.6mL)HKB21细胞的孔。然后将细胞在轨道摇床(125rpm)上在CO2温箱中于37℃温育3天，之后通过以1000rpm离心5分钟来沉淀细胞，收集上清液并保存于4℃。 [0159] 实施例5：因子IX的Western印迹 [0160] 将细胞培养物上清液(50μL)与20μL 4x SDS-PAGE加载染料混合，于95℃加热5分钟，加载到 4-12％SDS PAGE凝胶上，然后转移至硝酸纤维素 膜。用5％奶粉封闭30分钟之后，将膜与HRP标记的针对人FIX的山羊多克隆抗体(US Biological，Swampscott，Massachusetts，Catalog No.F0017-07B)一起于室温温育60分钟。在用含0.1％ -20缓冲液的磷酸盐缓冲盐水清洗之后，来自HRP的信号使用 Pico(Pierce，Rockford，IL)检测并使x-射线胶片曝光。 [0161] 实施例6：因子IX ELISA [0162] 使用FIX ELISA试剂盒(Hyphen Biomed/Aniara，Mason，OH)测定细胞培养物上清液中的FIX抗原水平。细胞培养物上清液在样品稀释缓冲液(试剂盒中供应的)中稀释以实现标准曲线的范围内的信号。使用在样品稀释剂中稀释的自人血浆(Hyphen Biomed/Aniara，产品目录号RK032A，比活性196U/mg)纯化的FIX蛋白创建100ng/mL至0.2ng/mL的标准曲线。将稀释的样品和标准品添加至经多克隆抗FIX捕捉抗体预包被的ELISA板。在添加多克隆检测抗体之后，将板于室温温育1小时，大量清洗，然后使用TMB底物(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)显色，如试剂盒制造商描述的，并使用 读板仪 (Molecular Devices，Sunnyvale，CA)于450nM测量信号。将标准曲线拟合两成分线图，并自曲线外推未知值。 [0163] 还使用商品化FIX ELISA试剂(Haemochrom Diagnostica GmbH，Essen，Germany)依照制造商的指令量化FIX表达水平。将小麦胚凝集素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)TM TM包被到384孔MaxiSorp 板(Nunc ，Rochester，NY)上。将孔封闭，清洗，然后添加上清液。在再次清洗之后，使用HRP偶联的多克隆抗FIX抗体(Haemochrom Diagnostica GmbH，Essen，Germany)进行检测。 [0164] 实施例7：因子IX凝固测定法 [0165] 在ElectraTM 1800C自动凝固分析仪(Beckman Coulter，Fullerton，CA)上运行的FIX缺陷人血浆中使用aPTT测定法测定FIX凝固活性。简言之，由仪器创建上清液样品在凝固稀释剂中的三个稀释度(three dilutiohs)，然后将100μL与100μL FIX缺陷血浆(Aniara，Mason，OH)和100μL自动化aPTT试剂(家兔脑磷脂和微粉化硅石(bioMérieux，Inc.，Durham，NC)混合。在添加100μL 25mM CaCl2溶液之后，记录凝块形成时间。使用与ELISA测定法中用作标准品相同的纯化的人FIX(Hyphen Biomed/Aniara)的系列稀释液为每次运行生成标准曲线。标准曲线通常是直线，相关系数0.95或更好，而且用于确定未知样品的FIX活性。包含位置86处的氨基酸替代的FIX多肽的活性显示于表2。包含一或多处氨基酸替代的FIX多肽的活性显示于表3和4。 [0166] 表2 [0167] [0168] 表3 [0169] [0170] [0171] 表4 [0172] [0173] [0174] 实施例8：循环FIX的测量 [0175] 使用体外测定法来测量FIX多肽的循环半衰期。此测定法基于FIX在体内和在体外介导腺病毒(Ad)在肝细胞中积累的能力。简言之，已经显示了FIX能结合Ad尾丝节(knob)域且为经由细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)的病毒摄取提供桥(Shayakhmetov，et al.，J.Virol 79：7478-7491，2005)。含有该尾丝节域中的突变的腺病毒载体突变体Ad5mut不结合FIX。Ad5mut具有显著降低的感染肝细胞的能力和体内肝毒性，证明了FIX在将Ad载体靶向肝细胞中发挥主要作用(Shayakhmetov，et al.，2005)。FIX将Ad载体靶向肝细胞的能力可被蛋白质-HSPG相互作用的抑制剂阻断(Shayakhmetov，et al.，2005)。 [0176] 另外，HSPG介导的FIX摄取显著促进FIX清除，因此预期干扰HSPG相互作用延长FIX的半衰期。因此，测量肝细胞中FIX和/或FIX变体的体外摄取，而且预期摄取降低的变体具有延长的体内半衰期。 [0177] 为了测量FIX体外半衰期，在FIX或FIX变体存在或缺失下将哺乳动物细胞与腺病毒一起温育。病毒摄取由野生型FIX介导，并通过病毒基因组中编码的报告基因的表达来测量，例如，绿色荧光蛋白(GFP)或萤光素酶表达。FIX变体存在下与野生型FIX相比降低的腺病毒摄取通过降低的报告基因表达来测量，例如，降低的GFP荧光或降低的萤光素酶酶活性。 [0178] 在体内使用本领域普通技术人员公知的标准技术测量FIX循环半衰期。简言之，通过静脉内注射将各个剂量的FIX或FIX变体施用于受试者。在注射后的多个时间点采集血液样品，并通过适宜测定法(例如，ELISA)测定FIX浓度。为了测定半衰期，就是FIX浓度为给药后立即的FIX浓度一半时的时间，将各个时间点的FIX浓度与施用FIX剂量后立即测量或预期的FIX浓度比较。体外测定法中降低的细胞摄取和体内测定法中延长的半衰期之间有相关性。 [0179] 实施例9：经过修饰的FIX的GlycoPEG化 [0180] 将大约5mg经过修饰的FIX蛋白缓冲液交换入反应缓冲液(25mMHEPES，pH7.7，50mM NaCl，10mM CaCl2，0.01％TWEEN-80)以消除干扰缀合反应的蔗糖和氨基酸，然后使用 1-ml样品环管(以反应缓冲液作为流动相)以1ml/min的流速用AKTA-FPLC层析系统(GE)加载到HiTrap脱盐5ml柱(Sephadex G25)上。收集并合并蛋白质级分(～2ml)入螺帽 管中。对此FIX溶液(～2.1mg/ml)，添加偏高碘酸钠(Sigma#311448，Mw213.89，NaIO4)储备溶液(400mM水溶液，新鲜制备的)以达到2mM的[NaIO4]终浓度进行温和氧化，在FIX的碳水化合物模块上生成反应性醛。将混合物在摇床上在黑暗中于4℃温育60分钟。低至 0.5mM的偏高碘酸钠也是有效的。 [0181] 然后通过在另一次15分钟4℃温育中用2M甘油储备液(至20mM甘油的终浓度)淬灭残余的NaIO4来终止氧化步骤。再次如上所述将氧化反应混合物(～2ml)直接加载到G25柱上以将氧化后的重组FIX与会干扰随后的PEG化反应的过量的NaIO4，甘油和甘油醛分开。 [0182] 对所得的反应缓冲液中氧化后的FIX溶液(～0.95mg/ml，4.5ml中4.3mg)，添加80mg肼-PEG30(40倍摩尔过量，NOF产品目录#SUNBRIGHTME-300HZ)和10mM苯胺(100％EtOH中的1M储备溶液)，并在旋转平台上将PEG化反应于4℃进行过夜。为PEG化反应找到的最佳条件是0.3至0.9mg/ml[FIX]及相对于[FIX]5至40倍摩尔过量添加肼-PEG30。 可以进一步优化PEG化时间以改变单PEG化FIX对二PEG化FIX的比例。 [0183] 通过SDS-PAGE，考马斯蓝，碘染色，Western印迹分析和大小排阻层析对GlycoPEG FIX的广泛表征证明了GlycoPEG化FIX含有大约70％单PEG化FIX和30％二PEG化FIX。通过降低偏高碘酸钠浓度至0.5mM，在因子IX浓度为0.6mg/ml时使用5倍摩尔过量的氨基氧-PEG，优化PEG化反应的时间，和在肝素柱上接着通过大小排阻层析来纯化，实现了对FIX的glycoPEG化方法的进一步优化。使用优化的条件，有可能实现98.7％同质的PEG化种类。高碘酸盐对碳水化合物氧化的速率和程度可通过反应时间，pH，温度和高碘酸钠浓度来控制，例如如Wolfe和Hage，199518关于抗体所述。已经报告了通过使用1mM高碘酸盐和0℃温度，糖蛋白上的唾液酸残基可被高碘酸钠(NaIO4)特异性氧化。可使用1mM高碘酸盐或甚至更低的浓度来优化FIXglycoPEG化的位点特异性。也可实现淬灭步骤的优化。 最后，可例如通过使用具有不同分子量的PEG，例如5K，10K，15K，20K，30K，40K，60K或直到 150K来优化PEG化步骤。也可以如上文导言所述使用备选聚合物。也可以如上文导言所述使用利用附着至PEG模块或其它聚合物的备选反应性基团的备选接头化学，例如包括氨基氧PGE或羟基-PEG-胺。 [0184] 实施例10：FIX-R338A使用PEG-酰肼的GlycoPEG化 [0185] 使用标准方法生成表达含有突变R338A的人因子IX(FIX-R338A)的BHK21细胞系，并为了15L规模灌注反应罐中的发酵而放大。通过离子交换层析将培养液中存在的分泌的FIX-R338A蛋白纯化至98％纯度。所得蛋白质如上文“方法”部分所述使用40Kda PEG-肼进行glycoPEG化。通过在PEG化反应期间包括苯胺作为催化剂，PEG化FIX-R338A的产率可以从约10％提高至约50％。对5mg FIX-R338A实施大规模PEG化，并在体外对所得蛋白质测定凝固活性，或是通过aPTT测定法(使用鞣花酸作为活化剂)或是使用商品化产色测定法试剂盒。这两种测定法都使用商业性生产的重组野生型FIX(rFIX)来生成标准曲线。在每次测定中运行起始材料(FIX-R338A)和rFIX的对照。表5所示数据指明glycoPEG化FIX-R338A具有介于起始材料的活性47％和60％之间但介于rFIX的活性的184％和189％之间。 [0186] 表5：GlycoPEG化FIX-R338A的体外凝固活性 [0187] [0188] 通过将活化肽中的糖上的PEG化与FIX的更高活性变体组合，有可能生成比活性比重组野生型FIX蛋白高约2倍的PEG化FIX。当rFIX进行相同glycoPEG化规程和纯化时，所得glycoPEG化rFIX具有122IU/mg的比活性(通过产色测定法)，其是未修饰的rFIX的比活性的59％。如此，与glycoPEG化重组野生型FIX相比，glycoPEG化R338A具有高3倍的比活性，这会能够用少3倍的蛋白质实现相同的治疗好处。 [0189] 对glycoPEG化FIX-R338A的凝胶分析明该蛋白质含有仅在一个位点(单PEG化)或在两个位点(二PEG化)FIX-R338A PEG化的混合物。对蛋白质染色的考马斯染色凝胶指明存在两个主要PEG化条带，指示单PEG化和二PEG化FIX-R338A。单PEG化形式表现为优势形式。 [0190] 实施例11：经过修饰的FIX使用氨基-氧-PEG的GlycoPEG化 [0191] 首先在AKTA-FPLC层析系统(GE Healthcare)上使用HiTrap脱盐5ml柱(GEHealthcare)以1ml/min的流速将纯化的因子IX(FIX)缓冲液交换入反应缓冲液(25mM HEPES，pH 7.7，50mM NaCl，10mM CaCl2，0.01％w/vTween-80)。收集并合并蛋白质级分。 通过添加自400mM储备水溶液新鲜制备至终浓度2mM的偏高碘酸钠(NaIO4)(Sigma)来氧化FIX。FIX的氧化在FIX的碳水化合物模块上产生反应性醛，其可以被氨基-氧-PEG或肼-PEG修饰。将混合物在摇床上在黑暗中于4℃温育60分钟。通过添加2M甘油至终浓度20mM甘油来淬灭NaIO4，并于4℃进一步温育15分钟。再次如上所述将氧化反应混合物直接加载到脱盐柱上以将氧化后的FIX与过量的NaIO4，甘油，和甘油醛分开，它们会干扰随后的PEG化。对所得氧化后的FIX溶液(FIX浓度～0.5mg/ml)，添加40倍摩尔过量的固体甲氧基-PEG-30-氧胺(NOF产品目录#SUNBRIGHT ME-300CA)和10mM苯胺(100％EtOH中 的1M储备溶液)。PEG化反应在旋转平台上于4℃进行过夜。为PEG化反应找到的最佳条件是0.3-0.9mg/ml FIX及20-40倍摩尔过量的PEG。可以进一步优化PEG化时间以改变所得单PEG化对二PEG化FIX的比例。 [0192] 将PEG化反应混合物用反应缓冲液1∶1稀释，并使用AKTA层析系统以0.5ml/TMmin流速加载到HiTrap 肝素HP 1-ml柱(GE)上以纯化PEG化FIX。游离PEG不结合肝素 柱。通过梯度洗脱(20分钟里0-100％缓冲液B)将PEG化FIX与未PEG化FIX分开。缓冲 液A是反应缓冲液，而缓冲液B是25mMHEPES，pH 7.7，500mM NaCl，20mM CaCl2，0.01％w/v Tween-80)。首先PEG化FIX洗脱，接着未PEG化FIX洗脱。合并含有PEG化FIX的级分，并进行内毒素清除。使用没有热原的H2O使用随 AG EndoTrap HD珠包装的1-ml Endotrap柱清除可能的内毒素。使用经过消毒的管道将柱附着至AKTA系统。AKTA仪器，所有线路，和柱用20％乙醇中的1N NaOH消毒1小时，接着用0.1N乙酸，20％乙醇消毒2小时。然后将柱用Milli-Q水大量清洗。首先将再生缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.5，1M NaCl， 2mM EDTA)应用于柱，然后，将柱以1ml/min用50％缓冲液B(25mM HEPES，pH 7.7，500mM NaCl，20mM CaCl2，0.01％Tween-80)平衡。以0.5ml/min将来自肝素柱的PEG化FIX加载到Endotrap柱上，并将含有FIX的流出级分收集入无菌、没有热原的容器。 [0193] 将纯化的且没有内毒素的PEG化FIX浓缩，通过超滤(10K MW截留)6次缓冲液交换至配制缓冲液(0.234％NaCl，8mM组氨酸，0.8％蔗糖，208mM甘氨酸，0.004％Tween-80)，等分，并在快速冷冻之后保存于-80℃。通过测量A280来测定GlycoPEG FIX的蛋白质浓-1 -1度(消光系数为13.3(mg/ml) cm )。自蛋白质浓度和FIX产色测定法和aPTT测定法(鞣花酸活化剂)计算比活性。还通过FIXa产色测定法和内毒素检测测定法来评估FIXa和内毒素可能的污染。还对GlycoPEG FIX实施别的生物化学表征(用考马斯蓝和碘染色的SDS-PAGE，Western印迹分析，大小排阻层析)，证明了GlycoPEG化FIX(峰1)含有60％单PEG化FIX和40％二PEG化FIX。PEG化效率估算为50％而总回收率估算为30％。 [0194] 实施例12：FIX-R338A使用PEG-氨基-氧的GlycoPEG化 [0195] 使用标准方法生成表达含有突变R338A的人因子IX(FIX-R338A)的BHK21细胞系，并为了15L规模灌注反应罐中的发酵而放大。通过离子交换层析将培养液中存在的分泌的FIX-R338A蛋白纯化至98％纯度。所得FIX-R338A蛋白如上所述使用氨基氧-30Kda PEG进行glycoPEG化。对5mgFIX-R338A实施PEG化，并在体外对所得蛋白质测定凝固活性，或是通过aPTT测定法(使用鞣花酸作为活化剂)或是使用商品化产色测定法试剂盒。这两种测定法都使用商业性生产的重组野生型FIX来生成标准曲线。在每次测定中运行起始材料(FIX-R338A)和rFIX的对照。表6所示数据指明glycoPEG化FIX-R338A具有介于起始材料的活性％和％之间但介于rFIX的活性的％和％之间。 [0196] 表6：使用氨基-氧PEG生成的GlycoPEG化FIX-R338A和GlycoPEG化rFIX的体外凝固活性 [0197] [0198] 实施例13：FIX-R338A使用PEG-氨基-氧在为生成同质的单PEG化FIX-R338A而优化的条件下的GlycoPEG化 [0199] 使用标准方法生成表达含有突变R338A的人因子IX(FIX-R338A)的BHK21细胞系，并为了15L规模灌注反应罐中的发酵而放大。通过离子交换层析将培养液中存在的分泌的FIX-R338A蛋白纯化至98％纯度。首先在AKTA-FPLC层析系统(GE Healthcare)上使用HiTrap脱盐5ml柱(GEHealthcare)以1ml/min的流速将10mg FIX-R338A蛋白缓冲液交换入反应缓冲液(25mM HEPES，pH 7.7，50mM NaCl，10mM CaCl2，0.01％w/vTween-80)。 收集并合并蛋白质级分。通过添加自400mM储备水溶液新鲜制备至终浓度0.5mM的偏高碘酸钠(NaIO4)(Sigma)来氧化FIX。FIX的氧化在FIX的碳水化合物模块上产生反应性醛，其可以被氨基-氧-PEG修饰。将混合物在摇床上在黑暗中于4℃温育60分钟。通过添加 2M甘油至终浓度20mM甘油来淬灭NaIO4，并于4℃进一步温育15分钟。再次如上所述将氧化反应混合物直接加载到脱盐柱上以将氧化后的FIX与过量的NaIO4，甘油，和甘油醛分开，它们会干扰随后的PEG化。对所得氧化后的FIX溶液(FIX浓度～0.6mg/ml)，添加相对于FIX蛋白5倍摩尔过量的固体甲氧基-PEG-30-氧胺(NOF产品目录#SUNBRIGHT ME-300CA)和10mM苯胺(100％EtOH中的1M储备溶液)。PEG化反应在旋转平台上于4℃进行2小 时。将PEG化反应混合物用反应缓冲液1∶1稀释，并使用AKTA层析系统以0.5ml/min流TM 速加载到HiTrap 肝素HP 1-ml柱(GE)上以纯化PEG化FIX。游离PEG不结合肝素柱。 通过梯度洗脱(20分钟里0-100％缓冲液B)将PEG化FIX与未PEG化FIX分开。缓冲液 A是反应缓冲液，而缓冲液B是25mM HEPES，pH 7.7，500mM NaCl，20mMCaCl2，0.01％w/v Tween-80)。首先PEG化FIX洗脱，接着未PEG化FIX洗脱。合并主要含有单PEG化FIX的级分，并进行大小排阻层析(SD200)以进一步分开单PEG化FIX-R338A、二PEG化FIX-R338A和游离FIX-R338A。收集含有95％同质的单PEG化FIX的级分，浓缩并透析回配制缓冲液(0.234％NaCl，8mM组氨酸，0.8％蔗糖，208mM甘氨酸，0.004％Tween-80)，等分，并在快速冷冻之后保存于-80℃。通过测量A280来测定GlycoPEG FIX-R338A的蛋白质浓度(消光-1 -1 系数为13.3(mg/ml) cm )。自蛋白质浓度和FIX产色测定法和aPTT测定法(鞣花酸活化剂)计算比活性。这两种测定法都使用商业性生产的重组野生型FIX来生成标准曲线。起始材料的对照(FIX-R338A)。表7所示数据指明glycoPEG化FIX-R338A具有介于起始材料的活性34％和80％之间，取决于测定法。 [0200] 表7：使用氨基-氧PEG和经过优化的条件生成的95％均质GlycoPEG化FIX-R338A的体外凝固活性 [0201] [0202] 实施例14：glycoPEG化FIX-R338A的药动学概况 [0203] 通过静脉内注射将GlycoPEG化FIX-R338A，FIX-R338A或重组野生型FIX(rFIX)施用于正常大鼠或血友病B小鼠。使用基于ELISA的测定法随时间测量FIX蛋白的循环水平。在正常大鼠中，glycoPEG化FIX-R338A的药动学概况与FIX-R338A和rFIX二者相比得到显著改善(图1)。 [0204] 在血友病B小鼠中，glycoPEG化FIX-R338A的药动学概况与FIX-R338A和rFIX二者相比得到显著改善(图2)。 [0205] 自这些研究计算得到的药动学参数(表8和9)指明glycoPEG化FIX-R338A具有半衰期(T1/2)改善，在大鼠中是约1.4倍而在小鼠中是约1.5倍。总体清除在大鼠中降低3至4倍而在小鼠中降低6至8倍。剂量标准化的曲线下面积(AUCnorm)和驻留时间均值(MRT)二者在两种物种中也升高。 [0206] 表8：大鼠中glycoPEG化FIX-R338A的药动学参数 [0207] [0208] 表9：血友病B小鼠中glycoPEG化FIX-R338A的药动学参数 [0209] [0210] 还测定在静脉内注射rFIX，FIX-R338A或glycoPEG化FIX-R338A任一之后不同时间来自血友病B小鼠的血浆样品中的FIX活性，如图3所示。这些数据证明PEG化FIX-R338A分子的活性所致显著改善的PK概况。 [0211] 实施例15：苯胺作为因子IX的PEG化的催化剂 [0212] 为了作为将聚合物模块，诸如PEG缀合至蛋白质，包括FIX上的糖的催化剂来评估苯胺，将重组WT-FIX蛋白PEG化，如实施例11所述进行，只是一个反应含有10mM苯胺，而第二个相同的反应在没有添加苯胺的情况中进行。通过SDS-PAGE上的分析来监测PEG化反应的时间过程(图4)。在存在苯胺的情况中，PEG化(表现为55Kda游离FIX蛋白转变成更高分子量形式)的效率升高。凝胶的量化指明在18小时反应之后，在苯胺缺失下只有18％的游离FIX发生PEG化，而在苯胺存在下73％的游离FIX发生PEG化，证明了苯胺改善PEG缀合率。 [0213] 实施例16：通过N157或N167任一处的突变实现的因子IX上糖的位点特异性聚合物缀合 [0214] 因子IX含有两个位于N157和N167的N-连接的糖基化位点，而且在哺乳动物细胞中在蛋白质表达期间在这些位点处添加的聚糖含有因子IX的总聚糖上存在的大多数唾液酸模块。实施例9至15所述聚合物诸如PEG对因子IX的唾液酸的缀合可发生于附着至N157和N167的聚糖任一或二者。从制药学观点看，会想要生成其中聚合物只附着于这两个N-连接的糖基化位点之一的聚合物缀合的因子IX，因为此类产物会更加同质。突变含有R338A突变的因子IX以将N157变成A157或将N167变成A167，如此消除N-连接的糖基化位点之一。由于天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)残基之间的结构相似性，预测N157Q和N167Q是用于消除相应的N-连接的糖基化位点的备选突变。R338A-N157A和R338A-N167A在BHK21细胞中的表达和细胞培养物上清液通过ELISA对抗原水平的测量和通过aPTT测定法对活性的测量证明了N167A突变蛋白具有与亲本FIX-R338A蛋白相似的比活性(表述成IU每mgFIX蛋白)(表10)。相反，N157A突变蛋白展现出比亲本FIX-R338A蛋白高1.7倍的比活性(表10)。对纯化的FIX-R338A-N157A蛋白测量到相似的比FIX-R338A蛋白高 1.7倍的比活性(表10)。因此，用于消除N157处的N-连接的糖基化位点并因此能够优先实现N167处的聚合物缀合的N157突变诸如N157A或N157Q较之N167处的突变对于生成 同质的聚合物缀合的因子IX蛋白而言是优选的。 [0215] 表10：细胞培养物上清液中的N157A和N167A突变蛋白和纯化的蛋白质的比活性(NT：未测试) [0216] [0217] |
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