Organic compound

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は牛乳タンパク質加水分解産物および、牛乳アレルギーに罹患しやすい幼児における免疫学的耐性を誘導するためのその使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＥＰＡ第４２１３０９号(サンド・ニュートリション・リミテッド(Sandoz Nutrition Ltd.))
は、高い加水分解率を有するが低い遊離アミノ酸含量を有する非アレルギー源性牛乳タンパク質加水分解産物を記載してる。 ＥＰＡ第４２１３０９号に記載の非アレルギー源性牛乳タンパク質加水分解産物は牛乳タンパク質のような食物タンパク質に対する非寛容性を有する幼児に対するタンパク質供給代替物としての使用を示唆する。

【０００３】本明細書で使用の「非アレルギー源性加水分解産物」および「アレルギー源性タンパク質を実質的に含まない加水分解産物」の語は置き換え可能である。
それらは、食物性タンパク質、更に具体的には牛乳タンパク質に対する非寛容性を有する幼児に、アレルギー反応を起こさずに供給できるタンパク質加水分解産物を意味する。

【０００４】

【発明の構成】アレルギー性疾患において、アレルギーの典型は、食物アレルギーが幼児で最も起こるように、
子供の年令と関係がある。 牛乳アレルギーは幼児おいて一般的な食物アレルギーであり、本疾患は全子供の２〜
７.５％の範囲で広がっている。 種々の症状が起こり得る。 症状は半分の患者で起こる急性(例えばアナフィラキシーおよびじんましん)または他の半分の患者における遅延臨床反応を意味するあまり特異的でないもの(例えば嘔吐または下痢)であり得る。 診断方法は、ヨーロッパ・ソサイエティー・フォー・ピーディアトリック・
ガストロエンテロロジー・アンド・ニュートリション・
ウォーキング・グループ(European Societyfor Paediat
ric Gastroenterology and Nutrition Working Group)
(ＥＳＰＧＡＮ、ジャーナル・オブ・ピーディアトリック・カストロエンテロロジー・アンド・ニュートリション(ESPGAN J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.)、１９９２
年；１４：１０８−１２)により示された基準により、
よく標準化されている。 牛乳タンパク質の完全な排除および加水分解調剤の食事はこの状態の選りすぐった処置法を意味する。 牛乳アレルギーは自然に消滅する。 牛乳耐性は２〜４才で現れ始めるが、安全性の理由から牛乳アレルギーに罹患した子供は６〜７才になるまでは牛乳タンパク質の摂取を避けることが示唆されている。

【０００５】本発明により、驚くべきことに、非アレルギー源性乳漿(whey)タンパク質加水分解産物が、牛乳アレルギーが自然な(即ち本来の)後天的耐性により通常期待されるよりも実質的に早く牛乳アレルギーが消滅するように、牛乳タンパク質耐性を誘導する能力を有することが発見された。

【０００６】本発明は、従って、処置が必要な子供に実質的にアレルギー源性タンパク質を含まない乳漿タンパク質加水分解産物を投与することを含む、牛乳アレルギーに罹患しやすい子供に牛乳タンパク質耐性を誘導する方法を提供する。

【０００７】アレルギー源性タンパク質を含まない乳漿タンパク質加水分解産物は、簡便には完全な調合食の形で投与する。

【０００８】本発明の他の態様は、実質的にアレルギー源性タンパク質を含まない乳漿タンパク質加水分解産物の、牛乳タンパク質耐性の誘導用食事用組成物の製造のための使用である。

【０００９】本発明の方法に好適な非アレルギー源性乳漿タンパク質加水分解産物の例は、カチオン性セリンエンドプロテアーゼ型エラスターゼ２の存在下、例えば３
５℃〜５０℃の温度で、７.０〜９.０のｐＨで、トリプシン−キモトリプシンによる乳漿タンパク質の酵素的加水分解により得られる得る加水分解産物である。

【００１０】出発物質として用いる乳漿タンパク質画分は、とりわけ酵素的加水分解を容易にするために、好ましくは、実質的に巨大脂質(macrolipids)を含まないものである。

【００１１】乳漿タンパク質は、例えば微小濾過／超濾過をして、分子量６０,０００ダルトン以上の大きなタンパク質の殆どを除去するために、前処理をし得る。 このような前処理された乳漿タンパク質混合物は以後「選択された乳漿タンパク質」と呼ぶ。 それはまだ分子量約６６.０００Daを有するある牛血清アルブミン(ＢＳＡ)
を含有する。

【００１２】エラスターゼ２の使用は、アレルギー源性エピトープの除去をし、高い有効な加水分解の割合(１
９％またはそれ以上)、ジ−〜デカペプチド、特にテトラ−〜デカペプチドは高い含量であるが低い遊離アミノ酸含量である生産物を提供する。

【００１３】好ましくは乳漿タンパク質、さらに好ましくは選択された乳漿タンパク質は、最初に例えば(選択された)乳漿タンパク質水溶液を４３±４℃まで熱し、
本溶液をペプシンでｐＨ２.０〜３.０で処理することによる、胃予備加水分解段階の対象とする。

【００１４】ＢＳＡのペプシン加水分解は、例えば非常に小さなペプチドとなるが、他の酵素の処理による高分子量(３０,０００〜４０,０００Da)のペプチド断片の連続した溶出による変性により、容易になる。 エラスターゼ２は、とりわけ中間サイズ(約１０,０００Da)を有するペプチドの還元をし、低分子量ペプチドの有利になるようにペプチドプロフィールの移動を誘発する。

【００１５】従って、特に本発明で使用するのが好ましい非アレルギー源性乳漿タンパク質加水分解産物は、選択された乳漿タンパク質の生理学的加水分解により得られ得る。 上記生理学的加水分解は胃段階、すなわちｐＨ
２.０〜３.０の間のペプシン予備加水分解、続いて、予備加水分解産物のトリプシン−キモトリプシンおよびカチオン性セリンエンドプロテアーゼ型エラスターゼ２の混合物による酵素的処理を含む。 このような生理学的加水分解に好ましい条件はＥＰＡ第４２１３０９号に記載されている。

【００１６】生理学的加水分解により得られ得る非アレルギー源性タンパク質加水分解産物の有効な加水分解の割合は、簡便には２０％〜３２％の範囲である。 本発明の方法で使用するのに好適な乳漿タンパク質加水分解産物の遊離アミノ酸含量は、好ましくは１５重量％以下、
さらに好ましくは１〜１３重量％の範囲である。

【００１７】有効な加水分解の割合は式：

【数１】

【００１８】本発明の方法で使用するのに好適な、生理学的加水分解により得られる非アレルギー源性乳漿タンパク質加水分解産物の典型的な分子量分布は下記の通りである(２１５nmのＵＶ検出により決定)；

【表１】 重量％ 範囲 さらに好ましくは 例えば ＭＷ＞５０００ ０.５〜４.０ ２.８〜３.８ ３.３ ５０００＞ＭＷ＞３０００ ２〜１０ ５〜１０ ５.２ ３０００＞ＭＷ＞１０００ ２９〜３６ ３３.５〜３５.５ ３３.９ １０００＞ＭＷ＞５００ ２６〜３１ ２９〜３１ ３０.９ ５００＞ＭＷ＞３００ １４.６〜２９.６ １５〜２１ ２０.６ ３００＞ＭＷ ５.９〜１２.９ ５.７〜７.７ ６.１

【００１９】このような非アレルギー源性乳漿タンパク質加水分解産物は、好ましくは非アレルギー源性カゼイン加水分解産物と、組成物における加水分解産物１００
ｇ当たりのアミノ酸ｇが母乳と同じであるように、重量比で、乳漿タンパク質加水分解産物：カゼイン加水分解産物５０：５０〜７０：３０、好ましくは６０：４０で投与される。

【００２０】非アレルギー源性カゼインタンパク質加水分解産物は、トリプシン−キモトリプシンおよびカチオン性セリンエンドプロテアーゼ型エラスターゼ２の混合物による酵素的処理により得られ得る。 カゼイン加水分解産物は、一般にアレルギー源性の観点から、乳漿タンパク質加水分解産物より問題とならない。 したがって、
一般的に−上記酵素的処理に加えて−胃加水分解段階を行う必要はない。

【００２１】一般に、本発明で使用するのに好適なカゼイン加水分解産物を製造するためのカゼイン出発物質は、実質的に糖タンパク質画分を含まないカゼインである；用いるカゼインは、簡便にはレンネットカゼイン、
すなわち、例えば牛ペプシンのようなペプシンとの凝固により得られるものである。

【００２２】本発明の方法で非アレルギー源性乳漿タンパク質加水分解産物との混合物として使用するのに好適な非アレルギー源性カゼイン加水分解産物の典型的な分子量分布は以下の通りである(２１５nmのＵＶ検出により決定)；

【表２】 重量％ 範囲 例えば ＭＷ＞５０００ ０〜１ ０ ５０００＞ＭＷ＞３０００ ０〜１ ０.１ ３０００＞ＭＷ＞１０００ １７〜２６ １８.６ １０００＞ＭＷ＞５００ ３３〜４０ ３７.４ ５００＞ＭＷ＞３００ ２６〜３１ ２９.２ ３００＞ＭＷ １１〜１６ １４.７

【００２３】特に好ましいカゼイン加水分解産物系の有効な加水分解の割合は２０〜３０％の範囲である。 本発明で使用するのに好ましいカゼイン加水分解産物の遊離アミノ酸含量は、好ましくは１５％以下、さらに好ましくは８〜１３％の範囲である。

【００２４】乳漿タンパク質加水分解産物およびカゼインタンパク質加水分解産物は、味覚を改善するために真菌アスペルギルス・オリザエ由来のタンパク質融解性酵素または膵臓プロテイナーゼ抽出物で処理し得る。 このような酵素は商業的に利用可能である。 これらの典型的な例は、ＣＯＲＯＬＡＳＥ ７０９２およびＣＯＲＯＬ
ＡＳＥ ＰＰ(レーム(Rohm))を含む。

【００２５】牛乳タンパク質のＣＯＲＯＬＡＳＥ ７０
９２型タンパク質融解性酵素による処理は、簡便にはｐ
Ｈ約８で、約１.０〜１.５％酵素／約２０００mUHb／mg
酵素(以下の実施例４参照)を有するタンパク質基質で、
約１1/4〜１3/4時間用いる。

【００２６】アスペルギルス・オリザエ由来のタンパク質融解性酵素は、簡便には有効な量の膵臓酵素(トリプシン−キモトリプシンおよび所望によりエラスターゼ２)を含むタンパク質混合物に、好ましくは膵臓酵素で４１〜４７℃で１時間から１1/2時間処理した後に加える。

【００２７】１.０〜１.５％ＣＯＲＯＬＡＳＥ ＰＰ型酵素／タンパク質基質のｐＨ約８での１1/4から１3/4時間の４１から４７℃での処理は、同様の味覚改良を可能にする。

【００２８】出発物質の製造、加水分解条件および任意の低温殺菌法、超濾過、濃縮および乾燥工程を含む後処理は、それ自身既知の方法で、例えばＥＰＡ第４２１３
０９号に記載の方法または以下に例示してある方法と同様にして行い得る。

【００２９】牛乳タンパク質または牛乳タンパク質画分加水分解により得られた加水分解産物の組成は加水分解条件に依存することは認識されよう。

【００３０】好ましくは、この条件は加水分解産物が有効な加水分解率を有し、遊離アミノ酸含量が本明細書に具体化してある範囲内になるように選択される。

【００３１】一般に、好ましくは非アレルギー源性乳漿タンパク質加水分解産物、更に好ましくは乳漿タンパク質加水分解産物：カゼイン加水分解産物の重量比５：１
〜１：１、最も好ましくは１.５：１の混合物を使用する。

【００３２】使用する乳漿タンパク質加水分解産物画分は、２１５nmのＵＶで測定した場合、簡便には３５重量％以下、好ましくは２２〜３３重量％の２〜５アミノ酸を含むペプチドおよび／または３５〜６０重量％の４〜
１０アミノ酸を含むペプチドを含む。 (値が出発物質の組成の自然な違いだけでなく、用いる検出法(ＵＶ２１
５nmによるクロマトグラフィー的検出およびレフラクション・インデックス(Refraction Index)検出法は異なった結果となるであろう)によって上記範囲内である程度変化するであろうことは認識されよう。 )

【００３３】牛乳タンパク質加水分解産物の牛乳タンパク質耐性を誘発する能力は、リンパ球刺激試験(Lymphoc
yte stimulation test)(LST)を用いて得られた結果から示唆される。

【００３４】

【背景】リンパ球刺激試験(LST)は、３カ月の排除食前および後の罪を犯すタンパク質に対する細胞性反応を研究するために、牛乳アレルギーの子供の滅菌血液で行う。 子供は、ＤＡＭＩＲＡ(商標)(サンド・ニュートリション・リミテッド)による処置の間に、より高濃度の罪を犯すタンパク質でしか細胞刺激されないことにより示される細胞性耐性が発達した。

【００３５】試験混合物で使用した緩和なタンパク質加水分解産物は、ＤＡＭＩＲＡ(商標)(サンド・ニュートリション・リミテッド)と呼ばれる、商業的に入手可能な産物である。

【００３６】ＤＡＭＩＲＡ(商標)は、６０％乳漿タンパク質および４０％レンネットカゼイン加水分解産物を含む。 乳漿タンパク質加水分解産物は、実質的に巨大脂質およびラクトースを含まない乳漿タンパク質の生理学的加水分解、即ち胃段階(ペプシン加水分解)および膵臓加水分解(トリプシン／キモトリプシンおよびエラスターゼ２による)を含む、本質的に以下の実施例１に記載したようにして得られる。 レンネットカゼイン加水分解産物は、本質的に、以下の実施例７に記載の方法で得られる。 ＤＡＭＩＲＡ(商標)組成物は実施例８に記載する。

【００３７】

【試験の記載】

リンパ球刺激試験 本試験は、滅菌ヘパリン化血液から、フィコール(Ficol
l)(ファルマシア)遠心後単離されたリンパ球画分で行う。 細胞を緩衝液(ＴＣ １９９ ハンクス)に懸濁し、
遠心し、３回洗浄する。 それを次に培養培地(ＲＰＭＩ
１６４０)中のＡＢひと血清(２０％濃度)溶液に加える。 １０ ⁶細胞／mlを、９６ウェルプレートで４個ずつ、異なった濃度の抗原とともにインキュベーションする。 ６種の異なった対数濃度(１０ ^-8から１０ ^-3 mg／ml
の全乳、カゼイン、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリンおよび牛乳タンパク質加水分解産物)が研究される。 ７日間インキュベーションの後、細胞ＤＮＡをメチル−Ｈ３チミジンで標識する；濾紙の上に回収し、
シンチレーション液と混合する。 細胞増殖を示す放射活性をベータカウンターで測定する。 結果は１分当たりの全計数(cpm)または刺激指数(ＳＩ)：

【数２】

【００３８】指数＞３は陽性と判断する。 抗原無しの陰性対照；フィトヘマグルチニンおよび破傷風毒素を陽性対照として使用する。

【００３９】

【結果】図１は、全牛乳に対するおよび３種の主要な抗原に対する診断時(試験１)およびＤＡＭＩＲＡ(商標)で処置３カ月後(試験２)の細胞性反応を示す。 図１ａは、
全牛乳濃度、図１ｂはα−ラクトアルブミン濃度、図１
ｃはβ−ラクトグロブリン濃度および図１ｄはカゼイン濃度に対する刺激指数(ＳＩ)を示す。

【００４０】刺激指数は、全牛乳濃度に対して試験期間中、試験１のほうが試験２と比べて高い。 この傾向はα
−ラクトアルブミンおよびβ−ラクトグロブリンに対してもまた観察される。 この指標は、試験１において１０
−５mg／mlまで陽性であり、試験２においては、全牛乳に対してすべての濃度で陰性であった。 両方の試験でβ
−ラクトグロブリンに対して１０−４mg／mlで陰性であった：α−ラクトグロブリンに対しては試験１では１０
−４mg／mlで陽性、試験２ではすべての濃度で陰性であり、カゼインでは試験２では１０−４mg／mlで陽性、試験１では同じ濃度で陰性であった。

【００４１】図２は３カ月後の全牛乳(図２ａ)およびＤ
ＡＭＩＲＡ(商標)(図２ｂ)の比較である。 刺激指数は、
試験１の牛乳試験では１０−５mg／mlで陽性に上昇し、
一方ＤＡＭＩＲＡの刺激指数は試験１のすべての濃度で陰性であった。 試験２において、刺激指数は両方のすべての濃度で陰性であった。 比較して、リンパ球増殖は試験したすべての濃度で、全牛乳の方がＤＡＭＩＲＡ(商標)と比較して少なかった。 これらの結果は、食事療法の間に免疫学的耐性が現れることを示唆する。 ＤＡＭＩ
ＲＡにおける陽性の結果は別の試験で確認される。

【００４２】その耐性誘発の観点から、タンパク質加水分解産物はまた１型糖尿病の遺伝的素養を有する幼児および子供における予防または治療を示唆する。

【００４３】牛血清アルブミン(ＢＳＡ)は免疫系の引金を引くことが実際に示唆されている。 抗−ＢＳＡ抗体、
特に膵臓β細胞表面に存在しＢＳＡペプチドの一部に似た構造を有する内因性抗原ｐ６９に結合したＩｇＧ抗−
ＢＳＡ抗体はアレルギー性反応の引金を引く。 このような免疫性攻撃は、１型糖尿病の発症を導くβ−細胞集団を減少させる。

【００４４】本明細書に記載の牛乳タンパク質加水分解産物の投与は、感受性の強いひとにおける膵臓β細胞の破壊を防止する。 １型糖尿病の遺伝的素養の時を得た診断は、したがって感受性の強い幼児および子供の１型糖尿病の、タンパク質加水分解産物処置による予防および治療を可能にする。 この処置は、簡便には子供が牛乳耐性を獲得するまで続ける。

【００４５】本発明の方法に使用するために、本発明のタンパク質加水分解産物は簡便には栄養学的に許容可能な組成物形で投与する。 このような組成物は炭水化物および脂肪酸源、ビタミン類、ミネラルおよび微量元素を含み得る。

【００４６】上記組成物は、好ましくは、単一の栄養源として使用した場合、本質的に一日のカロリー、窒素、
脂肪酸、ビタミン、ミネラルおよび微量元素のすべての必要条件に合うような完全な調合食(液体または粉末形)
である。

【００４７】幼児において、一日の供給すべきカロリー量は一般に体重Kg当たり１００〜１８０Kcalである。 一日に寄与される窒素源(すなわち本発明の乳漿／カゼイン加水分解産物)、炭水化物源および脂質源は広範囲で変化し得る。 本発明の一般的な組成物は、組成物の全エネルギー供給量中、炭水化物源が４５〜６８％、脂肪酸源が２５〜５０％および本発明のタンパク質加水分解産物が７〜１５％提供される。

【００４８】幼児用の完全な調合食として使用するのに特に好適な炭水化物の例は、幼児が低ラクロース量を有する食物を必要としない限り(この場合、炭水化物源は簡便にはラクトースを半ば排除する(＜１％ラクトース))、マルトデキストリン(１０〜２５％)およびラクトース(９０〜７５％)を基本にした混合物を含む。 好ましい脂肪酸源の例はトリグリセリド油およびリン脂質を含む。

【００４９】成人用組成物に使用する炭水化物は、好ましくは最初は低モノおよびジサッカライド(全炭水化物量中＜５重量％)、および非常に低い食物繊維および半ば除外したラクトース含量を元にした混合物である。 好ましくはこのような組成物において、全ラクトース含量は製剤中に存在するタンパク質加水分解産物の１重量％
以下である。

【００５０】本発明の組成物に含むのに好適なビタミンの例は、生理学的に許容可能な形のビタミンＡ、ビタミンＤ ₃ 、ビタミンＥ、ビタミンＫ ₁ 、ビタミンＣ、葉酸、
チアミン、リボフラビン、ビタミンＢ ₆ 、ビタミンＢ ₁₂ 、ナイアシンアミド、ビオチン、ｌ−カルニチン、
クロリンおよびパントテン酸を含む。 期待される使用に依存して、それぞれタウリンおよび／またはヒポタウリン、Ｌ−システインの包含、スレオニンの補給は有用であり得る。 本発明の組成物に加えるアミノ酸の量は、遊離アミノ酸または小さなペプチドの形では、例えば遊離アミノ酸含量、有効な加水分解率、４〜１０アミノ酸からなるペプチド等に関して、好ましくは本発明の方法に使用される非アレルギー源性加水分解産物の組成物に実質的に影響をおよぼさないようなものである。

【００５１】本発明の組成物に含むのに好適なミネラルおよび微量元素の例は、生理学的に許容可能な形のナトリウム、カリウム、カルシウム、リン、マグネシウム、
マンガン、銅、亜鉛、鉄、セレン、クロムおよびモリブデンである。

【００５２】ビタミン、ミネラルおよび微量元素の一日必要最少量は処置されるひとに依存することは認識されよう。 一般に一日必要最少量は政府当局により決定される：従って、それらは、国によって違い得る。

【００５３】以下の本発明を説明する実施例において、
％および部は特記しない限り重量であり、温度は摂氏である。

【００５４】

【実施例】

実施例１：選択された乳漿タンパク質加水分解産物 １.１ タンパク質溶液の製造 １２,０００のタンクに、７５００ｌの脱塩水を２５±
２℃で入れる。 ９００kgの脱脂質脱ラクトースラクトシーラム(lactoserum)を徐々にその中に溶解する。 混合物を、温度２５±２°の６００ｌの脱塩水で処理し、容量を１１５００ｌに合わせる。 水酸化の時間は１時間である。

【００５５】１.２ 熱処理 調整したクエン酸および乳酸(混合物Ａ：下記実施例２.
１参照)混合物を使用して溶液のｐＨを４.６±０.１に調節する。 混合物をｐＨ４.６で、１分間の８０℃瞬間熱処理により低温殺菌を行う。 混合物の温度を次に４３
±２℃に上げ、ｐＨをｐＨ２.６±０.１に３３％塩酸溶液を使用して調整する。

【００５６】１.３ ペプシン加水分解 牛ペプシン(BOVIPEP；ラボラトリー・プレシュール・グランデイ(Lab. Presure Granday))０.２ｇ／kgを次に加え、反応容器を１時間温度を４３℃に維持しながら往復させる。

【００５７】１.４ 超濾過による脱塩 ｐＨをｐＨ８±０.１に、調整したアルカリ混合物Ｂ(下記参照)を使用して調整する。 温度は４３±２℃に維持する。 混合物を、２５００ｌの浸透物が得られるまで超濾過(ＩＲＩＳ ３０３８膜−レーン・パウレンク(Rhon
e Poulenc)；膜表面８０ｍ ² 、温度５０℃)する。 この段階において、ジアフィルトレーション(diafiltration)
を開始する：４８００ｌの浸透物を溶出し、一方保持物の用量は、４５±２℃で、脱塩水４８００ｌを加えることにより借りと同じにする。

【００５８】保持物中の塩素含量を脱塩する。 それは１.７ｇ／ｌを越えてはならない。 もし越えれば、超濾過を、塩素含量が望ましい濃度に下がるまで、浸透物の量を捕捉して溶出により超濾過を続行する。 保持物の容量を、４５±２℃の脱塩水を用いて１２０００ｌに調整する。 温度およびｐＨは立証されている；もし必要であれは、温度を４５±２℃に熱して再調整し、ｐＨをアルカリ性混合物Ｂ(下記実施例２.２)を用いてｐＨ８に再調整する。

【００５９】１.５ エラスターゼ存在下のトリプシン／キモトリプシン加水分解 ＰＥＭ(以下の実施例２.３)およびエラスターゼ(以下の実施例２.４)を調整溶液の形で同時に加える：ＰＥＭはタンパク質基質１kg当たり３.５ｇ、エラスターゼは、
タンパク質基質１kg当たり１１２０Ｕ ₂ 、最大３８００
Ｕ ₁の割合である。 ｐＨは１時間１５分間、あらかじめ調整したアルカリ中和溶液Ｂを用いてｐＨ８±０.１に維持する。 加水分解は更に１時間１５分、更なるｐＨ調節はせずに続ける。 全ＰＥＭ／エラスターゼ加水分解時間中、混合物の撹拌を続け、温度を４５±２℃に維持する。

【００６０】１.６ 超濾過／ジアフィルトレーション−濃縮 タンパク質加水分解溶液を、次に５０℃で、ＩＲＩＳ
３０３８膜(レーン・パウレンク)−膜表面８０ｍ ²を用いて超濾過をする。 超濾過に続いて、保持物のレフラクション・インデックスが約１３％になった場合、ジアフィルトレーションを行う。 用いるジアフィルトレーションの割合は１.５である。 保持物を次いで冷却し、レフラクション・インデックスが３５−４０％になるまで濃縮する。 残ったタンパク質を、５０℃で、８０ｍ ²の膜表面を有するＩＲＩＳ ３０３８膜(レーン・パウレンク)を使用して超濾過して除去する。

【００６１】１.７ 滅菌／乾燥 濃縮した残留物を滅菌(１３０℃で５分)し、次いで噴霧乾燥する(入口温度１８０℃；出口温度８０℃)。 このようにして得た生産物は下記の物理特性を有する：

【表３】 溶解性 １００％ ｐＨ ６ 乾燥抽出 ９７.７５ｇ／１００ｇ タンパク質(Ｎ×６.５) ８９.３４ｇ／１００ｇ 全窒素(ＴＮ) １３.７４ｇ／１００ｇ 灰 ７.７６ｇ／１００ｇ Ｃａ ２７０mg／１００ｇ Ｎａ ５８０mg／１００ｇ Ｋ ２３００mg／１００ｇ Ｃｌ ２８６０mg／１００ｇ 遊離アミノ基中のＮ(ＡＮ) ２.６６ｇ／１００ｇ 全Ｎ含量(ＮＨ ₂またはＮＨ)(ＴＡＮ) １２.８０ｇ／１００ｇ 加水分解の見掛けの割合(ＡＮ／ＴＮ) １９.３５％ 加水分解の有効な割合(ＡＮ／ＴＡＮ) ２０.７５％

【００６２】

【表４】

【００６３】このようにして得た加水分解産物のアミノグラム(ｇ／１００アミノ酸)は下記の通りである(６個のサンプルの平均)：

【表５】

【００６４】遊離アミノ酸含量(ｇ／１００ｇ生産物)−
３個のサンプルの平均

【表６】

【００６５】ペプチド組成(６個のサンプルの平均)

【表７】 ＵＶ検出(２１５nm) ２−５アミノ酸からなるペプチド：２８.８０±０.６５ ２−10アミノ酸からなるペプチド：６０.８３±０.８７ ４−10アミノ酸からなるペプチド：３９.５２±１.１９ レフラクション・インデックスにより検出 ２−５アミノ酸からなるペプチド：２７.４２±３.７８ ２−10アミノ酸からなるペプチド：６４.７７±１.９２ ４−10アミノ酸からなるペプチド：４７.２０±２.６７

【００６６】実施例２ ２.１ 混合物Ａ ２５±２℃の脱塩水に３０kgの結晶クエン酸を撹拌しながら加える。 クエン酸が完全に溶解した後、３０lの乳酸(純度８０％)を加える。 次いで全量１３０lとなるまで更に脱塩水を加える。

【００６７】２.２ 混合物Ｂ ２５±２℃の脱塩水１００ｌにＫＯＨ５２.９７kgを、
完全な溶解溶液になるまで撹拌しながら加える。 次いで純粋な２１％アンモニア２１１.７５ｌを加え、脱塩水を加えて容量を３５０ｌに調整する。

【００６８】２.３ ＰＥＭ(酵素３.５ｇ／タンパク質１kg) 用いるタンパク質融解性酵素混合物は、ブタトリプシン、牛トリプシンおよび牛キモトリプシンの塩を含まない粉末形の濃縮混合物である、少なくともトリプシン活性１８００ＵＳＰ−ｕ／mgおよびキモトリプシン活性少なくとも３５０ＵＳＰ−ｕ／mgを有する商品名Ｐ.Ｅ.
Ｍ.２５００Ｓ(ノボ・インダストリエ・エンザイムズ・
ソシエテ・アノニム(NOVO Industrie Enzymes SA)、
パリ)である。 ＰＥＭ２５００Ｓを２５±２℃で脱塩水に溶解して、水性溶液として使用する。

【００６９】２.４ エラスターゼ(パンクレオペプチダーゼＥ) 用いるエラスターゼは豚膵臓由来のものであり、７０％
飽和硫酸アンモニウムに懸濁された形で、活性が１２０
Ｕ／タンパク質mg以下ではない、コードＥ３で、バイオザイム(ＧＢ)から市販されているものである。 バイオザイムにより用いられる単位定義は以下の通りである：１
マイクロモルのＮ−アセチル−トリ−Ｌ−アラニンメチルエステルを２５℃、ｐＨ８.５で１分当たりに加水分解する酵素量(メソッド・オブ・アッセイ(Method of as
say)：ゲルタ−およびホフマン(１９７０)、カナディアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Can.J.Bio
chem.)、４８、３８４)。

【００７０】実施例３：乳漿タンパク質加水分解産物 １時間１５分の中和段階(工程１.５)の後、加水分解を更に１時間４５分(１時間１５分の代わり)続ける以外、
実施例１の方法と同様に行う。 ＭＷ配分は以下の通りである：(２１５nmのＵＶ検出により測定）

【表８】

【００７１】実施例４：乳漿タンパク質加水分解産物 １時間１５分の中和段階(工程１.５)の後、１％ＣＯＲ
ＯＬＡＳＥ７０９２を加え、加水分解を１時間１５分続ける以外、実施例１の方法と同様に行う。 ＣＯＲＯＬＡ
ＳＥ７０９２(レーム)は、２０００mUHb／mgの活性を有するアスペルギルス・オリザエ培養物から液体形で製造されたタンパク質融解性酵素であり、１UHbは１分間にｐＨ７.５および３７℃で、ヘマグロブリン由来の１マイクロモルのＴＣＥ−可溶性加水分解産物中のチロシンと同じである。 このようにして得られた産物は、下記の物理化学的特性を有する：

【表９】 乾燥抽出 ９７.９７ｇ／１００ｇ 全窒素含量(ケルダール) １３.３０ｇ／１００ｇ タンパク質含量(×６.５) ８５.０１ｇ／１００ｇ 灰 ７.９９ｇ／１００ｇ Ｃａ ０.３３ｇ／１００ｇ Ｎａ ０.６７ｇ／１００ｇ Ｋ ３.０５ｇ／１００ｇ Ｃｌ ２.７２ｇ／１００ｇ ｐＨ ６.０５ 溶解性 １００％

【００７２】

【表１０】

【００７３】実施例５：乳漿タンパク質加水分解 ＣＯＲＯＬＡＳＥ ７０９２の代わりに膵臓プロテイナーゼ、ＣＯＲＯＬＡＳＥ ＰＰを用いる以外、実施例４
の方法と同様に行う。

【００７４】実施例６：乳漿タンパク質加水分解産物 出発物質として使用する乳漿タンパク質が、下記の通り巨大タンパク質を除去するために予備処理したものである以外、実施例１〜４に記載の方法と同様に行う。 商業的に入手可能な脱ラクトースラクトシーラムタンパク質粉末を精製し、巨大脂質および分子量６０,０００ダルトン以上を有する最も大きいタンパク質を、５０,００
０以上の動的分離を有する膜上の微小濾過および超濾過技術を用いて除去するために、予備処理する。 状況は、
免疫技術で測定して約９５％の免疫グロブリンＩｇＧが０.２２ミクロンの膜による微小濾過により溶出されるようおよび産物が１リットル当たり約７５ｇタンパク質を含むように、および１リットル当たりラクトースが２
ｇ以下であるように選択する。

【００７５】実施例７：レンネットカゼインのトリプシン／キモトリプシン／エラスターゼ−型２−加水分解 ａ）１０００kgのレンネットカゼイン(牛乳から、レンネットによる酵素的沈澱により得、少なくとも８４重量％のタンパク質−関連物を全乾燥物中に含み、水分含量は１０％以下である)を、脱塩水７０００ｌを含む１２
ｍ ³の反応容器に、撹拌しながら、５℃に冷却して部分法(portionwise)により加える。 混合物を７００ｌの脱塩水で処理し、混合物の容量を８３００ｌに調製する。
加水分解時間は１時間である。 ｂ）工程ａ）の溶液のｐＨを、アンモニアおよび水酸化カリウムのアルカリ溶液[Ｂ](実施例２.２)を用いてｐ
Ｈ８±０.１に調整する。 ｃ）温度は４５℃±２℃に調整する。 ｄ）ＰＥＭ(実施例２.３参照)およびエラスターゼ(実施例２.４参照)を同時にこのようにして得られた混合物に加える：ＰＥＭは１.９６ｇ／タンパク質kg、エラスターゼはタンパク質１kg当たり３４２０Ｕ ₁の割合である。 アンモニア／水酸化カリウム溶液Ｂ(実施例２.２)
を用いて溶液を中和することにより１時間１５分間、ｐ
Ｈを８±０.１に維持する。

【００７６】ｅ）ＣＯＬＯＬＡＳＥ ７０９２を、次に１５g/タンパク質kgの量で加える。 混合物は１時間１５
分４５±２℃に維持する。 ｆ）加水分解が終了した後(全加水分解時間２時間３０
分)、混合物を、膜表面８０ｍ ²を有するＩＲＩＳ ３０
３８膜(レーン−パウレンク)を用いて超濾過する。 温度は５０℃である。 ｇ）超濾過の後、レフラクション・インデックスが約１
３％になった場合、ジアフィルトレーションを行う。 使用するジアフィルトレーションの割合は１.５である。
２時間以上保存する場合、保持物の温度は５℃以下に冷却しなければならない。 ｈ）保持物を、レフラクション・インデックスが３５から４０％になるまで蒸発濃縮する。 濃縮物を１分間１２
５°±２℃で滅菌し、噴霧乾燥する(入口温度１８０
℃；出口温度８０℃)。

【００７７】このようにして得た生産物は下記の物理特性を有する：

【表１１】 溶解性 １００％ ｐＨ ７.２６ 乾燥抽出 ９７.６６ｇ／１００ｇ タンパク質(Ｎ×６.５) ９４.１２ｇ／１００ｇ 全窒素(ＴＮ) １４.４５ｇ／１００ｇ 灰 ４.２７ｇ／１００ｇ Ｃａ ３７０mg／１００ｇ Ｎａ ５０mg／１００ｇ Ｋ １２４０mg／１００ｇ Ｃｌ ９０mg／１００ｇ 遊離アミノ基中のＮ(ＡＮ) ３.３５ｇ／１００ｇ 全Ｎ含量(ＮＨ ₂またはＮＨ)(ＴＡＮ) １２.４０ｇ／１００ｇ 加水分解の見掛けの割合(ＡＮ／ＴＮ) ２３.２％ 加水分解の有効な割合(ＡＮ／ＴＡＮ) ２７.０％

【００７８】

【表１２】

【００７９】アミノグラム(ｇ／１００アミノ酸）

【表１３】

【００８０】実施例８：幼児用の調剤

【表１４】 加水分解したタンパク質＊ １３.１ｇ 脂肪 ２０.２ｇ 炭水化物 ５８.４ｇ ミネラル ２.８ｇ 非熱源有機化合物** ０.７ｇ 湿気 ４.８ｇ 総量 １００ｇ *(６０：４０の乳漿タンパク質：カゼイン混合物であり、乳漿タンパク質は実施例６の予備加水分会の後実施例１に従って加水分解されており、レンネットカゼインは実施例７に従って加水分解されている。)加水分解産物は１００ｇ最終産物当たり０.０５５ｇＬ−システインおよび０.０３ｇのタウリンと共に最終産物に加える。 **ビタミン画分および調剤におけるある微量元素およびミネラルの有機配位子に関する

【００８１】アミノグラムは下記の通りである(ｇ／１
００ｇアミノ酸)

【表１５】

【図面の簡単な説明】

【図１】 全牛乳に対するおよび３種の主要な抗原に対する診断時(試験１)およびＤＡＭＩＲＡ(商標)で処置３
カ月後(試験２)の細胞性反応を示すグラフである。

【図２】 ３カ月後の全牛乳(図２ａ)およびＤＡＭＩＲ
Ａ(商標)(図２ｂ)の比較を示すグラフである。

フロントページの続き (51)Int.Cl. ⁶識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ２３Ｊ 3/34 Ａ６１Ｋ 39/35 Ｃ１２Ｐ 21/06 9282−4Ｂ (72)発明者 ジャン−モーリス・カーン スイス、ツェーハー−3011ベルン、ユンケ ルンガッセ25番 (72)発明者 バルバラ・ポーラ スイス、ツェーハー−1201ジュネーヴ、プ ラス・コルナヴァン18−20番