一种利用微生物液态发酵生产弹性蛋白酶酶制剂的方法 |
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| 申请号 | CN201310398828.2 | 申请日 | 2013-09-05 | 公开(公告)号 | CN103627689A | 公开(公告)日 | 2014-03-12 |
| 申请人 | 徐州工程学院; | 发明人 | 高兆建; 张桂英; 张建萍; 侯进慧; 陈尚龙; 张从省; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种利用 微 生物 液态 发酵 生产弹性蛋白酶酶制剂的方法，其特征在于选用地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)ELAT4（CGMCC5700）作为弹性蛋白酶生产的菌种，经地衣芽孢杆菌菌种活化、 种子 液制备、发酵液培养、深层液体通 风 发酵和弹性蛋白酶酶制剂成品制备步骤，而制得弹性蛋白酶酶制剂。本发明制得的液体酶活 力 达到352U/ml、固体酶制剂酶活力达到2512u/g。本发明具有提高产弹性蛋白酶的效率、增强弹性蛋白酶的活性和降低生产成本的优点，且生产过程无废固物处理问题，对环境无污染。本发明适用于大批量生产弹性蛋白酶。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种利用微生物液态发酵生产弹性蛋白酶酶制剂的方法，其特征在于选用地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis) ELAT4 （CGMCC 5700）作为弹性蛋白酶生产的菌种，经地衣芽孢杆菌菌种活化、种子液制备、发酵液培养、深层液体通风发酵和弹性蛋白酶酶制剂成品制备步骤，而制得弹性蛋白酶酶制剂，具体步骤如下： |
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| 说明书全文 | 一种利用微生物液态发酵生产弹性蛋白酶酶制剂的方法技术领域背景技术[0002] 弹性蛋白酶是一种以分解不溶性弹性蛋白为特征的蛋白水解酶，主要存在于动物胰脏中，在皮肤、主动脉、血小板和白血球中也有分布，同时，在微生物类群中也广有分布，细菌、放线菌、真菌中都能分泌胞外弹性蛋白酶。弹性蛋白酶可使结缔组织蛋白质中的弹性蛋白消化分解，包括肽键结合的、酰胺结合的和酯结合的进行加水分解。弹性蛋白酶具有明显的β-脂蛋白酶作用，能活化磷酯酶A，降低血清胆固醇，改善血清脂质，降低血浆胆固醇及第密度脂蛋白、甘油三酯，升高密度脂蛋白、阻止脂质向动脉壁沉积和增大动脉的弹性，具有抗动脉粥样硬化及抗脂肪肝作用。在医学临床主要用于治疗高血脂症，防止动脉粥样硬化、脂肪肝。由于弹性蛋白酶能够专一降解结缔组织中坚韧的弹性纤维组分，所以当其他蛋白与弹性蛋白共存时，此酶优先对弹性蛋白水解，因此弹性蛋白酶也可以作为理想的肉类嫩化剂用于食品加工业。所以根据弹性蛋白酶的特性，弹性蛋白酶不仅在医药上有其应用价值，而且在食品、日用化工工业上有着广阔的前景和商业价值。目前，弹性蛋白酶大都是通过从动物的胰脏中获取得方法来制备的，这种方法产酶量低，保藏性不好，过程较为复杂，而且成本高。如何克服现有技术的不足已成为当今生物工程技术领域亟待解决的重点难题之一。 [0003] 发明内容[0004] 本发明的目的是为了克服现有技术的不足而提供一种利用微生物液态发酵生产弹性蛋白酶酶制剂的方法，本发明具有提高产弹性蛋白酶的效率、增强弹性蛋白酶的活性和降低生产成本的优点，适用于大批量生产弹性蛋白酶。 [0005] 根据本发明提出的一种利用微生物液态发酵生产弹性蛋白酶酶制剂的方法，其特征在于选用地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)ELAT4(CGMCC5700)作为弹性蛋白酶生产的菌种，经地衣芽孢杆菌菌种活化、种子液制备、发酵液培养、深层液体通风发酵和弹性蛋白酶酶制剂成品制备步骤，而制得弹性蛋白酶酶制剂，具体步骤如下：步骤一，菌种活化：将保藏的地衣芽孢杆菌在菌种活化培养基上划线两次，均在37℃培养箱中培养18-24h，第二次划线以第一次划线得到的单菌落为菌种。然后从第二次划线的平板上挑选单菌落接入液体菌种活化培养基或固体菌种活化培养基，培养温度37℃、时间180-200r／min、摇瓶培养OD600至1D600； 步骤二，种子液制备：从活化好的液体试管中接种菌液到种子培养基，培养温度 35-37℃、时间160-180r／min、摇床震荡培养18-24h，成为种子液；过平板划线法，用接种环从保存的菌种斜面中接种到菌种活化固体培养基中，放置37℃培养箱中培养18-24h，然后再次从活化的固体培养基中挑取单菌落接种到另一个菌种活化固体培养基上，进行二次活化，培养条件：37℃培养箱中培养18-24h；从平板上挑选单菌落接入含5mL液体菌种活化培养基或固体菌种活化培养基的试管中，将试管置于摇床，培养温度37℃、时间 180-200r／min、摇瓶培养OD600至1D600； 步骤三，摇瓶发酵液培养：将培养好的种子培养液以2％-8％(v／v)的接种量，接种至250ml三角瓶中，160-180r／min摇床震荡培养；摇瓶发酵培养基发酵前6-10h控制温度为35-37℃，10h后切换至26-30℃并保持到发酵结束；发酵0-10h过程中控制发酵液pH7.0-7.5，10h后至发酵结束过程中将pH保持在7.5-8.5； 步骤四，深层液体通风发酵：发酵罐灭菌前，按照1∶1000的比例加入消泡剂，发酵过程中的罐压维持0.04Mpa；接种量3-6％(v／v)、发酵罐初始发酵培养基自发酵初始至发酵14h，通风量0.55vvm；发酵14-24h，通风量0.75vvm；发酵25h至发酵结束，通风0.6vvm； 发酵0-30h，温度34-36℃；发酵30h后温度25-30℃；发酵过程pH7.5-8.0；发酵达到25h补加浓度为100g／L的葡萄糖溶液80ml；发酵达到30h，再次补加浓度100g／L的葡萄糖 100ml；发酵达到35h，补加浓度为100g／L的豆饼粉乳浊液150ml； 步骤五，弹性蛋白酶酶制剂成品制备： (1)、发酵液除菌：发酵液4℃、8000r/min离心10min去除菌体； (2)、超滤浓缩：第一次采用截留分子质量为60kDa的超滤膜过滤，保留滤出液；第二次用20kDa的超滤膜过滤，滤液浓缩3-5倍，保存截留液； (3)、硫酸铵盐析：将超滤后的滤液调节pH至6.5，向滤液中加入硫酸铵至饱和度25％， 4℃静置8-10h，然后在4℃下8000r/min离心机离心10min，去除底部沉淀，收集上清液；调节上清液pH8.5，添加硫酸铵至饱和度70％，4℃静置8-10h后冷冻并离心收集沉淀蛋白； 0.02mol／L、pH7.5的Tris-HCl缓冲溶液溶解沉淀，并充分透析； (4)、真空冷冻干燥：将透析后的酶液20kDa的超滤膜超滤，浓缩6-10倍，加入保护剂 1-2％海藻酸钠、2-3％蔗糖、3-5％麦芽糊精、0.1-0.25％山梨酸钾和0.1-0.4％苯甲酸钠； 经充分分散后，-20℃冷冻8-10h、真空度30-50Pa，温度-35℃以下、冷冻15-18h，再经粉碎即制得弹性蛋白酶酶制剂成品。 [0006] 经测定，本发明方法制得的弹性蛋白酶酶制剂成品的指标为：成品为棕褐色固体粉末、可溶于水、无异味；酶活力2512u／g，成品热稳定性为25℃条件下保存6个月后酶活力仍大于90％；酶催化活性适合作用的温度范围35℃-40℃；成品适合作用的pH值范围7.0-8.5；本发明采用摇瓶发酵方式所得的酶活力为：212u／ml；通过发酵方法，发酵液酶活达到：352U／ml。 [0007] 本发明与现有技术相比其显著优点在于：一是本发明发酵制备弹性蛋白酶的酶活性高，液体酶活力达到352U／ml、固体酶制剂酶活力达到2512u／g，弹性蛋白酶的总酶活回收率达80％以上、收率高，适合大批量生产制造；二是本发明以豆饼粉、麸皮、蛋白胨、玉米粉为主要原料，生产成本低，酶制剂制备过程采用离心、超滤、硫酸铵盐析、透析、冷冻干燥等步骤，产品杂质含量低，达到食品添加剂标准的要求；三是操作工艺简单，生产效率高、成本低，适合工业化生产；四是生产过程无废固物处理问题，对环境无污染。本发明适用于大批量生产弹性蛋白酶。 [0008] 具体实施方式下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。 [0009] 本发明实施例所用的菌种为地衣芽孢杆菌，该菌种保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏序列号为CGMCC No.5700。 [0010] 本发明提出的一种利用微生物液态发酵生产弹性蛋白酶酶制剂的方法，选用地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)ELAT4(CGMCC5700)作为弹性蛋白酶生产的菌种，经地衣芽孢杆菌菌种活化、种子液制备、发酵液培养、深层液体通风发酵和弹性蛋白酶酶制剂成品制备步骤，而制得弹性蛋白酶酶制剂，具体步骤如下：步骤一，菌种活化：将保藏的地衣芽孢杆菌在菌种活化培养基上划线两次，均在37℃培养箱中培养18-24h，第二次划线以第一次划线得到的单菌落为菌种。然后从第二次划线的平板上挑选单菌落接入液体菌种活化培养基或固体菌种活化培养基，培养温度37℃、时间180-200r/min、摇瓶培养OD600至1D600；其中： 液体菌种活化培养基配方(g／L)为：10.0蛋白胨、10.0葡萄糖、5.0酵母膏、 1.5K2HPO4·H2O和0.1MgSO4·7H2O，条件：pH7.2； 固体菌种活化培养基配方(g／L)为：10.0蛋白胨、10.0葡萄糖、5.0酵母膏、 1.5K2HPO4·H2O和0.1MgSO4·7H2O，外加15g琼脂粉，条件：pH7.2； 步骤二，种子液制备：从活化好的液体试管中接种菌液到种子培养基，培养温度 35-37℃、时间160-180r／min、摇床震荡培养18-24h，成为种子液；过平板划线法，用接种环从保存的菌种斜面中接种到菌种活化固体培养基中，放置37℃培养箱中培养18-24h，然后再次从活化的固体培养基中挑取单菌落接种到另一个菌种活化固体培养基上，进行二次活化，在37℃培养箱中培养18-24h；从平板上挑选单菌落接入含5mL液体菌种活化培养基或固体菌种活化培养基的试管中，将试管置于摇床，培养温度37℃、时间180-200r／min、摇瓶培养OD600至1D600；其中： 种子培养基配方(g／L)为：0.4牛肉膏、0.8蛋白胨、1.0酵母粉、0.5NaCl、0.1KH2PO4、 0.04MgSO4·7H2O和100mL蒸馏水，条件：pH7.0、灭菌温度121℃、灭菌时间20min； 液体菌种活化培养基配方(g／L)为：10.0蛋白胨、10.0葡萄糖、5.0酵母膏、 1.5K2HPO4·H2O和0.1MgSO4·7H2O，条件：pH7.2； 固体菌种活化培养基配方(g／L)为：10.0蛋白胨、10.0葡萄糖、5.0酵母膏、 1.5K2HPO4·H2O和0.1MgSO4·7H2O，外加15g琼脂粉，条件：pH7.2； 步骤三，发酵液培养：将培养好的种子培养液以2％-8％(v／v)的接种量，接种至 250ml三角瓶中，160-180r／min摇床震荡培养；摇瓶发酵培养基发酵前6-10h控制温度为35-37℃，10h后切换至26-30℃并保持到发酵结束；发酵0-10h过程中控制发酵液pH7.0-7.5，10h后至发酵结束过程中将pH保持在7.5-8.5；其中： 摇瓶发酵培养基配方(g／L)为：15豆饼粉、12麸皮、6蛋白胨、12玉米粉、23玉米浆、 16葡萄糖、2(NH4)2SO4、1.5K2HPO4·H2O、1吐温-80、5麦芽糖、0.1MgSO4·7H2O和0.5CaCl2； 步骤四，深层液体通风发酵：发酵罐灭菌前，按照1∶1000的比例加入消泡剂，发酵过程中的罐压维持0.04Mpa；接种量3-6％(v／v)、发酵罐初始发酵培养基自发酵初始至发酵14h，通风量0.55vvm；发酵14-24h，通风量0.75vvm；发酵25h至发酵结束，通风0.6vvm； 发酵0-30h，温度34-36℃；发酵30h后温度25-30℃；发酵过程pH7.5-8.0；发酵达到25h补加浓度为100g／L的葡萄糖溶液80ml；发酵达到30h，再次补加浓度100g／L的葡萄糖 100ml；发酵达到35h，补加浓度为100g／L的豆饼粉乳浊液150ml；其中： 发酵罐初始发酵培养基配方(g／L)为：15豆饼粉、12麸皮、6蛋白胨、玉米8粉、 23玉米浆、6葡萄糖、2(NH4)2SO4、1.5K2HPO4·H2O、1吐温-80、5麦芽糖、0.1MgSO4·7H2O和 0.5CaCl2； 步骤五，弹性蛋白酶酶制剂成品制备： (1)、发酵液除菌：发酵液4℃、8000r/min离心10min去除菌体； (2)、超滤浓缩：第一次采用截留分子质量为60kDa的超滤膜过滤，保留滤出液；第二次用20kDa的超滤膜过滤，滤液浓缩3-5倍，保存截留液； (3)、硫酸铵盐析：将超滤后的滤液调节pH至6.5，向滤液中加入硫酸铵至饱和度25％， 4℃静置8-10h，然后在4℃、8000r/min离心机中离心10min，去除底部沉淀，收集上清液； 调节上清液pH8.5，添加硫酸铵至饱和度70％，4℃静置8-10h后冷冻并离心收集沉淀蛋白； 0.02mol／L、pH7.5的Tris-HCl缓冲溶液溶解沉淀，并充分透析； (4)、真空冷冻干燥：将透析后的酶液20kDa的超滤膜超滤，浓缩6-10倍，加入保护剂 1-2％海藻酸钠、2-3％蔗糖、3-5％麦芽糊精、0.1-0.25％山梨酸钾和0.1-0.4％苯甲酸钠； 经充分分散后，-20℃冷冻8-10h、真空度30-50Pa，温度-35℃以下、冷冻15-18h，再经粉碎即制得弹性蛋白酶酶制剂成品。 [0011] 根据以上本发明提出的一种利用微生物液态发酵生产弹性蛋白酶酶制剂的方法，现以生产固体酶制剂酶活力达到2512u／g的弹性蛋白酶酶制剂成品为例，进一步说明本发明的具体实施方式。 [0012] 实施例1：发酵种子液的制备。 [0013] 1、菌种的活化：将保藏的地衣芽孢杆菌在菌种活化培养基上划线两次，均在37℃培养箱中培养 18-24h，第二次划线以第一次划线得到的单菌落为菌种。然后从第二次划线的平板上挑选单菌落接入液体菌种活化培养基或固体菌种活化培养基，培养温度37℃、时间180-200r/min、摇瓶培养OD600至1D600； 2、制备地衣芽孢杆菌种子液： 从活化好的液体试管菌中取2-4ml菌液接入装有40-80mL种子培养基的500mL三角瓶中，35-37℃，160-180r／min摇床震荡培养18-24h，作为种子液。 [0014] 种子培养基(g／L)：0.4牛肉膏、0.8蛋白胨、1酵母粉、0.5NaCl、0.1KH2PO4、0.04MgSO4·7H2O，加蒸馏水100mL，在pH7.0、温度121℃条件下灭菌20min。 [0015] 实例2、摇瓶发酵培养方法。 [0016] 将培养好的种子培养液以2％-8％(v／v)的接种量，接种至装有30-40mL发酵培养基的250ml三角瓶中，160-180r／min摇床震荡培养。发酵温度采用分阶段控制方法，即发酵前6-10h控制温度为35-37℃，10h后切换至26-30℃并保持到发酵结束；基于发酵过程中不同pH对菌体比生长速率及比产物合成速率的影响，通过发酵优化试验确定了pH两阶段控制方法，即0-10h时控制发酵液pH7.0-7.5，10h到发酵结束将pH保持在7.5-8.5；pH控制为滴加酸碱溶液的方法。采用摇瓶发酵方法所得的酶活力为：212u／ml。 [0017] 摇瓶发酵培养基配方(g／L)：15豆饼粉、12麸皮、6蛋白胨、12玉米粉、23玉米浆、6干酪素、16葡萄糖、2(NH4)2SO4、1.5K2HPO4·H2O、1吐温-80、5麦芽糖、0.1MgSO4·7H2O、0.5CaCl2，在pH7.5、温度121℃条件下灭菌20min。 [0018] 实例3：深层液体通风发酵种子液培养方法同实施例2。 [0019] 发酵罐灭菌前，按照1∶1000的比例加入消泡剂；通过发酵罐夹层升温到98℃，然后直接将蒸汽通入发酵罐中，温度升至121℃、保温30min后，逐渐降温至30-35℃；通入无菌空气，整个发酵过程发酵罐压力维持在0.04Mpa；将培养活化好的种子培养液以3-6％(v／v)的接种量，接种至装有10L(装液系数0.67)发酵培养基的发酵罐中，发酵初始至发酵14h，通风量控制在0.55vvm；发酵14-24h，通风量控制为0.75vvm.发酵25h到发酵结束通风控制为0.6vvm；发酵温度控制为：发酵0-30h温度控制在34-36℃，30h后至发酵过程结束控制在25-30℃；发酵pH的控制方法为：整个发酵过程保持pH在7.5-8.0之间，发酵30h后，通过补加碳源调节pH在以上范围内；发酵过程采用分批补料方法，发酵第25h补加浓度为100g／L的葡萄糖溶液80ml；发酵30h，再次补加相同浓度的葡萄糖溶液100ml；发酵35h，补加浓度为100g／L的豆饼粉乳浊液150ml。通过该深层液体通风发酵方法，发酵液酶活达到352U／ml； 发酵罐初始发酵培养基组成为(g／L)：15豆饼粉、12麸皮、4蛋白胨、8玉米粉、23玉米浆、16葡萄糖、2(NH4)2SO4、1.5K2HPO4·H2O、1吐温-80、0.1MgSO4·7H2O、0.5CaCl2，在pH7.5、温度121℃条件下灭菌20min。 [0020] 实例4：发酵液中弹性蛋白酶酶制剂的制备1、收集发酵结束的发酵液：采用冷冻离心机在4℃、8000r／min的条件下离心10min，去除底部菌体等固体残渣，收集上清液为初始粗酶液； 2、超滤浓缩：将离心过后的上清液用截留分子质量为60kDa的超滤膜进行过滤，保留滤出液，然后滤出液再通过截留分子量为20kDa的超滤膜过滤，滤液浓缩3-5倍，保存截留液； 3、硫酸铵盐析：将超滤后的滤液调节pH至6.5，然后再在低温0-4℃下，向分级超滤后的pH6.5的滤液中加入粉状的硫酸铵至饱和度25％，添加过程是在磁力搅拌器上边搅拌边添加，避免产生大量泡沫；硫酸铵完全溶解后，4℃静置8-10h，然后采用冷冻离心机，在 4℃、8000r／min的条件下离心10min，去除底部沉淀的杂蛋白，收集上清液；调节收集的上清液pH8.5，然后按照相同的方法向收集的上清液中添加硫酸铵至饱和度70％，4℃静置 8-10h后冷冻离心收集沉淀蛋白；取0.02mol／L、pH7.5的Tris-HCl缓冲溶液溶解沉淀，溶解液透析袋4℃透析10-14h，中间换水4-6次； 4、真空冷冻干燥：透析后的酶液再通过截留分子量为20kDa的超滤膜超滤，浓缩 6-10倍，加入保护剂1-2％海藻酸钠、2-3％蔗糖、3-5％麦芽糊精、0.1-0.25％山梨酸钾、 0.1-0.4％苯甲酸钠，并将各保护剂充分分散均匀，-20℃冷冻8-10h，粗酶液完全结冰，再在真空度30-50Pa、温度为-35℃条件下冷冻15-18h；干燥完成后，经粉碎，即得到弹性蛋白酶酶制剂。本发明制备的弹性蛋白酶酶制剂总酶活收率达到80％以上、本发明所得的成品酶活力2512u／g。 [0021] 实施例2-4中酶活性测定方法如下： |
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