프로테아제 효소 및 이의 용도

프로테아제 효소 및 이의 용도 {PROTEASE ENZYME AND USES THEREOF}

본 발명은, 다양한 용도, 특히 세제에 유용한 세린 프로테아제 효소, 특히 진균 세린 프로테아제 효소에 관한 것이다. 본 발명은, 상기 효소를 암호화하는 핵산 분자, 재조합 벡터, 상기 효소의 생성을 위한 숙주 세포, 상기 효소를 포함하는 효소 조성물뿐만 아니라 이러한 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 상기 효소의, 그리고 상기 효소를 포함하는 조성물의 다양한 용도에 관한 것이다.

미생물 프로테아제는 가장 중요한 가수분해 효소들 중에 속하며, 세제, 식품, 피혁, 제약, 진단제, 폐기물 관리 및 은 회수와 같은 다양한 산업 분야에서 응용되고 있다. 미생물 세포외 프로테아제는 전 세계의 산업적 효소 판매의 주요 부분을 차지한다(Cherry and Fidantsef, 2003). 시판되고 있는 프로테아제의 약 90%는 세제 효소이다 (Gupta et al., 2002). 현재 시판되어 사용되고 있는 세제 제제는 바실러스( Bacillus ) 종 기원의 서브틸리신 계열 또는 서브틸리신(EC 3.4.21.62)의 자연 발생 알칼리성 세린 프로테아제(EC 3.4.21)를 포함하거나 이의 재조합 프로테아제 제제이다(Maurer, 2004).

시판되고 있는 프로테아제의 예로는 서브틸리신 칼스버그(알칼라제®(Alcalase®)), 서브틸리신 309(사비나제®(Savinase®)), 서브틸리신 147(에스페라제®(Esperase®)), 칸나제(Kannase®), 에버라제®(Everlase®), 오보자임®(Ovozyme®), 및 냉-세척 프로테아제 폴라자임®(Polarzyme®)(Novozymes A/S, DK), 퓨라펙트®(Purafect®), 퓨라펙트® Ox, 퓨라펙트® 프라임 및 프로페라제®(Properase®)(Genencor Int., Inc., USA), 및 BLAP S 및 X 시리즈 (Henkel, DE)를 들 수 있다.

또한, 몇몇의 알칼리성 세린 프로테아제 및 이들 효소를 암호화하는 유전자는 효모 및 사상 진균을 포함한 진핵 유기체로부터 분리되었다. 미국 특허 제3,652,399호 및 EP 519229(Takeda Chemical Industries, Ltd., JP)는 푸사리움( Fusarium ) 속[무성 상태(asexual), 완전 세대(telemorph)] 또는 지베렐라( Gibberella ) 속[유성 상태(sexual), 불완전 세대(anamorph)], 특히 푸사리움 종 S-19-5(ATCC 20192, IFO 8884), 에프. 옥시스포룸( F. oxysporum ) f. sp. lini (IFO 5880) 또는 지. 사우비네티( G. saubinetti )(ATCC 20193, IFO 6608)로부터 유래되고 세제 및 다른 세정제 조성물의 제형에 유용한 알칼리성 프로테아제를 기재하고 있다. WO 1994025583 (NovoNordisk A/S, DK)는 푸사리움 종, 특히 에프. 옥시스포룸 균주(DSM 2672)로부터 유도가능한 활성 트립신-유사 프로테아제 효소 및 이를 암호화하는 DNA 서열을 기재하고 있다. 에프. 에퀴세티( F. equiseti ) 및 에프. 아쿠미나툼( F. acuminatum ) 유래의 세린 프로테아제의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 각각 WO 2010125174 및 WO 2010125175에 기재되어 있다(AB Enzymes Oy, FI). 또한, 진균 종, 예를 들면, 트리티라치움( Tritirachium ) 및 코니디오볼루스( Conidiobolus ) 유래의 알칼리성 프로테아제가 보고되었다[문헌(Anwar and Saleemuddin 1998)에서 검토됨].

액체 세제에서 프로테아제의 용도에 있어서의 주요 문제점은 이들의 불안정성이다. 액체 세제에서, 효소는 물, 및 비가역적 변성을 유발할 수 있는 음이온성 계면활성제 및 착화제와 같은 카오트로픽 제제(chaotropic agent)와 직접 접촉하게 된다. 프로테아제는 세제 제형 중의 기타 효소 및 자신들을 포함하는 단백질을 분해한다. 상기 자가-단백질 가수분해는 계면활성제 및 열에 의해 증진된다. 따라서, 프로테아제를 함유하는 액체 세제의 안정성은 제품 개발을 위한 주요 과제를 나타낸다(Maurer, 2010).

산업적 세린 프로테아제의 안정성을 개선시키기 위한 다양한 방법이 사용되어 왔다. WO 92/03529(NovoNordisk A/S, DK), US 2009/096916 (Genencor Int. Inc., US) 및 WO 2007/145963(Procter & Gamble Co., US)은 펩타이드 또는 단백질 유형의 가역적 프로테아제 억제제의 용도를 기재하고 있다. 프로테아제를 포함하는 액체 세제 조성물은 종종 폴리올의 존재 또는 부재하에 프로테아제의 활성을 억제하기 위한 붕산과 같은 프로테아제 억제제를 포함한다. 상기 억제제의 한 예로는 US 2010/0120649(Novozymes A/S, DK)에 기재된 4-포르밀 페닐 보론산(4-FPBA)이 있다. 프로테아제의 안정성은 또한 폴리올과 할라이드 염의 배합물을 사용함으로써 개선되어 왔다(WO 02/08398, Genencor Int. Inc., US). EP 0352244A2(NovoNordisk A/S, DK)는 계면활성제와 같은 양쪽성 화합물을 사용하여 바실러스( Bacillus ) 유도된 효소의 안정성을 개선시킴을 시사한다.

결정 구조로부터 유도된 정보 및 상동성 단백질간의 서열 유사성 비교에 기초하여, 안정성 및/또는 성능이 개선된 변이체를 고안할 수 있다. 촉매 효율이 개선되고/되거나 온도, 산화제 및 상이한 세척 조건에 대한 안정성이 보다 양호하고 액체 세제에서의 저장 안정성이 개선된 천연 세린 프로테아제의 변이체는 부위-지 돌연변이유발 및/또는 무작위 돌연변이유발을 통해 개발되었다.

세포외 알칼리성 엔도펩티다제로서 분리된 써모마이콜린(Thermomycolin) EC 3.4.21.65는 호열성 진균 말브란케아 풀셀라 변이체 설푸레아( Malbranchea pulcella var. sulfurea)에 의해 생성된다. 써모마이콜린은 325개 잔기의 단일쇄 단백질로서 기재되어 있다. 이것은 활성-부위 서열 ― Leu-Ser-(Gly)-Thr-Ser*-Met-을 갖고 이러한 서열은 서브틸리신 계열의 구성원에게는 전형적인 것이다. 써모마이콜린은 예외적으로 1개의 디설파이드 브릿지를 갖고 있다. 써모마이콜린은 호열성 세균의 세포외 세린 프로테이나제만큼 열에 안정하지 않지만 대부분의 진균 프로테이나제보다는 더 안정하다(문헌참조: Gaucher and Stevenson, 2004). 옹(Ong) 및 가우처(Gaucher)(1975)에 따르면, 써모마이콜린의 열 불활성화는 10mM Ca ²⁺ 의 존재하에 73℃에서 발생한다. 써모마이콜린은 광범위한 pH 범위상에서 카제인을 가수분해한다. 카제인의 가수분해를 위한 최적 pH는 약 8.5이다.

문헌[Abu-Shady et al. (2001)]은 이집트의 도축장으로부터 수거되어 프로테아제 효소를 수득하기 위해 배양된, 토양 샘플 유래의 국부적 분리물(local isolate)인 말브란케아 설푸레아( Malbranchea sulfurea ) 유래의 프로테아제 성질을 기재하고 있다. 상기 공개문헌은 15 내지 60분의 예비항온처리 시간을 사용한 30 내지 90℃에서 저농도(0.7%)의 특정 세제의 존재하에, 즉, 세척 조건과 유사한 조건에서 엠. 설푸레아 프로테아제의 상대적 활성을 기재하고 있다. 그러나, 이것은 세제 제형 중에 프로테아제를 사용하기에 적합한 필수 성질인 세제 자체에서의 상기 프로테아제의 저장 안정성 또는 얼룩 제거 성능의 임의의 지표를 제공하는 것은 아니다. 상기 공개문헌은 또한 부분적으로 정제된 프로테아제의 온도 및 pH 프로필을 기재하고 있다. 프로테아제의 최적 온도는 50℃이고 최적 pH는 9.0이다.

다양한 미생물 유래의 진균 세린 프로테아제, 예를 들면 액티노마이세테( actinomycete )(노카르디옵시스 다손빌레이( Nocardiopsis dassonvillei )) 및 진균(패실로마이세스 마르쿠안디( Paecilomyces marquandii )) 미생물 유래의 저온 알칼리성 프로테아제가 기술되어 있는 많은 특허 공보, 평론 및 논문[예를 들면, EP 0290567 및 EP 0290569(Novo Nordisk A/S, DK)]이 공개되어 있다는 사실에도 불구하고, 상이한 얼룩의 단백질성 물질을, 특히 저온 또는 중온의 온도 범위에서 변형, 분해 및 제거하는데 적합하고 효과적이며 고도로 다양한 성질을 갖는 세제의 존재 하에서 안정한 새로운 프로테아제에 대한 상당한 필요성이 여전히 남아 있다. 세린 프로테아제의 자가촉매 성질로 인해, 저장 동안의 안정성도 매우 중요하다.

또한, 상기 세린 프로테아제는 다량으로 생산될 수 있고 발효 브로쓰(fermentation broth) 및 균사체로부터 쉽게 분리하여 저렴하게 다운스트림에서 처리될 수 있는 것이 바람직할 수 있다.

발명의 요약

본 발명의 목적은, 광범위 pH 범위에서 활성이며, 특히 저온 및 중온에서 양호하게 기능하는 진균 기원의 세린 프로테아제를 제공하는 것이다. 세제 응용을 위한 세린 프로테아제는 또한 세제의 존재시에 안정해야 하고 세제와 혼화성이어야 한다. 특히, 본 발명의 목적은, 세탁물 및 접시 세척시 얼룩을 포함한 단백질성 물질을, 시판되고 있는 효소 제제보다 낮은 온도에서 제거함으로써, 예를 들면, 보다 민감한 물질이 세척될 수 있고 에너지를 절감시킬 수 있는 세린 프로테아제를 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 목적은, 상기 효소를 암호화하는 핵산 분자, 재조합 벡터, 상기 효소를 제조하기 위한 숙주 세포, 상기 효소를 포함하는 조성물, 상기 조성물의 제조 방법, 및 상기 효소의, 그리고 상기 효소를 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 진균 세린 프로테아제는, 고수율의 진균 숙주에서 생성될 수 있고 이의 다운스트림 프로세싱, 예를 들면, 발효 브로쓰 및 균사체의 분리는 수행하기에 용이하다.

본 발명은, 세린 프로테아제 활성을 갖고 서열번호 18에 정의된 아미노산 서열과 66% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 진균 세린 프로테아제 효소에 관한 것이다. 바람직한 세린 프로테아제는 말브란케아 신나모메아( Malbranchea cinnamomea )(Lib.) 오르스코트 데 후그( Oorschot de Hoog )로부터 유도된다.

본원에서 " 로부터 유도되는 "은 미지의 유기체 균주에 의해 생성되거나 생성될 수 있는 세린 프로테아제뿐만 아니라 상기 균주로부터 분리된 DNA 서열에 의해 암호화되고 상기 DNA 서열로 형질전환된 숙주 유기체에서 생성되는 세린 프로테아제를 나타내는 것으로 의도된다. 최종적으로, 상기 용어는 합성 및/또는 cDNA 기원의 DNA 서열에 의해 암호화되고 미지의 세린 프로테아제의 동정 특성을 갖는 세린 프로테아제를 나타내는 것으로 의도된다.

바람직하게, 본 발명은 세린 프로테아제 활성을 갖고, 서열번호 18에 정의된 성숙한 말브란케아( Malbranchea ) ALKO4122 프로테아제의 아미노산 서열 또는 서열번호 18에 정의된 성숙한 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 아미노산 서열과 66% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 진균 세린 프로테아제 효소에 관한 것이다.

본 발명의 진균 세린 프로테아제 효소는 말브란케아, 바람직하게는 말브란케아 신나모메아(Lib.) 오르스코트 데 후그(말브란케아 풀켈라 변이체 설푸레아(Miehe)의 동의어, Cooney & R. Emers.)로부터 수득할 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에 따라, 본 발명의 세린 프로테아제 효소는 수탁번호 CBS 128533하에 기탁된 말브란케아 ALKO4122 균주 또는 수탁번호 CBS 128564하에 기탁된 균주 말브란케아 ALKO4178로부터 수득할 수 있다. 말브란케아 ALKO4178의 프로테아제 효소는 근본적으로 말브란케아 ALKO4122 균주의 프로테아제 효소와 동일하다.

진균 세린 프로테아제 효소는 20 내지 35kDa의 분자량을 갖는다. 이 효소의 최적 온도는 pH 8.5에서 30℃ 내지 80℃의 범위 내이고, 바람직하게는 약 70℃이다. 이 효소의 최적 pH는 50℃에서 적어도 pH 6 내지 pH 10의 범위 내이고, 바람직하게는 pH 10이다. 온도 및 pH 특성은 30분의 반응 시간과 기질로서 카제인을 사용하여 측정되었다.

본 발명의 진균 세린 프로테아제는 0℃ 내지 90℃, 바람직하게는 5℃ 내지 60℃, 특히 바람직하게는 10 내지 40℃의 온도에서 세제의 존재 하에 단백질성 얼룩을 분해 또는 제거할 수 있다.

본 발명의 진균 세린 프로테아제 효소는, 엄중 조건하에서 수탁번호 DSM 24426하에 이. 콜라이 RF8758로 기탁된 뉴클레오타이드 서열번호 11을 포함한 플라스미드 pALK3092에 포함된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 성숙한 ALKO4122 프로테아제 서열번호 17을 암호화하는 서열과 하이브리드화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 대안으로, 본 발명의 진균 세린 프로테아제 효소는, 엄중 조건하에서 수탁번호 DSM 24427하에 이. 콜라이 RF8759로 기탁된 뉴클레오타이드 서열 서열번호 12를 포함하는 플라스미드 pALK3093에 포함된 폴리뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.

상기 효소는, 서열번호 18로 정의된 성숙한 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 아미노산 서열 또는 서열번호 18로 정의된 성숙한 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 아미노산 서열과 66% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 바람직하게는, 상기 효소는 뉴클레오타이드 서열번호 17을 포함하는 분리된 핵산 분자에 의해 암호화된다.

본 발명의 전장 진균 세린 프로테아제 효소는 수탁번호 DSM 24410하에 에스케리키아 콜라이 RF8791로 기탁된 pALK3094에 포함된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.

진균 세린 프로테아제 효소는, 적합한 숙주에서 세린 프로테아제 효소의 발현을 지시할 수 있는 조절 서열에 작동적으로 연결된 본 발명의 진균 세린 프로테아제를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터로부터 생성된다. 적합한 숙주로는 이종 숙주, 바람직하게는 트리코더마( Trichoderma ), 아스퍼질러스( Aspergillus ), 푸사리움( Fusarium ), 후미콜라( Humicola ), 크리소스포리움( Chrysosporium ), 뉴로스포라( Neurospora ), 리조푸스( Rhizopus ), 페니실리움( Penicillium ), 마이셀리오프토라( Myceliophthora ) 및 모르티리엘라( Mortiriella ) 속의 미생물 숙주를 포함한다.

바람직하게는 상기 효소는 트리코더마 또는 아스퍼질러스에서 생성되며, 가장 바람직하게는 티. 리세이( T. reesei )에서 생성된다.

또한, 본 발명은,

(a) 세린 프로테아제 활성을 갖고 서열번호 18로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자;

(b) 세린 프로테아제 활성을 갖고 서열번호 18의 아미노산 서열과 66% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자;

(c) 서열번호 17로 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 암호화 서열을 포함하는 핵산 분자;

(d) DSM 24410에 함유된 폴리뉴클레오타이드 서열의 암호화 서열을 포함하는 핵산 분자;

(e) 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 상기 (c) 또는 (d) 중 어느 하나의 핵산 분자의 암호화 서열과 암호화 서열이 상이한 핵산 분자; 및

(f) 엄중 조건하에서 DSM 24426에 함유된 핵산 분자와, 또는 세린 프로테아제 활성을 갖고 서열번호 18로 정의된 아미노산 서열과 66% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열번호 17과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 세린 프로테아제 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 적합한 숙주에서 상기 세린 프로테아제 유전자의 발현을 지시할 수 있는 조절 서열에 작동적으로 연결된 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 적합한 숙주로는 이종 숙주, 바람직하게는 트리코더마, 아스퍼질러스, 푸사리움, 후미콜라, 크리소스포리움, 뉴로스포라, 리조푸스, 페니실리움, 마이셀리오프토라 및 모르티리엘라 속의 미생물 숙주가 포함된다. 바람직하게, 상기 효소는 트리코더마 또는 아스퍼질러스에서 생성되며, 가장 바람직하게는 티. 리세이에서 생성된다.

또한, 본 발명은 상기된 바와 같이 재조합 발현 벡터를 포함한 숙주 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 사상 진균과 같은 미생물 숙주이다. 바람직한 숙주는 트리코더마, 아스퍼질러스, 푸사리움, 후미콜라, 크리소스포리움, 뉴로스포라, 리조푸스, 페니실리움, 마이셀리오프토라 및 모르티리엘라 속의 진균이다. 더욱 바람직하게는, 숙주는 트리코더마 또는 아스퍼질러스이며, 가장 바람직하게는 사상 진균인 티. 리세이이다.

본 발명은 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명의 핵산 서열에 의해 암호화된 세린 프로테아제 활성을 갖고 상기된 방법에 의해 수득될 수 있는 폴리펩타이드가 본 발명에 속한다.

본 발명은, 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 상기 세포로부터 폴리펩타이드를 회수하거나 배양 배지로부터 상기 세포를 분리하는 단계, 및 상청액을 수득하는 단계를 포함하는 효소 제제의 수득 방법에 관한 것이다. 또한, 상기된 방법에 의해 수득할 수 있는 효소 제제는 본 발명에 속한다.

본 발명은, 본 발명의 세린 프로테아제 효소를 포함한 효소 제제에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 세린 프로테아제 효소를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 효소 제제 또는 본 발명의 프로테아제 효소를 함유하는 조성물(예를 들면, 세제 제형)는 또한 조정제의 존재 또는 부재 하에 프로테아제(본 발명의 프로테아제 이외의 다른 프로테아제), 아밀라제, 셀룰라제, 리파제, 크실라나제, 만난아제, 큐티나제, 펙티나제 또는 옥시다제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다른 효소뿐만 아니라, 안정화제, 완충제, 계면활성제, 표백제, 조정제(mediator), 방식제(anti-corrosion agent), 빌더(builder), 재침착 방지제(anti-redeposition agent), 광학 증백제(optical brightener), 염료, 안료, 향료, 부식제, 마모제 및 보존제 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적합한 첨가제도 포함할 수 있다.

생산 숙주의 소비된 배양 배지는 그대로 사용할 수 있거나, 숙주 세포를 제거하고/하거나 배양 배지를 농축, 여과 또는 분별하여 사용할 수 있다. 또한, 배양 배지는 건조될 수 있다. 본 발명의 효소 제제 및 상기 세린 프로테아제 효소를 포함하는 조성물은 액상, 분말, 과립 또는 정제 형태일 수 있다. 상기 효소는 상기 제제내 또는 상기 조성물내 고정화된 형태일 수 있다.

또한, 본 발명의 세린 프로테아제 효소 또는 효소 제제를 세제로, 섬유 처리제로, 울, 모발, 피혁, 실크와 같은 단백질성 물질의 처리제로, 식품 또는 사료 처리제로, 또는 단백질성 물질의 변성, 분해 또는 제거와 관련된 임의의 응용에 사용하기 위한 용도는 본 발명에 속한다. 특히, 본 발명의 효소 또는 효소 제제는 액체 세제, 분말 세제 및 정제 세제 중의, 세제 첨가제로서 유용하다.

도 1 (도 1a 및 도 1b)은 말브란케아 ALKO4122 프로테아제 유전자의 뉴클레오타이드 서열, 이의 부분 프로모터(ATG로부터 업스트림의 50개 뉴클레오타이드) 및 종결 서열(정지 코돈으로부터 다운스트림의 60개 뉴클레오타이드) 및 상기 암호화된 프로테아제의 추론된 아미노산 서열을 도시한다. SignalP V3.0 프로그램에 의해 분석되는 추정 신호 펩타이드는 소문자로 밑줄그어 나타낸다. 프로 서열 및 프로 서열의 추론된 아미노산은 소문자로 나타낸다. 상기 성숙한 뉴클레오타이드 및 펩타이드 서열은 대문자로 나타낸다. 3개의 추정 인트론 서열은 소문자 및 이탤릭 문자로 나타내고 상기 뉴클레오타이드 서열 아래에 점선으로 표시한다. 상기 정지 코돈은 서열 아래에 별표로 나타낸다. 말브란케아 ALKO4178 프로테아제 유전자의 PCR 클로닝에 사용되는 프라이머 DET27(5'-센스 프라이머, s) 및 DET28(3'-안티센스 프라이머, as)의 위치는 이중선을 사용하여 밑줄그어져 있다.
도 1a 는 말브란케아 ALKO4122 프로테아제 유전자 및 이의 부분 프로모터의 뉴클레오타이드 서열을 도시한다. 상기 프로테아제 유전자 서열은 51번 내지 960번의 뉴클레오타이드, Met 1 내지 Val 279의 아미노산 서열을 암호화하는 서열 영역 및 상기 프로테아제의 Ala 280의 제1 코돈을 포함한다.
도 1b 는 말브란케아 ALKO4122 프로테아제 유전자 및 이의 부분 종결자의 뉴클레오타이드 서열을 도시한다. 상기 프로테아제 유전자 서열은 961번 내지 1486번의 뉴클레오타이드(정지 코돈 TAA가 포함됨) 및 프로테아제의 Ala 280(마지막 2개의 코돈) 내지 Arg 401의 아미노산 서열을 암호화하는 서열 영역을 포함한다.
도 2 는 pALK3097 발현 카세트를 작제하기 위한 골격으로 사용되는 pALK2777 플라스미드의 맵을 도식적으로 나타낸다. 상기 말브란케아 프로테아제 유전자는 cbh1(cel7A) 프로모터(SacII 부위를 통한 정확한 융합)와 종결 서열(링커내 BamHI 부위를 통해) 사이에서 SacII - BamHI 절단된 pALK2777에 라이게이션하였다. 추가의 세부 사항에 대해, 실시예 2를 참조한다. pALK2777 플라스미드는 형질전환체 스크리닝을 위한 합성 amdS 마커 유전자, pcbh1, cbh1 프로모터; tcbh1, cbh1 종결자; s_amdS, 합성 amdS 마커 유전자(cDNA); 링커, 예를 들면, BamHI 부위를 포함하는 링커 서열을 포함한다.
도 3 은 NotI 분해에 의해 벡터 골격으로부터 분리되고 트리코더마 리세이에서 말브란케아 ALKO4122 프로테아제 유전자를 발현하기 위해 사용되는 pALK3097 카세트, pcbh1, cbh1 프로모터; tcbh1, cbh1 종결자; s_amdS, 합성 amdS 마커 유전자(cDNA); 링커, 링커 서열을 도시한다.
도 4 는 12% SDS PAGE 겔상에서 분석되는 부분적으로 정제된 재조합 단백질을 도시한다. 레인 1. 부분적으로 정제된 말브란케아 프로테아제의 샘플, 레인 2. MW 마커(Page Ruler Unstained Protein Ladder, Fermentas).
도 5 (도 5a 및 도 5b)는 상이한 온도 및 pH 값에서의 효소의 상대적 활성을 도시한다.
도 5a 는 30분 반응 시간, 및 기질로서 카제인을 사용할 때 pH 8.5에서 검정되는 재조합 말브란케아 프로테아제 및 사비나제® 16L의 온도 프로필을 기재하고 있다. 상기 데이터 값은 3개의 별도 측정치의 평균값이다.
도 5b 는 재조합 말브란케아 프로테아제 및 사비나제® 16L의 활성에 대한 pH 효과를 기재하고 있다. 사용되는 완충액은 40mM 브리톤-로빈슨(Britton-Robinson) 완충액이었고, 카제인은 기질로서 사용되었고, 반응 시간은 30분이었고, 반응 온도는 50℃이었다. 상기 데이터 값은 3개의 별도 측정치의 평균값이다.
도 6 (도 6a, 도 6b, 도 6c 및 도 6d)은 농도가 5g/l인 시판되고 있는 액체 세제의 존재하에 10 내지 50℃, 약 pH 8, 60분에서 혈액/밀크/잉크 얼룩(Art.117, CO+PES, 시리얼 번호 11-08, 새로운 배치, EMPA)을 이용한 재조합 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 얼룩 제거 성능을 기재한다. 시판 프로테아제 제제 사비나제® 16L 및 사비나제® 울트라 16L은 비교용으로 사용되었다.
도 6a 는 10℃에서의 얼룩 제거 성능을 기재한다.
도 6b 는 20℃에서의 얼룩 제거 성능을 기재한다..
도 6c 는 30℃에서의 얼룩 제거 성능을 기재한다.
도 6d 는 50℃에서의 얼룩 제거 성능을 기재한다.
도 7 (도 7a, 도 7b, 도 7d 및 도 7c)은 농도가 5g/l인 시판 액체 세제의 존재하에 10 내지 50℃, 약 pH 8, 60분에서 혈액/밀크/잉크 얼룩(Art.117, CO+PES, 시리얼 번호 10-07, 오래된 배치, EMPA)을 이용한 재조합 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 얼룩 제거 성능을 기재한다. 사비나제® 울트라 16L은 비교용으로 사용되었다.
도 7a 는 10℃에서의 얼룩 제거 성능을 기재한다.
도 7b 는 20℃에서의 얼룩 제거 성능을 기재한다.
도 7c 는 30℃에서의 얼룩 제거 성능을 기재한다.
도 7d 는 50℃에서의 얼룩 제거 성능을 기재한다.
도 8 (도 8a, 도 8b, 도 8c 및 도 8d)는 농도가 5g/l인 시판 액체 세제의 존재하에 10 내지 50℃, 약 pH 8, 60분에서 혈액/밀크/잉크 얼룩(Art.117, CO+PES, 시리얼 번호 11-08, 새로운 배치, EMPA)을 이용한 재조합 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 얼룩 제거 성능을 기재한다. 사비나제® 16L 및 사비나제® 울트라 16L은 비교용으로 사용되었다.
도 8a 는 10℃에서의 얼룩 제거 성능을 기재한다(효소 용량은 단백질로서 계산됨).
도 8b 는 20℃에서의 얼룩 제거 성능을 기재한다(효소 용량은 단백질로서 계산됨).
도 8c 는 30℃에서의 얼룩 제거 성능을 기재한다(효소 용량은 단백질로서 계산됨).
도 8d 는 50℃에서의 얼룩 제거 성능을 기재한다(효소 용량은 단백질로서 계산됨).
도 9 (도 9a, 도 9b, 도 9c, 도 9d, 도 9e, 도 9f, 도 9g 및 도 9h)는 농도가 5g/l인 시판 액체 세제의 존재하에 30 및 60℃, 60분, 약 pH 8에서 세탁 측정 시험(Launder Ometer tests)에서 상이한 얼룩에 대한 재조합 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 성능을 보여준다. 시판 제제 사비나제® 울트라 16L은 비교용으로 사용되었다.
도 9a 는 30℃에서의 풀, 면, Art.164(시리얼 번호 23-03), EMPA에 대한 성능을 보여준다.
도 9b 는 60℃에서의 풀, 면, Art.164(시리얼 번호 23-03), EMPA에 대한 성능을 보여준다.
도 9c 는 30℃에서의 혈액/밀크/잉크, 면, Art.116(시리얼 번호 18-16), EMPA에 대한 성능을 보여준다.
도 9d 는 60℃에서의 혈액/밀크/잉크, 면, Art.116(시리얼 번호 18-16), EMPA에 대한 성능을 보여준다.
도 9e 는 30℃에서의 혈액/밀크/잉크, CO+PES, Art.117(시리얼 번호 11-08, 새로운 배치), EMPA에 대한 성능을 보여준다.
도 9f 는 60℃에서의 혈액/밀크/잉크, CO+PES, Art.117(시리얼 번호 11-08, 새로운 배치), EMPA에 대한 성능을 보여준다.
도 9g 는 30℃에서의 혈액/밀크/잉크, CO+PES, Art.117(시리얼 번호 10-07, 오래된 배치), EMPA에 대한 성능을 보여준다.
도 9h 는 60℃에서의 혈액/밀크/잉크, CO+PES, Art.117(시리얼 번호 10-07, 오래된 배치), EMPA에 대한 성능을 보여준다.
도 10 (도 10a 및 도 10b)은 세제 분말의 존재하에 프로테아제의 성능을 보여준다.
도 10a 는 시판되고 있는 통상적인 세제 분말(실시예 8에 기재됨) 5g/l의 존재하에 50℃, 60분, 약 pH 10.5에서 혈액/밀크/잉크, CO+PES, Art. 117(시리얼 번호 11-08), EMPA에 대한 재조합 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 성능을 기재한다. 사비나제® 울트라 16L은 비교용으로 사용되었다.
도 10b 는 세제 분말 Art. 601, EMPA 5g/l의 존재하에 50℃, 60분, 약 pH 10에서 혈액/밀크/잉크, CO+PES, Art. 117(시리얼 번호 11-08), EMPA에 대한 재조합 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 성능을 기재한다. 사비나제® 울트라 16L은 비교용으로 사용되었다.
도 11 (도 11a 및 도 11b)은 37℃에서 저장 동안에 프로테아제의 안정성을 보여준다.
도 11a 는 Proxel LV 또는 프로필렌 글리콜(PG)로 보존되고/안정화되는 경우 37℃에서 저장 동안에 재조합 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 안정성을 보여준다.
도 11b 는 Proxel LV 또는 프로필렌 글리콜로 보존되고/안정화되는 경우 37℃에서 저장 동안에 재조합 프로테아제 Fe_RF6318(WO2010125174A1)의 안정성을 보여준다.
도 12 (도 12a 및 도 12b)는 세제 중에 프로테아제의 안정성을 보여준다.
도 12a 는 37℃, pH 약 7에서 에코라벨 표준 세제(Ecolabel Reference Detergent) 중에서 재조합 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 안정성을 보여준다. 시판 제제 사비나제® 울트라 16L 및 재조합 프로테아제 Fe_RF6318 (WO2010125174A1)은 비교용으로 사용되었다. 세제 중에 사용되는 효소 제제의 양은 4%(w/w)였다.
도 12b 는 37℃(약 pH 8)에서 시판 액체 세제 중에서의 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 안정성을 보여준다. 시판 제제 사비나제® 울트라 16L 및 재조합 프로테아제 Fe_RF6318(WO2010125174A1)은 비교용으로 사용되었다. 세제중에 사용되는 효소 제제의 양은 4%(w/w)였다.
서열 목록
서열번호 1 은 말브란케아 프로테아제 프로브 합성을 위해 PCR에 사용되는 DET1 센스 프라이머의 서열이다.
서열번호 2 는 말브란케아 프로테아제 프로브 합성을 위해 PCR에 사용되는 DET2 센스 프라이머의 서열이다.
서열번호 3 은 말브란케아 프로테아제 프로브 합성을 위해 PCR에 사용되는 DET3 안티센스 프라이머의 서열이다.
서열번호 4 는 말브란케아 프로테아제 프로브 합성을 위해 PCR에 사용되는 DET4 안티센스 프라이머의 서열이다.
서열번호 5 는 말브란케아 프로테아제 프로브 합성을 위해 PCR에 사용되는 DET5 센스 프라이머의 서열이다.
서열번호 6 은 DET1 센스 PCR 프라이머의 디자인을 위해 사용되는 컨센서스 펩타이드 서열의 서열이다.
서열번호 7 은 DET2 센스 PCR 프라이머의 디자인을 위해 사용되는 컨센서스 펩타이드 서열의 서열이다.
서열번호 8 은 DET3 안티센스 PCR 프라이머의 디자인을 위해 사용되는 컨센서스 펩타이드 서열의 서열이다.
서열번호 9 는 DET4 안티센스 PCR 프라이머의 디자인을 위해 사용되는 컨센서스 펩타이드 서열이다.
서열번호 10 은 DET5 센스 PCR 프라이머의 디자인을 위해 사용되는 펩타이드 서열의 서열이다.
서열번호 11 은 PCR 반응에서 DET5 및 DET4를 사용하고 주형으로서 말브란케아 ALKO4122 게놈 DNA를 사용하여 수득된 PCR 단편의 서열이다. 상기 단편은 부분적 말브란케아 프로테아제 유전자를 함유하고, 이는 플라스미드 pALK3092내의 삽입체이다.
서열번호 12 는 PCR 반응에서 DET5 및 DET4를 사용하고 주형으로서 말브란케아 ALKO4178 게놈 DNA를 사용하여 수득된 PCR 단편의 서열이다. 상기 단편은 부분적 말브란케아 프로테아제 유전자를 함유하고, 이는 플라스미드 pALK3093내의 삽입체이다.
서열번호 13 은 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 전장 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이다. 상기 전장 유전자는 플라미스미드 pALK3094에 포함된다. PCR에 의해 말브란케아 ALKO4178로부터 클로닝된 프로테아제 유전자 서열은 상기 서열과 동일하였다.
서열번호 14 는 전장 프로테아제의 아미노산 Met 1 내지 Arg 401을 포함하는 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 전장 아미노산 서열이다.
서열번호 15 는 프로효소(proenzyme) 형태의 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 16 은 전장 프로테아제의 아미노산 Gly 21 내지 Arg 401을 포함하는 프로효소 형태의 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 아미노산 서열이다.
서열번호 17 은 성숙한 형태의 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 18 은 전장 효소의 아미노산 Ala 121 내지 Arg 401을 포함하는 성숙한 형태의 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 아미노산 서열이다.
서열번호 19 는 말브란케아 ALKO4178 프로테아제 유전자의 클로닝을 위해 사용되는 PCR 센스 프라이머 DET27의 서열이다.
서열번호 20 은 말브란케아 ALKO4178 프로테아제 유전자의 클로닝을 위해 사용되는 PCR 안티센스 프라이머 DET28의 서열이다.
서열번호 21 은 pALK3097에서의 발현 카세트의 작제에 사용되는 PCR 센스 프라이머 DET17의 서열이다.
서열번호 22 는 pALK3097에서의 발현 카세트의 작제에 사용되는 PCR 안티센스 프라이머 DET18의 서열이다.
기탁
말브란케아 ALKO4122는 2010년 12월 20일에 네덜란드 우트레흐트 3508 아데 웁살랄란 8 소재의 센트랄뷔레아우 포르 스힘멜퀼튀레스(Centraalbureau Voor Schimmel cultures)에 기탁되었고 수탁번호 CBS 128533을 부여받았다.
말브란케아 ALKO4178은 2011년 1월 5일에 네덜란드 우트레흐트 3508 아데 웁살랄란 8 소재의 센트랄뷔레아우 포르 스힘멜퀼튀레스(Centraalbureau Voor Schimmel cultures)에 기탁되었고 수탁번호 CBS 128564를 부여받았다.
플라스미드 pALK3094를 포함하는 이. 콜라이 균주 RF8791은 2010년 12월 20일에 독일 데-3824 브라운슈바이크 인호펜슈트라쎄 7 베에 소재하는 도이췌 삼룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulture GmbH)에 기탁되었고 수탁번호 DSM 24410을 부여받았다.
플라스미드 pALK3092를 포함하는 이. 콜라이 균주 RF8758은 2010년 1월 3일에 독일 데-3824 브라운슈바이크 인호펜슈트라쎄 7 베에 소재하는 도이췌 삼룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulture GmbH)에 기탁되었고 수탁번호 DSM 24426을 부여받았다.
플라스미드 pALK3093을 포함하는 이. 콜라이 균주 FR8759는 2010년 1월 3일에 독일 데-3824 브라운슈바이크 인호펜슈트라쎄 7 베에 소재하는 도이췌 삼룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulture GmbH)에 기탁되었고 수탁번호 DSM 24427을 부여받았다.

본 발명은 진균 기원의 세린 프로테아제 효소를 제공한다. 상기 프로테아제는 세척시에 광범위 pH 범위에서 활성이고, 넓은 최적 온도를 가지며, 특히, 중온 및 고온에서뿐만 아니라 저온 범위에서도 우수한 성능을 갖는다. 효소는 세제 응용에 이상적이고, 전형적인 세제 조성물에 내성이며, 세제 용액 중의 낮은 효소 수준에서 효과적이다. 특히, 상기 프로테아제는 0℃ 내지 90℃의 적용 온도에서 활성이며, 바람직한 온도 범위는 5℃ 내지 60℃이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40℃이다. 본 발명의 프로테아제는 또한 액체 세제 조성물에서 매우 안정하다. 따라서, 본 발명은 세제 및 다른 응용, 특히 액체 제형에 사용하기 위한 새로운 세린 프로테아제를 제공한다. 진균 세린 프로테아제는 고수율의 진균 숙주 및 이의 다운스트림 공정(예를 들면, 발효 브로쓰와 균사체의 분리를 수행하기 용이하다)에서 생성될 수 있다.

특히, 본 발명은, 세린 프로테아제 활성을 갖고, 서열번호 18에 정의된 아미노산 서열과 66% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 세린 프로테아제 효소를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은, 세린 프로테아제 활성을 갖고 서열번호 18에 정의된 아미노산 서열을 포함하는, 진균 세린 프로테아제 효소를 제공한다. 바람직한 세린 프로테아제는 말브란케아 신나모메아(Lib.) 오르스코트 데 후그로부터 유도된다.

본 발명과 관련하여 사용된 용어 " 세린 프로테아제 " 또는 " 세린 엔도펩티다 제 " 또는 " 세린 엔도프로테이나제 "는 국제 생화학 및 분자생물학 협회의 명명법에 따라 EC 3.4.21로 분류된 효소를 의미한다.

프로테아제는 그룹 특이적 억제제를 사용하여 분류될 수 있다. 상기 다양한 그룹의 세린 프로테아제 억제제로는 합성 화학적 억제제 및 천연 단백질성 억제제가 포함된다. 따라서, 세린 프로테아제 활성은 특이적 기질의 절단을 기초로 하는 검정 또는 적합한 조건하에서 세린 프로테아제의 특이적 억제제의 존재 또는 부재하에 기질을 함유하는 임의의 단백질을 사용하는 검정에서 측정될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 " 세린 프로테아제 활성 "은 단백질 함유 기질, 예를 들면, 카제인, 헤모글로빈 및 BSA에 대한 가수분해 활성을 의미한다. 단백질가수분해 활성을 분석하는 방법은 문헌에 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[Gupta et al.(2002)]을 참조한다.

세린 프로테아제는 신호 서열(분비 신호 펩타이드 또는 프레펩타이드) 및 프로서열(프로펩타이드)의 제거에 의해 활성화되어 활성의 성숙한 형태의 효소가 얻어지는 프레프로효소 형태의 불활성 자이모겐 전구체 또는 자이모겐으로서 합성된다(Chen and Inouye, 2008). 상기 활성화 과정은 프로테아제의 작용을 포함하고, 예를 들면, 번역 후 생성 단계 동안에 또는 소비된 배양 배지에서 또는 배양 배지 또는 효소 제제의 저장 동안에 세린 프로테아제의 제한된 자기-분해 또는 자가촉매성 프로세싱으로부터 비롯될 수 있다. 프로효소의 활성화는 또한 숙주 유기체의 배양 동안에 또는 배양 후에 불활성 프로효소를 활성의 성숙한 효소로 전환시킬 수 있는 단백질가수분해 효소를 배양 배지에 첨가함으로써 달성할 수 있다. 효소의 단축은 또한 예를 들면, 생성 숙주를 형질전환시키기 전에, 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 절단시킴으로써 달성될 수 있다. 본 발명에서 세린 프로테아제의 " 프레프로-형태 "는 프레- 및 프로펩타이드를 포함하는 효소를 의미한다. " 프로-형태 "는 프로펩타이드를 포함하지만 프레펩타이드(신호 서열)가 결여되어 있는 효소를 의미한다.

상기 용어 " 성숙한 "은 신호 서열(프레펩타이드) 및 프로펩타이드의 제거 후 효소적 또는 촉매적 활성을 위한 필수 아미노산을 포함하는 세린 프로테아제 효소의 형태를 의미한다. 사상 진균에서, 이는 배양 배지로 분비되는 천연 형태이다. 성숙한 서열의 제1 아미노산은 분비된 프로테아제의 N-말단 서열분석에 의해 결정될 수 있다. 생화학적 데이터를 전혀 이용할 수 없는 경우에, N-말단의 위치는, 상기 아미노산 서열을 상동성 단백질(들)의 성숙한 아미노산 서열(들)과 정렬시킴으로써 평가할 수 있다. 상기 정렬은 예를 들면, ClustalW2 정렬 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)을 사용하여 수행할 수 있다.

가장 큰 그룹의 시판 세린 프로테아제는 " 알칼리성 세린 프로테아제 "이고, 이것은 상기 효소가 pH 9 내지 pH 11 또는 심지어 pH 10 내지 12.5에서 활성이고 안정하며(Shimogaki et al., 1991), pH 9 주변에서 등전점을 가짐을 의미한다. 촉매 활성의 최적 pH의 측정은 단백질 기질에 대한 활성에 따라 상이한 pH 값에서 적합한 완충액중에서 수행될 수 있다. 전형적으로, 세제 프로테아제는 이것이 작동하는 세제 용액의 pH 값이 대략적으로 효소에 대한 pI 값과 동일한 경우, 최상의 성능을 가지며 pI는 폴리아크릴아미드, 전분 또는 아가로스로 구성된 고정화된 pH 농도 구배 겔상에 등전점 포커싱시킴에 의해 또는 아미노산 서열 유래의 pI를 평가함에 의해, 예를 들면, ExPASy 서버에서 pI/MW 도구를 사용함에 의해 결정될 수 있다(http: //expasy. org/tools/pi tool.html ; Gasteiger et al., 2003).

성숙한 알칼리성 세린 프로테아제의 분자량은 15 내지 35kDa, 전형적으로 약 25 내지 30kDa 범위이다(Rao et al. 1998). 세린 프로테아제의 분자량은 문헌[참조: Laemmli (1970)]에 따라 질량 분광측정기에 의해 또는 SDS-PAGE상에서 측정할 수 있다. 상기 분자량은 또한 효소의 아미노산 서열로부터 예측될 수 있다.

대부분의 천연 세린 프로테아제의 최적 온도는 60℃ 주변이다(문헌참조: Rao et al., 1998). 세린 프로테아제의 상기 최적 온도는 실시예 3에 기재된 바와 같은 카제인 기질과 함께 상이한 온도에서 적합한 완충액중에서 측정될 수 있거나 문헌(Gupta et al., 2002)에 기재된 다른 기질 및 완충액 시스템을 사용함에 의해 측정될 수 있다.

본 발명에 따른 성숙한 재조합 말브란케아 세린 프로테아제는 약 29kDa의 분자량을 갖고 최적 온도는 30분 반응 시간 및 기질로서 카제인을 사용할 때 pH 8.5에서, 약 70℃이고, 30분 반응 시간 및 기질로서 카제인을 사용할 때 50℃에서, pH 10과 같은 알칼리성 pH 범위에서 활성이다. 상기 재조합 말브란케아 세린 프로테아제는 광범위한 온도 범위, 즉, 저온 내지 중온 및 심지어 고온 범위에서 고도로 다양한 성질을 갖는 세제의 존재하에 우수한 성능을 갖는다. 상기 재조합 말브란케아 세린 프로테아제는 세척 조건 및 세제 중에 보조 성분 및 첨가제에 따라 특히 60℃ 이하의 온도에서 유용하다.

세제중에서와 같은 다양한 산업적 응용에서 말브란케아 세린 프로테아제의 성능을 개선시키기 위해, 천연 효소의 성질을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 이들 성질은 예를 들면, 저장 안정성, 세제의 존재 또는 부재하의 안정성, pH 안정성, 산화적 안정성 또는 표백제에 대한 내성 및 기질 특이성을 포함한다. 상기 효소의 자가 단백질가수분해 활성은 저장 안정성에 대해 효과를 갖고 가능한 한 낮아야만 한다. 또한, 예를 들면, 세탁 및 식기 세척 조성물에서, 변형된 프로테아제의 세척 성능은 모 프로테아제 효소 또는 전구체 프로테아제 효소와 비교하여 손상되지 않아야 함은 자명하다. 즉, 효소 변이체는 모 세린 프로테아제와 비교하는 경우 유사하거나 심지어 개선된 세척 성능 및 얼룩 제거 성질을 갖는 것이 바람직할 수 있다.

생성된 프로테아제 효소, 특히 세린 프로테아제는 염 제조, 한외여과, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 여과 및 소수성 상호작용 크로마토그래피와 같은 효소 화학의 통상적인 방법을 사용하여 정제할 수 있다. 정제는 단백질 측정, 효소 활성 검정 및 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 모니터링할 수 있다. 정제된 효소의 다양한 온도 및 pH 값에서의 효소 활성 및 안정성뿐만 아니라 분자량 및 등전점도 측정할 수 있다.

본 발명의 재조합 세린 프로테아제의 정제는 실시예 4에서 입증되었다. 원심분리되고 여과된 배양 상청액은 20mM MES pH 5.3으로 평형화된 HiPrep 26/10 탈염 컬럼(제조원: GE Healthcare)에 적용하였다. 겔 여과된 샘플은 20mM MES pH 5.3으로 평형화된 1mL S 세파로스(Sepharose) HP 컬럼(제조원: GE Healthcare)에 적용하였다. 단백질은 증가하는 NaCl 구배(0.5M)를 이용하여 용출시켰다. 프로테아제 함유 분획물을 모으고 아미콘 울트라-4(Amicon Ultra-4) 10,000 CO 원심분리 여과 장치 MILLIPORE를 사용하여 농축시켰다. 샘플은 20mM MES, 150mM NaCl pH 5.3으로 평형화된 슈퍼덱스(Superdex) 75 겔 여과 컬럼을 사용하여 추가로 정제하였다. 프로테아제 함유 분획물을 모았다. 최종 샘플은 SDS PAGE 겔(도 4)상에서 분석하였다. 당연히, 본원에 기술된 방법 대신에 또는 그 이외에 다른 공지된 정제 방법을 사용하여 본 발명의 효소를 분리하는 것은 가능하다. 재조합 세린 프로테아제는 실시예 4에 기재된 바와 같이 정제되었고 실시예 5에 기재된 바와 같이 pH 및 온도 프로필의 특성확인을 위해 사용되었다.

프로테아제 활성은 일반적으로 가용성 기질의 분해를 기초로 한다. 세제 적용에서 프로테아제는 적어도 부분적으로 불용성인 물질에 작용해야 한다. 따라서, 세제 프로테아제에 중요한 매개변수는 이들 불용성 단편에 흡착하여 가수분해하는 능력이다.

본 발명의 세린 프로테아제 효소는 세균, 고세균, 진균, 효모 및 고등 진핵생물(예: 식물)을 포함한 임의의 유기체로부터도 유도될 수 있다. 바람직하게는, 상기 효소는 사상 진균 및 효소를 포함한 진균, 예를 들면 말브란케아를 포함하는 그룹으로부터 선택된 속으로부터 기원한다. 진균 알칼리성 프로테아제는 미생물-불포함 효소 또는 효소 조성물을 생성하는 다운스트림 프로세싱의 용이함으로 인하여 세균 프로테아제보다 유리하다. 균사체는 효소의 정제 이전에 여과 기술을 통해 쉽게 제거할 수 있다.

본 발명의 진균 발효 생성물의 약한 냄새는 전형적으로 불쾌한 냄새를 갖는 바실러스 유도된 생성물에 비해 이점이다. 따라서, 덜한 향기는 최종 조성물에서 냄새를 차단하기 위해 요구되고 이것은 생성물을 향기의 용도가 바람직하지 않은 응용에도 적합하게 한다.

본 발명은 광범위한 온도 범위, 즉, 0℃ 내지 90℃의 저온 내지 중온의 범위, 바람직하게는 5 내지 60℃ 범위의 온도 및 특히 바람직하게는 10 내지 40℃의 온도 범위에서 상당히 다양한 특성을 갖는 세제의 존재 하에 양호한 성능을 갖는 진균 세린 프로테아제에 관한 것이다.

본 발명에서, 세제의 존재 하의 양호한 성능 은 효소, 이러한 경우에서는 본 발명의 재조합 진균 세린 프로테아제가 시판되고 있는 많은 서브틸리신보다 낮은 온도 범위에서 기능함을 의미한다. 즉, 양호한 성능은, 효소가 저온 내지 중온의 범위에서, 그러나 특히 현재 시판되고 있는 서브틸리신 제품, 예를 들면, 시판 서브틸리신 효소 제품 사비나제® 또는 사비나제® 울트라 16L(Novozymes A/S, DK)보다 낮은 온도 범위에서 단백질성 얼룩 또는 물질을 분해 또는 제거할 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 진균 세린 프로테아제는 세척 조건 및 세제 중에 보조 성분 및 첨가제에 의존하여, 특히 60℃ 이하의 온도에서 유용하다. 상기 효소는 또한 50℃ 이하, 40℃ 이하, 30℃ 이하, 20℃ 이하 및 10℃ 이하에서 기능한다. 특히 놀랍게도 70℃ 주변의 최적 온도를 갖는 호열성 효소는 40℃ 미만의 온도, 심지어 30℃ 미만의 온도에서 효과적이고 유용하다.

세제의 존재하에, 본 발명의 진균 세린 프로테아제는 상기 정의된 온도에서 기능하고, 특히 상기 진균 세린 프로테아제는 40℃ 이하의 온도에서 세제의 존재하에 우수한 성능을 갖는다. deltaL*로서 측정되는 상이한 균주에 대한 다양한 시험 조건에서 말브란케아 유래의 진균 세린 프로테아제의 얼룩 제거 성능은 시판되고 있는 제품 사비나제® 및 사비나제® 울트라 16L(Novozymes A/S, DK)의 성능보다 훨씬 양호하다. 상기 결과는 실시예 6 내지 실시예 8 및 도 6 내지 도 10에 나타낸다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 따라, 재조합 진균 세린 프로테아제 효소는, 세린 프로테아제 활성을 갖고 서열번호 18에 정의된 성숙한 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 아미노산 서열 또는 서열번호 18에 정의된 성숙한 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 아미노산 서열과 66% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다. 바람직한 효소는 66% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 더 바람직하게는 80% 이상의 동일성을 나타낸다. 더욱 더 바람직하게 상기 아미노산 서열은 서열번호 18의 아미노산 서열과 85% 이상 또는 90% 이상 또는 95% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 보여준다. 적합하게는 효소의 동일성은 상응하는 성숙한 서열 영역을 사용하여 비교한다.

말브란케아, 바람직하게는 말브란케아 신나모메아 (Lib.) 오르스코트 데 후그(말브란케아 풀켈라 변이체. 설푸레아(Miehe)의 동의어, Cooney & R. Emers.)로부터 유도가능한 본 발명의 세린 프로테아제는 EC3.4.21의 구성원이다. 특히 바람직한 실시형태에 따라, 본 발명의 세린 프로테아제 효소는 수탁번호 CBS 128533하에 기탁된 말브란케아 ALKO4122 균주 또는 수탁번호 CBS 128564하에 기탁된 균주 말브란케아 ALKO4178로부터 유도될 수 있다. 말브란케아 ALKO4178의 프로테아제는 근본적으로 말브란케아 ALKO4122 균주의 프로테아제와 동일하다.

본원에서 용어 " 동일성 "은 거의 동일한 양의 아미노산을 갖는 상응하는 서열 영역 내에서 서로 비교된 두 아미노산 서열 사이의 동일성을 의미한다. 예를 들면, 두 아미노산 서열의 전장 또는 성숙한 서열의 동일성이 비교될 수 있다. 비교될 두 분자의 아미노산 서열은 하나 이상의 위치에서 상이할 수 있지만, 이는 분자의 생물학적 기능 또는 구조를 변경하지 않는다. 이러한 변이는 상이한 숙주 유기체 또는 아미노산 서열의 돌연변이 때문에 자연적으로 발생할 수 있거나, 또는 특이적 돌연변이유발에 의해 달성될 수 있다. 변이는 아미노산 서열 중 하나 이상의 위치에서의 결실, 치환, 삽입, 부가 또는 조합으로부터 기인할 수 있다. 서열의 동일성은 디폴트 세팅(단백질 중량 매트릭스: Gonnet, 공백 개시: 10, 공백 연장: 0.20, 공백 거리 5)과 함께 ClustalW2 정렬( http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ )을 사용함으로써 측정된다.

본 발명의 하나의 바람직한 실시형태는 세린 프로테아제 활성 및 서열번호 18로 정의된 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 아미노산 서열을 갖는 성숙한 진균 세린 프로테아제 효소이다. 성숙한 효소에는 신호 서열 또는 프레펩타이드 및 프로서열 또는 프로펩타이드가 결여되어 있다. 본 발명의 성숙한 세린 프로테아제는 서열번호 14를 특징으로 하는 전장 프로테아제의 아미노산 Ala21 내지 Arg401을 포함한다. 따라서, 신호 서열(프레펩타이드) 및 프로펩타이드를 포함한 서열번호 14를 갖는 전장 말브란케아 ALKO4122 프로테아제 효소 및 신호 서열(프레펩타이드)이 결여되어 있고, 따라서, 서열번호 16을 갖는 프로효소 형태도 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명은 그 성숙한 형태의 분자량이 20 내지 35 kDa, 바람직하게는 25 내지 33 kDa, 더욱 바람직하게는 28 내지 30 kDa인 진균 세린 프로테아제 효소에 관한 것이다. 가장 바람직한 분자량(MW)은 ExPASy 서버에서 Compute pI/MW 도구(Gasteiger et al., 2003)을 사용하여 얻은 성숙한 폴리펩타이드에 대해 29 kDa의 예측된 분자량이다.

본 발명의 효소는 광범위한 온도 범위에서 단백질성 물질을 분해하는데 효과적이다. 진균 세린 프로테아제는 실시예 5에 기술된 바와 같이 30분의 반응 시간 및 기질로서 카제인을 사용하여 pH 8.5에서 측정했을 때 30℃ 내지 80℃(최대 활성의 약 10% 이상), 바람직하게는 40℃ 내지 80℃(최대 활성의 약 20% 이상), 더욱 바람직하게는 50℃ 내지 80℃(최대 활성의 약 40% 이상), 가장 바람직하게는 60℃ 내지 80℃(최대 활성의 약 65% 이상)의 범위의 최적 온도를 갖고, 70℃에서 최대 활성이었다.

상기 효소는 실시예 5에 기술된 바와 같이 30분의 반응 시간 및 기질로서 카제인을 사용할 때 50℃에서, pH 6 내지 적어도 pH 10 범위의 최적 pH를 갖는다. 특히, 최적 pH는 pH 6 내지 pH 10(최대 활성의 약 60% 이상), 더욱 바람직하게는 pH 9 내지 pH 10(최대 활성의 약 70% 이상), 및 가장 바람직하게는 약 pH 10이다.

세린 프로테아제, 적합하게는 본 발명의 진균 세린 프로테아제는 "세제의 존재 하에 양호한 성능"을 가지며, 즉, 저온 범위에서, 특히 현재 시판되는 서브틸리신 제품, 예를 들면, 시판 효소 제품 사비나제® 또는 사비나제® 울트라 16L(Novozymes A/S, DK)보다 더욱 낮은 온도 범위에서 세제의 존재 하에 단백질성 얼룩 또는 물질을 분해 또는 제거할 수 있다. 세제의 존재 하에 본 발명의 효소는 5℃ 내지 60℃, 바람직하게는 50℃ 또는 그 이하에서 잘 기능한다. 또한, 상기 효소는 40℃ 이하 또는 30℃ 이하의 온도에서 작용한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면 진균 세린 프로테아제 효소는, 엄중 조건하에서 수탁번호 DSM 24426하에 도이췌 삼룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulture GmbH)에 기탁된 이. 콜라이 RF8758 중의 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열을 포함한 플라스미드 pALK3092에 포함된 폴리뉴클레오타이드 또는 프로브 서열과 하이브리드화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.

유사한 방식으로, 본 발명의 진균 세린 프로테아제 효소(말브란케아 ALKO4178)는, 엄중 조건하에서 수탁번호 DSM24427하에 이. 콜라이 RF8759로 기탁된 뉴클레오타이드 서열(서열번호 12)을 포함하는 플라스미드 pALK3093에 포함된 폴리뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.

추가로, 본 발명의 진균 세린 프로테아제 효소는, 엄중 조건하에서 수탁번호 DSM 24410하에 이. 콜라이 RF8791로 기탁된 뉴클레오타이드 서열(서열번호 17)을 포함하는 플라스미드 pALK3094에 포함된 폴리뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화하는 분리된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.

본 발명에서, 말브란케아 프로테아제 유전자는 실시예 1d에 기술된 바와 같이 엄중 하이브리드화를 사용하여 PCR에 의해 제조된 프로브로 분리하였다. 숙주 유기체의 cDNA 또는 게놈 DNA를 분리하는데 표준 분자 생물학 방법, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook 및 Russell, 2001]과 같은 분자 생물학 핸드북에 기재된 방법이 사용될 수 있다.

예를 들면, 100 내지 200개 이상의 뉴클레오타이드로 이루어진 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 17과 같은 DNA 프로브와의 하이브리드화는, "고도의 엄중" 조건, 즉, 완벽한 하이브리드의 계산된 융점 온도(Tm)보다 낮은 20 내지 25℃의 온도에서의 하이브리드화로 수행하는 것이 일반적이고, 상기 Tm은 문헌(Bolton and McCarthy (1962))에 따라 계산된다. 일반적으로, 예비하이브리드화 및 하이브리드화는 6xSSC(또는 6xSSPE), 5x덴하르트(Denhardt) 시약, 0.5% (w/v) SDS, 100㎍/㎖ 변성되고 단편화된 연어 정자 DNA 중에서 적어도 65℃에서 수행한다. 50% 포름아미드의 첨가는 예비하이브리드화 및 하이브리드화 온도를 42℃로 저하시킨다. 세척은 실온(RT)에서 낮은 염 농도, 예를 들면, 2xSSC-0.5% SDS (w/v)에서 15분간 수행하고, 이어서, 실온에서 2xSSC-0.1% SDS(w/v), 마지막으로 적어도 65℃에서 0.1xSSC-0.1% SDS(w/v)에서 수행하거나 실시예 1d에 기재된 조건에서 수행한다.

하나의 바람직한 실시형태에 따라, 본 발명의 진균 세린 프로테아제 효소는 서열번호 18을 특징으로 하는 아미노산 서열을 포함한 폴리펩타이드, 또는 서열번호 18의 아미노산 서열과 66% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산 분자에 의해 암호화된다. 바람직한 효소는 66% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 80% 이상의 동일성을 보여준다. 더욱 더 바람직하게는 아미노산 서열은 서열번호 18의 아미노산 서열과 85% 이상, 또는 90% 이상 또는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99%의 동일성을 보여준다. 효소의 동일성은 상응하는 성숙한 서열 영역을 사용하여 비교된다.

따라서, 성숙한 형태의 효소 이외에 프레펩타이드(신호 서열) 및 프로펩타이드를 포함한 본 발명의 전장 세린 프로테아제의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자에 의해 암호화되고, 상기 아미노산 서열이 서열번호 14를 특징으로 하는 폴리펩타이드 서열은 본 발명의 범위에 속한다.

또한, 성숙한 형태의 효소 이외에 프로펩타이드를 포함한 본 발명의 세린 프로테아제 효소의 프로펩타이드 형태를 암호화하는 핵산 분자에 의해 암호화되고, 상기 아미노산 서열이 서열번호 16을 특징으로 하는 폴리펩타이드 서열도 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명의 하나의 바람직한 실시형태는 서열번호 18을 갖는 성숙한 형태의 말브란케아 ALKO4122 세린 프로테아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 의해 암호화된 진균 세린 프로테아제 효소이다.

하나의 바람직한 실시형태에 따라, 본 발명의 진균 세린 프로테아제 효소는 성숙한 형태의 말브란케아 ALKO4122 효소(서열번호 18)를 암호화하는 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 의해 암호화된다.

따라서, 효소에 대한 "암호화 서열"을 포함하는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드는 본 발명의 범위에 속한다. 표현 "암호화 서열"은 번역 개시 코돈(ATG)으로부터 개시되어 번역 정지 코돈 (TAA, TAG 또는 TGA)에서 정지하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 번역된 전장 폴리펩타이드는 보통 메티오닌으로 개시하고, 인트론 영역을 포함할 수 있다.

또한, 말브란케아 ALKO4122 프로효소 형태를 암호화하는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화된 진균 세린 프로테아제 효소도 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 따라, 진균 세린 프로테아제는 수탁번호 DSM 24410하에 기탁된 이. 콜라이 RF8791에 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드 pALK3094에 포함된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.

본 발명의 한 실시형태는 상기 특성확인된 진균 세린 프로테아제 효소를 암호화하고 적합한 숙주에서 상기 세린 프로테아제 효소의 발현을 지시할 수 있는 조절 서열에 작동적으로 연결된 핵산 분자를 포함한 재조합 발현 벡터로부터 생성된 세린 프로테아제 효소이다. 상기 재조합 발현 벡터의 작제 및 상기 벡터의 용도는 실시예 2에 보다 상세하게 기재되어 있다.

진균 세린 프로테아제 효소의 생성에 적합한 숙주는 세균, 효모 및 진균을 포함한 세균 숙주와 같은 동종 또는 이종 숙주이다. 트리코더마( Trichoderma ), 아스퍼질러스( Aspergillus ), 푸사리움( Fusarium ), 후미콜라( Humicola ), 크리소스포리움 뉴로스포라( Chrysosporium Neurospora ), 리조푸스( Rhizopus ), 페니실리움( Penicillium ), 마이셀리오프토라( Myceliophthora ) 및 모르티리엘라( Mortiriella )와 같은 사상 진균이 효소 생성물의 다운스트림 프로세싱 및 회수의 용이함으로 인해 바람직한 생성 숙주이다. 적합한 숙주는 티. 리세이, 에이. 나이거, 에이. 오리재, 에이. 소재, 에이. 아와모리 또는 에이. 자포니쿠스 유형의 균주, 에프. 베네나툼 또는 에프. 옥시스포룸, 에이취. 인솔렌스 또는 에이취. 라누기노사, 엔. 크라사 및 씨. 룩노웬스와 같은 종을 포함하며, 이들 중 일부는 예를 들면, 시판 효소의 AMFEP 2009 목록(http://www.amfep.org/list.html)에서 효소 생성 숙주 유기체로 수록되어 있다. 효소가 티. 리세이 또는 에이. 나이거, 에이. 오리재 또는 에이. 아와모리와 같은 트리코더마 속 또는 아스퍼질러스 속의 사상 진균 숙주에서 생성되는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 가장 바람직한 실시형태에 따르면, 진균 세린 프로테아제 효소는 티. 리세이에서 생성된다.

또한, 본 발명은

(g) 세린 프로테아제 활성을 가지며 서열번호 18로 나타낸 아미노산 서열을 포함한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자;

(h) 세린 프로테아제 활성을 가지며 서열번호 18의 아미노산 서열과 66% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자;

(i) 서열번호 17로 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 암호화 서열을 포함한 핵산 분자;

(j) DSM 24410에 함유된 폴리뉴클레오타이드 서열의 암호화 서열을 포함한 핵산 분자;

(k) 암호화 서열이 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 (c) 또는 (d) 중 어느 하나의 핵산 분자의 암호화 서열과 상이한 핵산 분자; 및

(l) 엄중 조건하에서 DSM 24426에 함유된 핵산 분자와, 또는 세린 프로테아제 활성을 나타내고 서열번호 18로 나타낸 아미노산 서열과 66% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열번호 17과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 세린 프로테아제 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명의 핵산 분자는 RNA 또는 DNA일 수 있으며, 여기서, DNA는 게놈 DNA 또는 cDNA로 이루어질 수 있다.

게놈 및 플라스미드 DNA의 분리, DNA의 분해에 의한 DNA 단편의 생성, 서열분석, 이. 콜라이 형질전환 등을 포함하여 본 발명의 진균 세린 프로테아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 분리 및 효소 처리에 표준 분자 생물학 방법을 사용할 수 있다. 기본적인 방법은 표준 분자 생물학 핸드북(예: Sambrook and Russell, 2001)에 기재되어 있다.

말브란케아 ALKO4122 폴리펩타이드를 암호화하는 말브란케아 프로테아제 유전자의 분리는 실시예 1에 기재되어 있다. 간단히 설명하면, PCR 반응에서 축퇴성 올리고뉴클레오타이드 프라이머(서열번호 5 및 서열번호 4)를 사용함으로써 수득된 PCR 단편을 사용하여 말브란케아 ALKO4122로부터 상기 프로테아제 유전자를 분리하였다. 상기 프로테아제 유전자를 포함하는 게놈 단편은 pBluescript II KS+ 벡터에 라이게이션하였다. 전장 말브란케아 프로테아제 유전자는 수탁번호 DSM 24410하에 DSMZ 배양물 수집기관에 이. 콜라이로 기탁된 플라스미드 pALK3094에 포함되어 있었다. 세린 프로테아제의 추론된 아미노산 서열은 DNA 서열로부터 분석되었다.

말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 13), 이의 부분 프로모터 및 종결 서열 및 추론된 아미노산 서열(서열번호 14)은 도 1a 및 도 1b에 제시되어 있다. 이 유전자의 길이는 1436 bp(정지 코돈을 포함)이다. 72 bp, 87 bp 및 71bp의 길이를 갖는 3개의 추정 인트론이 발견되었다. 추론된 단백질 서열은 20개 아미노산의 예측된 신호 서열(SignalP V3.0; Nielsen et al., 1997 및 Nielsen and Krogh, 1998) 및 Gly21 내지 Asp120의 예측된 프로펩타이드를 포함하여 401개의 아미노산으로 이루어진다. 상기 예측된 분자량은 성숙한 폴리펩타이드에 대해 28.5kDa이고 예측된 pI는 6.15였다. 이들 예측값은 ExPASy 서버에서 Compute pI/MW 툴을 사용하여 이루어졌다(Gasteiger et al., 2003). 추론된 아미노산 서열은 3개의 가능한 N-당화 부위(Asn134, Asn172 및 Asn277)를 함유하였지만, CBS 서버 NetNGlyc V1.0에 따르면 단지 2개 부위, Asn134 및 Asn277만이 가능하다. 공개된 프로테아제 서열과의 상동성은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST 프로그램 버젼 2.2.25를 사용하여 조사하였다(Altschul et al., 1990). 가장 상동성인 서열의 상응하는 영역에 대한 성숙한 말브란케아 프로테아제 서열의 동일성 값은 ClustalW2 정렬(매트릭스: Gonnet, 공백 개시: 10, 공백 연장: 0.20, 공백 길이 5; 예를 들면, www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ )을 사용하여 얻었다. 결과는 표 2에 나타낸다.

본 발명의 성숙한 말브란케아 ALKO4122 프로테아제(서열번호 18)에 대한 BLASTP 조사로부터 수득된 최고의 동일성 값은 다음과 같았다: 코시디오이데스 포사다시( Coccidioides posadasii ) 추정 서브틸리신-유사 프로테아제(EER24932.1) 및 코시디오이데스 이미티스( Coccidioides immitis ) 하이포테티컬 단백질(hypothetical protein) CIMG_09197 (XP_ 001239485.1)에 대해 66%, 운시노카르푸스 레시( Uncinocarpus reesii ) 하이포테티컬 단백질 UREG_05170 (EEP80328.1)에 대해 65%, 코시디오이데스 이미티스 하이포테티컬 단백질 CIMB_01394 (XP_001247623.1), 코시디오이세스 포사다시( Coccidioides posadasii ) 추정 서브틸리신-유사 프로테아제 (EER23662.1), 운시노카르푸스 레시 하이포테티컬 단백질 (EEP81307.1) 및 아르트로더마 오타(Arthroderma otae) 알칼리성 프로테이나제 (EEQ28657.1)에 대해 64%. 특허 분야에서 서열에 대한 최고 동일성은 미국 특허 제5962765호에서의 서열번호 2(AAE30270.1; 메타리지움 아니소플리애( Metarhizium anisopliae ) 유래의 프로테아제) 및 WO 8807581에서의 서열번호 15(AAA54276.1; 트리티라키움 알붐( Tritirachium album ) 유래의 프로테아제)에 대해 55%였다. 성숙한 말브란케아 ALKO4122 프로테아제 서열(서열번호 18)은 ClustalW2 정렬을 사용하여 상기 상동성 서열의 성숙한 서열과 정렬하였다. ClustalW2 정렬을 사용함으로써 수득된 상기 동일성 값(스코어 %)(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)은 63% 내지 65%였다.

따라서, 서열번호 18, 서열번호 15를 특징으로 하는 성숙한 형태의 말브란케아 ALKO4122 효소의 아미노산 서열, 즉, 서열번호 14의 전장 세린 프로테아제의 아미노산 Ala121 내지 Arg401을 포함하는 진균 세린 프로테아제 효소 또는 폴리펩타이드를 암호화하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 분리된 핵산 분자는 본 발명의 범위에 속한다.

핵산 분자는 바람직하게 본 발명의 성숙한 형태의 진균 세린 프로테아제 효소를 암호화하는 서열번호 17로 나타낸 암호화 서열을 포함한 분자이다.

본 발명의 분리된 핵산 분자는 DSM 24410, DSM 24426 또는 DSM 24427에 함유된 폴리뉴클레오타이드 서열의 암호화 서열을 포함한 분자일 수 있다. DSM 24426은 전장 말브란케아 ALKO4122 프로테아제 유전자를 클로닝하는데 사용된 PCR 단편의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 11)을 함유한다. DSM 24427은 말브란케아 ALKO4178로부터 수득된 PCR 단편의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 12)을 함유한다. DSM 24410은 전장 말브란케아 ALKO4122 프로테아제 유전자의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 13)을 함유한다.

또한, 본 발명의 핵산 분자는 상기 특징으로 하는 뉴클레오타이드 서열의 유사체일 수 있다. "축퇴성"은 1개 이상의 뉴클레오타이드 또는 코돈이 상이하지만 본 발명의 재조합 프로테아제를 암호화하는, 뉴클레오타이드 서열의 유사체를 의미한다.

또한, 핵산 분자는, 엄중 조건하에서 각각 수탁번호 DSM 24426 및 DSM 24427하에 이. 콜라이로 기탁된 플라스미드 pALK3092 또는 pALK3093에 함유된 PCR 프로브, 또는 세린 프로테아제 활성을 갖는 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하는 서열번호 17의 DNA 서열 및 아미노산 서열과 하이브리드화하는 핵산 분자일 수 있다. 하이브리드화 DNA는 말브란케아 종에 속하는 진균으로부터 기원될 수 있거나 다른 진균 종으로부터 기원할 수 있다.

따라서, 서열번호 17로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한 분리된 핵산 분자 및 이의 유사체는 본 발명의 범위에 속한다.

또한, 본 발명은 적합한 원핵생물 또는 진핵생물 숙주에서 해당 세린 프로테아제를 암호화하는 핵산 서열을 증식 또는 발현하기 위해 사용될 수 있는, 재조합 발현 벡터 또는 재조합 발현 작제물에 관한 것이다. 재조합 발현 벡터는 적합한 숙주에서 세린 프로테아제 암호화 서열의 발현 및 분비를 촉진 또는 지시하는, DNA 또는 핵산 서열, 예를 들면 상기 세린 프로테아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터, 인핸서, 종결자(전사 및 번역 종결 신호를 포함함) 및 신호 서열을 포함한다. 또한, 발현 벡터는 형질전환 균주의 선별을 위한 마커 유전자를 포함하거나 선별 마커가 공동-형질전환에 의해 다른 벡터 작제물로서 상기 숙주에 도입될 수 있다. 상기 조절 서열은 생성 유기체와 동종 또는 이종일 수 있거나, 또는 이들 서열은 세린 프로테아제를 암호화하는 유전자가 분리된 유기체로부터 기원할 수 있다.

사상 진균 숙주에서 본 발명의 세린 프로테아제를 발현하기 위한 프로모터의 예로는 에이. 오리재 TAKA 아밀라제, 알칼리성 프로테아제 ALP 및 트리오스 포스페이트 이소머라제, 리조푸스 미에헤이 리파제, 아스퍼질러스 나이거 또는 에이. 아와모리 글루코아밀라제 (glaA), 푸사리움 옥시스포리움 트립신-유사 프로테아제, 크리소스포리움 룩노웬스 셀로비오하이드롤라제 1 프로모터, 트리코더마 리세이 셀로비오하이드롤라제 I (Cel7A) 등의 프로모터가 있다.

효모에서, 예를 들면 에스. 세레비지애 에놀라제 (ENO-1), 갈락토키나제 (GAL1), 알코올 데하이드로게나제 (ADH2) 및 3-포스포글리세레이트 키나제의 프로모터가 발현을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

세균 숙주에서 본 발명의 세린 프로테아제의 전사를 지시하기 위한 프로모터 서열의 예로는 에스케리키아 콜라이의 lac 오페론의 프로모터, 스트렙토마이세스 코엘리칼라 아가라제 dagA 프로모터, 비. 리체니포르미스 알파-아밀라제 유전자 ( amy L)의 프로모터, 비. 스테아로써모필러스 말토제닉 아밀라제 유전자( amy M)의 프로모터, 비. 서브틸리스 xyl A 및 xyl B 유전자의 프로모터 등이 있다.

적합한 종결자는 상기 언급된 유전자의 종결자 또는 특성확인된 임의의 다른 종결 서열을 포함한다.

적합한 형질전환 또는 선별 마커는 숙주의 결함을 보상하는 것, 예를 들면, 비. 서브틸리스 또는 비. 리체니포르미스의 dal 유전자 또는 아스퍼질러스 amd S 및 nia D를 포함한다. 또한, 선별은 항생제 내성, 예를 들면, 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 플레오마이신 또는 하이그로마이신 내성을 부여하는 마커에 기초할 수 있다.

본 발명의 세린 프로테아제의 세포외 발현이 바람직하다. 따라서, 재조합 벡터는 선별 숙주에서의 분비를 촉진하는 서열을 포함한다. 본 발명의 세린 프로테아제의 신호 서열 또는 프레서열 또는 프레펩타이드가 재조합 발현 벡터에 포함될 수 있거나 또는 천연 신호 서열이 선별 숙주에서의 발현을 촉진할 수 있는 다른 신호 서열로 대체될 수 있다. 따라서, 선택된 신호 서열은 발현 숙주와 동종 또는 이종일 수 있다. 또한, 천연 폴리펩타이드는 다른 프로펩타이드로 대체될 수 있다. 상기 프로펩타이드는 발현 숙주와 동종 또는 이종일 수 있다.

적합한 신호 서열의 예로는 진균 또는 효모 유기체의 신호 서열, 예를 들면, 잘 발현된 유전자 유래의 신호 서열이 있다. 이러한 신호 서열은 문헌을 통해 잘 알려져 있다.

재조합 벡터는 안정한 발현을 수득하고/하거나 숙주 게놈내 특정 위치로의 표적화를 촉진시키기 위해 숙주 염색체 DNA내로 벡터의 통합을 촉진하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 말브란케아 ALKO4122 프로테아제는 실시예 2에 기재된 바와 같이 티. 리세이 cbh1 ( cel7A ) 프로모터로부터 자체의 신호 서열과 함께 발현되었다. 티. 리세이 숙주를 형질전환하기 위해 사용된 발현 작제물은 또한 비형질전환 세포로부터 형질전환체를 선별하기 위해 cbh1 종결자 및 합성 amdS 마커를 포함하였다.

또한, 본 발명은 상기된 재조합 발현 벡터를 포함한 숙주 세포에 관한 것이다. 진균 세린 프로테아제 효소의 생성에 적합한 숙주는 세균, 효모 및 진균을 포함한 미생물 숙주와 같은 동종 또는 이종 숙주이다. 또한, 식물 또는 포유동물 세포의 생성 시스템도 가능하다.

트리코더마, 아스퍼질러스, 푸사리움, 후미콜라, 크리소스포리움, 뉴로스포라, 리조푸스, 페니실리움, 마이셀리오프토라 및 모르티리엘라와 같은 사상 진균이 효소 생성물의 다운스트림 프로세싱 및 회수의 용이함으로 인해 바람직한 생성 숙주이다. 적합한 발현 및 생성 숙주 시스템으로는 예를 들면, 사상 진균 숙주 트리코더마 리세이(문헌참조: EP 244234)를 위해 개발된 생성 시스템, 또는 아스퍼질러스 생성 시스템(예를 들면, 에이. 오리재 또는 에이. 나이거(문헌참조: WO 9708325, US 5,843,745, US 5,770,418), 에이. 아와모리, 에이. 소재 및 에이. 자포니쿠스-유형 균주), 또는 푸사리움(예: 에프. 옥시포룸(Malardier et al., 1989) 또는 에프. 베네나툼)을 위해 개발된 생성 시스템, 및 뉴로스포라 크라사, 리조푸스 미에헤이, 모르티리엘라 알피니스, 에이취. 라누기노사 또는 에이취. 인솔렌스 또는 크리소스포리움 룩노웬스(문헌참조: US 6,573,086)를 위해 개발된 생성 시스템이 있다. 효모를 위해 개발된 적합한 생성 시스템으로는 사카로마이세스, 스키조사카로마이세스 또는 피키아 파스토리스를 위해 개발된 시스템이 있다. 세균을 위해 개발된 적합한 생성 시스템으로는 바실러스(예: 비. 서브틸리스, 비. 리체니포르미스, 비. 아밀로리쿼파시엔스), 이. 콜라이 또는 액티노마이세테 스트렙토마이세스를 위해 개발된 생성 시스템이 있다. 바람직하게는 본 발명의 세린 프로테아제는 트리코더마 속 또는 아스퍼질러스 속 (예: 티. 리세이 또는 에이. 나이거, 에이. 오리재, 에이. 소재, 에이. 아와모리 또는 에이. 자포니쿠스-유형 균주)의 사상 진균 숙주에서 생성된다. 본 발명의 가장 바람직한 실시형태에 따르면 진균 세린 프로테아제 효소는 티. 리세이에서 생성된다.

또한, 본 발명은 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, 적합한 조건 하에서 본 발명의 세린 프로테아제를 위한 재조합 발현 벡터를 함유한 천연 또는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 임의로 상기 효소를 분리하는 단계를 포함한다. 생성 배지는 숙주 유기체를 성장시키기에 적합하고 효율적인 발현을 위한 유도제를 함유한 배지일 수 있다. 적합한 배지는 문헌을 통해 잘 알려져 있다.

본 발명은 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드에 관한 것이며, 상기 폴리펩타이드는 본 발명의 핵산 분자에 의해 암호화되고 상기된 공정에 의해 수득가능하다.

또한, 본 발명은 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한 효소 제제를 수득하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 세포로부터 폴리펩타이드를 회수하거나 또는 세포를 배양 배지로부터 분리하는 단계, 및 세린 프로테아제 활성을 갖는 상청액을 수득하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 특성확인된 세린 프로테아제 효소를 포함하는 효소 제제에 관한 것이다. 효소 제제 또는 조성물은 세린 프로테아제 활성을 가지며 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하다.

본 발명의 세린 프로테아제를 포함하는 조성물뿐만 아니라 효소 제제도 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명의 프로테아제 효소를 함유하는 상기 효소 제제 또는 조성물(예를 들면, 세제 제형)은, 프로테아제(본 발명의 세린 프로테아제 이외의 다른 프로테아제), 아밀라제, 리파제, 셀룰라제, 큐티나제, 펙티나제, 만난아제, 크실라나제 및 옥시다제(예: 라카제 또는 퍼옥시다제)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 다른 효소를 조정제와 함께 또는 조정제 없이 추가로 포함할 수 있다. 이들 효소는 예를 들면, 처리될 물질에 존재하는 탄수화물 및 오일 또는 지방을 제거함으로써 본 발명의 세린 프로테아제의 성능을 증진시킬 것으로 예상된다. 상기 효소들은 숙주 균주에 의해 생성된 천연 또는 재조합 효소일 수 있거나, 또는 생성 공정 후 배양 상청액에 첨가될 수 있다.

상기 효소 제제 또는 조성물은 계면활성제 또는 표면 활성제, 완충제, 방식제, 안정화제, 표백제, 조정제, 빌더(builder), 부식제, 마모제 및 보존제, 광학 증백제, 재침착 방지제, 염료, 안료, 향료 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된하나 이상의 적합한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

계면활성제는 기름을 에멀젼화하고 표면을 습윤화하는데 유용하다. 계면활성제는 반-극성을 포함한 비이온성 및/또는 음이온성 및/또는 양이온성 및/또는 양쪽성 이온성일 수 있다.

완충제는 효소 제제 또는 조성물에 첨가되어 pH를 조정하거나 다른 성분의 성능 또는 안정성에 영향을 미칠 수 있다.

적합한 안정화제는 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤과 같은 폴리올, 당 또는 당 알코올, 락트산, 붕산 또는 붕산 유도체, 펩타이드 등을 포함한다.

표백제는 유기 화합물을 산화시키고 분해시키기 위해 사용된다. 적합한 화학적 표백 시스템의 예로는 H ₂ O ₂ 공급원(예: 테트라아세틸에틸렌디아민과 같은 과산-형성 표백 활성화제의 존재 또는 부재하의 과붕산염 또는 과탄산염), 또는 대안으로 퍼옥시산(예: 아미드, 이미드 또는 설폰 유형)이 있다. 화학적 산화제는 라카제 또는 퍼옥시다제와 같은 산화 효소를 사용함으로써 부분적으로 또는 완전히 대체될 수 있다. 많은 라카제는 조정제의 부재하에 효과적으로 기능하지 않는다.

빌더 또는 착화제는 제올라이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 카보네이트, 시트레이트 등과 같은 물질을 포함한다. 효소 제제는 하나 이상의 중합체, 예를 들면 카복시메틸셀룰로즈, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리딘) 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 연화제, 부식제, 다른 성분의 부패를 방지하기 위한 보존제, 마모제 및 발포 및 점도 성질을 변형하는 물질이 첨가될 수 있다.

본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에 따라, 상기 효소 제제 또는 상기 효소를 포함하는 조성물은 액체, 분말, 과립 또는 정제의 형태로 존재한다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 따라, 상기 조성물은 액체, 분말, 과립 또는 정제 형태의 세제 제형이다. 추가로, 상기 제제 또는 조성물 중의 효소는 고정화된 효소 형태로 존재할 수 있다.

본 발명의 세린 프로테아제는 다른 프로테아제, 특히 알칼리성 프로테아제와 마찬가지로 세제, 단백질, 양조, 육류, 사진, 피혁, 유제품 및 제약 산업에 사용될 수 있다(Kalisz, 1988; Rao et al., 1998). 예를 들면, 본 발명의 프로테아제는 섬유 단백질 폐기물(예: 뿔, 피혁, 네일 및 모발)을 유용한 바이오매스, 단백질 농축물 또는 아미노산으로 전환시키는 화학물질의 대체물로서 사용될 수 있다(Anwar and Saleemuddin, 1998). 본 발명의 세린 프로테아제의 사용은 다른 효소와 마찬가지로 피혁의 질을 개선하면서 환경 오염을 감소시키고 에너지를 절감하는데 성공적임을 입증할 수 있으며, 펩타이드의 합성 및 D,L-아미노산 혼합물의 분해능(resolution)에 유용할 수 있다. 화상 및 상처의 치료에서의 넓은 스펙트럼 항생물질과 병용되는 서브틸리신은 제약 산업에서 세린 프로테아제의 사용 예이고, 따라서 본 발명의 진균 세린 프로테아제는 또한 이러한 용도에 적용될 수 있고, 또한 알칼리성 프로테아제와 마찬가지로 수술 도구에 묻은 혈액을 제거하고 콘택트렌즈 또는 의치를 세정하는데 사용될 수 있다. 코니디오볼루스 코로나투스 유래의 알칼리성 프로테아제와 마찬가지로, 본 발명의 진균 세린 프로테아제는 동물 세포 배양액 중의 트립신을 대체하기 위한 것으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 프로테아제는 막을 세정하고 바이오필름을 파괴하는데 사용될 수 있다. 제빵에서 본 발명의 프로테아제는 예를 들면 글루텐 망을 파괴하기 위해 사용될 수 있고, 다른 식품 용도로서 식품 단백질(예: 우유 중의 단백질)을 가수분해하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 프로테아제는 예를 들면, 효모를 처리하고, 렌더링하며(동물 뼈로부터 더 많은 단백질을 추출), 새로운 향료를 생성하고, 쓴맛을 저감시키며, 에멀젼화 특성을 변화시키고, 생체활성(bioactive) 펩타이드를 생성하며, 단백질의 알레르기 유발 항원을 감소시키는데 사용될 수 있다. 기질은 동물, 식물 및 미생물 단백질을 포함한다.

세제 산업, 특히 세탁 세제 산업은 높은 pH 범위에서 활성인 프로테아제의 주요 단일 소비재 산업으로 각광받아 왔다(Anwar and Saleemuddin, 1998). 이상적인 세제 프로테아제는 식품, 풀, 혈액 및 기타 신체 분비물에 의한 아주 다양한 얼룩의 제거를 용이하게 하기 위해 넓은 기질 특이성을 보유해야 한다. 이 효소는 세제 용액의 pH 및 이온 강도, 세정 온도 및 pH에서 활성이어야 하며, 기계적 작동뿐만 아니라 세제에 첨가된 킬레이트제 및 산화제에도 내성이어야 한다. 에너지 보존에 대한 인식으로 인하여, 현재 보다 낮은 온도에서 프로테아제를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

또한, 본 발명은 세린 프로테아제 효소 또는 효소 제제의 세제용 용도, 직물 섬유의 처리, 단백질성 물질, 예를 들면, 울, 모발, 실크, 피혁의 처리, 사료 또는 식품의 처리 또는 단백질성 물질의 변성, 분해 또는 제거와 관련된 임의의 응용에 사용하는 용도에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 하나의 바람직한 실시형태는 자동 접시 세척 조성물을 포함하여 세탁 세제 및 접시 세척 조성물에 유용한 세제 첨가제로서의 상기 특성확인된 세린 프로테아제 효소의 용도이다.

표현 "세제"는 세정을 보조하거나 세정 특성을 갖고 있는 것으로 의도된 물질 또는 재료를 의미하는데 사용된다. 용어 "세정력"은 세정 특성의 존재 또는 정도를 가리킨다. 세정 특성의 정도는 직물 섬유 또는 유리와 같은 수불용성 고체 담체에 결합된 상이한 단백질성 또는 단백질 함유 기질 물질 또는 얼룩 또는 얼룩 혼합물에 대해 시험될 수 있다. 전형적인 단백질성 물질은 혈액, 우유, 잉크, 계란, 풀 및 소스를 포함한다. 시험 목적을 위한 다양한 단백질성 얼룩이 시판되고 있다. 세제 효소의 기능은 단백질-함유 얼룩을 분해하고 제거하는 것이다. 시험 결과는 세정 시험에 사용된 얼룩의 유형, 세제의 조성 및 직물의 성질 및 상태에 의해 좌우된다(Maurer, 2004).

본원과 관련된 용어 " 저온 "은 현재 많은 이용가능한 효소 제제, 특히 세제 효소 제제의 성능을 위해 최적이 아닌, 실험에 따른 10℃ 내지 30℃의 온도 범위를 의미한다. 용어 " 중온 "은 30℃ 내지 60℃의 온도 범위를 의미한다.

용어 " 저온 또는 중온 범위에서 응용가능한 "은 상기 효소가 저온 또는 중온 범위(10℃ 내지 60℃)에서 효과적으로 기능하는 것이 바람직할 수 있는 산업적 응용을 포함한다. 상기 응용은 식품, 사료 및 피혁 산업, 약제, 진단제, 폐기물 관리 및 은 회수에서의 이들의 용도를 포함한다. 본원에서 의미하는 바와 같이, 이들 응용은 식물 병리학적 진균 및 선충의 생물학적 제어에서 생물제어제로서 본 발명의 세린 프로테아제 효소의 용도를 배제한다.

본 발명에서, 용어 " 세제 안정성 "은 효소 또는 효소 변이체가 저장 및/또는 세척 동안에 세제 용액중에서 이의 활성을 충분히 유지함을 의미한다. 따라서, 실시예 6의 표 3에 기재된 바와 같이 에코라벨(Ecolabel) 표준 세제, 라이트 듀티(light duty)(wfk Testgewebe GmbH) 또는 시판되고 있는 액체 세제와 같은 세제의 존재하에 단백질성 얼룩 또는 물질을 분해시키거나 제거하는데 효율적이다. 상기 안정성은 예를 들면, 세제중에서 수일 항온처리(37℃에서)한 후 잔류 활성을 측정함에 의해 검정할 수 있다. 상기 잔류 프로테아제 활성은 실시예 3에 기재된 방법 또는 문헌(참조: Gupta et al. 2002)에 기재된 임의의 다른 방법을 사용하여 측정할 수 있다.

용어 세린 프로테아제의 " 유효량 "은 특이적 세제 조성물에서 효소 활성을 달성하기 위해 필요한 프로테아제 효소의 양을 언급한다. 바람직하게, 본 발명의 세제 조성물은 세제 조성물 중 약 0.0001중량% 내지 약 10중량%, 보다 바람직하게는 0.001중량% 내지 약 1중량%, 보다 더 바람직하게는 0.001중량% 내지 약 0.5중량%의 본 발명의 프로테아제 변이체를 포함한다.

전형적으로, 프로테아제의 세척 성능은 "얼룩 제거 효율" 또는 "얼룩 제거 효과" 또는 "세정 성질 정도"로서 측정되며, 이들 용어는 얼룩진 물질(예: 인위적으로 더럽힌 직물 또는 피검 의류)의 광택 또는 색 변화의 가시적이고 측정가능한 증가를 의미한다. 광택 또는 색 변화 값은 예를 들면 실시예 6 내지 실시예 8에 기재된 바와 같이 L*a*b* 색 공간 좌표를 이용한 분광계로 색을 반사율 값으로 측정함으로써 결정될 수 있다. 프로테아제 성능(얼룩 제거 효율)을 표시하는 단백질성 얼룩의 색바램 또는 제거는 예를 들면 ΔL*로서 계산되며, 이는 효소 처리된 직물의 광택 값 L* - 효소 없이 세척액(효소 블랭크 또는 대조군)으로 처리된 직물의 광택 값 L*을 의미한다. 세제의 존재는 얼룩의 제거에 있어서의 효소의 성능을 개선시킬 수 있다. 본 발명의 세린 프로테아제는 알칼리성 조건에서 다른 조성의 세제 존재 하에서 여러 종류의 단백질성 얼룩을 분해시킨다 (실시예 6 내지 실시예 8에 기재됨).

실시예 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 세린 프로테아제는 시판중인 프로테아제 제제 사비나제® 16 L 및 사비나제® 울트라 16L(도 6 및 도 7)보다 상당히 우수한 시판되는 액체 세제 중에서 10 내지 50℃에서 및 특히 30℃ 이하에서 혈액/밀크/잉크 얼룩을 제거하였다. 상기 효소 제제는 활성 단위로서 투약되었다. 상기 동일한 효과는 또한 투약량이 첨가된 단백질의 양으로서 계산되는 경우에 관찰되었다(도 8). 말브란케아 ALKO4122 프로테아제는 놀랍게도 카제인 기질에 대한 분석 조건에서 이의 최적 온도가 고온(대략 70℃, 도 5a)임에도 불구하고 매우 광범위한 온도 범위에서 및 특히 10 내지 30℃와 같은 저온에서 최적의 얼룩 제거 성능을 나타낸다. 분석 조건에서 유사한 온도 프로필을 갖는 사비나제®(도 5a)는 차가운 세척 온도에서 명백히 보다 낮은 성능을 보여준다. 상기 시험 결과는 본 발명에 따른 프로테아제가 광범위한 온도 범위에서 및 심지어 매우 차가운 세척 온도에서 액체 세제와 함께 우수한 성능을 가짐을 지적한다.

말브란케아 ALKO4122 프로테아제는 상이한 혈액/밀크/잉크 얼룩 이외에도, 30 및 60℃에서 액체 세제중에서 시험되는 경우 풀 및 코코아와 같은 얼룩을 제거하는데 효과적이었다. 처리는 ATLAS LP-2 Launder-Ometer 및 투약된 활성 효소 중에서 수행되었다. 결과(도 9a 내지 도 9h)는 말브란케아 프로테아제가 30 및 60℃의 온도 둘 다에서 몇몇의 얼룩에 대해 효과적임을 보여주고 사비나제® 울트라 16L과 비교하여 우수한 얼룩 제거 성능을 보여주었다. 말브란케아 ALKO4122는 또한 땅콩 오일/밀크 및 난황 얼룩에 대해 효과적이었다.

말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 성능은 또한 실시예 8에 기재된 바와 같은 pH 10.5 또는 10에서 각각 50℃에서 표백제 및 광학 증백제를 함유하는 시판중인 통상의 세제 분말 및 광학 증백제 및 표백제 없이 ECE 표준 세제 77과 함께 시험되었다. 폴리에스테르-면 물질에 대한 혈액/밀크/잉크 얼룩을 제거하는데 있어서 효소의 능력을 검정하였다. 도 10a 및 도 10b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프로테아제는 또한 매우 알칼리성인 조건에서 분말 세제용으로 적합하고 상기 효과는 각각의 효소 제제가 활성 단위로 투약되는 경우, 사비나제® 울트라 16L과 비교하여 유사하였다.

세척 이외에도, 본 발명의 효소는 실시예 9 및 실시예 10에 나타낸 바와 같이, 액체 세제 중에서 저장되는 경우에도 또한 저장 동안에도 이의 활성을 충분히 보유한다. 말브란케아 ALKO4122 프로테아제는 예를 들면, 푸사리움 프로테아제 Fe_RF6318 (WO2010125174A1)와 비교하여 37℃에서 우수한 저장 안정성을 갖는다(도 11a 및 도 11b). 도 12a 및 도 12b는 말브란케아 프로테아제가 푸사리움 프로테아제와 비교하여 에코라벨(Ecolabel) 표준 세제, 라이트 듀티(light duty)(wfk Testgewebe GmbH) 및 시판중인 액체 세제(표 3) 중에서 특히 우수한 안정성을 갖고 시판중인 세균 프로테아제 사비나제® 16L과 비교하여 에코라벨에서 유사한 안정성을 가짐을 보여준다. 승온에서 본 발명에 따른 프로테아제의 양호한 안정성은 특히 온대 기후 국가에서 액체 세제 제형에 적합하게 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 따라, 본 발명의 진균 세린 프로테아제는 실시예 6 내지 실시예 10에 나타낸 바와 같이 세제 액체 및 세제 분말 중에서 유용하다. 본 발명의 효소 제제의 효소는 수동 세탁용 및 기계 세탁용으로 제형화될 수 있거나 가정용 고체 표면 세정 또는 바람직하게는 수동 식기세척 작업 또는 기계 식기세척 작업에서의 사용을 위해 제형화될 수 있다.

결론적으로, 호열성 미생물 기원이고, 특히 저온에서 잘 작용하며 액체 세제 조성물중에서 혼화성이고 안정하여 안정화제 및 기타 첨가제가 덜 요구되는 새로운 열안정성 진균 세린 프로테아제 효소가 제공되는 것으로 보여질 수 있다.

본 발명은 본 발명의 일부 실시형태에 관한 하기의 실시예에서 설명되지만, 본 발명이 이들 실시예에만 제한됨을 의미하는 것은 아니다.

실시예

실시예 1

말브란케아 유래의 프로테아제를 클로닝하기 위한 프로브의 합성, 및 말브란 케아 ALKO4122 및 ALKO4178 균주 유래의 프로테아제 유전자의 클로닝

(a) DNA의 분리 및 사용된 분자 생물학 방법

표준 분자 생물학 방법은 이. 콜라이 형질전환, 서열분석 등에서 DNA의 분리 및 효소 처리(예를 들면, 플라스미드 DNA의 분리, DNA 단편을 제조하기 위한 DNA의 분해)에 사용하였다. 사용되는 기본 방법은 효소, 시약 또는 키트 제조업체에 의해 기재된 바와 같거나 표준 분자 생물학 핸드북(예를 들면, Sambrook and Russell (2001))에 기재된 바와 같다. 사상 진균 유래의 게놈 DNA의 분리는 문헌[참조: Raeder and Broda (1985)]에 상세히 기재된 바와 같이 수행하였다.

(b) 프로브 제조를 위한 프라이머

말브란케아 프로테아제를 암호화하는 유전자를 클로닝하기 위한 프로브는 PCR에 의해 합성하였다. 축퇴성 센스 및 안티센스 올리고스는 진균 프로테아제(예를 들면, WO2010125174, WO2010125175 및 WO2011003968에서 각각 푸사리움 에퀴세티 RF6318, 푸사리움 아쿠미나툼 RF7182, 티. 리세이 Prb1, AB Enzymes Oy)의 컨센서스 아미노산 서열을 기준으로 계획하였다. 추가의 5'-프라이머 (DET5)는 말브란케아 신나모메아 써모마이콜린(모두 34개 아미노산: Swiss-Prot 수탁번호 P13858.1)의 공개된 N-말단 서열로부터 선택된 영역에 따라 합성하였다. DET5를 고안하기 위해 상기 서열의 아미노산 20번 내지 28번을 사용하였다. 프라이머의 서열 및 이들의 고안을 위해 사용되는 펩타이드 서열(각각, 서열번호 1 내지 5 및 서열번호 6 내지 10)은 하기 표 1에 나타낸다. 프라이머의 계획에 사용되는 펩타이드 서열 및 이들의 서열번호 6 내지 10뿐만 아니라 올리고 명칭, 서열번호, 길이, 축퇴성 및 뉴클레오타이드 서열도 표에 포함된다.

(c) PCR 반응 및 전장 프로테아제 유전자를 클로닝하기 위한 프로브의 선택

말브란케아 ALKO4122 및 ALKO4178로부터 분리된 게놈 DNA 제제는 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다. 말브란케아 ALKO4122는 CBS 동정 서비스(네덜란드, 우트레흐트)에 의해 2011년 1월에 말브란케아 신나모메아(Lib.) 오르스코트 데 후그(말브란케아 풀켈라 변이체 설푸레아의 동의어 (Miehe) Cooney & R. Emers.)로서 동정되었다. 말브란케아 ALKO4178은 말브란케아 설푸레아로서 수탁기관[Roal Oy culture collection]에 기탁되었고 상기 분리물의 동정은 사상 진균의 동정을 전문으로 하는 CBS 또는 기타 기관에 의해 수행되었다.

게놈 DNA의 분리를 위해, 말브란케아 ALKO4122 및 ALKO4178 균사체는 50ml의 글루코스-효모 추출물 배지(25g 글루코스, 27.5g 효모 추출물 pH 6.5)중에서 250rpm으로 4일 동안 37℃에서 상기 균주를 배양함에 의해 성장시켰다. 상기 균사체를 수거하고 게놈 DNA를 분리하여 프로브 합성을 위한 주형으로서 사용하였다. 상기 PCR 반응 혼합물은 Phusion® GC 완충액(Finnzymes/Fisher Scientific, Finland), 0.2 mM dNTPs, 50 pmol의 각각의 프라이머, DMSO(용적의 1/10) 및 1 단위의 Phusion ^® 폴리머라제 (Finnzymes/Fisher Scientific) 및 50㎕의 반응 용적 당 대략 0.5 내지 1μg의 게놈 DNA를 함유하였다. PCR 반응을 위한 조건은 다음과 같다: 98℃에서 1분 초기 변성에 이어서 98℃에서 10초 28회, 45, 47, 52 및 57℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 30초 연장 및 72℃에서 5분동안 최종 연장. 프라이머 조합체 DET5(서열번호 5) 및 DET4(서열번호 4)는 3개의 최저 어닐링 온도에서 제조하였고(상기 참조) DNA 생성물은 약 0.8kb의 크기를 갖는다. 상기 크기는 공개된 진균 프로테아제 서열을 기준으로 하는 계산에 따라 프로테아제 유전자로부터 수득될 것으로 예상되는 크기에 상응하였다. 유사한 크기를 갖는 생성물은 ALKO4122 또는 ALKO4178 게놈 DNA를 주형으로서 사용했을 때 수득되었다. 상기 DNA 생성물은 PCR 반응 혼합물로부터 분리하여 정제하였고 제조업자의 지침(Invitrogen, USA)에 따라 pCR ^® 4 Blunt-TOPO 벡터에 라이게이션하였다. 수득한 플라스미드를 pALK3092(삽입체로서의 ALKO4122 PCR 생성물) 및 pALK3093(삽입체로서의 ALKO4178 PCR 생성물)로 명명하였다. 상기 삽입체는 pALK3092(서열번호 11) 및 pALK3093(서열번호 12) 둘 다로부터 서열분석하였다. 삽입체 둘 다는 길이가 791bp인 것으로 밝혀졌고 이들은 합성 영역(프라이머 서열은 무시함)에서 서로 하나의 뉴클레오타이드 차이를 나타내었다. pALK3092 삽입체에서 뉴클레오타이드 323번은 C이고 pALK3093 삽입체에서는 T였다. 각각 플라스미드 pALK3092 및 pALK3093을 포함하는 이. 콜라이 균주 RF8758 및 RF8759는 각각 수탁번호 DSM 24426 및 DSM 24427하에 수탁기관[DSMZ collection]에 기탁하였다.

BLASTP 검색은 디폴트 셋팅으로 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 프로그램 버젼 2.2.23을 사용하여 수득된 서열로 수행하였다(문헌참조: Altschul et al., 1990). 암호화된 아미노산 서열은 예를 들면, 운시노카르푸스 레시( Uncinocarpus reesii ) 유래의 하이포테티컬 및 보존된 하이포테티컬 단백질(각각 XP_002584481.1 및 XP_002583205.1) 및 코시디오이데스 포사다시 ( Coccidioides posadasii (EER24932.1)) 유래의 추정 서브틸리신-유사 단백질 및 코시디오이데스 이미티스( Coccidioides immitis )(XP_001239485.1) 유래의 하이포테티컬 단백질과 상동성을 나타냈고 59 내지 65%의 동일성을 갖는다. 따라서, 상기 결과는, PCR 반응으로부터 수득된 DNA 단편이 프로테아제를 암호화하는 유전자의 일부이고, 따라서 말브란케아 유래의 전장 프로테아제 유전자(들)을 스크리닝하기 위한 프로브로서 유용함을 나타낸다. 그러나, 프라이머 DET5에 의해 암호화된 서열에 이어지는 암호화된 아미노산 서열은 공개된 말브란케아 써모마이콜린 서열(아미노산 29번 내지 34번, 수탁번호 P13858)과 동일하지 않았다.

(d) 전장 말브란케아 ALKO4122 프로테아제 유전자의 클로닝

말브란케아 ALKO4122 및 ALKO4178 게놈 DNA는 써던 블롯 분석을 위해 몇몇의 제한 효소로 분해하였다. 상기 분해는 겔 상에서 전개하였고 써던 이전 및 하이브리드화를 수행하였다. 써던 블롯을 위한 프로브는 M13 역배향 프라이머 및 M13 정배향 프라이머 및 주형으로서의 pALK3092(실시예 1c)를 사용하는 PCR에 의해 표지화시켰다. 프로브 서열은 서열번호 11(실시예 1c)을 포함한다. PCR DIG(디곡시게닌) 표지화 혼합물 및 하이브리드화를 사용한 프로브의 표지화는 제조업자의 지침(Roche, Germany)에 따라 수행하였다. 하이브리드화는 68℃에서 밤새 수행하였다. 하이브리드화 후 필터는 다음과 같이 세척하였다: 2 x SSC - 0.1 % SDS를 사용하여 실온에서 2 x 5분 세척에 이어서 0.1 x SSC-0.1% SDS를 사용하여 68℃에서 2 x 15분 세척.

말브란케아 ALKO4122 및 ALKO4178 게놈 DNA에서 몇몇의 하이브리드화 단편을 검출하였다. 대부분의 분해물은 게놈 둘 다로부터 동일한 결과를 제공하였다. 대략 2.7 kb의 단편의 하이브리드화는 게놈 XbaI 분해물로부터 수득하였다. XbaI 단편은 전장 프로테아제 유전자를 함유하는 것으로 분석되었다(프로브 서열에 함유된 XbaI 및 PstI을 사용한 게놈 DNA의 이중 분해 및 공개된 진균 프로테아제 서열을 기초로 하는 크기 계산에 의해 수행됨). DNA 단편은 하이드리드화 단편(대략 2.7kb)의 크기 범위인 ALKO4122 게놈 XbaI 분해물로부터 분리하였다. 분리는 아가로스 겔로부터 수행하였다. 분리된 게놈 단편은 XbaI로 절단된 pBluescript II KS+ (Stratagene, USA) 벡터에 클로닝하였다. 라이게이션 혼합물을 에스케리치아 콜라이 XL 10-골드 세포(Stratagene)로 형질전환시키고 50μg/ml 앰피실린을 함유하는 LB(Luria-Bertani) 상에 도말하였다. 양성 이. 콜라이 콜로니는 프로브로서 PCR 표지된 pALK3092 삽입체와 함께 콜로니 하이브리드화를 사용하여 스크리닝하였다. 하이브리드화는 게놈 DNA 분해에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다. 모두 20개 클론을 플레이트로부터 집어내고 이들 중 8개가 XbaI 제한 분해 및 써던 블롯 하이브리드화(게놈 하이브리드화에 대해 기재된 바와 같이 수행됨)에 의해 예상된 크기를 갖는 삽입체를 함유하고 pALK3092 프로브와 하이브리드화하는 것으로 밝혀졌다. XbaI 삽입체 (2961 bp)를 서열분석하고 전장 말브란케아 ALKO4122 프로테아제 유전자(서열번호 13)를 함유하는 것으로 확인되었다. 상기 XbaI 게놈 단편을 함유하는 플라스미드는 pALK3094로 명명하였다. 플라스미드 pALK3094를 함유하는 이. 콜라이 균주 RF8791은 수탁번호 DSM 24410하에 수탁기관(DSMZ collection)에 기탁하였다T.

(e) 말브란케아 ALKO4122 프로테아제를 암호화하는 유전자 및 상기 프로테아제의 추론된 아미노산 서열의 특성확인

유전자 서열(서열번호 13), 이의 부분 프로모터 및 종결 서열 및 암호화된 프로테아제의 추론된 아미노산 서열(서열번호 14)은 도 1에 나타낸다. 유전자의 길이는 정지 코돈을 포함하여 1436 bp이다. 3개의 추정 인트론은 72, 87 및 71 bp의 길이를 갖는 것으로 밝혀졌다. 인트론은 여러 진균 인트론으로부터 동정된 것들에 따른 내부 컨센서스 서열 뿐만 아니라 컨센서스 5' 및 3' 경계 서열을 가졌다(문헌참조: Gurr et al., 1987). 추론된 단백질 서열(서열번호 14)은 20개 아미노산의 예측된 신호 서열 (문헌참조: SignalP V3.0; Nielsen et al., 1997 and Nielsen and Krogh, 1998) 및 100개 아미노산의 예측된 프로 서열을 포함하는 401개 아미노산으로 이루어진다. 성숙한 프로테아제의 N-말단의 위치, Ala 121를 다른 진균 프로테아제 서열과 비교하여 평가하였다. 성숙한 프로테아제의 예측된 분자량은 28530 Da이었고 예측된 pI는 6.15였다. 이들 예측은 ExPASy 서버(Gasteiger et al., 2003)에서 Compute pI/MW 도구를 사용하여 계산하였다. 추론된 성숙한 아미노산 서열은 성숙한 서열의 아미노산 위치 Asn134, Asn172 및 Asn277에서 3개의 가능한 N-당화 부위(도 1에서 아미노산 위치 254, 292 및 397)를 함유하였지만 CBS 서버 NetNGlyc V1.0에 따르면, Asn134 및 Asn277 위치에서의 부위만 유사하다.

말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 N-말단 서열은 단지 부분적으로 이전에 공개된 엠. 시나모네아 써모마이콜린 N-말단 서열(P13858)에 상응하였고, 단지 처음 28개 아미노산이 이들 2개의 서열과 동일하였다.

게놈 ALKO4122 프로테아제 유전자 서열과 상응하는 영역에서 비교하여 pALK3092에서의 말브란케아 ALKO4122 프로테아제 유전자 프로브 서열에는 1개의 뉴클레오타이드 차이가 있었다. 그러나 상기 게놈 ALKO4122 프로테아제 유전자 서열은 상응하는 영역에서 pALK3093에서의 ALKO4178 프로테아제 프로브 서열과 동일하였다. 따라서, pALK3092 삽입체에서 1개의 뉴클레오타이드 차이(실시예 1c)는 가장 가능하게는 프로브 PCR 반응시에 돌연변이로부터 비롯된 것이다.

(f) 말브란케아 ALKO4178 프로테아제 유전자의 클로닝

프라이머 DET27 (서열번호 19) 및 DET28 (서열번호 20)은 PCR에 의해 말브란케아 ALKO4178로부터 전장 프로테아제 유전자를 합성하기 위해 디자인하였다. DET 27은 프로모터(ATG로부터 뉴클레오타이드 -44 내지 -24) 기원의 센스 프라이머이고 DET28은 말브란케아 ALKO4122 프로테아제 유전자의 종결자(정지 코돈 기원의 뉴클레오타이드 55 내지 36) 기원의 안티센스 프라이머이다(도 1). PCR 반응 혼합물은 1XPhusion® HF 완충액 (Finnzymes/Fisher Scientific, Finland), 0.2 mM dNTPs, 75 pmol의 각각의 프라이머 및 2 단위의 Phusion® 폴리머라제 (Finnzymes/Fisher Scientific) 및 200㎕의 반응 용적 당 대략 1.5 μg의 게놈 DNA를 함유하였다. PCR 반응을 위한 조건은 다음과 같다: 98℃에서 30초 초기 변성에 이어서 98℃에서 10초 24회, 60 및 65℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 60초 연장 및 7분동안 72℃에서 최종 연장. 예상되는 길이(~ 1.5 kb)의 단편은 반응으로부터 수득하였다. 2개의 별도의 PCR 반응으로부터 단편을 분리하고 pCR4®Blunt-TOPO® 벡터에 연결하였다. 상기 삽입체는 별도의 클론으로부터 서열분석하였다. 클론 둘다에서 삽입체의 서열은 서로간에 및 말브란케아 ALKO4122 프로테아제 유전자, 이의 부분 프로모터 및 종결자와 동일하였다(도 1). 말브란케아 ALKO4178 프로테아제 유전자를 함유하는 플라스미드(수득된 PCR 단편)는 pALK3147로 명명하였다. 상기 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이 클론은 RF9332로서 기관[Roal Oy culture collection]에 보관하였다.

(g) 상동성 , 동일성 및 정렬 연구

성숙한 말브란케아 ALKO4122 프로테아제 아미노산 서열(서열번호 18)을 사용하여 공개 공급원으로부터 상동성 프로테아제 서열을 검색하였다. GenBank의 특허 분야에서 중복 단백질 서열과 단백질 서열 둘다를 검색하였다. 디폴팅 셋팅과 함께 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 BLASTP 프로그램 버젼 2.2.25을 검색에 사용하였다(문헌참조: Altschul et al., 1990). 모든 중복 서열로부터 수득된 최고 동일성은 코시디오이데스 포사타시 추정 서브틸리신 유사 프로테아제 (EER24932.1) 및 코씨디오이데스 이미티스 추정 단백질 CEVIG_09197 (XP_001239485.1)에 대해 66%였고, 운시노카푸스 레시 추정 단백질 UREG_05170 (EEP80328.1)에 대해 65%, 코시디오이데스 이미티스 추정 단백질 CIMB 01394 (XP_001247623.1), 코시디오이데스 포사다시 추정 서브틸리신 유사 프로테아제(EER23662.1), 운시노카푸스 레시 추정 단백질(EEP81307.1) 및 아트로더마 오타에 알칼리성 프로테이나제 (EEQ28657.1)에 대해 64% 였다. EER24932.1 및 XP 001239485.1는 단지 서로 3개의 아미노산에서 차이가 있고 XP 001247623.1와 EER23662.1는 서로 단지 1개의 아미노산에서 차이가 있다. 말브란케아 ALKO4122 프로테아제 서열은 ClustalW2 정렬을 사용하여 상기 상동성 서열과 정렬시켰다. 상기 프로테아제로부터의 추정 성숙한 서열을 정렬에 사용하였다. 각각의 프로테아제 기원의 성숙한 서열은 서로 비교하였다. ClustalW2 정렬(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)을 사용하여 수득된 동일성 값(스코어 %)은 표 2에 나타낸다. 신호 펩타이드 및 프로펩타이드를 배제한 성숙한 아미노산 서열은 디폴트 셋팅을 사용하여 정렬시켰다(단백질 중량 매트릭스: Gonnet, 공백 개시: 10, 공백 연장: 0.20, 공백 거리 5). 서열번호 18은 ALKO4122 프로테아제의 성숙한 아미노산 서열이다. 수득된 상기 상동성 값(스코어 %)은 63% 내지 65%였다.

특허 분야에서 서열에 대한 최고의 동일성은 US 5962765에서 서열번호 2(AAE30270.1; 메타리지움 아니소플리애 기원의 프로테아제) 및 WO 8807581에서 서열번호 15(AAA54276.1; 트리티라키움 알붐 기원의 프로테아제)에 대해 55%였다.

실시예 2

트리코더마 리세이에서 재조합 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 생성

(a) 생성 벡터 및 생성 균주의 제조

상기 발현 플라스미드 pALK3097는 트리코더마 리세이에서 재조합 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 생성을 위해 작제하였다. 이 자신의 신호 서열을 갖는 유전자는 PCR에 의해 티. 리세이 cbh1(cel7A) 프로모터에 정확하게 융합시켰다. 상기 PCR 반응에 사용되는 프라이머는 DET17 (5'-프라이머; 서열번호 21) 및 DET18 (3' -프라이머; 서열번호 22)로 명명하였다. DET17 프라이머는 SacII 부위(ATG로부터 위치 -16) 내지 위치 -1까지의 부분 cbh1 프로모터, 및 말브란케아 프로테아제 유전자의 처음 부분(ATG 개시 코돈을 포함하는 26개 뉴클레오타이드) 및 5' 말단에서 3개 추가의 뉴클레오타이드를 함유한다. DET18은 말브란케아 프로테아제 유전자의 말단 기원의 26개 뉴클레오타이드(정지 코돈을 포함하는) 및 이의 3' 말단 기원의 유전자를 pALK2777 링커(cbh1 종결자; 하기 참조)에 융합시키기 위한 BamHI 부위를 함유하는 링커를 함유한다. 상기 프로테아제 유전자의 천연 종결자는 상기 작제물에 포함되지 않는다.

상기 프로테아제 유전자는 SacII-BamHI 분해에 의해 PCR 단편으로부터 절단하였고 동일한 효소로 절단된 pALK2777 발현 벡터 골격에 융합시켰다(도 2). 상기 pALK2777 플라스미드는 cbh1 프로모터(SacII 부위에 대해), 예를 들면, BamHI 부위를 함유하는 링커, cbh1 종결자 및 형질전환체를 스크리닝하기 위한 합성 amdS 유전자를 함유한다. pALK2777에서 합성 amdS 유전자는 천연 amdS 유전자와 비교하여 단축된 종결자(XbaI 부위에 대해)를 함유한다(문헌참조: Kelly and Hynes, 1985). 또한, 천연 amdS 유전자의 인트론은 제거되었고 amdS 프로모터 및 유전자 기원의 선택된 제한 부위를 변형시켜 발현 카세트의 작제 및 분리를 용이하게 하였다. 그러나, 합성 amdS 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열은 야생형 amdS 유전자에 의해 암호화된 것과 동일하다.

7.2 kb의 선형 발현 카세트(도 3에 제공됨)는 NotI 분해 후 벡터 골격으로부터 분리하였고 트리코더마 리세이 원형질체를 형질전환시키기 위해 사용되었다. 사용된 티. 리세이 숙주 균주는 4개의 주요 티. 리세이 셀룰라제 (CBHI, CBHII, EGI, EGII)중 어느 하나를 생성하지 않는다. 상기 형질전환은 문헌[참조: Karhunen et al. (1993)]에 기재된 변형과 함께 문헌[참조: Penttila et al. (1987)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 상기 형질전환체는 이들을 PD상에 포자를 형성하기 전에 단일 분생자를 통해 선별 플레이트상에서 정제하였다.

(b) 진탕 플라스크 및 실험실 규모 생물반응기에서 프로테아제 제조

상기 형질전환체는 PD 슬랜트로부터 5% KH ₂ PO ₄ 및 pH 6.0으로 완충된 50ml의 복합 락토스 기반 셀룰라제 유도 배지(Joutsjoki et al., 1993)를 함유하는 진탕 플라스크에 접종하였다. 상기 형질전환체의 프로테아제 생성은 30℃, 250rpm에서 5일동안 형질전환체를 성장시킨 후 배양 상청액으로부터 분석하였다. SDS-PAGE 겔에서, 예상되는 질량의 재조합 프로테아제에 상응하는 약 30kDa의 주요 단백질 밴드는 소모된 배양 상청액으로부터 검출하였다. 상기 프로테아제 활성은 실시예 3에 기재된 바와 같은 기질로서 카제인을 사용하여 샘플로부터 분석하였다. 숙주와 비교하여 명백하게 증가된 활성은 배양 상청액으로부터 측정하였다. 진균 게놈으로의 발현 카세트의 통합은 써던 블롯 분석(여기서, 여러 게놈 분해물이 사용되었고 발현 카세트 pALK3097이 프로브로서 사용되었다)을 사용함에 의해 선택된 형질전환체로부터 확인하였다.

진탕 플라스크 배양물에서 최상의 프로테아제 활성을 나타내는 티. 리세이 형질전환체를 선택하여 실험실 규모의 생물반응기에서 배양하였다. 셀룰라제 유도 복합 배지를 상기 배양에 사용하였다. 배양물 또는 농축된 샘플로부터 수득된 소모된 배양 배지는 실시예 6 내지 10에 제공된 응용 시험에 대해서 뿐만 아니라 재조합 말브란케아 ALKO4122 프로테아제(실시예 3 내지 5)의 정제 및 추가의 생화학적 특성 분석을 위한 출발 물질로서 사용하였다.

실시예 3

프로테아제 활성 분석

프로테아제 활성은 기질로서 카제인을 사용하여 측정하였다. 프로테아제에 의한 카제인의 분해율은 시간의 함수로서 산-용해성 펩타이드 단편의 방출을 모니터링함에 의해 측정하였다. 산-용해성 펩타이드는 분광학적으로 정량하였다. 상기 결과는 ml당(또는 g당) 분당 1㎍의 타이로신으로 나타내었다.

상기 분석에 요구되는 처음 모든 시약 용액은 다음과 같은 탈이온수, Milli-Q 또는 등가물에서 제조하였다.

( STW ) 합성 수돗물:

하기의 스톡 용액을 제조하였다:

(A) 5.8g CaCl ₂ x 2 H ₂ 0 / 200 ml H ₂ 0

(B) 2.8g MgCl ₂ x 6 H ₂ 0 / 200 ml H ₂ 0

(C) 4.2g NaHCO ₃ / 200 ml H ₂ 0

10ml의 상기 용액들을 소정의 순서로 교반과 함께 300ml의 H ₂ O에 첨가하고 이어서 H ₂ O를 사용하여 1리터까지 채운다. 상기 수득한 용액은 합성 수돗물로서 불리운다.

합성 수돗물에서 트리스 용액 0.3 M:

36.3g의 트리즈마 염기(SIGMA T-1503)를 합성 수돗물에 용해시키고 1리터까지 채운다.

카제인 용액:

6g의 카제인(Hammarsten Usb. 12840)을 350ml의 합성 수돗물에 첨가하고 자기 교반과 함께 10분동안 용해시켰다. 50 ml의 트리스 용액을 첨가하고 상기 용액을 10분동안 추가로 교반시켰다. 이어서, 상기 용액을 70℃까지 가열하였다. 그 후, 온도를 50℃로 감소시키고 pH를 0.1M NaOH를 사용하여 8.5로 조정하였다. 실온에 도달할때까지 교반을 계속하였다. 상기 용액을 합성 수돗물로 500ml까지 채웠다. 상기 기질 용액을 냉장고(또는 동결 저장됨)에서 최대 3일동안 저장하였다.

110 mM의 트리클로로아세트산 시약 (반응 정지 용액):

18g의 TCA (Merck 807)를 H ₂ 0에 용해시키고 1리터까지 채웠다.

0.5M Na ₂ CO :

53g의 Na ₂ CO ₃ 를 H ₂ O에 용해시키고 1리터까지 채웠다.

폴린 용액:

25ml의 2N 폴린-시오칼토 페놀 시약(Ciocalteu's phenol reagent) (SIGMA, F 9252)을 H ₂ O를 사용하여 100ml까지 희석시켰다.

샘플 희석 완충액 :

상기 샘플을 50mM Tris-HCl 완충액(pH 8.5) 중에 희석시켰다.

가장 적합한 희석은 반응물에서 0.4 내지 0.8의 흡광도를 생성시킨다.

검정:

상기 검정은 50℃에서 5분동안 시험 튜브 중에 2.5ml의 기질 용액을 온화하게 함에 의해 개시하였다. 그 후, 0.5ml의 희석된 효소 용액을 첨가하고 볼텍스 믹서와 혼합하고 반응은 정확하게 30분동안 50℃에서 수행하였다. 상기 효소 블랭크는 샘플처럼 제조하였지만 상기 반응 정지 용액(110mM TCA)을 샘플 전에 시험 튜브중에 첨가하였다. 반응 후, 2.5ml의 정지 용액을 튜브중에 첨가하고(블랭크에 대해서는 아님), 내용물을 혼합하고 실온에서 30분동안 방치하였다. 튜브는 10분동안 4000rpm으로 원심분리하였다(문헌참조: Hettich Rotanta 460). 1ml의 투명한 상청액은 2.5 ml의 0.5 M의 Na ₂ C0 ₃ 및 0.5 ml의 희석된 폴린 시약과 혼합하였다. 10분동안 대기 후(발색), 혼합물의 흡광도(색상)를 효소 블랭크에 대하여 660nm에서 측정하였다.

적어도 2개의 병행 샘플은 각각의 측정에 사용하였다.

실시예 4.

재조합 프로테아제의 정제

세포 및 고체물을, 발효로부터 수득된 소모된 배양 배지(실시예 2)로부터 30분동안, +4℃에서 50000g의 원심분리로 제거하였다(문헌참조: Sorvall RC6 plus). 8ml의 상청액은 프로테아제의 정제를 위해 사용하였다. 모든 정제 단계는 냉실에서 수행하였다. 원심분리 한 후, 샘플을 20mM의 MES pH 5.3으로 평형화시킨 HiPrep 26/10 탈염 컬럼(제조원: GE Healthcare)에 적용하기 전에 0.44㎛ 필터(MILLEX HV Millipore)를 통해 여과하였다. 겔 여과된 샘플은 20mM MES pH 5.3으로 평형화시킨 1ml의 S 세파로스 HP 컬럼(제조원: GE Healthcare)에 적용하였다. 단백질은 증가하는 NaCl 농도 구배(0.5M)를 사용하여 용출시켰다. 프로테아제는 Amicon 울트라-4 10,000 CO 원심분리 여과기 장치 MILLIPORE를 사용하여 모으고 농축시킨 분획물을 함유한다. 샘플은 20 mM MES, 150 mM NaCl pH 5.3으로 평형화시키는 슈퍼덱스 75 겔 여과 컬럼을 사용하여 추가로 정제하였다. 프로테아제는 pH 및 온도 프로필의 특성 분석을 위해 배합되고 사용된 분획물을 함유한다. 최종 샘플은 SDS PAGE 겔 상에서 분석하였다(도 4).

실시예 5.

재조합 프로테아제의 특징 분석

온도 프로필

온도 프로필은 실시예 3에 기재된 바와 같은 분석을 사용함에 의해 재조합 말브란케아 프로테아제 및 사비나제® 16L에 대해 수득하였다. 상기 결과는 도 5a에 나타낸다. 상기 프로테아제는 70℃ 주변의 최적 온도를 갖는다.

pH -프로필

말브란케아 프로테아제 및 사비나제® 16L의 pH 프로필은 효소 샘플이 희석되고 카제인이 40mM 브리톤-로빈슨 완충액 중에 용해되고, 반응 pH를 pH 6 내지 10으로 조정하고, 반응 시간이 30분이고 효소 반응이 0.22M 나트륨 아세테이트 및 0.33M 아세트산을 함유하는 0.11M TCA 용액을 사용하여 정지되는 것을 제외하고는 실시예 3에 기재된 바와 같은 기질로서 카제인을 사용하여 50℃에서 측정하였다. 상기 결과는 도 5b에 나타낸다. 상기 재조합 프로테아제는 pH 6 내지 pH 10에서 50% 이상의 상대적 활성을 나타내고 pH 10주변에서 최고 활성을 나타낸다.

실시예 6.

상이한 온도에서 액체 세제를 사용한 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 얼룩 제거 성능

실시예 2 (b)에 기재된 바와 같은, 트리코더마에서 생성된 말브란케아 ALKO4122 프로테아제는 5g/l 농도의 시판중인 액체 세제의 존재하에 10, 20, 30 및 50℃에서 혈액/밀크/잉크 표준 얼룩을 제거하는 이의 능력에 대해 시험되었다(표 3). 표준 얼룩, 인공적으로 얼룩진 시험 옷 Art.117 (혈액/밀크/잉크, 폴리에스테르 + 면, 시리얼 번호 11-08 또는 10-07, EMPA Testmaterialen AG, Switzerland)를 시험 물질로서 사용하였다. 시판중인 프로테아제 제제 사비나제® 16L 및 사비나제® 울트라 16L (프로테아제 억제제, 4-FBPA를 함유함) 및 효소 없이 처리(대조군)는 비교용으로 사용하였다. 각각의 효소 제제는 세척액 ml 당 0 내지 8 또는 0 내지 16의 활성 단위(㎍ 타이로신/분)로 투여하였다. 활성은 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정하였다.

5g의 시판중인 액체 세제는 1리터의 수돗물(dH≤4)에 용해시키고 자기 교반기로 잘 혼합하고 세척 온도로 온화시켰다. 세척액 중의 pH는 대략 8이었다. 얼룩 직물을 먼저 1.5cm x 1.5cm 스와치로 절단하고 상기 조각을 구석 부분을 절단하여 둥글게 하였다. 조각들을 미세적정 플레이트의 웰에 위치시켰다(Nunc 150200). 직경이 2cm인 각각의 웰에, 물(대략 50 ㎕)중에서 세제 및 효소 희석액을 함유하는 1.5ml의 세척액을 직물의 상부에 첨가하였다. 샘플과 함께 플레이트는 130rpm으로 60분동안 10, 20, 30 및 50℃에서 Infors Ecotron 배양 진탕기에서 항온처리하였다. 그 후, 스와치는 흐르는 물하에 주의깊게 세정하였고(대략 세척 온도) 일조에 대해 보호된 그리드상에 실내에서 밤새 건조시켰다.

상기 얼룩 제거 효과는 L*a*b* 색상 공간 배위체 (illuminant D65/2°)를 사용하는 미놀타 CM 2500 분광측정기로 굴절값으로서 색상을 측정함에 의해 평가하였다. 스와치의 양 측면으로부터 색상은 처리 후 측정하였다. 각각의 값은 직물의 양 측면으로부터 측정된 2개 이상의 병행 직물 샘플의 평균값이다. 혈액/밀크/잉크 얼룩의 색의 희미함은 프로테아제 성능(얼룩 제거 효율)을 지적하고 △L* (델타 L*)로 계산하고 이것은 효소 처리된 직물의 명도값 L* - 효소 부재하에 세척액으로 처리된 직물(효소 블랭크, 대조군)의 명도값 L*을 의미한다.

도 6a 내지 도 6d에 나타낸 결과는 말브란케아 ALKO4122 프로테아제가 시판중인 사비나제® 제제와 비교하여 시험된 모든 온도에서 혈액/밀크/잉크 얼룩(Art.117, 시리얼 번호 11-08)에 대해 상당히 우수한 효과를 가짐을 지적한다. 혈액/밀크/잉크 얼룩의 보다 오래된 배치(시리얼 번호 10-07)는 효소 없이(단지 세제만으로) 제거하기란 보다 어려웠고 따라서 효소 기여(△L*)가 보다 새로운 배치 11-08로 수행된 시험과 비교하여 상당히 보다 높은 것으로 나타났다. 말브란케아 제제는 사비나제® (도 7a 내지 도 7d)와 비교하여 상기 어려운 오래된 얼룩 물질에 대해 보다 효율적이었다. 또한, 투여량이 첨가된 단백질의 양으로서 계산되는 경우(도 8a 내지 도 8d), 상기 얼룩 제거 효율은 말브란케아 설푸레아 ALKO4122 프로테아제를 사용하는 경우 가장 높았다. 효소 제제로부터 단백질의 양은 표준물로서 소 감마글로불린(Bio-Rad)를 사용하는 Bio-Rad 단백질 분석 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)으로 측정하였다.

말브란케아 ALKO4122 프로테아제가 카제인 기질에 대한 분석적 조건하에서 이의 최적의 고온(대략 70℃, 도 5a)에도 불구하고, 매우 광범위한 온도 범위 및 특히, 10 내지 30℃와 같은 저온에서 최적의 얼룩 제거 성능을 보여준다는 것은 놀랍다. 분석학적 조건(도 5)에서 유사한 온도 프로필을 갖는 사비나제®(도 5a)은 냉 세척 온도에서 명백히 보다 낮은 성능을 보여준다. 이들 시험 결과는 말브란케아 ALKO4122 프로테아제가 광범위한 온도 범위 및 심지어 매우 낮은 세척 온도에서 우수한 성능을 가짐을 지적한다.

실시예 7.

액체 세제 및 상이한 얼룩과 함께 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 세탁 시험

실시예 2(b)에 기재된 바와 같이, 트리코더마에서 생성된 말브란케아 ALKO4122 프로테아제는 시판되고 있는 프로테아제 제제 사비나제® 울트라 16 L과 비교하여 30 및 60℃에서 시판되고 있는 액체 세제를 사용하여 상이한 얼룩을 제거하는 능력에 대해 시험하였다. 하기의 EMPA 기원의 인공 얼룩진 시험 옷을 사용하였다: 혈액/밀크/잉크 (Art.117, 시리얼 번호 11-08 및 10-07, 폴리에스테르 + 면), 혈액/밀크/잉크 (Art.116, 시리얼 번호 18-16, 면), 풀 (Art. 164, 시리얼 번호 23-03, 면) 및 코코아 (Art.112, 시리얼 번호 31-06, 면). 상기 직물은 6cm x 6cm 스와치로 절단하였고 상기 가장자리는 지그-재그 바느질로 깔금하게 하였다.

얼룩 제거 처리는 다음과 같이 LP-2 세탁기 Ometer 중에서 다음과 같이 수행하였다. 세탁기 Ometer는 먼저 30 또는 60℃로 예비 가열하였다. 이어서 세척액 ml 당 0, 2, 5, 10 및 20 (40) 활성 단위의 효소는 250ml의 온화된 세척액 및 얼룩 스와치를 함유하는 1.2리터의 용기에 첨가하였다. 활성(㎍ 타이로신/분)은 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정하였다. 상기 세척액은 수돗물 (dH ≤ 4) 리터 당 5g의 시판되고 있는 액체 세제를 함유하였고 이의 pH는 대략 8이었다. 세탁기 Ometer는 42rpm의 회전 속도로 60분동안 30℃에서 수행하였다. 그 후, 상기 스와치는 세정수(약 20℃)하에 주의깊게 세정하였고 일조에 대해 보호된 그리드상에서 실내 공기에서 밤새 건조시켰다.

처리 후 스와치의 색상은 L*a*b* 색상 공간 배위체를 사용하는 미놀타 CM 2500 분광측정기로 측정하였고 얼룩 제거 효과는 실시예 6에 기재된 바와 같이 △L*로서 계산하였다. 스와치의 양 측면으로부터의 색상은 처리 후 측정하였다. 각각의 값은 스와치 당 12개 이상의 측정치의 평균값이다. 상기 측정은 직물의 폴딩 때문에 처리 동안에 형성된 마크를 주름짖게 하는 면적(면 얼룩 Art. 116 and Art. 112에서)으로부터 회피하였다.

도 9a 내지 도 9h에 나타낸 결과는 말브란케아 설푸레아 ALKO4122 프로테아제가 시판되고 있는 프로테아제 제제 사비나제® 울트라 16L과 비교하여, 30 및 60℃에서 풀 얼룩(Art. 164, 시리얼 번호 23-03) 및 상이한 혈액/밀크/잉크 얼룩(Art.117, 시리얼 번호 11-08 및 10-07, Art.116, 시리얼 번호 18-16)에 대해 보다 우수한 효과를 가짐을 지적한다. 10 - 20 단위의 사비나제® 울트라 16L의 투여량은 세제 효소에 대해 전형적인 사용 수준 범위에 있는, 세제의 중량 당 0.4 내지 0.7%의 효소 제제의 투여량과 동일하였다.

또한, 코코아 얼룩으로 수득된 결과는 사비나제® Ultra 16L과 비교하여 말브란케아로 보다 우수하였다(데이터는 나타내지 않음). 추가의 세탁기 시험에서 (데이터는 나타내지 않음), 말브란케아 프로테아제는 또한 CFT의 하기 얼룩(Center for Testmaterials BV, 네덜란드: 땅콩유, 안료, 높은 밀크 (C-10), 난황, 안료, 숙성된 (CS-38), 풀 추출물 (CS-08))에 대해 30℃에서 효과적인 것으로 밝혀졌다. 동일한 시판되고 있는 액체 세제는 모든 시험에 사용하였다. 이들 시험의 결과는 말브란케아 프로테아제가 광범위한 온도 범위 30 - 60℃에서 여러 얼룩에 대해 효율적임을 지적한다.

실시예 8.

세제 분말과 함께 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 얼룩 제거 성능

세제(5g/l)의 존재하에 혈액/밀크/잉크 표준 얼룩을 제거하기 위해 트리코더마에서 생성된 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 능력은 실시예 7에 기재된 바와 같이 유사한 시험 시스템을 사용하여 50℃에서 시험하였고, 단, 표백제, 광학 증백제 및 포스페이트/포스포네이트를 함유하는 시판되고 있는 통상적인 세제 분말 및 광학 증백제 및 표백제(Art. 601, EMPA)가 없는 ECE 표준 세제 77가 사용되었다. 또한, 처리 후 스와치의 색상은 L*a*b* 색상 공간 배위체를 사용하는 미놀타 CM 2500 분광측정기로 측정하였고 얼룩 제거 효과는 실시예 6에 기재된 바와 같이 △L*로 계산하였다.

결과(도 10a 및 도 10b)는 말브란케아 ALKO4122 프로테아제가 또한 고알칼리성 조건(pH 약 10 내지 10.5)에서 세제 분말과 함께 사용될 수 있음을 보여준다.

실시예 9.

말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 저장 안정성

37℃에서 트리코더마에서 생성된 말브란케아 ALKO4122의 저장은 하기의 제형 레시피를 사용하여 시험하였다: 1) 0.2 % (w/w) Proxel LV (보존제, Arch Biosides, UK), 6으로 조정된 pH, 2) 20 % 프로필렌 글리콜, 6으로 조정된 pH, 3) 50% 프로필렌 글리콜, 5.5로 조정된 pH. 상기 샘플을 사르스테트(Sarstedt) 시험 튜브(13ml)에 팩킹시키고 37℃에서 항온처리하였다. 특정 간격으로 활성을 측정하고 (실시예 3에 기재된 바와 같이) 유사한 조건에서 푸사리움 프로테아제 Fe_RF6318 (WO2010125174A1)으로 수득된 조기 결과와 비교하였다.

도 11은 말브란케아 ALKO4122 프로테아제가 야생형 푸사리움 프로테아제 Fe_RF6318와 비교하여 승온(37℃)에서 우수한 저장 안정성을 가짐을 보여준다. 프로필렌 글리콜이 안정화를 위해 사용되는 경우, 푸사리움 프로테아제의 잔류 활성은 7일 항온처리 후 약 20%인 반면 말브란케아 프로테아제는 상기 시점에서 활성을 잃지 않았다.

실시예 10.

액체 세제 중에서 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 안정성

37℃에서 트리코더마에서 생성된 말브란케아 ALKO4122 프로테아제의 안정성은 시판중인 액체 세제(표 3) 및 에코라벨 표준 세제, 라이트 듀티(Ch. Nr. 196-391, wfk Testgewebe GmbH) 중에서 시험하였다. 사비나제® 16L 및 푸사리움 프로테아제 Fe_RF6318 (WO2010125174A1)은 표준물로서 사용하였다.

하기의 시험 시스템을 사용하였다: 0.4 g의 효소 제제 및 9.6g의 세제 용액은 사르스테트 시험 튜브(13ml) 중에서 잘 혼합하였다. 0.2%의 Proxel LV는 다른 성분과 이를 혼합하기 전에 세제 중에 보존제로서 사용하였다. 시판되고 있는 액체 세제 중에 제조된 샘플의 pH값은 대략 8이었다. 에코라벨 표준 세제 중에 제조된 샘플의 pH는 대략 7.2였다. 시험 튜브는 37℃에서 항온처리하고 상기 프로테아제 활성은 특정 간격으로 실시예 3에 기재된 방법에 따라 측정하였다.

도 12는 말브란케아 ALKO4122가 야생형 푸사리움 프로테아제 Fe_RF6318 (WO2010125174A1)과 비교하여 액체 세제 중에서 승온(37℃)에서 매우 우수한 저장 안정성을 가짐을 보여준다. 말브란케아 프로테아제는 에코라벨 표준 세제중에서의 사비나제® 16L과 비교하여 유사한 안정성을 가졌다.

실온에서 우수한 안정성이 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).

참조문헌

센트랄뷔레아우 포르 스힘멜퀼튀레스(CBS)

CBS128533

20101220

센트랄뷔레아우 포르 스힘멜퀼튀레스(CBS)

CBS128564

20110105

도이췌 삼룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(DSMZ)

DSM24410

20101220

도이췌 삼룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(DSMZ)

DSM24426

20110103

도이췌 삼룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(DSMZ)

DSM24427

20110103

SEQUENCE LISTING <110> AB ENZYMES OY <120> PROTEASE ENZYME AND USES THEREOF <130> B1005PFI <150> FI 20115310 <151> 2011-03-31 <150> US 61/470,168 <151> 2011-03-31 <160> 22 <170> KopatentIn 1.7 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of DET1 sense primer used in PCR for Malbranchea protease probe synthesis. <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 ggncayggna cncaygt 17 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of DET2 sense primer used in PCR for Malbranchea protease probe synthesis. <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <400> 2 aaytgggcng tnaaygayat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of DET3 antisense primer used in PCR for Malbranchea protease probe synthesis. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 3 nccrtarttn gtraanswng 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of DET4 antisense primer used in PCR for Malbranchea protease probe synthesis. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 4 ngccatnswn gtnccnswda 20 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of DET5 sense primer used in PCR for Malbranchea protease probe synthesis. <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 5 cargcnggna thmgngayta ycayta 26 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a consensus peptide sequence used for design of DET1 sense PCR primer. <400> 6 Gly His Gly Thr His Val 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a consensus peptide sequence used for design of DET2 sense PCR primer. <400> 7 Asn Trp Ala Val Asn Asp Ile 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a consensus peptide sequence used for design of DET3 antisense PCR primer. <400> 8 Ala Ser Phe Thr Asn Tyr Gly 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of a consensus peptide sequence used for design of DET4 antisense PCR primer. <400> 9 Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of the peptide sequence used for design of DET5 sense PCR primer. <400> 10 Gln Ala Gly Ile Arg Asp Tyr His Tyr 1 5 <210> 11 <211> 791 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of the PCR fragment obtained using DET5 and DET4 in PCR reaction and Malbranchea ALKO4122 genomic DNA as a template. This fragment contains a partial Malbranchea protease gene and is an insert in the plasmid pALK3092. <400> 11 caggcgggaa ttagggatta tcactacgat gactccgccg gtgaaggcgt catcgtctat 60 gatgttgaca ccggtattga catcagccat ccggatttcg agggccgtgc tatatggggt 120 tccaaccatg tcgaccgcgt taaccaggat cagaatggcc atgggacaca cgttgctggt 180 actattggtg gaagggcgta cggagtcgcc aagaaggcca caatagtggc tgtcaaggtt 240 ctcgacgccc aggggtcagg tactatcagc ggtattattg ctggtcttga ctggagtgtc 300 aatcatgctc gacagaatgg agccactaga agagcggctt tgaacatgag ccttggcggt 360 gggcgcagta tctctttcaa tcaggctgct gcaagtgctg tccaagccgg attgttcgtc 420 gcggttgctg ccggaaatga aggggtaagt gacttctttc tggcccctcc tatccgtacc 480 tgcagaagct aaccagattg ctcttatttt ttttcttttt tcaaaatata gcaaaatgca 540 ggtaacactt ccccagcctc agagccttct gtttgcacag taggggcaac ctcatcgaat 600 gatgccgcca catcctggtc caactatggc tcagttggta cgtagggctc ggttttattt 660 attacttctt ccccacatgc gatcagaccg gccgctgact atatttagtt gacgtttacg 720 ctcccggaga cgcaattgtc tctacctggc ccggtggcgg ttccaggtct ctcaccggca 780 cctcgatggc t 791 <210> 12 <211> 791 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223 > Sequence of the PCR fragment obtained using DET5 and DET4 in PCR reaction and Malbranchea ALKO4178 genomic DNA as a template. This fragment contains a partial Malbranchea protease gene and is an insert in the plasmid pALK3093. <400> 12 caagccggaa ttagtgatta ccactacgat gactccgccg gtgaaggcgt catcgtctat 60 gatgttgaca ccggtattga catcagccat ccggatttcg agggccgtgc tatatggggt 120 tccaaccatg tcgaccgcgt taaccaggat cagaatggcc atgggacaca cgttgctggt 180 actattggtg gaagggcgta cggagtcgcc aagaaggcca caatagtggc tgtcaaggtt 240 ctcgacgccc aggggtcagg tactatcagc ggtattattg ctggtcttga ctggagtgtc 300 aatcatgctc gacagaatgg agtcactaga agagcggctt tgaacatgag ccttggcggt 360 gggcgcagta tctctttcaa tcaggctgct gcaagtgctg tccaagccgg attgttcgtc 420 gcggttgctg ccggaaatga aggggtaagt gacttctttc tggcccctcc tatccgtacc 480 tgcagaagct aaccagattg ctcttatttt ttttcttttt tcaaaatata gcaaaatgca 540 ggtaacactt ccccagcctc agagccttct gtttgcacag taggggcaac ctcatcgaat 600 gatgccgcca catcctggtc caactatggc tcagttggta cgtagggctc ggttttattt 660 attacttctt ccccacatgc gatcagaccg gccgctgact atatttagtt gacgtttacg 720 ctcccggaga cgcaattgtc tctacctggc ccggtggcgg ttccaggtct ctctcaggaa 780 caaccatggc t 791 <210> 13 <211> 1436 <212> DNA <213> Malbranchea cinnamomea <220> <221> misc_feature <223> genomic sequence <400> 13 atgggcgtct tcagcaaact cttgtatctg tcttttgcag tcacggcctc tgtcaatgcc 60 ggtgaaatcc tttcagtcgc caacaaggac agtgttatcc ctgacacgta tatcgtggtg 120 ttgaaggaag gagtttcaac ccaggagttc aatgctcata aaaactgggt gaacgagatt 180 catcgcacca acctcacgag gcgtgacctg ggtttcactg gcgagttaaa gcatagctat 240 gattttggtg gacatggact gaagggctac agcggcaagt ttgatgccac tgccattcag 300 gaaattgcca atgatcctaa tgtatgcttg ttaagaattc ttcccagcga gatatcttca 360 tgcaagccat gcaattgctg acaggtgaat taggtggcct acgtcgaacc ggaccaggag 420 gtgaagcttg atgcattggt gacgcagagt aatgcaccat cctggggcct tggccgtatt 480 tccaaccgac aggctggtat tcgtgattac cactacgatg actccgccgg tgaaggcgtc 540 atcgtctatg atgttgacac cggtattgac atcagccatc cggatttcga gggccgtgct 600 atatggggtt ccaaccatgt cgaccgcgtt aaccaggatc agaatggcca tgggacacac 660 gttgctggta ctattggtgg aagggcgtac ggagtcgcca agaaggccac aatagtggct 720 gtcaaggttc tcgacgccca ggggtcaggt actatcagcg gtattattgc tggtcttgac 780 tggagtgtca atcatgctcg acagaatgga gtcacta gaa gagcggcttt gaacatgagc 840 cttggcggtg ggcgcagtat ctctttcaat caggctgctg caagtgctgt ccaagccgga 900 ttgttcgtcg cggttgctgc cggaaatgaa ggggtaagtg acttctttct ggcccctcct 960 atccgtacct gcagaagcta accagattgc tcttattttt tttctttttt caaaatatag 1020 caaaatgcag gtaacacttc cccagcctca gagccttctg tttgcacagt aggggcaacc 1080 tcatcgaatg atgccgccac atcctggtcc aactatggct cagttggtac gtagggctcg 1140 gttttattta ttacttcttc cccacatgcg atcagaccgg ccgctgacta tatttagttg 1200 acgtttacgc tcccggagac gcaattgtct ctacctggcc cggtggcggt tccaggtctc 1260 tctcaggcac atcgatggct tctccacacg tcgccggcct gggtgcatac ctcatcgctc 1320 tggagggcat tagcggaggc agtgtatgtg accgtatcaa agagctggct caacctgtcg 1380 tccagcctgg tccaggcacc accaaccgtc ttatctacaa cggcagtggc cgctaa 1436 <210> 14 <211> 401 <212> PRT <213> Malbranchea cinnamomea <220> <221> misc_feature <223> genomic sequence <400> 14 Met Gly Val Phe Ser Lys Leu Leu Tyr Leu Ser Phe Ala Val Thr Ala 1 5 10 15 Ser Val Asn Ala Gly Glu Ile Leu Ser Val Ala Asn Lys Asp Ser Val 20 25 30 Ile Pro Asp Thr Tyr Ile Val Val Leu Lys Glu Gly Val Ser Thr Gln 35 40 45 Glu Phe Asn Ala His Lys Asn Trp Val Asn Glu Ile His Arg Thr Asn 50 55 60 Leu Thr Arg Arg Asp Leu Gly Phe Thr Gly Glu Leu Lys His Ser Tyr 65 70 75 80 Asp Phe Gly Gly His Gly Leu Lys Gly Tyr Ser Gly Lys Phe Asp Ala 85 90 95 Thr Ala Ile Gln Glu Ile Ala Asn Asp Pro Asn Val Ala Tyr Val Glu 100 105 110 Pro Asp Gln Glu Val Lys Leu Asp Ala Leu Val Thr Gln Ser Asn Ala 115 120 125 Pro Ser Trp Gly Leu Gly Arg Ile Ser Asn Arg Gln Ala Gly Ile Arg 130 135 140 Asp Tyr His Tyr Asp Asp Ser Ala Gly Glu Gly Val Ile Val Tyr Asp 145 150 155 160 Val Asp Thr Gly Ile Asp Ile Ser His Pro Asp Phe Glu Gly Arg Ala 165 170 175 Ile Trp Gly Ser Asn His Val Asp Arg Val Asn Gln Asp Gln Asn Gly 180 185 190 His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Gly Gly Arg Ala Tyr Gly Val 195 200 205 Ala Lys Lys Ala Thr Ile Val Ala Val Lys Val Leu Asp Ala Gln Gly 210 215 220 Ser Gly Thr Ile Ser Gly Ile Ile Ala Gly Leu Asp Trp Ser Val Asn 225 230 235 240 His Ala Arg Gln A sn Gly Val Thr Arg Arg Ala Ala Leu Asn Met Ser 245 250 255 Leu Gly Gly Gly Arg Ser Ile Ser Phe Asn Gln Ala Ala Ala Ser Ala 260 265 270 Val Gln Ala Gly Leu Phe Val Ala Val Ala Ala Gly Asn Glu Gly Gln 275 280 285 Asn Ala Gly Asn Thr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val 290 295 300 Gly Ala Thr Ser Ser Asn Asp Ala Ala Thr Ser Trp Ser Asn Tyr Gly 305 310 315 320 Ser Val Val Asp Val Tyr Ala Pro Gly Asp Ala Ile Val Ser Thr Trp 325 330 335 Pro Gly Gly Gly Ser Arg Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro 340 345 350 His Val Ala Gly Leu Gly Ala Tyr Leu Ile Ala Leu Glu Gly Ile Ser 355 360 365 Gly Gly Ser Val Cys Asp Arg Ile Lys Glu Leu Ala Gln Pro Val Val 370 375 380 Gln Pro Gly Pro Gly Thr Thr Asn Arg Leu Ile Tyr Asn Gly Ser Gly 385 390 395 400 Arg <210> 15 <211> 1376 <212> DNA <213> Malbranchea cinnamomea <220> <221> misc_feature <223> genomic sequence <400> 15 ggtgaaatcc tttcagtcgc caacaaggac agtgttatcc ctgacacgta tatcgtggtg 60 ttgaaggaag gagtttcaac ccaggagttc aatgctcata aaaactgggt gaacg agatt 120 catcgcacca acctcacgag gcgtgacctg ggtttcactg gcgagttaaa gcatagctat 180 gattttggtg gacatggact gaagggctac agcggcaagt ttgatgccac tgccattcag 240 gaaattgcca atgatcctaa tgtatgcttg ttaagaattc ttcccagcga gatatcttca 300 tgcaagccat gcaattgctg acaggtgaat taggtggcct acgtcgaacc ggaccaggag 360 gtgaagcttg atgcattggt gacgcagagt aatgcaccat cctggggcct tggccgtatt 420 tccaaccgac aggctggtat tcgtgattac cactacgatg actccgccgg tgaaggcgtc 480 atcgtctatg atgttgacac cggtattgac atcagccatc cggatttcga gggccgtgct 540 atatggggtt ccaaccatgt cgaccgcgtt aaccaggatc agaatggcca tgggacacac 600 gttgctggta ctattggtgg aagggcgtac ggagtcgcca agaaggccac aatagtggct 660 gtcaaggttc tcgacgccca ggggtcaggt actatcagcg gtattattgc tggtcttgac 720 tggagtgtca atcatgctcg acagaatgga gtcactagaa gagcggcttt gaacatgagc 780 cttggcggtg ggcgcagtat ctctttcaat caggctgctg caagtgctgt ccaagccgga 840 ttgttcgtcg cggttgctgc cggaaatgaa ggggtaagtg acttctttct ggcccctcct 900 atccgtacct gcagaagcta accagattgc tcttattttt tttctttttt caaaatatag 960 caaaatgcag gtaacacttc cccagcctca gagccttctg tttgcacagt aggggcaacc 1020 tcatcgaatg atgccgccac atcctggtcc aactatggct cagttggtac gtagggctcg 1080 gttttattta ttacttcttc cccacatgcg atcagaccgg ccgctgacta tatttagttg 1140 acgtttacgc tcccggagac gcaattgtct ctacctggcc cggtggcggt tccaggtctc 1200 tctcaggcac atcgatggct tctccacacg tcgccggcct gggtgcatac ctcatcgctc 1260 tggagggcat tagcggaggc agtgtatgtg accgtatcaa agagctggct caacctgtcg 1320 tccagcctgg tccaggcacc accaaccgtc ttatctacaa cggcagtggc cgctaa 1376 <210> 16 <211> 381 <212> PRT <213> Malbranchea cinnamomea <220> <221> misc_feature <223> genomic sequence <400> 16 Gly Glu Ile Leu Ser Val Ala Asn Lys Asp Ser Val Ile Pro Asp Thr 1 5 10 15 Tyr Ile Val Val Leu Lys Glu Gly Val Ser Thr Gln Glu Phe Asn Ala 20 25 30 His Lys Asn Trp Val Asn Glu Ile His Arg Thr Asn Leu Thr Arg Arg 35 40 45 Asp Leu Gly Phe Thr Gly Glu Leu Lys His Ser Tyr Asp Phe Gly Gly 50 55 60 His Gly Leu Lys Gly Tyr Ser Gly Lys Phe Asp Ala Thr Ala Ile Gln 65 70 75 80 Glu Ile Ala Asn Asp Pro Asn Val A la Tyr Val Glu Pro Asp Gln Glu 85 90 95 Val Lys Leu Asp Ala Leu Val Thr Gln Ser Asn Ala Pro Ser Trp Gly 100 105 110 Leu Gly Arg Ile Ser Asn Arg Gln Ala Gly Ile Arg Asp Tyr His Tyr 115 120 125 Asp Asp Ser Ala Gly Glu Gly Val Ile Val Tyr Asp Val Asp Thr Gly 130 135 140 Ile Asp Ile Ser His Pro Asp Phe Glu Gly Arg Ala Ile Trp Gly Ser 145 150 155 160 Asn His Val Asp Arg Val Asn Gln Asp Gln Asn Gly His Gly Thr His 165 170 175 Val Ala Gly Thr Ile Gly Gly Arg Ala Tyr Gly Val Ala Lys Lys Ala 180 185 190 Thr Ile Val Ala Val Lys Val Leu Asp Ala Gln Gly Ser Gly Thr Ile 195 200 205 Ser Gly Ile Ile Ala Gly Leu Asp Trp Ser Val Asn His Ala Arg Gln 210 215 220 Asn Gly Val Thr Arg Arg Ala Ala Leu Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly 225 230 235 240 Arg Ser Ile Ser Phe Asn Gln Ala Ala Ala Ser Ala Val Gln Ala Gly 245 250 255 Leu Phe Val Ala Val Ala Ala Gly Asn Glu Gly Gln Asn Ala Gly Asn 260 265 270 Thr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala Thr Ser 275 280 285 Ser Asn Asp Ala Ala Thr Ser Trp Ser Asn Tyr Gly Ser Val Val Asp 290 295 300 Val Tyr Ala Pro Gly Asp Ala Ile Val Ser Thr Trp Pro Gly Gly Gly 305 310 315 320 Ser Arg Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly 325 330 335 Leu Gly Ala Tyr Leu Ile Ala Leu Glu Gly Ile Ser Gly Gly Ser Val 340 345 350 Cys Asp Arg Ile Lys Glu Leu Ala Gln Pro Val Val Gln Pro Gly Pro 355 360 365 Gly Thr Thr Asn Arg Leu Ile Tyr Asn Gly Ser Gly Arg 370 375 380 <210> 17 <211> 1004 <212> DNA <213> Malbranchea cinnamomea <220> <221> misc_feature <223> genomic sequence <400> 17 gcattggtga cgcagagtaa tgcaccatcc tggggccttg gccgtatttc caaccgacag 60 gctggtattc gtgattacca ctacgatgac tccgccggtg aaggcgtcat cgtctatgat 120 gttgacaccg gtattgacat cagccatccg gatttcgagg gccgtgctat atggggttcc 180 aaccatgtcg accgcgttaa ccaggatcag aatggccatg ggacacacgt tgctggtact 240 attggtggaa gggcgtacgg agtcgccaag aaggccacaa tagtggctgt caaggttctc 300 gacgcccagg ggtcaggtac tatcagcggt attattgctg gtcttgactg gagtgtcaat 360 catgctcgac agaatggagt cactagaaga gcggctttga acatgagcct tg gcggtggg 420 cgcagtatct ctttcaatca ggctgctgca agtgctgtcc aagccggatt gttcgtcgcg 480 gttgctgccg gaaatgaagg ggtaagtgac ttctttctgg cccctcctat ccgtacctgc 540 agaagctaac cagattgctc ttattttttt tcttttttca aaatatagca aaatgcaggt 600 aacacttccc cagcctcaga gccttctgtt tgcacagtag gggcaacctc atcgaatgat 660 gccgccacat cctggtccaa ctatggctca gttggtacgt agggctcggt tttatttatt 720 acttcttccc cacatgcgat cagaccggcc gctgactata tttagttgac gtttacgctc 780 ccggagacgc aattgtctct acctggcccg gtggcggttc caggtctctc tcaggcacat 840 cgatggcttc tccacacgtc gccggcctgg gtgcatacct catcgctctg gagggcatta 900 gcggaggcag tgtatgtgac cgtatcaaag agctggctca acctgtcgtc cagcctggtc 960 caggcaccac caaccgtctt atctacaacg gcagtggccg ctaa 1004 <210> 18 <211> 281 <212> PRT <213> Malbranchea cinnamomea <220> <221> misc_feature <223> genomic sequence <400> 18 Ala Leu Val Thr Gln Ser Asn Ala Pro Ser Trp Gly Leu Gly Arg Ile 1 5 10 15 Ser Asn Arg Gln Ala Gly Ile Arg Asp Tyr His Tyr Asp Asp Ser Ala 20 25 30 Gly Glu Gly Val Ile Val Tyr Asp Val Asp T hr Gly Ile Asp Ile Ser 35 40 45 His Pro Asp Phe Glu Gly Arg Ala Ile Trp Gly Ser Asn His Val Asp 50 55 60 Arg Val Asn Gln Asp Gln Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr 65 70 75 80 Ile Gly Gly Arg Ala Tyr Gly Val Ala Lys Lys Ala Thr Ile Val Ala 85 90 95 Val Lys Val Leu Asp Ala Gln Gly Ser Gly Thr Ile Ser Gly Ile Ile 100 105 110 Ala Gly Leu Asp Trp Ser Val Asn His Ala Arg Gln Asn Gly Val Thr 115 120 125 Arg Arg Ala Ala Leu Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Arg Ser Ile Ser 130 135 140 Phe Asn Gln Ala Ala Ala Ser Ala Val Gln Ala Gly Leu Phe Val Ala 145 150 155 160 Val Ala Ala Gly Asn Glu Gly Gln Asn Ala Gly Asn Thr Ser Pro Ala 165 170 175 Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala Thr Ser Ser Asn Asp Ala 180 185 190 Ala Thr Ser Trp Ser Asn Tyr Gly Ser Val Val Asp Val Tyr Ala Pro 195 200 205 Gly Asp Ala Ile Val Ser Thr Trp Pro Gly Gly Gly Ser Arg Ser Leu 210 215 220 Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Gly Ala Tyr 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Glu Gly Ile Ser Gly Gly Ser Val Cys As p Arg Ile 245 250 255 Lys Glu Leu Ala Gln Pro Val Val Gln Pro Gly Pro Gly Thr Thr Asn 260 265 270 Arg Leu Ile Tyr Asn Gly Ser Gly Arg 275 280 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of the PCR sense primer DET27 used for cloning of the Malbranchea ALKO4178 protease gene. <400> 19 gcaggcaatc ccactcagtt c 21 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of the PCR antisense primer DET28 used for cloning of the Malbranchea ALKO4178 protease gene. <400> 20 atcctgcatt gcccgagtc 19 <210> 21 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of the PCR sense primer DET17. <400> 21 tccccgcgga ctgcgcatca tgggcgtctt cagcaaactc ttgta 45 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of the PCR antisense primer DET18. <400> 22 cgcggatcct tagcggccac tgccgttgta gataa 35