用于提高表达的细菌提取物中选定蛋白的蛋白水解失活 |
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| 申请号 | CN201380063443.9 | 申请日 | 2013-10-08 | 公开(公告)号 | CN104837863A | 公开(公告)日 | 2015-08-12 |
| 申请人 | 苏特罗生物制药公司; | 发明人 | 克里斯托弗·D·萨诺斯; 克里斯托弗·J·默里; 杨俊豪; 希瑟·斯蒂芬森; | ||||
| 摘要 | 本 申请 提供能够被蛋白酶OmpT1切割的修饰蛋白。可以在暴露的表面基序中修饰蛋白以并入OmpT1切割位点。还提供了编码修饰蛋白的核酸，表达修饰蛋白的细菌细胞和包含修饰RF1的无细胞合成体系。本申请进一步提供在无细胞合成体系中，通过修饰蛋白与OmpT1 接触 ，降低修饰蛋白的不利活性的方法。还提供在无细胞合成体系中，减少RF1在琥珀密码子竞争的方法，以及在无细胞合成体系中表达蛋白的方法。本 发明 的修饰蛋白可被用于增加在琥珀密码子并入非天然 氨 基酸的蛋白的产率。 | ||||||
| 权利要求 | 1.功能性释放因子1蛋白(RF1)，其可被外膜蛋白T1(OmpT1)切割，其中可切断的OmpT1肽键位于对应于野生型RF1(SEQ ID NO:1)的氨基酸287-304的转换环区中，并且其中所述转换环区被修饰为包含两个相邻碱性氨基酸，所述碱性氨基酸在pH7.0下带正电荷。 |
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| 说明书全文 | 用于提高表达的细菌提取物中选定蛋白的蛋白水解失活[0001] 相关申请的引用 [0003] 本发明涉及无细胞合成技术，尤其是细菌提取物中选定蛋白的蛋白水解失活。优选的用途为增加在界定的氨基酸残基处并入非天然氨基酸的多肽的产率。 [0004] 发明背景 [0005] 应用细菌无细胞提取物进行体外蛋白合成提供了超过传统体内蛋白表达方法的多种优势。无细胞体系能引导细胞代谢资源的大部分(即使不是全部)朝向一种蛋白的唯一产生。此外，体外的情况下缺乏细胞壁和膜组分是有利的，因为这允许控制合成环境。然而，无细胞提取物的效率可因细菌蛋白而降低，细菌蛋白可直接或间接抑制蛋白合成。因此，使会降低蛋白合成效率的不希望的蛋白失活应当增加在无细胞提取物中希望蛋白的产率。例如，会降低蛋白合成效率的蛋白的失活应当增加在界定的氨基酸残基处并入非天然氨基酸的多肽的产率。将非天然氨基酸(nnAA)引入多肽对于增加蛋白的生物多样性和功能具有作用。产生在界定的氨基酸残基处并入nnAA的多肽的一种方法是使用nnAA、包含氨酰化的正交CUA的tRNA，该tRNA用于在蛋白翻译期间，在琥珀(终止)密码子处将nnAA引入到新生多肽。然而，nnAA在琥珀密码子处的并入能够被天然细菌终止复合体所抑制，该复合体正常识别终止密码子并终止翻译。释放因子1(RF1)为终止复合体蛋白，它通过识别mRNA序列中的琥珀密码子来促进翻译的终止。琥珀终止密码子的RF1识别能够促进在非天然氨基酸并入位点的成熟前截短产物，因此降低蛋白的产率。因此，减弱RF1的活性可以增加nnAA并入重组蛋白。 [0006] 已证实，可通过三种方式减弱RF1的活性而增加nnAA的并入：1)RF1的中和抗体失活，2)RF1基因组敲除(在RF2支持菌株中)，和3)RF1定点去除，使用工程化的菌株表达包含通过亲和色谱法(几丁质结合域和His标签)来去除的蛋白标签的RF1。本申请描述新的方法，通过在RF1氨基酸序列中引入蛋白水解切割位点来使RF1失活。切割位点在细菌细胞生长过程中不被蛋白酶接近，但当细菌细胞被裂解产生无细胞提取物时，切割位点被蛋白酶切割。因此，在表达本文描述的修饰的RF1变体的细菌细胞提取物中，在琥珀密码子处并入nnAA的全长多肽的产率会提高。 [0007] 发明概述 [0008] 本发明提供重组靶蛋白，该蛋白被修饰为包含外膜蛋白T1(OmpT1)蛋白酶切割位点。OmpT1切割位点包括可切断的OmpT1肽键。在某些实施方案中，靶蛋白被修饰为在靶蛋白的表面暴露基序中引入OmpT1切割位点。因为OmpT1高效地在双碱性残基间切割底物，所以天然的表面暴露基序被修饰为包括两个相邻的在pH7.0下带正电荷的碱性氨基酸。靶蛋白可为例如正常细胞生长和/或生存所需要的必要蛋白。 [0009] 在某些实施方案中，当蛋白的基序区域是非复合时，表面暴露基序具有至少的B因子。在某些实施方案中，表面暴露基序具有约 至约 的总溶剂可及表面面积。在某些实施方案中，靶蛋白被修饰为使得可切断的OmpT1肽键位于蛋白中的位置在Ramachadran图中展示0°至-180°的 角或者0°至+180°的ψ角。 [0010] 一方面，本发明提供细菌细胞，其表达OmpT1和必要靶蛋白，所述必要靶蛋白被重组修饰为包括可切断的OmpT1肽键。在某些实施方案中，可切断的OmpT1肽键位于表面暴露基序中，天然基序被修饰为包括两个相邻的在pH7.0下带正电荷的碱性氨基酸。在某些实施方案中，细菌细胞表达必要靶蛋白，其被重组修饰为包括可切断的OmpT1肽键，当蛋白是非复合时，该键在蛋白中的位置位于具有至少 的B因子的表面暴露基序中。在某些实施方案中，细菌细胞表达必要靶蛋白，所述必要靶蛋白被重组修饰为包括可切断的OmpT1肽键，该键在蛋白中的位置位于具有约 至约 的总溶剂可及表面面积的表面暴露基序中。在一个实施方案中，细菌细胞表达必要靶蛋白，所述必要靶蛋白被重组修饰为包括可切断的OmpT1肽键，该键在蛋白中的位置在Ramachadran图中展示0°至-180°的 角或者0°至+180°的ψ角。在一个实施方案中，细菌细胞为大肠杆菌(E.coli)。 [0012] 在第二方面，本发明提供了在体外无细胞合成体系中，减少修饰的必要靶蛋白的不利活性的方法，该方法包括以下步骤： [0013] i)培养表达修饰的必要靶蛋白的OmpT1阳性细菌，所述蛋白被修饰为包含可切断的OmptT1肽键，其中蛋白被修饰为包含两个相邻的在pH7.0下带正电荷的碱性氨基酸； [0014] ii)裂解细菌以产生无细胞合成提取物； [0015] iii)使必要靶蛋白与OmpT1接触，OmpT1的量足以将完整蛋白减少50％； [0016] iv)向提取物中加入核酸模板，其中模板编码感兴趣的蛋白；和 [0017] v)允许无细胞合成体系产生感兴趣的蛋白。 [0018] 在该方法的某些实施方案中，当蛋白是非复合时，可切断的OmptT1肽键位于具有至少 的B因子的表面暴露基序中。在某些实施方案中，可切断的OmpT1肽键位于具有约25 至约 的总溶剂可及表面面积的表面暴露基序中。在某些实施方案中，可 切断的OmpT1肽键在蛋白中的位置在Ramachadran图中展示0°至-180°的 角或者0° 至+180°的ψ角。 [0020] 在第三方面，本发明提供功能性释放因子1蛋白(RF1)，其可被外膜蛋白T1(OmpT1)切割，其中可切断的OmpT1肽键位于对应于野生型RF1(SEQ ID NO:1)的氨基酸 287-304的转换环区中，并且转换环区被修饰为包括两个相邻的在pH7.0下带正电荷的碱性氨基酸。在某些实施方案中，两个相邻的碱性氨基酸独立地选自精氨酸和赖氨酸。在其他实施方案中，转换环区被修饰为具有三个相邻碱性氨基酸。在某些实施方案中，第296位的天然天冬酰胺胺被取代为三个相邻碱性氨基酸之一。功能性修饰RF1蛋白被OmpT1切割的速度快于野生型RF1。例如，在一个实施方案中，当修饰的和野生型蛋白以相似浓度存在于来自表达OmpT1的细菌的无细胞提取物中，于30℃、30分钟后，修饰的RF1被OmpT1的切割活性大于野生型RF1(SEQ ID NO:1)的50％。 [0021] 在某些实施方案中，可被OmpT1切割的功能RF1在转换环区中包含OmpT1切割肽。 [0022] 在第四方面，本发明提供编码功能性释放因子1蛋白(RF1)的核酸，该蛋白可被外膜蛋白T1(OmpT1)切割，其中可切断的OmpT1肽键位于对应于野生型RF1(SEQ ID NO:1)的氨基酸287-304的RF1转换环区中，并且转换环区被修饰为包括两个相邻的在pH7.0下带正电荷的碱性氨基酸。 [0023] 在第五方面，本发明提供在体外无细胞合成体系中，减少在琥珀密码子处RF1竞争的方法，该方法包括以下步骤： [0024] i)培养表达可被外膜蛋白T1(OmpT1)切割的功能释放因子1蛋白(RF1)的OmpT1阳性细菌； [0025] ii)裂解细菌以产生无细胞合成提取物； [0026] iii)使RF1蛋白与OmpT1接触，OmpT1的量足以将完整RF1蛋白减少50％； [0027] iv)向提取物中加入核酸模板，其中模板编码感兴趣的蛋白并包括琥珀密码子；和 [0028] v)允许无细胞合成体系产生感兴趣的蛋白， [0029] 其中RF1蛋白具有可切断的OmpT1肽键，该肽键位于对应于野生型RF1(SEQ ID NO:1)的氨基酸287-304的转换环区中，其中转换环区被修饰为包含两个相邻的碱性氨基酸，所述碱性氨基酸在pH7.0下带正电荷。 [0030] 在该方法的一个实施方案中，OmpT1阳性细菌来自大肠杆菌。在某些实施方案中，在细胞溶解后和感兴趣的蛋白的合成过程中，细菌的氧化磷酸化体系保持有活性。在其他实施方案中，无细胞合成体系在感兴趣的蛋白的琥珀密码子处置入非天然氨基酸。 [0031] 在另一个方面，本发明提供无细胞合成体系，其在单一反应混合物中包含： [0032] i)足以翻译编码蛋白的核酸模板的、来自细菌裂解物的组分； [0033] ii)编码感兴趣的蛋白并具有至少一个琥珀密码子的核酸模板； [0034] iii)与琥珀密码子互补的tRNA；和 [0035] iv)功能性释放因子1(RF1)蛋白，其可被外膜蛋白T1(OmpT1)切割，其中可切断的OmpT1肽键位于对应于野生型RF1(SEQ ID NO:1)的氨基酸287-304的RF1转换环区中，其中转换环区被修饰为包含两个相邻的碱性氨基酸，所述碱性氨基酸在pH7.0下带正电荷。 [0036] 在某些实施方案中，无细胞合成体系反应混合物进一步包括非天然氨基酸和相应的氨基酸合成酶，该酶能够使与琥珀密码子互补的tRNA装载非天然氨基酸。在某些实施方案中，无细胞合成体系通过有活性的氧化磷酸化体系生成ATP。 [0037] 在另一个方面，本发明提供在无细胞合成体系中表达蛋白的方法，包括： [0038] i.在允许蛋白合成的条件下，使核酸模板与细菌提取物合并，该提取物含有已被OmpT1、在可切断的OmpT1肽键处切割的RF1蛋白，其中可切断的OmpT1肽键位于对应于野生型RF1(SEQ ID NO:1)的氨基酸287-303的转换环区中，其中转换环区被修饰为包含两个相邻的碱性氨基酸，所述碱性氨基酸在pH7.0下带正电荷；和 [0039] ii.从核酸模板表达蛋白。 [0040] 在另一个方面，本发明提供细菌细胞，其包含基因组整合的编码可被OmpT1切割的功能性RF1的序列。 [0042] 图1显示当加入缺乏OmpT活性的无细胞提取物时，包含OmpT切割位点的修饰RF1蛋白变体具有野生型RF1活性。当在Fc蛋白(Fc_S378TAG)的第S378位引入的琥珀密码子处加入非天然氨基酸时，外源RF-1变体降低抑制(增加链终止)的活性被测定。图1(A)泳道1为对照提取物，无外源添加的RF1。该提取物包含野生型RF1，这导致降低的琥珀抑制，产生截短的Fc(胶中的下部条带)。泳道2为对照提取物，包含外源添加的野生型(WT)RF1。野生型RF1的加入导致进一步的琥珀抑制降低，产生相对更被截短的Fc。泳道3-7显示无细胞提取物，包含本发明的不同RF1变体。所有五种变体具有RF1活性。图1(B)显示RF1变体的相对活性，其中添加WT RF1活性设置成100％，不添加RF1设置为0％。 [0043] 图2显示当nnAA被引入重链的不同位置时，相比于表达野生型RF1的细菌菌株，来自被工程化而表达修饰的RF1变体(A18)的细菌菌株的无细胞提取物产生全长IgG的产率明显增加。2(A)左图：SBJY001提取物，包含完整的OmpT和野生型RF1。2(A)右图：SBHS016提取物(菌株16)，包含完整的OmpT和RF1变体A18。全长(完整)IgG的条带强 度在菌株16提取物中更强，表明nnAA的并入明显提高，截短的蛋白减少。2(B)显示在重链指定位置包含nnAA的蛋白的IgG可溶产率在菌株16提取物中明显提高，表明OmpT切割RF1变体A18导致更少的截短重链。“RF1+”(RF1正)提取物指的是来自菌株001的RF1，其未被OmpT切割。“RF1-”(RF1负)提取物指的是来自菌株16的RF1，其被修饰为包含OmpT切割位点并因此被OmpT活性降解。 [0044] 图3显示来自被工程化而表达修饰的RF1变体(A18)的细菌菌株的无细胞提取物产生琥珀抑制的明显增加，对应于在重链的指定位置并入nnAA的增加。3(A)左图：SBJY001提取物，包含完整的OmpT和野生型RF1。3(A)右图：SBHS016(菌株16)提取物，包含完整的OmpT和RF1变体A18。全长(完整)重链(Hc)的条带强度在菌株16提取物中更强，表明nnAA的并入明显增加，截短蛋白减少。3(B)显示在重链指定位置包含nnAA的蛋白的琥珀抑制在菌株16提取物中明显增加，表明OmpT切割RF1变体A18导致增加的琥珀抑制。 “RF1+”(RF1正)提取物指的是来自菌株001的RF1，其未被OmpT切割。“RF1-”(RF1负)提取物指的是来自菌株16的RF1，其被修饰为包含OmpT切割位点并因此被OmpT活性降解。 [0045] 定义 [0046] “氨酰化(aminoacylation或aminoacylate)”指的是tRNA被"装载"其正确的氨基酸的完整过程，这是向化合物添加氨酰基的结果。这与本发明是有关的，经历氨酰化或者已经被氨酰化的tRNA为已经被装载氨基酸的tRNA，经历氨酰化或者已经被氨酰化的氨基酸为已经被装载于tRNA分子的氨基酸。 [0047] “氨酰基-tRNA合成酶”或“tRNA合成酶”或“合成酶”或“aaRS”或“RS”指的是催化氨基酸和tRNA分子之间形成共价键的酶。其导致"装载的"tRNA分子，即tRNA分子通过酯键连接各自的氨基酸。 [0049] 琥珀密码子为RNA中的多肽链终止序列(UAG)(在DNA中为TAG)，其在多数生物体中的作用是终止多肽翻译。如果适当的tRNA被其同源氨酰基-tRNA合成酶所装载，则琥珀密码子也能够编码蛋白氨基酸吡咯赖氨酸。 [0050] “琥珀密码子tRNA”或“琥珀抑制子tRNA”或“琥珀反密码子tRNA”指的是结合琥珀密码子的tRNA。 [0051] “相邻氨基酸”指的是在多肽的氨基酸序列中，氨基酸直接先于或跟随彼此。例如，在多肽的一级氨基酸序列的第2位的氨基酸与第1位和第3位的氨基酸相邻。“两个相邻碱性氨基酸”指的是在多肽的一级氨基酸序列中，一个碱性氨基酸直接先于或跟随另一个碱性氨基酸。例如，在RF1氨基酸序列第295位的碱性氨基酸Arg(R)能够与RF1氨基酸序列中第296位的处引入的碱性氨基酸(如K或R)相邻。 [0052] “细菌来源的无细胞提取物”指的是能够将mRNA翻译为多肽的体外反应混合物的制备物。混合物包括核糖体、ATP、氨基酸和tRNA。它们可直接来源于裂解的细菌、纯化的组分或两者的组合。 [0053] “碱性氨基酸”为极性的，在低于它们的pKa's的pH值下带正电荷，并且非常亲水。在中性pH下的碱性氨基酸的例子包括精氨酸(Arg＝R)，赖氨酸(Lys＝K)和组氨酸(His＝H)。 [0054] "无细胞合成体系"指的是在包含生物提取物和/或指定试剂的反应混合物中体外合成多肽。反应混合物会包含产生大分子(例如DNA，mRNA等)的模板；合成大分子所需的单体，例如氨基酸，核苷酸等等；合成必需的共因子、酶和其他试剂，例如核糖体、未装载的tRNA、装载非天然氨基酸的tRNA、聚合酶、转录因子等。 [0055] 术语“切割活性大于野生型RF1的50％”指的是在指定条件下，本文所述修饰的蛋白的切割速率大于野生型蛋白的切割速率的50％。例如，当修饰的和野生型蛋白以相似浓度(例如，浓度为0.1-1.0微摩尔)存在于来自表达OmpT1的细菌的无细胞提取物中时，在30℃下、30分钟后，切割速率能够大于野生型蛋白的切割速率的50％。 [0056] 术语“不利活性”指的是在无细胞提取物中蛋白合成过程中，降低蛋白产率的活性。例如，不利活性能够在无细胞合成体系中抑制细胞转录和/或翻译。不利活性可包括在无细胞合成反应中产生的二硫键蛋白的有效蛋白折叠所需要的GSSG的酶促减少。不利活性还可包括释放因子引起的提前链终止，使得多肽延伸在引入的终止密码子处过早终止。 [0057] “靶蛋白”是被修饰为包括蛋白酶切割位点的蛋白，或被修饰为包括nnAA的蛋白。“必要靶蛋白”是细胞(如细菌细胞或真核细胞)正常生长和/或生存所必需的蛋白。 [0058] “功能性释放因子1(RF1)蛋白”指的是保留等同于或基本类似于野生型的RF1或未修饰的RF1蛋白的活性的RF1。功能性RF1活性可例如通过以下方式检测，测定表达修饰的RF1蛋白的细菌的生长速率，并将该生长速率与表达野生型或未修饰RF1的细菌比较。被修饰为包含OmpT切割位点的其他蛋白的功能活性可被类似地检测，例如，通过测定表达修饰的蛋白的细菌的生长速率，并将该生长速率与表达野生型或未修饰蛋白的细菌比较。功能性RF1活性也可通过以下检测，例如，修饰的RF1蛋白减少在编码靶蛋白的mRNA的指定位置处的nnAA的正交tRNA并入，从而增加提前链终止的量(即，增加截短蛋白的量)的能力。 [0059] 在本发明的背景下，术语“被修饰为包括”指的是在蛋白或多肽序列中的氨基酸取代、添加或缺失，或编码修饰的蛋白的核酸序列中的对应的取代、添加或缺失。修饰的蛋白可包括从野生型蛋白序列中替换相等数量的氨基酸的氨基酸取代，添加到野生型序列的氨基酸，或从野生型序列中缺失的氨基酸。例如，蛋白可被修饰为包括在氨基酸序列中相应的位置替换野生型氨基酸的碱性氨基酸。蛋白也可被修饰为包括作为已知蛋白酶切割序列的氨基酸序列，如OmpT切割序列。 [0060] “非天然(non-natural)”或“非天然(non-native)”氨基酸指的是不属于所有蛋白的构建模块的20种天然存在的氨基酸之一的氨基酸，尽管如此，其可通过生物工程被并入蛋白。非天然氨基酸可包括20种天然存在的氨基酸之一的D-肽异构体或任何翻译后修饰。多种非天然氨基酸可用于本发明的方法。可基于非天然氨基酸的希望的特性选择非天然氨基酸，例如，非天然氨基酸的功能，如修饰蛋白生物学特性(例如毒性、生物分布或半衰期)、结构性质、光谱性质、化学和/或光化学性质、催化性质、与其他分子反应(共价或非共价)的能力等。可用于本发明的方法中的非天然氨基酸包括但不限于，酪氨酸非天然类似物；谷氨酸非天然类似物；苯丙氨酸非天然类似物；丝氨酸非天然类似物；苏氨酸非天然类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、巯基、磺基、硒、酯、硫代酸、硼酸酯、硼酸盐、磷酸基、膦酰基、磷化氢、杂环、烯酮、亚胺、醛基、羟胺、酮或氨基取代的氨基酸，或以上的任意组合；带有可光活化交联剂的氨基酸；自旋标记的氨基酸；荧光氨基酸；带有新的官能团的氨基酸；与另一分子共价或非共价相互作用的氨基酸；金属结合氨基酸；含金属氨基酸；放射性氨基酸；光笼和/或光异构化氨基酸；含生物素或生物素类似物氨基酸；糖基化或糖修饰的氨基酸；含酮的氨基酸；含聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化学切割的或可光切割的氨基酸；带有延长侧链的氨基酸； 含有毒性基团的氨基酸；糖取代氨基酸，例如，糖取代丝氨酸等；碳连接含糖氨基酸，例如，糖取代丝氨酸等；碳连接含糖氨基酸；氧化还原氨基酸；含有α-羟基的酸；含有氨基硫代酸的氨基酸；α,α-双取代的氨基酸；β-氨基酸；除脯氨酸以外的环氨基酸等。 [0061] “核酸模板”包括多肽所翻译自的DNA或RNA多核苷酸。本领域技术人员可理解，DNA核酸模板必须首先转录为RNA，并且RNA翻译为多肽。DNA可在体内或体外转录为RNA。DNA模板体外转录的方法在本领域中是熟知的。在某些实施方案中，DNA模板经历同时的体外转录和翻译。 [0062] “外膜蛋白T1(OmpT1)”是表面膜丝氨酸蛋白酶，并属于革兰氏阴性细菌的omptin家族。OmpT1已知能切割抗微生物肽，活化人纤维蛋白溶酶原，以及降解某些异源重组蛋白。OmpT1和其同系物以高催化效率切割二碱性残基间的合成底物。含有二碱性残基的序列的切割已被证实对抗生素肽和大肠杆菌素的失活、运输中细菌膜蛋白水解、以及表达重组蛋白的大肠杆菌的降解都发挥重要作用。在本发明的背景下，OmpT1具有一定的优势在于其位于细胞外膜上，因此其不会接触位于完整细菌细胞内的可能底物蛋白。 [0063] 术语“细菌的氧化磷酸化体系保持有活性”指的是细菌裂解物在蛋白合成过程中，表现出有活性的氧化磷酸化。例如，使用ATP合成酶和氧的还原，细菌裂解物可产生ATP。应当理解，在蛋白合成过程中，本领域已知的其他翻译体系也可使用活性的氧化磷酸化。氧化磷酸化的激活作用可通过使用特异性抑制剂(如电子运输链抑制剂)抑制通路来揭示。 [0064] “翻译”指的是RNA模板转换成含有天然和/或非天然氨基酸的多肽的过程，并且是本领域熟知的。翻译包括起始步骤，其中核糖体附于RNA模板，通常在FMet密码子处(例如，AUG)，和延伸步骤，其中已装载的tRNA分子的反密码子与RNA模板的密码子配对，该步骤随核糖体在RNA模板向下游移动而重复。当每个tRNA反密码子与其对应的密码子配对时，装载于每个tRNA分子的氨基酸的氨基通过肽键共价连接于前面氨基酸的羧基。通常，翻译也包含终止步骤，其中核糖体遇到翻译终止密码子，因此终止链的延伸并从核糖体释放多肽。然而，在本文描述的方法中，RNA模板可包含具有琥珀终止密码子UAG的ORF，该密码子可被装载nnAA的tRNA的反密码子CUA所识别。因此，在这些方法中，琥珀密码子不是必须作用而终止翻译。 [0065] “翻译体系”指的是在体外能够将mRNA翻译为多肽的组分混合物。翻译体系可为在体外能够将mRNA翻译为多肽的无细胞提取物，重建的细胞裂解物，或纯化的组分混合物。例如，本文描述方法中使用的无细胞提取物或细胞裂解物可来源于大肠杆菌(E.coli)。翻译体系也可包含纯化的和重建的体外翻译体系。本文描述方法也可利用在蛋白合成过程中展示活性的氧化磷酸化的翻译体系。例如，翻译体系可使用ATP合成酶产生ATP。翻译体系也可包含至少一种核酸模板。使用翻译体系，核酸模板可同时转录并翻译成蛋白。 [0066] “重建核糖体翻译体系”指的是能够在体外翻译如mRNA的核酸分子的纯化组分的混合物，描述于Tan et al.，Methods 36，279-290(2005)，和Forster et al.，美国专利6,977,150，通过引用将上述文献全部并入本文。 [0067] “可切断的OmpT1肽键”指的是能被OmpT1切割的肽键。 [0068] “表面暴露基序”是存在于蛋白分子外部的结构域。表面暴露基序一般更易受到蛋白水解切割，例如被如OmpT1的丝氨酸蛋白酶切割。本领域的技术人员应当理解，表面暴露基序可以几种方式限定。例如，表面暴露基序通常缺少二级结构，如α螺旋或β折叠。而且，表面暴露基序通常不享有显著的氨基酸序列同源性，即使在同源蛋白序列之间。然而，本领域技术人员可计算感兴趣的蛋白的区域的相对表面可及面积，使用嵌入pymol分子建模软件中的GetArea算法(参见网址pymolwiki.org/index.php/Get_Area)。 [0069] “具有至少 的B因子的表面暴露基序”指的是表面暴露基序中各原子的运动性。表面暴露基序中的原子比蛋白核心中的原子具有更大的运动性。B因子通常表示结构(如蛋白)的不同部分的相对振动运动。具有低B因子的原子属于蛋白中有序的一部分，因此具有相对低的运动性。具有大B因子的原子属于蛋白中相对灵活的一部分，因此具有相对高的运动性。B因子越高，越可能观察到蛋白结构中个体原子的位置差。例如，40-60的B因子表明观察到的位置差可达到1.0埃。大于60的B因子表明该原子不太可能位于其观察到的位置的1.0埃内。(参见例如，网址wiki.cmbi.ru.nl/index.php/B-factor)。B因子计算如下： [0070] [0071] 其中Ui2为原子i的均方位移。这产生权重因数原子i对傅里叶变换的贡献通过： [0072] [0073] 随着U增加，B增加，并且该原子对散射的贡献降低。参见例如，网址：pldserver1.biochem.queensu.ca/～rlc/work/teaching/definitions.shtml。B因子计量单位为[0074] 术语“Ramachadran图”指的是将蛋白结构中每个氨基酸残基的主链二面角ψ(Psi)相对 的可视化方法。计算 和ψ角的方法描述于例如，Lovell,S.C.et al.,Proteins：Structure，Function，and Genetics，50:437-450(2003)， 和Chen,V.B.et al.,MolProbity:all-atom structure validation for macromolecular crystallography,Acta Crystallographica D66:12-21(2010)。本领域技术人员可参阅以上参考文献确定Ramachadran图中 和ψ角，或，为了方便，本领域技术人员可使用网络上可自由获取的软件程序。例如，本领域技术人员可上传坐标文件或PDB文件到kinemage.biochem.duke.edu的Molprobity服务器(见Chen，V.B.et al.，同上)。或者，本领域技术人员可使用网站boscoh.com/ramaplot提供的Ramachandran Plot Explorer。 [0075] 术语“总溶剂可及表面面积”(SASA)指的是蛋白或多肽的溶剂可及的表面面积。溶剂可及表面面积可被描述以 为单位，并可通过“滚珠”算法计算，该算法由Shrake&Rupley 开 发 (Shrake，A；Rupley，JA.(1973)."Environment and exposure to solvent of proteins atoms.Lysozyme and insulin".J Mol Biol 79(2):351–71.)。溶剂可及表面面积也可通过描述于Fraczkiewicz，R.and Braun，W.，“Exact and efficient analytical calculation of the accessible surface areas and their gradients for macromolecules,”J.Comp.Chem.，19:319-333(1998)中的方法计算。为了方便，本领域技术人员可使用网络上自由获取的软件程序计算总溶剂可及表面面积。例如，本领域技术人员可使用德州大学医学分院网站utmb.edu/getarea.html中的软件程序GETAREA来计算蛋白分子的溶剂可及表面面积(溶剂化能)，描述于Fraczkiewicz，R.and Braun，W.(Id)，通过输入原子坐标到PDB(蛋白数据库)格式，并定义需要的水探针半径(参数：水探针半径＝1.4)。 [0076] 术语“转换环区”指的是连接RF1的结构域3和4并形成刚性连接的表面暴露基序，该刚性连接使结构域3的GGQ基序与50S亚基的肽基转移酶中心(PTC)中的肽基-tRNA酯键接触。终止复合体对终止密码子的识别使转换环区的重排构象稳定，其可引导结构域3到PTC中。转换环的重排导致螺旋α7的再定向和延伸，以便GGQ基序停靠于PTC中。 参阅，Korostelev，A.et al.，“Recognition of the amber UAG stop codon by release factor RF1,”EMBO Journal(2010)29，2577–2585。RF1转换环区相当于SEQ ID NO:1的氨基酸287至304，并包含如下氨基酸序列：287-QQAEASTRRNLLGSGDRS-304(SEQ ID NO:4)。 [0077] “野生型”蛋白为未修饰的蛋白，具有天然的或天然存在的蛋白的氨基酸序列和/或功能活性。例如，野生型RF1蛋白可具有SEQ ID NO:1的序列。“对照蛋白”可为野生型蛋白或预先修饰的蛋白。 [0078] "天然氨基酸"指的是一种或多种被遗传密码编码的天然存在的氨基酸。"内源天然氨基酸"指的是被用于产生裂解物的宿主细胞产生的天然氨基酸。 [0079] “非天然氨基酸”(“nnAA”)指的是具有式NH3-(CR)-COOH的化学结构，其中R不是界定天然氨基酸的20种最常见取代基中的任何一种。 [0080] 当涉及两个或更多个核酸或多肽序列时，术语"相同"或"同一性百分比"指的是当使用分别描述于Altschul et al.(J.Mol.Biol.215:403-10，1990)和Altschul，et al.(Nucleic Acids Res.，25:3389-3402，1997)的BLAST和PSI-BLAST算法进行测量，在比较窗或指定区域上为了最大对应性进行比较和比对时，两个或更多个序列或子序列相同或具有规定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基(例如，在指定的区域上，60％同一性，任选为65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％或99％同一性)。执行BLAST分析的软件可公开获自National Center for Biotechnology Information(参阅网址ncbi.nlm.nih.gov)。该算法涉及首先鉴定高分序列对(HSP)，通过鉴定问询序列中长度W的短字符，当与数据库序列中相同长度的字符比对时，其匹配或满足一些正值阈值分数T。T被称为邻近字符评分阈值(Altschul et al.，同上)。这些最初的邻近字符命中充当为启动搜索来找到含有它们的更长的HSP的种子。字符命中在两个方向沿着每个序列延伸直到累积的比对分数可被提高。对于核苷酸序列，累积评分的计算使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；通常>0)和N(不匹配残基的罚分；通常<0)。对于氨基酸序列，计分矩阵被用于计算累积分数。当累积对比分数从最高达到值下降量X；由于累积一个或多个负分数残基比对而累积分数达到零或以下；或达到任一序列的端点，字符命中在每个方向的延伸停止。BLAST算法的参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用默认字长(W)为11，预期值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两个链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认字长为3，预期值(E)为10，BLOSUM62计分矩阵(见Henikoff and Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915，1989)使用比对值(B)为50，预期值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两个链的比较。 [0081] "序列同一性百分比"通过在比较窗比较两个以最佳方式比对的序列来确定，其中对于两个序列的最佳比对，比较窗中多核苷酸或多肽序列的一部分可相比于参考序列(不包括添加或缺失)包括添加或缺失(即，缺口)。百分比通过以下计算：测定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数目以得到匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗中位置总数目，并把结果乘以100以得到序列同一性百分比。 [0082] 本文所用的"比较窗"包括关于选自20到600的任一数目的连续位置的片段，一般约50到约200，更通常为约100到约150，其中在两个序列被最佳比对后，序列可与相同数量连续位置的参考序列比较。用于比较的序列比对方法为本领域所熟知。 [0083] BLAST算法还执行两个序列间的相似性的统计分析(见，例如，Karlin and Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-87，1993)。BLAST算法提供的相似性的一个衡量标准为最小和概率(P(N))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列间偶然发生匹配的概率。例如，核酸被认为与参考序列相似，如果检测核酸与参考核酸比较中的最小和概率小于约0.2，通常小于约0.01，更通常小于约0.001。 [0084] 当序列同一性百分比用于多肽时，公认的是不相同的一个或多个残基位置可区别为保守型氨基酸取代，其中第一氨基酸残基被取代为另一个具有相似化学性质的(如相似带电或疏水或亲水性)的氨基酸残基，因此没有改变多肽的功能性质。当多肽序列的区别在于保守取代时，序列同一性百分比可被向上调整以校正取代的保守性。此类调整可通过使用公知的方法来完成，例如，计算保守取代为部分而不是全部的错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，当相同的氨基酸给出分数1，非保守取代给出分数0时，保守取代给出的分数介于0和1之间。保守取代的计分可通过描述于Pearson et al.(Meth.Mol.Biol.24:307-331，1994)中的算法来计算。比对也可通过简单目测和人工序列比对来进行。 [0085] 当涉及具体的多核苷酸序列，术语"保守修饰的变异"指的是编码相同的或本质相同的氨基酸序列的不同的多核苷酸序列，或当多核苷酸不编码氨基酸序列时，指的是本质相同的序列。因为遗传密码的简并性，大量功能相同的多核苷酸编码任何给定的多肽。比如，密码子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG都编码精氨酸。因此，在每一个被密码子指定为精氨酸的位置，该密码子可被改变为所述任何相应的密码子，而不改变编码的多肽。此种核苷酸序列变异为"沉默变异"，可被认为是一类"保守修饰的变异"。如此，应当认识到，本文公开的每个编码蛋白变体的多核苷酸序列还描述了每个可能的沉默变异。同时也应当认识到，多核苷酸的每个密码子(除了AUG(其通常是蛋氨酸的唯一密码子)和UUG(其通常是色氨酸的唯一密码子))，可通过标准技术被修饰而产生功能相同的分子。因此，不改变编码多肽序列的每个多核苷酸的沉默变异在本文中隐含描述。 [0086] 此外，应当认识到，在编码序列中，改变、增加或缺失单个氨基酸或小百分比氨基酸(通常小于10％，一般小于1％)的各个取代、缺失或增加可被认为保守修饰变异，条件是改变导致氨基酸被取代为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似的氨基酸的保守氨基酸取代为本领域所熟知，包括以下六组，每组中包含被认为互相为保守取代的氨基酸: [0087] 1)丙氨酸(Ala，A)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)； [0088] 2)天冬氨酸(Asp，D)，谷氨酸(Glu，E)； [0089] 3)天冬酰胺(Asn，N)，谷氨酰胺(Gln，Q)； [0090] 4)精氨酸(Arg，R)，赖氨酸(Lys，K)； [0091] 5)异亮氨酸(Ile，I)，亮氨酸(Leu，L)，蛋氨酸(Met，M)，缬氨酸(Val，V)；和[0092] 6)苯丙氨酸(Phe，F)，酪氨酸(Tyr，Y)，色氨酸(Trp，W)。 [0093] 如果氨基酸序列或核苷酸序列彼此或与参考序列在给出的比对窗口具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％的序列同一性，则认为两个或更多个氨基酸序列或两个或更多个核苷酸序列"基本上相似"。如果两个或更多个蛋白合并了向氨基酸序列中提供功能类似的氨基酸的保守取代氨基酸，则也认为它们基本上相似。 [0094] “启动子”指的是核酸模板中位于转录起始的上游或下游的序列元件。启动子序列参与识别并结合起始转录的RNA聚合酶和其他蛋白。启动子的实例包括T7，SP6和T3噬菌体启动子。 [0095] “5’非翻译区”指的是核酸模板中位于开放读码框的上游或5’端的核酸序列。在RNA中，5’非翻译区位于核酸模板中的翻译起始密码子之前。在DNA中，5’非翻译区指的是被转录成RNA并位于翻译起始密码子5’端的核酸序列。在DNA中，翻译起始密码子通常为ATG，在RNA中翻译起始密码子通常为AUG。 [0096] “一级氨基酸序列”指的是通过肽键连接在一起成为多肽的氨基酸残基的次序。氨基酸残基的次序一般开始于多肽的氨基端并继续到多肽的羧基端。一级氨基酸序列由核酸模板中RNA密码子的核苷酸序列所决定。 [0097] “开放读码框”指的是核酸模板中被翻译成感兴趣的多肽的核苷酸序列。本文所指的开放读码框(ORF)可包括至少一个对应结合装载nnAA的tRNA的限定的氨基酸残基的密码子。至少一个密码子可为琥珀密码子。 [0098] "同受有义tRNA"指的是结合相同氨基酸的可选密码子的不同的tRNA种类。 [0099] "tRNA"或"转移RNA"指的是翻译过程中，在蛋白合成的核糖体位点转移特定氨基酸以生成多肽链的小RNA分子。tRNA包括可与对应的mRNA密码子相配对的三碱基密码子。因为遗传密码的简并性，氨基酸可联合多种tRNA，但每种tRNA分子只能联合一种氨基酸。 [0100] 术语“多肽”和“蛋白”可交换使用，指的是包含两个或更多个被肽键连接的氨基酸的化合物。蛋白可包含一个或多个多肽链。 [0101] 术语“当蛋白为非复合时”指的是溶液中蛋白的结构，或溶液中蛋白的结构的一部分、区域或结构域，并且不是当蛋白为与其他分子(如蛋白，配体，酶底物或抑制剂复合物，核糖体，结合抗体或抗体片段，RNA，和DNA)的复合体的一部分时的蛋白的结构，或溶液中蛋白的结构的一部分、区域或结构域。该术语也指蛋白结构域的结构，例如溶液中的包含表面暴露基序的氨基酸。 [0102] 本文使用的术语"约"，当修饰任何量时，指的是本领域技术人员通常遇到的量的变化，例如，在蛋白合成或X-射线晶体学实验中。例如，术语“约”指的是指定的分析技术的测量中遇到的正常变化，包括批次或样本之内或之间。因此，术语约可包括测量值的1-10％的变化，例如5％或10％的变化。本文公开的量包括这些量的等同值，包括被术语“约”修饰的或未修饰的量。 [0103] 发明详细描述 [0104] 介绍 [0105] 本发明提供靶蛋白，其被重组修饰为包含OmpT1蛋白酶切割位点，能够被OmpT1切割。OmpT1切割位点包括可切断的OmpT1肽键。在一个实施方案中，靶蛋白被修饰为包含两个相邻的pH7.0下带正电的碱性氨基酸。在某些实施方案中，靶蛋白被修饰为引入OmpT1切割位点至靶蛋白的表面暴露基序。在某些实施方案中，当蛋白或表面暴露基序是非复合时(即，自由存在于溶液和/或不是包含其他分子的大分子结构的一部分)，可切断的OmpT1肽键位于具有至少 的B因子的表面暴露基序中。在某些实施方案中，可切断的OmpT1肽键位于具有约 至约 的总溶剂可及表面面积(SASA)的表面暴 露基序中。在某些实施方案中，靶蛋白被修饰，使得可切断的OmpT1肽键位于蛋白中的位置在Ramachadran图中展示0°至-180°的 角或者0°至+180°的ψ角。 [0106] 本领域技术人员应当理解，以上实施方案需要感兴趣的蛋白结构域的结构信息。然而，表面环一般为无序的，因此可能对于感兴趣的靶蛋白没有晶体结构可知。因此，在某些实施方案中，在缺乏结构信息时，可以使用类似结构建立同源模型，以预测约 至约的SASA，或Ramachadran图中0°至-180°的 角或者0°至+180°的ψ角。 [0107] 本发明还提供表达OmpT1和重组修饰的靶蛋白的细菌细胞。在某些实施方案中，重组修饰的靶蛋白为必要蛋白，例如，正常细胞生长和/或生存所需要的蛋白。 [0108] 选择本文描述的靶蛋白是因为它们在体外无细胞合成体系中具有不利活性。例如，靶蛋白可抑制编码感兴趣的蛋白的核酸模板的转录和/或翻译。因此，本发明提供了通过用OmpT1蛋白酶将靶蛋白失活，在体外无细胞合成体系中降低修饰的必要靶蛋白的不利活性的方法。在某些实施方案中，该方法包括培养表达修饰的必要靶蛋白的OmpT1阳性细菌，其中靶蛋白被修饰为含有在表面暴露基序包含可切断的OmpT1肽键的OmpT1切割位点；裂解细菌以产生无细胞合成提取物；使修饰的必要靶蛋白与OmpT1接触，OmpT1的量足以使完整的靶蛋白的量减少50％；向提取物中加入核酸模板，其中模板编码感兴趣的蛋白；和允许无细胞合成体系产生感兴趣的蛋白。该方法优势在于当靶蛋白可能对细胞生长和/或生存重要时，细胞生长过程中修饰的靶蛋白和OmpT1蛋白酶的空间分离，然而当细菌细胞被破坏和裂解以产生无细胞提取物时，靶蛋白被OmpT1切割。 [0109] 在方法的某些实施方案中，当蛋白或表面暴露基序是非复合时，可切断的OmptT1肽键位于具有至少 的B因子的表面暴露基序中。例如，表面暴露基序可具有50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或 或更大的B因子，或B因子范围可为约50至约 约50至约 约50至约 约60至约 约60至约 或约60至约 在方法的某些实施方案中， 可切断的OmptT1肽键位于具有约 至约 的总溶剂可及表面面积的表面暴露 基序中。例如，在某些实施方案中，总溶剂可及表面面积为约25、30、35、40、45、50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220 或(其中术语“约”修饰前面的每一个值)。在方法的一个实施方案中，可切断的OmpT1肽键位于蛋白中的位置在Ramachadran图中展示0°至-180°的 角或者0°至+180°的 ψ角。如上所述，在缺乏结构信息时，可以使用类似结构构建同源模型，以预测约 至约 的SASA，或Ramachadran图中0°至-180°的 角或者0°至+180°的ψ角。 [0110] 上文提及的感兴趣的蛋白包括工程化为在氨基酸序列的规定位置并入非天然氨基酸(nnAA)的蛋白。向蛋白引入nnAA可导致具有优选性质的蛋白。向感兴趣的蛋白或多肽引入nnAA的一种方法为，在蛋白翻译过程中使用识别琥珀(终止)密码子的氨酰化的正交tRNA来向新生多肽链引入nnAA。然而，引入nnAA的蛋白的产率可由翻译终止复合体的蛋白降低，翻译终止复合体通过识别mRNA序列中的结束或终止密码子而促使翻译终止。释放因子1(RF1)为终止复合体的一部分，并可识别UAG(琥珀)终止密码子。RF1对琥珀密码子的识别可促进在nnAA并入位点处的提前链终止，这将减少希望的蛋白的产率。本文所描述的方法通过减少细菌细胞裂解物中RF1的功能活性而解决了这个问题。因此，在某些实施方案中，必要靶蛋白为RF1。通过在RF1中引入OmpT1蛋白酶切割位点而降低RF1的功能活性。OmpT1是位于完整细菌的外细胞膜上的酶。因此，在完整的细胞中，修饰的RF1不会作为OmpT1的底物。当细菌膜被破坏时，例如，在细菌裂解物中，OmpT1酶能够在引入的切割位点接触和切割修饰的RF1，因此降低RF1的功能活性。该方法适用于翻译终止复合体中存在的其他释放因子，如RF2，其可识别UGA终止密码子。该方法也适用于在体外翻译过程中降解mRNA的蛋白，如RNA酶。进一步地，该方法通常适用于细菌提取物中抑制感兴趣的蛋白的转录和/或翻译的任何蛋白。 [0111] 一般方法 [0112] 除非另有规定，本文所用的所有技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意义。对于本领域的定义和术语，本领域技术人员特别可参考Green，M.R.，and Sambrook，J.，eds.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，4th ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2012)，和Ausubel，F.M.，et al.，Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 99)，John Wiley&Sons，New York(2012)，通过引用将以上文献并入本文。标准方法也出现在Bindereif，&Westhof(2005)Handbook of RNA Biochemistry，Wiley-VCH，Weinheim，Germany，其描述了RNA操作和分析的详细方法，通过引用将以上文献并入本文。生成重组核酸的适当分子技术的例子和充分指导技术人员完成多种克隆实验的说明可参阅Green，M.R.，and Sambrook，J.，(Id.)；Ausubel，F.M.，et al.，(Id.)；Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology(Volume 152Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.1987)；以及PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press，San Diego，Calif.1990)，通过引用将以上文献并入本文。 [0113] 蛋白纯化、色谱分析、电泳、离心和结晶的方法描述于Coligan et al.(2000)Current Protocols in Protein Science，Vol.1，John Wiley and Sons，Inc.，New York。无细胞合成的方法描述于Spirin&Swartz(2008)Cell-Free Protein Synthesis，Wiley-VCH，Weinheim，Germany。使用无细胞合成向蛋白中并入非天然氨基酸的方法描述于Shimizu et al(2006)FEBS Journal，273，4133-4140。 [0114] PCR扩增方法被本领域所熟知，并描描述于，例如，Innis et al.，PCR Protocols：A Guide to Methods And Applications，Academic Press Inc.San Diego，Calif.，1990。 扩增反应一般包括待扩增的DNA，热稳定的DNA聚合酶，两个寡核苷酸引物，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，反应缓冲液和镁。通常，合适的热循环次数为1至25。引物设计和PCR条件优化的方法在本领域所熟知，并能在标准分子生物学教科书中找到，如Ausubel et al.，th Short Protocols in Molecular Biology，5 Edition，Wiley，2002，和Innis et al.，PCR Protocols，Academic Press，1990。在设计具有需要的特异性和最佳的扩增性能的引物中可使用计算机程序(例如，Oligo版本5.0(National Biosciences))。在某些实施方案中，PCR引物可另外地含有限制性内切酶的识别位点，以便于扩增的DNA片段插入载体中具体的限制酶位点。如果限制性位点被加到PCR引物的5'端，优选包括几个(例如，2或3个)另外的5'碱基，以产生更高的酶切割效率。在某些实施方案中，PCR引物也可包含RNA聚合酶启动子位点，如T7或SP6，以允许随后的体外转录。体外转录的方法被本领域的技术人员所熟知(参阅，例如，Van Gelder et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1663-1667， 1990；Eberwine et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:3010-3014，1992)。 [0115] OMPT1可切割的蛋白 [0116] 本发明提供能够被如OmpT1的蛋白水解酶切割和灭活的靶蛋白。为了能够被蛋白酶切割，蛋白被修饰而引入蛋白水解切割位点于蛋白中。在某些实施方案中，引入修饰的靶蛋白的切割位点为可切断的OmpT1肽键，可切断的OmpT1被引入靶蛋白的表面暴露基序中。被OmpT1识别的切割位点包含两个相邻碱性残基。因此，本文描述的靶蛋白被修饰成包含两个相邻的在pH 7.0下带正电荷的碱性残基。 [0117] 修饰蛋白以在具有至少 的B因子的表面暴露基序中引入OmpT1切割位点 [0118] 在某些实施方案中，靶蛋白被修饰而向表面暴露基序中引入可切断的OmpT1肽键，当靶蛋白或基序区域的氨基酸序列是非复合时，表面暴露基序具有至少 的B因子。具有至少 的B因子的表面暴露基序的位置可通过多种方法来确定。在结晶蛋 白数据库(PDB)文件中针对每个原子给出B因子。表面暴露基序的B因子可通过使用嵌入pymol分子模型软件中的GetArea算法来计算(参阅网址pymolwiki.org/index.php/Get_Area)。或者，如果蛋白的X射线晶体结构无法获得而蛋白的NMR结构可获得，则随机卷曲指数(RCI)可被用于代替大的B因子(见Berjanskii，M.V.，et al.，Application of the random coil index to studying protein flexibility，J Biomol NMR.2008Jan； 40(1):31-48.Epub 2007Nov 6)。 [0119] 为了修饰靶蛋白以将OmpT1切割位点于引入至具有至少 的B因子的表面暴露基序中，来自蛋白的X射线晶体结构的B因子可被映射到氨基酸序列，并且序列被重组修饰为在具有大的B因子的位点包含可切断的OmptT1肽键。随后，可检测重组修饰的靶蛋白在包含OmpT1的细胞提取物中的蛋白降解。在某些实施方案中，B因子为至少50、60、70、 80、90或 在某些实施方案中，B因子为约50至约 约50至约 或约 50至约 应当理解，本文描述的范围包括终点值之间的所有值。 [0120] 修饰蛋白以在具有约 至约 的总溶剂可及表面面积的表面暴露基序中引入OmpT1切割位点。 [0121] 在某些实施方案中，靶蛋白被修饰为在具有约 至约 的总溶剂可及表面面积的表面暴露基序中引入可切断的OmpT1肽键。具有约 至约 的总 溶剂可及表面面积的表面暴露基序的位置可使用本领域熟知的方法确定。例如，软件程序GETAREA可用于定位交叉原子的溶剂暴露顶点，描述于Fraczkiewicz，R.and Braun，W.，“Exact and efficient analytical calculation of the accessible surface areas and their gradients for macromolecules,”J.Comp.Chem.，19，319-333(1998)。因此，可通过使用GETAREA软件计算蛋白分子的溶剂可及表面面积(溶剂化能)，通过在PBD(蛋白数据库)格式中输入原子坐标，规定希望的水探针半径，并规定希望的输出等级，使用德州大学医学分院网站curie.utmb.edu/getarea.html提供的表格(参数：水探针半径＝1.4)。 其他确定总溶剂可及表面面积的方法描述于Eisenberg，D.and McLachlan，A.D.(1986)Nature，319，199；Markley，J.L.；et al.(1998)Pure&Appl.Chem.，70，117； 和 Wesson，L.and Eisenberg，D.(1992)Protein Sci.，1，227。 [0122] 修饰蛋白以在蛋白中在Ramachadran图中展示0°至-180°的 角或者0°至+180°的ψ角的位置引入OmpT1切割位点 [0123] 在某些实施方案中，靶蛋白被修饰而引入可切断的OmpT1肽键，所述肽键在蛋白中的位置在Ramachadran图中展示0°至-180°的 角或者0°至+180°的ψ角。蛋白中在Ramachadran图中展示0°至-180°的 角或者0°至+180°的ψ角的位置的定 位可使用本领域熟知的方法确定。计算 和ψ角的方法被描述于例如，Lovell，S.C.et al.，Protein:Structure，Function，and Genetics，50:437-450(2003)。通过上传坐标文件或PDB文件到于网址kinemage.biochem.duke.edu的MOLPROBITY服务器，可测量 Ramachadran图中的 和ψ角(见Chen，V.B.，et al.，(2010)MolProbity:all-atom structure validation for macromolecular crystallography.Acta Crystallographica D66:12-21.)。或者，可使用网站boscoh.com/ramaplot中提供的Ramachandran Plot Explorer。 [0124] 本文描述的修饰的蛋白为选定的，因为它们能够在无细胞合成体系中抑制蛋白产生。因此，在某些实施方案中，本文描述的修饰的蛋白在细菌无细胞提取物中减少全长蛋白产生。例如，蛋白RF1和RF2为能识别mRNA中的终止密码子并终止多肽链翻译的终止复合体的一部分。使用本文描述的无细胞翻译体系，当将非天然氨基酸并入蛋白中时，过早终止翻译是不希望的。减少终止复合体对终止密码子的识别能够增加并入nnAA的蛋白的产率。因此，在某些实施方案中，RF和/或RF2蛋白或它们的功能同系物被修饰为当RF1和/或RF2蛋白或它们的功能同系物为非复合时，在具有至少 的B因子的表面暴露基序中 含有OmpT1切割位点。在某些实施方案中，RF1和/或RF2蛋白或它们的功能同系物被修饰为在具有约 至约 的总溶剂可及表面面积的表面暴露基序中包含OmpT1切 割位点。在某些实施方案中，RF1和/或RF2蛋白或它们的功能同系物被修饰为在蛋白中在Ramachadran图中展示0°至-180°的 角或者0°至+180°的ψ角的位置含有OmpT1切 割位点。在某些实施方案中，功能修饰的蛋白基本上类似于RF1(SEQ ID NO:1)或RF2(SEQ ID NO:2)。 [0125] RF1蛋白包括来自大肠杆菌的RF1野生型原型蛋白(SEQ ID NO:1)以及多态性变异体和重组产生的突变蛋白。RF1蛋白定义为与野生型具有基本相同的生物活性或功能能力(例如，任一项的至少80％)，与原型蛋白RF1具有至少60％，70％，80％，90％或95％序列同一性，和/或结合针对原型蛋白SEQ ID NO:1产生的多克隆抗体。 [0126] 关于RF1蛋白与多克隆抗体的结合，RF1蛋白在指定的免疫测定条件下，会以至少两倍于背景的特异性结合指定抗体，其中抗体基本不以显著的量结合样品中存在的其他蛋白。例如，针对RF1(SEQ ID NO:1)或其异构体或部分产生的多克隆抗体可被选择以获得只与RF1而不与除了RF1的多态性变异体之外的其他蛋白特异性免疫反应的多克隆抗体。多种免疫分析形式可用于选择与具体蛋白特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定通常用于选择与蛋白特异性免疫反应的抗体(见，例如，Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(1988)，关于可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件侧描述)。通常特异性或选择性反应会至少两倍于背景信号或噪音，更通常为背景的大于10倍到100倍。 [0127] 如实施例中所描述，RF1被成功修饰为在表面暴露基序中引入功能性OmpT1切割位点。然而，在RF1中引入假定的双碱性OmpT1切割位点并非总能导致蛋白被OmpT1有效切割。例如，单个氨基酸取代M74R，E76K，E84K，A85R，E87R，E108R，T293R和S304K在已有Arg或Lys的旁边被引入RF1的环区，从而产生双碱性切割位点。然而，当RF1变体表达于OmpT阳性细胞提取物时，这些变体未被有效切割。因此，本发明提供意外的结果，即，诸如RF1的蛋白可被修饰，使得蛋白能够被如OmpT1的蛋白酶切割。 [0128] 本领域技术人员应当理解，引入的切割位点可被具有OmpT1样酶活性的酶切割，其中酶活性来自OmpT1的功能性同系物或片段的，或来自修饰为具有OmpT1样活性的蛋白。 [0129] OmpT1对未修饰的蛋白的切割 [0130] 本文描述的蛋白也可包含内源OmpT1蛋白酶切割位点。例如，在某些实施方案中，未修饰的或野生型蛋白包含双碱性氨基酸序列，其包含可被OmpT1切割的可切断OmpT1肽键。OmpT1对蛋白的切割可通过以下来测试，将纯化的蛋白与表达OmpT1的细菌无细胞提取物孵育，并比较其中切割的量与不表达OmpT1的无细胞提取物中检测的切割的量。在某些实施方案中，包含内源的OmpT1切割位点的未修饰的蛋白对正常细胞生长或功能为必需的或需要的，但在无细胞提取物中抑制蛋白翻译。因此，本发明提供通过OmpT1的切割选择性地使未修饰的蛋白失活的方法，其中失活的时间可被控制，以致蛋白在细胞生长过程中有功能，但在表达OmpT1的细胞提取物中失活。 [0131] 模板 [0132] 为了产生本发明的蛋白，需要核酸模板。本发明的模板被用于产生修饰为含有可切断的OmpT1切割位点的蛋白。本发明的模板也被用于产生在无细胞体系中表达的感兴趣的蛋白。用于无细胞蛋白合成的模板可为mRNA或DNA。模板可包含任何具体兴趣基因的序列，并可编码全长多肽或其任何长度的片段。作为蛋白合成模板的核酸任选地来源于天然来源或可为合成的或重组的。例如，DNA可为重组DNA，例如，质粒、病毒等。 [0133] 在一个实施方案中，DNA模板包含编码含有OmpT1切割位点的靶蛋白的ORF。例如，ORF能够编码正常细胞生长和生存所需要的修饰的靶蛋白，但是其活性直接或间接地降低了无细胞提取物中的蛋白的产率。因此，ORF可编码终止复合体的蛋白组分，如RF1或RF2或它们的修饰变体。ORF还可编码降解RNA模板的RNA酶。 [0134] 在另一个实施方案中，DNA模板包含编码被修饰为并入非天然氨基酸的感兴趣的蛋白的ORF。因此，ORF可编码在氨基酸序列的规定位置并入nnAA、具有生物学重要性的任何蛋白。此类感兴趣的蛋白非限制性实例包括抗体、激素、细胞因子和病毒蛋白。本发明使用正义密码子用于非天然氨基酸的并入，且回避本领域的常见正交组分的要求。在这些实施方案中，ORF包含至少一个同受正义密码子。ORF进一步包含对应于识别装载非天然氨基酸的tRNA的限定氨基酸残基的一个密码子。在某些实施方案中，ORF包含结合装载非天然氨基酸的tRNA的琥珀密码子(UAG)。在其他实施方案中，模板能够翻译完整的和功能性蛋白，不管非天然氨基酸是否被选择并入感兴趣的蛋白。 [0135] 含有感兴趣的ORF的DNA模板可操作地连接于至少一个启动子和一个或多个其他调控序列，包括但不限于抑制子、激活子、转录和翻译增强子、DNA结合蛋白等。本文使用的DNA模板的合适的量可通过在熟知的克隆载体和宿主中通过扩增DNA或聚合酶链反应(PCR)来产生。 [0136] DNA模板可进一步包含在框内连接于编码用于分离和纯化表达的蛋白的氨基酸序列(例如以高亲和力结合于色谱介质的聚氨基酸标签)的核酸序列的感兴趣的ORF。聚氨基酸标签可位于ORF的5’端或3’端，导致在表达的蛋白中分别位于氨基末端或羧基末端的标签。在一个实施方案中，ORF在框内连接于编码聚组氨酸标签的序列。 [0137] 一个实施方案使用细菌裂解物。DNA模板可被构建用于细菌表达，通过将希望的蛋白编码DNA可操作地连接于启动子序列和细菌核糖体结合位点(Shine-Delgarno序列)。适合与本发明的无细胞转录-翻译方法中的DNA模板一起使用的启动子包括在细菌提取物所获自的细菌中能够启动体内转录的任何DNA序列。优选的启动子在宿主细胞中能够有效启动转录。编码所需蛋白的DNA以及含有所需启动子和Shine-Dalgarno(SD)序列的DNA可通过本领域熟知的多种方法来制备。或者，所需DNA序列可从存在的克隆中获得，如果没有可供使用的克隆，则通过筛选DNA文库和从文库克隆中构建所需DNA序列。 [0138] 编码感兴趣的蛋白的RNA模板可从转化有载体的重组宿主细胞方便的产生，载体被构建为表达带有细菌核糖体结合位点(SD序列)的mRNA，核糖体结合位点可操作地连接于所需基因的编码序列，使得反应混合物中的核糖体能够结合和翻译该mRNA。因此，载体携带能够在具体宿主细胞中启动DNA转录、用于RNA模板的合成的任何启动子。 [0139] 因为从细菌中提取未降解的RNA比较困难，因此高等真核细胞培养物优选用于产生RNA模板。原则上，任何高等真核细胞培养物都可行，包括脊椎动物和无脊椎动物的细胞培养物。RNA模板可方便地从宿主细胞培养物中提取的总细胞RNA部分分离。总细胞RNA可通过本领域熟知的任何方法从宿主细胞培养物中分离。如果RNA模板设计为在其3'端包含被真核宿主细胞所识别的多腺苷化信号，则所需的RNA模板可与大部分细胞mRNA一起被分离。因此，宿主细胞产生带有多聚腺苷酸(聚(A))尾巴的RNA模板。多聚腺苷酸化的mRNA可使用本领域所熟知的任何方法，通过在寡聚脱氧胸甘酸(寡聚(dT))-纤维素柱上的亲和层析，从大部分细胞RNA中分离出来。如果编码所需蛋白的mRNA的大小已知，该mRNA制备物可通过RNA的琼脂糖凝胶电泳被进一步纯化为具有特定大小的mRNA分子。 [0140] 具有OmpT1切割位点的修饰的蛋白的表达 [0141] 当核酸模板产生后，该模板被用于在细胞中表达含有OmpT1切割位点的重组靶蛋白，或在无细胞翻译体系中合成修饰的重组靶蛋白。例如，在足以将模板翻译为蛋白的条件下，可将模板加入细胞裂解物。细胞裂解物可来自细菌细胞或真核细胞。然后，可通过本领域熟知的方法(如下面描述的)纯化表达的蛋白。 [0142] 纯化蛋白以检测活性 [0143] 可按照本领域中的标准化方式纯化包含OmpT1切割位点的蛋白。可回收和纯化本发明的蛋白的方法包括，但不局限于，硫酸铵法或乙醇沉淀，酸或碱提取，柱层析法，亲和柱层析法，阴离子或阳离子交换层析法，磷酸纤维素层析法，疏水作用层析法，羟磷石灰层析法，凝集素层析法，凝胶电泳法等。例如，含有N端组氨酸标签的蛋白可使用包含如镍和钴的金属离子的亲和介质来纯化。然后，洗涤亲和介质以去除未结合的蛋白，以及洗脱和回收结合的蛋白。在某些实施方案中，使用固定化金属离子亲和层析法(IMAC)来纯化聚组氨酸标签标记的蛋白。也可使用高效液相色谱法(HPLC)来纯化修饰的蛋白，或当需要高纯度时的其他合适的方法。优选的纯化方法提供于实施例1中。 [0144] 纯化之后，包含OmpT1切割位点的蛋白可具有不同于相关多肽的所需构象的构象。因此，纯化的蛋白可经受产生优选蛋白构象的条件。多种纯化/蛋白折叠的方法为本领域所熟知，例如，Deutscher，Methods in Enzymology Vol.182:Guide to Protein Purification(Academic Press，Inc.N.Y.1990)；Bollag et al.，Protein Methods，2nd Edition，(Wiley-Liss，N.Y.1996)。一般而言，偶尔需要变性和还原表达的多肽，然后使多肽重新折叠为优选的构象。例如，胍、尿素、DTT、DTE和/或分子伴侣可被加入感兴趣的翻译产物。蛋白的还原、变性和复性的方法为本领域技术人员所熟知。见，例 如 Debinski et al.，J.Biol.Chem.268:14065-70(1993)；Buchner et al.，Anal.Biochem.205:263-70(1992)。 [0145] 具有OmpT1切割位点的修饰的蛋白的功能生物活性的确认 [0146] 根据本文所述修饰的蛋白的所需用途，修饰的蛋白具有与未修饰的野生型蛋白相当的生物活性是重要的。例如，如果待修饰的蛋白对细菌的正常生长是重要的，则需要保持蛋白的正常活性水平，直到细胞被裂解以产生用于翻译的无细胞裂解物。因此，本发明的方法提供了包含OmpT1切割位点的修饰的蛋白，其具有与天然型或野生型蛋白相当的生物活性。保持野生型的活性水平或与野生型相当的活性水平的修饰的蛋白在本文中称为功能蛋白。可通过在功能分析实验中测定活性水平来测定蛋白的具体活性。或者，可通过测定非功能分析实验中存在的蛋白的量来测定蛋白的具体活性，例如免疫染色、ELISA、考马斯或银染凝胶定量等，并测量生物活性蛋白与总蛋白的比值。通常，如果如此界定的具体活性为野生型蛋白的至少约50％，或至少约60％，约70％，约80％，约90％或大于野生型蛋白，则认为修饰的蛋白与野生型蛋白是相当的。见，例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1989)。 [0147] 修饰的蛋白的功能活性可通过多种方法测量。例如，表达修饰蛋白的细菌的生长速率可与表达野生型、对照或未修饰的蛋白的细菌的生长速率相比较。修饰的蛋白的功能活性也可通过测定修饰的蛋白在mRNA模板中在终止密码子处终止翻译的能力来测定。翻译的终止导致截短的蛋白，因此修饰的蛋白的相对活性可通过以下来定量，测量截短蛋白和全长蛋白的量，并将截短的蛋白与全长蛋白的比值与野生型中的结果比较，如实施例所述和图1所示。如果截短的蛋白与全长蛋白的比值为使用野生型蛋白的截短的蛋白与全长蛋白的比值的至少约50％，60％，70％，80％，90％，95％或更大，则认为修饰的蛋白具有与野生型蛋白相当的活性。 [0148] 修饰的蛋白可被OmpT1切割的确认 [0149] 当修饰的蛋白被确认为具有与野生型或未修饰的蛋白相当的生物活性，测试修饰的蛋白以确定其可被OmpT1切割。用于检测本发明的修饰的蛋白可被OmpT1切割的一种方法为将包含OmpT1切割位点的重组蛋白加入到包含功能性OmpT1的无细胞提取物中。如果修饰的蛋白可被OmpT1所切割，则在凝胶电泳(例如，SDS-PAGE)中它会比完整的蛋白迁移到明显更低的分子量。可在适于在修饰的蛋白并入放射性标记的条件下，通过在翻译反应14 中包括如 C的放射性标记来检测修饰的蛋白。放射性标记的蛋白的迁移可被可视化，例如，在凝胶的放射自显影中。修饰的蛋白被OmpT1的切割也可通过Western印记分析来检测，例如，通过将蛋白从凝胶转移到固相支持物，使支持物接触结合完整蛋白和切割蛋白的抗体，并使用可检测的标记来可视化结合抗体。 [0150] OmpT1的切割活性可通过比较OmpT1对修饰蛋白的切割量或切割速率与OmpT1对未修饰蛋白的切割量或切割速率。例如，在规定的条件下，OmpT1对修饰的蛋白的切割速率可大于野生型蛋白的切割速率的50％。在某些实施方案中，当修饰的和野生型蛋白以相似浓度(例如，浓度为0.1-1.0微摩尔)存在于表达OmpT1的细菌的无细胞提取物中时，于30℃下、30分钟后，本文描述的修饰的蛋白的切割速率大于野生型蛋白的切割速率的50％。在某些实施方案中，当修饰的蛋白以0.1-1.0微摩尔的浓度存在于表达OmpT1的细菌的无细胞提取物中，于30℃下、60分钟后，大于90％的修饰的蛋白被OmpT1切割。 [0151] 应当理解，本文描述的引入修饰的蛋白的OmpT切割位点可被具有OmpT样酶活性的任何蛋白或多肽切割。所需要的是OmpT1样酶能够切割被修饰为含有OmpT切割位点的蛋白。例如，OmpT样蛋白水解活性可由野生型或天然OmpT1或其功能性同系物或片段来提供。OmpT样活性也可由与OmpT1基本上相同或基本上相似的蛋白来提供。例如，具有OmpT样活性的蛋白可与OmpT1具有至少60％，70％，80％，90％，95％或99％的序列同一性。在某些实施方案中，具有OmpT样活性的蛋白与SEQ ID NO:3具有至少60％，70％，80％，90％，95％或99％的同一性。在某些实施方案中，具有OmpT1活性的蛋白被结合OmpT1和其变体的多克隆抗体特异性结合。结合OmpT1和其功能性变体的多克隆抗体的选择可按照本文所描述来进行，用于选择结合RF1的多克隆抗体。 [0152] 用OmpT1可切割的蛋白转化细菌 [0153] 一旦如前文所述修饰的必要靶蛋白被确定为保持野生型功能并易于被OmpT1切割，将编码修饰的蛋白的核酸转化入细菌。在适于将核酸并入细菌基因组的条件下，可用细菌转化核酸。例如，使用实施例中所描述的寡核苷酸介导的等位基因置换，可用具有本文所述的编码OmpT1切割位点的序列的寡核苷酸转化细菌。在细菌基因组中所需突变的并入可例如通过以下确定，使用错配扩增突变检测(MAMA)PCR筛选转化的克隆，如实施例中所描述。 [0154] 无细胞翻译体系中使用OmpT1可切割的蛋白以增加蛋白产率 [0155] 当表达于含有活性OmpT1蛋白酶的细菌细胞提取物中时，具有OmpT1切割位点的修饰的靶蛋白被高效的降解。在本发明的多种应用中，认真选择被修饰为OmpT1可切割的抑制性蛋白能够提高无细胞合成体系的产生能力。例如，在一个优选的应用中，选择的靶蛋白被OmpT1的切割能够在无细胞提取物中增加并入非天然氨基酸的全长蛋白的翻译效率。在一些实施方案中，非天然氨基酸在引入mRNA模板的琥珀密码子处被并入。如上文描述，非天然氨基酸在琥珀密码子处的并入可被终止复合体蛋白(如RF1和RF2)所抑制。因此，在特别理想的实施方案中，RF1和/或RF2被OmpT1切割和失活能够增加被工程化而在琥珀密码子处并入非天然氨基酸的蛋白的产率。 [0156] 非天然氨基酸 [0157] 如上文描述，在一个优选的应用中，修饰的靶蛋白被OmpT1降解在无细胞合成体系中增加并入非天然氨基酸的蛋白的产率。本发明中所使用的非天然氨基酸一般包含一个或多个化学修饰的氨基酸衍生物或类似物，其中化学结构具有式NH3-(CR)-COOH，其中R不是20种定义天然氨基酸的典型取代基中的任何一个。合适的非天然氨基酸衍生物可从供应商处购买，例如，Bachem Inc.，(Torrance，CA)；Genzyme Pharmaceuticals(Cambridge，MA)；Senn Chemicals(Dielsdorf，Switzerland)；Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)；Synthetec，Inc(Albany，OR)。优选地，非天然氨基酸包括但不限于甘氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、色氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、组氨酸的衍生物和/或类似物，以及β-氨基酸和同系物，BOC-保护氨基酸和FMOC-保护氨基酸。 [0158] 不可商购的非天然氨基酸衍生物、类似物和模拟物的产生可通过几种方法完成。例如，一种方法是使用本领域熟知的有机化学方法合成感兴趣的非天然氨基酸，另一种方法为使用本领域熟知的化学酶促合成。参见，例如，Kamphuis et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.， 672:510-527，1992；Ager DJ and Fotheringham IG，Curr.Opin.Drug Discov.Devel.， 4:800-807，2001；和 Weiner et al.，Chem.Soc.Rev.，39:1656-1691，2010；Asymmetric Syntheses of Unnatural amino acids and Hydroxyethylene Peptide Isosteres，Wieslaw M.Kazmierski，ed.，Peptidomimetics Protocols，Vol.23，1998；和Unnatural amino acids，Kumar G.Gadamasetti and Tamim Braish，ed.，Process Chemistry in the Pharmaceutical Industry，Vol.2，2008。 [0159] 本领域技术人员能够理解，很多操作和方法可用于合成非天然氨基酸，例如，描述于Wieslaw M.Kazmierski，ed.，Peptidomimetics Protocols，Vol.23，1998；Wang L et al.，Chemistry and Biology，16:323-336，2009；和Wang F，Robbins S，Guo J，Shen W and Schultz PG.，PLoS One，5:e9354，2010。 [0160] 非天然氨基酸可包含非天然的L-和D-α氨基酸。L-α氨基酸可通过本领域熟知的方法化学合成，例如但不限于，通过铑催化的炔烃与乙基亚胺乙酸的氢化结合的C-C键生成的氢介导的还原偶联(Kong et al.，J.Am.Chem.Soc.，127:11269-11276，2005)。或者，可利用代谢工程化的半合成产物。例如，发酵方法可用于通过从携带再工程化半胱氨酸生物合成途径的大肠杆菌合成非天然氨基酸(见Maier TH，Nature，21:422-427，2003)。α-氨基酸的外消旋混合物可使用不对称的Strecker合成法来产生(描述于Zuend et al.，Nature，461；968-970(2009))或使用转氨酶进行大规模合成(描述于Taylor et al.，Trends Biotechnol.，16:412-419，1998)。双环三级α-氨基酸可通过甘氨酸来源的Schiff碱或具有环醚亲电体的硝基乙酸的烃化，随后酸诱导的开环且在NH4OH中环化来产生(见Strachan et al.，J.Org.Chem.，71:9909-9911(2006))。 [0161] 非天然氨基酸可进一步包含β-氨基酸，其在代谢中非常稳定，表现缓慢的微生物降解，并对蛋白酶和肽酶固有稳定。β氨基酸合成的例子描述于Tan CYK and Weaver DF，Tetrahedron，58:7449-7461，2002。 [0162] 在某些情况下，非天然氨基酸包含常用于固相肽合成的化学修饰的氨基酸，包括但不限于，叔丁氧基羰基-(Boc)或(9H-芴-9-基甲氧基)羰基(Fmoc)保护的氨基酸。例如，亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和脯氨酸的Boc衍生物可通过选择性的3,3-二甲基二环氧乙烷侧链氧化而产生，描述于Saladino et al.，J.Org.Chem.，64:8468-8474，1999。α-氨基酸的Fmoc衍生物可通过硝基乙酸乙酯的烃化并转化为衍生物而合成(见Fu et al.，J.Org Chem.，66:7118-7124，2001)。 [0163] 可用于本发明的非天然氨基酸可以包括但不限于，20种典型氨基酸取代基的非天然类似物或衍生物。本领域技术人员应当理解，多种非天然氨基酸的合成会涉及本领域熟知的一系列化学法和化学酶促法。在某些实施方案中，非天然氨基酸可根据本领域熟知的针对每种非天然氨基酸的具体衍生物的方法合成。Sycheva et al.，Microbiology，76:712-718，2007描述了合成非天然氨基酸正缬氨酸和正亮氨酸的方法。二烯丙基化脯氨酸衍生物可通过实际立体选择性合成而产生(见Belvisi et al.，Tetrahedron， 57:6463-6473，2001)。例如，色氨酸衍生物可通过三氟甲磺酸镱催化的吲哚的亲电取代反应而合成，描述于Janczuk et al.，Tetrahedron Lett.，43:4271-4274，2002，5-芳基色氨酸衍生物的合成描述于Wang et al.，Tetrahedron，58:3101-3110，2002。非天然丝氨酸类似物可通过一级烷氧基团的β片段化被产生(见Boto et al.，J.Org.Chem.， 72:7260-7269，2007)。或者，苯基丝氨酸的合成方法描述于Koskinen et al.，Tetrahedron Lett.，36:5619-5622，1995。L-苯基甘氨酸的合成方法描述于Cho et al.，Biotechnol.Bioprocess.Eng.，11；299-305，2006。合成D-4-羟基苯甘氨酸的化学酶促方法描述于Yu et al.，Folia Microbiol(Praha)，54:509-15；2009。2-萘基丙氨酸或Boc保护的2-萘基丙氨酸的产生的非限制性描述于Boaz et al.，Org.Process Res.Dev.，9:472-478；2005。 碘-L-酪氨酸和p-苯甲基-L-苯丙氨酸的合成描述于Hino N，Nat.Protoc.，1:2957-2962， 2007。 [0164] 装载的tRNA [0165] 为了将本文描述的非天然氨基酸入并入所希望的多肽，上文所述的nnAA需要被装载到同受正义或琥珀密码子tRNA。本文所使用的tRNA装载反应指的是体外tRNA氨酰化反应，其中所希望的同受正义密码子或琥珀密码子tRNA被其各自的感兴趣的氨基酸氨酰化。tRNA装载反应包括装载反应混合物，同受正义tRNA，并且在本发明中，可包括天然或非天然氨基酸。tRNA装载反应可与无细胞翻译反应在同一反应中原位发生，或可发生于另外的反应中，其中装载的tRNA被加入无细胞翻译反应。 [0166] 在tRNA装载反应中使用的tRNA分子可从对于选择的任何tRNA的合成DNA模板合成，然后在存在合适的5'和3'引物的条件下通过PCR扩增。然后，可使用T7RNA聚合酶体外转录产生的含有T7-启动子序列的双链DNA模板，从而产生tRNA分子，随后将其加入tRNA装载反应中。 [0167] tRNA装载反应可以为独立于蛋白合成反应的、用所需氨基酸氨酰化正义密码子或琥珀密码子tRNA分子的任何反应。该反应可在提取物中、人工反应混合物中或两者的组合中发生。合适的tRNA氨酰化反应条件为本领域普通技术人员所熟知。通常，tRNA氨酰化作用发生在生理缓冲液，其具有6.5-8.5的pH值，0.5-10mM高能磷酸盐(如ATP)，5-200mM MgCl2，20-200mM KCl。优选地，反应在存在还原剂(如0-10mM二硫苏糖醇)的情况下进行。当氨酰基-tRNA合成酶被外源加入时，合成酶浓度一般为1-100nM。本领域的技术人员容易认识到，这些条件可被改变以优化tRNA氨酰化，例如为了预选的氨基酸的高特异性，高产率和最低的交叉反应性。 [0168] 在本发明其他实施方案中，通过氨酰基-tRNA合成酶装载同受或琥珀tRNA。tRNA装载反应可利用对待装载的同受正义tRNAs特异性的天然氨酰基-tRNA合成酶，工程化氨酰基-tRNA合成酶，或能够为tRNA分子装载多种氨基酸的"混杂"氨酰基tRNA合成酶。混杂氨酰基-tRNA合成酶可为自身被工程化，或可包括有时可在自然界中存在的内源产生的氨酰基-tRNA合成酶。使用氨酰基-tRNA合成酶为同受tRNA装载天然和非天然氨基酸的方法描述于WO2010/081110，通过引用其内容并入本文。 [0169] 翻译体系 [0170] 以上描述的装载的同受正义或琥珀tRNA现在与翻译体系结合，翻译体系可包含无细胞提取物，细胞裂解物或重建的翻译体系，以及用于合成在预选的(定义的)位置具有非天然氨基酸的所需多肽或蛋白的核酸模板。反应混合物可进一步包含待合成的大分子的单体，例如氨基酸，核苷酸等，以及共因子、酶和合成必需的其他试剂，例如核糖体，tRNA，聚合酶，转录因子等。除如无细胞提取物、核酸模板和氨基酸的上述组分之外，蛋白合成具体需要的原料可被加入反应中。原料包括盐，亚叶酸，环AMP，蛋白或核酸降解酶抑制剂，蛋白合成抑制剂或调节剂，氧化/还原电位调节剂，非变性表面活性剂，缓冲液组分，精胺，亚精胺，腐胺等。多种无细胞合成反应体系在本领域所熟知。参阅，例 如，Kim，D.M.and Swartz，J.R.Biotechnol.Bioeng.66:180-8(1999)；Kim，D.M.and Swartz，J.R.Biotechnol.Prog.16:385-90(2000)；Kim，D.M.and Swartz，J.R.Biotechnol.Bioeng.74:309-16(2001)；Swartz et al，Methods MoL Biol.267:169-82(2004)；Kim，D.M.and Swartz，J.R.Biotechnol.Bioeng.85:122-29(2004)；Jewett，M.C.and Swartz，J.R.，Biotechnol.Bioeng.86:19-26(2004)；Yin，G.and Swartz，J.R.，Biotechnol.Bioeng.86:188-95(2004)；Jewett，M.C.and Swartz，J.R.，Biotechnol.Bioeng.87:465-72(2004)；Voloshin，A.M.and Swartz，J.R.，Biotechnol. Bioeng.91:516-21(2005)。希望的多肽的无细胞合成的其他条件描述于WO2010/081110，通过引用将其内容并入本文。 [0171] 在某些实施方案中，DNA模板被用于驱动体外蛋白合成，RNA聚合酶被加入反应混合物以提供DNA模板的增强的转录。适于本文使用的RNA聚合酶包括在细菌提取物所来源于的细菌中有功能的任何RNA聚合酶。在其他实施方案中，RNA模板被用于驱动体外蛋白合成，反应混合物的组分可以任何方便的次序被混合在一起，但优选地，按最后加入RNA模板的次序混合，从而最小化核酸酶可能引起的RNA模板的降解。 [0172] 无细胞翻译体系 [0173] 无细胞蛋白合成可利用细胞机制的催化能力。体外获得最大蛋白产率需要足够的底物供应(例如三磷酸核苷和氨基酸)、稳定的环境、催化剂稳定性和除去或避免抑制性副产物。体外合成反应的优化得益于再创建快速生长生物体的体内状态。在本发明的TM某些实施方案中，无细胞合成因而被实施于氧化磷酸化活化的反应中，即，CYTOMIM 体系。 TM TM CYTOMIM 体系被定义为使用具有优化镁浓度、不存在聚乙二醇的反应条件。CYTOMIM 体系TM 不积累已知抑制蛋白合成的磷酸盐，而常规的二级能量源导致磷酸盐积累。CYTOMIM 体系的多种其他特点描述于美国专利7,338,789，通过引用将其整体内容并入本文。 [0174] 活化的氧化磷酸化通路的存在可通过缺少对二级能量源(如磷酸烯醇丙酮酸盐，磷酸肌醇，乙酰磷酸，或糖酵解的中间产物如葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸和丙酮酸)的需求来证明。活化的氧化磷酸化通路的存在也可通过通路对抑制剂(如电子传递链抑制剂)的敏感性来确定。电子传递链抑制剂的实例包括2-庚基-4-羟基喹啉-N-氧化物(HQNO)，2,4-二硝基酚，氰化物，叠氮化物，噻吩甲酰三氟丙酮和羰基-氰化物-m-氯苯腙。或者，在一个实施方案中，无细胞翻译体系不包括活化的氧化磷酸化通路。 [0175] 体外或无细胞蛋白合成比常规体内蛋白表达方法提供多种优势。无细胞体系能引导大部分(即使不是全部)的细胞代谢资源朝向一种蛋白的唯一产生。此外，体外情况下缺乏细胞壁和膜组分是有利的，因为允许控制合成环境。例如，可改变tRNA水平以反映所表达的基因的密码子使用。氧化还原电位、pH或离子强度也可被改变，比体内蛋白合成具有更好的灵活性，因为不需要考虑细胞生长或活力。此外，可容易的完成纯化的正确折叠的蛋白产物的直接回收。 [0176] 无细胞体系的产生能力在近些年来提升了超过2个数量级，从约5μg/ml-hr到约500μg/ml-hr。这样的提高使得体外蛋白合成成为实验室规模研究的实用技术，并为高通量蛋白表达提供了平台技术。其进一步表明使用无细胞技术作为蛋白药物的体内大规模商业化产生的替代方案的可行性。 [0177] 产生裂解物 [0178] 本发明利用细胞裂解物进行靶蛋白的体外翻译。为了方便，用作为裂解物来源的生物体可被称为来源生物体或宿主细胞。宿主细胞可为细菌、酵母、哺乳动物或植物细胞，或能够合成蛋白的任何其他类型细胞。裂解物包含能够翻译编码所需蛋白的信使核糖核酸(mRNA)的组分，并任选包含能够转录编码所需蛋白的DNA的组分。这样的组分包括，例如，DNA指导的RNA聚合酶(RNA聚合酶)，编码所需蛋白的DNA的转录起始所需的任何转录激10 活物，转运核糖核酸(tRNA)，氨酰基-tRNA合成酶，70S核糖体，N -甲酰四氢叶酸，甲酰蛋氨Met 酸-tRNAf 合成酶，肽基转移酶，起始因子(如IF-1，IF-2和IF-3)，延伸因子(如EF-Tu，EF-Ts和EF-G)，释放因子(如RF-1，RF-2和RF-3)等。 [0179] 一个实施方案使用裂解物来源于的细菌细胞。来源于任何细菌菌株的细菌裂解物可用于本发明的方法中。细菌裂解物可按如下获得。使选择的细菌在本领域熟知的生长条件下，在任意多种生长培养基中过夜生长，并且本领域技术人员可针对具体细菌的生长容易地进行优化。例如，用于合成的天然环境利用来源于细菌细胞的细胞裂解物，细菌细胞生长于含葡萄糖和磷酸盐的培养基，其中葡萄糖存在的浓度至少为约0.25％(重量/体积)，更通常为至少约1％，通常不大于约4％，更通常不大于约2％。此类培养基的例子为2YTPG培养基，然而本领域的技术人员能够理解，许多培养基可为此目的而调整，已有多种公开的适用于如大肠杆菌的细菌生长的培养基，使用规定的和不规定的营养素来源。过夜收集的细胞可被裂解，通过将细胞团悬浮于适当的细胞悬浮液，并通过超声破坏悬浮的细胞，在弗氏压碎器中破坏悬浮的细胞，持续气流高压均化作用，或本领域熟知的任何有效裂解细胞的其他方法。然后，将细胞裂解物离心或过滤以除去大的DNA片段。实施例 [0180] 实施例1 [0181] 该实施例描述修饰RF1蛋白以引入可被OmpT1蛋白酶切割的氨基酸序列。 [0182] 方法： [0183] 构建模板以向RF1中引入OMPT1切割位点 [0184] 使用基于PCR的策略来向编码本文所述修饰的RF1蛋白的核酸模板中引入所需核苷酸序列改变。根据制造商所建议的方案，使用Phusion Hot Start Flex 2X Master Mix(NEB)来进行PCR反应。通常，进行两步重叠PCR以向RF1编码基因中引入OmpT切割突变，如下文详细描述。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)来纯化PCR产生的DNA模板以用于无细胞表达中。PCR纯化后，通过Mclab(South San Francisco，CA)来测序变体，以确认期望突变的存在。 [0185] 制备GamS蛋白以防止无细胞反应中DNA模板的降解 [0186] 从DNA模板的转录效率可由于模板被无细胞提取物中的内源细菌核酸外切酶降解而降低。简式λ噬菌体Gam蛋白(GamS)已知能通过抑制RecBCD(核酸外切酶V)的活性而保护DNA模板免于降解(见Sitararman，K.，Esposito，D.，Klarmann，G.，Grice，S.F.L.，Hartley，J.L.and Chatterjee，D.K.2004，A Novel Cell-free Protein Synthesis System.J Biotechnol.110:257-263)。因此，GamS蛋白被用于本实施例中，在无细胞转录反应过程中稳定PCR模板。为了产生重组GamS蛋白，GamS基因被扩增为包含C端聚组氨酸标签，GGSHHHHHH(SEQ ID NO:50)，通过引物，5’-ATATATCATATGAACGCTTATTACATTCAGGATCGTCTTGAG-3’(SEQ ID NO:51)，和5’-ATATATGTCGACTTAATGATGATGATGATGATGAGAACCCCCTACC TCTGAATCAATATCAACCTGGTGGTG-3’(SEQ ID NO:52)，使用pKD46(Datsenko，K.A.and Wanner，B.2000，One-step Inactivation of Chromosomal Genes in Escherichia coli K-12Using PCR Produces.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640-6645)作为模板。GamS基因在NdeI/SalI限制性位点被亚克隆入无细胞表达质粒pYD317。将GamS在体外表达并通过固定化金属亲和层析法(IMAC)纯化，纯度高于90％(数据未显示)。在应用前，GamS蛋白被保存在-70℃，于100mM Tris-乙酸缓冲液(pH 8.2)，其还包含160mM乙酸钾，200mM氯化钠和 10％蔗糖。 [0187] 细菌菌株和质粒 [0188] SBJY001是大肠杆菌K12衍生体，针对开放式无细胞蛋白产生进行过优化。用质粒pKD46(Coli Genetic Stock Center)转化SBJY001，该质粒包含在诱导型阿拉伯糖启动子控制下的λ噬菌体Red重组酶基因。 [0189] SBHS002的构建 [0190] SBHS002为通过P1转导而产生的ompT缺失的大肠杆菌菌株。P1裂解物来自于RJW0554-1(CGSC#8680)，其是包含侧翼为FRT位点的ompT::Kan突变的Keio收集菌株。然后，JW0554-1P1裂解物被用于通过P1转导向SBJY001中引入突变。克隆生长于含30μg/R ml卡那霉素的LB上，以筛选卡那霉素抗性。用708-FLPe Cm表达载体(Gene Bridges)转R 化SBJY001ompT::Kan。诱导FLP合成，并筛选丢失卡那霉素抗性的克隆。卡那霉素抗性克隆被测序，以确认ompT的缺失。ompT缺失的菌株称为SBHS002。 [0191] N端组氨酸标记的RF1的克隆和表达 [0192] 从大肠杆菌菌株A19的基因组DNA中扩增RF1，使用引物5His-RF1:CATATGCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGCTCTAAGCCTTCTATCGTTGCCAAACTGGAAGCC(SEQ ID NO:138) 和 3RF1:GTCGACTTATTCCTGCTCGGACAACGCCGCCAG(SEQ ID NO:139)，该引物引入N端组氨酸标签和NdeI/SalI限制性位点。将该插入物连接到表达载体pYD317并通过测序确认。利用该质粒，于25mL无细胞反应中表达RF1，通过IMAC纯化，并缓冲液交换至PBS。 [0193] 利用无细胞提取物切割重组RF1变体 [0194] 为了检测本文所述修饰的RF1蛋白是否可被OmpT切割，在存在或不存在OmpT的情况下，将重组RF1变体与细胞提取物一起培养。在外膜具有完整的ompT蛋白酶的SBJY001细胞和ompT缺失的SBHS002细胞被培养于5mL LB中，于37℃过夜生长。50μL的每种培养物于8,000rpm离心2分钟，并用10mM Tris、20mM氯化铵和10mM氯化镁洗涤两次。随后，将细胞团重悬于50μL缓冲液，并加入10μg纯化的重组大肠杆菌RF1蛋白。将样品被在37℃下孵育。将样品于8,000rpm离心2分钟。包含RF1蛋白的上清液被取出，并在SDS-PAGE凝胶上电泳。 [0195] RF1变体的无细胞表达 [0196] 无细胞转录/翻译反应于60μl体积、30℃下、24深孔板(货号95040470，Thermo Scientific)中进行4.5小时。RF1变体表达的PCR模板浓度为10μg/ml。反应成分还包括8mM谷氨酸镁，130mM谷氨酸钾，35mM丙酮酸钠，1.2mM AMP，GMP，UMP和CMP分别为0.86mM， 4mM草酸钠，1mM腐胺，1.5mM亚精胺，15mM磷酸钾，1mM酪氨酸，其他19种氨基酸每种2mM， 100nM T7RNA聚合酶，30％(V/V)S30细胞提取物。为促进二硫化形成，在无细胞反应前，用 50μM IAM室温处理S30细胞提取物30分钟。2mM氧化谷胱甘肽(GSSG)和1mM还原谷胱甘肽(GSH)的混合物与4.3μM大肠杆菌二硫化物异构酶DsbC也被加入。为了利用SDS-PAGE 14 和放射自显影来分析无细胞表达的RF1变体，反应在痕量[ C]-亮氨酸(300μCi/摩尔；GE Life Sciences，NJ)的存在下进行。RF1变体表达于从细菌菌株SBJY001制备的OmpT-阳性(OmpT+)细胞提取物中，或从细菌菌株SBHS002(SBJY001ΔompT)制备的OmpT-阴性 (OmpT-)细胞提取物中。为了使PCR模板在无细胞反应中稳定，加入1.4μM GamS蛋白以抑制RecBCD的活性。 [0197] SDS-PAGE和放射自显影 [0198] 为了确定修饰的RF1蛋白是否能被OmpT切割，通过SDS-PAGE和放射自显影来分14 析上述无细胞反应中翻译的RF1蛋白。用台式离心机的最大速度离心被 C标记的无细胞反应样品，将4μL上清液和Invitrogen SDS-PAGE样品加样缓冲液以及水混合。将样品上样于4～12％Bis-Tris SDS-PAGE胶，并用MES电泳缓冲液电泳约45分钟。之后，将胶干燥并暴露于磷化荧光屏(63-0034-86，GE healthcare，USA)过夜，之后使用Storm460(GE healthcare，USA)扫描。 [0199] OmpT切割位点引入到RF1 [0200] 为了鉴定RF1序列中可能的OmpT切割位点，在已有的Arg或Lys旁边，将单个Arg或Lys突变引入RF1不同的环区。基于原核生物I类释放因子的序列比对来预测环区(参阅Graille，M.，Heurgue-Hamard，V.，Champ，S.，Mora，L.，Scrima，N.，Ulryck，N.，Tilbeurgh，H.and Buckingham，R.H.2005，Molecular Basis for Bacterial Class I Release Factor Methylation by PrmC.Molecular Cell.20:917-927)。为了产生所需变体，将突变序列设计在正向和反向寡核苷酸引物中间(表1)。在第一步PCR中，使用5chiT2PT7，5’-GCGTACTAGCGTACCACGTGGCTGGTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGG-3’(SEQ ID NO:53)和反向引物(表1)通过PCR来扩增5’片段。5’片段包括T7启动子，N端序列恒定区和突变位点。在第一步中，使用正向引物(表1)和3chiT2TT7，5’-GCGTACTAGCGTACCACGTGGCTGGTGGCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGC-3’(SEQ ID NO:54)来扩增3’片段。3’片段包括突变位点，C端恒定区和T7终止子序列。在第二步PCR中，使用单引物5chiT2,5’-GCGTACTAGCGTACCACGTGGCTGGTGG-3’(SEQ ID NO:55)，将5’片段和3’片段DNA通过重叠PCR来组装，。 [0201] 首先，将9个单突变M74R、E76R、E84R、A85R、E87R、E108R、T293R、N296K和S304R引入环区中已有的Arg或Lys旁边(表2)。在存在或不存在OmpT的情况下，使用PCR模板，将这些RF1变体和WT RF1在无细胞提取物中表达。通过SDS-PAGE和放射自显影来分析RF1蛋白。当表达于OmpT阴性细胞提取物中时，所有10种RF1变体在SDS-PAGE上显示完整的全长蛋白。然而，当表达于含OmpT的细胞提取物中时，变体N296R被部分消化，但其他变体按照预期以全长未消化的蛋白迁移。N296位于RF1的转换环区，该区为柔性的并容易受到蛋白酶消化。 [0202] 第一轮筛选中，选择N296K，由于其在细胞提取物中被OmpT部分消化。在第二轮筛选中，利用表1中所列引物，使用上述相同的方法产生双突变和三突变变体的PCR模板。在存在或不存在OmpT的情况下，在无细胞表达中检测6种双突变N296K/L297V、N296K/L297K、N296K/L297R、N296R/L297V、N296R/L297K、N296R/L297R和2种三突变N296K/L297R/L298K和N296K/L297R/L298R(表2)。所有8种双突变和三突变RF1变体被OmpT1切割(数据未显示)。在这些变体中，N296K/L297R/L298R对OmpT的消化最敏感。 [0203] 表1.用于OmpT切割位点筛选的正向和反向引物序列 [0204] [0205] [0206] *突变序列被下划线标注 [0207] 表2. RF1的单取代、双取代和三取代变体 [0208]编号 单取代变体 A-1 M74R A-2 E76K A-3 E84K A-4 A85R A-5 E87R A-6 E108R A-7 T293R A-8 N296K A-9 S304K 双取代变体 A-11 N296K/L297V A-12 N296K/L297K A-13 N296K/L297R A-14 N296R/L297V A-15 N296R/L297K A-16 N296R/L297R 三取代变体 A-17 N296K/L297R/L298K A-18 N296K/L297R/L298R [0209] 向RF1的转换环区插入OmpT切割肽 [0210] 除了引入上述的氨基酸突变之外，RF1也被修饰为将转换环区中的野生型序列替换为已知的OmpT蛋白酶敏感肽序列(见Hwang，B.，Varadarajan，N.，Li，H.，Rodriguez，S.，Iverson，B.L.and Georgiou，G.2007，Substrate Specificity of the Escherichia coli Outer Membrane Protease OmpP.J.Bacteriol.189:522-530；McCarter，J.D.，Stephens，D.，Shoemaker，K.，Rosenberg，S.，Kirsch，J.F.and Georgiou，G.2004，Substrate Specificity of the Escherichia coli Outer Membrane Protease OmpT.J.Bacteriol.186:5919-5925)。构建22种RF1变体，并列于表3。变体1到14号包含用于OmpT消化ARRG(SEQ ID NO:47)。变体15号包含ARR而不是ARRG(SEQ ID NO:47)，因为其位于转换环的末端。变体16号包含单突变N296R。变体17，18和19号包含OmpT切割肽WLAARRGRG(SEQ ID NO:48)。变体20，21和22号包含另一种OmpT切割肽WGGRWARKKGTI(SEQ ID NO:49)。 [0211] 突变序列被设计在表4中列出的正向和反向寡核苷酸引物中。在第一步PCR中，使用引物5chiT2PT7和反向引物(表4)通过PCR来扩增5’片段。5’片段包括T7启动子、N端序列恒定区和突变位点。在第一步中，还使用正向引物(表3)和3chiT2TT7来扩增3’片段。3’片段包括突变位点，C端恒定区和T7终止序列。在第二步PCR中，使用上述的单引物5chiT2，通过重叠PCR来装配5’片段和3’片段DNA。 [0212] 在存在或不存在OmpT的情况下，在细胞提取物中，使用PCR模板来表达22种RF1变体(表3)。在ARRG(SEQ ID NO:47)插入变体中，9号对OmpT消化表现最高的敏感性。包含OmpT切割肽WLAARRGRG(SEQ ID NO:48)的变体17，18和19号被OmpT部分消化。然而，它们的敏感性比包含OmpT切割肽WGGRWARKKGTI(SEQ ID NO:49)的变体20，21和22号低的多。在这22种构建体中，选择变体9，20，21和22号，因为它们是对OmpT消化最敏感的RF1变体。 [0213] 表3.插入RF1转换环的OmpT切割肽序列 [0214]编号 肽** SEQ ID NO: *0 QQAEASTRRNLLGSGDRS 4 1 QARRGSTRRNLLGSGDRS 26 2 QQARRGTRRNLLGSGDRS 27 3 QQAARRGRRNLLGSGDRS 28 4 QQAEARRGRNLLGSGDRS 29 5 QQAEAARRGNLLGSGDRS 30 6 QQAEASARRGLLGSGDRS 31 7 QQAEASTARRGLGSGDRS 32 8 QQAEASTRARRGGSGDRS 33 9 QQAEASTRRARRGSGDRS 34 10 QQAEASTRRNARRGGDRS 35 11 QQAEASTRRNLARRGDRS 36 12 QQAEASTRRNLLARRGRS 37 13 QQAEASTRRNLLGARRGS 38 14 QQAEASTRRNLLGSARRG 39 15 QQAEASTRRNLLGSGARR 40 16 QQAEASTRRRLLGSGDRS 6 17 QQAWLAARRGRGGSGDRS 41 18 QQAEWLAARRGRGSGDRS 42 19 QQAEAWLAARRGRGGDRS 43 20 QQWGGRWARKKGTIGDRS 44 21 QQAWGGRWARKKGTIDRS 45 22 QQAEWGGRWARKKGTIRS 46 [0215] *WT转换环肽序列(Q287至S304) [0216] **插入的氨基酸或肽序列被下划线标注 [0217] 表4. OmpT切割肽插入的正向和反向引物序列 [0218] [0219] [0220] [0221] [0222] *突变序列被下划线标注 [0223] 实施例2 [0224] 在证实RF1被成功修饰为可被OmpT1蛋白酶切割后，本实施例描述表达修饰的RF1和完整的OmpT1的重组细菌菌株的构建。本实施例的目的是展示重组菌株所表达的RF1变体在来自于表达OmpT1重组菌株的无细胞提取物中被切割。 [0225] 寡核苷酸介导的等位基因置换 [0226] 为了产生表达本文所述修饰的RF1蛋白的细菌菌株，寡核苷酸介导的等位基因置换(OMAR)被用于向细菌基因组中插入RF1突变。OMAR的实验方案改造自之前报道的方案(Wang and Church，Methods in Enzymology，2011，498，409-426)。简言之，使包含pKD46质粒的SBJY001于30℃下生长于3ml LB和50μg/mL氨苄西林中，达到OD6000.3。之后，于37℃下，用1mM L-阿拉伯糖诱导细胞45分钟。用冷的10％甘油洗涤细胞团两遍，并重悬于30μL冷的10％甘油。5μM每种寡核苷酸加入重悬细胞。合成的寡核苷酸(Integrated DNA Technologies)的长度为90个碱基对，并设计为在DNA复制过程中退火到滞后链(参阅表5)。将细胞在1mm杯中、于1800V、电穿孔5ms。之后，于3mL LB 50μg/ml Amp中恢复。该过程重复13个循环。将细胞稀释并接种于LB琼脂板，于37℃生长过夜。 [0227] 用于鉴定具有所需突变的细菌菌株的MAMA PCR [0228] 通过改造的错配扩增突变实验(MAMA)PCR来筛选细菌克隆以鉴定在RF1具有所需突变的菌株(Cha et.Al，PCR Methods and Applications，1992，2，14-20)。简言之，通用5’引物与对每种突变特异性的3’引物联合使用以区分突变体和WT克隆(见表5)。寡核苷酸订货于Eurofins MWG Operon。 Blue PCR Supermix(Invitrogen)被用 于进行MAMA PCR。PCR运行程序为95℃3分钟，30x(95℃15秒，58℃20秒，72℃1分钟)和72℃5分钟。将PCR产物在96孔E-凝胶(Invitrogen)上电泳以显现任何条带。 [0229] 提取物的制备和Western印迹 [0230] 将被工程化为包含修饰的RF1变体的菌株SBHS015，SBHS016和SBHS017培养于Tunair摇瓶中的500mL TB、于37℃下震荡过夜。将细胞在6000g离心15分钟。用6mL S30缓冲液(10mM Tris，14mM乙酸镁和60mM乙酸钾)洗涤细胞团两次:1g细胞团。之后，将细胞重悬于2mL S30缓冲液:1g细胞团。使用均质机裂解重悬细胞。然后，以15,000g、30分钟离心澄清提取物两次。将提取物在30℃水浴中活化1、2或3小时。通过用纯化的重组大肠杆菌RF1蛋白接种兔，制备抗RF1抗体，之后使用亲和基质(YenZym Antibodies LLC)来纯化。使用重组蛋白的ELISA和Western印迹来确定抗体的特异性。将细胞团、裂解物和提取物样品在SDS-PAGE胶电泳，并使用 系统(Invitrogen)将其转移到PVDF膜上。使用抗RF1一抗，然后后使用抗兔碱性磷酸酶偶联二抗(Invitrogen)。使用碱性磷酸酶显色底物溶液(包含5-溴-4-氯-3-吲哚-1-磷酸盐和氮蓝四唑(Invitrogen))来显 现条带。 [0231] 表5.用于OMAR和MAMA PCR的寡核苷酸序列。 [0232] [0233] [0234] 鉴定出了成功在基因组中并入RF1突变的3种重组细菌菌株。菌株SBHS015包含RF1的N296K/L297R双突变变体，称为变体A13。菌株SBHS016包含RF1的N296K/L297R/L298R三突变变体，称为变体A18。菌株SBHS017包含RF1的N296K/L297R/L298K三突变变体，称为变体A17。全部三种菌株也表达完整的OmpT1，正如它们源自亲本菌株SBJY001。当重组菌株被裂解并被培养不同的时间(0，1，2和3小时)时，如Western印迹分析所确定的(数据未显示)，修饰的RF1蛋白变体在所有时间点被无细胞提取物有效切割。相比之下，未修饰的野生型RF1被菌株SBJY001的切割在相同的时间段未被检测到，表明在含有完整OmpT1的无细胞提取物中，野生型RF1未被有效切割。 [0235] 该实施例证实，重组细菌菌株被工程化为表达修饰的RF1变体，并且RF1变体可被来自OmpT1阳性菌株的无细胞提取物切割。 [0236] 实施例3 [0237] 实施例3展示了被修饰为在转换环区包含OmpT1切割位的完整RF1蛋白点具有野生型RF1功能。 [0238] 重组RF1变体的功能检测 [0239] 为了检测本文所述重组RF1变体的功能，测定RF1变体在琥珀密码子处终止翻译的能力。在SBHS002提取物(OmpT缺失菌株)中存在500nM纯化的重组大肠杆菌野生型或14 突变RF1和2μM非天然氨基酸的条件下，表达带有TAG突变的Fc蛋白。在存在 C-Leu条件下，在30℃进行60μL无细胞反应物5小时。将最终反应物离心以获得可溶部分，进行还原SDS-PAGE胶电泳，转移到PVDF膜(Invitrogen)，暴露于磷光荧光屏过夜。使用Storm Imager来可视化磷光荧光屏，使用ImageQuant来测定相对的条带强度。通过比较截短的Fc蛋白的量与阴性对照(无外源加入RF1)和阳性对照(加入WT RF1)来测定突变体的相对活性。使用以下公式来测定截短蛋白的百分比：(截短的蛋白计数/总蛋白计数)x100％。 使用以下公式来测定相对RF1活性：[(变体截短的蛋白-阴性对照截短的蛋白)/(WT RF1截短的蛋白–阴性对照截短的蛋白)]x 100％。 [0240] 如图1中所示，本文所述的RF1变体具有RF1活性，正如当在引入于Fc蛋白第S378位的琥珀密码子并入非天然氨基酸(pAzF)时，翻译的截短所证实的。特别是，RF1变体A13(具有N296K/L297R取代)具有与野生型RF1类似的活性水平。 [0241] 该实施例证实，修饰为在转换环区包含OmpT切割位点的完整的RF1蛋白具有功能性RF1活性(例如，减少的琥珀抑制)。 [0242] 实施例4 [0243] 实施例4证实，使用包含在转换环区有OmpT1切割位点的RF1变体的无细胞提取物，赫赛汀(Herceptin)蛋白的IgG重链中非天然氨基酸的并入增，。无细胞提取物来自实施例2中所述细菌菌株。 [0244] 方法 [0245] 赫赛汀重链的定点突变 [0246] 为了向赫赛汀的重链引入nnAA，编码赫赛汀的DNA模板被突变为在编码序列的不同位点引入琥珀密码子。使用在C端包含赫赛汀6xHis编码区的pYD质粒作为DNA模板以及在正义和反义方向都包含琥珀密码子的合成寡核苷酸(Operon)(表6)来进行定点突变。每个突变的寡核苷酸与DNA模板和 聚合酶(Thermo，Cat#F531s)混合，终体积 为20μL。每个成分的终浓度为每种寡核苷酸0.16μM，模板DNA 0.5ng/μL， 聚合酶0.02U/μL，配制于包含1.5mM MgCl2和200μM dNTP的HF缓冲液(Thermo)。混合物孵育于98℃5m，18个PCR循环(98℃30s，55℃1m，72℃4m)，72℃下10m，保存于4℃最多16h。DpnI(NEB)被加入混合物，终浓度为0.6U/μL并在37℃下孵育1h。根据厂商流程(Invitrogen，MultiShotTM96孔板TOP10)，5μL每种混合物被转化入50μL化学感受态大肠杆菌细胞。转化的细胞于200μLSOC(Invitrogen)、37℃下恢复1h，并接种于加入50μg/mL卡那霉素(Teknova)的Luria-Bertani(LB)琼脂。37℃下孵育24h后，使用Qpix2(Genetix)挑取克隆到含7.5％甘油和50μg/mL卡那霉素的200μL LB，于37℃生长24h，20μL培养物被用于循环扩增，并通过引物延伸来测序，使用T7(5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’；SEQ ID NO:147)和T7term(5’-GCTAGTTATTGCTCAGCG-3’；SEQ ID NO:148)引物(Sequetech)。使用Sequencher(Gene Codes)来分析序列。 [0247] 表6.在赫赛汀的指定位点引入琥珀密码子的引物 [0248] [0249] [0250] 提取物的制备 [0251] 在终密度40-55OD时获集具有修饰的RF1变体A18的大肠杆菌菌株SBHS016，并使用Sharples Model AS14离心机于14,000g离心10分钟以除去消耗后的培养基。以6mL/g细胞的比例的S30缓冲液(14mM MgAcO，60mM KAcO，10mM Tris)将细胞团重悬均匀，并再次使用Sharples AS14于14,000g离心10分钟以进一步除去消耗后的培养基。以2mL/g细胞比例的S30将产生的澄清细胞团重悬，通过使细胞一次性通过17,000psi下的Avestin Emulsiflex C-55均质机而裂解细胞。通过两次于14,000g离心30分钟来澄清均浆，产生的沉淀团被弃掉。将产生的细胞提取物溶液在30℃孵育2小时，之后再次使用Sharples AS14于14,000g离心以去除微粒性物质。终溶液被冷冻于LN2并存于-80℃，直到无细胞蛋白合成需要。 [0252] 将无细胞提取物在室温下解冻，并与50μM碘乙酰胺孵育30min。无细胞反应于30℃进行最多10h，反应包含30％(v/v)碘乙酰胺处理的提取物和8mM谷氨酸镁，10mM谷氨酸氨，130mM谷氨酸钾，35mM丙酮酸钠，1.2mM AMP，GMP、UMP和CMP每种0.86mM，2mM氨基酸(酪氨酸为1mM)，4mM草酸钠，1mM腐胺，1.5mM亚精胺，15mM磷酸钾,100nM T7RNAP，2.5μM大肠杆菌DsbC，5μM酵母PDI，2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)和15μM酵母tRNA pN3F氨酰 14 14 基tRNA。为了用 C标记合成的蛋白，3.33％(v/v)l-[U- C]-亮氨酸(300mCi/mmole；GE Life Sciences，Piscataway，NJ)也被加入反应。重链TAG变体质粒和野生型轻链质粒的浓度分别为7.5μg/mL和2.5μg/mL。作为对照，野生型轻链的无细胞表达与TAG变体平行完成。 [0253] 基于我们的内部研究，从重链选择12个难以抑制的位点，包括N297，T299，K320，G341，Q342，P343，Y373，F404，F405，S415，Q418，和V422。S136选为阳性对照，其具有相对高的抑制。来自菌株SBJY001(表达野生型RF1)和SBHS016(表达修饰的RF1)的两种细胞提取物被用于比较提取物在这些难以抑制的位点并入nnAA的能力。 [0254] 在24孔板中进行60μL无细胞反应。无细胞反应完成后，进行TCA沉淀来测定合成的总蛋白和可溶蛋白。按照平行方式，非还原和还原胶用于放射自显影实验。对于非还原胶，4μL样品，8μL DI H2O和4μL 4X LDS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)在上样前混合。对于还原胶，4μL样品，1μL 1M DTT，7μL DI H2O和4μL 4X LDS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)混合并在热杂交中70C下加热5分钟。根据厂商的建议，通过4～12％Bis-Tris SDS–PAGE胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)来分析样品。将胶干燥并通过放射自显影分析，在约16小时暴露后使用Storm 840PhosphoImager。 [0255] [0256] 其中条带强度用ImageQuantTM软件来测定，[可溶的蛋白]通过TCA沉淀法来估测。 [0257] 通过还原SDS-PAGE胶的[14C]-放射性自显影来测定在重链不同位点的琥珀密码子抑制。全长野生型重链和抑制的重链TAG变体在SDS-PAGE运行为49Kd。TAG变体的未抑制的(截短)重链运行为较低的分子量。 [0258] 重链中TAG的抑制通过以下预测： [0259]TM [0260] 其中带强度用ImageQuant 软件来测定。 [0261] 为了产生用于纯化的原材料，反应规模被扩大为相同条件下1mL于10cm培养皿。 [0262] tRNA产生 [0263] 所有tRNApheCUA转录物的转录在以下条件下进行：20-50ng/μl pYD318-tRNAphe AAA-HDV-T7trm，40mM NaCl，10mM MgCl2，10mM DTT，4mM dNTPs，2.5mM 亚 精 胺，1U/ml PPiase，2.5mg/ml T7 RNA聚合酶和40mM Tris(pH 7.9)。通过使用XK50/100柱上的串联Sephacryl 100或300树脂的凝胶过滤层析法，将tRNA分子从亲本RNA和HDV核酸酶RNA产物分离。在50mM Tris(pH 6.5)和250mM NaCl中构建尺寸柱。包含tRNA的部分被合并，与1/10体积的3M乙酸钠(pH 5.2)混合，等体积的异丙醇被加入来沉淀RNA。tRNA作为沉淀保存，或重悬于10mM Tris(pH 6.5)和0.1mM EDTA。 [0264] 用配制于100mM MES pH 5.5、10mM MgCl2和10mM 2-巯基乙醇的T4多核苷酸激酶处理氨酰化反应中使用的tRNA1hr，以除去2’,3’-环磷酸，在tRNA的3’端留下2’,3’-OH基团。用苯酚：氯仿：异戊醇提取T4 PNK处理过的tRNA，并使用G25柱缓冲液交换，G25柱能除去无机磷酸盐和多余苯酚。用异丙醇或乙醇沉淀tRNA，重悬于10mM Tris(pH 6.5)和0.1mM EDTA。通过加热tRNA到70℃20分钟来使tRNA再折叠。之后加入10mM MgCl2，使混合物慢慢地平衡到室温。 [0265] tRNA转录物的HDV核酸酶切割，在产生同质3’端的同时，留下干扰接下来的氨酰化的2’-3’环磷酸部分。已经发现，可使用T4多核苷酸激酶(PNK)将其除去。使40μM tRNA于37℃与配制于50mM MES(pH 5.5)、10mM MgCl2、300mM NaCl和0.1mM EDTA的0.050mg/ml PNK孵育。可通过两种不同方法来测试脱磷酸作用。使用变性凝胶电泳验证脱磷酸作用。已经报道，脱磷酸tRNA在酸/尿素胶电泳中具有降低的运动性。将包含3μg脱磷酸的tRNA的样品份于上样缓冲液(100mM乙酸钠(pH 5.2)中，7M尿素，1mg/ml溴酚蓝染料)稀释两倍，上样于6.5％19:1丙烯酰胺，100mM乙酸钠(pH 5.2)，7M尿素胶(40cm X 34cm)，并于40W电泳过夜。使用配制于0.5M乙酸钠(pH 5.2)的0.06％亚甲基蓝染色胶30分钟，和并用去离子水退色。仅5分钟后，两个实验均显示显著的脱磷酸作用。1小时后脱磷酸作用基本完成，将tRNA加热到70℃再折叠，加入10mM MgCl2，之后缓慢冷却到室温。使用Nano-Drop 1000分光光度计(Thermo Scientific)来测量RNA的浓度，并通过凝胶电泳来确认。 [0266] 琥珀抑制子tRNA氨酰化 [0267] 非天然氨酰化条件为50mM HEPES pH 8.1，40mM KCl，75mM MgCl2，5mM ATP，phe8-40μM tRNA CUA，10mM DTT，2mM氨基酸(pN3F)和40μM PheRS T415A D243A。通过tRNAphe 的氨酰化的和未氨酰化的部分的HPLC HIC解析来完成tRNA CUA氨酰化百分比的测定。该方法允许我们在tRNA被加工并可用于并入蛋白之后监控我们的tRNA的氨酰化程度。反应在37℃进行15min，并用2.5体积的300mM乙酸钠pH 5.5淬灭。用25:24:1的苯酚：氯仿：异戊醇pH 5.2(ambion)提取淬灭的样品，并涡旋振荡2min。之后，14,000rcf、4℃、离心10-30min以分离水相(tRNA)和有机相(蛋白)。水相(含tRNA)被取出，并加入预平衡的(300mM NaOAC)G25 sephadex树脂尺寸排阻柱，该柱根据分子的大小进行分离。将洗脱液与2.5体积的100％乙醇混合。并于-80℃孵育15-30分钟，于12,000-14,000rcf离心 30-45分钟。氨酰化tRNA现为沉淀，可保存于-80℃或重悬于微酸性缓冲液，用于输入HPLC和/或用于OCFS反应。 [0268] HPLC C5HIC柱在缓冲液A(50mM磷酸钾和1.5M硫酸铵pH 5.7)中平衡，直到UV轨迹不从0波动。将1-10μg tRNA与100μl of 2X缓冲液A(100mM磷酸钾和3M硫酸铵)混合。输入样品并在缓冲液A到缓冲液B(50mM磷酸钾和5％异丙醇)的梯度中运行超过50分钟。 [0269] pN3F向turboGFP TAG突变体的并入: [0270] 为监测存在琥珀密码子(终止密码子)的构建体中的绿色荧光蛋白的荧光，编码turboGFP(Evrogen，Russia)的DNA被克隆入我们的OCFS表达载体pYD317。通过重叠PCR诱变将终止密码子(TAG)插入到对应于根据turboGFP(pdb 2G6X)的晶体结构的赖氨酸37，酪氨酸50和谷氨酸205(以及组合)的核苷酸处。因此，装载tRNA的终止密码子的任何抑制将产生荧光。反应于30℃、在带粘性盖(VWR，9503130)的分光光度计中(Molecular Devices，SpectraMaxM5)进行5小时，以10分钟间隔测定荧光强度，λEx＝476nm，λEm＝510。OCFS反应混合物与抑制剂立即加入微量板中，25μL终反应体积，包含30％S30提取物，24ug/mL pheT7 RNA聚合酶，1mM L-酪氨酸(Sigma，T8566)，预混合*，10-60μM pN3F-tRNA CUA或未装phe 载的tRNA CUA和3nM turboGFP质粒，配制于DEPC处理过的水(G Biosciences，786-109)。 使用不含终止密码子的turboGFP的阳性对照反应被用于确保反应进行的速率与之前观察的相似，而包含turboGFP Y50TAG的反应也在无tRNA下进行以确保无荧光被检测到(阴性对照)。抑制效率的计算通过比较阳性对照荧光与包含琥珀密码子的模板荧光。 [0271] 如图2所示，SBJY001无细胞提取物(表达OmpT1和野生型RF-1)中IgG重链TAG变体的表达导致可溶全长IgG相对差的产率。相比之下，SBHS016无细胞提取物(表达OmpT1和含三取代N296K/L297R/L298R的修饰的RF-1蛋白(变体A18))中IgG重链TAG变体的表达导致全长IgG相对高的产率。此外，如图3所示，SBJY001无细胞提取物中IgG重链TAG变体的表达导致相对差的琥珀抑制(即，重链蛋白被截短)。相比之下，SBHS016无细胞提取物中IgG重链TAG变体的表达导致相对高的琥珀抑制(即，很少的重链蛋白被截短)，这对应于图2中观察到的全长IgG明显更高的产率。 [0272] 该实施例证实，相比于不能被OmpT1切割的完整RF1，OmpT1对RF1的切割提供显著升高的在编码序列的琥珀密码子处并入所需nnAA的重链的产率。 [0273] 应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅为说明的目的，在其基础上可进行的多种改动或变化可被本领域的技术人员理解，并且意图将这些将改动或变化包括在本申请的精神和实质以及所附权利要求的范围内。通过引用的方式将本文引用的所有出版物、序列登录号、专利和专利申请整体并入本文，用于所有目的。 [0275] SEQ ID NO:1 [0276] 大肠杆菌释放因子1(RF1) [0277] MKPSIVAKLEALHERHEEVQALLGDAQTIADQERFRALSREYAQLSDVSRCFTDWQQVQEDIETAQMMLDDPEMREMAQDELREAKEKSEQLEQQLQVLLLPKDPDDERNAFLEVRAGTGGDEAALFAGDLFRMYSRYAEARRWRVEIMSASEGEHGGYKEIIAKISGDGVYGRLKFESGGHRVQRVPATESQGRIHTSACTVAVMPELPDAELPDINPADLRIDTFRSSGAGGQHVNTTDSAIRITHLPTGIVVECQDERSQHKNKAKALSVLGARIHAAEMAKRQQAEASTRRNLLGSGDRSDRNRTYNFPQGRVTDHRINLTLYRLDEVMEGKLDMLIEPIIQEHQADQLAALSEQE [0278] SEQ ID NO:2 [0279] 大肠杆菌释放因子2(RF2) [0280] MFEINPVNNRIQDLTERSDVLRGYLDYDAKKERLEEVNAELEQPDVWNEPERAQALGKERSSLEAVVDTLDQMKQGLEDVSGLLELAVEADDEETFNEAVAELDALEEKLAQLEFRRMFSGEYDSADCYLDIQAGSGGTEAQDWASMLERMYLRWAESRGFKTEIIEESEGEVAGIKSVTIKISGDYAYGWLRTETGVHRLVRKSPFDSGGRRHTSFSSAFVYPEVDDDIDIEINPADLRIDVYRTSGAGGQHVNRTESAVRITHIPTGIVTQCQNDRSQHKNKDQAMKQMKAKLYELEMQKKNAEKQAMEDNKSDIGWGSQIRSYVLDDSRIKDLRTGVETRNTQAVLDGSLDQFIEASLKAGL [0281] SEQ ID NO:3 [0282] 大肠杆菌外膜蛋白T1(OmpT)(下划线为信号肽) [0283] MRAKLLGIVLTTPIAISSFASTETLSFTPDNINADISLGTLSGKTKERVYLAEEGGRKVSQLDWKFNNAAIIKGAINWDLMPQISIGAAGWTTLGSRGGNMVDQDWMDSSNPGTWTDESRHPDTQLNYANEFDLNIKGWLLNEPNYRLGLMAGYQESRYSFTARGGSYIYSSEEGFRDDIGSFPNGERAIGYKQRFKMPYIGLTGSYRYEDFELGGTFKYSGWVESSDNDEHYDPGKRITYRSKVKDQNYYSVAVNAGYYVTPNAKVYVEGAWNRVTNKKGNTSLYDHNNNTSDYSKNGAGIENYNFITTAGLKYTF [0284] SEQ ID NO:4 [0285] 释放因子1(RF1)的转换环区，氨基酸287至304 [0286] QQAEASTRRNLLGSGDRS [0287] SEQ ID NO:5 [0288] 释放因子1(RF1)的转换环区中的N296K突变，氨基酸287至304 [0289] QQAEASTRRKLLGSGDRS [0290] SEQ ID NO:6 [0291] 释放因子1(RF1)的转换环区中的N296R突变，氨基酸287至304 [0292] QQAEASTRRRLLGSGDRS [0293] SEQ ID NO:7 [0294] 释放因子1(RF1)的转换环区中的L297K突变，氨基酸287至304 [0295] QQAEASTRRNKLGSGDRS [0296] SEQ ID NO:8 [0297] 释放因子1(RF1)的转换环区中的L297R突变，氨基酸287至304 [0298] QQAEASTRRNRLGSGDRS [0299] SEQ ID NO:9 [0300] 释放因子1(RF1)的转换环区中的L297V突变，氨基酸287至304 [0301] QQAEASTRRNVLGSGDRS [0302] SEQ ID NO:10 [0303] 释放因子1(RF1)的转换环区中的L298K突变，氨基酸287至304 [0304] QQAEASTRRNLKGSGDRS [0305] SEQ ID NO:11 [0306] 释放因子1(RF1)的转换环区中的L298R突变，氨基酸287至304 [0307] QQAEASTRRNLRGSGDRS [0308] SEQ ID NO:12 [0309] 释放因子1(RF1)的转换环区中的N296K、L297K突变，氨基酸287至304 [0310] QQAEASTRRKKLGSGDRS [0311] SEQ ID NO:13 [0312] 释放因子1(RF1)的转换环区中的N296K，L297R＝A13突变，氨基酸287至304[0313] QQAEASTRRKRLGSGDRS [0314] SEQ ID NO:14 [0315] 释放因子1(RF1)的转换环区中的N296K，L297V突变，氨基酸287至304 [0316] QQAEASTRRKVLGSGDRS [0317] SEQ ID NO:15 [0318] 释放因子1(RF1)的转换环区中的N296K，L297V突变，氨基酸287至304 [0319] QQAEASTRRRKLGSGDRS [0320] SEQ ID NO:16 [0321] 释放因子1(RF1)的转换环区中的N296R，L297R突变，氨基酸287至304 [0322] QQAEASTRRRRLGSGDRS [0323] SEQ ID NO:17 [0324] 释放因子1(RF1)的转换环区中的N296R，L297V突变，氨基酸287至304 [0325] QQAEASTRRRVLGSGDRS [0326] SEQ ID NO:18 [0327] 释放因子1(RF1)的转换环区中的N296K，L297K，L298K突变，氨基酸287至304[0328] QQAEASTRRKKKGSGDRS [0329] SEQ ID NO:19 [0330] 释放因子1(RF1)的转换环区中的N296K，L297K，L298R突变，氨基酸287至304[0331] QQAEASTRRKKRGSGDRS [0332] SEQ ID NO:20 [0333] 释放因子1(RF1)的转换环区中的N296K，L297R，L298K＝A17突变，氨基酸287至304 [0334] QQAEASTRRKRKGSGDRS [0335] SEQ ID NO:21 [0336] 释放因子1(RF1)的转换环区中的N296K，L297R，L298R＝A18突变。氨基酸287至304 [0337] QQAEASTRRKRRGSGDRS [0338] SEQ ID NO:22 [0339] 释放因子1(RF1)的转换环区中的N296R，L297R，L298R突变，氨基酸287至304[0340] QQAEASTRRRRRGSGDRS [0341] SEQ ID NO:23 [0342] 释放因子1(RF1)的转换环区中的N296R，L297K，L298R突变，氨基酸287至304[0343] QQAEASTRRRKRGSGDRS [0344] SEQ ID NO:24 [0345] 释放因子1(RF1)的转换环区N296R，L297R，L298K突变，氨基酸287至304 [0346] QQAEASTRRRRKGSGDRS [0347] SEQ ID NO:25 [0348] 释放因子1(RF1)的转换环区中的N296R，L297K，L298K突变，氨基酸287至304[0349] QQAEASTRRRKKGSGDRS [0350] SEQ ID NO:26 [0351] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0352] QARRGSTRRNLLGSGDRS [0353] SEQ ID NO:27 [0354] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0355] QQARRGTRRNLLGSGDRS [0356] SEQ ID NO:28 [0357] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0358] QQAARRGRRNLLGSGDRS [0359] SEQ ID NO:29 [0360] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0361] QQAEARRGRNLLGSGDRS [0362] SEQ ID NO:30 [0363] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0364] QQAEAARRGNLLGSGDRS [0365] SEQ ID NO:31 [0366] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0367] QQAEASARRGLLGSGDRS [0368] SEQ ID NO:32 [0369] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0370] QQAEASTARRGLGSGDRS [0371] SEQ ID NO:33 [0372] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0373] QQAEASTRARRGGSGDRS [0374] SEQ ID NO:34 [0375] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0376] QQAEASTRRARRGSGDRS [0377] SEQ ID NO:35 [0378] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0379] QQAEASTRRNARRGGDRS [0380] SEQ ID NO:36 [0381] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0382] QQAEASTRRNLARRGDRS [0383] SEQ ID NO:37 [0384] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0385] QQAEASTRRNLLARRGRS [0386] SEQ ID NO:38 [0387] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0388] QQAEASTRRNLLGARRGS [0389] SEQ ID NO:39 [0390] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0391] QQAEASTRRNLLGSARRG [0392] SEQ ID NO:40 [0393] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0394] QQAEASTRRNLLGSGARR [0395] SEQ ID NO:41 [0396] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0397] QQAWLAARRGRGGSGDRS [0398] SEQ ID NO:42 [0399] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0400] QQAEWLAARRGRGSGDRS [0401] SEQ ID NO:43 [0402] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0403] QQAEAWLAARRGRGGDRS [0404] SEQ ID NO:44 [0405] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0406] QQWGGRWARKKGTIGDRS [0407] SEQ ID NO:45 [0408] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0409] QQAWGGRWARKKGTIDRS [0410] SEQ ID NO:46 [0411] 插入释放因子1(RF1)的转换环的OmpT切割肽序列，氨基酸287至304 [0412] QQAEWGGRWARKKGTIRS [0413] SEQ ID NO:47 [0414] OmpT切割肽 [0415] ARRG [0416] SEQ ID NO:48 [0417] OmpT切割肽 [0418] WLAARRGRG [0419] SEQ ID NO:49 [0420] OmpT切割肽 [0421] WGGRWARKKGTI [0422] SEQ ID NO:50 [0423] 简式λ噬菌体Gam蛋白(GamS)的C-端序列 [0424] GGSHHHHHH [0425] SEQ ID NO:51 [0426] 简式λ噬菌体Gam蛋白(GamS)基因扩增引物 [0427] ATATATCATATGAACGCTTATTACATTCAGGATCGTCTTGAG [0428] SEQ ID NO:52 [0429] 简式λ噬菌体Gam蛋白(GamS)基因扩增引物 [0430] ATATATGTCGACTTAATGATGATGATGATGATGAGAACCCCCTACCTCTGAATCAATATCAACCTGGTGGTG [0431] SEQ ID NO:53 [0432] 5’-片段包括T7启动子，N端序列恒定区和突变位点，第一步PCR扩增引物5chiT2PT7 [0433] GCGTACTAGCGTACCACGTGGCTGGTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGG [0434] SEQ ID NO:54 [0435] 3’-片段包括突变位点，C-端恒定区和T7终止子序列，第一步PCR扩增引物3chiT2TT7 [0436] GCGTACTAGCGTACCACGTGGCTGGTGGCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGC [0437] SEQ ID NO:55 [0438] 单引物5chiT2，用于通过重叠PCR组装5’-片段和3’-片段 [0439] GCGTACTAGCGTACCACGTGGCTGGTGG [0440] SEQ ID NO:56 [0441] WT RF1变体OmpT切割位点筛选正向引物 [0442] GCTCGATGATCCTGAAATGCGTGAGATGGCGCAGG [0443] SEQ ID NO:57 [0444] M74R RF1变体OmpT切割位点筛选正向引物 [0445] GCTCGATGATCCTGAACGCCGTGAGATGGCGCAGG [0446] SEQ ID NO:58 [0447] E76K RF1变体OmpT切割位点筛选正向引物 [0448] CGATGATCCTGAAATGCGTAAGATGGCGCAGGATGAAC [0449] SEQ ID NO:59 [0450] E84K RF1变体OmpT切割位点筛选正向引物 [0451] CAGGATGAACTGCGCAAAGCTAAAGAAAAAAGCGAGCAAC [0452] SEQ ID NO:60 [0453] A85R RF1变体OmpT切割位点筛选正向引物 [0454] CAGGATGAACTGCGCGAACGTAAAGAAAAAAGCGAGCAAC [0455] SEQ ID NO:61 [0456] E87R RF1变体OmpT切割位点筛选正向引物 [0457] GGATGAACTGCGCGAAGCTAAACGTAAAAGCGAGCAACTGGAAC [0458] SEQ ID NO:62 [0459] E108R RF1变体OmpT切割位点筛选正向引物 [0460] GCCAAAAGATCCTGATGACCGTCGTAACGCCTTCCTCG [0461] SEQ ID NO:63 [0462] T293R RF1变体OmpT切割位点筛选正向引物 [0463] CAACAGGCCGAAGCGTCTCGCCGTCGTAACCTGC [0464] SEQ ID NO:64 [0465] N296K RF1变体OmpT切割位点筛选正向引物 [0466] GCGTCTACCCGTCGTAAACTGCTGGGGAGTGGCG [0467] SEQ ID NO:65 [0468] S304K RF1变体OmpT切割位点筛选正向引物 [0469] GGGAGTGGCGATCGCAAGGACCGTAACCGTACTTAC [0470] SEQ ID NO:66 [0471] N296K/L297V RF1变体OmpT切割位点筛选正向引物 [0472] CGAAGCGTCTACCCGTCGTAAAGTTCTGGGGAGTGGCGATCGCAGC [0473] SEQ ID NO:67 [0474] N296K/L297K RF1变体OmpT切割位点筛选正向引物 [0475] CGAAGCGTCTACCCGTCGTAAAAAGCTGGGGAGTGGCGATCGCAGC [0476] SEQ ID NO:68 [0477] N296K/L297R RF1变体OmpT切割位点筛选正向引物 [0478] CGAAGCGTCTACCCGTCGTAAACGTCTGGGGAGTGGCGATCGCAGC [0479] SEQ ID NO:69 [0480] N296R/L297V RF1变体OmpT切割位点筛选正向引物 [0481] CGAAGCGTCTACCCGTCGTCGCGTTCTGGGGAGTGGCGATCGCAGC [0482] SEQ ID NO:70 [0483] N296R/L297K RF1变体OmpT切割位点筛选正向引物 [0484] CGAAGCGTCTACCCGTCGTCGCAAGCTGGGGAGTGGCGATCGCAGC [0485] SEQ ID NO:71 [0486] N296R/L297R RF1变体OmpT切割位点筛选正向引物 [0487] CGAAGCGTCTACCCGTCGTCGCCGTCTGGGGAGTGGCGATCGCAGC [0488] SEQ ID NO:72 [0489] N296K/L297R/L298K RF1变体OmpT切割位点筛选正向引物 [0490] CAGGCCGAAGCGTCTACCCGTCGTAAACGTAAGGGGAGTGGCGATCGCAGCGACC 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