[0001] 对序列表的引用

[0002] 本申请包含计算机可读形式的序列表，将该序列表通过引用结合在此。

[0003] 发明背景发明领域

[0004] 本发明涉及具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸的用途。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞连同产生这些多肽的方法。本发明
具体涉及具有蛋白酶活性的多肽在食品应用和洗涤剂中的用途。

[0005] 相关技术说明

[0006] 酶已经在清洁组合物中使用了数十年，如用于各种目的的洗涤剂，如在家庭护理和工业清洗中的衣物洗涤和餐具洗涤。使用不同酶的混合物，每种酶都表现出其对构成来
自各种污渍的污物的特定物质的比活性。蛋白酶是降解蛋白质的酶，并且可以用于清洗过
程如餐具洗涤和衣物洗涤以去除蛋白质污渍。最常用的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，特别是枯
草杆菌酶。这个家族先前已经进一步由西埃泽恩(Siezen)RJ和洛因伊森(Leunissen)JAM，
1997，蛋白质科学(Protein Science)，6，501-523被分组为6个不同亚组。这些亚组之一是枯草杆菌蛋白酶家族，该家族包括枯草杆菌酶，如 (诺维信公司
(Novozymes A/S))和 (汉高公司(Henkel AG))。这些年来，枯草杆菌蛋白酶和其他蛋
白酶已经被基因工程化以提高其性能。典型地，将这些蛋白酶设计为满足不同目的，如增加其洗涤性能，例如，在低温条件下，和/或增加其去除某些污渍的能力。商业上已知的基因工程蛋白质包括
(诺维信公司)、
和 (丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))。尽管存在针对各种目的
所设计的许多优化的蛋白酶，但是污物和污渍的组成非常复杂，并且洗涤条件和洗涤剂组
合物改变以满足不同使用者需要。所有这些因素使得获得在清洗和洗涤剂中使用的不同类
型的蛋白酶是有利的。

[0007] 发明概述

[0008] 本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的芽孢杆菌属多肽，这些多肽选自由以下各项组成的组：

[0009] (a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少97％序列一致性的多肽；

[0010] (b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少97％序列一致性；

[0011] (c)SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入；和

[0012] (d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。

[0013] 本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体；重组表达载体；重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。

[0014] 本发明还涉及本发明蛋白酶在洗涤剂、清洁和洗涤剂组合物以及洗涤剂组合物中的用途，进行清洁和污渍去除过程的方法。

[0015] 本发明还涉及编码包括SEQ ID NO:2的氨基酸-108至-82或由其组成的信号肽的多核苷酸、编码包括SEQ ID NO:2的氨基酸-81至-1或由其组成的前肽的多核苷酸、或编码
包括SEQ ID NO:2的氨基酸-108至-1或由其组成的信号肽和前肽的多核苷酸，其每一者被
可操作地连接至编码蛋白质的基因；包括这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体、以及重组宿主细胞；以及产生蛋白质的方法。

[0016] 序列表综述

[0017] SEQ ID NO:1是霍耐克芽孢杆菌(Bacillus horneckiae)蛋白酶的DNA序列

[0018] SEQ ID NO:2是如从SEQ ID NO:1推导的氨基酸序列

[0019] SEQ ID NO:3是成熟霍耐克芽孢杆菌蛋白酶的氨基酸序列

[0020] SEQ ID NO:4正向引物

[0021] SEQ ID NO:5反向引物

[0022] SEQ ID NO:6是TY-145蛋白酶(WO 2004/067737，SEQ ID NO:1)的氨基酸序列

[0023] SEQ ID NO:7是迟缓芽孢杆菌的氨基酸序列

[0024] SEQ ID NO:8是疏棉状嗜热丝孢菌(Termomyces lanuginosus)的氨基酸序列

[0025] SEQ ID NO:9是芽孢杆菌属的氨基酸序列

[0026] SEQ ID NO:10是盐敏芽孢杆菌(Bacillus halmapalus)的氨基酸序列

[0027] SEQ ID NO:11是芽孢杆菌属的氨基酸序列

[0028] SEQ ID NO:12是嗜纤维菌属的氨基酸序列

[0029] SEQ ID NO:13是芽孢杆菌属的氨基酸序列

[0030] SEQ ID NO:14是芽孢杆菌属的氨基酸序列

[0031] SEQ ID NO:15是芽孢杆菌属的氨基酸序列

[0032] SEQ ID NO:16是克劳氏芽孢杆菌分泌信号的氨基酸序列

[0033] SEQ ID NO:17是SEQ ID NO:2的同系物的氨基酸序列

[0034] SEQ ID NO:18是SEQ ID NO:2的同系物的氨基酸序列

[0035] SEQ ID NO:19是SEQ ID NO:2的同系物的氨基酸序列

[0036] 定义

[0037] 具有蛋白酶活性的多肽

[0038] 具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有时还被指定为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是在其任一端开始水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用的内
切型蛋白酶(内肽酶)。内肽酶对N-和C-末端被封闭的肽底物显示出活性，这些底物与所讨
论的蛋白酶的特异性有关。

[0039] 术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。它包括属于EC 3.4酶组的任何酶(包括其13个亚类中的每一种)。EC编号参考加利福尼亚州(California)的圣迭戈(San Diego)
的NC-IUBMB学术出版社(Academic Press)的1992年酶命名法，分别包括出版于欧洲生物化
学期刊(Eur.J.Biochem.)1994，223，1-5、欧洲生物化学期刊1995，232，1-6、欧洲生物化学期刊1996，237，1-5、欧洲生物化学期刊1997，250，1-6、以及欧洲生物化学期刊1999，264，
610-650的增刊1-5。术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森(Siezen)等人，蛋白质工程学
(Protein Engng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学(Protein Science)6(1997)
501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶是特征为在活性位点具有与底
物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚组。另外，枯草杆菌酶(以及丝氨酸蛋白酶)
的特征为除了丝氨酸以外，还具有两个活性位点氨基酸残基，即组氨酸和天冬氨酸残基。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。术语“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(EC 3.4)。本发明的蛋白酶是内肽酶(EC 3.4.21)。存在若干蛋白酶活性类
型：三种主要的活性类型是：胰蛋白酶样，其中在Arg或Lys后在P1处存在酰胺底物的切割；
糜蛋白酶样，其中切割发生在P1处，在疏水性氨基酸中的一个之后；以及弹性蛋白酶样，其中切割在P1处Ala之后。出于本发明的目的，根据以下实例中所描述的程序确定蛋白酶活
性。

[0040] 术语“蛋白酶活性”意指通过水解多肽链中的将氨基酸连接在一起的肽键，催化酰胺键或蛋白的水解的蛋白水解活性(EC 3.4.21.)。用于测定蛋白酶活性的若干测定在本领域是可获得的。出于本发明的目的，如在本申请的实例中所述的，可以使用Suc-AAPF-pNA测定来测定蛋白酶活性。本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的蛋白酶活性。

[0041] 如在此使用的术语“分离的多肽”是指从来源分离的多肽。在一方面，该多肽是至少20％纯的，更优选至少40％纯的，更优选至少60％纯的，甚至更优选至少80％纯的，最优选至少90％纯的并且甚至最优选至少95％纯的，如通过SDS-PAGE所确定。如在此使用的术语“纯的”是指样品、组合物等中的多肽纯度。因此，如至少95％纯的意指，不超过5％的样品、组合物等由杂质组成。确定分离的多肽的纯度在本领域技术人员的知识范围内。

[0042] 术语“基本上纯的多肽”在此指包含按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多
1％，并且甚至最优选至多0.5％的该多肽与其天然地或重组地相关的其他多肽材料的多肽
制剂。因此，优选的是该基本上纯的多肽按存在于该制剂中的所有多肽材料的重量计是至
少92％纯的，优选至少94％纯的，更优选至少95％纯的，更优选至少96％纯的，更优选至少
97％纯的，更优选至少98％纯的，甚至更优选至少99％纯的，最优选至少99.5％纯的，并且甚至最优选100％纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。例如，这可以通过采用熟知的重组方法或采用经典的纯化方法制备多肽来完成。

[0043] 术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，成熟多肽是具有SEQ ID NO:3的多肽。在另一方面，成熟多肽是由SEQ ID NO:1的氨基酸825至1766或SEQ ID NO:2的氨基酸1至314编码的。

[0044] 两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列一致性”描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The 
European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends in Genetics)16:276-277；http://emboss.org)(优选3.0.0版或更新版本)的
尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼
(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的一致性程度。使用版本6.1.0。所使用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

[0045] (一致的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

[0046] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，见上文；http://emboss.org)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的一致性程度。使用版本6.1.0。所使用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致
性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

[0047] (一致的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

[0048] 术语“片段”意指使一个或多个(即，若干个)氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。

[0049] 术语“多肽的功能片段”或“其功能片段”用来描述衍生自更长的多肽(例如，成熟多肽)的多肽，以及已经在N-末端区或C-末端区或两个区域中截短以产生亲本多肽的片段的多肽。为了成为功能多肽，该片段必须保持全长/成熟多肽的至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少100％的蛋白酶活性。

[0050] 术语“子序列”意指使一个或多个(若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸，其中该子序列编码具有蛋白酶活性的片段。

[0051] 术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位
基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

[0052] 术语“变体”意指在一个或多个(若干个)位置包含改变(即，一个或多个(即，若干个)氨基酸残基取代、插入和/或缺失)的具有蛋白酶活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸置换占据一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据一个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。

[0053] 在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。采用已接受的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

[0054] 如在此使用的术语“取代”是指氨基酸取代，其中使用以下命名法：初始氨基酸，位置，取代氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取
代。

[0055] 如在此使用的术语“缺失”是指氨基酸缺失，其中使用以下命名法：初始氨基酸，位* *置，*。因此，在位置195处的甘氨酸缺失表示为“Gly195”或者“G195”。多重缺失通过加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。

[0056] 如在此使用的术语“插入”是指氨基酸插入，其中使用以下命名法：初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入氨基酸#1、插入氨基酸#2；等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Glyl95GlyLysAla”或“G195GKA”。

[0057] 在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，
该序列因此将是：

[0058]亲本： 变体：
195 195 195a 195b
G G-K-A

[0059] 如果存在多个改变，那么包括此类多个改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。

[0060] 术语“清洁组合物”和“清洁配制品”是指用于从有待清洁的物品上除去不希望的化合物的组合物，这些物品是例如织物、地毯、餐具(包括玻璃器皿)、接触镜、硬表面(例如瓷砖、锌(zinc)、地板和桌面)、头发(香波)、皮肤(肥皂和面霜)、牙齿(漱口剂、牙膏)等。这些术语涵盖针对具体类型的所希望的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、颗粒、粉末或喷雾组合物)所选的任何材料/化合物，只要该组合物与蛋白酶以及该组合物中使用的其他一种或多种酶可相容即可。通过考虑有待清洁的表面、物品或织物，以及针对使用过程中的清洁条件的组合物的所希望的形式而容易地具体选择清洁组合物材料。这些术语进一
步是指适于清洁、漂白、消毒、和/或灭菌任何物品和/或表面的任何组合物。其意图是，这些术语包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬
表面清洁配制品，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面以及窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；
织物清新剂；织物柔软剂；和纺织品和衣物预去污剂，以及餐具洗涤剂)。

[0061] 除非另有说明，术语“洗涤剂组合物”包括颗粒状或粉状的全效或重垢清洗剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状的全效清洗剂，尤其是所谓的重垢液(HDL)类型；液体细薄织物洗涤剂；手洗餐具清洗剂或轻垢餐具清洗剂，尤其是高泡沫型的那些；机洗餐具洗涤剂，包括用于居家及机构使用的多种片型、颗粒型、液体型以及冲洗助剂型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌洗手液类型、清洁棒、漱口液、义齿清洁剂、汽车或地毯清洁剂、浴室清洁剂；洗发香波和护发素；沐浴露(shower gel)、沐浴露(foam bath)；金属清洗剂；以及清洁助剂，如漂白剂添加剂和“去污棒”或预处理类型。

[0062] 除非另有说明，术语“洗涤剂组合物”包括颗粒状或粉状的全效或重垢清洗剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状的全效清洗剂，尤其是所谓的重垢液(HDL)类型；液体细薄织物洗涤剂；手洗餐具清洗剂或轻垢餐具清洗剂，尤其是高泡沫型的那些；机洗餐具洗涤剂，包括用于居家及机构使用的多种片型、颗粒型、液体型以及冲洗助剂型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌洗手液类型、清洁棒、皂条、漱口液、义齿清洁剂、汽车或地毯清洁剂、浴室清洁剂；洗发香波和护发素；沐浴露(shower gel)、沐浴露(foam bath)；金属清洗剂；以及清洁助剂，如漂白剂添加剂和“去污棒”或预处理类型。就预期用于脏物体清洁的洗涤介质中的混合物而言，使用术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配制品”。在一些实施例中，就洗涤织物和/或衣服而言，使用该术语(例如，“衣物洗涤剂”)。在替代性实施例中，该术语是指例如用于清洁餐具、刀具等等的那些的其他洗涤剂(例如“餐具清洗洗涤剂”)。它并不意图使本发明限于任何特定的洗涤剂配制品或组合物。术语“洗涤剂组合物”不旨在限于包含表面活性剂的组合物。其意图是，除了根据本发明的蛋白酶以外，该术语涵盖了可能包含以下各项的洗涤剂：例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、以及增溶剂。

[0063] 术语“织物”涵盖任何纺织材料。因此，其意图是，该术语涵盖衣服，连同织物、纱线、纤维、非织造材料、天然材料、合成材料以及任何其他纺织材料。

[0064] 术语“纺织品”是指织造织物，连同适于转化为或用作纱线、织造、针织以及非织造织物的短纤维和长丝。该术语涵盖制自天然以及合成(例如，制造的)纤维的纱线。术语“纺织材料”是纤维、纱线中间体、纱线、织物以及制自纤维的产品(例如，衣服以及其他物品)的通用术语。

[0065] 术语“非织物洗涤剂组合物”包括非纺织品表面洗涤剂组合物，包括但不限于用于硬表面清洁的组合物，例如餐具洗涤洗涤剂组合物、口服洗涤剂组合物、义齿洗涤剂组合物以及个人清洁组合物。

[0066] 术语“酶的有效量”是指在特定应用中，例如在定义的洗涤剂组合物中达到所需的酶活性所必需的酶量。此类有效量可以由本领域的普通技术人员容易地确定并且基于多种因素，如使用的具体酶、清洁应用、洗涤剂组合物的特定组成以及是否需要液体或干燥(例如，颗粒状、棒状)组合物等。术语蛋白酶的“有效量”是指例如在定义的洗涤剂组合物中达到希望水平的酶活性的在上文描述的蛋白酶量。

[0067] 如在此使用的术语“水硬度”或“硬度(degree of hardness)”或“dH”或“°dH”是指德国硬度(degree of hardness)。一度被定义为10毫克氧化钙/升水。

[0068] 在此使用术语“相关洗涤条件”指示在洗涤剂细分市场中实际用于家用的条件，具体是洗涤温度、时间、洗涤力学、洗涤剂浓度、洗涤剂类型以及水硬度。

[0069] 术语“辅料”意指针对希望的具体类型的洗涤剂组合物和产品形式(例如，液体、颗粒、粉末、棒状、糊状、喷雾、片、凝胶或泡沫组合物)选择的任何液体、固体或气体材料，这些材料也优选地与用于该组合物中的蛋白酶可相容。在一些实施例中，颗粒状组合物处于“压缩”形式，而在其他实施例中，液体组合物处于“浓缩”形式。

[0070] 如在此使用的术语“去污酶(stain removing enzyme)”描述帮助从织物或硬表面除去污物或污垢的酶。去污酶对特定底物起作用，例如蛋白酶对蛋白质起作用、淀粉酶对淀粉起作用、脂肪酶和角质酶对脂质(脂肪和油)起作用、果胶酶对果胶起作用并且半纤维素
酶对半纤维素起作用。污物通常是具有不同组分的复杂混合物的沉积物，这导致材料自身
局部变色或这在物体上留下粘性表面，该粘性表面可以吸引溶解于洗涤液中的污物从而导
致玷污的区域变色。当酶对存在于污物中的其特定底物起作用时，该酶降解或部分降解其
底物，从而帮助在洗涤过程中除去与底物相关的污垢和污物组分。例如，当蛋白酶对草渍起作用时，它降解草中的蛋白组分并且允许在洗涤过程中释放绿色/棕色。

[0071] 在此背景下，术语“减少的量”意指在其他方面相同的条件下，该组分的量小于将用于参比过程中的量。在一个优选实施例中，该量被减少例如至少5％，如至少10％、至少15％、至少20％或如另外在此所述的。

[0072] 术语“低洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。亚洲(例如，日本)洗涤剂典型地被认为是低洗涤剂浓度体系。

[0073] 术语“中洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在约800ppm与约2000ppm之间的洗涤剂组分。北美洲洗涤剂通常被认为是中洗涤剂浓度体系。

[0074] 术语“高洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在大于约2000ppm的洗涤剂组分。欧洲洗涤剂通常被认为是高洗涤剂浓度体系。

[0075] 发明详述

[0076] 在一方面，本发明涉及具有蛋白酶活性的分离多肽，该分离多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少97％序列一致性的多肽；(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少97％序列一致性；(c)SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入；和(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。

[0077] 在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。在一方面，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不超过20个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18或19个。因此，在一个实施例中，该分离多肽在与SEQ ID NO:2的位置S173和S175相应的一个或多个位置处具有取代。在一个具体的实施例中，在与SEQ ID NO:2的位置S173相应的位置处的取代是S173P或S173Y。这种变体在此已经呈现为具有SEQ ID NO:17
或18的氨基酸序列的同系物。在另一个具体的实施例中，该多肽在与SEQ ID NO:2的位置
S173和S175相应的位置处包括两个取代，其中这些取代为S173P+S175P。这种变体在此已经呈现为具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的同系物。

[0078] 在另一个实施例中，向SEQ ID NO:2的成熟多肽中引入的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目不超过40个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、或39个。

[0079] 本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有蛋白酶活性的片段。在另一方面，该多肽包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至314或由其组成。

[0080] 在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:3具有至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的具有蛋白酶活性的多肽。在一方面，该多肽与具有SEQ ID NO:3的成熟多肽相差不超过20个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18或19个。在另一个实施例中，向SEQ ID NO:3的成熟多肽中引入的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目不超过40个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、或39个。

[0081] 在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:17的成熟多肽具有至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。在一方面，该多肽与SEQ ID NO:17的成熟多肽相差不超过20个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18或19个。在另一个实施例中，向SEQ ID NO:17的成熟多肽中引入的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目不超过40个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、或39个。

[0082] 本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有蛋白酶活性的片段。在另一方面，该多肽包括SEQ ID NO:17的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包括SEQ ID NO:17的氨基酸1至314或由其组成。

[0083] 在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。在一方面，该多肽与SEQ ID NO:18的成熟多肽相差不超过20个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18或19个。在另一个实施例中，向SEQ ID NO:18的成熟多肽中引入的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目不超过40个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、或39个。

[0084] 本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有蛋白酶活性的片段。在另一方面，该多肽包括SEQ ID NO:18的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包括SEQ ID NO:18的氨基酸1至314或由其组成。

[0085] 在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:19的成熟多肽具有至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的具有蛋白酶活性的分离的多肽。在一方面，该多肽与SEQ ID NO:19的成熟多肽相差不超过20个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18或19个。在另一个实施例中，向SEQ ID NO:19的成熟多肽中引入的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目不超过40个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、或39个。

[0086] 本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有蛋白酶活性的片段。在另一方面，该多肽包括SEQ ID NO:19的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包括SEQ ID NO:19的氨基酸1至314或由其组成。

[0087] 在另一个实施例中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有蛋白酶活性的分离的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，或其全长互补体杂交(萨姆布
鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆实验指南(Molecular Cloning,A Laboratory 
Manual)，第二版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。

[0088] SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段可根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的株系的、编码具有蛋白
酶活性的多肽的DNA。具体而言，可以根据标准DNA印迹程序，使用这类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴别和分离其中的对应基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷
酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸或至少900个
32 3 35
核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用 P、H、S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。

[0089] 可以筛选从此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖
或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并
固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的
克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。

[0090] 出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下项的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)其子序列；杂交是在非常低至非常高严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知
的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

[0091] 因此，在一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸501至1766、核苷酸600至1600、核苷酸700至1500、或核苷酸800至1200。在另一方面，核酸探针是编码以下项的多核苷酸：SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1。

[0092] 在一个实施例中，本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，该分离的多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少97％、至少
98％、至少99％、或100％的序列一致性。

[0093] 在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目不超过20个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、或19个。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小缺失，典型地为1-30个氨基酸；小的氨基末端的或羧基末端的延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；高达20-25个残基的小连接肽；或通过改变净电荷或另一功能有利于纯化的小的延伸，例如聚组氨酸段、抗原表位或结合域。

[0094] 保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu以及Asp/Gly。

[0095] 可替代地，氨基酸改变具有这样的性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。

[0096] 可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244：1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见
希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德沃斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴定必需氨基
酸。还可以从与相关多肽的比对推断鉴定必需氨基酸。对于本发明的多肽，包括氨基酸D38、H75和S254的催化三联体对于酶的蛋白酶活性是必需的。

[0097] 在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的催化活性。

[0098] 可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的
那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:
127)。

[0099] 可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:
893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

[0100] 该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。

[0101] 该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融
合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的
控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀
(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。

[0102] 融合多肽可以在两种多肽之间进一步包括切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于以下各项中披露的位点：
马丁(Martin)等人，2003，工业微生物学与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)
3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森(Rasmussen)-威尔逊(Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学
(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；华德(Ward)等人，1995，生物技术
(Biotechnology)13:498-503；以及孔特拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；
伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯(Collins)-莱斯
(Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白：结构、功能和遗传学(Proteins：Structure，Function，and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯
(Stevens)，2003，世界药物发现(DrugDiscovery World)4:35-48。

[0103] 具有蛋白酶活性的多肽的来源

[0104] 可以从任何属的微生物获得本发明的具有蛋白酶活性的多肽。出于本发明的目的，如在此结合给定的来源使用的术语“从…中获得”应意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，从给定来源获
得的多肽被分泌到细胞外。

[0105] 该多肽可以是细菌蛋白酶。例如，该多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属
(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)蛋白酶；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属
(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属
(Pseudomonas)、沙门菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)蛋白酶。

[0106] 在一个实施例中，该多肽是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌
(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus 
coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌
(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌
(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金杆菌
(Bacillus thuringiensis)蛋白酶。

[0107] 在一个实施例中，该多肽是芽孢杆菌属蛋白酶，在另一个实施例中，该蛋白酶是霍耐克芽孢杆菌。在一个具体实施例中，该多肽是具有SEQ ID NO:2的蛋白酶或SEQ ID NO:3的成熟多肽。

[0108] 这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von 
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau 
Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究
中心(NRRL)。

[0109] 可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本多肽。用于直接地从自然生活环境分离微生物和DNA的技术是本领域中熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样本的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得编码亲本多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码亲本多肽的多核苷酸，就可以通过
使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如，萨姆布鲁克
(Sambrook)等人，1989，见上文)。

[0110] 多核苷酸

[0111] 本发明还涉及编码本发明的多肽或催化结构域的分离的多核苷酸，如在此所述。因此，在一方面，本发明涉及与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少97％序列一致性的多核苷酸。在一个实施例中，本发明的多核苷酸编码与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少
97％序列一致性的成熟多肽。

[0112] 用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA、或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例
如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guide to Methods and 
Application)，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以克隆自芽孢杆菌属的菌株或相关有机体，并且因此，例如可以是该多核苷酸多肽编码区的
等位基因变体或物种变体。

[0113] 编码本发明多肽的多核苷酸的修饰对于合成基本上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指该多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式
呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷
酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白质表达与纯化(Protein Expression and Purification)2:95-107。

[0114] 信号肽和前肽

[0115] 本发明还涉及编码信号肽的多核苷酸，该信号肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸-108至-82或由其组成。本发明还涉及编码前肽的多核苷酸，该前肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸-
81至-1或由其组成。本发明还涉及编码信号肽和前肽的多核苷酸，该信号肽和前肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸-108至-1或由其组成。所述多核苷酸可以进一步包括编码蛋白质的基因，所述蛋白质与信号肽和/或前肽可操作地连接。该蛋白质优选地对于该信号肽和/或前肽来
说是外源的。在一个实施例中，编码该信号肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1的核苷酸501至
581。在另一个实施例中，编码该前肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1的核苷酸582至824。在另一个实施例中，编码该信号肽和该前肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1的核苷酸501至824。

[0116] 本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体及重组宿主细胞。

[0117] 本发明还涉及产生蛋白质的方法，该方法包括：(a)对包括这种多核苷酸的重组宿主细胞进行培养；并且(b)回收该蛋白质。

[0118] 该蛋白对于宿主细胞而言可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在此不意图是指特定长度的编码产物，并且因此涵盖肽、寡肽及多肽。术语“蛋白质”还涵盖组合形成编码的产物的两个或更多个多肽。这些蛋白质还包括杂合多肽和融合多肽。

[0119] 优选地，该蛋白质是激素、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报告子。例如，该蛋白质可以是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。该基因可以从任何原核、真核或其他来源获得。

[0120] 核酸构建体

[0121] 本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合
适的宿主细胞中的表达。因此，在一个实施例中，核酸构建体包括与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少97％序列一致性的多核苷酸序列，并且其中该多核苷酸可操作地连接
至一个或多个控制序列上，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序
列在适合的宿主细胞中的表达。

[0122] 可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

[0123] 该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷酸进行表达的多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启
动子，并且可以由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

[0124] 用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基
因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学
(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡
(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteins 
from recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。

[0125] 用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(Fusarium venenatum Daria)(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900)、米黑毛霉(Rhizomucor miehei)
脂肪酶、米黑毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；
及其突变型启动子、截短型启动子和杂合型启动子。

[0126] 在酵母宿主中，有用的启动子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

[0127] 控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用
于本发明中。

[0128] 用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。

[0129] 丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

[0130] 用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有
用的终止子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文描述。

[0131] 该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区，它增加该基因的表达。

[0132] 适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal of 
Bacteriology)177:3465-3471)。

[0133] 该控制序列还可以是前导序列，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导序列可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中起
作用的任何前导序列。

[0134] 用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

[0135] 适用于酵母宿主细胞的前导序列从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

[0136] 控制序列还可以是聚腺苷酸化序列；可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用
在宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。

[0137] 用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

[0138] 对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中得以描述。

[0139] 控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含在翻译阅读框中与编
码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-端可以包含对于该编码序列而言是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码
序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿
主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

[0140] 用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论
(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。

[0141] 用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下各项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑毛霉天冬氨酸蛋白酶。

[0142] 对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文，描述了其他有用的信号肽编码序列。

[0143] 该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通
常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多
肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

[0144] 在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

[0145] 还可能希望地是添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，
包括调节化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还
原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将
与调节序列可操作地连接。

[0146] 表达载体

[0147] 本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。因此，在一个实施例中，重组表达载体包括与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少97％序列一致性的多核苷酸序列、启动子、以及转录和翻译停止信号。

[0148] 不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该多肽的
多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体
插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

[0149] 重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体
的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。

[0150] 该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入宿主细胞的基
因组中的总DNA)或转座子。

[0151] 该载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒
抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

[0152] 细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸
氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链
霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。

[0153] 载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

[0154] 对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该
载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中
的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整
合元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及
800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重
组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源
重组整合到宿主细胞的基因组中。

[0155] 对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术
语“复制起点(origin of replication)”或“质粒复制子(plasmid replicator)”意指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。

[0156] 细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

[0157] 用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。

[0158] 在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:
9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可以根据披露于WO 00/24883中的方法来完成。

[0159] 可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含与该多核苷
酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当
的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以
及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

[0160] 用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

[0161] 宿主细胞

[0162] 本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产
生。因此，在一个实施例中，该重组宿主细胞包括与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少97％序列一致性的多核苷酸序列，该多核苷酸序列连接至一个或多个控制序列上，该
一个或多个控制序列指导与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少97％序列一致性的多肽的产
生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作
为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大
程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

[0163] 该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

[0164] 原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

[0165] 细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金杆菌细胞。

[0166] 细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。

[0167] 细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。

[0168] 将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志
(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-
Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参
见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实
现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(Folia 
Microbiol.)(布拉格(Praha))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，
1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，
2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢
菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨
(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见，例如，佩里(Perry)和藏满
(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)
65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论
(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中
的任何方法。

[0169] 宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

[0170] 宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥
(Cambridge，UK)中进行定义的)。

[0171] 该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在将来可能有变化，出于本发明的目的，酵母应如酵母生物学和活动性(Biology and Activities of Yeast)(斯
金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会(Soc.App.Bacteriol.Symposium)系列第9期，1980)所述地进行定义。

[0172] 酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

[0173] 真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

[0174] 丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

[0175] 例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis 
gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis 
subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金
孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus 
hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

[0176] 可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和约
尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474
以及科里蒂森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描
述。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:
147-156和WO 96/00787描述。酵母可以使用以下各文献中所描述的程序转化：贝克尔
(Becker)和古伦特(Guarente)，在艾本尔森，J.N.(Abelson,J.N.)和塞蒙，M.I.(Simon,
M.I.)编辑，酵母遗传学与分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics and Molecular 
Biology)，酶学方法(Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；埃托(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:
163；及辛伦(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:
1920。

[0177] 生产方法

[0178] 本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且(b)回收该多肽。在一个优选实施例中，该细胞是芽孢杆菌属细胞。在一个更优选实施例中，该细胞是芽孢杆菌属细胞。在一个最优选实施例中，该细胞选自产生具有SEQ ID NO 2的多肽的霍耐克芽孢杆菌。

[0179] 因此，本发明的一方面涉及产生与SEQ ID NO:2具有至少97％一致性的多肽的方法，该方法包括：(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且(b)回收该多肽。

[0180] 本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；并且(b)回收该多肽。

[0181] 因此，本发明的一方面涉及产生如下多肽的方法，该多肽与SEQ ID NO:2具有至少97％一致性，该方法包括：

[0182] (a)在有益于产生该多肽的条件下培养宿主细胞；并且

[0183] (b)回收该多肽。

[0184] 宿主细胞可以是细菌宿主细胞，例如芽孢杆菌属、链球菌属或链霉菌属细胞。宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。宿主细胞可以是真菌细胞，该真菌细胞可以是酵母细胞。多种适合的宿主细胞描述于本申请的“宿主细胞”部分中。因此，在一个具体实施例中，该细胞是芽孢杆菌。

[0185] 细胞或宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许该多肽表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在适合的营养培养基中发生，该培养基包含碳源和氮源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得
或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌
到该营养培养基中，那么可直接从培养基中回收多肽。如果多肽不被分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。

[0186] 可以使用特异性针对这些多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。

[0187] 可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。

[0188] 可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登
(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。

[0189] 在一个替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。

[0190] 洗涤剂组合物

[0191] 在一方面，本发明针对洗涤剂组合物，这些洗涤剂组合物包括结合一种或多种另外的清洁组合物组分的本发明的蛋白酶。因此，在一个实施例中，本发明涉及包括具有蛋白酶活性的分离的多肽的洗涤剂组合物，该分离的多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少
97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。

[0192] 另外的组分的选择在普通技术人员技术内并且包括常规成分，包括以下列出的示例性、非限制性组分。对于织物护理，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的织物的类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通
技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性，并且包括常规成分，包括以下列出的示例性、非限制性组分。

[0193] 对于纺织品护理，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的纺织品的类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。

[0194] 该洗涤剂组合物可以适合于纺织品的洗涤或适合于硬表面清洁，包括餐具清洗(包括自动餐具清洗)。

[0195] 在本发明的一个实施例中，可以将本发明的蛋白酶以对应于以下的量添加至洗涤剂组合物中：每升的洗涤液0.001-200mg的蛋白，例如0.005-100mg的蛋白，优选0.01-50mg的蛋白，更优选0.05-20mg的蛋白，甚至更优选0.1-10mg的蛋白。

[0196] 可以使用常规稳定剂使本发明的洗涤剂组合物中的一种或多种酶稳定化，这些稳定剂例如是多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰苯基硼酸))，并且该组合物可以如(例如)WO 92/19709
和WO 92/19708中所述进行配制，或者可以使用如WO 2005/105826和WO 2009/118375所述
的肽醛或酮使根据本发明的蛋白酶稳定化。本发明的蛋白酶还可以掺入WO 97/07202中所
披露的洗涤剂配制品中，将该专利通过引用而特此结合。

[0197] 表面活性剂

[0198] 洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合
物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％的水平存在，例如约1％至
约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性
剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。

[0199] 当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％，例如从约5％至约30％(包括从约5％至约15％)、或从约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地说是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的
异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或
AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。

[0200] 当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基
三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)、及其组合。

[0201] 当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，例如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(APE)，壬基酚乙氧基化物
(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺
(FADA)，乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品及其组合。

[0202] 当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲基氧化胺、N-
(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链
烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。

[0203] 当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、以及磺基甜菜碱、及其组合。

[0204] 助水溶剂

[0205] 助水溶剂是如下化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性
剂已知的所谓两亲特性)；然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)的综述，2007，胶体&界面科学新见(Current Opinion in Colloid&Interface Science)，12:121-128。助水溶剂并不显示临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中
间相。很多助水溶剂反而示出连续型聚集过程，其中聚集体的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制
品(如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高
粘度。

[0206] 洗涤剂可以包含按重量计0-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性
实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。

[0207] 助洗剂和共助洗剂

[0208] 洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65％，例如约5％至约50％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂或其混合物。在洗涤餐具洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是
50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螯合剂。
可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂
的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐(如三磷酸钠(STP或STPP))、碳酸盐(如碳酸钠)、可溶性硅酸盐(如偏硅酸钠)、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司
(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺(如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚胺基二乙醇(DEA)和三乙醇胺
(TEA))、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。

[0209] 洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-65％，例如约5％至约50％的洗涤剂共助洗剂或其混合物。洗涤剂组合物可以只包括共助洗剂，或结合助洗剂，例如沸石助洗剂。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚
(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，例如氨基羧酸
盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟乙烷-1,1-二基双(膦酸)(HEDP)、乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸
(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-
ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸
(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、氨基乙磺
酸-N,N-二乙酸(TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸
(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦
酸)(ATMP)、及其组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 
5977053中

[0210] 漂白系统

[0211] 该洗涤剂可以包含按重量计0-10％，例如约1％至约5％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催
化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预成型过酸及其混合物。
适合的预成型过酸包括但不限于：过氧羧酸及盐，过碳酸及盐，过亚氨酸(perimidic acid)及盐，过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))，及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，这些系统可以包括例如与过酸形成漂白活化剂组合的无
机盐，包括碱金属盐，例如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。漂白活化剂在此意指与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形
成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。有待于在此使用的适合的漂白
活化剂包括属于酯酰胺类、酰亚胺类或酐类的那些，适合的实例是四乙酰乙二胺(TAED)、3,
5,5-三甲基己酰氧基苯磺酸钠、二过氧十二烷酸、4-(十二烷酰氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-
(癸酰氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(3,5,5-三甲基己酰氧基)苯磺酸
盐(ISONOBS)、四乙酰乙二胺(TAED)和4-(壬酰氧基)苯磺酸盐(NOBS)和/或WO 98/17767中
披露的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别
优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像特雷森(Triacin))具有以下
优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗衣添加剂提供良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸，如6-(邻苯二甲酰基氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有下式的有机催化剂：

[0212]

[0213] (iii)及其混合物；其中每个R1独立地是包含从9至24个碳的支链烷基基团或包含从11至24个碳的直链烷基基团，优选地，每个R1独立地是包含从9至18个碳的支链烷基基团
1
或包含从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地，每个R独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三基和异-十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259、WO 2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。

[0214] 聚合物

[0215] 洗涤剂可以包含按重量计0-10％，例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。聚合物可以作为如以上提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油污清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于
一种的以下提到的基序(motif)。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)
(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(乙烯亚胺)、羧甲基菊糖(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水改性CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚对苯二甲酸乙二酯和聚氧乙烯对苯二甲酸乙二酯的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。
另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧
基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。也考虑了以上提到的
聚合物的盐。

[0216] 织物调色剂

[0217] 本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如当配制在洗涤剂组合物中时，可以在织物与包括所述洗涤剂组合物的洗涤液体接触时沉积在所述织物上从而通过可
见光吸收/反射来改变所述织物色彩的染料或色素。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如描述于WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/
03276和EP 1876226中(将其通过引用而特此结合)。洗涤剂组合物优选包括从约
0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约
0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是特别优选的。合适的调色剂还披露于例如WO 
2007/087257、WO 2007/087243中。

[0218] 另外的酶

[0219] 洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包括一种或多种另外的酶，如另外的蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。

[0220] 一般而言，一种或多种所选酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。

[0221] 因此，在一个实施例中，该洗涤剂组合物包括一种或多种另外的酶，其中这些另外的酶选自下组，该组由以下各项组成

[0222] i)与SEQ ID NO:7中的蛋白酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的蛋白酶：32、33、48-54、58-62、94-107、116、123-133、150、152-156、158-161、164、169、175-186、197、
198、203-216；

[0223] ii)与SEQ ID NO:8中的脂肪酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的脂肪酶：1-5、27、33、38、57、91、94、96、97、111、163、210、225、231、233、249和254-256；

[0224] iii)与SEQ ID NO:9中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：9、118、149、182、186、195、202、257、295、299、R320、323、339、345和458；

[0225] iv)与SEQ ID NO:10中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：140、195、206、243、260和476；

[0226] v)与SEQ ID NO:21中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：180、181、243和475；

[0227] vi)与SEQ ID NO:12中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：178、179、187、203、458、459、460和476；

[0228] vii)与SEQ ID NO:13中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括修饰的α-淀粉酶：202；

[0229] viii)与SEQ ID NO:14中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：405、421、422和428；和/或

[0230] ix)根据SEQ ID NO:15的α-淀粉酶。

[0231] 纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从在US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,
178、US 5,776,757以及WO 89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真
菌纤维素酶。

[0232] 特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例是例如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,
686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及WO 99/001544中的那些纤维素酶变体。

[0233] 其他纤维素酶是具有以下序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶，该序列与WO 2002/099091的SEQ ID NO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％一致性，或家族44木
葡聚糖酶，该木葡聚糖酶具有以下序列，该序列与WO 2001/062903的SEQ ID NO:2的位置
40-559具有至少60％一致性。

[0234] 可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(诺维信公司)、Carezyme TM TM TM
Premium (诺维信公司)、Celluclean (诺维信公司)、Celluclean Classic (诺维信公
司)、CellusoftTM(诺维信公司)、WhitezymeTM(诺维信公司)、ClazinaseTM和Puradax HATM(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao 
Corporation))。

[0235] 蛋白酶：待与本发明的蛋白酶一起使用的适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如植物或微生物来源。优选微生物来源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。它可以是碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，例如来自M5、M7或M8家族的那些。

[0236] 术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森(Siezen)等人，蛋白质工程学(Protein Engng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学(Protein Science)6(1997)501-523的
丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨
酸的蛋白酶的一个亚组。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。

[0237] 枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于WO 89/06279中的枯草杆菌蛋白酶迟缓(lentus)、枯草杆菌蛋白酶诺和(Novo)、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)
中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/
026024以及WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来
源的)和镰孢属蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及来源于纤维单胞菌属(Cellumonas)的糜蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。

[0238] 进一步优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在例如WO 95/23221中所述)、及其变体(在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的)。

[0239] 金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993(杰能科国际公司(Genencor Int.))中的中性金属蛋白酶，例如来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。

[0240] 有用的蛋白酶的实例是于以下各项中描述的变体：WO 92/19729、WO 96/034946、WO 98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 
04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、61、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、
103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、
222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’进行编号。更优选地，这些枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、G61E,D、V68A、N76D、N87S,R、*
97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’进行编号)。

[0241] 适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些： DuralaseTm、DurazymTm、 Ultra、 Ultra、
Ultra、
Ultra、 以及 (诺维
信公司)，以下列商品名出售的那些：
Purafect PreferenzTm、Purafect Purafect Purafect
EffectenzTm、
以及 (丹尼斯克/杜邦公司)、
AxapemTM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(序列示于US 5352604的图
29中)及其变体(汉高公司)以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋
白酶)。

[0242] 脂肪酶和角质酶：适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如如描述于EP 
258068和EP 305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉
属的角质酶，例如特异腐质霉(WO 96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的
一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218272)、洋
葱假单胞菌(EP 331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)；来
自稻瘟病菌的角质酶(WO 10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5,389,536)；来
自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 11/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌
脂肪酶(WO 11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 11/084599)；以及来自灰色链霉
菌(WO 11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 12/137147)。

[0243] 其他实例是脂肪酶变体，例如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/
04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/
109500中的那些。

[0244] 优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特-博克德斯公司(Gist-Brocades))。

[0245] 再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝
杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶
(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公
司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V
变体)(WO 10/100028)。

[0246] 淀粉酶：可以与本发明的蛋白酶一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌来源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶
包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB 1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌具体株系的α-淀粉酶。

[0247] 适合的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ ID NO:3具有90％序列一致性的变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/
43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在一个或多个以下位置中具有取代的变
体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、
209、211、243、264、304、305、391、408以及444。

[0248] 不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在位置181和182中具
有缺失并且在位置193中具有取代的那些。

[0249] 其他适合的淀粉酶是包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌
α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的变体。这一杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、
G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:
6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合
α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：

[0250] M197T；

[0251] H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或

[0252] G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。

[0253] 适合的另外的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在以下位置中的一个或多
个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。

[0254] 可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7具有90％序列一致性的变体。使用WO 96/023873的SEQ ID 2用于编号，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具
有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及
476。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置，例如181和182、182和183、或位置183和184具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476的一个或多个中具有取代的那些。

[0255] 可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815中的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列一致性或与WO 
01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列一致性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10
的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、
179、190、201、207、211以及264。

[0256] 另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ ID NO:2具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:2的优选变体是在以下位置中的一个或多
个中具有C-末端的截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ ID NO:2的更优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K和/或位置R180和/或S181或T182和/或G183的缺失。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

[0257] N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；

[0258] N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；

[0259] S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或

[0260] S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的并且任选地进一步在位置243处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺
失。

[0261] 其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ ID NO:12具有至少90％序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ ID 
NO:12的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28，R118，N174；R181，G182，D183，G184，G186，W189，N195，M202，Y298，N299，K302，S303，N306，R310，N314；R320，H324，E345，Y396，R400，W439，R444，N445，K446，Q449，R458，N471，N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有R118K、N195F、R320K及R458K的取代的变体，以及另外在选自下组的一个或多个位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。

[0262] 其他实例是例如描述于WO 2011/098531、WO 2013/001078及WO 2013/001087中的那些淀粉酶变体。

[0263] 可商购的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、StainzymeTM、Stainzyme PlusTM、NatalaseTM、Liquozyme X及BANTM(来自诺维信公司)，以及RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、Powerase及Preferenz S100(来自杰能科国际公司/杜邦公司(Genencor International Inc./DuPont))。

[0264] 过氧化物酶/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/
15257中描述的那些。

[0265] 可商购的过氧化物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司)。

[0266] 该一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包含一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，
即独立添加剂或组合添加剂，可以被配制为，例如颗粒、液体、浆体等。优选的洗涤剂添加剂配制品是颗粒，尤其是非尘颗粒；液体，尤其是稳定化的液体；或浆体。

[0267] 非尘颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000
的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；具有
15至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪族醇，其中醇含有12至20个碳原子；脂肪醇；脂肪
酸；以及脂肪酸的单-和双-和三甘油酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实
例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二
醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法制备。

[0268] 辅料

[0269] 还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任
何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术内。

[0270] 分散剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体地说，粉状洗涤剂可以包括分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少
两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。适合的分散剂例如描述于粉状洗涤
剂，表面活性剂科学系列，第71卷中，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker)。

[0271] 染料转移抑制剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚
合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混
合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制剂可以按组合物重量计的以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。

[0272] 荧光增白剂-本发明的洗涤剂组合物还将优选地包含另外的组分,这些组分可以给正清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约
0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的
任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。二氨基茋-磺酸衍生物型的荧光增白剂的实
例包括以下的钠盐：4,4'-双(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)茋-2,2'-二磺酸
盐；4,4'-双(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)茋-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双(2-苯胺基-4
(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)茋-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双(4-苯基-2,
1,3-三唑-2-基)茋-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙基氨基)-s-
三嗪-6-基氨基)茋-2,2'-二磺酸盐和2-(茋基-4"-萘并-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸
盐。优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉基-4苯胺基-s-三
嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二
钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的Parawhite KX，由派拉蒙矿物与化学(Paramount 
Minerals and Chemicals)，孟买，印度供应。适合用于在本发明中使用的其他荧光剂包括
1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。

[0273] 适合的荧光增亮剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。

[0274] 污物释放聚合物-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污物释放聚合物，这些污物释放聚合物帮助从织物，例如棉或聚酯基织物上除去污垢，特别是从聚酯基织物上除去疏水污垢。污物释放聚合物可以例如是非离子型或阴离子型对苯二甲酸基聚合
物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)。另一种类型的污物释放聚合物是包括核心结构和连接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两
亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO 
2009/087523中详细描述的(将其通过引用而特此结合)。此外，任意接枝共聚物是适合的污物释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856以及
WO 2006/113314中(将其通过引用而特此结合)。其他污物释放聚合物是取代的多糖结构，
尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如EP 1867808或WO 2003/040279中
描述的那些(将二者都通过引用而特此结合)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子改性的纤维素、非离子改性的纤维素、阳离子改性的纤维素、兼性离子改性的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。

[0275] 抗再沉积剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷和/或聚乙二醇
(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸与马来酸的共聚物以及乙氧基化聚乙亚胺。以上在污物释放聚合物下描述的纤维素基聚合物还可以用作抗再沉积剂。

[0276] 其他适合的辅料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。

[0277] 洗涤剂产品的配制品

[0278] 本发明的洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如条、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉末、颗粒、膏、凝胶、或规则的、压缩的或浓缩的液体。

[0279] 洗涤剂配制品形式：层(相同或不同的相)、袋、对比用于机器配量单位的形式。

[0280] 袋可以被配置为单个或多个的室。它可以具有适合保存该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为袋的室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选的是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约
150,000。膜还可以是共混物组合物，该共混物组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由美国印第安纳州盖里
(Gary,Ind.，US)的克里斯克拉夫特工业产品公司(Chris Craft In.Prod.)销售)加增塑
剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上
可以与包括固体的室不同。参考文献：(US 2009/0011970 A1)。

[0281] 可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。由此可以避免组分之间的负面的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可
以引起选择的组分的延迟溶解。

[0282] 非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以包含从0-30％的有机溶剂。液体
或凝胶洗涤剂可以是非水性的。

[0283] 洗衣皂条

[0284] 本发明的酶可以被添加至洗衣皂条中并且用于手洗洗衣、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combo bar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于它们包含的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括包含来自脂肪酸的肥皂
和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为不随着时间显著变化的物理形式，即如果将固体物体(例如洗衣皂条)放置
于容器内部，该固体物体不发生改变来填充它被放置于其中的容器。条典型地是处于条形
的固体但是可以处于其他固体形状，例如圆形或卵形。

[0285] 洗衣皂条可以包含一种或多种另外的酶，蛋白酶抑制剂例如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)，硼酸，硼酸盐，硼砂和/或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰苯基硼酸，一种或多种肥皂或合成表面活性剂，多元醇例如甘油，pH控制化合物例如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸，和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na+、K+或NH4+并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，这样使得一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。

[0286] 洗衣皂条还可以包含络合剂像EDTA和HEDP，香料和/或不同类型的填充剂，表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂，助洗剂，聚合的污垢释放剂，洗涤剂螯合剂，稳定剂，填充剂，染料，着色剂，染料转移抑制剂，烷氧基化的聚碳酸酯，抑泡剂，结构剂，粘合剂，浸出剂，漂白活化剂，粘土去污剂，抗再沉积剂，聚合分散剂，增白剂，织物柔软剂，香料和/或本领域已知的其他化合物。

[0287] 洗衣皂条可以在常规的洗衣皂条制造设备中进行加工，例如但不限制于：混合器、压条机例如双级真空压条机、挤出机、切割机、标识压模机(logo-stamper)、冷却隧道以及包装机。本发明不局限于通过任何单一方法制备洗衣皂条。可以在过程的不同阶段向肥皂中添加本发明的预混料。例如，可以制备包含肥皂、酶、任选地一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混料并且然后将该混合物压条。可以同时添
加作为例如处于液态的蛋白酶抑制剂的酶以及任选的另外的酶。除了混合步骤和压条步骤
以外，该工艺还可以进一步包括研磨、挤出、切割、压模、冷却和/或包装的步骤。

[0288] 颗粒洗涤剂配制品

[0289] 如描述于WO 09/092699、EP 1705241、EP 1382668、WO 07/001262、US 6472364、WO 04/074419或WO 09/102854中的，可以配制颗粒洗涤剂。其他有用的洗涤剂配制品描述于以下各项中：WO 09/124162、WO 09/124163、WO 09/117340、WO 09/117341、WO 09/117342、WO 
09/072069、WO 09/063355、WO 09/132870、WO 09/121757、WO 09/112296、WO 09/112298、WO 
09/103822、WO 09/087033、WO 09/050026、WO 09/047125、WO 09/047126、WO 09/047127、WO 
09/047128、WO 09/021784、WO 09/010375、WO 09/000605、WO 09/122125、WO 09/095645、WO 
09/040544、WO 09/040545、WO 09/024780、WO 09/004295、WO 09/004294、WO 09/121725、WO 
09/115391、WO 09/115392、WO 09/074398、WO 09/074403、WO 09/068501、WO 09/065770、WO 
09/021813、WO 09/030632以及WO 09/015951。

[0290] WO 2011025615、WO 2011016958、WO 2011005803、WO 2011005623、WO 2011005730、WO 2011005844、WO 2011005904、WO 2011005630、WO 2011005830、WO 
2011005912、WO 2011005905、WO 2011005910、WO 2011005813、WO 2010135238、WO 
2010120863、WO 2010108002、WO 2010111365、WO 2010108000、WO 2010107635、WO 
2010090915、WO 2010033976、WO 2010033746、WO 2010033747、WO 2010033897、
WO2010033979、WO2010030540、WO2010030541、WO2010030539、WO 2010024467、WO 
2010024469、WO 2010024470、WO 2010025161、WO 2010014395、WO 2010044905、WO 
2010145887、WO 2010142503、WO 2010122051、WO 2010102861、WO 2010099997、WO 
2010084039、WO 2010076292、WO 2010069742、WO 2010069718、WO 2010069957、WO 
2010057784、WO 2010054986、WO 2010018043、WO 2010003783、WO 2010003792、WO 
2011023716、WO 2010142539、WO 2010118959、WO 2010115813、WO 2010105942、WO 
2010105961、WO 2010105962、WO 2010094356、WO 2010084203、WO 2010078979、WO 
2010072456、WO 2010069905、WO 2010076165、WO 2010072603、WO 2010066486、WO 
2010066631、WO 2010066632、WO 2010063689、WO 2010060821、WO 2010049187、WO 
2010031607、WO 2010000636。

[0291] 用途

[0292] 本发明针对用于使用具有蛋白酶活性的多肽或其组合物的方法。本发明可以在纺织品和织物的湿洗(例如家用衣物洗涤和工业衣物洗涤)中使用其组合物。本发明针对用于
在硬表面清洁例如自动餐具洗涤(ADW)、汽车洗涤以及工业表面清洁中使用其组合物的方
法。

[0293] 本发明蛋白酶在洗涤剂组合物和清洁过程中的用途

[0294] 对于洗涤剂配制者而言重要的污垢和污物由许多不同物质构成，已经开发具有不同底物特异性的一系列不同的酶用于在涉及衣物洗涤和硬表面清洁(例如餐具洗涤)两者
中使用。认为这些酶提供酶洗涤益处，因为与不具有酶的同一过程相比，它们在其应用至其中的清洁过程中特异性地改善污物去除。本领域中已知的去污酶包括以下酶，例如糖酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、角质酶以及果胶酶。

[0295] 在一方面，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的分离的多肽在洗涤剂组合物和清洁过程(如衣物洗涤和硬表面
清洁)中的用途。

[0296] 在另一方面，本发明涉及本发明的蛋白酶在洗涤剂组合物和清洁过程，例如衣物洗涤和硬表面清洁中的用途。因此，在一个实施例中，本发明展示了本发明的蛋白酶对各种污物以及在各种条件下的洗涤效果。在本发明的一个具体实施例中，该洗涤剂组合物及在
清洁过程中的用途涉及本发明的蛋白酶与以上提及的去污酶中的至少一种一起使用。

[0297] 在本发明的一个优选方面中，本发明的蛋白酶可以与另外的酶组合，这些另外的酶具体描述于“其他酶”部分中；优选地将本发明的蛋白酶与至少两种酶，更优选是至少三种、四种或五种酶组合。优选地，这些酶具有不同的底物特异性，例如碳水化合物分解活性(carbolytic activity)、蛋白水解活性、淀粉分解活性、脂质分解活性、溶半纤维活性或溶果胶活性。酶组合可以例如是本发明的蛋白酶与另一种去污酶，例如本发明的蛋白酶与淀
粉酶、本发明的蛋白酶与纤维素酶、本发明的蛋白酶与半纤维素酶、本发明的蛋白酶与脂肪酶、本发明的蛋白酶与角质酶、本发明的蛋白酶与果胶酶或本发明的蛋白酶与抗再沉积酶，特别优选本发明的蛋白酶和淀粉酶。更优选地，本发明的蛋白酶与至少两种其他去污酶组
合，例如本发明的蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶；或本发明的蛋白酶、淀粉酶及果胶酶；或本发明的蛋白酶、淀粉酶及角质酶；或本发明的蛋白酶、淀粉酶及纤维素酶；或本发明的蛋白酶、淀粉酶及半纤维素酶；或本发明的蛋白酶、脂肪酶及果胶酶；或本发明的蛋白酶、脂肪酶及角质酶；或本发明的蛋白酶、脂肪酶及纤维素酶；或本发明的蛋白酶、脂肪酶及半纤维素酶。甚至更优选地，本发明的蛋白酶可以与至少三种其他去污酶组合，例如本发明的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及果胶酶；或本发明的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及角质酶；或本发明的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及纤维素酶；或本发明的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及半纤维素酶，优选本发明的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶。本发明的蛋白酶可以与任何选自非穷尽性列表的酶组合，该列表包括：糖酶(例如淀粉酶)、半纤维素酶、果胶酶、纤维素酶、黄原胶酶或支链淀粉酶，肽酶，其他蛋白酶或金属蛋白酶。在本发明的一个实施例中，本发明的蛋白酶可以与一TM
种或多种金属蛋白酶组合，例如M4金属蛋白酶，包括Neutrase 或嗜热菌蛋白酶。此类组合可以进一步包括如上概述的其他洗涤剂酶的组合。

[0298] 清洁过程或者纺织品护理过程可以例如是衣物洗涤过程、餐具洗涤过程或硬表面(如浴室瓷砖、地板、桌面、排水管、水槽以及脸盆)清洁。衣物洗涤过程可以例如是家用洗衣，但是它也可以是工业洗衣。此外，本发明涉及用于洗涤织物和/或衣物的方法，其中该方法包括用包含洗涤剂组合物和至少一种本发明的蛋白酶的洗涤溶液处理织物。例如，可以
在机器洗涤过程中或者在手动洗涤过程中进行清洁过程或纺织品护理过程。洗涤溶液可以
例如是含有洗涤剂组合物的水性洗涤溶液。

[0299] 经过洗涤、清洁的织物和/或衣物或者本发明的纺织品护理过程可以是常规的可洗涤衣物洗涤，例如家用洗涤。优选地，衣物洗涤的主要部分是衣物和织物，包括针织品、编织物、斜纹粗棉布、非编织物、毛毡、纱线、以及毛布巾。这些织物可以是纤维素基的，如天然纤维素，包括棉布、亚麻、亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维；或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括纤维胶/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)或其共混物。这些织物还可以是非纤维素基的，如天然聚酰胺，包括羊毛、骆驼毛、羊绒、马海毛、兔毛或丝；或者合成聚合物，如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和氨纶/弹性纤维；或其共混物以及纤维素基和非纤维素基纤维的共混物。共混物的实例是棉和/或人造丝/纤维
胶与一种或几种伴随材料的共混物，该伴随材料例如是羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/纤维胶、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。

[0300] 最近几年，人们对替换洗涤剂中的组分的兴趣逐渐增加，这源于用可再生生物组分如酶和多肽替换石油化学产品而不损害洗涤性能。当洗涤剂组合物的组分改变新酶活性
或者相比于常用洗涤剂酶(如蛋白酶)具有替代和/或改进的特性的新酶时，需要脂肪酶和
淀粉酶来实现与传统洗涤剂组合物相比时相似或改进的洗涤性能。

[0301] 本发明的蛋白酶可用于蛋白质污渍去除过程。蛋白质污渍可能是如食品污渍等污渍，或例如婴儿食品、皮脂、可可、蛋、血、奶、墨、草、或其组合。

[0302] 典型的洗涤剂组合物包括除酶之外的各种组分，这些组分具有不同的作用，一些组分像表面活性剂降低洗涤剂的表面张力，这允许正清洁的污物被提起和分散并随后被洗
涤出来，其他组分像漂白系统通常通过氧化除去颜色并且许多漂白剂还具有强杀菌特性，
并且用于消毒和灭菌。再其他组分像助洗剂和螯合剂例如通过从液体中除去金属离子来软
化洗涤水。

[0303] 在一个具体实施例中，本发明涉及包括本发明的蛋白酶的组合物在衣物或餐具洗涤中的用途，其中所述酶组合物进一步包括以下各项中的至少一种或多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分。

[0304] 因此，在一个实施例中，本发明涉及包括与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少97％序列一致性的多肽的组合物在衣物或餐具洗涤中的用途，其中该组合物进一步包括以下各
项中的至少一种或多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分。

[0305] 在本发明的一个优选实施例中，表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的量相比于在未添加本发明的蛋白酶情况下使用的表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的量有所减少。优选地，作为表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的该至少一种组分按以下量存在：比在不添加本发明的蛋白酶的情况下组分在系统中的量(例如，此组分的常规的量)少1％、如少2％、如少3％、如少4％、如少5％、如少6％、如少7％、如少8％、如少9％、如少10％、如少
15％、如少20％、如少25％、如少30％、如少35％、如少40％、如少45％、如少50％。在一个实施例中，将本发明的蛋白酶用于洗涤剂组合物中，其中所述组合物不含至少一种组分，该组分是表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分和/或聚合物。

[0306] 洗涤方法

[0307] 包含本发明的蛋白酶的洗涤剂组合物理想地适用于在衣物洗涤应用中使用。因此，本发明包括洗涤织物的方法。该方法包括将有待洗涤的织物与包含根据本发明的洗涤
剂组合物的清洁衣物洗涤溶液接触的步骤。织物可以包括能够在常规消费者使用条件下被
洗涤的任何织物。该溶液优选具有从约5.5至约8的pH。可以在溶液中按以下浓度使用这些
组合物：从约100ppm，优选500ppm至约15,000ppm。水温的范围典型地是从约5℃至约90℃，包括约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约
60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃以及约90℃。水与织物之比典型地是从约1:1至约30:1。

[0308] 在具体实施例中，在从约5.0至约11.5的pH下执行该洗涤方法，或在替代性实施例中，甚至从约6至约10.5，例如约5至约11、约5至约10、约5至约9、约5至约8、约5至约7、约5.5至约11、约5.5至约10、约5.5至约9、约5.5至约8、约5.5.至约7、约6至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约6.5至约11、约6.5至约10、约6.5至约9、约6.5至约8、约6.5至约7、约7至约11、约7至约10、约7至约9或约7至约8，优选约5.5至约9，并且更优选约6至约8。

[0309] 在具体实施例中，在以下硬度下执行该洗涤方法：从约0°dH至约30°dH，例如约1°dH、约2°dH、约3°dH、约4°dH、约5°dH、约6°dH、约7°dH、约8°dH、约9°dH、约10°dH、约11°dH、约
12°dH、约13°dH、约14°dH、约15°dH、约16°dH、约17°dH、约18°dH、约19°dH、约20°dH、约21°dH、约22°dH、约23°dH、约24°dH、约25°dH、约26°dH、约27°dH、约28°dH、约29°dH、约30°dH。在典型欧洲洗涤条件下，硬度是约15°dH，在典型美国洗涤条件下，是约6°dH，并且在典型亚洲洗涤条件下，是约3°dH。

[0310] 本发明涉及用包括本发明的蛋白酶的洗涤剂组合物清洁织物、餐具或硬表面的方法。

[0311] 一个优选实施例涉及清洁方法，所述方法包括在适合于清洁物体的条件下将所述物体与包含本发明的蛋白酶的清洁组合物接触的步骤。在一个优选实施例中，该清洁组合
物是洗涤剂组合物并且该过程是衣物洗涤或餐具洗涤过程。

[0312] 仍另一个实施例涉及用于从织物上除去污物的方法，该方法包括在适合于清洁所述物体的条件下将所述织物与包含本发明的蛋白酶的组合物接触。

[0313] 在一个优选实施例中，用于在以上方法中使用的组合物进一步包括至少一种如以上“其他酶”部分列出的另外的酶，如选自下组的酶，该组由以下各项组成：糖酶、淀粉酶、肽酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶或角质酶或其组合。在又另一个优选实施例中，这些组合物包括减少的量的以下组分中的至少一种或多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分或聚合物。

[0314] 实例

[0315] 实例1：表达与纯化：

[0316] 来自霍耐克芽孢杆菌(SEQ ID NO 1)的编码基因的分离、基因组测序和鉴定。

[0317] 将来自芽孢杆菌属的细菌菌株霍耐克芽孢杆菌从环境样品中分离，并且将通过16S核糖体亚基基因的的测序所鉴定的物种在表1中列出。

[0318] 表1：

[0319]

[0320] 通过使用QIAamp DNA血液迷你试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)(凯杰公司(Qiagen)，希尔登，德国)分离来自细菌菌株的染色体DNA。将2ug的染色体DNA送至FASTERIS SA，瑞士进行基因组测序。通过Illumina测序对基因组进行测序。分析得到的基因组序列，并且使用BLAST程序通过检索与蛋白酶TY145(SEQ ID NO:6)进行比较来鉴定S8蛋白酶。编
码本发明多肽的鉴定基因的DNA序列作为SEQ ID NO:2包括在序列表中。

[0321] 来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶在枯草芽孢杆菌表达宿主中的克隆与表达。

[0322] 为了来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶(SEQ ID NO:2)的表达克隆，使用线性整合载体系统。线性整合构建体是PCR融合产物，该融合产物由两个枯草芽孢杆菌同源染色体区域之间的基因连同强启动子与氯霉素抗性标记的融合制备。通过重叠延伸拼接(SOE)PCR进行
融合(霍顿(Horton)，R.M.、亨特(Hunt)，H.D.、胡(Ho)，S.N.、皮伦(Pullen)，J.K.以及皮斯(Pease)，L.R.(1989)，不使用限制酶，通过重叠延伸的基因剪接的工程化杂种基因
(Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes，gene 
splicing by overlap extension)基因(Gene)77:61-68)。专利申请WO 2003/095658中也
描述了SOE PCR方法。在三联启动子系统(如WO 99/43835中所述)的控制下表达该基因，该
启动子系统由包含稳定化序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)启动子和苏云金杆菌cryIIIA启动子组成。编码氯霉素乙酰基转移
酶的基因被用作标记(描述于例如戴德瑞奇森(Diderichsen)，B.；波尔森(Poulsen)，G.B.；
约根森(Joergensen)，S.T.；枯草芽孢杆菌的有用的克隆载体(A useful cloning vector for Bacillus subtilis)30:312(1993))。在芽孢杆菌属染色体上通过同源重组将最终的
基因构建体整合到果胶酸裂解酶位点中。用包含至两个侧翼载体片段的突出端的基因特异
性引物从对应的菌株的染色体DNA扩增基因片段(引物序列列于表2中)。用克劳氏芽孢杆菌
分泌信号(具有以下氨基酸序列：MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA(SEQ ID NO 16))代替天
然的分泌信号来表达所有的基因。

[0323] 表2：用于PCR扩增的引物：

[0324] 正向引物：GTTCATCGATCGCATCGGCTAAAGATAAAGTTGAGGCAAAGGAACA(SEQ ID NO:4)

[0325] 反向引物：GCGTTTTTTTATTGATTAACGCGTTTATTTTACTCTTGGATAGCCGAACC(SEQ ID NO:5)

[0326] 使这两个载体片段和该基因片段经受SOE PCR反应，以将这三个片段装配到线性载体构建体中。将等分部分的该PCR产物转化到枯草芽孢杆菌中。在每ml补充有6μg氯霉素的LB琼脂板上选择转化体。使包含该整合表达构建体的所得重组枯草芽孢杆菌克隆在液体
培养基中进行生长。收获包含酶的上清液并如以下所述的将这些酶进行纯化。

[0327] 来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶的纯化

[0328] 将培养液离心(26000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤以便除去剩余芽孢杆菌宿主细胞。将0.2μm滤液以
1:1与3.0M(NH4)2SO4混合，并且将该混合物施加到苯基-琼脂糖FF(高取代(high sub))柱
(来自GE医疗公司(GE Healthcare))上，该柱以100mM H3BO3、10mM MES/NaOH、2mM CaCl2、
1.5M(NH4)2SO4(pH 6.0)平衡。在用平衡缓冲液洗涤该柱之后，将蛋白酶用100mM H3BO3、10mM MES、2mM CaCl2(pH 6.0)进行逐步洗脱。收集洗脱峰(包含蛋白酶活性)，并且施加至在
100mM H3BO3、10mM MES、2mM CaCl2(pH 6.0)中平衡的杆菌肽琼脂糖柱(来自Upfront层析公司(Upfront chromatography))上。在用平衡缓冲液充分地洗涤该柱之后，将蛋白酶用具有
25％(v/v)2-丙醇的100mM H3BO3、10mM MES、2mM CaCl2、1M NaCl(pH 6.0)洗脱。将洗脱峰(包含蛋白酶活性)转移至在G25葡聚糖凝胶柱(来自GE医疗公司)上的20mM MES、2mM CaCl2
(pH 6.0)。经G25转移的峰是纯化的制剂，并且将其用于进一步实验。通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白酶制剂，并且将凝胶用考马斯染色，看到了大约36-37kDa的主带，并且看到了两条分别为大约29Da和7-8kDa的次带。埃德曼降解显示次带代表带切口的蛋白酶分子。这得到
如下事实的支持，即如果在没有还原剂的情况下跑胶，在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上仅
看到一条带，表明分子内硫桥连接了带切口的蛋白酶分子的两部分。

[0329] 通过蛋白酶活性测定使用Suc-AAPF-pNA作为底物测试纯化的蛋白酶的活性。如下进行该测定：

[0330] pNA底物：Suc-AAPF-pNA(巴亨(Bachem)L-1400)。

[0331] 温度：室温(25℃)

[0332] 测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，pH 9.0。

[0333] 将20μl蛋白酶(稀释于0.01％Triton X-100中)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg，溶解在1.0ml DMSO中，并进一步地用0.01％Triton X-100稀释45倍)开始进行测定。监测OD405的初始增加作为蛋白酶活性的量度。

[0334] 本领域技术人员已知替代性测定，可以使用这些替代性测定以便确定具有蛋白酶活性的多肽或像这样的蛋白酶的活性。

[0335] 实例2：用来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶进行TOM洗涤

[0336] 使用Tergo-O-Meter(TOM)洗涤系统，使用洗衣液标准洗涤剂在六种不同的污渍上测试来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶的洗涤性能。

[0337] Tergo-O-Meter(TOM)是中等规模标准洗涤系统，它可以应用于同时测试多达16种不同洗涤条件。TOM基本上是大型的具有多达16个开放金属烧杯淹没至其中的温度受控的
水浴。每个烧杯构成一个小的顶部加载型洗涤机并且在实验期间，它们中的每一者包含特
定洗涤剂/酶系统的溶液和污染的和未污染的织物。使用污染的和未污染的织物，可以确定该特定洗涤剂/酶系统的性能。可以通过旋转搅拌臂获得机械应力，该旋转搅拌臂搅拌在每个烧杯内的液体。因为TOM烧杯没有盖子，在TOM实验过程中抽取样品是可能的，并且从而便于选择在洗涤过程中在线收集信息。

[0338] TOM标准洗涤系统主要可以用于洗涤剂和酶的中等规模测试，在US或LA(拉丁美洲)或AP(亚太地区)洗涤条件下。在TOM实验中，如‘压载物与污物’的比率和‘织物与洗涤液’的比率的因素可以变化。因此，TOM提供了在小规模实验(如AMSA和微型洗涤)与在顶部加载型衣物洗涤机中的更费时的全规模实验之间的联系。

[0339] 通过使用水浴进行TOM实验，水浴具有多达16个钢制烧杯并且每个烧杯一个旋转臂，每个烧杯的容量是500或1200mL的洗涤剂溶液。该实验在从5℃至80℃的温度范围内进
行。水浴充满去离子水，并且旋转速度设为70至120rpm/min。

[0340] 所有烧杯都是干净的并且不含微量的先前测试材料。

[0341] 然后在桶中制备具有所希望的量的洗涤剂、温度和水硬度的洗涤溶液。洗涤剂在磁搅拌10min期间溶解。洗涤溶液在制备之后30至60min之内使用。将1000ml洗涤溶液添加
至各TOM烧杯，并且开始在120rpm下搅拌。向用于测试本发明酶的那些烧杯中，将酶添加至烧杯中。将与压载物混合的小块布样(亦称“织物”)喷湿并装入烧杯中。当小块布样和压载物添加到烧杯中时开始时间测量。洗涤进行30分钟，并且通过停止搅拌烧杯来停止。将洗涤加载物从TOM烧杯转移到筛，以便用冷自来水冲洗。将小块布样和压载物转移到欧洲洗涤
机，进行14min的冲洗循环。将小块布样与压载物分离并且置于被纸覆盖的托盘上。将另一张纸加至小块布样的顶部。使小块布样干燥过夜，并且然后如以下所描述的在Color Eye下测量。

[0342] 实验条件总结于表3中。

[0343] 表3：用于衣物洗涤实验的实验条件

[0344]

[0345] 通过将CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:CO3-＝4:1:7.5)添加至测试系统中将水硬度调节至15°dH。

[0346] 表4：在20℃下，与没有蛋白酶的洗涤剂相比，包括来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶的洗涤剂的Δ反射值

[0347]小块布样 CS-37 C-05 PC-03 CS-01 C-H010 062KC
霍耐克芽孢杆菌 6.0 5.7 7.8 2.9 3.4 10.3

[0348] 表4的结果显示，包含霍耐克芽孢杆菌的洗涤剂有效改进了在20℃下对蛋(CS-37)、血/奶/墨(C-05)、血(CS-01)、巧克力/奶(C-H010，PC-03)和草(062KC)污渍的洗涤性能。

[0349] 表5：在20℃下，与洗涤剂TY-145蛋白酶(SEQ ID NO 10)相比，包括来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶的洗涤剂的相对洗涤性能

[0350]小块布样 CS-37 C-05 PC-03 CS-01 C-H010 062KC
霍耐克芽孢杆菌 0.8 0.9 1.1 0.7 1.0 0.8

[0351] 实例3：用来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶进行TOM洗涤

[0352] 如以上所描述的，使用Tergo-O-Meter(TOM)洗涤系统，使用两种不同的洗涤剂和六种不同污渍，进一步测试来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶的洗涤性能。

[0353] 如在TOM中针对衣物洗涤方法所描述的，用描述于表1中的洗涤剂组合物和小块布样执行实验，并且实验条件如下表6中所指定。

[0354] 表6：用于衣物洗涤实验的实验条件

[0355]

[0356] 通过将CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:CO3-＝4:1:7.5)添加至测试系统中将水硬度调节至15°dH。

[0357] 表7：在20℃下，与没有蛋白酶的洗涤剂相比，包括来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶的洗涤剂的Δ反射值

[0358]

[0359] 表7的结果显示，当都在洗涤剂“联合利华小&强大洗涤剂”和在液体标准洗涤剂K中测试时，包括霍耐克芽孢杆菌的洗涤剂都有效改进了在20℃下对蛋(CS-37)、血/奶/墨
(C-05)、血(CS-01)、巧克力/奶(C-H010，PC-03)和草(062KC)污渍的洗涤性能。

[0360] 实例4：使用来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶进行AMSA洗涤

[0361] 使用自动机械应力测定(AMSA)，使用洗衣液标准洗涤剂在五种不同技术污渍上测试来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶的洗涤性能。

[0362] 通过AMSA，可以检査许多小体积酶洗涤剂溶液在衣物洗涤中的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的槽，以及盖子，盖子将待洗涤的纺织品对槽开口强力挤压。在洗涤期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是在第23-24页的“特定方法实施例(Special method embodiments)”段落。

[0363] 表8：标准洗涤剂和测试材料如下：

[0364]

[0365]

[0366] 测试材料从EMPA试验材料AG(EMPA Testmaterials AG， 12，CH-9015St.Gallen，瑞士)，从测试材料BV中心(Center For Testmaterials BV，邮政信箱120，
3133KT弗拉尔丁恩，荷兰)和WFK测试织物有限公司(WFK Testgewebe GmbH)(Christenfeld 
10，D-41379Brüggen，德国)获得。

[0367] 通过将CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+＝4:1:7.5)添加到测试系统中将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水冲洗并干燥。

[0368] 将洗涤性能作为所洗涤纺织品颜色的亮度进行测量。亮度也可以表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光
的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能。

[0369] 使用专业平板扫描仪(Kodak iQsmart，柯达(Kodak)，Midtager 29，DK-2605丹麦)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。

[0370] 为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24位像素值转化为红色、绿色和蓝色(RGB)值。可以通过将RGB值作为向量相加并随后考虑所得向量的长度计算强度值
(Int)：

[0371]

[0372] 使用单循环洗涤程序，用描述于表1中的洗涤剂组合物和小块布样执行实验，并且实验条件如下表9中所指定。

[0373] 表9：用于衣物洗涤实验的实验条件

[0374]洗涤剂剂量 洗衣液标准洗涤剂B 3.33g/L
测试溶液体积 160μL
pH 按原来的情况
洗涤时间 20分钟
温度 20℃
水硬度 15°dH
蛋白酶浓度 0-10-30-60-100nM
小块布样 EMPA117EH、PC-03、CS-38、CS-01、C-03

[0375] 通过将CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:CO3-＝4:1:7.5)添加至测试系统中将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水冲洗并干燥。

[0376] 表10：在20℃下，与没有蛋白酶的洗涤剂相比，包括来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶的洗涤剂的Δ强度值

[0377]

[0378]

[0379] 表10的结果显示，包括霍耐克芽孢杆菌的洗涤剂有效改进了在20℃下对蛋(CS-38)、血/奶/墨(EMPA117EH)、血(CS-01)和巧克力/奶(PC-03，C-03)的洗涤性能。

[0380] 实例5：来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶的AMSA剂量反应洗涤

[0381] 使用四种不同洗涤剂在三种不同污渍上测试来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶的剂量反应洗涤性能。

[0382] 如在AMSA中针对衣物洗涤方法所描述的，使用单循环洗涤程序，用描述于表1中的洗涤剂组合物和小块布样执行实验，并且实验条件如下表11中所指定。

[0383] 表11：用于衣物洗涤实验的实验条件

[0384]

[0385] 通过将CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:CO3-＝4:1:7.5)添加至测试系统中将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水冲洗并干燥。

[0386] 表12：在20℃下，与没有淀粉酶的洗涤剂相比，来自霍耐克芽孢杆菌的淀粉酶对C-05血/奶/墨污渍的性能

[0387]

[0388] 表13：在20℃下，与没有蛋白酶的洗涤剂相比，来自霍耐克芽孢杆菌的淀粉酶对PC-03可可污渍的性能

[0389]

[0390] 表14：在20℃下，与没有蛋白酶的洗涤剂相比，来自霍耐克芽孢杆菌的淀粉酶对CS-37全蛋w/色素污渍的性能

[0391]

[0392] 表12、13和14的结果显示，包括霍耐克芽孢杆菌的洗涤剂有效改进了在20℃下对蛋、血/奶和巧克力/奶的洗涤性能。

[0393] 实例6：来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶的微型洗涤结果

[0394] 使用微型洗涤系统，使用洗衣液标准洗涤剂在一种技术污渍上测试来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶的洗涤性能。

[0395] 微型洗涤测定是如下测试方法，其中污染的纺织品被连续地提起放进测试溶液中并且随后冲洗。

[0396] 表15：在以下指定的实验条件下进行洗涤实验：

[0397]

[0398]

[0399] 测试材料从EMPA试验材料AG(EMPA Testmaterials AG， 12，CH-9015St.Gallen，瑞士)，从测试材料BV中心(Center for Testmaterials BV，邮政信箱120，
3133KT弗拉尔丁恩，荷兰)和WFK测试织物有限公司(WFK Testgewebe GmbH)(Christenfeld 
10，D-41379Brüggen，德国)获得。

[0400] 随后将纺织品风干并且将洗涤性能测量为这些纺织品的颜色的亮度。还可以将亮度表示为反射比(R)，反射比是当用白光照射时，从测试材料发射或发出的光的量度。使用Zeiss MCS 521 VIS分光光度计在460nm处测量纺织品的反射比(R)。根据制造商的方案进
行测量。

[0401] 通过取得来自用酶洗涤的小块布样的测量值并且与来自未用酶洗涤的小块布样的测量值相减来计算针对每种污渍的酶效果，ΔRem酶。

[0402] 如在微型洗涤测定中针对衣物洗涤方法所描述的，用描述于表1中的洗涤剂组合物和小块布样执行实验，并且实验条件如下表16中所指定。

[0403] 表16：用于微型洗涤衣物洗涤实验的实验条件

[0404]

[0405]

[0406] 通过将CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:CO3-＝4:1:7.5)添加至测试系统中将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水冲洗并干燥。

[0407] 表17：在30℃下，与没有蛋白酶的洗涤剂相比，包括来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶的洗涤剂的Δ强度值

[0408]洗涤剂 酶剂量nM 洗衣液标准洗涤剂 洗衣液标准洗涤剂B
霍耐克芽孢杆菌 0.0 0 0.0
  0.9 1.2 0.3
  1.9 2.4 0.6
  3.7 3.5 1.3
  7.4 5.0 2.0
  22.2 6.7 2.9

[0409] 表17的结果显示，包括霍耐克芽孢杆菌的洗涤剂有效改进了在30℃下对巧克力/奶的洗涤性能。

[0410] 实例7：来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶的满量程洗涤结果

[0411] 在满量程洗涤(full scale wash)中，测试来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶的洗涤性能。在洗衣液标准洗涤剂B中，在14种不同的污渍上在90nM下测试洗涤性能。

[0412] 洗涤并冲洗之后，将小块布样摊开铺平并且允许在室温下风干过夜。在洗涤的次日评估所有洗涤。使用具有非常小孔径的Macbeth Color Eye 7000反射分光光度计进行小
块布样的光反射评估。在入射光中没有UV的情况下进行测量并且提取460nm处的反射。在未洗涤的和洗涤的小块布样上进行测量。将有待测量的测试小块布样放置在相同类型和颜色
的另一个小块布样的顶部。

[0413] 通过取得来自用酶洗涤的小块布样的测量值并且与来自未用酶洗涤的小块布样的测量值相减来计算针对每种污渍的酶效果，ΔRem酶。将洗涤性能表示为Δ反射值(Δ
Rem)。

[0414] 用描述于表1中的洗涤剂组合物和小块布样执行实验，并且实验条件如下表18中所指定。

[0415] 表18：用于满量程洗涤衣物洗涤实验的实验条件

[0416]

[0417] 通过将CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:CO3-＝4:1:7.5)添加至测试系统中将水硬度调节至15°dH。

[0418] 表19：在20℃下，与没有蛋白酶的洗涤剂相比，包括来自霍耐克芽孢杆菌的蛋白酶的洗涤剂的Δ反射值

[0419]污渍 90nM
CS-01 6.1
WE5DASBWKc 5.4
C-05 9
EMPA 116 7.6
EMPA 117 7.4
C-03 4.9
PC-03 13.3
C-H010 10.2
EMPA 112 7.7
CS-37 7.3
10EG 3.1
EMPA164 2.8
C-10 11.8

[0420] 表19的结果显示，包括霍耐克芽孢杆菌的洗涤剂有效改进了在20℃下对蛋(CS-37，WFK10EG)、血(CS-01，WE5DASBWKc)、血/奶/墨(C-05，EMPA116，EMPA117)，草(EMPA164)、奶(C-10)和巧克力/奶(C-H010，PC-03，C-03，EMPA112)的洗涤性能。

[0421] 实例8：通过定点诱变构建霍耐克芽孢杆菌同系物

[0422] 定点同系物构建自具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的亲本蛋白酶，包括根据本发明的特定取代。这些同系物是通过传统的克隆DNA片段制得(萨拉布鲁克(Sambrook)等人，
分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港，
1989)，使用PCR连同专门设计的诱变寡核苷酸，这些寡核苷酸在所得序列中引入所希望的
突变。

[0423] 对应于希望的一个或多个突变位点侧翼的DNA序列合成诱变的寡核苷酸，其由限定取代的DNA碱基对分离。以此方式，构建并产生下表20中所列的同系物。

[0424] 为了进一步评估本发明的同系物，将包含本发明的同系物的突变DNA转化到感受态枯草芽孢杆菌菌株中并使用标准方案发酵(TB-甘油培养基，3-4天，30℃)。

[0425] 表20具有SEQ ID NO:2的序列的亲本蛋白酶的同系物

[0426]与SEQ ID NO:2的差异 SEQ ID NO:
S173P SEQ ID NO:17
S173Y SEQ ID NO:18
S173P，S175P SEQ ID NO:19

[0427] 实例9：同系物的储存稳定性测定

[0428] 通过将蛋白酶同系物与洗涤剂混合，并且在35℃下0、2.5和23小时孵育后测量残余蛋白酶活性，来评估在液体洗涤剂(如表8中所描述的标准B洗涤剂)中的蛋白酶同系物的
储存稳定性。

[0429] 一式两份地测试所有同系物，即，SEQ ID NO:17、18和19，连同具有SEQ ID NO:2的序列的蛋白酶，并且培养上清液被包括在所有板上。将具有SEQ ID NO:2的蛋白酶用作参照。将包含蛋白酶同系物(或作为参照的SEQ ID NO:2)的30μl培养上清液与270μl标准B洗涤剂在微量滴定板(Nunc U96PP 0.5ml)的孔中使用磁棒进行混合(在Zephyr移液工作站
(Caliper LifeSciences公司)上持续30min)。然后将20μl的这种混合物转移至另一个微量滴定板(加有磁棒的Nunc U96PP 0.5ml)中，并且与150μl测定缓冲液(100mM Tris，pH 8.6)混合(在Zephyr上至少混合5min)。将30μl的这种稀释液转移至Nunc F 96-MTP中，并且在添加70μl底物溶液(在测定缓冲液中的0.72mg/ml Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(巴亨L-1400))
后，通过每20sec持续5min在405nm下测量吸光度来确定非应激样品的初始活性(在
SpectraMax Plus上)。从在405nm下的吸光度初始线性增加的斜率确定活性。在密封后，将洗涤剂板在艾本德恒温混匀仪(Eppendorf Thermomixer)中在35℃下进行孵育(未振荡)。
在2.5和23小时孵育后，抽取20μl样品，并且像初始非应激活性一样，测量应激样品的残余活性。

[0430] 在用洗涤剂孵育过程中的活性下降被假定为指数式的。从Log(活性)对孵育时间的线性回归发现半衰期(t1/2)，并且，将半衰期改进因子(t1/2IF)计算为相对于SEQ ID 
NO:2参照的半衰期的蛋白酶同系物的半衰期。

[0431] 表21：标准B中的同系物的储存稳定性。

[0432] t1/2IF：相对于SEQ ID NO:2参照，半衰期改进因子

[0433]

[0434] 表21的结果显示，本发明的多肽的变体至少具有与具有SEQ ID NO:2的蛋白酶相似的储存稳定性。因此，与SEQ ID NO:2具有至少99％序列一致性的蛋白酶具有相似的储存特性。