具有增强特性的硫叶菌磷酸三酯酶样(PLL)内酯酶活性及其用途 |
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申请号 | CN201480027328.0 | 申请日 | 2014-04-14 | 公开(公告)号 | CN105209061A | 公开(公告)日 | 2015-12-30 |
申请人 | 国家科研中心; 艾克斯-马赛大学; | 发明人 | E·查波里雷; M·埃利亚斯; J·海波洛特; D·劳特; | ||||
摘要 | 本 发明 提供了突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,并且衍生自对应于SEQ ID NO:1的共有序列的极端嗜热 磷酸 二酯酶,所述的突变的PTE包含选自53个推定的 位置 中的至少一个突变,并且所述的突变的PTE具有增强的特性。此外,本发明提供了包含突变的极端嗜热PTE的组合物及其用途,尤其是作为有机磷酸酯化合物的 生物 清除剂或者作为使用内酯进行通讯的细菌的群体猝灭剂。 | ||||||
权利要求 | 1.增加极端嗜热磷酸三酯酶的内酯酶催化活性的单一突变的用途,其中所述的极端嗜热磷酸三酯酶具有对应于SEQ ID NO:1的共有序列的序列, |
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说明书全文 | 具有增强特性的硫叶菌磷酸三酯酶样(PLL)内酯酶活性及其用途 [0001] 本发明涉及具有增强特性的硫叶菌磷酸三酯酶样内酯酶(SulfolobalPhosphotriesterase-Like Lactonase,PLL)活性及其用途,尤其是作为有机磷化合物的生物清除剂或者作为使用内酯进行通讯的细菌的群体猝灭剂(quorum quencher)。 [0002] 有机磷酸酯(OP)杀虫剂已经成为目前可以利用的最广泛使用的杀虫剂。在农业上、家庭中、公园和兽医实践中,使用OP。由于大部分的这些化合物抑制了一些酯酶,所以暴露于OP可以通过多个途径导致严重的毒性。OP不可逆地抑制乙酰胆碱酯酶(哺乳动物神经系统的一种重要的酶),导致所有脊椎动物严重的损害。酶功能的损失导致乙酰胆碱在肌体的不同区间中累积,从而导致肌肉收缩、瘫痪和呼吸抑制。肺分泌增加伴有呼吸衰竭是有机磷酸酯中毒而导致死亡的通常原因。 [0003] 在第二次世界大战之前,军队也研发出一些OP。对毒性改善和/或稳定性提高的OP的发现导致化学战剂(CWA)的研发,例如沙林、梭曼、塔崩或VX。此外,OP杀虫剂(与CWA OP相比,容易获得,但是毒性不那么低)构成了人群的重要危险。面对这些增加的威胁,解毒剂的研发便更迫切了。 [0004] 由OP的疏水性,其通过吸入、消化和皮肤渗透而高效地吸收。中毒的发生取决于化合物的吸收速率。根据接触的方法,急性OP中毒的症状在暴露过程中或暴露过程后,在几分钟至几小时内发展。通过吸收而暴露导致毒性症状最快地出现,然后是胃肠道途径,最后是皮肤途径。 [0005] 保护性外套和面具并不总是提供针对OP的有效保护。在通过OP污染皮肤、衣物或头发而中毒的患者中,必须使用手术皂或洗衣店去污剂来进行去污过程。治疗高度污染的人得施用阿托品或安定,其在具有毒蕈碱受体的终末器官中,拮抗过量浓度的乙酰胆碱的作用。不幸的是,阿托品对烟酸作用是无效的,烟酸样作用在严重中毒的情况下具体为肌无力和呼吸抑制。当在中毒后的不到48小时给药磷定(一种胆碱酯酶活化剂)时,其减轻OP中毒的烟酸以及毒蕈碱作用。使用此类化合物对沙林(一旦被吸入,其保持了极快速的作用)是无效的。此外,清洁气道及改善组织氧化也是极有帮助的。 [0006] 尽管上述技术形成了预防中的一些进展,但是现有的对这些中毒的保护以及治疗仍然是不令人满意的。 [0007] 在90年代早期,在几种细菌中识别了最初的OP水解酶(Cheng etal.,1993,Appl.Environ.Microbiol.,59:3138-3140,Raveh et al.,1993,Biochem Pharmacol.,45:2465-2474)。这些酶能够催化OP中磷酯键的水解。不幸的是,由于它们与OP的低化学计量结合能力,所以需要巨大量的酶来治愈中毒的个体。这导致不成比例地且非常昂贵地使用这些酶。 [0008] 统称为磷酸三酯酶(PTE)的一些其他微生物酶显示对于具有P-O或P-S键的有机磷化合物的偏好。这些酶是氨基水解酶超级家族的成员,是催化水解具有不同化学特性的广泛化合物(磷酯、酯、氨基化合物等)的酶。在土壤细菌中分离出它们的编码基因opd(有机磷酸盐降解基因),其中所述的细菌例如有缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta),也称为缺陷短波单胞菌(Brevundominas diminuta)(Munnecke et al.,1976,Appl.Environ.Microbiol.,32:7-13);产 黄 菌 属(Falvobacterium)的 菌 种 (Sethunathan et al.,1973,Can J Microbiol,19:873-875);和放 射形土壤杆 菌(Agrobacterium radiobacter)(Horne et al.,2003,FEMS Microbiol Lett,222:1-8),此外,在古生菌中还识别出类似于opd的基因(Merone et al.,2005,Extremophiles,9:297-305)。由于极端嗜热PTE能够水解杀虫剂以及多种神经试剂,所以极端嗜热PTE的催化特性被广泛研究(Jackson et al.,2005,Biochem Biophys Acta,1752:56-64/Jackson et al.,2008,J Mol Biol,375:1189-1196/Wong et al.,2007,Biochemistry,46:13352-13369/ Elias et al.,2008,J Mol Biol,379:1017-1028/Pompea et al.,2009,Extremophiles,13:461-470)。由于极端嗜热PTE在中等温度下具有抵抗有机溶剂或去污剂的能力,所以其具有非常稳定和廉价生产的优点。因此,极端嗜热PTE有希望用于研发用于神经毒性试剂(OP)的生物清除剂。 [0009] 近来,由硫叶菌属物种(Sulfolobus sp.)分离和纯化出3种极端嗜热PTE:由硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)分离到SsoPox(Merone et al.,2005,Extremophiles,9:297-305);由嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidicaldarius)分离到SacPox(Porzio et al.,2007,Biochimie,89:625-636);以及由冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)分离到SisLac(也称为SisPox)(Gotthard et al.,2011,Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 67:354-357/Hiblot et al.,2012,PLoS One 7:e47028)。SsoPox,SacPox和SisLac为被称为磷酸三酯酶样内酯酶(PLL)的酶家族的成员。系统发育和生化研究表明SsoPox和SisLac酶为被赋予混杂的对氧磷酶活性的天然内酯酶,并且更通常地,具有有机磷酸酯水解酶活性(Afriat et al.,2006,Biochemistry,45:13677-13686/Elias et al.,2012,J Biol Chem.,287(1):11-20)。尽管PTE和PLL酶展现出相同的(β/α)8桶折叠或所谓的TIM桶,但是它们水解不同底物(例如内酯或OP)的能力是不同的。 [0010] 内酯是细菌合成的信号传导分子,从而允许它们用于检测群体的密度。这些细胞至细胞的通讯的过程称为群体感应(QS),并且公知地,用于调控细菌的许多关键生物学功能,包括生物膜形成(Popat et al.,2008,British Medical Bulletin,87:63-75)。QS与毒力之间的连接成为许多细菌感染的发病机理的中心,包括铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)(Sakuragi et al.,2007,J Bacteriol,189:5383-5386),而且还包括鲍曼不动杆菌(A.baumanii)(Stacy et al.,2012,ACS Chem Biol,7(10):1719-1728),伯克霍尔德氏菌属物种(Bulkolderia sp.)(McKeon et al.,2011,J Infect Dis,Feb 1;203(3):383-92),弧菌属(Vibrio)的菌种(Augustine et al.,2010,Arch Microbiol 192(12):1019-1022)或者胡萝卜欧氏杆菌(E.caratovora)(Dong et al.,2001,Nature,411:813-817)。干扰QS系统(也称为群体猝灭)是在植物和动物中控制细菌疾病的有前途的方法(Dong et al.,2001,nature,411:813-817)。N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)为介导许多革兰氏 阴性细菌和一些古细菌有机体的细菌通讯的分子(Zhang et al.,2012,ISME J.,Jul; 6(7):1336-44)。其传统上调节感染和毒力感染。这些分子在介质中累积,从而达到可以改变细菌转录图谱的某一阈值(Hentzer et al.,2003,Embo J,22:3803-3815)。通过水解AHL,内酯酶样PLL可以猝灭细菌之间AHL介导的通讯,如同人类对氧磷酶(Ma et al.,2009,Appl Microbiol Biotechnol,83:135-141) 或 AiiA 内 酯 酶 (Dong et al.,2001,Nature,411:813-817)中可见。由于PLL的双重催化活性(内酯酶和磷酸三酯酶),PLL构成了作为群体淬灭试剂或OP生物清除剂,用于生物技术用途的有高度吸引力的候选物。 [0011] 在WO 2008/145865中,本发明的发明人通过在紧邻SsoPox的活性位点引入突变而提供了具有针对OP更高活性的新型PTE。该工作的主要目的是获得具有接近于一种嗜温PTE的催化性能的新酶。 [0012] 令人吃惊地,本发明人发现在PLL酶的多个β层或环中引入突变不仅增加的OP水解的活性,而且还增加的所述的酶的内酯酶活性。 [0013] 本发明的一个方面提供了具有内酯酶活性的新型突变的极端嗜热PTE,其具有以下2种优点: [0014] -比野生型极端嗜热PTE,针对OP更高的活性,或者针对AHL更高的活性,或者针对OP和针对AHL更高的活性; [0015] -比嗜温PTE更稳定并且更廉价地生产。 [0016] 本发明的另一个方面考虑了用于建立突变的极端嗜热PTE变体文库的方法。 [0017] 本发明的另一个方面提供了用于对材料、皮肤、头发或粘膜的被OP污染的表面进行去污的有效工具。所述的工具可以为具有新的突变的极端嗜热PTE的组合物、生物清除剂、去污盒、去污试剂盒、浸渍材料。 [0018] 本发明的另一个方面提供了能够以降低的成本大规模合成新的突变的极端嗜热PTE的载体和宿主细胞。 [0019] 本发明的另一个方面涉及在对被有机磷化合物污染的材料表面、皮肤或粘膜进行去污的背景下,或者在被有机磷化合物污染的水进行污染控制的背景下,或者在破坏大量神经毒性试剂的背景下,新的突变的极端嗜热PTE作为生物清除剂的用途。 [0020] 本发明的另一个方面提供了包含新的突变的极端嗜热PTE的组合物,该组合物用于治疗由使用AHL进行通讯的细菌所引起的疾病。表达细菌不仅涉及细菌,而且涉及古细菌。 [0021] 本发明的主题是具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE,该突变的极端嗜热PTE由对应于SEQ ID NO:1的共有序列的极端嗜热磷酸三酯酶衍生得到,所述的突变的PTE包含选自以下的至少一个突变:除了位置48、132、166、267、269、272、279、282、283和299以外,SEQ ID NO:1中,位置9处的甘氨酸G、位置10处的赖氨酸K、位置29处的缬氨酸V、位置48处的苯丙氨酸F或亮氨酸L、位置56处的赖氨酸K、位置69处的脯氨酸P、位置70处的苏氨酸T、位置74处的亮氨酸L、位置78处的异亮氨酸I、位置85处的缬氨酸V、位置99处的酪氨酸Y、位置101处的酪氨酸Y、位置124处的异亮氨酸I、位置132处的亮氨酸L或丝氨酸S或天冬酰氨N、位置143处的天冬氨酸D、位置166处的赖氨酸K或天冬酰氨N、位置169处的异亮氨酸I、位置193处的天冬氨酸D、位置195处的甘氨酸G、位置225处的精氨酸R、位置227处的甘氨酸G、位置228处的亮氨酸L、位置230处的亮氨酸L、位置231处的苯丙氨酸F、位置232处的亮氨酸L、位置259处的酪氨酸Y、位置260处的半胱氨酸C、位置261处的半胱氨酸C、位置262处的苏氨酸T、位置263处的异亮氨酸I、位置264处的天冬氨酸D、位置265处的色氨酸W、位置266处的甘氨酸G、位置267处的苏氨酸T或异亮氨酸I、位置268处的丙氨酸A、位置269处的赖氨酸K或精氨酸R、位置270处的脯氨酸P、位置271处的谷氨酸E、位置272处的酪氨酸Y或亮氨酸L、位置273处的赖氨酸K、位置274处的脯氨酸P、位置275处的赖氨酸K、位置276处的亮氨酸L、位置277处的丙氨酸A、位置278处的脯氨酸P、位置279处的精氨酸R或赖氨酸K、位置280处的色氨酸W、位置281处的丝氨酸S、位置282处的异亮氨酸I或蛋氨酸M、位置283处的苏氨酸T或丙氨酸A或丝氨酸S、位置284处的亮氨酸L、位置285处的异亮氨酸I、位置299处的天冬酰氨N或丝氨酸S或苏氨酸T被不同于共有序列中所述的氨基酸的任何其他的天然氨基酸取代,其中所述的取代可以使用共有序列中所述的一种氨基酸来实施,只要所述位置上的所述的取代总是与由上述位置中选择的至少另一种取代相关联;或者通过任何其他的非天然氨基酸来实施,前提条件是当至少一种突变选自位置99处的酪氨酸Y、位置101处的酪氨酸Y、位置225处的精氨酸R、位置260处的半胱氨酸C的取代时,则所述的至少一个突变总是与选自以下的至少一个突变相关联:位置9处的甘氨酸G、位置10处的赖氨酸K、位置48处的苯丙氨酸F或亮氨酸L、位置56处的赖氨酸K、位置78处的异亮氨酸I、位置85处的缬氨酸V、位置 124处的异亮氨酸I、位置132处的亮氨酸L或丝氨酸S或天冬酰氨N、位置166处的赖氨酸K或天冬酰氨N、位置169处的异亮氨酸I、位置193处的天冬氨酸D、位置195处的甘氨酸G、位置230处的亮氨酸L、位置232处的亮氨酸L、位置259处的酪氨酸Y、位置261处的半胱氨酸C、位置262处的苏氨酸T、位置263处的异亮氨酸I、位置264处的天冬氨酸D、位置 266处的甘氨酸G、位置267处的苏氨酸T或异亮氨酸I、位置268处的丙氨酸A、位置269处的赖氨酸K或精氨酸R、位置270处的脯氨酸P、位置271处的谷氨酸E、位置272处的酪氨酸Y或亮氨酸L、位置273处的赖氨酸K、位置274处的脯氨酸P、位置275处的赖氨酸K、位置276处的亮氨酸L、位置277处的丙氨酸A、位置278处的脯氨酸P、位置279处的精氨酸R或赖氨酸K、位置281处的丝氨酸S、位置282处的异亮氨酸I或蛋氨酸M、位置283处的苏氨酸T或丙氨酸A或丝氨酸S、位置284处的亮氨酸L、位置285处的异亮氨酸I、位置 299处的天冬酰氨N或丝氨酸S或苏氨酸T;并且前提条件是当选自位置29处的缬氨酸V、位置69处的脯氨酸P、位置70处的苏氨酸T、位置74处的亮氨酸L、位置143处的天冬氨酸D、位置227处的甘氨酸G、位置228处的亮氨酸L、位置231处的苯丙氨酸F、位置265处的色氨酸W、位置280处的色氨酸W的取代的至少一个突变与选自位置99处的酪氨酸Y、位置101处的酪氨酸Y、位置225处的精氨酸R、位置260处的半胱氨酸C的取代的至少一个突变相关联从而形成相关的突变时,则所述的相关的突变总是与选自以下的取代的至少一个突变相关联的:位置9处的甘氨酸G、位置10处的赖氨酸K、位置48处的苯丙氨酸F或亮氨酸L、位置56处的赖氨酸K、位置78处的异亮氨酸I、位置85处的缬氨酸V、位置124处的异亮氨酸I、位置132处的亮氨酸L或丝氨酸S或天冬酰氨N、位置166处的赖氨酸K或天冬酰氨N、位置169处的异亮氨酸I、位置193处的天冬氨酸D、位置195处的甘氨酸G、位置230处的亮氨酸L、位置232处的亮氨酸L、位置259处的酪氨酸Y、位置261处的半胱氨酸C、位置262处的苏氨酸T、位置263处的异亮氨酸I、位置264处的天冬氨酸D、位置266处的甘氨酸G、位置267处的苏氨酸T或异亮氨酸I、位置268处的丙氨酸A、位置269处的赖氨酸K或精氨酸R、位置270处的脯氨酸P、位置271处的谷氨酸E、位置272处的酪氨酸Y或亮氨酸L、位置273处的赖氨酸K、位置274处的脯氨酸P、位置275处的赖氨酸K、位置 276处的亮氨酸L、位置277处的丙氨酸A、位置278处的脯氨酸P、位置279处的精氨酸R或赖氨酸K、位置281处的丝氨酸S、位置282处的异亮氨酸I或蛋氨酸M、位置283处的苏氨酸T或丙氨酸A或丝氨酸S、位置284处的亮氨酸L、位置285处的异亮氨酸I、位置299处的天冬酰氨N或丝氨酸S或苏氨酸T。 [0022] PTE是最初被鉴定为能够水解含磷酸三酯酶的有机磷化合物的锌-金属蛋白酶,但是最近发现该家族的更多成员还具有内酯酶活性。内酯酶活性能够水解在内酯环中结合的酯。 [0023] 表达“具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE”涉及具有内酯酶和磷酸三酯酶催化活性的任何酶,所述的酶是从属于PLL或PTE超级家族的嗜热或极端嗜热细菌分离的。“超级家族”是指共有相同的折叠(拓扑结构和二级结构元件)以及相同的活性位点结构的一大类蛋白质。超级家族由共有相同的三维结构和功能的几大类蛋白质组成,每类都展现出不同的功能。这些功能通常共有共同的元件(例如在酶催化作用中重要的化学步骤),还具有形成该元件的活性位点的残基。“嗜热细菌”是指在45℃至120℃之间生活的细菌。“极端嗜热细菌”是指其最佳温度高于80℃的细菌。从嗜热或极端嗜热细菌分离的酶的热稳定性赋予它们以廉价生产的优点,一方面是因为它们在有机溶剂中是稳定的(其使得它们更适用于工业过程),另一方面是因为通过加热细胞(生产上述的酶)的细胞裂解物的技术它们可以极为廉价地纯化,因此在一个阶段中获得高的产率和高的纯度。 [0024] 根据本发明试验部分公开的方法,可以在各自的底物上检验内酯酶和磷酸三酯酶的催化活性。 [0025] 值得注意的是,由于在用于构建突变的极端嗜热PTE的载体的克隆位点中对限制性内切酶进行选择,所以由试验方案,在SEQ ID NO:1的位置2处引入氨基酸残基,用于形成不同的突变的极端嗜热PTE。例如在所述的载体的克隆位点使用NcoI限制性内切酶,使得在SEQ ID NO:1的位置2处加入丙氨酸残基,以避免阅读框改变。在SEQ ID NO:1的位置2处引入所述的丙氨酸残基在野生型或突变的极端嗜热PTE的活性中没有作用。这意味着具有由SEQ ID NO:1衍生的序列的2种突变的极端嗜热PTE在性能方面确切地具有相同的酶活性,其中一种突变的极端嗜热PTE在位置2处具有加入的丙氨酸残基,另一种突变的极端嗜热PTE在位置2处不含所述的丙氨酸残基。 [0026] 对于位置48、132、166、267、269、272、279、282、283和299,可以使用共有序列中所述的氨基酸之一进行取代,即,天然极端嗜热PTE中已经存在的氨基酸,只要所述的位置上的所述的取代总是与上述位置中选择的至少任何其他的取代相关联。例如如果位置48处的苯丙氨酸F被亮氨酸L取代,则另一个取代应该至少在所公开的52个其他位置的任意一处进行。 [0027] 第一条款的目的在于排除在SEQ ID NO:1的位置Y99,Y101,R225或C260处的单一突变。当上述位置之一的天然氨基酸突变时,则总是与SEQ ID NO:1的位置G9、K10、F/L48、K56、I78、V85、I124、L/S/N132、K/N166、I169、D193、G195、L230、L232、Y259、C261、T262、I263、D264、G266、T/I267、A268、K/R269、P270、E271、Y/L272、K273、P274、K275、L276、A277、P278、R/K279、S281、I/M282、T/A/S283、L284、I285、N/S/T299处的39个取代的至少一个相关联。 [0028] 第二条款的目的在于排除选自以下的至少一个突变的所有组合:与选自SEQ ID NO:1的位置99处酪氨酸Y、位置101处酪氨酸Y的取代、位置225处精氨酸R的取代、位置260处半胱氨酸C的取代中的至少一种突变相关联的选自位置29处缬氨酸V的取代、位置 69处脯氨酸P的取代、位置70处苏氨酸T的取代、位置74处亮氨酸L的取代、位置143处天冬氨酸D的取代、位置227处甘氨酸G的取代、位置228处亮氨酸L的取代、位置231处苯丙氨酸F的取代、位置265处色氨酸W的取代、位置280处色氨酸W的取代。当发生此类突变的组合,则总是与SEQ ID NO:1的位置G9、K10、F/L48、K56、I78、V85、I124、L/S/N132、K/N166、I169、D193、G195、L230、L232、Y259、C261、T262、I263、D264、G266、T/I267、A268、K/R269、P270、E271、Y/L272、K273、P274、K275、L276、A277、P278、R/K279、S281、I/M282、T/A/S283、L284、I285、N/S/T299处的39个取代的至少一个相关联。 [0029] 上述条款的目的在于排除本发明人之前在WO 2008/145865中公开的一些特定突变的极端嗜热磷酸三酯酶(PTE)。 [0030] 本发明具有内酯酶活性的突变的极端嗜热磷酸三酯酶(PTE)具有比其所衍生来源的具有内酯酶活性的野生型极端嗜热磷酸三酯酶(PTE)更高活性的优点,不仅是在水解OP的背景下,还是在治疗由使用AHL进行通讯的细菌所导致的疾病(值得注意的是水解AHL)的背景下。 [0031] 此外,本发明具有内酯酶活性的极端嗜热PTE在以下背景下还具有比其所衍生来源的野生型极端嗜热PTE更高活性的优点: [0032] -在水解OP的背景下,和/或 [0033] -在群体淬灭的背景下,即,在抵抗病原体感染的背景下。 [0034] 在优选的实施方案中,突变的极端嗜热磷酸三酯酶(PTE)具有内酯酶活性,并且衍生自根据本发明的极端嗜热磷酸三酯酶,其中SEQ ID NO:1中位置2处的氨基酸缺失,所述的突变的PTE包含选自以下的至少一个突变:除了位置47、131、165、266、268、271、278、281、282和298以外,SEQ ID NO:1中,位置8处的甘氨酸G、位置9处的赖氨酸K、位置28处的缬氨酸V、位置47处的苯丙氨酸F或亮氨酸L、位置55处的赖氨酸K、位置68处的脯氨酸P、位置69处的苏氨酸T、位置73处的亮氨酸L、位置77处的异亮氨酸I、位置84处的缬氨酸V、位置98处的酪氨酸Y、位置100处的酪氨酸Y、位置123处的异亮氨酸I、位置131处的亮氨酸L或丝氨酸S或天冬酰氨N、位置142处的天冬氨酸D、位置165处的赖氨酸K或天冬酰氨N、位置168处的异亮氨酸I、位置192处的天冬氨酸D、位置194处的甘氨酸G、位置224处的精氨酸R、位置226处的甘氨酸G、位置227处的亮氨酸L、位置229处的亮氨酸L、位置230处的苯丙氨酸F、位置231处的亮氨酸L、位置258处的酪氨酸Y、位置259处的半胱氨酸C、位置260处的半胱氨酸C、位置261处的苏氨酸T、位置262处的异亮氨酸I、位置263处的天冬氨酸D、位置264处的色氨酸W、位置265处的甘氨酸G、位置266处的苏氨酸T或异亮氨酸I、位置267处的丙氨酸A、位置268处的赖氨酸K或精氨酸R、位置269处的脯氨酸P、位置270处的谷氨酸E、位置271处的酪氨酸Y或亮氨酸L、位置272处的赖氨酸K、位置273处的脯氨酸P、位置274处的赖氨酸K、位置275处的亮氨酸L、位置276处的丙氨酸A、位置277处的脯氨酸P、位置278处的精氨酸R或赖氨酸K、位置279处的色氨酸W、位置280处的丝氨酸S、位置281处的异亮氨酸I或蛋氨酸M、位置282处的苏氨酸T或丙氨酸A或丝氨酸S、位置283处的亮氨酸L、位置284处的异亮氨酸I、位置298处的天冬酰氨N或丝氨酸S或苏氨酸T被不同于共有序列中所述的氨基酸的任何其他的天然氨基酸取代,其中所述的取代可以使用共有序列中所述的一种氨基酸来实施,只要所述位置上的所述的取代总是与由上述位置中选择的至少另一种取代相关联;或者通过任何其他的非天然氨基酸来实施,前提条件是当至少一种突变选自位置98处的酪氨酸Y、位置100处的酪氨酸Y、位置224处的精氨酸R、位置259处的半胱氨酸C的取代时,则所述的至少一个突变总是与选自以下的至少一个突变相关联:位置8处的甘氨酸G、位置9处的赖氨酸K、位置 47处的苯丙氨酸F或亮氨酸L、位置55处的赖氨酸K、位置77处的异亮氨酸I、位置84处的缬氨酸V、位置123处的异亮氨酸I、位置131处的亮氨酸L或丝氨酸S或天冬酰氨N、位置165处的赖氨酸K或天冬酰氨N、位置168处的异亮氨酸I、位置192处的天冬氨酸D、位置194处的甘氨酸G、位置229处的亮氨酸L、位置231处的亮氨酸L、位置258处的酪氨酸Y、位置260处的半胱氨酸C、位置261处的苏氨酸T、位置262处的异亮氨酸I、位置263处的天冬氨酸D、位置265处的甘氨酸G、位置266处的苏氨酸T或异亮氨酸I、位置267处的丙氨酸A、位置268处的赖氨酸K或精氨酸R、位置269处的脯氨酸P、位置270处的谷氨酸E、位置271处的酪氨酸Y或亮氨酸L、位置272处的赖氨酸K、位置273处的脯氨酸P、位置 274处的赖氨酸K、位置275处的亮氨酸L、位置276处的丙氨酸A、位置277处的脯氨酸P、位置278处的精氨酸R或赖氨酸K、位置280处的丝氨酸S、位置281处的异亮氨酸I或蛋氨酸M、位置282处的苏氨酸T或丙氨酸A或丝氨酸S、位置283处的亮氨酸L、位置284处的异亮氨酸I、位置298处的天冬酰氨N或丝氨酸S或苏氨酸T;并且前提条件是当选自位置28处的缬氨酸V、位置68处的脯氨酸P、位置69处的苏氨酸T、位置73处的亮氨酸L、位置142处的天冬氨酸D、位置226处的甘氨酸G、位置227处的亮氨酸L、位置230处的苯丙氨酸F、位置264处的色氨酸W、位置279处的色氨酸W的取代的至少一个突变与选自位置 98处的酪氨酸Y、位置100处的酪氨酸Y、位置224处的精氨酸R、位置259处的半胱氨酸C的取代的至少一个突变相关联从而形成相关的突变时,则所述的相关的突变总是与选自以下的至少一个突变相关联的:位置8处的甘氨酸G、位置9处的赖氨酸K、位置47处的苯丙氨酸F或亮氨酸L、位置55处的赖氨酸K、位置77处的异亮氨酸I、位置84处的缬氨酸V、位置123处的异亮氨酸I、位置131处的亮氨酸L或丝氨酸S或天冬酰氨N、位置165处的赖氨酸K或天冬酰氨N、位置168处的异亮氨酸I、位置192处的天冬氨酸D、位置194处的甘氨酸G、位置229处的亮氨酸L、位置231处的亮氨酸L、位置258处的酪氨酸Y、位置260处的半胱氨酸C、位置261处的苏氨酸T、位置262处的异亮氨酸I、位置263处的天冬氨酸D、位置265处的甘氨酸G、位置266处的苏氨酸T或异亮氨酸I、位置267处的丙氨酸A、位置268处的赖氨酸K或精氨酸R、位置269处的脯氨酸P、位置270处的谷氨酸E、位置271处的酪氨酸Y或亮氨酸L、位置272处的赖氨酸K、位置273处的脯氨酸P、位置274处的赖氨酸K、位置275处的亮氨酸L、位置276处的丙氨酸A、位置277处的脯氨酸P、位置278处的精氨酸R或赖氨酸K、位置280处的丝氨酸S、位置281处的异亮氨酸I或蛋氨酸M、位置 282处的苏氨酸T或丙氨酸A或丝氨酸S、位置283处的亮氨酸L、位置284处的异亮氨酸I、位置298处的天冬酰氨N或丝氨酸S或苏氨酸T。 [0035] 在该优选的实施方案中,SEQ ID NO:1中缺乏位置2处的丙氨酸残基。 [0036] 第一条款的目的在于排除在SEQ ID NO:1的位置Y98,Y100,R224或C259处的单一的突变。当上述位置之一的天然氨基酸突变时,则总是与SEQ ID NO:1的位置G8、K9、F/L47、K55、I77、V84、I123、L/S/N131、K/N165、I168、D192、G194、L229、L231、Y258、C260、T261、I262、D263、G265、T/I266、A267、K/R268、P269、E270、Y/L271、K272、P273、K274、L275、A276、P277、R/K278、S280、I/M281、T/A/S282、L283、I284、N/S/T298处的39个取代的至少一个相关联。 [0037] 第二条款的目的在于排除以下的至少一个突变的所有组合:与选自SEQ ID NO:1的位置98处酪氨酸Y、位置100处酪氨酸Y的取代、位置224处精氨酸R的取代、位置259处半胱氨酸C的取代的至少一种突变相关联的选自位置28处缬氨酸V的取代、位置68处脯氨酸P的取代、位置69处苏氨酸T的取代、位置73处亮氨酸L的取代、位置142处天冬氨酸D的取代、位置226处甘氨酸G的取代、位置227处亮氨酸L的取代、位置230处苯丙氨酸F的取代、位置264处色氨酸W的取代、位置279处色氨酸W的取代。当发生此类突变的组合,则总是与SEQ ID NO:1的位置G8、K9、F/L47、K55、I77、V84、I123、L/S/N131、K/N165、I168、D192、G194、L229、L231、Y258、C260、T261、I262、D263、G265、T/I266、A267、K/R268、P269、E270、Y/L271、K272、P273、K274、L275、A276、P277、R/K278、S280、I/M281、T/A/S282、L283、I284、N/S/T298的39个取代的至少一个相关联。 [0038] 在更优选的实施方案中,根据本发明具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE,对应于SEQ ID NO:3的序列或者与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少70%或更高的同一性,所述的突变的PTE包含选自以下的至少一个突变:SEQ ID NO:3中,位置7处的甘氨酸G、位置8处的赖氨酸K、位置27处的缬氨酸V、位置46处的苯丙氨酸F、位置54处的赖氨酸K、位置67处的脯氨酸P、位置68处的苏氨酸T、位置72处的亮氨酸L、位置76处的异亮氨酸I、位置83处的缬氨酸V、位置97处的酪氨酸Y、位置99处的酪氨酸Y、位置122处的异亮氨酸I、位置130处的亮氨酸L、位置141处的天冬氨酸D、位置164处的赖氨酸K、位置167处的异亮氨酸I、位置191处的天冬氨酸D、位置193处的甘氨酸G、位置223处的精氨酸R、位置225处的甘氨酸G、位置226处的亮氨酸L、位置228处的亮氨酸L、位置229处的苯丙氨酸F、位置230处的亮氨酸L、位置257处的酪氨酸Y、位置258处的半胱氨酸C、位置259处的半胱氨酸C、位置260处的苏氨酸T、位置261处的异亮氨酸I、位置262处的天冬氨酸D、位置263处的色氨酸W、位置264处的甘氨酸G、位置265处的苏氨酸T、位置266处的丙氨酸A、位置267处的赖氨酸K、位置268处的脯氨酸P、位置269处的谷氨酸E、位置270处的酪氨酸Y、位置271处的赖氨酸K、位置272处的脯氨酸P、位置273处的赖氨酸K、位置274处的亮氨酸L、位置275处的丙氨酸A、位置276处的脯氨酸P、位置277处的精氨酸R、位置278处的色氨酸W、位置279处的丝氨酸S、位置280处的异亮氨酸I、位置281处的苏氨酸T、位置282处的亮氨酸L、位置283处的异亮氨酸I、位置297处的天冬酰氨N被任何其他的天然或非天然氨基酸取代,前提条件是当至少一种突变选自位置97处的酪氨酸Y、位置99处的酪氨酸Y、位置223处的精氨酸R、位置258处的半胱氨酸C的取代时,则所述的至少一个突变总是与选自以下的至少一个突变相关联:位置7处的甘氨酸G、位置8处的赖氨酸K、位置46处的苯丙氨酸F、位置54处的赖氨酸K、位置76处的异亮氨酸I、位置83处的缬氨酸V、位置122处的异亮氨酸I、位置130处的亮氨酸L、位置164处的赖氨酸K、位置167处的异亮氨酸I、位置191处的天冬氨酸D、位置193处的甘氨酸G、位置228处的亮氨酸L、位置230处的亮氨酸L、位置257处的酪氨酸Y、位置259处的半胱氨酸C、位置260处的苏氨酸T、位置261处的异亮氨酸I、位置262处的天冬氨酸D、位置264处的甘氨酸G、位置265处的苏氨酸T、位置266处的丙氨酸A、位置267处的赖氨酸K、位置268处的脯氨酸P、位置269处的谷氨酸E、位置270处的酪氨酸Y、位置271处的赖氨酸K、位置272处的脯氨酸P、位置273处的赖氨酸K、位置274处的亮氨酸L、位置275处的丙氨酸A、位置276处的脯氨酸P、位置277处的精氨酸R、位置279处的丝氨酸S、位置280处的异亮氨酸I、位置281处的苏氨酸T、位置282处的亮氨酸L、位置283处的异亮氨酸I、位置297处的天冬酰氨N;并且前提条件是当选自位置27处的缬氨酸V、位置67处的脯氨酸P、位置68处的苏氨酸T、位置72处的亮氨酸L、位置141处的天冬氨酸D、位置225处的甘氨酸G、位置226处的亮氨酸L、位置229处的苯丙氨酸F、位置263处的色氨酸W、位置278处的色氨酸W的取代的至少一个突变与选自位置97处的酪氨酸Y、位置99处的酪氨酸Y、位置223处的精氨酸R、位置258处的半胱氨酸C的取代的至少一个突变相关联从而形成相关的突变时,则所述的相关的突变总是与选自以下的取代的至少一个突变相关联的:位置7处的甘氨酸G、位置8处的赖氨酸K、位置46处的苯丙氨酸F、位置54处的赖氨酸K、位置76处的异亮氨酸I、位置83处的缬氨酸V、位置122处的异亮氨酸I、位置130处的亮氨酸L、位置164处的赖氨酸K、位置167处的异亮氨酸I、位置191处的天冬氨酸D、位置193处的甘氨酸G、位置228处的亮氨酸L、位置230处的亮氨酸L、位置257处的酪氨酸Y、位置259处的半胱氨酸C、位置260处的苏氨酸T、位置261处的异亮氨酸I、位置262处的天冬氨酸D、位置264处的甘氨酸G、位置265处的苏氨酸T、位置266处的丙氨酸A、位置267处的赖氨酸K、位置 268处的脯氨酸P、位置269处的谷氨酸E、位置270处的酪氨酸Y、位置271处的赖氨酸K、位置272处的脯氨酸P、位置273处的赖氨酸K、位置274处的亮氨酸L、位置275处的丙氨酸A、位置276处的脯氨酸P、位置277处的精氨酸R、位置279处的丝氨酸S、位置280处的异亮氨酸I、位置281处的苏氨酸T、位置282处的亮氨酸L、位置283处的异亮氨酸I、位置 297处的天冬酰氨N。 [0039] 在该更优选的实施方案中,SEQ ID NO:1中缺乏位置2处的丙氨酸残基和位置3处的苏氨酸残基。 [0040] 第一条款的目的在于排除在SEQ ID NO:1的位置Y97、Y99、R223或C258处的单一的突变。当上述位置之一的天然氨基酸突变时,则总是与SEQ ID NO:1的位置G7、K8、F46、K54、I76、V83、I122、L130、K164、I167、D191、G193、L228、L230、Y257、C259、T260、I261、D262、G264、T265、A266、K267、P268、E269、Y270、K271、P272、K273、L274、A275、P276、R277、S279、I280、T281、L282、I283、N297处的39个取代的至少一个相关联。 [0041] 第二条款的目的在于排除选自以下的至少一个突变的所有组合:与选自SEQ ID NO:1的位置97处酪氨酸Y、位置99处酪氨酸Y的取代、位置223处精氨酸R的取代、位置258处半胱氨酸C的取代的至少一种突变相关联的选自位置27处缬氨酸V的取代、位置67处脯氨酸P的取代、位置68处苏氨酸T的取代、位置72处亮氨酸L的取代、位置141处天冬氨酸D的取代、位置225处甘氨酸G的取代、位置226处亮氨酸L的取代、位置229处苯丙氨酸F的取代、位置263处色氨酸W的取代、位置278处色氨酸W的取代。当发生此类突变的组合,则总是与SEQ ID NO:1的位置G7、K8、F46、K54、I76、V83、I122、L130、K164、I167、D191、G193、L228、L230、Y257、C259、T260、I261、D262、G264、T265、A266、K267、P268、E269、Y270、K271、P272、K273、L274、A275、P276、R277、S279、I280、T281、L282、I283、N297的39个取代的至少一个相关联。 [0042] 本发明更具体地涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,并且衍生自根据本发明的极端嗜热磷酸三酯酶,其中SEQ ID NO:1中位置2处的氨基酸缺失,所述的突变的PTE包含选自以下的至少一个突变:SEQ ID NO:1中,位置28处的缬氨酸V、位置68处的脯氨酸P、位置69处的苏氨酸T、位置73处的亮氨酸L、位置98处的酪氨酸Y、位置100的酪氨酸Y、位置142处的天冬氨酸D、位置224处的精氨酸R、位置226处的甘氨酸G、位置227处的亮氨酸L、位置230处的苯丙氨酸F、位置259处的半胱氨酸C、位置264处的色氨酸W、位置279处的色氨酸W被不同于共有序列中所述的氨基酸的任何其他天然氨基酸或者被任何其他的非天然氨基酸取代。 [0043] 在甚至更具体的实施方案中,上述突变的极端嗜热PTE具有内酯酶活性,并且衍生自根据本发明的极端嗜热磷酸三酯酶,其中SEQ ID NO:1中位置2处的氨基酸缺失,所述的突变的PTE仅包含一个突变,所述的突变选自:SEQ ID NO:1中,位置28处的缬氨酸V、位置68处的脯氨酸P、位置69处的苏氨酸T、位置73处的亮氨酸L、位置142处的天冬氨酸D、位置226处的甘氨酸G、位置227处的亮氨酸L、位置230处的苯丙氨酸F、位置264处的色氨酸W、位置279处的色氨酸W被不同于共有序列中所述的氨基酸的任何其他天然氨基酸或者被任何其他的非天然氨基酸取代。 [0044] 在更具体的实施方案中,上述突变的极端嗜热PTE具有内酯酶活性,并且衍生自根据本发明的极端嗜热磷酸三酯酶,其中SEQ ID NO:1中位置2处的氨基酸缺失,所述的突变的PTE包含选自以下的至少一个突变:SEQ ID NO:1中,位置8处的甘氨酸G、位置9处的赖氨酸K、位置47处的苯丙氨酸F或亮氨酸L、位置55处的赖氨酸K、位置77处的异亮氨酸I、位置84处的缬氨酸V、位置123处的异亮氨酸I、位置131处的亮氨酸L或丝氨酸S或天冬酰氨N、位置165处的赖氨酸K或天冬酰氨N、位置168处的异亮氨酸I、位置192处的天冬氨酸D、位置194处的甘氨酸G、位置229处的亮氨酸L、位置231处的亮氨酸L、位置258处的酪氨酸Y、位置260处的半胱氨酸C、位置261处的苏氨酸T、位置262处的异亮氨酸I、位置263处的天冬氨酸D、位置265处的甘氨酸G、位置266处的苏氨酸T或异亮氨酸I、位置267处的丙氨酸A、位置268处的赖氨酸K或精氨酸R、位置269处的脯氨酸P、位置270处的谷氨酸E、位置271处的酪氨酸Y或亮氨酸L、位置272处的赖氨酸K、位置273处的脯氨酸P、位置274处的赖氨酸K、位置275处的亮氨酸L、位置276处的丙氨酸A、位置277处的脯氨酸P、位置278处的精氨酸R或赖氨酸K、位置280处的丝氨酸S、位置281处的异亮氨酸I或蛋氨酸M、位置282处的苏氨酸T或丙氨酸A或丝氨酸S、位置283处的亮氨酸L、位置284处的异亮氨酸I、位置298处的天冬酰胺N或丝氨酸S或苏氨酸T被不同于共有序列中所述的氨基酸的任何其他天然氨基酸或者被任何其他的非天然氨基酸取代。 [0045] 在更具体的实施方案中,上述突变的极端嗜热PTE具有内酯酶活性,并且衍生自根据本发明的极端嗜热磷酸三酯酶,其中SEQ ID NO:1中位置2处的氨基酸缺失,所述的突变的PTE仅包含一个突变,所述的突变选自:SEQ ID NO:1中,位置8处的甘氨酸G、位置9处的赖氨酸K、位置47处的苯丙氨酸F或亮氨酸L、位置55处的赖氨酸K、位置77处的异亮氨酸I、位置84处的缬氨酸V、位置123处的异亮氨酸I、位置131处的亮氨酸L或丝氨酸S或天冬酰氨N、位置165处的赖氨酸K或天冬酰氨N、位置168处的异亮氨酸I、位置192处的天冬氨酸D、位置194处的甘氨酸G、位置229处的亮氨酸L、位置231处的亮氨酸L、位置258处的酪氨酸Y、位置260处的半胱氨酸C、位置261处的苏氨酸T、位置262处的异亮氨酸I、位置263处的天冬氨酸D、位置265处的甘氨酸G、位置266处的苏氨酸T或异亮氨酸I、位置267处的丙氨酸A、位置268处的赖氨酸K或精氨酸R、位置269处的脯氨酸P、位置 270处的谷氨酸E、位置271处的酪氨酸Y或亮氨酸L、位置272处的赖氨酸K、位置273处的脯氨酸P、位置274处的赖氨酸K、位置275处的亮氨酸L、位置276处的丙氨酸A、位置277处的脯氨酸P、位置278处的精氨酸R或赖氨酸K、位置280处的丝氨酸S、位置281处的异亮氨酸I或蛋氨酸M、位置282处的苏氨酸T或丙氨酸A或丝氨酸S、位置283处的亮氨酸L、位置284处的异亮氨酸I、位置298处的天冬酰胺N或丝氨酸S或苏氨酸T被不同于共有序列中所述的氨基酸的任何其他天然氨基酸或者被任何其他的非天然氨基酸取代。 [0046] 本发明的更具体的主题为上述具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE,其衍生自对应于序列SEQ ID NO:3的硫磺矿硫化叶菌的极端嗜热PTE,或者衍生自对应于序列SEQ ID NO:5的嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的极端嗜热PTE,或者衍生自对应于SEQ ID NO:7的冰岛硫化叶菌的极端嗜热PTE,所述序列SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7属于共有序列SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:5中缺失SEQ ID NO:1中位置2处的氨基酸,SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:7中缺失SEQ ID NO:1中位置2和3处的氨基酸。 [0047] 本发明更具体的涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自根据本发明的极端嗜热磷酸三酯酶,其中SEQ ID NO:1中位置2处的氨基酸缺失,并且其中至少一个突变选自: [0048] -位置8处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是STA,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0049] -位置9处的赖氨酸K被选自RHDEC,特别是EDR,尤其是E的带电荷的氨基酸取代, [0050] -位置28处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是GIFA,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0051] -位置47处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是LYW,尤其是L的极性氨基酸取代;或者位置47处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是YW的极性氨基酸取代, [0052] -位置55处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IRL,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0053] -位置69处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN,特别是VAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0054] -位置73处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是CAMI,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0055] -位置77处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是PTV,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0056] -位置84处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是AGI,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0057] -位置98处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是FCLW,尤其是W的疏水性氨基酸取代, [0058] -位置100处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是GEWF,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0059] -位置123处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是LAV,尤其是L的非大型氨基酸取代, [0060] -位置131处的亮氨酸L或丝氨酸S或天冬酰氨N被选自GPIVADCT,特别是PT,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0061] -位置142处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE,特别是SET,尤其是T的极性氨基酸取代, [0062] -位置165处的赖氨酸K被选自WYSTCNQRHDE,特别是NQR,尤其是N的极性氨基酸取代;或者位置165处的天冬酰氨N被选自WYSTCQRKHDE,特别是QR的极性氨基酸取代,[0063] -位置194处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCNQRKHDE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0064] -位置224处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNKHDE,特别是CSTAH,尤其是AC的极性氨基酸取代, [0065] -位置227处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是AIVH,尤其是V的极性氨基酸取代, [0066] -位置229处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWYC,特别是IM,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0067] -位置230处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN,特别是LTAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0068] -位置231处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN,特别是PVA,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0069] -位置259处的半胱氨酸C被选自VILMFGAPWY,特别是YLIA,尤其是LA的疏水性氨基酸取代, [0070] -位置262处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC,特别是FWC,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0071] -位置264处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSTN,特别是ALMFCITV,尤其是F的非大型氨基酸取代,前提条件是SEQ ID NO:3中,位置264处的色氨酸W没有被苯丙氨酸F取代, [0072] -位置275处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是AVP,尤其是P的疏水性氨基酸取代, [0073] -位置276处的丙氨酸A被选自VILMFGPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVDCSTN,特别是NVMT,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0074] -位置281处的异亮氨酸I或蛋氨酸M被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLFGAPWYC,特别是TYP,尤其是T的疏水性氨基酸取代, [0075] -位置283处的亮氨酸L被选自EKHRQYWFM,特别是FMH,尤其是M的大型氨基酸取代, [0076] -以及位置298处的天冬酰氨N或丝氨酸S或苏氨酸T被选自WYCQRKHDE,尤其是Q的极性氨基酸取代。 [0077] 在位置G8、K9、V28、F/L47、K55、T69、L73、I77、V84、Y98、Y100、I123、L/S/N131、D142、K/N165、G194、R224、L227、L229、F230、L231、C259、I262、W264、L275、A276、I/M281、L283和N/S/T298中的这29个具体的取代属于被称为组1的第一组取代。 [0078] 这些位置被认为是调控酶活性的重要位置,并且还涉及AHL底物在酶的活性位点中的容量。所述的位置通过定向进化策略来鉴定。 [0079] 术语“取代”是指一个氨基酸被另一个氨基酸替代。取代可以是保守的,即,取代的氨基酸被相同结构或具有相同物理化学特性的氨基酸(极性、疏水性、酸性、碱性氨基酸)替代,这样蛋白质的三维结构保持不变;或者被相反的非保守的氨基酸替代。 [0080] 当组1与序列有关时,其是指在所述的序列中,发生所述组的至少一个取代。 [0081] 本发明更具体的涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自根据本发明的极端嗜热磷酸三酯酶,其中SEQ ID NO:1中位置2处的氨基酸缺失,并且其中至少一个突变选自: [0082] -位置168处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是VAL,尤其是V的疏水性氨基酸取代, [0083] -位置192处的天冬氨酸D被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0084] -位置258处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWC,特别是CSVW,尤其是C的疏水性氨基酸取代, [0085] -位置260处的半胱氨酸C被选自GPLIVADSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWY,特别是SFWV,尤其是S的疏水性氨基酸取代, [0086] -位置261处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSCQNRKHE,特别是GH,尤其是G的极性氨基酸取代, [0087] -位置263处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE的极性氨基酸取代,或者被选自GPLIVACSTN,特别是SLH的非大型氨基酸取代, [0088] -位置265处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFAPWYC,特别是AVP的疏水性氨基酸取代, [0089] -位置266处的苏氨酸T或异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLVADCSN,特别是VWP,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0090] -位置267处的丙氨酸A被选自WYSTCQNRKHDE,特别是NQ,尤其是N的极性氨基酸取代, [0091] -位置268处的赖氨酸K或精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IAP,尤其是IP的疏水性氨基酸取代, [0092] -位置269处的脯氨酸P被选自VILMFGACWY,特别是MCL,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0093] -位置270处的谷氨酸E被选自WYSTCQNRKHD,特别是DQ,尤其是D的极性氨基酸取代, [0094] -位置271处的酪氨酸Y或亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWC,特别是VA的疏水性氨基酸取代, [0095] -位置272处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是MLA的疏水性氨基酸取代, [0096] -位置273处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是DEL,尤其是DL的极性氨基酸取代, [0097] -位置274处的赖氨酸K被选自GLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRHD,特别是R的极性氨基酸取代, [0098] -位置277处的脯氨酸P被选自EHKRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAWYC,特别是KAV,尤其是K的疏水性氨基酸取代, [0099] -位置278处的精氨酸R或赖氨酸K被选自WYSTCQNHDE,特别是DNQ,尤其是DN的大型氨基酸取代, [0100] -位置280处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYTCQNRKHDE,特别是GH的极性氨基酸取代, [0101] -位置282处的苏氨酸T或丙氨酸A或丝氨酸S被选自GPLIVDCN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGPWYC,特别是LV,尤其是L的疏水性氨基酸取代, [0102] -以及位置284处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是VAL,尤其是V的非大型氨基酸取代。 [0103] 在位置I168、D192、Y258、C260、T261、D263、G265、T/I266、A267、K/R268、P269、E270、Y/L271、K272、P273、K274、P277、R/K278、S280、T/A/S282和I 284中的这21个具体的取代属于被称为组2的第二组取代。 [0104] 这些位置主要涉及在酶的活性位点中的AHL底物容留(accomodation)。通过分析酶家族的进化史来选择这些位置。 [0105] 当组2与序列有关时,其是指在所述的序列中,发生所述组的至少一个取代。 [0106] 本发明更具体的涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自根据本发明的极端嗜热磷酸三酯酶,其中SEQ ID NO:1中位置2处的氨基酸缺失,并且其中至少一个突变选自: [0107] -位置68处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN,特别是GAV的非大型氨基酸取代,[0108] -位置226处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是AVP的非大型氨基酸取代,[0109] -以及位置279处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自RKHDEC,特别是RKDI,尤其是R的带电荷的氨基酸取代。 [0110] 在位置P68、G226和W279中的这3个具体的取代属于被称为组3的第三组取代。 [0111] 这些位置高度疑似与酶的酶活性有关。 [0112] 当组3与序列有关时,其是指在所述的序列中,发生所述组的至少一个取代。 [0113] 本发明更具体的涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自根据本发明的极端嗜热磷酸三酯酶,其中SEQ ID NO:1中位置2处的氨基酸缺失,并且其中至少一个突变选自: [0114] -位置8处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是STA,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0115] -位置9处的赖氨酸K被选自RHDEC,特别是EDR,尤其是E的带电荷的氨基酸取代, [0116] -位置28处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是GIFA,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0117] -位置47处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是LYW,尤其是L的极性氨基酸取代;或者位置47处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是YW的极性氨基酸取代, [0118] -位置55处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IRL,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0119] -位置69处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN,特别是VAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0120] -位置73处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是CAMI,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0121] -位置77处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是PTV,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0122] -位置84处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是AGI,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0123] -位置98处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是FCLW,尤其是W的疏水性氨基酸取代, [0124] -位置100处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是GEWF,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0125] -位置123处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是LAV,尤其是L的非大型氨基酸取代, [0126] -位置131处的亮氨酸L或丝氨酸S或天冬酰氨N被选自GPIVADCT,特别是PT,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0127] -位置142处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE,特别是SET,尤其是T的极性氨基酸取代, [0128] -位置165处的赖氨酸K被选自WYSTCNQRHDE,特别是NQR,尤其是N的极性氨基酸取代,或者位置165处的天冬酰氨N被选自WYSTCQRKHDE,特别是QR的极性氨基酸取代,[0129] -位置194处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCNQRKHDE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0130] -位置224处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNKHDE,特别是CSTAH,尤其是AC的极性氨基酸取代, [0131] -位置227处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是AIVH,尤其是V的极性氨基酸取代, [0132] -位置229处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWYC,特别是IM,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0133] -位置230处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN,特别是LTAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0134] -位置231处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN,特别是PVA,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0135] -位置259处的半胱氨酸C被选自VILMFGAPWY,特别是YLIA,尤其是LA的疏水性氨基酸取代, [0136] -位置262处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC,特别是FWC,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0137] -位置264处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSTN,特别是ALMFCITV,尤其是F的非大型氨基酸取代,前提条件是SEQ ID NO:3中,位置264处的色氨酸W不能被苯丙氨酸F取代, [0138] -位置275处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是AVP,尤其是P的疏水性氨基酸取代, [0139] -位置276处的丙氨酸A被选自VILMFGPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVDCSTN,特别是NVMT,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0140] -位置281处的异亮氨酸I或蛋氨酸M被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLFGAPWYC,特别是TYP,尤其是T的疏水性氨基酸取代, [0141] -位置283处的亮氨酸L被选自EKHRQYWFM,特别是FMH,尤其是M的大型氨基酸取代, [0142] -以及位置298处的天冬酰氨N或丝氨酸S或苏氨酸T被选自WYCQRKHDE,尤其是Q的极性氨基酸取代, [0143] 并且进一步包含选自以下的至少一个突变: [0144] -位置168处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是VAL,尤其是V的疏水性氨基酸取代, [0145] -位置192处的天冬氨酸D被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0146] -位置258处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWC,特别是CSVW,尤其是C的疏水性氨基酸取代, [0147] -位置260处的半胱氨酸C被选自GPLIVADSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWY,特别是SFWV,尤其是S的疏水性氨基酸取代, [0148] -位置261处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSCQNRKHE,特别是GH,尤其是G的极性氨基酸取代, [0149] -位置263处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE的极性氨基酸取代,或者被选自GPLIVACSTN,特别是SLH的非大型氨基酸取代, [0150] -位置265处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFAPWYC,特别是AVP的疏水性氨基酸取代, [0151] -位置266处的苏氨酸T或异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLVADCSN,特别是VWP,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0152] -位置267处的丙氨酸A被选自WYSTCQNRKHDE,特别是NQ,尤其是N的极性氨基酸取代, [0153] -位置268处的赖氨酸K或精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IAP,尤其是IP的疏水性氨基酸取代, [0154] -位置269处的脯氨酸P被选自VILMFGACWY,特别是MCL,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0155] -位置270处的谷氨酸E被选自WYSTCQNRKHD,特别是DQ,尤其是D的极性氨基酸取代, [0156] -位置271处的酪氨酸Y或亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWC,特别是VA的疏水性氨基酸取代, [0157] -位置272处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是MLA的疏水性氨基酸取代, [0158] -位置273处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是DEL,尤其是DL的极性氨基酸取代, [0159] -位置274处的赖氨酸K被选自GLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRHD,特别是R的极性氨基酸取代, [0160] -位置277处的脯氨酸P被选自EHKRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAWYC,特别是KAV,尤其是K的疏水性氨基酸取代, [0161] -位置278处的精氨酸R或赖氨酸K被选自WYSTCQNHDE,特别是DNQ,尤其是DN的极性氨基酸取代, [0162] -位置280处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYTCQNRKHDE,特别是GH的极性氨基酸取代, [0163] -位置282处的苏氨酸T或丙氨酸A或丝氨酸S被选自GPLIVDCN的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGPWYC,特别是LV,尤其是L的疏水性氨基酸取代, [0164] -以及位置284处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是VAL,尤其是V的非大型氨基酸取代。 [0165] 这意味着在位置G8、K9、V28、F/L47、K55、T69、L73、I77、V84、Y98、Y100、I123、L/S/N131、D142、N165、G194、R224、L227、L229、F230、L231、C259、I262、W264、L275、A276、I/M281、L283和N/S/T298中组1的29个具体的取代中至少一个取代可以与位置I168、D192、Y258、C260、T261、D263、G265、T/I266、A267、K/R268、P269、E270、Y/L271、K272、P273、K274、P277、R/K278、S280、T/A/S282和I284中组2的21个具体的取代中的至少一个取代相关联。 [0166] 本发明甚至更具体的涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自根据本发明的极端嗜热磷酸三酯酶,其中SEQ ID NO:1中位置2处的氨基酸缺失,并且其中至少一个突变选自: [0167] -位置8处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是STA,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0168] -位置9处的赖氨酸K被选自RHDEC,特别是EDR,尤其是E的带电荷的氨基酸取代, [0169] -位置28处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是GIFA,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0170] -位置47处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是LYW,尤其是L的极性氨基酸取代;或者位置47处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是YW的极性氨基酸取代, [0171] -位置55处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IRL,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0172] -位置69处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN,特别是VAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0173] -位置73处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是CAMI,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0174] -位置77处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是PTV,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0175] -位置84处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是AGI,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0176] -位置98处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是FCLW,尤其是W的疏水性氨基酸取代, [0177] -位置100处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是GEWF,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0178] -位置123处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是LAV,尤其是L的非大型氨基酸取代, [0179] -位置131处的亮氨酸L或丝氨酸S或天冬酰氨N被选自GPIVADCT,特别是PT,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0180] -位置142处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE,特别是SET,尤其是T的极性氨基酸取代, [0181] -位置165处的赖氨酸K被选自WYSTCNQRHDE,特别是NQR,尤其是N的极性氨基酸取代;或者位置165处的天冬酰氨N被选自WYSTCQRKHDE,特别是QR的极性氨基酸取代,[0182] -位置194处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCNQRKHDE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0183] -位置224处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNKHDE,特别是CSTAH,尤其是AC的极性氨基酸取代, [0184] -位置227处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是AIVH,尤其是V的极性氨基酸取代, [0185] -位置229处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWYC,特别是IM,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0186] -位置230处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN,特别是LTAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0187] -位置231处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN,特别是PVA,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0188] -位置259处的半胱氨酸C被选自VILMFGAPWY,特别是YLIA,尤其是LA的疏水性氨基酸取代, [0189] -位置262处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC,特别是FWC,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0190] -位置264处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSTN,特别是ALMFCITV,尤其是F的非大型氨基酸取代,前提条件是SEQ ID NO:3中,位置264处的色氨酸W不能被苯丙氨酸F取代, [0191] -位置275处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是AVP,尤其是P的疏水性氨基酸取代, [0192] -位置276处的丙氨酸A被选自VILMFGPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVDCSTN,特别是NVMT,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0193] -位置281处的异亮氨酸I或蛋氨酸M被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLFGAPWYC,特别是TYP,尤其是T的疏水性氨基酸取代, [0194] -位置283处的亮氨酸L被选自EKHRQYWFM,特别是FMH,尤其是M的大型氨基酸取代, [0195] -以及位置298处的天冬酰氨N或丝氨酸S或苏氨酸T被选自WYCQRKHDE,尤其是Q的极性氨基酸取代, [0196] 进一步包含选自以下的至少一个突变: [0197] -位置68处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN,特别是GAV的非大型氨基酸取代,[0198] -位置226处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是AVP的非大型氨基酸取代,[0199] -以及位置279处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自RKHDEC,特别是RKDI,尤其是R的带电荷的氨基酸取代。 [0200] 这意味着在位置G8、K9、V28、F/L47、K55、T69、L73、I77、V84、Y98、Y100、I123、L/S/N131、D142、N165、G194、R224、L227、L229、F230、L231、C259、I262、W264、L275、A276、I/M281、L283和N/S/T298中组1的29个具体的取代中的至少一个取代可以与位置P68、G226和W279中组3的3个具体的取代中的至少一个取代相关联。 [0201] 本发明甚至更具体的涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自根据本发明的极端嗜热磷酸三酯酶,其中SEQ ID NO:1中位置2处的氨基酸缺失,并且其中至少一个突变选自: [0202] -位置8处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是STA,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0203] -位置9处的赖氨酸K被选自RHDEC,特别是EDR,尤其是E的带电荷的氨基酸取代, [0204] -位置28处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是GIFA,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0205] -位置47处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是LYW,尤其是L的极性氨基酸取代;或者位置47处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是YW的极性氨基酸取代, [0206] -位置55处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IRL,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0207] -位置69处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN,特别是VAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0208] -位置73处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是CAMI,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0209] -位置77处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是PTV,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0210] -位置84处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是AGI,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0211] -位置98处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是FCLW,尤其是W的疏水性氨基酸取代, [0212] -位置100处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是GEWF,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0213] -位置123处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是LAV,尤其是L的非大型氨基酸取代, [0214] -位置131处的亮氨酸L或丝氨酸S或天冬酰氨N被选自GPIVADCT,特别是PT,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0215] -位置142处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE,特别是SET,尤其是T的极性氨基酸取代, [0216] -位置165处的赖氨酸K被选自WYSTCNQRHDE,特别是NQR,尤其是N的极性氨基酸取代;或者位置165处的天冬酰氨N被选自WYSTCQRKHDE,特别是QR的极性氨基酸取代,[0217] -位置194处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCNQRKHDE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0218] -位置224处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNKHDE,特别是CSTAH,尤其是AC的极性氨基酸取代, [0219] -位置227处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是AIVH,尤其是V的极性氨基酸取代, [0220] -位置229处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWYC,特别是IM,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0221] -位置230处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN,特别是LTAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0222] -位置231处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN,特别是PVA,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0223] -位置259处的半胱氨酸C被选自VILMFGAPWY,特别是YLIA,尤其是LA的疏水性氨基酸取代, [0224] -位置262处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC,特别是FWC,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0225] -位置264处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSTN,特别是ALMFCITV,尤其是F的非大型氨基酸取代,前提条件是SEQ ID NO:3中,位置264处的色氨酸W不能被苯丙氨酸F取代, [0226] -位置275处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是AVP,尤其是P的疏水性氨基酸取代, [0227] -位置276处的丙氨酸A被选自VILMFGPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVDCSTN,特别是NVMT,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0228] -位置281处的异亮氨酸I或蛋氨酸M被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLFGAPWYC,特别是TYP,尤其是T的疏水性氨基酸取代, [0229] -位置283处的亮氨酸L被选自EKHRQYWFM,特别是FMH,尤其是M的大型氨基酸取代, [0230] -以及位置298处的天冬酰氨N或丝氨酸S或苏氨酸T被选自WYCQRKHDE,尤其是Q的极性氨基酸取代, [0231] 进一步包含选自以下的至少一个突变: [0232] -位置168处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是VAL,尤其是V的疏水性氨基酸取代, [0233] -位置192处的天冬氨酸D被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0234] -位置258处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWC,特别是CSVW,尤其是C的疏水性氨基酸取代, [0235] -位置260处的半胱氨酸C被选自GPLIVADSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWY,特别是SFWV,尤其是S的疏水性氨基酸取代, [0236] -位置261处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSCQNRKHE,特别是GH,尤其是G的极性氨基酸取代, [0237] -位置263处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE的极性氨基酸取代,或者被选自GPLIVACSTN,特别是SLH的非大型氨基酸取代, [0238] -位置265处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFAPWYC,特别是AVP的疏水性氨基酸取代, [0239] -位置266处的苏氨酸T或异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLVADCSN,特别是VWP,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0240] -位置267处的丙氨酸A被选自WYSTCQNRKHDE,特别是NQ,尤其是N的极性氨基酸取代, [0241] -位置268处的赖氨酸K或精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IAP,尤其是IP的疏水性氨基酸取代, [0242] -位置269处的脯氨酸P被选自VILMFGACWY,特别是MCL,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0243] -位置270处的谷氨酸E被选自WYSTCQNRKHD,特别是DQ,尤其是D的极性氨基酸取代, [0244] -位置271处的酪氨酸Y或亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWC,特别是VA的疏水性氨基酸取代, [0245] -位置272处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是MLA的疏水性氨基酸取代, [0246] -位置273处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是DEL,尤其是DL的极性氨基酸取代, [0247] -位置274处的赖氨酸K被选自GLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRHD,特别是R的极性氨基酸取代, [0248] -位置277处的脯氨酸P被选自EHKRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAWYC,特别是KAV,尤其是K的疏水性氨基酸取代, [0249] -位置278处的精氨酸R或赖氨酸K被选自WYSTCQNHDE,特别是DNQ,尤其是DN的极性氨基酸取代, [0250] -位置280处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYTCQNRKHDE,特别是GH的极性氨基酸取代, [0251] -位置282处的苏氨酸T或丙氨酸A或丝氨酸S被选自GPLIVDCN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGPWYC,特别是LV,尤其是L的疏水性氨基酸取代, [0252] -以及位置284处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是VAL,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0253] 进一步包含选自以下的至少一种突变: [0254] -位置68处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN,特别是GAV的非大型氨基酸取代,[0255] -位置226处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是AVP的非大型氨基酸取代,[0256] -以及位置279处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自RKHDEC,特别是RKDI,尤其是R的带电荷的氨基酸取代。 [0257] 这意味着在位置G8、K9、V28、F/L47、K55、T69、L73、I77、V84、Y98、Y100、I123、L/S/N131、D142、N165、G194、R224、L227、L229、F230、L231、C259、I262、W264、L275、A276、I/M281、L283和N/S/T298中组1的29个具体的取代中的至少一个取代可以I168,D192,Y258,C260,T261,D263,G265,T/I266,A267,K/R268,P269,E270,Y/L271,K272,P273,K274,P277,R/K278,S280,T/A/S282和I284中组2的21个具体的取代中的至少一个取代以及与位置P68、G226和W279中组3的3个具体的取代中的至少一个取代相关联。 [0258] 本发明甚至更具体的涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自根据本发明的极端嗜热磷酸三酯酶,其中SEQ ID NO:1中位置2处的氨基酸缺失,并且其中至少一个突变选自: [0259] -位置168处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是VAL,尤其是V的疏水性氨基酸取代, [0260] -位置192处的天冬氨酸D被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0261] -位置258处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWC,特别是CSVW,尤其是C的疏水性氨基酸取代, [0262] -位置260处的半胱氨酸C被选自GPLIVADSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWY,特别是SFWV,尤其是S的疏水性氨基酸取代, [0263] -位置261处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSCQNRKHE,特别是GH,尤其是G的极性氨基酸取代, [0264] -位置263处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE的非大型氨基酸取代,或者被选自GPLIVACSTN,特别是SLH的非大型氨基酸取代, [0265] -位置265处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFAPWYC,特别是AVP的疏水性氨基酸取代, [0266] -位置266处的苏氨酸T或异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLVADCSN,特别是VWP,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0267] -位置267处的丙氨酸A被选自WYSTCQNRKHDE,特别是NQ,尤其是N的极性氨基酸取代, [0268] -位置268处的赖氨酸K或精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IAP,尤其是IP的疏水性氨基酸取代, [0269] -位置269处的脯氨酸P被选自VILMFGACWY,特别是MCL,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0270] -位置270处的谷氨酸E被选自WYSTCQNRKHD,特别是DQ,尤其是D的极性氨基酸取代, [0271] -位置271处的酪氨酸Y或亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWC,特别是VA的疏水性氨基酸取代, [0272] -位置272处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是MLA的疏水性氨基酸取代, [0273] -位置273处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是DEL,尤其是DL的极性氨基酸取代, [0274] -位置274处的赖氨酸K被选自GLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRHD,特别是R的极性氨基酸取代, [0275] -位置277处的脯氨酸P被选自EHKRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAWYC,特别是KAV,尤其是K的疏水性氨基酸取代, [0276] -位置278处的精氨酸R或赖氨酸K被选自WYSTCQNHDE,特别是DNQ,尤其是DN的极性氨基酸取代, [0277] -位置280处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYTCQNRKHDE,特别是GH的极性氨基酸取代, [0278] -位置282处的苏氨酸T或丙氨酸A或丝氨酸S被选自GPLIVDCN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGPWYC,特别是LV,尤其是L的疏水性氨基酸取代, [0279] -以及位置284处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是VAL,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0280] 进一步包含选自以下的至少一个突变: [0281] -位置68处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN,特别是GAV的非大型氨基酸取代,[0282] -位置226处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是AVP的非大型氨基酸取代,[0283] -以及位置279处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自RKHDEC,特别是RKDI,尤其是R的带电荷的氨基酸取代。 [0284] 这意味着在位置I168、D192、Y258、C260、T261、D263、G265、T/I266、A267、K/R268、P269、E270、Y/L271、K272、P273、K274、P277、R/K278、S280、T/A/S282和I284中组2的21个具体的取代中的至少一个取代可以与位置P68、G226和W279中组3的3个具体的取代中的至少一个取代相关联。 [0285] 本发明甚至更具体地涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:3的硫磺矿硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且所述的突变的PTE包含选自以下的至少一个突变:SEQ ID NO:3中,位置27处的缬氨酸V,位置67处的脯氨酸P,位置68处的苏氨酸T,位置72处的亮氨酸L,位置97处的酪氨酸Y,位置99处的酪氨酸Y,位 置141处的天冬氨酸D,位置223处的精氨酸R,位置225处的甘氨酸G,位置226处的亮 氨酸L,位置229处的苯丙氨酸F,位置258处的半胱氨酸C,位置263处的色氨酸W和位 置278处的色氨酸W被任何其他天然的或非天然的氨基酸取代。 [0286] 在甚至更具体的实施方案中,具有内酯酶活性的、衍生自对应于序列SEQ ID NO:3的硫磺矿硫化叶菌的上述突变的极端嗜热PTE仅包含一个突变,所述的突变选自:SEQ ID NO:3中,位置27处的缬氨酸V,位置67处的脯氨酸P,位置68处的苏氨酸T,位置72处的亮氨酸L,位置141处的天冬氨酸D,位置225处的甘氨酸G,位置226处的亮氨酸L,位 置229处的苯丙氨酸F,位置263处的色氨酸W和位置278处的色氨酸W被任何其他天然 的或非天然的氨基酸取代。 [0287] 在更具体的实施方案中,上述突变的极端嗜热PTE具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:3的硫磺矿硫化叶菌的极端嗜热PTE,并包含选自以下的至少一个突变:SEQ ID NO:3中,位置7处的甘氨酸G,位置8处的赖氨酸K,位置46处的苯丙氨酸F,位 置54处的赖氨酸K,位置76处的异亮氨酸I,位置83处的缬氨酸V,位置122处的异亮氨 酸I,位置130处的亮氨酸L,位置164处的赖氨酸K,位置167处的异亮氨酸I,位置191 处的天冬氨酸D,位置193处的甘氨酸G,位置228处的亮氨酸L,位置230处的亮氨酸L, 位置257处的酪氨酸Y,位置259处的半胱氨酸C,位置260处的苏氨酸T,位置261处的 异亮氨酸I,位置262处的天冬氨酸D,位置264处的甘氨酸G,位置265处的苏氨酸T,位 置266处的丙氨酸A,位置267处的赖氨酸K,位置268处的脯氨酸P,位置269处的谷氨 酸E,位置270处的酪氨酸Y,位置271处的赖氨酸K,位置272处的脯氨酸P,位置273处 的赖氨酸K,位置274处的亮氨酸L,位置275处的丙氨酸A,位置276处的脯氨酸P,位置 277处的精氨酸R,位置279处的丝氨酸S,位置280处的异亮氨酸I,位置281处的苏氨酸 T,位置282处的亮氨酸L,位置283处的异亮氨酸I和位置297处的天冬酰氨N被任何其 他天然的或非天然的氨基酸取代。 [0288] 在甚至更具体的实施方案中,上述突变的极端嗜热PTE具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:3的硫磺矿硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且仅包含一个突变,所述的突变选自:SEQ ID NO:3中,位置7处的甘氨酸G,位置8处的赖氨酸K,位置46处的苯丙氨酸F,位置54处的赖氨酸K,位置76处的异亮氨酸I,位置83处的缬氨酸V,位置122处的异亮氨酸I,位置130处的亮氨酸L,位置164处的赖氨酸K,位置167处的异亮氨酸I, 位置191处的天冬氨酸D,位置193处的甘氨酸G,位置228处的亮氨酸L,位置230处的 亮氨酸L,位置257处的酪氨酸Y,位置259处的半胱氨酸C,位置260处的苏氨酸T,位置 261处的异亮氨酸I,位置262处的天冬氨酸D,位置264处的甘氨酸G,位置265处的苏 氨酸T,位置266处的丙氨酸A,位置267处的赖氨酸K,位置268处的脯氨酸P,位置269 处的谷氨酸E,位置270处的酪氨酸Y,位置271处的赖氨酸K,位置272处的脯氨酸P,位 置273处的赖氨酸K,位置274处的亮氨酸L,位置275处的丙氨酸A,位置276处的脯氨 酸P,位置277处的精氨酸R,位置279处的丝氨酸S,位置280处的异亮氨酸I,位置281 处的苏氨酸T,位置282处的亮氨酸L,位置283处的异亮氨酸I和位置297处的天冬酰氨 N被任何其他天然的或非天然的氨基酸取代。 [0289] 本发明更具体地涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:3的硫磺矿硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0290] -位置7处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是STA,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0291] -位置8处的赖氨酸K被选自RHDEC,特别是EDR,尤其是E的带电荷的氨基酸取代, [0292] -位置27处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是GIFA,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0293] -位置46处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是LYW,尤其是L的极性氨基酸取代, [0294] -位置54处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IRL,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0295] -位置68处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN,特别是VAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0296] -位置72处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是CAMI,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0297] -位置76处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是PTV,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0298] -位置83处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是AGI,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0299] -位置97处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是FCLW,尤其是W的疏水性氨基酸取代, [0300] -位置99处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是GEWF,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0301] -位置122处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是LAV,尤其是L的非大型氨基酸取代, [0302] -位置130处的亮氨酸L被选自GPLIVADCSTN,特别是PST,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0303] -位置141处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE,特别是SET,尤其是T的极性氨基酸取代, [0304] -位置164处的赖氨酸K被选自WYSTCQNRHDE,特别是NQR,尤其是N的极性氨基酸取代, [0305] -位置193处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCNQRKHDE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0306] -位置223处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNKHDE,特别是CSTAH,尤其是AC的极性氨基酸取代, [0307] -位置226处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是AIVH,尤其是V的极性氨基酸取代, [0308] -位置228处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWYC,特别是IM,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0309] -位置229处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN,特别是LTAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0310] -位置230处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN,特别是PVA,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0311] -位置258处的半胱氨酸C被选自VILMFGAPWY,特别是YLIA,尤其是LA的疏水性氨基酸取代, [0312] -位置261处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC,特别是FWC,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0313] -位置263处的色氨酸W被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMGAPYC,特别是ALMCITV的疏水性氨基酸取代, [0314] -位置274处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是AVP,尤其是P的疏水性氨基酸取代, [0315] -位置275处的丙氨酸A被选自VILMFGPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVDCSTN,特别是NVMT,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0316] -位置280处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是TMYP,尤其是T的疏水性氨基酸取代, [0317] -位置282处的亮氨酸L被选自EKHRQYWFM,特别是FMH,尤其是M的大型氨基酸取代, [0318] -以及位置297处的天冬酰氨N被选自WYSTCQRKHDE,特别是QST,尤其是S的极性氨基酸取代。 [0319] 位置G7、K8、V27、F46、K54、T68、L72、I76、V83、Y97、Y99、I122、L130、D141、N164、G193、R223、L226、L228、F229、L230、C258、I261、W263、L274、A275、I280、L282和N297中的这些29个具体的取代属于被称为组4的第四组取代。 [0320] 本发明更具体地涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:3的硫磺矿硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0321] -位置167处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是VAL,尤其是V的疏水性氨基酸取代, [0322] -位置191处的天冬氨酸D被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0323] -位置257处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWC,特别是CSVW,尤其是C的疏水性氨基酸取代, [0324] -位置259处的半胱氨酸C被选自GPLIVADSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWY,特别是SFWV,尤其是S的疏水性氨基酸取代, [0325] -位置260处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSCQNRKHE,特别是GH,尤其是G的极性氨基酸取代, [0326] -位置262处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE的极性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSTN,特别是SLH的非大型氨基酸取代, [0327] -位置264处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFAPWYC,特别是AVP的疏水性氨基酸取代, [0328] -位置265处的苏氨酸T被选自VILMFGAPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSN,特别是VWP,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0329] -位置266处的丙氨酸A被选自WYSTCQNRKHDE,特别是NQ,尤其是N的极性氨基酸取代, [0330] -位置267处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IAP,尤其是IP的疏水性氨基酸取代, [0331] -位置268处的脯氨酸P被选自VILMFGAWYC,特别是MCL,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0332] -位置269处的谷氨酸E被选自WYSTCQNRKHD,特别是DQ,尤其是D的极性氨基酸取代, [0333] -位置270处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是VAL的疏水性氨基酸取代, [0334] -位置271处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是MLA的疏水性氨基酸取代, [0335] -位置272处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是DEL,尤其是DL的极性氨基酸取代, [0336] -位置273处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRHD,特别是RP的极性氨基酸取代, [0337] -位置276处的脯氨酸P被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAWYC,特别是KAV,尤其是K的疏水性氨基酸取代, [0338] -位置277处的精氨酸R被选自WYSTCQNKHDE,特别是DNQ,尤其是DN的极性氨基酸取代, [0339] -位置279处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYTCQNRKHDE,特别是GH的极性氨基酸取代, [0340] -位置281处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是ALV,尤其是AL的疏水性氨基酸取代, [0341] -以及位置283处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是VAL,尤其是V的非大型氨基酸取代。 [0342] 位置I167、D191、Y257、C259、T260、D262、G264、T265、A266、K267、P268、E269、Y270、K271、P272、K273、P276、R277、S279、T281和I283中的这些21个具体的取代属于被称为组5的第五组取代。 [0343] 本发明更具体地涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:3的硫磺矿硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0344] -位置67处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN,特别是GAV的非大型氨基酸取代,[0345] -位置225处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是AVP的非大型氨基酸取代,[0346] -以及位置278处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自RKHDEC,特别是RKDI,尤其是R的带电荷的氨基酸取代。 [0347] 位置P67、G225和W278中的这些3个具体的取代属于组6的第六组取代。 [0348] 此外,本发明还涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:3的硫磺矿硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0349] -位置7处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是STA,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0350] -位置8处的赖氨酸K被选自RHDEC,特别是EDR,尤其是E的带电荷的氨基酸取代, [0351] -位置27处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是GIFA,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0352] -位置46处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是LYW,尤其是L的极性氨基酸取代, [0353] -位置54处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IRL,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0354] -位置68处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN,特别是VAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0355] -位置72处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是CAMI,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0356] -位置76处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是PTV,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0357] -位置83处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是AGI,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0358] -位置97处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是FCLW,尤其是W的疏水性氨基酸取代, [0359] -位置99处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是GEWF,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0360] -位置122处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是LAV,尤其是L的非大型氨基酸取代, [0361] -位置130处的亮氨酸L被选自GPLIVADCSTN,特别是PST,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0362] -位置141处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE,特别是SET,尤其是T的极性氨基酸取代, [0363] -位置164处的赖氨酸K被选自WYSTCQNRHDE,特别是NQR,尤其是N的极性氨基酸取代, [0364] -位置193处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCNQRKHDE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0365] -位置223处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNKHDE,特别是CSTAH,尤其是AC的极性氨基酸取代, [0366] -位置226处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是AIVH,尤其是V的极性氨基酸取代, [0367] -位置228处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWYC,特别是IM,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0368] -位置229处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN,特别是LTAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0369] -位置230处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN,特别是PVA,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0370] -位置258处的半胱氨酸C被选自VILMFGAPWY,特别是YLIA,尤其是LA的疏水性氨基酸取代, [0371] -位置261处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC,特别是FWC,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0372] -位置263处的色氨酸W被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMGAPYC,特别是ALMCITV的疏水性氨基酸取代, [0373] -位置274处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是AVP,尤其是P的疏水性氨基酸取代, [0374] -位置275处的丙氨酸A被选自VILMFGPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVDCSTN,特别是NVMT,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0375] -位置280处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是TMYP,尤其是T的疏水性氨基酸取代, [0376] -位置282处的亮氨酸L被选自EKHRQYWFM,特别是FMH,尤其是M的大型氨基酸取代, [0377] -以及位置297处的天冬酰氨N被选自WYSTCQRKHDE,特别是QST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0378] 进一步包含选自以下的至少一个突变: [0379] -位置167处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是VAL,尤其是V的疏水性氨基酸取代, [0380] -位置191处的天冬氨酸D被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0381] -位置257处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWC,特别是CSVW,尤其是C的疏水性氨基酸取代, [0382] -位置259处的半胱氨酸C被选自GPLIVADSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWY,特别是SFWV,尤其是S的疏水性氨基酸取代, [0383] -位置260处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSCQNRKHE,特别是GH,尤其是G的极性氨基酸取代, [0384] -位置262处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE的极性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSTN,特别是SLH的非大型氨基酸取代, [0385] -位置264处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFAPWYC,特别是AVP的疏水性氨基酸取代, [0386] -位置265处的苏氨酸T被选自VILMFGAPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSN,特别是VWP,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0387] -位置266处的丙氨酸A被选自WYSTCQNRKHDE,特别是NQ,尤其是N的极性氨基酸取代, [0388] -位置267处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IAP,尤其是IP的疏水性氨基酸取代, [0389] -位置268处的脯氨酸P被选自VILMFGAWYC,特别是MCL,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0390] -位置269处的谷氨酸E被选自WYSTCQNRKHD,特别是DQ,尤其是D的极性氨基酸取代, [0391] -位置270处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是VAL的疏水性氨基酸取代, [0392] -位置271处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是MLA的疏水性氨基酸取代, [0393] -位置272处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是DEL,尤其是DL的极性氨基酸取代, [0394] -位置273处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRHD,特别是RP的极性氨基酸取代, [0395] -位置276处的脯氨酸P被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAWYC,特别是KAV,尤其是K的疏水性氨基酸取代, [0396] -位置277处的精氨酸R被选自WYSTCQNKHDE,特别是DNQ,尤其是DN的极性氨基酸取代, [0397] -位置279处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYTCQNRKHDE,特别是GH的极性氨基酸取代, [0398] -位置281处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是ALV,尤其是AL的疏水性氨基酸取代, [0399] -以及位置283处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是VAL,尤其是V的非大型氨基酸取代。 [0400] 这意味着在位置G7、K8、V27、F46、K54、T68、L72、I76、V83、Y97、Y99、I122、L130、D141、N164、G193、R223、L226、L228、F229、L230、C258、I261、W263、L274、A275、I280、L282和N297中组4的29个具体的取代中的至少一个取代可以与位置I167、D191、Y257、C259、T260、D262、G264、T265、A266、K267、P268、E269、Y270、K271、P272、K273、P276、R277、S279、T281中组5的21个具体的取代中的至少一个取代相关联。 [0401] 此外,本发明还涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:3的硫磺矿硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0402] -位置7处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是STA,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0403] -位置8处的赖氨酸K被选自RHDEC,特别是EDR,尤其是E的带电荷的氨基酸取代, [0404] -位置27处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是GIFA,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0405] -位置46处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是LYW,尤其是L的极性氨基酸取代, [0406] -位置54处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IRL,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0407] -位置68处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN,特别是VAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0408] -位置72处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是CAMI,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0409] -位置76处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是PTV,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0410] -位置83处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是AGI,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0411] -位置97处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是FCLW,尤其是W的疏水性氨基酸取代, [0412] -位置99处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是GEWF,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0413] -位置122处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是LAV,尤其是L的非大型氨基酸取代, [0414] -位置130处的亮氨酸L被选自GPLIVADCSTN,特别是PST,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0415] -位置141处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE,特别是SET,尤其是T的极性氨基酸取代, [0416] -位置164处的赖氨酸K被选自WYSTCQNRHDE,特别是NQR,尤其是N的极性氨基酸取代, [0417] -位置193处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCNQRKHDE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0418] -位置223处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNKHDE,特别是CSTAH,尤其是AC的极性氨基酸取代, [0419] -位置226处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是AIVH,尤其是V的极性氨基酸取代, [0420] -位置228处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWYC,特别是IM,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0421] -位置229处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN,特别是LTAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0422] -位置230处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN,特别是PVA,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0423] -位置258处的半胱氨酸C被选自VILMFGAPWY,特别是YLIA,尤其是LA的疏水性氨基酸取代, [0424] -位置261处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC,特别是FWC,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0425] -位置263处的色氨酸W被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMGAPYC,特别是ALMCITV的疏水性氨基酸取代, [0426] -位置274处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是AVP,尤其是P的疏水性氨基酸取代, [0427] -位置275处的丙氨酸A被选自VILMFGPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVDCSTN,特别是NVMT,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0428] -位置280处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是TMYP,尤其是T的疏水性氨基酸取代, [0429] -位置282处的亮氨酸L被选自EKHRQYWFM,特别是FMH,尤其是M的大型氨基酸取代, [0430] -以及位置297处的天冬酰氨N被选自WYSTCQRKHDE,特别是QST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0431] 进一步包含选自以下的至少一个突变: [0432] -位置67处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN,特别是GAV的非大型氨基酸取代,[0433] -位置225处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是AVP的非大型氨基酸取代,[0434] -以及位置278处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自RKHDEC,特别是RKDI,尤其是R的带电荷的氨基酸取代。 [0435] 这意味着在位置G7、K8、V27、F46、K54、T68、L72、I76、V83、Y97、Y99、I122、L130、D141、N164、G193、R223、L226、L228、F229、L230、C258、I261、W263、L274、A275、I280、L282和N297中组4的29个具体的取代中的至少一个取代可以与位置P67、G225和W278中组6的3个具体的取代中的至少一个取代相关联。 [0436] 此外,本发明还涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:3的硫磺矿硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0437] -位置7处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是STA,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0438] -位置8处的赖氨酸K被选自RHDEC,特别是EDR,尤其是E的带电荷的氨基酸取代, [0439] -位置27处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是GIFA,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0440] -位置46处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是LYW,尤其是L的极性氨基酸取代, [0441] -位置54处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IRL,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0442] -位置68处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN,特别是VAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0443] -位置72处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是CAMI,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0444] -位置76处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是PTV,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0445] -位置83处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是AGI,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0446] -位置97处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是FCLW,尤其是W的疏水性氨基酸取代, [0447] -位置99处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是GEWF,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0448] -位置122处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是LAV,尤其是L的非大型氨基酸取代, [0449] -位置130处的亮氨酸L被选自GPLIVADCSTN,特别是PST,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0450] -位置141处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE,特别是SET,尤其是T的极性氨基酸取代, [0451] -位置164处的赖氨酸K被选自WYSTCQNRHDE,特别是NQR,尤其是N的极性氨基酸取代, [0452] -位置193处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCNQRKHDE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0453] -位置223处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNKHDE,特别是CSTAH,尤其是AC的极性氨基酸取代, [0454] -位置226处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是AIVH,尤其是V的极性氨基酸取代, [0455] -位置228处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWYC,特别是IM,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0456] -位置229处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN,特别是LTAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0457] -位置230处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN,特别是PVA,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0458] -位置258处的半胱氨酸C被选自VILMFGAPWY,特别是YLIA,尤其是LA的疏水性氨基酸取代, [0459] -位置261处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC,特别是FWC,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0460] -位置263处的色氨酸W被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMGAPYC,特别是ALMCITV的疏水性氨基酸取代, [0461] -位置274处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是AVP,尤其是P的疏水性氨基酸取代, [0462] -位置275处的丙氨酸A被选自VILMFGPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVDCSTN,特别是NVMT,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0463] -位置280处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是TMYP,尤其是T的疏水性氨基酸取代, [0464] -位置282处的亮氨酸L被选自EKHRQYWFM,特别是FMH,尤其是M的大型氨基酸取代, [0465] -以及位置297处的天冬酰氨N被选自WYSTCQRKHDE,特别是QST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0466] 进一步包含选自以下的至少一个突变: [0467] -位置167处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是VAL,尤其是V的疏水性氨基酸取代, [0468] -位置191处的天冬氨酸D被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0469] -位置257处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWC,特别是CSVW,尤其是C的疏水性氨基酸取代, [0470] -位置259处的半胱氨酸C被选自GPLIVADSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWY,特别是SFWV,尤其是S的疏水性氨基酸取代, [0471] -位置260处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSCQNRKHE,特别是GH,尤其是G的极性氨基酸取代, [0472] -位置262处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE的极性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSTN,特别是SLH的非大型氨基酸取代, [0473] -位置264处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFAPWYC,特别是AVP的疏水性氨基酸取代, [0474] -位置265处的苏氨酸T被选自VILMFGAPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSN,特别是VWP,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0475] -位置266处的丙氨酸A被选自WYSTCQNRKHDE,特别是NQ,尤其是N的极性氨基酸取代, [0476] -位置267处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IAP,尤其是IP的疏水性氨基酸取代, [0477] -位置268处的脯氨酸P被选自VILMFGAWYC,特别是MCL,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0478] -位置269处的谷氨酸E被选自WYSTCQNRKHD,特别是DQ,尤其是D的极性氨基酸取代, [0479] -位置270处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是VAL的疏水性氨基酸取代, [0480] -位置271处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是MLA的疏水性氨基酸取代, [0481] -位置272处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是DEL,尤其是DL的极性氨基酸取代, [0482] -位置273处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRHD,特别是RP的极性氨基酸取代, [0483] -位置276处的脯氨酸P被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAWYC,特别是KAV,尤其是K的疏水性氨基酸取代, [0484] -位置277处的精氨酸R被选自WYSTCQNKHDE,特别是DNQ,尤其是DN的极性氨基酸取代, [0485] -位置279处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYTCQNRKHDE,特别是GH的极性氨基酸取代, [0486] -位置281处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是ALV,尤其是AL的疏水性氨基酸取代, [0487] -以及位置283处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是VAL,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0488] 进一步包含选自以下的至少一个突变: [0489] -位置67处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN,特别是GAV的非大型氨基酸取代,[0490] -位置225处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是AVP的非大型氨基酸取代,[0491] -以及位置278处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自RKHDEC,特别是RKDI,尤其是R的带电荷的氨基酸取代。 [0492] 这意味着在位置G7、K8、V27、F46、K54、T68、L72、I76、V83、Y97、Y99、I122、L130、D141、N164、G193、R223、L226、L228、F229、L230、C258、I261、W263、L274、A275、I280、L282和N297中组4的29个具体的取代中的至少一个取代可以与位置I167、D191、Y257、C259、T260、D262、G264、T265、A266、K267、P268、E269、Y270、K271、P272、K273、P276、R277、S279、T281中组5的21个具体的取代中的至少一个取代、以及位置P67、G225和W278中组6的3个具体的取代中的至少一个取代相关联。 [0493] 此外,本发明还涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:3的硫磺矿硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0494] -位置167处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是VAL,尤其是V的疏水性氨基酸取代, [0495] -位置191处的天冬氨酸D被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0496] -位置257处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWC,特别是CSVW,尤其是C的疏水性氨基酸取代, [0497] -位置259处的半胱氨酸C被选自GPLIVADSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWY,特别是SFWV,尤其是S的疏水性氨基酸取代, [0498] -位置260处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSCQNRKHE,特别是GH,尤其是G的极性氨基酸取代, [0499] -位置262处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE的极性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSTN,特别是SLH的非大型氨基酸取代, [0500] -位置264处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFAPWYC,特别是AVP的疏水性氨基酸取代, [0501] -位置265处的苏氨酸T被选自VILMFGAPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSN,特别是VWP,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0502] -位置266处的丙氨酸A被选自WYSTCQNRKHDE,特别是NQ,尤其是N的极性氨基酸取代, [0503] -位置267处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IAP,尤其是IP的疏水性氨基酸取代, [0504] -位置268处的脯氨酸P被选自VILMFGAWYC,特别是MCL,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0505] -位置269处的谷氨酸E被选自WYSTCQNRKHD,特别是DQ,尤其是D的极性氨基酸取代, [0506] -位置270处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是VAL的疏水性氨基酸取代, [0507] -位置271处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是MLA的疏水性氨基酸取代, [0508] -位置272处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是DEL,尤其是DL的极性氨基酸取代, [0509] -位置273处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRHD,特别是RP的极性氨基酸取代, [0510] -位置276处的脯氨酸P被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAWYC,特别是KAV,尤其是K的疏水性氨基酸取代, [0511] -位置277处的精氨酸R被选自WYSTCQNKHDE,特别是DNQ,尤其是DN的极性氨基酸取代, [0512] -位置279处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYTCQNRKHDE,特别是GH的极性氨基酸取代, [0513] -位置281处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是ALV,尤其是AL的疏水性氨基酸取代, [0514] -以及位置283处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是VAL,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0515] 进一步包含选自以下的至少一个突变: [0516] -位置67处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN,特别是GAV的非大型氨基酸取代,[0517] -位置225处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是AVP的非大型氨基酸取代,[0518] -以及位置278处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自RKHDEC,特别是RKDI,尤其是R的带电荷的氨基酸取代。 [0519] 这意味着在位置I167、D191、Y257、C259、T260、D262、G264、T265、A266、K267、P268、E269、Y270、K271、P272、K273、P276、R277、S279、T281中组5的21个具体的取代中的至少一个取代可以与位置P67、G225和W278中组6的3个具体的取代中的至少一个取代相关联。 [0520] 本发明更具体的主体为突变的极端嗜热PTE,其具有根据本发明的内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:3的硫磺矿硫化叶菌的极端嗜热PTE,所述的突变的极端嗜热PTE对应于以下序列: [0521] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:9包含以下一个突变:位置263处的色氨酸W被蛋氨酸M取代, [0522] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:11包含以下一个突变:位置263处的色氨酸W被亮氨酸L取代, [0523] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:13包含以下一个突变:位置263处的色氨酸W被丙氨酸A取代, [0524] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:15包含以下一个突变:位置263处的色氨酸W被异亮氨酸I取代, [0525] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:17包含以下一个突变:位置263处的色氨酸W被缬氨酸V取代, [0526] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:19包含以下一个突变:位置263处的色氨酸W被苏氨酸T取代, [0527] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:21包含以下3个突变:位置258处的半胱氨酸C被亮氨酸L取代,位置261处的异亮氨酸I被苯丙氨酸F取代,位置263处的色氨酸W被丙氨酸A取代, [0528] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:23包含以下4个突变:位置27处的缬氨酸V被丙氨酸A取代,位置97处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置228处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代,位置263处的色氨酸W被蛋氨酸M取代, [0529] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:25包含以下4个突变:位置27处的缬氨酸V被丙氨酸A取代,位置97处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置263处的色氨酸W被亮氨酸L取代,位置280处的异亮氨酸I被苏氨酸T取代, [0530] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:27包含以下4个突变:位置46处的苯丙氨酸F被亮氨酸L取代,位置258处的半胱氨酸C被丙氨酸A取代,位置263处的色氨酸W被蛋氨酸M取代,位置280处的异亮氨酸I被苏氨酸T取代, [0531] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:29包含以下6个突变:位置27处的缬氨酸V被丙氨酸A取代,位置76处的异亮氨酸I被苏氨酸T取代,位置97处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置99处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置130处的亮氨酸L被脯氨酸P取代,位置226处的亮氨酸L被缬氨酸V取代, [0532] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:31包含以下6个突变:位置72处的亮氨酸L被异亮氨酸I取代,位置99处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置122处的异亮氨酸I被亮氨酸L取代,位置228处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代,位置229处的苯丙氨酸F被丝氨酸S取代,位置263处的色氨酸W被亮氨酸L取代, [0533] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:33包含以下7个突变:位置68处的苏氨酸T被丝氨酸S取代,位置72处的亮氨酸L被异亮氨酸I取代,位置130处的亮氨酸L被脯氨酸P取代,位置228处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代,位置229处的苯丙氨酸F被丝氨酸S取代,位置263处的色氨酸W被蛋氨酸M取代,位置274处的亮氨酸L被脯氨酸P取代, [0534] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:35包含以下6个突变:位置68处的苏氨酸T被丝氨酸S取代,位置76处的异亮氨酸I被苏氨酸T取代,位置97处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置99处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置228处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代,位置263处的色氨酸W被亮氨酸L取代, [0535] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:37包含以下5个突变:位置8处的赖氨酸K被谷氨酸E取代,位置46处的苯丙氨酸F被亮氨酸L取代,位置97处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置99处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置228处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代,[0536] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:39包含以下2个突变:位置72处的亮氨酸L被异亮氨酸I取代,位置263处的色氨酸W被苯丙氨酸F取代, [0537] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:41包含以下5个突变:位置68处的苏氨酸T被丝氨酸S取代,位置97处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置99处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置130处的亮氨酸L被脯氨酸P取代,位置228处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代,[0538] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:43包含以下4个突变:位置27处的缬氨酸V被丙氨酸A取代,位置46处的苯丙氨酸F被亮氨酸L取代,位置226处的亮氨酸L被缬氨酸V取代,位置263处的色氨酸W被亮氨酸L取代, [0539] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:45包含以下8个突变:位置67处的脯氨酸P被缬氨酸V取代,位置68处的苏氨酸T被丝氨酸S取代,位置97处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置99处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置228处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代,位置258处的半胱氨酸C被丙氨酸A取代,位置263处的色氨酸W被亮氨酸L取代,位置280处的异亮氨酸I被苏氨酸T取代, [0540] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:47包含以下8个突变:位置46处的苯丙氨酸F被亮氨酸L取代,位置68处的苏氨酸T被丝氨酸S取代,位置97处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置99处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置130处的亮氨酸L被脯氨酸P取代,位置164处的赖氨酸K被天冬酰氨N取代,位置226处的亮氨酸L被缬氨酸V取代,位置263处的色氨酸W被蛋氨酸M取代, [0541] -对应于SEQ ID NO:3的SEQ ID NO:49包含以下5个突变:位置68处的苏氨酸T被丝氨酸S取代,位置72处的亮氨酸L被异亮氨酸I取代,位置97处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置99处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置130处的亮氨酸L被脯氨酸P取代。 [0542] 上述突变的极端嗜热PTE的编码序列具有根据本发明的内酯酶活性,并且衍生自对应于SEQ ID NO:3以及对应于以下序列SEQ ID NO:8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48的硫磺矿硫化叶菌的极端嗜热PTE,该突变的极端嗜热PTE也是本发明的一部分。 [0543] 此外,本发明还涉及突变的极端嗜热PTE,其具有根据本发明的内酯酶活性,并且衍生自对应于SEQ ID NO:3的硫磺矿硫化叶菌的极端嗜热PTE,所述的突变的极端嗜热PTE对应于以下序列SEQ ID NO:139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177和179,以及它们各自的编码序列SEQ ID NO:138、140、142、 144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176和178。 [0544] 本发明的更具体的主题为具有内酯酶活性的上述突变的极端嗜热PTE,其中与盐桥有关的至少一个氨基酸通过取代或删除而修饰,这样与其中与盐桥有关的氨基酸是未修饰的、具有内酯酶活性的突变极端嗜热PTE的活化温度相比,所述的具有内酯酶活性的突变极端嗜热PTE的活化温度降低。 [0545] “取代”是指一个氨基酸被另一个氨基酸替代。“删除”是指氨基酸的除去,这样经历所述删除的蛋白质序列比未经历所述删除的序列更短。 [0546] 在优选的实施方案中,与上述提及的盐桥有关的氨基酸可以被至少2个氨基酸替代。这则是“加入”,并且经历所述加入的蛋白质序列比未经历所述加入的序列更长。 [0547] 根据本发明定义的取代同等地涉及天然或非天然(人造)的氨基酸。因此,与盐桥有关的氨基酸可以被天然或人工的氨基酸替代。 [0548] 本发明更具体地涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:3的硫磺矿硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且进一步包含至少一个突变,该突变对应于以下氨基酸对的至少一个氨基酸被另一个天然或非天然的氨基酸取代,SEQ ID NO:3中氨基酸对的位置如下所示:2R/314S、14K/12E、26R/75D、26R/42E、 33R/42E、33R/45E、55R/52E、55R/285E、74R/121D、81K/42E、81K/43D、84K/80E、109R/113E、 123K/162E、147K/148D、151K/148D、154R/150E、154R/187E、154R/188E、161K/188E、 183R/150E、183R/187E、183R/180E、210K/245D、215K/214D、223R/256D、223R/202D、 234K/204D、235R/202D、241R/245D、245D/244K、250K/249D、277R/286D、292K/298E、 310K/307E。 [0549] 此外,本发明还涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:5的嗜酸热硫化叶菌的极端嗜热PTE,所述的突变的PTE包含选自以下的至少一个突变:SEQ ID NO:5中,位置8处的甘氨酸G,位置9处的赖氨酸K,位置28处的缬氨酸V,位置47处的亮氨酸L,位置55处的赖氨酸K,位置68处的脯氨酸P,位置69处的苏氨酸T,位置73处的亮氨酸L,位置77处的异亮氨酸I,位置84处的缬氨酸V,位置 98处的酪氨酸Y,位置100处的酪氨酸Y,位置123处的异亮氨酸I,位置131处的天冬酰 氨N,位置142处的天冬氨酸D,位置165处的天冬酰氨N,位置168处的异亮氨酸I,位置 192处的天冬氨酸D,位置194处的甘氨酸G,位置224处的精氨酸R,位置226处的甘氨 酸G,位置227处的亮氨酸L,位置229处的亮氨酸L,位置230处的苯丙氨酸F,位置231 处的亮氨酸L,位置258处的酪氨酸Y,位置259处的半胱氨酸C,位置260处的半胱氨酸 C,位置261处的苏氨酸T,位置262处的异亮氨酸I,位置263处的天冬氨酸D,位置264 处的色氨酸W,位置265处的甘氨酸G,位置266处的异亮氨酸I,位置267处的丙氨酸A, 位置268处的赖氨酸K,位置269处的脯氨酸P,位置270处的谷氨酸E,位置271处的酪 氨酸Y,位置272处的赖氨酸K,位置273处的脯氨酸P,位置274处的赖氨酸K,位置275 处的亮氨酸L,位置276处的丙氨酸A,位置277处的脯氨酸P,位置278处的赖氨酸K,位 置279处的色氨酸W,位置280处的丝氨酸S,位置281处的蛋氨酸M,位置282处的丝氨 酸S,位置283处的亮氨酸L,位置284处的异亮氨酸I和位置298处的苏氨酸T被任何其 他的天然或非天然的氨基酸取代。 [0550] 在更具体的实施方案中,上述突变的极端嗜热PTE具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:5的嗜酸热硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且该突变的极端嗜热PTE包含选自以下的至少一个突变:SEQ ID NO:5中,位置28处的缬氨酸V,位置68处的脯氨酸P,位置69处的苏氨酸T,位置73处的亮氨酸L,位置98处的酪氨酸Y,位置100处的酪氨酸Y,位置142处的天冬氨酸D,位置224处的精氨酸R,位置226处的甘氨酸G,位置227处的 亮氨酸L,位置230处的苯丙氨酸F,位置259处的半胱氨酸C,位置264处的色氨酸W和 位置279处的色氨酸W被任何其他的天然或非天然的氨基酸取代。 [0551] 在甚至更具体的实施方案中,上述突变的极端嗜热PTE具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:5的嗜酸热硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且仅包含一个突变,该突变选自:SEQ ID NO:5中,位置28处的缬氨酸V,位置68处的脯氨酸P,位置69处的苏氨酸T,位置73处的亮氨酸L,位置142处的天冬氨酸D,位置226处的甘氨酸G,位置227处的亮氨酸L,位置230处的苯丙氨酸F,位置264处的色氨酸W和位置279处的色氨酸W被任 何其他的天然或非天然的氨基酸取代。 [0552] 在更具体的实施方案中,上述突变的极端嗜热PTE具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:5的嗜酸热硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且仅包含一个突变,该突变选自:SEQ ID NO:5中,位置8处的甘氨酸G,位置9处的赖氨酸K,位置47处的亮氨酸L,位置55处的赖氨酸K,位置77处的异亮氨酸I,位置84处的缬氨酸V,位置123处的异亮氨酸I, 位置131处的天冬酰氨N,位置165处的天冬酰氨N,位置168处的异亮氨酸I,位置192 处的天冬氨酸D,位置194处的甘氨酸G,位置229处的亮氨酸L,位置231处的亮氨酸L, 位置258处的酪氨酸Y,位置260处的半胱氨酸C,位置261处的苏氨酸T,位置262处的 异亮氨酸I,位置263处的天冬氨酸D,位置265处的甘氨酸G,位置266处的异亮氨酸I, 位置267处的丙氨酸A,位置268处的赖氨酸K,位置269处的脯氨酸P,位置270处的谷 氨酸E,位置271处的酪氨酸Y,位置272处的赖氨酸K,位置273处的脯氨酸P,位置274 处的赖氨酸K,位置275处的亮氨酸L,位置276处的丙氨酸A,位置277处的脯氨酸P,位 置278处的赖氨酸K,位置280处的丝氨酸S,位置281处的蛋氨酸M,位置282处的丝氨 酸S,位置283处的亮氨酸L,位置284处的异亮氨酸I以及位置298处的苏氨酸T被任何 其他的天然或非天然的氨基酸取代。 [0553] 在甚至更具体的实施方案中,上述突变的极端嗜热PTE具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:5的嗜酸热硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且仅包含一个突变,该突变选自:SEQ ID NO:5中,位置8处的甘氨酸G,位置9处的赖氨酸K,位置47处的亮氨酸L,位置55处的赖氨酸K,位置77处的异亮氨酸I,位置84处的缬氨酸V,位置123处的异亮氨酸I,位置131处的天冬酰氨N,位置165处的天冬酰氨N,位置168处的异亮氨酸I,位 置192处的天冬氨酸D,位置194处的甘氨酸G,位置229处的亮氨酸L,位置231处的亮氨 酸L,位置258处的酪氨酸Y,位置260处的半胱氨酸C,位置261处的苏氨酸T,位置262 处的异亮氨酸I,位置263处的天冬氨酸D,位置265处的甘氨酸G,位置266处的异亮氨 酸I,位置267处的丙氨酸A,位置268处的赖氨酸K,位置269处的脯氨酸P,位置270处 的谷氨酸E,位置271处的酪氨酸Y,位置272处的赖氨酸K,位置273处的脯氨酸P,位置 274处的赖氨酸K,位置275处的亮氨酸L,位置276处的丙氨酸A,位置277处的脯氨酸 P,位置278处的赖氨酸K,位置280处的丝氨酸S,位置281处的蛋氨酸M,位置282处的 丝氨酸S,位置283处的亮氨酸L,位置284处的异亮氨酸I以及位置298处的苏氨酸T被 任何其他的天然或非天然的氨基酸取代。 [0554] 本发明更具体的涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:5的嗜酸热硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0555] -位置8处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是STA,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0556] -位置9处的赖氨酸K被选自RHDEC,特别是EDR,尤其是E的带电荷的氨基酸取代, [0557] -位置28处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是GIFA,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0558] -位置47处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是YW的极性氨基酸取代, [0559] -位置55处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IRL,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0560] -位置69处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN,特别是VAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0561] -位置73处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是CAMI,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0562] -位置77处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是PTV,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0563] -位置84处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是AGI,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0564] -位置98处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是FCLW,尤其是W的疏水性氨基酸取代, [0565] -位置100处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是GEWF,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0566] -位置123处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是LAV,尤其是L的非大型氨基酸取代, [0567] -位置131处的天冬酰氨N被选自GPLIVADCSTN,特别是PST,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0568] -位置142处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE,特别是SET,尤其是T的极性氨基酸取代, [0569] -位置165处的天冬酰氨N被选自WYSTCQRKHDE,特别是QR的极性氨基酸取代,[0570] -位置194处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCNQRKHDE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0571] -位置224处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNKHDE,特别是CSTAH,尤其是AC的极性氨基酸取代, [0572] -位置227处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是AIVH,尤其是V的极性氨基酸取代, [0573] -位置229处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWYC,特别是IM,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0574] -位置230处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN,特别是LTAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0575] -位置231处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN,特别是PVA,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0576] -位置259处的半胱氨酸C被选自VILMFGAPWY,特别是YLIA,尤其是LA的疏水性氨基酸取代, [0577] -位置262处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC,特别是FWC,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0578] -位置264处的色氨酸W被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPYC,特别是ALMFCITV,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0579] -位置275处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是AVP,尤其是P的疏水性氨基酸取代, [0580] -位置276处的丙氨酸A被选自VILMFGPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVDCSTN,特别是NVMT,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0581] -位置281处的蛋氨酸M被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLFGAPWYC,特别是TYP,尤其是T的疏水性氨基酸取代, [0582] -位置283处的亮氨酸L被选自EKHRQYWFM,特别是FMH,尤其是M的大型氨基酸取代, [0583] -以及位置298处的苏氨酸T被选自WYSCQNRKHDE,特别是QS,尤其是S的极性氨基酸取代。 [0584] 位置G8、K9、V28、L47、K55、T69、L73、I77、V84、Y98、Y100、I123、N131、D142、N165、G194、R224、L227、L229、F230、L231、C259、I262、W264、L275、A276、M281、L283和T298中的这些29个具体的取代属于被称为组7的第七组取代。 [0585] 本发明更具体的涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:5的嗜酸热硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0586] -位置168处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是VAL,尤其是V的疏水性氨基酸取代, [0587] -位置192处的天冬氨酸D被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0588] -位置258处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWC,特别是CSVW,尤其是C的疏水性氨基酸取代, [0589] -位置260处的半胱氨酸C被选自GPLIVADSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWY,特别是SFWV,尤其是S的疏水性氨基酸取代, [0590] -位置261处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSCQNRKHE,特别是GH,尤其是G的极性氨基酸取代, [0591] -位置263处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE的极性氨基酸取代,或者被选自GPLIVACSTN,特别是SLH的非大型氨基酸取代, [0592] -位置265处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFAPWYC,特别是AVP的疏水性氨基酸取代, [0593] -位置266处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLVADCSN,特别是VWP,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0594] -位置267处的丙氨酸A被选自WYSTCQNRKHDE,特别是NQ,尤其是N的极性氨基酸取代, [0595] -位置268处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IAP,尤其是IP的疏水性氨基酸取代, [0596] -位置269处的脯氨酸P被选自VILMFGAWYC,特别是MCL,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0597] -位置270处的谷氨酸E被选自WYSTCQNRKHD,特别是DQ,尤其是D的极性氨基酸取代, [0598] -位置271处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是VAL的疏水性氨基酸取代, [0599] -位置272处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是MLA的疏水性氨基酸取代, [0600] -位置273处的脯氨酸P被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是DEL,尤其是DL的极性氨基酸取代, [0601] -位置274处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRHD,特别是RP的极性氨基酸取代, [0602] -位置277处的脯氨酸P被选自EHKRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAWYC,特别是KAV,尤其是K的疏水性氨基酸取代, [0603] -位置278处的赖氨酸K被选自WYSTCQNRHDE,特别是DNQ,尤其是DN的极性氨基酸取代, [0604] -位置280处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYTCQNRKHDE,特别是GH的极性氨基酸取代, [0605] -位置282处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是ALV,尤其是AL的疏水性氨基酸取代, [0606] -以及位置284处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是VAL,尤其是V的非大型氨基酸取代。 [0607] 位置I168、D192、Y258、C260、T261、D263、G265、I266、A267、K268、P269、E270、Y/L271、K272、P273、K274、P277、K278、S280、S282和I284中的这些21个具体的取代属于被称为组8的第八组取代。 [0608] 本发明更具体的涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:5的嗜酸热硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0609] -位置68处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN,特别是GAV的非大型氨基酸取代,[0610] -位置226处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是AVP的非大型氨基酸取代,[0611] -以及位置279处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自RKHDEC,特别是RKDI,尤其是R的带电荷的氨基酸取代。 [0612] 在位置P68、G226和W279中的这3个具体的取代属于被称为组9的第九组取代。 [0613] 此外,本发明还涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:5的嗜酸热硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0614] -位置8处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是STA,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0615] -位置9处的赖氨酸K被选自RHDEC,特别是EDR,尤其是E的带电荷的氨基酸取代, [0616] -位置28处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是GIFA,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0617] -位置47处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是YW的极性氨基酸取代, [0618] -位置55处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IRL,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0619] -位置69处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN,特别是VAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0620] -位置73处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是CAMI,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0621] -位置77处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是PTV,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0622] -位置84处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是AGI,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0623] -位置98处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是FCLW,尤其是W的疏水性氨基酸取代, [0624] -位置100处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是GEWF,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0625] -位置123处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是LAV,尤其是L的非大型氨基酸取代, [0626] -位置131处的天冬酰氨N被选自GPLIVADCSTN,特别是PST,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0627] -位置142处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE,特别是SET,尤其是T的极性氨基酸取代, [0628] -位置165处的天冬酰氨N被选自WYSTCQRKHDE,特别是QR的极性氨基酸取代,[0629] -位置194处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCNQRKHDE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0630] -位置224处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNKHDE,特别是CSTAH,尤其是AC的极性氨基酸取代, [0631] -位置227处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是AIVH,尤其是V的极性氨基酸取代, [0632] -位置229处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWYC,特别是IM,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0633] -位置230处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN,特别是LTAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0634] -位置231处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN,特别是PVA,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0635] -位置259处的半胱氨酸C被选自VILMFGAPWY,特别是YLIA,尤其是LA的疏水性氨基酸取代, [0636] -位置262处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC,特别是FWC,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0637] -位置264处的色氨酸W被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPYC,特别是ALMFCITV,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0638] -位置275处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是AVP,尤其是P的疏水性氨基酸取代, [0639] -位置276处的丙氨酸A被选自VILMFGPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVDCSTN,特别是NVMT,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0640] -位置281处的蛋氨酸M被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILFGAPWYC,特别是TYP,尤其是T的疏水性氨基酸取代, [0641] -位置283处的亮氨酸L被选自EKHRQYWFM,特别是FMH,尤其是M的大型氨基酸取代, [0642] -以及位置298处的苏氨酸T被选自WYSCQNRKHDE,特别是QS,尤其是S的极性氨基酸取代, [0643] 进一步包含选自以下的至少一个突变: [0644] -位置168处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是VAL,尤其是V的疏水性氨基酸取代, [0645] -位置192处的天冬氨酸D被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0646] -位置258处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWC,特别是CSVW,尤其是C的疏水性氨基酸取代, [0647] -位置260处的半胱氨酸C被选自GPLIVADSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWY,特别是SFWV,尤其是S的疏水性氨基酸取代, [0648] -位置261处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSCQNRKHE,特别是GH,尤其是G的极性氨基酸取代, [0649] -位置263处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE的极性氨基酸取代,或者被选自GPLIVACSTN,特别是SLH的非大型氨基酸取代, [0650] -位置265处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFAPWYC,特别是AVP的疏水性氨基酸取代, [0651] -位置266处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLVADCSTN,特别是VWP,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0652] -位置267处的丙氨酸A被选自WYSTCQNRKHDE,特别是NQ,尤其是N的极性氨基酸取代, [0653] -位置268处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IAP,尤其是IP的疏水性氨基酸取代, [0654] -位置269处的脯氨酸P被选自VILMFGAWYC,特别是MCL,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0655] -位置270处的谷氨酸E被选自WYSTCQNRKHD,特别是DQ,尤其是D的极性氨基酸取代, [0656] -位置271处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是VAL的疏水性氨基酸取代, [0657] -位置272处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是MLA的疏水性氨基酸取代, [0658] -位置273处的脯氨酸P被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是DEL,尤其是DL的极性氨基酸取代, [0659] -位置274处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRHD,特别是RP的极性氨基酸取代, [0660] -位置277处的脯氨酸P被选自EHKRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAWYC,特别是KAV,尤其是K的疏水性氨基酸取代, [0661] -位置278处的赖氨酸K被选自WYSTCQNRHDE,特别是DNQ,尤其是DN的极性氨基酸取代, [0662] -位置280处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYTCQNRKHDE,特别是GH的极性氨基酸取代, [0663] -位置282处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是ALV,尤其是AL的疏水性氨基酸取代, [0664] -以及位置284处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是VAL,尤其是V的非大型氨基酸取代。 [0665] 这意味着在位置G8、K9、V28、L47、K55、T69、L73、I77、V84、Y98、Y100、I123、N131、D142、N165、G194、R224、L227、L229、F230、L231、C259、I262、W264、L275、A276、M281、L283和T298中组7的29个具体的取代中的至少一个取代可以与位置I168、D192、Y258、C260、T261、D263、G265、I266、A267、K268、P269、E270、Y/L271、K272、P273、K274、P277、K278、S280、S282和I284中组8的21个具体的取代中的至少一个取代相关联。 [0666] 此外,本发明还涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:5的嗜酸热硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0667] -位置8处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是STA,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0668] -位置9处的赖氨酸K被选自RHDEC,特别是EDR,尤其是E的带电荷的氨基酸取代, [0669] -位置28处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是GIFA,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0670] -位置47处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是YW的极性氨基酸取代, [0671] -位置55处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IRL,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0672] -位置69处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN,特别是VAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0673] -位置73处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是CAMI,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0674] -位置77处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是PTV,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0675] -位置84处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是AGI,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0676] -位置98处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是FCLW,尤其是W的疏水性氨基酸取代, [0677] -位置100处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是GEWF,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0678] -位置123处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是LAV,尤其是L的非大型氨基酸取代, [0679] -位置131处的天冬酰氨N被选自GPLIVADCSTN,特别是PST,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0680] -位置142处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE,特别是SET,尤其是T的极性氨基酸取代, [0681] -位置165处的天冬酰氨N被选自WYSTCQRKHDE,特别是QR的极性氨基酸取代,[0682] -位置194处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCNQRKHDE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0683] -位置224处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNKHDE,特别是CSTAH,尤其是AC的极性氨基酸取代, [0684] -位置227处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是AIVH,尤其是V的极性氨基酸取代, [0685] -位置229处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWYC,特别是IM,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0686] -位置230处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN,特别是LTAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0687] -位置231处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN,特别是PVA,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0688] -位置259处的半胱氨酸C被选自VILMFGAPWY,特别是YLIA,尤其是LA的疏水性氨基酸取代, [0689] -位置262处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC,特别是FWC,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0690] -位置264处的色氨酸W被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPYC,特别是ALMFCITV,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0691] -位置275处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是AVP,尤其是P的疏水性氨基酸取代, [0692] -位置276处的丙氨酸A被选自VILMFGPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVDCSTN,特别是NVMT,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0693] -位置281处的蛋氨酸M被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILFGAPWYC的疏水性氨基酸取代,特别是TYP,尤其是T, [0694] -位置283处的亮氨酸L被选自EKHRQYWFM,特别是FMH,尤其是M的大型氨基酸取代, [0695] -以及位置298处的苏氨酸T被选自WYSCQNRKHDE,特别是QS,尤其是S的极性氨基酸取代, [0696] 进一步包含选自以下的至少一个突变: [0697] -位置68处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN,特别是GAV的非大型氨基酸取代,[0698] -位置226处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是AVP的非大型氨基酸取代,[0699] -以及位置279处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自RKHDEC,特别是RKDI,尤其是R的带电荷的氨基酸取代。 [0700] 这意味着在位置G8、K9、V28、L47、K55、T69、L73、I77、V84、Y98、Y100、I123、N131、D142、N165、G194、R224、L227、L229、F230、L231、C259、I262、W264、L275、A276、M281、L283和T298中组7的29个具体的取代中的至少一个取代可以与位置P68,G226和W279中组9的3个具体的取代中的至少一个取代相关联。 [0701] 此外,本发明还涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:5的嗜酸热硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0702] -位置8处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是STA,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0703] -位置9处的赖氨酸K被选自RHDEC,特别是EDR,尤其是E的带电荷的氨基酸取代, [0704] -位置28处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是GIFA,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0705] -位置47处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是YW的极性氨基酸取代, [0706] -位置55处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IRL,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0707] -位置69处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN,特别是VAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0708] -位置73处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是CAMI,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0709] -位置77处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是PTV,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0710] -位置84处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是AGI,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0711] -位置98处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是FCLW,尤其是W的疏水性氨基酸取代, [0712] -位置100处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是GEWF,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0713] -位置123处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是LAV,尤其是L的非大型氨基酸取代, [0714] -位置131处的天冬酰氨N被选自GPLIVADCSTN,特别是PST,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0715] -位置142处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE,特别是SET,尤其是T的极性氨基酸取代, [0716] -位置165处的天冬酰氨N被选自WYSTCQRKHDE,特别是QR的极性氨基酸取代,[0717] -位置194处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCNQRKHDE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0718] -位置224处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNKHDE,特别是CSTAH,尤其是AC的极性氨基酸取代, [0719] -位置227处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是AIVH,尤其是V的极性氨基酸取代, [0720] -位置229处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWYC,特别是IM,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0721] -位置230处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN,特别是LTAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0722] -位置231处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN,特别是PVA,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0723] -位置259处的半胱氨酸C被选自VILMFGAPWY,特别是YLIA,尤其是LA的疏水性氨基酸取代, [0724] -位置262处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC,特别是FWC,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0725] -位置264处的色氨酸W被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPYC,特别是ALMFCITV,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0726] -位置275处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是AVP,尤其是P的疏水性氨基酸取代, [0727] -位置276处的丙氨酸A被选自VILMFGPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVDCSTN,特别是NVMT,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0728] -位置281处的蛋氨酸M被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILFGAPWYC的疏水性氨基酸取代,特别是TYP,尤其是T, [0729] -位置283处的亮氨酸L被选自EKHRQYWFM,特别是FMH,尤其是M的大型氨基酸取代, [0730] -以及位置298处的苏氨酸T被选自WYSCQNRKHDE,特别是QS,尤其是S的极性氨基酸取代, [0731] 进一步包含选自以下的至少一个突变: [0732] -位置168处的异亮氨酸I被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是VAL,尤其是V的疏水性氨基酸取代, [0733] -位置192处的天冬氨酸D被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0734] -位置258处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWC,特别是CSVW,尤其是C的疏水性氨基酸取代, [0735] -位置260处的半胱氨酸C被选自GPLIVADSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWY,特别是SFWV,尤其是S的疏水性氨基酸取代, [0736] -位置261处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSCQNRKHE,特别是GH,尤其是G的极性氨基酸取代, [0737] -位置263处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE的极性氨基酸取代,或者被选自GPLIVACSTN,特别是SLH的非大型氨基酸取代, [0738] -位置265处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFAPWYC,特别是AVP的疏水性氨基酸取代, [0739] -位置266处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLVADCSTN,特别是VWP,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0740] -位置267处的丙氨酸A被选自WYSTCQNRKHDE,特别是NQ,尤其是N的极性氨基酸取代, [0741] -位置268处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IAP,尤其是IP的疏水性氨基酸取代, [0742] -位置269处的脯氨酸P被选自VILMFGAWYC,特别是MCL,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0743] -位置270处的谷氨酸E被选自WYSTCQNRKHD,特别是DQ,尤其是D的极性氨基酸取代, [0744] -位置271处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是VAL的疏水性氨基酸取代, [0745] -位置272处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是MLA的疏水性氨基酸取代, [0746] -位置273处的脯氨酸P被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是DEL,尤其是DL的极性氨基酸取代, [0747] -位置274处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRHD,特别是RP的极性氨基酸取代, [0748] -位置277处的脯氨酸P被选自EHKRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAWYC,特别是KAV,尤其是K的疏水性氨基酸取代, [0749] -位置278处的赖氨酸K被选自WYSTCQNRHDE,特别是DNQ,尤其是DN的极性氨基酸取代, [0750] -位置280处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYTCQNRKHDE,特别是GH的极性氨基酸取代, [0751] -位置282处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是ALV,尤其是AL的疏水性氨基酸取代, [0752] -以及位置284处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是VAL,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0753] 进一步包含选自以下的至少一个突变: [0754] -位置68处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN,特别是GAV的非大型氨基酸取代,[0755] -位置226处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是AVP的非大型氨基酸取代,[0756] -以及位置279处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自RKHDEC,特别是RKDI,尤其是R的带电荷的氨基酸取代。 [0757] 这意味着在位置G8、K9、V28、L47、K55、T69、L73、I77、V84、Y98、Y100、I123、N131、D142、N165、G194、R224、L227、L229、F230、L231、C259、I262、W264、L275、A276、M281、L283和T298中组7的29个具体的取代中的至少一个取代可以与位置I168、D192、Y258、C260、T261、D263、G265、I266、A267、K268、P269、E270、Y/L271、K272、P273、K274、P277、K278、S280、S282和I284中组8的21个具体的取代中的至少一个取代以及位置P68、G226和W279中组9的3个具体的取代中的至少一个取代相关联。 [0758] 此外,本发明还涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:5的嗜酸热硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0759] -位置168处的异亮氨酸I被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是VAL,尤其是V的疏水性氨基酸取代, [0760] -位置192处的天冬氨酸D被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0761] -位置258处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWC,特别是CSVW,尤其是C的疏水性氨基酸取代, [0762] -位置260处的半胱氨酸C被选自GPLIVADSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWY,特别是SFWV,尤其是S的疏水性氨基酸取代, [0763] -位置261处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSCQNRKHE,特别是GH,尤其是G的极性氨基酸取代, [0764] -位置263处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE的极性氨基酸取代,或者被选自GPLIVACSTN,特别是SLH的非大型氨基酸取代, [0765] -位置265处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFAPWYC,特别是AVP的疏水性氨基酸取代, [0766] -位置266处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLVADCSTN,特别是VWP,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0767] -位置267处的丙氨酸A被选自WYSTCQNRKHDE,特别是NQ,尤其是N的极性氨基酸取代, [0768] -位置268处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IAP,尤其是IP的疏水性氨基酸取代, [0769] -位置269处的脯氨酸P被选自VILMFGAWYC,特别是MCL,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0770] -位置270处的谷氨酸E被选自WYSTCQNRKHD,特别是DQ,尤其是D的极性氨基酸取代, [0771] -位置271处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是VAL的疏水性氨基酸取代, [0772] -位置272处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是MLA的疏水性氨基酸取代, [0773] -位置273处的脯氨酸P被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是DEL,尤其是DL的极性氨基酸取代, [0774] -位置274处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRHD,特别是RP的极性氨基酸取代, [0775] -位置277处的脯氨酸P被选自EHKRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAWYC,特别是KAV,尤其是K的疏水性氨基酸取代, [0776] -位置278处的赖氨酸K被选自WYSTCQNRHDE,特别是DNQ,尤其是DN的极性氨基酸取代, [0777] -位置280处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYTCQNRKHDE,特别是GH的极性氨基酸取代, [0778] -位置282处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是ALV,尤其是AL的疏水性氨基酸取代, [0779] -以及位置284处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是VAL,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0780] 进一步包含选自以下的至少一个突变: [0781] -位置68处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN,特别是GAV的非大型氨基酸取代,[0782] -位置226处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是AVP的非大型氨基酸取代,[0783] -以及位置279处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自RKHDEC,特别是RKDI,尤其是R的带电荷的氨基酸取代。 [0784] 这意味着在位置I168、D192、Y258、C260、T261、D263、G265、I266、A267、K268、P269、E270、Y/L271、K272、P273、K274、P277、K278、S280、S282和I284中组8的21个具体的取代中的至少一个取代可以与位置P68、G226和W279中组9的3个具体的取代中的至少一个取代相关联。 [0785] 本发明更具体的主题是突变的极端嗜热PTE,其具有根据本发明的内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:5的嗜酸热硫化叶菌的极端嗜热PTE,所述的突变的极端嗜热PTE对应于以下序列: [0786] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:51包含以下1个突变:位置264处的色氨酸W被苯丙氨酸F取代, [0787] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:53包含以下1个突变:位置264处的色氨酸W被蛋氨酸M取代, [0788] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:55包含以下1个突变:位置264处的色氨酸W被亮氨酸L取代, [0789] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:57包含以下1个突变:位置264处的色氨酸W被丙氨酸A取代, [0790] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:59包含以下1个突变:位置264处的色氨酸W被异亮氨酸I取代, [0791] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:61包含以下1个突变:位置264处的色氨酸W被缬氨酸V取代, [0792] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:63包含以下1个突变:位置264处的色氨酸W被苏氨酸T取代, [0793] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:65包含以下3个突变:位置259处的半胱氨酸C被亮氨酸L取代,位置262处的异亮氨酸I被苯丙氨酸F取代,位置264处的色氨酸W被丙氨酸A取代, [0794] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:67包含以下4个突变:位置28处的缬氨酸V被丙氨酸A取代,位置98处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置229处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代,位置264处的色氨酸W被蛋氨酸M取代, [0795] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:69包含以下4个突变:位置28处的缬氨酸V被丙氨酸A取代,位置98处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置264处的色氨酸W被亮氨酸L取代,位置281处的蛋氨酸M被苏氨酸T取代, [0796] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:71包含以下4个突变:位置259处的半胱氨酸C被丙氨酸A取代,位置264处的色氨酸W被蛋氨酸M取代,位置281处的蛋氨酸M被苏氨酸T取代, [0797] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:73包含以下6个突变:位置28处的缬氨酸V被丙氨酸A取代,位置77处的异亮氨酸I被苏氨酸T取代,位置98处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置100处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置131处的天冬酰氨N被脯氨酸P取代,位置227处的亮氨酸L被缬氨酸V取代, [0798] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:75包含以下6个突变:位置73处的亮氨酸L被异亮氨酸I取代,位置100处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置123处的异亮氨酸I被亮氨酸L取代,位置229处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代,位置230处的苯丙氨酸F被丝氨酸S取代,位置264处的色氨酸W被亮氨酸L取代, [0799] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:77包含以下7个突变:位置69处的苏氨酸T被丝氨酸S取代,位置73处的亮氨酸L被异亮氨酸I取代,位置131处的天冬酰氨N被脯氨酸P取代,位置229处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代,位置230处的苯丙氨酸F被丝氨酸S取代,位置264处的色氨酸W被蛋氨酸M取代,位置275处的亮氨酸L被脯氨酸P取代, [0800] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:79包含以下6个突变:位置69处的苏氨酸T被丝氨酸S取代,位置77处的异亮氨酸I被苏氨酸T取代,位置98处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置100处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置229处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代,位置264处的色氨酸W被亮氨酸L取代, [0801] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:81包含以下5个突变:位置9处的赖氨酸K被谷氨酸E取代,位置98处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置100处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置229处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代, [0802] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:83包含以下2个突变:位置73处的亮氨酸L被异亮氨酸I取代,位置264处的色氨酸W被苯丙氨酸F取代, [0803] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:85包含以下5个突变:位置69处的苏氨酸T被丝氨酸S取代,位置98处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置100处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置131处的天冬酰氨N被脯氨酸P取代,位置229处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代, [0804] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:87包含以下4个突变:位置28处的缬氨酸V被丙氨酸A取代,位置227处的亮氨酸L被缬氨酸V取代,位置264处的色氨酸W被亮氨酸L取代, [0805] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:89包含以下8个突变:位置68处的脯氨酸P被缬氨酸V取代,位置69处的苏氨酸T被丝氨酸S取代,位置98处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置100处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置229处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代,位置259处的半胱氨酸C被丙氨酸A取代,位置264处的色氨酸W被亮氨酸L取代,位置281处的蛋氨酸M被苏氨酸T取代, [0806] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:91包含以下8个突变:位置69处的苏氨酸T被丝氨酸S,取代,位置98处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置100处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置131处的天冬酰氨N被脯氨酸P取代,位置227处的亮氨酸L被缬氨酸V取代,位置264处的色氨酸W被蛋氨酸M取代, [0807] -对应于SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:93包含以下5个突变:位置69处的苏氨酸T被丝氨酸S,取代,位置73处的亮氨酸L被异亮氨酸I取代,位置98处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置100处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置131处的天冬酰氨N被脯氨酸P取代。 [0808] 此外,上述突变的极端嗜热PTE的编码序列也是本发明的一部分,其中所述的突变的极端嗜热PTE具有根据本发明的内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:5以及对应于以下序列SEQ ID NO:50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90和92的嗜酸热硫化叶菌的极端嗜热PTE。 [0809] 此外,本发明还涉及突变的极端嗜热PTE,其具有根据本发明的内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:5的嗜酸热硫化叶菌的极端嗜热PTE,所述的突变的极端嗜热PTE的蛋白质对应于以下序列SEQ ID NO:181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、21、213、215、217、219、221和223,以及它们的各自编码序列SEQ ID NO:180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、 216、218、220和222。 [0810] 本发明更具体的涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自根据序列SEQ ID NO:5的嗜酸热硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且进一步包含至少一个突变,该突变对应于以下氨基酸对的至少一个氨基酸被另一个天然或非天然的氨基酸取代,SEQ ID NO:5中氨基酸对的位置如下所示:3K/315S、15G/13S、27R/76D、27R/43E、 34R/43E、34R/46E、56T/53E、56T/286T、75R/122D、82K/43E、82K/44D、85K/81E、110R/114E、 124K/163E、148R/149D、152R/149D、155R/151E、155R/188E、155R/189E、162K/189E、 184R/151E、184R/188E、184R/181E、211K/246D、216K/215D、224R/257D、224R/203D、 235K/205D、236R/203D、242K/246D、246D/245K、251R/250D、278K/287D、293K/299D、 311A/308K。 [0811] 此外,本发明涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:7的冰岛硫化叶菌的极端嗜热PTE,所述的突变的PTE包含选自以下的至少一个突变:SEQ ID NO:7中,位置7处的甘氨酸G,位置8处的赖氨酸K,位置27处的缬氨酸V,位置46处的亮氨酸L,位置54处的赖氨酸K,位置67处的脯氨酸P,位置68处的苏氨酸T,位置72处的亮氨酸L,位置76处的异亮氨酸I,位置83处的缬氨酸V,位置97处的 酪氨酸Y,位置99处的酪氨酸Y,位置122处的异亮氨酸I,位置130处的丝氨酸S,位置 141处的天冬氨酸D,位置164处的赖氨酸K,位置167处的异亮氨酸I,位置191处的天冬 氨酸D,位置193处的甘氨酸G,位置223处的精氨酸R,位置225处的甘氨酸G,位置226 处的亮氨酸L,位置228处的亮氨酸L,位置229处的苯丙氨酸F,位置230处的亮氨酸L, 位置257处的酪氨酸Y,位置258处的半胱氨酸C,位置259处的半胱氨酸C,位置260处 的苏氨酸T,位置261处的异亮氨酸I,位置262处的天冬氨酸D,位置263处的色氨酸W, 位置264处的甘氨酸G,位置265处的苏氨酸T,位置266处的丙氨酸A,位置267处的精 氨酸R,位置268处的脯氨酸P,位置269处的谷氨酸E,位置270处的亮氨酸L,位置271 处的赖氨酸K,位置272处的脯氨酸P,位置273处的赖氨酸K,位置274处的亮氨酸L,位 置275处的丙氨酸A,位置276处的脯氨酸P,位置277处的精氨酸R,位置278处的色氨 酸W,位置279处的丝氨酸S,位置280处的蛋氨酸M,位置281处的丙氨酸A,位置282处 的丝氨酸S,位置283处的异亮氨酸I和位置297处的丝氨酸S被任何其他的天然或非天 然的氨基酸取代。 [0812] 在更具体的实施方案中,上述突变的极端嗜热PTE具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:7的冰岛硫化叶菌的极端嗜热PTE,所述的突变的极端嗜热PTE包含选自以下的至少一个突变:SEQ ID NO:7中,位置27处的缬氨酸V,位置67处的脯氨酸P,位置68处的苏氨酸T,位置72处的亮氨酸L,位置97处的酪氨酸Y,位置99处的酪氨酸Y,位 置141处的天冬氨酸D,位置223处的精氨酸R,位置225处的甘氨酸G,位置226处的亮 氨酸L,位置229处的苯丙氨酸F,位置258处的半胱氨酸C,位置263处的色氨酸W和位 置278处的色氨酸W被任何其他的天然或非天然的氨基酸取代。 [0813] 在甚至更具体的实施方案中,上述突变的极端嗜热PTE具有内酯酶活性,衍生自对应于序列的SEQ ID NO:7的极端嗜热PTE,并且仅包含一个突变,所述的突变选自:SEQ ID NO:7中,位置27处的缬氨酸V,位置67处的脯氨酸P,位置68处的苏氨酸T,位置72处的亮氨酸L,位置141处的天冬氨酸D,位置225处的甘氨酸G,位置226处的亮氨酸L,位 置229处的苯丙氨酸F,位置263处的色氨酸W和位置278处的色氨酸W被任何其他的天 然或非天然的氨基酸取代。 [0814] 在甚至更具体的实施方案中,上述突变的极端嗜热PTE具有内酯酶活性,衍生自对应于序列的SEQ ID NO:7的冰岛硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且包含选自以下的至少一个突变:SEQ ID NO:7中,位置7处的甘氨酸G,位置8处的赖氨酸K,位置46处的亮氨酸L,位置54处的赖氨酸K,位置76处的异亮氨酸I,位置83处的缬氨酸V,位置122处的异亮氨酸I,位置130处的丝氨酸S,位置164处的赖氨酸K,位置167处的异亮氨酸I,位置 191处的天冬氨酸D,位置193处的甘氨酸G,位置228处的亮氨酸L,位置230处的亮氨酸 L,位置257处的酪氨酸Y,位置259处的半胱氨酸C,位置260处的苏氨酸T,位置261处 的异亮氨酸I,位置262处的天冬氨酸D,位置264处的甘氨酸G,位置265处的苏氨酸T, 位置266处的丙氨酸A,位置267处的精氨酸R,位置268处的脯氨酸P,位置269处的谷 氨酸E,位置270处的亮氨酸L,位置271处的赖氨酸K,位置272处的脯氨酸P,位置273 处的赖氨酸K,位置274处的亮氨酸L,位置275处的丙氨酸A,位置276处的脯氨酸P,位 置277处的精氨酸R,位置279处的丝氨酸S,位置280处的蛋氨酸M,位置281处的丙氨 酸A,位置282处的亮氨酸L,位置283处的异亮氨酸I和位置297处的丝氨酸S被任何其 他的天然或非天然的氨基酸取代。 [0815] 在甚至更具体的实施方案中,上述突变的极端嗜热PTE具有内酯酶活性,衍生自对应于序列的SEQ ID NO:7的冰岛硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且仅包含一个突变,所述的突变选自:SEQ ID NO:7中,位置7处的甘氨酸G,位置8处的赖氨酸K,位置46处的亮氨酸L,位置54处的赖氨酸K,位置76处的异亮氨酸I,位置83处的缬氨酸V,位置122处的异亮氨酸I,位置130处的丝氨酸S,位置164处的赖氨酸K,位置167处的异亮氨酸I, 位置191处的天冬氨酸D,位置193处的甘氨酸G,位置228处的亮氨酸L,位置230处的 亮氨酸L,位置257处的酪氨酸Y,位置259处的半胱氨酸C,位置260处的苏氨酸T,位置 261处的异亮氨酸I,位置262处的天冬氨酸D,位置264处的甘氨酸G,位置265处的苏 氨酸T,位置266处的丙氨酸A,位置267处的精氨酸R,位置268处的脯氨酸P,位置269 处的谷氨酸E,位置270处的亮氨酸L,位置271处的赖氨酸K,位置272处的脯氨酸P,位 置273处的赖氨酸K,位置274处的亮氨酸L,位置275处的丙氨酸A,位置276处的脯氨 酸P,位置277处的精氨酸R,位置279处的丝氨酸S,位置280处的蛋氨酸M,位置281处 的丙氨酸A,位置282处的亮氨酸L,位置283处的异亮氨酸I和位置297处的丝氨酸S被 任何其他的天然或非天然的氨基酸取代。 [0816] 本发明更具体的涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:7的冰岛硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0817] -位置7处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是STA,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0818] -位置8处的赖氨酸K被选自RHDEC,特别是EDR,尤其是E的带电荷的氨基酸取代, [0819] -位置27处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是GIFA,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0820] -位置46处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是YW的极性氨基酸取代, [0821] -位置54处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IRL,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0822] -位置68处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN,特别是VAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0823] -位置72处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是CAMI,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0824] -位置76处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是PTV,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0825] -位置83处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是AGI,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0826] -位置97处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是FCLW,尤其是W的疏水性氨基酸取代, [0827] -位置99处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是GEWF,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0828] -位置122处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是LAV,尤其是L的非大型氨基酸取代, [0829] -位置130处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN,特别是PT,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0830] -位置141处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE,特别是SET,尤其是T的极性氨基酸取代, [0831] -位置164处的赖氨酸K被选自WYSTCQNRHDE,特别是NQR,尤其是N的极性氨基酸取代, [0832] -位置193处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCNQRKHDE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0833] -位置223处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNKHDE,特别是CSTAH,尤其是AC的极性氨基酸取代, [0834] -位置226处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是AIVH,尤其是V的极性氨基酸取代, [0835] -位置228处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWYC,特别是IM,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0836] -位置229处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN,特别是LTAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0837] -位置230处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN,特别是PVA,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0838] -位置258处的半胱氨酸C被选自VILMFGAPWY,特别是YLIA,尤其是LA的疏水性氨基酸取代, [0839] -位置261处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC,特别是FWC,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0840] -位置263处的色氨酸W被选自GPLIVDCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPYC,特别是ALMFCITV,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0841] -位置274处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是AVP,尤其是P的疏水性氨基酸取代, [0842] -位置275处的丙氨酸A被选自VILMFGPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVDCSTN,特别是NVMT,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0843] -位置280处的蛋氨酸M被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是TYP,尤其是T的疏水性氨基酸取代, [0844] -位置282处的亮氨酸L被选自EKHRQYWFM,特别是FMH,尤其是M的大型氨基酸取代, [0845] -以及位置297处的丝氨酸S被选自WYTCQNRKHDE,特别是QT的极性氨基酸取代。 [0846] 位置G7、K8、V27、F46、K54、T68、L72、I76、V83、Y97、Y99、I122、S130、D141、K164、G193、R223、L226、L228、F229、L230、C258、I261、W263、L274、A275、M280、L282和N297中这些29个具体的取代属于被称为组10的第十组取代。 [0847] 本发明更具体的涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:7的冰岛硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0848] -位置167处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是VAL,尤其是V的疏水性氨基酸取代, [0849] -位置191处的天冬氨酸D被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0850] -位置257处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWC,特别是CSVW,尤其是C的疏水性氨基酸取代, [0851] -位置259处的半胱氨酸C被选自GPLIVADSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWY,特别是SFWV,尤其是S的疏水性氨基酸取代, [0852] -位置260处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSCQNRKHE,特别是GH,尤其是G的极性氨基酸取代, [0853] -位置262处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE的极性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSTN,特别是SLH的非大型氨基酸取代, [0854] -位置264处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFAPWYC,特别是AVP的疏水性氨基酸取代, [0855] -位置265处的苏氨酸T被选自VILMFGAPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSN,特别是VWP,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0856] -位置266处的丙氨酸A被选自WYSTCQNRKHDE,特别是NQ,尤其是N的极性氨基酸取代, [0857] -位置267处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IAP,尤其是IP的疏水性氨基酸取代, [0858] -位置268处的脯氨酸P被选自VILMFGAWYC,特别是MCL,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0859] -位置269处的谷氨酸E被选自WYSTCQNRKHD,特别是DQ,尤其是D的极性氨基酸取代, [0860] -位置270处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是VA的疏水性氨基酸取代, [0861] -位置271处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是MLA的疏水性氨基酸取代, [0862] -位置272处的脯氨酸P被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是DEL,尤其是DL的极性氨基酸取代, [0863] -位置273处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRHD,特别是RP的极性氨基酸取代, [0864] -位置276处的脯氨酸P被选自EHKRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAWYC,特别是KAV,尤其是K的疏水性氨基酸取代, [0865] -位置277处的精氨酸R被选自WYSTCQNKHDE,特别是DNQ,尤其是DN的极性氨基酸取代, [0866] -位置279处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYTCQNRKHDE,特别是GH的极性氨基酸取代, [0867] -位置281处的丙氨酸A被选自GPLIVDCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是ALV,尤其是AL的疏水性氨基酸取代, [0868] -以及位置283处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是VAL,尤其是V的非大型氨基酸取代。 [0869] 位置I167、D191、Y257、C259、T260、D262、G264、T265、A266、R267、P268、E269、L270、K271、P272、K273、P276、R277、S279、A281和I283中这些21个具体的取代属于被称为组11的第十一组取代。 [0870] 本发明更具体的涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:7的冰岛硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0871] -位置67处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN,特别是GAV的非大型氨基酸取代,[0872] -位置225处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是AVP的非大型氨基酸取代,[0873] -以及位置278处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自RKHDEC,特别是RKDI,尤其是R的带电荷的氨基酸取代。 [0874] 位置P67、G225和W278中这些3个具体的取代属于被称为组12的第十二组取代。 [0875] 此外,本发明还涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:7的冰岛硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0876] -位置7处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是STA,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0877] -位置8处的赖氨酸K被选自RHDEC,特别是EDR,尤其是E的带电荷的氨基酸取代, [0878] -位置27处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是GIFA,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0879] -位置46处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是YW的极性氨基酸取代, [0880] -位置54处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IRL,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0881] -位置68处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN,特别是VAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0882] -位置72处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是CAMI,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0883] -位置76处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是PTV,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0884] -位置83处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是AGI,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0885] -位置97处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是FCLW,尤其是W的疏水性氨基酸取代, [0886] -位置99处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是GEWF,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0887] -位置122处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是LAV,尤其是L的非大型氨基酸取代, [0888] -位置130处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN,特别是PT,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0889] -位置141处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE,特别是SET,尤其是T的极性氨基酸取代, [0890] -位置164处的赖氨酸K被选自WYSTCQNRHDE,特别是NQR,尤其是N的极性氨基酸取代, [0891] -位置193处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCNQRKHDE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0892] -位置223处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNKHDE,特别是CSTAH,尤其是AC的极性氨基酸取代, [0893] -位置226处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是AIVH,尤其是V的极性氨基酸取代, [0894] -位置228处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWYC,特别是IM,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0895] -位置229处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN,特别是LTAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0896] -位置230处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN,特别是PVA,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0897] -位置258处的半胱氨酸C被选自VILMFGAPWY,特别是YLIA,尤其是LA的疏水性氨基酸取代, [0898] -位置261处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC,特别是FWC,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0899] -位置263处的色氨酸W被选自GPLIVDCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPYC,特别是ALMFCITV,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0900] -位置274处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是AVP,尤其是P的疏水性氨基酸取代, [0901] -位置275处的丙氨酸A被选自VILMFGPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVDCSTN,特别是NVMT,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0902] -位置280处的蛋氨酸M被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是TYP,尤其是T的疏水性氨基酸取代, [0903] -位置282处的亮氨酸L被选自EKHRQYWFM,特别是FMH,尤其是M的大型氨基酸取代, [0904] -以及位置297处的丝氨酸S被选自WYTCQNRKHDE,特别是QT的极性氨基酸取代,[0905] 进一步包含选自以下的至少一个突变: [0906] -位置167处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是VAL,尤其是V的疏水性氨基酸取代, [0907] -位置191处的天冬氨酸D被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0908] -位置257处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWC,特别是CSVW,尤其是C的疏水性氨基酸取代, [0909] -位置259处的半胱氨酸C被选自GPLIVADSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWY,特别是SFWV,尤其是S的疏水性氨基酸取代, [0910] -位置260处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSCQNRKHE,特别是GH,尤其是G的极性氨基酸取代, [0911] -位置262处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE的极性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSTN,特别是SLH的非大型氨基酸取代, [0912] -位置264处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFAPWYC,特别是AVP的疏水性氨基酸取代, [0913] -位置265处的苏氨酸T被选自VILMFGAPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSN,特别是VWP,尤其是V的非大型氨基酸取代, [0914] -位置266处的丙氨酸A被选自WYSTCQNRKHDE,特别是NQ,尤其是N的极性氨基酸取代, [0915] -位置267处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IAP,尤其是IP的疏水性氨基酸取代, [0916] -位置268处的脯氨酸P被选自VILMFGAWYC,特别是MCL,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0917] -位置269处的谷氨酸E被选自WYSTCQNRKHD,特别是DQ,尤其是D的极性氨基酸取代, [0918] -位置270处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是VA的疏水性氨基酸取代, [0919] -位置271处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是MLA的疏水性氨基酸取代, [0920] -位置272处的脯氨酸P被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是DEL,尤其是DL的极性氨基酸取代, [0921] -位置273处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRHD,特别是RP的极性氨基酸取代, [0922] -位置276处的脯氨酸P被选自EHKRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAWYC,特别是KAV,尤其是K的疏水性氨基酸取代, [0923] -位置277处的精氨酸R被选自WYSTCQNKHDE,特别是DNQ,尤其是DN的极性氨基酸取代, [0924] -位置279处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYTCQNRKHDE,特别是GH的极性氨基酸取代, [0925] -位置281处的丙氨酸A被选自GPLIVDCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是ALV,尤其是AL的疏水性氨基酸取代, [0926] -以及位置283处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是VAL,尤其是V的非大型氨基酸取代。 [0927] 这意味着位置G7、K8、V27、F46、K54、T68、L72、I76、V83、Y97、Y99、I122、S130、D141、K164、G193、R223、L226、L228、F229、L230、C258、I261、W263、L274、A275、M280、L282和N297中组10的29个具体的取代中的至少一个取代可以与位置I167、D191、Y257、C259、T260、D262、G264、T265、A266、R267、P268、E269、L270、K271、P272、K273、P276、R277、S279、A281和I283中组11的21个具体的取代中的至少一个取代相关联。 [0928] 此外,本发明还涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:7的冰岛硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0929] -位置7处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是STA,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0930] -位置8处的赖氨酸K被选自RHDEC,特别是EDR,尤其是E的带电荷的氨基酸取代, [0931] -位置27处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是GIFA,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0932] -位置46处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是YW的极性氨基酸取代, [0933] -位置54处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IRL,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0934] -位置68处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN,特别是VAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0935] -位置72处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是CAMI,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0936] -位置76处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是PTV,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0937] -位置83处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是AGI,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0938] -位置97处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是FCLW,尤其是W的疏水性氨基酸取代, [0939] -位置99处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是GEWF,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0940] -位置122处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是LAV,尤其是L的非大型氨基酸取代, [0941] -位置130处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN,特别是PT,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0942] -位置141处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE,特别是SET,尤其是T的极性氨基酸取代, [0943] -位置164处的赖氨酸K被选自WYSTCQNRHDE,特别是NQR,尤其是N的极性氨基酸取代, [0944] -位置193处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCNQRKHDE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0945] -位置223处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNKHDE,特别是CSTAH,尤其是AC的极性氨基酸取代, [0946] -位置226处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是AIVH,尤其是V的极性氨基酸取代, [0947] -位置228处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWYC,特别是IM,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0948] -位置229处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN,特别是LTAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0949] -位置230处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN,特别是PVA,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0950] -位置258处的半胱氨酸C被选自VILMFGAPWY,特别是YLIA,尤其是LA的疏水性氨基酸取代, [0951] -位置261处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC,特别是FWC,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0952] -位置263处的色氨酸W被选自GPLIVDCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPYC,特别是ALMFCITV,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0953] -位置274处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是AVP,尤其是P的疏水性氨基酸取代, [0954] -位置275处的丙氨酸A被选自VILMFGPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVDCSTN,特别是NVMT,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0955] -位置280处的蛋氨酸M被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是TYP,尤其是T的疏水性氨基酸取代, [0956] -位置282处的亮氨酸L被选自EKHRQYWFM,特别是FMH,尤其是M的大型氨基酸取代, [0957] -以及位置297处的丝氨酸S被选自WYTCQNRKHDE,特别是QT的极性氨基酸取代,[0958] 进一步包含选自以下的至少一个突变: [0959] -位置67处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN,特别是GAV的非大型氨基酸取代,[0960] -位置225处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是AVP的非大型氨基酸取代,[0961] -以及位置278处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自RKHDEC,特别是RKDI,尤其是R的带电荷的氨基酸取代。 [0962] 这意味着位置G7、K8、V27、F46、K54、T68、L72、I76、V83、Y97、Y99、I122、S130、D141、K164、G193、R223、L226、L228、F229、L230、C258、I261、W263、L274、A275、M280、L282和N297中组10的29个具体的取代中的至少一个取代可以与K273、P276、R277、S279、A281和I283中的至少一个取代、以及与位置P67、G225和W278中组12的3个具体的取代中的至少一个取代相关联。 [0963] 此外,本发明还涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:7的冰岛硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [0964] -位置7处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是STA,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0965] -位置8处的赖氨酸K被选自RHDEC,特别是EDR,尤其是E的带电荷的氨基酸取代, [0966] -位置27处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是GIFA,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0967] -位置46处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是YW的极性氨基酸取代, [0968] -位置54处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IRL,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0969] -位置68处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN,特别是VAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0970] -位置72处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是CAMI,尤其是I的疏水性氨基酸取代, [0971] -位置76处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是PTV,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0972] -位置83处的缬氨酸V被选自GPLIADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自ILMFGAPWYC,特别是AGI,尤其是A的疏水性氨基酸取代, [0973] -位置97处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是FCLW,尤其是W的疏水性氨基酸取代, [0974] -位置99处的酪氨酸Y被选自EHKRQWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是GEWF,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0975] -位置122处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是LAV,尤其是L的非大型氨基酸取代, [0976] -位置130处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN,特别是PT,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0977] -位置141处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE,特别是SET,尤其是T的极性氨基酸取代, [0978] -位置164处的赖氨酸K被选自WYSTCQNRHDE,特别是NQR,尤其是N的极性氨基酸取代, [0979] -位置193处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCNQRKHDE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0980] -位置223处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNKHDE,特别是CSTAH,尤其是AC的极性氨基酸取代, [0981] -位置226处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是AIVH,尤其是V的极性氨基酸取代, [0982] -位置228处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VIMFGAPWYC,特别是IM,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [0983] -位置229处的苯丙氨酸F被选自GPLIVADCSTN,特别是LTAS,尤其是S的非大型氨基酸取代, [0984] -位置230处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN,特别是PVA,尤其是P的非大型氨基酸取代, [0985] -位置258处的半胱氨酸C被选自VILMFGAPWY,特别是YLIA,尤其是LA的疏水性氨基酸取代, [0986] -位置261处的异亮氨酸I被选自VLMFGAPWYC,特别是FWC,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0987] -位置263处的色氨酸W被选自GPLIVDCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPYC,特别是ALMFCITV,尤其是F的疏水性氨基酸取代, [0988] -位置274处的亮氨酸L被选自VIMFGAPWYC,特别是AVP,尤其是P的疏水性氨基酸取代, [0989] -位置275处的丙氨酸A被选自VILMFGPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVDCSTN,特别是NVMT,尤其是T的非大型氨基酸取代, [0990] -位置280处的蛋氨酸M被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是TYP,尤其是T的疏水性氨基酸取代, [0991] -位置282处的亮氨酸L被选自EKHRQYWFM,特别是FMH,尤其是M的大型氨基酸取代, [0992] -以及位置297处的丝氨酸S被选自WYTCQNRKHDE,特别是QT的极性氨基酸取代,[0993] 进一步包含选自以下的至少一个突变: [0994] -位置167处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是VAL,尤其是V的疏水性氨基酸取代, [0995] -位置191处的天冬氨酸D被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [0996] -位置257处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWC,特别是CSVW,尤其是C的疏水性氨基酸取代, [0997] -位置259处的半胱氨酸C被选自GPLIVADSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWY,特别是SFWV,尤其是S的疏水性氨基酸取代, [0998] -位置260处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSCQNRKHE,特别是GH,尤其是G的极性氨基酸取代, [0999] -位置262处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE的极性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSTN,特别是SLH的非大型氨基酸取代, [1000] -位置264处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFAPWYC,特别是AVP的疏水性氨基酸取代, [1001] -位置265处的苏氨酸T被选自VILMFGAPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSN,特别是VWP,尤其是V的非大型氨基酸取代, [1002] -位置266处的丙氨酸A被选自WYSTCQNRKHDE,特别是NQ,尤其是N的极性氨基酸取代, [1003] -位置267处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IAP,尤其是IP的疏水性氨基酸取代, [1004] -位置268处的脯氨酸P被选自VILMFGAWYC,特别是MCL,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [1005] -位置269处的谷氨酸E被选自WYSTCQNRKHD,特别是DQ,尤其是D的极性氨基酸取代, [1006] -位置270处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是VA的疏水性氨基酸取代, [1007] -位置271处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是MLA的疏水性氨基酸取代, [1008] -位置272处的脯氨酸P被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是DEL,尤其是DL的极性氨基酸取代, [1009] -位置273处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRHD,特别是RP的极性氨基酸取代, [1010] -位置276处的脯氨酸P被选自EHKRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAWYC,特别是KAV,尤其是K的疏水性氨基酸取代, [1011] -位置277处的精氨酸R被选自WYSTCQNKHDE,特别是DNQ,尤其是DN的极性氨基酸取代, [1012] -位置279处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYTCQNRKHDE,特别是GH的极性氨基酸取代, [1013] -位置281处的丙氨酸A被选自GPLIVDCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是ALV,尤其是AL的疏水性氨基酸取代, [1014] -以及位置283处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是VAL,尤其是V的非大型氨基酸取代, [1015] 进一步包含选自以下的至少一个突变: [1016] -位置67处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN,特别是GAV的非大型氨基酸取代,[1017] -位置225处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是AVP的非大型氨基酸取代,[1018] -以及位置278处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自RKHDEC,特别是RKDI,尤其是R的带电荷的氨基酸取代。 [1019] 这意味着位置G7、K8、V27、F46、K54、T68、L72、I76、V83、Y97、Y99、I122、S130、D141、K164、G193、R223、L226、L228、F229、L230、C258、I261、W263、L274、A275、M280、L282和N297中组10的29个具体的取代中的至少一个取代可以与位置I167、D191、Y257、C259、T260、D262、G264、T265、A266、R267、P268、E269、L270、K271、P272、K273、P276、R277、S279、A281和I283中组11的21个具体的取代的至少一个取代、以及与位置P67,G225和W278中组12的3个具体的取代中的至少一个取代相关联。 [1020] 此外,本发明还涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:7的冰岛硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且其中至少一个突变选自: [1021] -位置167处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWYC,特别是VAL,尤其是V的疏水性氨基酸取代, [1022] -位置191处的天冬氨酸D被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHE,特别是ST,尤其是S的极性氨基酸取代, [1023] -位置257处的酪氨酸Y被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VLMFGAPWC,特别是CSVW,尤其是C的疏水性氨基酸取代, [1024] -位置259处的半胱氨酸C被选自GPLIVADSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWY,特别是SFWV,尤其是S的疏水性氨基酸取代, [1025] -位置260处的苏氨酸T被选自GPLIVADCSN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSCQNRKHE,特别是GH,尤其是G的极性氨基酸取代, [1026] -位置262处的天冬氨酸D被选自WYSTCQNRKHE的极性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSTN,特别是SLH的非大型氨基酸取代, [1027] -位置264处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFAPWYC,特别是AVP的疏水性氨基酸取代, [1028] -位置265处的苏氨酸T被选自VILMFGAPWYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自GPLIVADCSN,特别是VWP,尤其是V的非大型氨基酸取代, [1029] -位置266处的丙氨酸A被选自WYSTCQNRKHDE,特别是NQ,尤其是N的极性氨基酸取代, [1030] -位置267处的精氨酸R被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是IAP,尤其是IP的疏水性氨基酸取代, [1031] -位置268处的脯氨酸P被选自VILMFGAWYC,特别是MCL,尤其是M的疏水性氨基酸取代, [1032] -位置269处的谷氨酸E被选自WYSTCQNRKHD,特别是DQ,尤其是D的极性氨基酸取代, [1033] -位置270处的亮氨酸L被选自GPIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWC,特别是VA的疏水性氨基酸取代, [1034] -位置271处的赖氨酸K被选自EHRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是MLA的疏水性氨基酸取代, [1035] -位置272处的脯氨酸P被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRKHDE,特别是DEL,尤其是DL的极性氨基酸取代, [1036] -位置273处的赖氨酸K被选自GPLIVADCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYSTCQNRHD,特别是RP的极性氨基酸取代, [1037] -位置276处的脯氨酸P被选自EHKRQYWFM的大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAWYC,特别是KAV,尤其是K的疏水性氨基酸取代, [1038] -位置277处的精氨酸R被选自WYSTCQNKHDE,特别是DNQ,尤其是DN的极性氨基酸取代, [1039] -位置279处的丝氨酸S被选自GPLIVADCTN的非大型氨基酸取代,或者被选自WYTCQNRKHDE,特别是GH的极性氨基酸取代, [1040] -位置281处的丙氨酸A被选自GPLIVDCSTN的非大型氨基酸取代,或者被选自VILMFGAPWYC,特别是ALV,尤其是AL的疏水性氨基酸取代, [1041] -以及位置283处的异亮氨酸I被选自GPLVADCSTN,特别是VAL,尤其是V的非大型氨基酸取代, [1042] 进一步包含选自以下的至少一个突变: [1043] -位置67处的脯氨酸P被选自GLIVADCSTN,特别是GAV的非大型氨基酸取代,[1044] -位置225处的甘氨酸G被选自PLIVADCSTN,特别是AVP的非大型氨基酸取代,[1045] -以及位置278处的色氨酸W被选自VILMFGAPYC的疏水性氨基酸取代,或者被选自RKHDEC,特别是RKDI,尤其是R的带电荷的氨基酸取代。 [1046] 这意味着位置I167、D191、Y257、C259、T260、D262、G264、T265、A266、R267、P268、E269、L270、K271、P272、K273、P276、R277、S279、A281和I283中组11的21个具体的取代中的至少一个取代可以与位置P67、G225和W278中组12的3个具体的取代中的至少一个取代相关联。 [1047] 本发明更具体的主题为突变的极端嗜热PTE,其具有根据本发明的内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:7的冰岛硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且所述的极端嗜热PTE对应于以下序列: [1048] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:95包含以下1个突变:位置263处的色氨酸W被苯丙氨酸F取代, [1049] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:97包含以下1个突变:位置263处的色氨酸W被蛋氨酸M取代, [1050] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:99包含以下1个突变:位置263处的色氨酸W被亮氨酸L取代, [1051] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:101包含以下1个突变:位置263处的色氨酸W被丙氨酸A取代, [1052] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:103包含以下1个突变:位置263处的色氨酸W被异亮氨酸I取代, [1053] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:105包含以下1个突变:位置263处的色氨酸W被缬氨酸V取代, [1054] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:107包含以下1个突变:位置263处的色氨酸W被苏氨酸T取代, [1055] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:109包含以下3个突变:位置258处的半胱氨酸C被亮氨酸L取代,位置261处的异亮氨酸I被苯丙氨酸F取代,位置263处的色氨酸W被丙氨酸A取代, [1056] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:111包含以下4个突变:位置27处的缬氨酸V被丙氨酸A取代,位置97处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置228处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代,位置263处的色氨酸W被蛋氨酸M取代, [1057] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:113包含以下4个突变:位置27处的缬氨酸V被丙氨酸A取代,位置97处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置263处的色氨酸W被亮氨酸L取代,位置280处的蛋氨酸M被苏氨酸T取代, [1058] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:115包含以下4个突变:位置258处的半胱氨酸C被丙氨酸A取代,位置263处的色氨酸W被蛋氨酸M取代,位置280处的蛋氨酸M被苏氨酸T取代, [1059] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:117包含以下6个突变:位置27处的缬氨酸V被丙氨酸A取代,位置76处的异亮氨酸I被苏氨酸T取代,位置97处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置99处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置130处的丝氨酸S被脯氨酸P取代,位置226处的亮氨酸L被缬氨酸V取代, [1060] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:119包含以下6个突变:位置72处的亮氨酸L被异亮氨酸I取代,位置99处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置122处的异亮氨酸I被亮氨酸L取代,位置228处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代,位置229处的苯丙氨酸F被丝氨酸S取代,位置263处的色氨酸W被亮氨酸L取代, [1061] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:121包含以下7个突变:位置68处的苏氨酸T被丝氨酸S取代,位置72处的亮氨酸L被异亮氨酸I取代,位置130处的丝氨酸S被脯氨酸P取代,位置228处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代,位置229处的苯丙氨酸F被丝氨酸S取代,位置263处的色氨酸W被蛋氨酸M取代,位置274处的亮氨酸L被脯氨酸P取代, [1062] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:123包含以下6个突变:位置68处的苏氨酸T被丝氨酸S取代,位置76处的异亮氨酸I被苏氨酸T取代,位置97处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置99处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置228处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代,位置263处的色氨酸W被亮氨酸L取代, [1063] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:125包含以下5个突变:位置8处的赖氨酸K被谷氨酸E取代,位置97处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置99处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置228处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代, [1064] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:127包含以下2个突变:位置72处的亮氨酸L被异亮氨酸I取代,位置263处的色氨酸W被苯丙氨酸F取代, [1065] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:129包含以下5个突变:位置68处的苏氨酸T被丝氨酸S取代,位置97处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置99处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置130处的丝氨酸S被脯氨酸P取代,位置228处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代,[1066] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:131包含以下4个突变:位置27处的缬氨酸V被丙氨酸A取代,位置226处的亮氨酸L被缬氨酸V取代,位置263处的色氨酸W被亮氨酸L取代, [1067] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:133包含以下8个突变:位置67处的脯氨酸P被缬氨酸V取代,位置68处的苏氨酸T被丝氨酸S取代,位置97处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置99处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置228处的亮氨酸L被蛋氨酸M取代,位置258处的半胱氨酸C被丙氨酸A取代,位置263处的色氨酸W被亮氨酸L取代,位置280处的蛋氨酸M被苏氨酸T取代, [1068] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:135包含以下8个突变:位置68处的苏氨酸T被丝氨酸S取代,位置97处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置99处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置130处的丝氨酸S被脯氨酸P取代,位置164处的赖氨酸K被天冬酰氨N取代,位置226处的亮氨酸L被缬氨酸V取代,位置263处的色氨酸W被蛋氨酸M取代, [1069] -对应于SEQ ID NO:7的SEQ ID NO:137包含以下5个突变:位置68处的苏氨酸T被丝氨酸S取代,位置72处的亮氨酸L被异亮氨酸I取代,位置97处的酪氨酸Y被色氨酸W取代,位置99处的酪氨酸Y被苯丙氨酸F取代,位置130处的丝氨酸S被脯氨酸P取代。 [1070] 此外,上述突变的极端嗜热PTE的编码序列也是本发明的一部分,其中所述的突变的极端嗜热PTE具有根据本发明的内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:7以及对应于以下序列SEQ ID NO:94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134和136的冰岛硫化叶菌的极端嗜热PTE。 [1071] 此外,本发明还涉及突变的极端嗜热PTE,其具有根据本发明的内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:7的冰岛硫化叶菌的极端嗜热PTE,所述的突变的极端嗜热PTE的蛋白质对应于以下序列SEQ ID NO:225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265和267,以及它们各自的编码序列SEQ ID NO:224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、 260、262、264和266。 [1072] 本发明更具体地涉及上述突变的极端嗜热PTE,其具有内酯酶活性,衍生自对应于序列SEQ ID NO:7的冰岛硫化叶菌的极端嗜热PTE,并且进一步包含至少一个突变,该突变对应于以下氨基酸对的至少一个氨基酸被另一个天然或非天然的氨基酸取代,SEQ ID NO:7中氨基酸对的位置如下所示:2R/314S、14E/12E、26R/75D、26R/42E、 33R/42E、33R/45E、55R/52E、55R/285E、74R/121D、81K/42E、81K/43D、84K/80E、109R/113E、 123K/162E、147K/148D、151K/148D、154R/150E、154R/187E、154R/188E、161K/188E、 183R/150E、183R/187E、183R/180E、210K/245D、215K/214D、223R/256D、223R/202D、 234K/204D、235R/202D、241K/245D、245D/244K、250R/249D、277R/286D、292K/298E、 310K/307E。 [1073] 此外,本发明还涉及突变的极端嗜热磷酸三酯酶,其具有内酯酶活性,衍生自通过共有序列SEQ ID NO:1定义的极端嗜热磷酸三酯酶,具有单一突变的所述的突变的极端嗜热磷酸三酯酶为共有序列SEQ ID NO:1中位置265处的色氨酸W的取代。 [1074] 在一个实施方案中,本发明涉及如上文所定义的突变的极端嗜热磷酸三酯酶,具有单一突变的所述的突变的极端嗜热磷酸三酯酶为共有序列SEQ ID NO:1中位置265处的色氨酸W被苏氨酸T所取代。 [1075] 在一个实施方案中,本发明涉及如上文所定义的突变的极端嗜热磷酸三酯酶,具有单一突变的所述的突变的极端嗜热磷酸三酯酶在序列SEQ ID NO:3的位置263处的色氨酸W被异亮氨酸I,缬氨酸V,苏氨酸T或丙氨酸A所取代。 [1076] 此外,本发明还涉及分离的核酸序列,其编码如上文所定义的具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE。 [1077] 此外,本发明的主题为包含核酸的载体,其中所述的核酸编码如上文所定义的具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE。此类载体可以为质粒、粘粒、噬菌体或用于克隆和表达核酸的任何其他的工具。 [1078] 此外,本发明还涉及通过使用上文所定义的载体转染的宿主细胞,特别是细菌,这样它们的基因组包含编码如上文所定义的具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE的核苷酸序列,所述的突变的极端嗜热PTE具有内酯酶活性,产生于宿主细胞的细胞质中或者分泌在它们的表面上。 [1079] 此外,本发明的主题为用于产生具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE变体的方法,其包括: [1080] -将包含核酸序列的多个载体引入至宿主细胞的群体中,其中所述的核酸序列编码具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE, [1081] -在合适的培养介质中培养宿主细胞的群体, [1082] -在所述的培养的宿主细胞中表达所述的多核苷酸, [1083] -回收多个突变的极端嗜热PTE变体。 [1084] 此外,本发明还涉及具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE变体文库,其是通过用于生成所上文所公开的具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE文库的方法获得的。 [1085] 所述的文库的目的是提供具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE的多肽变体,其相对于衍生该突变的极端嗜热PTE的、具有内酯酶活性的野生型极端嗜热PTE而言,具有增强的表现型特性。 [1086] 此外,本发明还涉及增加极端嗜热磷酸三酯酶的内酯酶催化活性的突变的用途,所述的极端嗜热磷酸三酯酶具有对应于SEQ ID NO:1的共有序列的序列,其中位置265处的氨基酸W被选自异亮氨酸I、缬氨酸V、苏氨酸T或丙氨酸A的氨基酸取代,从而得到突变的极端嗜热磷酸三酯酶,该突变的极端嗜热磷酸三酯酶与对应于SEQ ID NO:1共有序列的、所述的极端嗜热磷酸三酯酶的内酯酶活性相比,具有增加的内酯酶催化活性。 [1087] 本发明还涉及增加极端嗜热磷酸三酯酶的内酯酶催化活性的单一突变的用途,所述的极端嗜热磷酸三酯酶具有对应于SEQ ID NO:1的共有序列的序列,其中位置265处的氨基酸W被选自异亮氨酸I、缬氨酸V、苏氨酸T或丙氨酸A的氨基酸取代,从而得到突变的极端嗜热磷酸三酯酶,该突变的极端嗜热磷酸三酯酶与对应于SEQ ID NO:1共有序列的、所述的极端嗜热磷酸三酯酶的内酯酶活性相比,具有增加的内酯酶催化活性。 [1088] 本发明还涉及增加极端嗜热磷酸三酯酶的内酯酶催化活性的方法,所述的极端嗜热磷酸三酯酶具有对应于SEQ ID NO:1的共有序列的序列,所述的方法包括用选自异亮氨酸I、缬氨酸V、苏氨酸T或丙氨酸A的氨基酸取代位置265处的氨基酸W的步骤,从而得到突变的极端嗜热磷酸三酯酶,该突变的极端嗜热磷酸三酯酶与对应于SEQ ID NO:1共有序列的、所述的极端嗜热磷酸三酯酶的内酯酶活性相比,具有增加的内酯酶催化活性。 [1089] 本发明还涉及用于增加极端嗜热磷酸三酯酶的内酯酶催化活性的方法,所述的极端嗜热磷酸三酯酶具有对应于SEQ ID NO:1的共有序列的序列,所述的方法包括用选自异亮氨酸I、缬氨酸V、苏氨酸T或丙氨酸A的氨基酸单一地取代位置265处的氨基酸W的步骤,从而得到突变的极端嗜热磷酸三酯酶,该突变的极端嗜热磷酸三酯酶与对应于SEQ ID NO:1共有序列的、所述的极端嗜热磷酸三酯酶的内酯酶活性相比,具有增加的内酯酶催化活性。 [1090] 表述“内酯酶催化活性”是指内酯的水解,特别是N-酰基高丝氨酸内酯(AHL),其介导了许多革兰氏阴性细菌和一些古细菌有机体的细菌通讯。 [1091] 表述“增加的内酯酶的催化活性”是指,对于AHL的水解而言,与衍生突变的极端嗜热PTE的非突变的极端嗜热PTE的Kcat/KM比值相比,突变的极端嗜热PTE具有较更高的Kcat/KM比值。 [1092] 优选地,与非突变的极端嗜热PTE相比,突变的极端嗜热PTE的Kcat/KM增加,为至少2倍,更优选地为25至70倍。 [1093] 在一个实施方案中,本发明关于如上文所定义的用途或方法,其中所述的极端嗜热磷酸三酯酶为野生型极端嗜热磷酸三酯酶。 [1094] 在一个实施方案中,本发明关于如上文所定义的用途或方法,其中与所述的极端嗜热磷酸三酯酶对3-氧-C12AHL的水解相比,所述的突变的极端嗜热磷酸三酯酶对3-氧-C12AHL的水解增加,为至少2倍,特别是25至70倍。 [1095] 优选地,与非突变的极端嗜热PTE相比,突变的极端嗜热PTE的Kcat/KM增加,为至少2倍,更优选地增加25至70倍。 [1096] 在一个实施方案中,本发明关于如上文所定义的用途或方法,其中所述的突变的极端嗜热磷酸三酯酶具有热稳定性,其基本类似于所述的极端嗜热磷酸三酯酶的热稳定性。 [1097] 表述“热稳定性”是指PTE抵抗高温的能力,特别是高于70℃,更特别是70℃至120℃。在这些温度下,保持PTE的3D结构,并且这些酶仍是有活性的,而且能够水解OP或内酯。 [1098] 传统上,修饰PTE的催化活性的突变与相比于非突变的PTE,在突变的PTE中热稳定性的丧失相关。但是,本发明的突变的PTE具有的热稳定性基本类似于所述的极端嗜热磷酸三酯酶的热稳定性。 [1099] 可以通过测定熔解温度来验证PTE的热稳定性。 [1100] 本发明的突变的PTE的熔解温度为高于80℃,优选高于85℃,优选高于90℃。 [1101] 可以通过圆二色光谱来测量该熔解温度。 [1102] 在一个实施方案中,本发明关于如上文所定义的用途或方法,其中SEQ ID NO:1中位置2处的氨基酸缺失。 [1103] 在一个实施方案中,本发明关于如上文所定义的用途或方法,其中所述的极端嗜热磷酸三酯酶选自:得自硫磺矿硫化叶菌的SEQ ID NO:3,得自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocalaricus)的SEQ ID NO:5,或者得自冰岛硫化叶菌的SEQ ID NO:7,其中所述的序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7属于共有SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:5中缺失SEQ ID NO:1中位置2处的氨基酸,以及SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:7中缺失SEQ ID NO:1中位置2和3处的氨基酸。 [1104] 在一个实施方案中,本发明关于如上文所定义的用途或方法,其中至少位置265处的氨基酸W被选自异亮氨酸I、缬氨酸V、苏氨酸T或丙氨酸A的氨基酸取代。 [1105] 在一个实施方案中,本发明关于如上文所定义的用途或方法,其中位置265处的所述的氨基酸W被异亮氨酸I取代。 [1106] 在一个实施方案中,本发明关于如上文所定义的用途或方法,其中所述的突变的极端嗜热磷酸三酯酶进一步包含至少一个额外的取代,所述的至少一个额外的取代选自:SEQ ID NO:1中,位置G9、K10、V29、F/L48、K56、P69、T70、L74、I78、V85、I124、L/S/N132、D143、K/N166、I169、D193、G195、G227、L228、L230、F231、L232、Y259、C261、T262、I263、D264、G266、T/I267、A268、K/R269、P270、E271、Y/L272、K273、P274、K275、L276、A277、P278、R/K279、W280、S281、I/M282、T/A/S283、L284、I285、N/S/T299的取代。 [1107] 在一个实施方案中,本发明关于如上文所定义的用途或方法,其中所述的突变的极端嗜热磷酸三酯酶进一步包含至少一个额外的取代,所述的至少一个额外的取代选自:SEQ ID NO:1中,位置G9、K10、V29、F/L48、K56、P69、T70、L74、I78、V85、I124、L/S/N132、D143、K/N166、I169、D193、G195、G227、L228、L230、F231、L232、Y259、C261、T262、I263、D264、G266、T/I267、A268、K/R269、P270、E271、Y/L272、K273、P274、K275、L276、A277、P278、W280、S281、I/M282、T/A/S283、L284、I285、N/S/T299的取代。 [1108] 在一个实施方案中,本发明关于如上文所定义的用途或方法,其中所述的突变的极端嗜热磷酸三酯酶进一步包含至少一个补充的取代,所述的至少一个补充的取代选自SEQ ID NO:1中,位置Y99、Y101、R225和C260处的取代。 [1109] 在一个实施方案中,本发明关于如上文所定义的用途或方法,其中所述的突变的极端嗜热PTE对应于以下序列:SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107。 [1110] 在一个实施方案中,本发明关于如上文所定义的用途或方法,其中所述的突变的极端嗜热PTE对应于以下序列:SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:109。 [1111] 此外,本发明还涉及组合物,该组合物包含如上文所定义的具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE。 [1112] 在优选的实施方案中,包含具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE的如上文所定义的组合物进一步包含至少一种去污剂。 [1113] 在更优选的实施方案中,上述组合物可以用作洗衣剂来清洁浸渍有OP化合物的材料,其中所述的组合物包含具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE和至少一种去污剂。 [1114] 本发明的一个方面关于本发明的突变的极端嗜热PTE用于对有机磷化合物进行去污的用途。该方面是基于突变的极端嗜热PTE催化OP中磷酯键水解的能力。 [1115] 因此,本发明还涉及如上文所定义的具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE、或者如上文所定义的宿主细胞,作为生物清除剂的用途: [1116] -在对被有机磷化合物污染的材料、皮肤或粘膜的表面进行去污的背景下,[1117] -在预防或治疗由于摄入或吸入有机磷化合物而导致外部或内部中毒的背景下,[1118] -在对被有机磷化合物污染的水进行污染控制的背景下,或者 [1119] -在破坏大量神经毒性试剂的背景下。 [1120] 在一个实施方案中,本发明涉及如上文所定义的用途,其中所述的突变的极端嗜热PTE选自:SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119。 [1121] 在一个实施方案中,本发明涉及如上文所定义的用途,其中所述的突变的极端嗜热PTE选自:SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:109。 [1122] 此外,本发明的主题是浸渍有如上文所定义的具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE的材料,所述的材料是液体或固体形式,例如为手套、多种外套、抹布、喷雾泡沫。 [1123] 本发明的另一个主题为对污染有有机磷化合物的材料、皮肤或粘膜的表面进行去污的、或者用于对被有机磷化合物污染的水进行污染控制的试剂盒,所述的试剂盒包含如上文所定义的具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE,或者浸渍有如上文所定义的具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE的材料。 [1124] 此外,本发明的主题是有机磷化合物的生物清除剂,其包含如上文所定义的具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE。 [1125] 此外,本发明还涉及用于外部去污的药筒,在该药筒的内部,植入了如上文所定义的具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE。所述的药筒可以用于对被OP化合物毒害的个体的血液进行去污。 [1126] 本发明的另一个方面关于本发明的突变的极端嗜热PTE作为抗细菌试剂的用途。该方面是基于本发明的突变的极端嗜热PTE用于水解内酯、并由此破坏使用高丝氨酸内酯底物进行通讯的微生物有机体的群体感应。 [1127] 因此,本发明关于如上文所定义的突变的极端嗜热磷酸三酯酶用于破坏细菌中的群体感应的用途。 [1128] 在一个实施方案中,本发明关于突变的极端嗜热磷酸三酯酶的用途,其中所述的突变的极端嗜热磷酸三酯酶具有对应于SEQ ID NO:1的共有序列的序列,其中位置265处的氨基酸W被选自异亮氨酸I、缬氨酸V、苏氨酸T或丙氨酸A的氨基酸取代,所述的突变的极端嗜热磷酸三酯酶与对应于SEQ ID NO:1共有序列的所述的极端嗜热磷酸三酯酶的内酯酶活性相比,具有增加的内酯酶催化活性。 [1129] 在一个实施方案中,本发明关于如上文所定义的突变的极端嗜热磷酸三酯酶用于破坏细菌中的群体感应的用途,所述的突变的极端嗜热PTE选自:SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107。 [1130] 在一个实施方案中,本发明关于如上文所定义的突变的极端嗜热磷酸三酯酶用于破坏细菌中的群体感应的用途,所述的突变的极端嗜热PTE选自:SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:109。 [1131] 在一个实施方案中,本发明关于如上文所定义的突变的极端嗜热磷酸三酯酶用于破坏细菌中的群体感应的用途,所述的突变的极端嗜热PTE选自:SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:109。 [1132] 在一个实施方案中,本发明关于本发明的突变的极端嗜热PTE用于限制生物膜的形成的用途,尤其是在船或其他海洋设备中。 [1133] 具体而言,可以将突变的极端嗜热PTE加入至着色介质中,以便限制生物膜的形成,尤其是在船或其他海洋设备中。 [1134] 在一个实施方案中,本发明关于本发明的突变的极端嗜热PTE用于抑制植物的火疫病或者用于抑制蔬菜的腐烂的用途。 [1135] 植物的火疫病是由于被欧文氏菌属(Erwinia)的细菌感染所引起的,而蔬菜的腐烂是由于沙雷氏菌属(Serratia)的细菌感染所引起的。 [1136] 植物和蔬菜被欧文氏菌属和沙雷氏菌属细菌的定植均涉及基于内酯底物的群体感应。此类内酯底物可以被PTE水解,从而抑制和/或治疗欧文氏菌属和沙雷氏菌属的感染。 [1137] 此外,本发明的主题还为植物检疫组合物,其包含如上文所定义的至少一种突变的极端嗜热PTE作为活性成分。 [1138] 此外,本发明的主题还为抗细菌组合物,其包含如上文所定义的至少一种突变的极端嗜热PTE作为活性组分。 [1139] 此外,本发明还涉及药物组合物,其包含如上文所定义的具有内酯酶活性的至少一种突变的极端嗜热PTE作为活性组分,以及药学可接受的媒介物。 [1140] 此外,本发明还涉及用于治疗由于存在的细菌而导致的病理学(尤其是肺炎或医源性疾病)的药物组合物。 [1141] 此外,本发明还涉及用于治疗牙菌斑的药物组合物。 [1142] 此外,本发明还涉及在治疗眼睛感染或眼睛表面治愈中用作滴眼剂的药物组合物。 [1143] 在优选的实施方案中,如上文所定义的药物组合物进一步包含选自庆大霉素、环丙沙星、头孢他啶、亚胺培南、托伯拉霉素的至少一种抗生素,其中所述的药物组合物包含具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE。 [1144] 在更优选的实施方案中,如上文所定义的药物组合物以可以通过可注射途径进行施用的形式(特别是溶液中、包装的或聚乙二醇化的)或者以局部途径(特别是以药膏、喷雾剂或擦试剂的形式)进行施用的形式存在。 [1146] 此外,本发明还涉及用于治疗由使用高丝氨酸内酯底物进行通讯的细菌引起的细菌感染的组合物或药物组合物,其中所述的组合物或药物组合物包含具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE,所述的感染特别是在血液、伤口、烧伤、皮肤、生物材料-肌体的接触区域。 [1147] 此外,本发明的主题还为用于破坏使用高丝氨酸内酯底物进行通讯的微生物有机体的群体感应的方法,所述的方法由向有需要的患者施用足量的组合物或药物组合物组成,其中所述的组合物或药物组合物包含如上文所定义的具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE。 [1148] 此外,本发明的另一个主题还为如上文所定义的突变的极端嗜热PTE用作药物。 [1149] 在一个实施方案中,本发明关于如上文所定义的突变的极端嗜热PTE用于治疗细菌感染。 [1150] 在一个实施方案中,本发明关于如上文所定义的突变的极端嗜热PTE用于治疗肺炎或医源性疾病,其中所述的肺炎或医源性疾病是由使用高丝氨酸内酯底物进行通讯的细菌,特别是在血液、伤口、烧伤、皮肤、生物材料-肌体接触区域中所引起的。 [1151] 在一个实施方案中,本发明关于如上文所定义的突变的极端嗜热PTE用于治疗牙菌斑。 [1152] 在一个实施方案中,本发明关于如上文所定义的突变的极端嗜热PTE用于治疗眼睛感染或眼睛表面治愈。 [1153] 本发明通过以下附图和硫磺矿硫化叶菌的磷酸三酯酶的实例进一步说明,并且在制备根据本发明的如上文所定义的、具有内酯酶活性的突变的极端嗜热PTE的背景下对硫磺矿硫化叶菌的磷酸三酯酶进行突变。这些实例无意于限定本发明。 [1154] 附图简述 [1155] 图1:SsoPox底物的化学结构。 [1156] 图 中 示 出 了 对 氧 磷 (A.)、CMP- 香 豆 素 (B.)、3- 氧 -C12AHL(C.)、3-氧-C10AHL(D.)、十一烷-δ-内酯(E.)和十一烷-γ-内酯(F.)的化学结构。 [1157] 图2:SsoPox磷酸三酯酶活性的筛选和表征。 [1158] 使用1mM(A.)和100μM(B.)对氧磷底物以及50μM(C.)CMP-香豆素底物来筛选W263饱和位点变体的相对磷酸三酯酶活性。针对对氧磷水解来表征最佳变体(即,SsoPox W263F、W263M、W263A和W263L),并将催化效率与SsoPox wt(D.)比较。 [1159] 图3:SsoPox内酯酶活性的筛选和表征。 [1160] 基于绿脓杆菌(P.aeruginosa)的内酯酶活性的筛选方法的示意图。针对3-氧-C12AHL水解(B.)来筛选W263饱和位点变体的相对内酯酶活性。针对3-氧-C12AHL水解来表征最佳变体(即,SsoPox W263I、W263V、W263T和W263A),并将催化效率与SsoPox wt(C.)比较。 [1161] 图4:SsoPox W263I介导的对lasB转录的抑制。 [1162] 图表显示,经处理培养物中的表达表示为未处理对照(无SsoPox W263I)的lasB表达的百分率,并且表示来自3个独立试验的平均的数据,并且每个试验都具有3个技术重复:误差柱表示95%的置信区间。SsoPoxW263I的Student’s T检验,p=<0.05。用于将基线与酶的最高剂量进行比较的所有T检验。 [1163] 图5:SsoPoxW263I对PAO1生物膜的形成的抑制。 [1164] 如方法部分中所述,生物膜在MBEC装置中生长。SsoPox W263I对绿脓杆菌生物膜形成的抑制以剂量依赖的方式可见:SsoPoxW263I的Student’s T检验,p=<0.05。 [1165] 图6:在感染后,2组动物的48小时生存曲线。 [1166] 动物感染有108CFU/mL(300μL)绿脓杆菌PAO1以及未处理的(NT)或者使用SsoPoxW263I立即处理(IT)的。 [1167] 图7:感染后的肺组织学检查。 [1168] 代表未处理的(NT)(A)、差异处理的(DT)(B)以及立即处理的(IT)(C)组的肺的病理学图谱:肺切片的病理学吉姆萨染色x100的显微照片。NT组的平均组织学严重性得分(HSS)为(平均值±SD)2,64±0.4,IT组为1.27±0.6(p=0.005,相对于NT),DT组为2.32±0.4(p=NS与NT)。 实施例 [1169] 实施例1 [1170] 在本实施例中,经实验生成SsoPox变体并表征。 [1171] 1-试验过程 [1172] 1.1-初始材料 [1173] 优化SsoPox编 码基因 用于大 肠杆菌(Escherichia coli) 表达,并 由GeneArt(Life Technologies,France)合成[1]。随后,将该基因克隆至定制版本的 pET32b(Novagen)中(=pET32b-ΔTrx-SsoPox),其中NcoI和NotI作为克隆位点。通过sequencage(Sequencage plateforme,Timone,Marseille,France)验证SsoPox序列。2种质粒均用于演变方案。 [1174] 1.2-定点诱变 [1175] 由初始使用的质粒pET22b-SsoPox按要求形成SsoPox的位置W263的饱和位点,从而作为提供者(GeneArt,Invitrogen;Germany)。通过测序检查各变体,并提供作为大肠杆菌DH5α细胞甘油库。由大肠杆菌DH5α细胞纯化20个质粒(pET22b-SsoPox-W263X),并通过电穿孔转化至BL21(DE3)-pLysS菌株中用于活性筛选,并且转化至BL21(DE3)-pGro7/EL(TaKaRa)中,用于大量生产/纯化(参见下文中相关的部分)。 [1176] 对于其他的定点诱变或所选位置的饱和位点而言,使用引入了所需变化的引物,使用pfu Turbo聚合酶(Agilent)来扩增整体质粒。根据顾客的意见完成PCR组成,最终体积为25μL,并由100ng质粒进行扩增。PCR方案如下: [1177] [1178] 在37℃下在45’期间,通过DpnI酶消化(1μl;Fermentas)除去剩余的初始质粒。在90℃下失活20’后,纯化DNA(QIAquick PCR Purification Kit;Qiagen),从而得到大约30μL可变量的DNA。然后,将5μL纯化的DNA转化至大肠杆菌电感受态细胞(50μL; E.cloni;Lucigen)中,在37℃下在1h内在1mL SOC培养基中回收,然后铺平板于补充有氨苄青霉素(100μg/mL)的琼脂培养基上。对多个克隆进行测序,从而验证良好实施的诱变(Sequencage plateforme,Timone,Marseille,France),并将经验证的质粒转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)-pGro7/GroEL(TaKaRa)中,用于大量生产/纯化以及分析(参见下文中相关的部分)。 [1179] 1.3-定向演化方法 [1180] 使用 II Random Mutagenesis Kit,最终25μL,使用引物T7-启动子(TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG)和T7-RP(GCT AGT TAT TGC TCA GCG G)以及500ng基质(对应于6μg pET32b-ΔTrx-SsoPox质粒)来实施定向演化方案。根据客户的建议形成其他的PCR元件。PCR方案如下: [1181] [1182] 然后,在37℃下,在45’期间,通过DpnI酶(1μl;Fermentas)消化剩余的质粒,然后在90℃下失活20’。接着,纯化DNA(QIAquick PCR Purification Kit;Qiagen),从而获得以100ng/μL的大约50μL的DNA。对于下一步骤,请参照“克隆和库的形成”部分。 [1183] 1.4-方法 [1184] 使用引物T7-启动子(TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG)和T7-RP(GCT AGT TAT TGC TCA GCG G),由pET32b-ΔTrx-SsoPox质粒,通过PCR(500μL RedTaq;Sigma)来扩增SsoPox编码基因。PCR方案如下: [1185] [1186] 然后,在37℃下,在45’期间,通过DpnI酶(1μl;Fermentas)消化剩余的质粒,然后在90℃下失活20’。接着,纯化DNA(QIAquick PCR Purification Kit;Qiagen),从而获得以200ng/μL的大约100μL的DNA。在20℃下,在30”,1’和2’期间,在缓冲剂TrisHCl100mM pH7.5,MnCl2 10mM中通过2UE的DNAseI(TaKaRa)消化15μL DNA(~3μg)。通 过在60mM EDTA存在下,在90℃下温育10’来终止消化。离心后,将DNA等分物合并,并在TAE缓冲剂中进行琼脂糖凝胶电泳(2%;w/v),在50mA下15’。由凝胶切下由平均大小为TM 70bp(由50至150pb)组成的片段,并使用D-tube Dyalizer Maxi(Calbiochem)装置进行纯化。 [1187] 由凝胶提取的DNA(浓度>12ng/μL)在“装配PCR”中用作基质,其中所述的装配PCR由100ng基质、2pmol引入了突变的引物并使用2.5UE的Pfu Turbo聚合酶(Agilent)组成,其最终体积为25μl。引物混合物由寡核苷酸混合物(由等量的经修饰的位置组成)组成。PCR方案如下: [1188] [1189] 在方向5’-3’上,引入了突变的引物如下: [1190]SEQ ID NO 引物 序列5′-3′ SEQ ID NO:268 W263M-F TGCACCATTGATATGGGCACCGCA AAACCG SEQ ID NO:269 W263M-R CGGTTTTGCGGTGCCCATATCAATGGTGCA SEQ ID NO:270 W263L-F TGCACCATTGATCTGGGCACCGCAAAACCG SEQ ID NO:271 W263L-R CGGTTTTGCGGTGCCCAGATCAATGGTGCA SEQ ID NO:272 W263A-F TGCACCATTGATGCAGGCACCGCAAAACCG SEQ ID NO:273 W263A-R CGGTTTTGCGGTGCCTGCATCAATGGTGCA SEQ ID NO:274 W263I-F TGCACCATTGATATTGGCACCGCAAAACCG SEQ ID NO:275 W263I-R CGGTTTTGCGGTGCCAATATCAATGGTGCA SEQ ID NO:276 W263V-F TGCACCATTGATGTTGGCACCGCAAAACCG SEQ ID NO:277 W263V-R CGGTTTTGCGGTGCCAACATCAATGGTGCA SEQ ID NO:278 W263T-F TGCACCATTGATACCGGCACCGCAAAACCG SEQ ID NO:279 W263T-R CGGTTTTGCGGTGCCGGTATCAATGGTGCA SEQ ID NO:280 C258L-F ATTAGCCATGATTATCTGTGCACCATTGAT SEQ ID NO:281 C258L-R ATCAATGGTGCACAGATAATCATGGCTAAT SEQ ID NO:282 I261F-F GATTATTGCTGCACCTTTGATTGGGGCACC SEQ ID NO:283 I261F-R GGTGCCCCAATCAAAGGTGCAGCAATAATC SEQ ID NO:284 V27A-F GAACATCTGCGTGCATTTAGCGAAGCAGTT SEQ ID NO:285 V27A-R AACTGCTTCGCTAAATGCACGCAGATGTTC SEQ ID NO:286 Y97W-F GGCACCGGTATTTGGATTTATATCGATCTGCCG SEQ ID NO:287 Y97W-R CGGCAGATCGATATAAATCCAAATACCGGTGCC SEQ ID NO:288 L228M-F GATCGTTATGGTCTGGACATGTTTCTGCCGGTT SEQ ID NO:289 L228M-R AACCGGCAGAAACATGTCCAGACCATAACGATC SEQ ID NO:290 I280T-F GCACCGCGTTGGAGCACTACCCTGATTTTTG SEQ ID NO:291 I280T-R CAAAAATCAGGGTAGTGCTCCAACGCGGTGC SEQ ID NO:292 F46L-F CTGTATAATGAAGATGAAGAACTGCGCAATGCCGTGAATGAAG SEQ ID NO:293 F46L-R CTTCATTCACGGCATTGCGCAGTTCTTCATCTTCATTATACAG SEQ ID NO:294 I76T-F GTTATGGGTCTGGGTCGTGATACTCGTTTTATGGAAAAAGTTGTG SEQ ID NO:295 I76T-R CACAACTTTTTCCATAAAACGAGTATCACGACCCAGACCCATAAC SEQ ID NO:296 Y99F-F GGCACCGGTATTTATATTTTTATCGATCTGCCG SEQ ID NO:297 Y99F-R CGGCAGATCGATAAAAATATAAATACCGGTGCC SEQ ID NO:298 L130P-F GGCATTCAGGGCACCCCGAATAAAGCAGGTTTTG SEQ ID NO:299 L130P-R CAAAACCTGCTTTATTCGGGGTGCCCTGAATGCC SEQ ID NO:300 L226V-F GATCGTTATGGTGTGGACCTGTTTCTGCCGGTT SEQ ID NO:301 L226V-R AACCGGCAGAAACAGGTCCACACCATAACGATC SEQ ID NO:302 L72I-F GTTATGGGTATTGGTCGTGATATTCGTTTT [1191]SEQ ID NO 引物 序列5′-3′ SEQ ID NO:303 L72I-R AAAACGAATATCACGACCAATACCCATAAC SEQ ID NO:304 F229S-F GATCGTTATGGTCTGGACCTGTCTCTGCCGGTT SEQ ID NO:305 F229S-R AACCGGCAGAGACAGGTCCAGACCATAACGATC SEQ ID NO:306 T68S-F AAAACCATTGTTGATCCGAGTGTTATGGGT SEQ ID NO:307 T68S-R ACCCATAACACTCGGATCAACAATGGTTTT SEQ ID NO:308 K8E-F CATTCCGCTGGTTGGTGAAGATAGCATTGAAAG SEQ ID NO:309 K8E-R CTTTCAATGCTATCTTCACCAACCAGCGGAATG SEQ ID NO:310 P67S-F AAAACCATTGTTGATTCGACCGTTATGGGT SEQ ID NO:311 P67S-R ACCCATAACGGTCGAATCAACAATGGTTTT SEQ ID NO:312 K164N-F CAATAAAGAAACCAATGTTCCGATTATTACCC SEQ ID NO:313 K164N-R GGGTAATAATCGGAACATTGGTTTCTTTATTG [1192] 表1:用于创建SsoPox变体的引物的列表 [1193] 最 后,装 配PCR 作 为“巢 式PCR”的 基 质。1μL 装 配PCR 用 作 传 统PCR(50μL,RedTaq;Sigma),并且克隆引物为SsoPox-lib-pET-5’(ATGCGCATTCCGCTGGTTGG)和SsoPox-lib-pET-3’(TTATTAGCTAAAGAATTTTTTCGGATTTTC)。PCR方案如下: [1194] [1195] 1.5-克隆和库的形成 [1196] 使用提取试剂盒(QIAquick PCR Purification Kit;Qiagen)纯化PCR产物,然后在37℃下在45’期间,通过NcoI Fastdigest和NotI Fastdigest酶(各种酶均为12UE;Fermentas)进行消化。然后,在90℃下通过20’温育使酶失活,然后纯化(QIAquick PCR Purification Kit;Qiagen),以便根据顾客的建议,克隆至pET32b-Δtrx质粒的事先脱磷酸化的相应的限制性位点(10UE/μl CIP;NEB)。在16℃下在16h期间,使用50ng质粒以及T4-DNA连接酶(摩尔比为1:3)进行连接(20UE;NEB)。 [1197] 连接后,在90℃下将连接酶失活20’,然后通过传统的醇沉淀,由盐形式进行纯化,并在10μL水中回收。使用5μL纯化的连接物对大肠杆菌电感受态细胞(50μL;E.cloni;Lucingen)进行电穿孔,并在37℃下在1h内在1mL SOC介质中回收。然后,将1mL全部物质铺平板于琼脂选择培养基(氨苄青霉素100μg/mL)上,并在37℃下温育过夜。 4 [1198] 在琼脂平板上获得高于10集落的转化效率之后,使用1mL质粒提取试剂盒溶液1(Qiaprep Spin Miniprep kit;Quiagen)收获集落,然后,根据建议的程序由细胞提取质粒。所获得的质粒合并物构成了库,使用100ng用于电穿孔50μL电感受态 BL21(DE3)-pGro7/EL(TaKaRa)。在37℃下在SOC介质中回收1h后,将细胞铺平板于加入了氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(37μg/mL)的琼脂平板上。 [1199] 2-筛选过程 [1200] 通过吸头挑取集落将微培养物接种于96孔板中,其中所述的微培养物由补充有氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(34μg/mL)的600μL ZYP培养基[3,4]组成。培养物在37℃下在1600rpm摇动下生长5h后,通过将温度过渡至25℃并加入CoCl2(0.2mM)和阿拉伯糖(0.2%,w/v)而介导活化。在过夜生长后,移去吸头并用于挑取琼脂平板(氨苄青霉素100μg/mL;氯霉素34μg/mL)上的分开的集落用于菌株保存。将培养物离心,用于保持细胞团,将该细胞团再次悬浮于由50mM HEPES pH 8、150mM NaCl、CoCl2 0.2mM、Lysozyme0.25mg/ml、PMSF 0.1mM DNAseI 10μg/ml和MgSO4 20mM组成的裂解缓冲剂中。通过冻/融步骤破坏细胞,并通过离心除去细胞碎片(13 000g,4℃,30’)。进行蛋白质的部分纯化,并通过在70℃下温育15分钟来探索SsoPox超高的热稳定性[5]。通过离心收获聚集的蛋白质(13 000g,25℃,30’)。 [1201] 2.1-磷酸三酯酶活性的筛选 [1202] 通过监测发色团磷酸三酯的水解(对氧磷、甲基-对氧磷、对硫磷、甲基对硫磷(1mM或100μM,Fluka))来介导磷酸三酯酶活性的筛选。在96孔板中,在用于200μL反应物的6.2mm光程长度池中使用微板读取器(Synergy HT;BioTek,USA)以及Gen5.1软件在-1 -125℃下实施动力学试验,用于10’监测磷酸三酯(ε405nm=17 000M cm )的水解。在pte缓冲剂(50mM HEPES pH 8、150mM NaCl、0.2mM CoCl2)中进行标准测试。 [1203] 2.2-内酯酶活性的筛选 [1204] 通过绿脓杆菌的基因修饰菌株PAO1 来介导内酯酶活性的筛选(PAO1-ΔlasI-JP2)。在绿脓杆菌中,在3-氧-C12AHL存在下,JP2质粒编码蛋白质,该蛋白质编码了生物发光产物;在wt P.aeruginosa中负责3-氧-C12AHL合成的lasI基因被删除。将SsoPox变体(5μL 10倍稀释的部分纯化的变体)与3-氧-C12AHL(100nM)在100μL pte缓冲剂中混合,并在室温下温育20分钟。通过绿脓杆菌PAO1-ΔlasI-JP2(1/50)的过夜预培养来接种体积为450μL的LB培养基(乳酸甲氧苄啶为300μg/mL),并补充蛋白质/AHL混合物(50μL)。在SsoPox的酶水解之前,3-氧-C12AHL的最终理论浓度为20mM。 在37℃下培养270分钟后,使用Gen5.1软件监测的微板读取器(Synergy HT,BioTek,USA)在96孔板中测量200μL培养物等分物的细胞密度(OD600nm)和生物发光(460-40nm;强度 100)。对照由相同的试验组成,但是不含酶和/或不含AHL。 [1205] 将最佳变体再次铺平板,然后按照之前所述放置于微培养物中,而且每个克隆呈现4次。完全相同地实施之前的方案,从而证明所述的结果。但是,裂解缓冲剂和pte缓冲剂不包含CoCl2盐,从而避免了在改善方法中酶对金属的亲和性的损失。 [1206] 3-改善的证明和分析 [1207] 然后,对最佳变体进行测序(Sequencage plateforme,Timone,Marseille,France),并大量生产以用于催化特性分析。针对最佳改善所选的基因或质粒可以用于实施下一轮的多样性的形成(即,返回至第一部分)。 [1208] 使用大肠杆菌菌株BL21(DE3)-pGro7/GroEL(TaKaRa)进行大量的蛋白质的生产。按照之前所述[4,6,7],在500mL ZYP培养基[3](100μg/ml氨苄青霉素,34μg/ml氯霉素)中进行生产,并加入0.2%(w/v)阿拉伯糖(Sigma-Aldrich;France)用于诱导伴侣蛋白GroEL/ES的表达,并将温度过度至25℃。按照之前所述[7],进行纯化。简言之,在70℃下实施30’温育的单一的步骤,然后进行差示硫酸铵沉淀,透析和尺寸排阻色谱法。使用超微量分光光度计(nanodrop,thermofisher scientific,France),使用PROT-PARAM(Expasy工具软件)[8]中蛋白质一级序列生成的蛋白质摩尔消光系数来定量蛋白质。3.1-动力学共性 [1209] 在25℃下评价催化参数,并按照之前所述[6],在96孔板中在用于200μL反应物的6.2mm光程长度池中,使用微板读取器(Synergy HT,BioTek,USA)和Gen5.1软件进行记录。使用Graph-Pad Prism 5软件,通过对Michaelis-Menten(MM)等式[9]拟合数据而获得催化参数。当在试验中不能达到Vmax时,使用Graph-Pad Prism 5软件,通过对线性回归拟合MM图的线性部分而获得催化效率。 [1210] 3.2-磷酸三酯酶活性的表征 [1211] 在pte缓冲剂中,通过向该缓冲剂中加入2mM DTNB进行标准测试,从而测量OP的-1 -1PNP衍生物(ε405nm=17 000M cm ),神经试剂香豆素衍生物(CMP-香豆素、IMP-香豆素、-1 -1 -1 -1 PinP-香豆素)[10](ε412nm=37 000M cm )或马拉息昂(ε412nm=13 700M cm )的时间过程水解。此外,按照之前所述,在加入0.1和/或0.01%SDS的pte缓冲剂中实施动力学[1]。 [1212] 3.3-内酯酶活性的表征 [1213] 按照之前所述的方案[6],实施内酯酶动力学。在AHL的浓度范围0-2mM内,在lac缓冲剂(Bicine 2,5mM pH 8,3、NaCl 150mM,CoCl2 0,2mM、甲酚紫0,25mM和0.5%DMSO)中实施内酯的时间过程水解。甲酚紫(在25℃下为pKa 8,3)是通过培养基的酸化而跟踪内酯环水解的pH指示剂。评价577nm下的摩尔消光系数,从而记录在乙酸浓度0-0,35mM范围内,缓冲剂缺乏。 [1214] 3.4-熔解温度的测定 [1215] 按照之前所述[6],使用Jasco J-810分光偏振计并使用Spectra Manager软件记录圆形二色性光谱,其中所述的Jasco J-810分光偏振计在1mm厚的石英池中装配有Pelletier型温度控制系统(Jasco PTC-4235)。简言之,在10mM磷酸钠缓冲剂中在pH8下进行测量,其中所述的缓冲剂中的蛋白质浓度为0.1mg/ml。在pH8的10mM磷酸钠缓冲剂(包含浓度(1.5-4M)增加的氯化胍)中,通过将温度由20℃增加至95℃(5℃/min)在222nm下记录变性。使用GraphPadPrism 5软件,通过线性拟合来推断不具有氯化胍的理论Tm。 [1216] 2-结果 [1217] 2.1-磷酸三酯酶和内酯酶活性的筛选 [1218] 之前强调,与假单胞菌(P.diminuta)PTE活性位点相比,SsoPox活性位点的一些残基有损于磷酸三酯酶活性(Hiblot et al.,2012,PloS One 7(10),e47028)。特别是,W263形成了SsoPox活性位点中的位阻,从而阻断了OP的进入。但是,已经显示W263F改变5 使得磷酸三酯酶活性改善,但是Trp和Phe均为累赘的残基 。这产生了位置W263改变的实际影响的问题。实际上,W263位置位于二聚体的界面上,并且在活性位点上加帽环将内酯环定位在SsoPox复合结构中与HTL一起。因此,研究该位置处的改变会更好地理解它们的结构影响,从而允许活性改善。 [1219] 磷酸三酯酶和内酯酶活性的筛选 [1220] 实施W263位置的饱和位点以便筛选磷酸三酯酶和内酯酶的活性。少量产生各变体(3mL)并部分纯化,从而探索SsoPox的天然热阻以实施活性筛选。 [1221] 磷酸三酯酶的活性筛选 [1222] 使用1mM和100μM来评价各变体水解对氧磷底物的能力(图1-A),并观察到相同的趋势。最有效的变体分别为SsoPox W263L、W263M和W263F,并且与SsoPox wt相比,在1mM和100μM下,比活分别增加为30-50以及20-35倍。此外,有趣地记录到在饱和位点变体(在W263K后)中,天然酶(W263)对对氧磷的水解具有更低的效率。 [1223] CMP-香豆素(图1-C)为还用于评价变体水解神经试剂的能力的环沙林衍生物(50μM)。SsoPox变体W263F、W263M和W263L展现出最佳的比活(图2-C)。与SsoPox wt相比,改善为4至11倍。 [1224] 总之,SsoPox W263F、W263L和W263M似乎能够最佳地改善磷酸三酯水解。改变主要涉及疏水性残基,具有可变的累赘物。这些蛋白质形成了“磷酸三酯酶所选变体”组。 [1225] 内酯酶活性的筛选 [1226] 假定,位阻的减小不仅解释为SsoPox W263F的磷酸三酯酶活性的改善。因此,该位置的改变使得内酯酶活性改善。为了探索该问题,已经研发了内酯酶活性的筛选方法。该筛选是基于删除了lasI基因并携带JP2质粒的绿脓杆菌PAO1衍生菌株,从而在3-氧-C12AHL(l)(涉及绿脓杆菌群体感应系统的主要内酯)存在下可以产生生物发光 (图1-C)。简言之,该菌株本身不能产生3-氧-C12AHL,因此本质上不能产生生物发光。 试验中,生物发光的强度仅仅是由于外源加入的3-氧-C12AHL。因此,如果将内酯酶与 3-氧-C12AHL预温育,则生物发光将于内酯酶(3-氧-C12AHL酶)活性呈反比。 [1227] 使用该筛选方法,选择SsoPox W263A、W263I、W263T和W263V用于潜在地内酯酶活性的改善(图3-B)。在我们的筛选条件下,不能评价改善的幅度。所选的改变涉及少量的且主要的疏水性残基。这4种变体形成了“内酯酶所选变体”组。 [1228] 2.2-SsoPox变体的酶的表征 [1229] 2.2.1-单一位置变体 [1230] 通过对磷酸三酯酶和内酯酶所选变体的酶表征可以证实筛选结果。可以大量地生产和纯化这些变体。已经表征了它们对内酯(3-氧-C12AHL(l))和磷酸三酯(对氧磷)底物的催化参数(表2)。 [1231] [1232] 表2:SsoPox的W263变体的内酯酶和磷酸三酯酶活性(ND对应于未测定的值)[1233] 磷酸三酯酶活性的表征 [1234] 在之前的研究中表征了wt SsoPox的磷酸三酯酶活性(Hiblot et al.,2012,PloS One 7(10),e47028)。如在筛选实验中已经观察到的那样,所有所选的变体对对氧磷的催化效率均高于wt蛋白质(表2)。在磷酸三酯酶所选的变体中,SsoPox W263F展现出最高4 -1 -1 的对氧磷酶催化效率(kcat/KM=1,21(±0,33)x10 M s ),然后为SsoPox W263M和SsoPox W263L,并且与wt酶相比分别增加为23,3,14,1和4,6倍(表2,图2-D)。在内酯酶所选的 3 -1 -1 变体中,仅SsoPox W263A(kcat/KM=3,55(±1,30)x10 M s )展现出比SsoPox W263L磷酸三酯酶所选的变体更高的对氧磷酶催化效率(比wt酶改善6,8倍)。 [1235] 针对磷酸三酯酶活性的改善来选择SsoPox W263L变体。由于其对磷酸三酯水解的潜力,已经寻求到其水解不同的神经试剂衍生物的能力(表3)。 [1236] [1237] 表3:SsoPox的W263L变体的磷酸三酯酶活性。ND对应于未测定的值。在SDS存在下,对于对氧磷和甲基-对硫磷而言,将试验数据拟合底物抑制等式,因为其比传统的MM等式更合适地拟合。结果,计算的催化效率仅仅在较低的底物浓度下是可利用的。 [1238] 已经显示阴离子去污剂(例如SDS)能够增加SsoPox的磷酸三酯酶活性(Hiblot4 -1 -1 et al.,2012,PloS One 7(10),e47028)。在0,01%SDS(kcat/KM=6,29(±1,62)x10 M s )存在下,将SsoPox W263L对对氧磷的水解与wt酶对对氧磷的水解比较(kcat/KM= 3 -1 -1 6,41(±1,51)x10M s )。SDS诱导的对SsoPox W263L的催化效率的改善(19,8倍)高于 wt SsoPox中所观察到的改善(12,4倍)。提出SDS引起的活性的改善是由于蛋白质的球体挠性(Hiblot et al.,2012,PloS One 7(10),e47028)。SsoPox W263L所观察到的改善更高是由于部分改变诱导的挠性,其模拟了SDS诱导的挠性。实际上,亮氨酸比Trp的累赘程度低,磷酸三酯酶改善可以归因于位阻的降低。 [1239] 此外,0,01%的SDS还能够增加SsoPox W263L对甲基-对氧磷的水解(5,3倍)。 [1240] 脱氧胆酸(DOC,一种温和的去污剂)在增加SsoPox W263L对对氧磷的水解方面4 (kcat/KM=1,30(±0,30)x10 )比SDS的功效更低。 [1241] 内酯酶活性的表征 [1242] 使用化学差异性内酯底物的目的在于理解SsoPox的内酯酶活性的改善。AHL和γ/δ-内酯(氧-内酯)在内酯环上是差异性地酰基化的(图1)。我们已经研究了具有不同尺寸的链的AHL。3-氧-C10AHL(l)(图1-D)对于wt酶而言,与3-氧-C12AHL(l)对 4 -1 -1 于已经筛选的变体相比,是好上10倍的底物(分别为kcat/KM=3,16(±0.40)x10 M s 和 3 -1 -1 kcat/KM=2,96(±0,99)x10 M s ;数据未示出)。此外,还已经研究了展现出不同环大小的 2种不同的氧-内酯。Wt SsoPox对十一烷-δ-内酯(r)(大小为6个原子的环)比对十一烷-γ-内酯(r)(大小为5个原子的环)展现出10倍以上的催化效率(分别为kcat/KM= 4 -1 -1 3 -1 -1 6,72(±2,54)x10M s 和kcat/KM=2,36(±0,38)x10 M s ;数据未示出)。 [1243] 定向演化允许“选择你所筛选的”。考虑到最佳内酯酶变体是基于它们水解3-氧-C12AHL的能力而筛选的,则对3-氧-C12AHL酶的活性实施动力学表征(表2)。所获得的结果可以证明内酯酶所选的变体展现出与SsoPox wt相比,改善的3-氧-C12AHL酶的催化效率。这些改善从对于SsoPox W263T而言26倍,到对于SsoPox W263V而言66倍, 5 -1 -1 并且kcat/KM=1,95(±0,44)x10 M s ,这是我们所了解的最佳的(图3-C)。关于磷酸三酯酶所选的变体,它们均未呈现增加的3-氧-C12AHL酶催化效率,仅SsoPox W263F呈现出与wt酶相当的效率。SsoPox W263L、W263A和W263M失去了水解上述分子的能力。所观察到的改善程度使得3-氧-C12成为潜在的混杂的底物。 [1244] 已经获得了对3-氧-C12AHL、3-氧-C10AHL、δ-内酯和十一烷-γ-内酯底物的一系列补充的结果(参见表2’)。 [1245] [1246] [1247] 表2’:SsoPox的W263变体的内酯酶活性(ND对应于未测定的值)。 [1248] 热稳定性 [1249] 通过圆形二色性光谱测定wt SsoPox酶和单一位置变体的熔解温度。结果如下: [1250] -wt:104℃ [1251] -W263F:91.8±1.7℃ [1252] -W263M:85.3±0.9℃ [1253] -W263L:92.0±2.1℃ [1254] -W263T:89.2±0.4℃ [1255] -W263V:84.1±1.6℃ [1256] -W263I:87.8±1.2℃。 [1257] 2.2.2-多位置变体 [1258] 已经针对一些上文提及的突变的极端嗜热磷酸三酯酶(PTE)水解OP或AHL化合物的能力进行测试,其中所述的突变的极端嗜热磷酸三酯酶具有内酯酶活性并且衍生自对应于SEQ ID NO:3序列的极端嗜热磷酸三酯酶。它们的酶活性的结果示于下文中。 [1259] 已经针对5种突变的极端嗜热磷酸三酯酶(PTE)的磷酸三酯酶活性进行测试,其中所述的突变的极端嗜热磷酸三酯酶具有内酯酶活性并且衍生自对应于SEQ ID NO:3序列的硫磺矿硫化叶菌的极端嗜热PTE。使用乙基-对氧磷、甲基-对氧磷、乙基-对硫磷、甲基-对硫磷和马拉息昂对磷酸三酯酶活性进行评价。结果示于下表4和5中。 [1260] [1261] 表4:SsoPoxαsA1、αsA6、αsB5的变体的磷酸三酯酶活性。催化活性表示成-1 -1M s (ND=未测试,VLH=极低的水解)。 [1262] [1263] 表5:SsoPoxαsC6和αsD6的变体的磷酸三酯酶活性。催化活性表示成M-1s-1(ND=未测试,VLH=极低的水解)。 [1264] 在磷酸三酯酶所选的变体中,SsoPoxαsD6对乙基-对氧磷、乙基-对硫磷和甲基-对硫磷展现出最高的对氧磷酶催化效率。SsoPoxαsC6对马拉息昂展现出最高的对氧磷酶催化效率。与SsoPox wt不同,SsoPoxαsA6、αsB5、αsC6和αsD6目前能够水解甲基对硫磷。 [1265] 由于其水解多种OP底物的能力,SsoPoxαsD6可能成为SsoPox最感兴趣的变体。 [1266] 实施例2 [1267] 在本实施例中,我们测试了对3-氧-C12AHL的水解能力得到改善的变体SsoPox W263I在体外是否能够降低绿脓杆菌生物膜的形成和毒力因子的产生,以及在体内是否能够降低死亡率。我们提供了内酯酶介导的群体猝灭展现出毒力以及在大鼠肺感染模型中降低绿脓杆菌致死率的证据。 [1268] 1-试验过程 [1269] 1.1-绿脓杆菌的培养 [1270] 试验室菌株PAO1(ATCC编号15692)用于所有的实验中。菌株在LB(BD,France)培养基上生长,并在-80℃下保持在50%LB肉汤和50%甘油中。携带染色体整合的PlasB-luxCDABE报告子构建体的绿脓杆菌PAO1[11]按照与野生型菌株相同的方式保持。 在摇动(200rpm)下,使菌株在37℃下在Luria-Bertani(LB)培养基(BD,France)中生长。 当需要时,使用1.5%细菌琼脂使LB固化。 [1271] 对于体内研究而言,在实验时,使包含细菌的等分物解冻,并在COS(Biomerieux,France)(Columbia,含有5%绵羊血)琼脂平板上培养。对10个新鲜的集落取样,并在37℃下在持续搅拌下在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB,Biomerieux,France)中培养过夜,直至培养的PAO1的OD600nm=1。随后,进行系列稀释,从而调节细菌的量,并通过在合 8 适的培养基上铺平板系列稀释物并计数集落来证明确切的浓度。10CFU/ml接种物用于所有的动物感染。 [1272] 1.2-生物膜形成的测定 [1273] 在10%TSB中以1:50稀释绿脓杆菌PAO1的培养物(18小时),并分配于Calgary Biofilm Device 96孔板(Innovotech Inc.,Edmonton,Canada)的孔中。为了测试对生物膜形成的抑制,将3倍系列稀释物(50μg降至0.5μg的SsoPox W263I)加入至孔中。将平板在以120Hz摇动下在37℃下温育4小时。使用1%结晶紫染色生物膜。由生物膜得到的结晶紫溶解于100%乙醇中,并通过测量600nm处的吸光率来进行定量[14]。此外,还在600nm处测量绿脓杆菌PAO1浮游生物的生长。 [1274] 1.3-LasB报告系统 [1275] 由18hr老的培养物得到的、携带PlasB-luxCDABE的绿脓杆菌PAO1的等分物置于96孔板的孔中,其后加入由50μg至0.05μg的SsoPox W263I的稀释物。将平板在37℃下温育90分钟,每10分钟摇动一次,其中每10分钟测量一次发光,从而测定群体感应报告子的活性。 [1276] 1.4-动物的一般程序 [1277] 在单个的塑料笼中饲养得自SAS Janvier(Le-Genest-St-Isle,France)的、重250至300g的成年Sprague-Dawley雄性无病原体大鼠,其中所述的塑料笼放置于通风加压的柜子(A-BOX 160,Noroit,Rezé,France)中,并且可以自由获得水和标准的饮食。使用在 100%氧气中5% (Abbott,Rungis,France)麻醉动物(麻醉箱,Harvard Apparatus,Les Ulis,France)。暴露它们的气管,并使用16号导管插管,用于施用药品和/或细菌。清醒的动物仍放回与初始相同的条件下饲养,并每天称重。在各试验结束时,使用腹膜内注射致死剂量的戊硫代巴比妥(Panpharma,France)实施安乐死。 [1278] 1.5-吸入SsoPox W263I的大鼠的耐受 [1279] 在初步研究中,在接受250μl浓度为0.1、1或10mg/ml的SsoPox W263I的3组动物(n=3/组)中证明通过气管内途径施用SsoPox的耐受,并将其与接受250μl磷酸盐缓冲盐水(PBS;Biomerieux;France)的5个对照比较。在6、24和48小时后每组处死一只动物。在48小时后处死存活的动物。死后移出肺并记录它们的肉眼可见的方面,然后保存于福尔马林中用于组织学评估。 [1280] 1.6-大鼠呼吸感染模型和SsoPox W263I处理 [1281] 通过气管内接种包含108CFU/ml绿脓杆菌PAO1的250μl PBS溶液来感染3组20只动物。同时,第一组在气管中接受250μl额外PBS(未处理组:NT),另一组接受浓度为1mg/ml的250μl SsoPox W263I(立即处理组:IT)。在最后一组中,动物在3小时后接受浓度为1mg/ml的250μl SsoPox W263I(延迟处理组:DT)。使用与感染相同的麻醉过程在气管内递送SsoPox W263I和额外的PBS。 [1282] 1.7-肺处理 [1283] 感染后,观察动物2天,并记录自发死亡率。在48小时后对存活大鼠实施安乐死。在死亡后,以无菌方式除去肺。在PBS中均化处理右肺,用于细菌培养。保存左肺用于组织学分析。 [1284] 1.8-组织学严重性得分(HSS) [1285] 由病理学家实施检查,所述的病理学家对组的特性是盲态的(H.L.)。如之前所报告,基于支气管肺炎损伤的数量来计算HSS(0为无损伤;1为30处损伤/肺;2为≥30处损伤/肺;3为支气管肺炎的融合损伤)[13]。 [1286] 1.9-统计学 [1287] 基于受PAO1感染的NT组中80%的死亡率(由文献数据可知[12])降低至处理组中50%的预期死亡率来计算研究动物的数量(20动物/组),并且统计功效为90%且2组α值为0.05。 [1288] 2-结果 [1289] 2.1-SsoPox W263I引起的lasB表达和生物膜形成的减少 [1290] 我们测量在绿脓杆菌PAO1菌株中的lasB转录,其中所述的菌株携带染色体整合的PlasB-luxCDABE报告子构建体。基因lasB编码弹性蛋白酶,一种由群体感应调节的典型毒力因子。将SsoPox W263I加入至绿脓杆菌PAO1培养物中会显著地减少lasB转录(图4)。SsoPox W263I介导的lasB的抑制展现出剂量依赖的概况,其中酶的半数抑制浓度([C1/2])为大约0.5μg/mL(图4)。 [1291] 此外,群体感应还部分地调节了生物膜的形成。研究SsoPox W263I对绿脓杆菌形成生物膜的能力的影响。我们的结果显示内酯酶以剂量依赖的方式抑制生物膜的形成。并且[C1/2]为大约170μg/mL(图5)。 [1292] 2.2-SsoPox W263I保护大鼠免于患上绿脓杆菌PAO1肺炎 [1293] 研究SsoPox处理对大鼠呼吸组织的影响。气管灌输SsoPox W263I是良好耐受的,不管施用剂量(至多2.5mg)如何,均未观察到自发死亡率。处理后除去的肺显示未见肉眼可见的损伤迹象,并且组织学分析显示正常的肺实质。SsoPox W263I在大鼠呼吸实质中未引起可观察到的急性炎性反应。 [1294] 在2组20只大鼠中,对SsoPox W263I对绿脓杆菌肺感染的影响进行研究。在未处理组(NT)中,在接种绿脓杆菌后的死亡率为75%(15/20)。当在接种绿脓杆菌后立即使用SsoPox(1mg/mL)处理大鼠时(IT),死亡率显著降低至20%(4/20)(p=0.0001,对于NT)(图6)。此外,我们观察到IT组中的体重损失(由接种绿脓杆菌的那天开始直至死亡那天测量的)显著低于NT组(分别为11.3±12g与20.4±9.3g;p=0.01)。DT组损失25.6±1.82g体重(p=0.77,对于NT组)。此外,DT组中直至死亡的平均时间显著长于对照组(37±13与25±16小时;p=0,01)。 [1295] 与IT组的存活增加相一致,我们记录到IT组中的动物的肺比NT组具有更低的炎性损害(图7):HSS(1.27±0.6与2,64±0.4;p=0.005)。在DT组中,平均HSS无异于NT组。 [1296] 实施例3 [1297] 分别在24小时和48小时期间,对牡蛎幼虫(太平洋牡蛎(Crassostrea gigas))和海胆幼虫(拟球海胆(Paracentrotuslividus))的活力和发育来测试SsoPox的毒力。使用10mg/l、1mg/l、100μg/l、10μg/l、1μg/l或100ng/l SsoPox进行实验,并分析至少100个幼虫的2种样品。CuSO4用作毒性对照。 [1298] 在海胆幼虫的情况下,在任何测试浓度下均未观察到作用。 [1299] 在牡蛎幼虫的情况下,在等于或低于1mg/L的浓度下未观察到作用,在2,9mg/L(样品1)或3,5mg/L(样品2)的浓度下,仅10%的群体受影响。 [1300] 这些结果表明高浓度的SsoPox对于活的有机体是无毒性的,因此在海洋环境中使用SsoPox可以被认为是有利的。 [1301] 参考文献 [1302] 1.Hiblot J,Gotthard G,Chabriere E,Elias M(2012)Characterisation of the organophosphate hydrolase catalytic activity of SsoPox.Sci Rep 2:779. 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