RNA-유도된 표적 DNA 변형 및 전사의 RNA-유도된 조절을 위한 방법 및 조성물 |
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| 申请号 | KR1020177034069 | 申请日 | 2013-03-15 | 公开(公告)号 | KR1020170134766A | 公开(公告)日 | 2017-12-06 |
| 申请人 | 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아; 유니버시티 오브 비엔나; 샤르팡티에 엠마뉴엘; | 发明人 | 샤르팡티에엠마뉴엘; 도우드나제니퍼에이.; 지넥마틴; 칠린스키크지슈토프; 도우드나케이트제임스해리슨; 림웬델; 치레이; | ||||
| 摘要 | 본개시내용은표적서열을포함하는 DNA-표적화 RNA를제공하고, 변형폴리펩타이드와함께, 표적 DNA 및/또는표적 DNA와연관된폴리펩타이드의부위특이적인변형을제공한다. 본개시내용은추가로, 부위특이적인변형폴리펩타이드를제공한다. 본개시내용은추가로, 표적 DNA 및/또는표적 DNA와연관된폴리펩타이드의부위특이적인변형방법을제공한다. 본개시내용은표적세포에서표적핵산의전사를조절하는방법을제공하고, 일반적으로상기표적핵산을효소적으로불활성 Cas9 폴리펩타이드및 DNA-표적화 RNA와접촉시키는것을수반한다. 본방법을수행하기위한키트및 조성물이또한제공된다. 본개시내용은 Cas9를생산하는유전적으로변형된세포; 및 Cas9 이식유전자비-인간다중세포유기체를제공한다. | ||||||
| 权利要求 | 표적 DNA를 하기를 포함하는 복합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 DNA의 변형 방법: (a) Cas9 폴리펩타이드 및 (b) (i) 표적 DNA에서 서열에 대해 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA-표적화 분절 및 (ii) 상기 Cas9 폴리펩타이드와 상호작용하는 단백질-결합 분절 을 포함하는 단일-분자 DNA-표적화 RNA, 여기서 단백질-결합 분절은 혼성화되어 이중 가닥 RNA(dsRNA) 듀플렉스를 형성하는 뉴클레오타이드의 두 개의 상보성 스트레치를 포함하고, 상기 dsRNA 듀플렉스는 tracrRNA 및 CRISPR RNA(crRNA)의 상보성 뉴클레오타이드를 포함하며, 뉴클레오타이드의 상기 두 개의 상보성 스트레치는 개재 뉴클레오타이드에 의해 공유적으로 결합되고, 상기 접촉시키는 단계는 시험관 내에서 또는 생체 외 세포에서 일어나며; 상기 변형은 표적 DNA의 절단이다. 제1 항에 있어서, 상기 dsRNA 듀플렉스는 8 염기쌍(bp) 내지 30 bp의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법. 제1 항 또는 제2 항에 있어서, 단백질-결합 분절의 dsRNA 듀플렉스를 형성하기 위해 혼성화되는 뉴클레오타이드들 사이의 % 상보성이 70%보다 큰 것을 특징으로 하는 방법. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 DNA는 박테리아 세포, 고세균 세포, 단일-세포 진핵 유기체, 식물 세포, 무척추 동물로부터의 세포 또는 척추동물로부터의 세포에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 DNA는 염색체 DNA인 것을 특징으로 하는 방법. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계는 세포에 (a) 상기 Cas9 폴리펩타이드 또는 상기 Cas9 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 (b) 상기 DNA-표적화 RNA 또는 상기 DNA-표적화 RNA를 인코딩하는 DNA 폴리뉴클레오타이드를 도입시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. 제6 항에 있어서, 방법은 세포에 공여체 폴리뉴클레오타이드를 도입시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 형질도입 도메인은 Cas9 폴리펩타이드의 아미노 말단에 공유적으로 결합되고, 상기 단백질 형질도입 도메인은 Cas9 폴리펩타이드의 사이토졸로부터 세포의 소기관 내로의 가로지름을 촉진하는 것을 특징으로 하는 방법. 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 형질도입 도메인은 Cas9 폴리펩타이드의 카르복실 말단에 공유적으로 결합되고, 상기 단백질 형질도입 도메인은 Cas9 폴리펩타이드의 사이토졸로부터 세포의 소기관 내로의 가로지름을 촉진하는 것을 특징으로 하는 방법. (a) Cas9 폴리펩타이드 또는 상기 Cas9 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 (b) 단일 분자 DNA-표적화 RNA 또는 상기 DNA-표적화 RNA를 인코딩하는 DNA 폴리뉴클레오타이드 를 포함하는 조성물로서, 상기 단일-분자 DNA-표적화 RNA는 (i) 표적 DNA에서 서열에 대해 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA-표적화 분절 및 (ii) 상기 Cas9 폴리펩타이드와 상호작용하는 단백질-결합 분절을 포함하고, 여기서 단백질-결합 분절은 혼성화되어 이중 가닥 RNA(dsRNA) 듀플렉스를 형성하는 뉴클레오타이드의 두 개의 상보성 스트레치를 포함하며, 상기 dsRNA 듀플렉스는 tracrRNA 및 CRISPR RNA(crRNA)의 상보성 뉴클레오타이드를 포함하고, 뉴클레오타이드의 상기 두 개의 상보성 스트레치는 개재 뉴클레오타이드에 의해 공유적으로 결합되는 조성물. 제10 항에 있어서, 상기 dsRNA 듀플렉스는 8 염기쌍 (bp) 내지 30 bp의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물. 제10 항 또는 제11 항에 있어서, 단백질-결합 분절의 dsRNA 듀플렉스를 형성하기 위해 혼성화되는 뉴클레오타이드들 사이의 % 상보성이 70%보다 큰 것을 특징으로 하는 조성물. 제10 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 DNA는 박테리아 세포, 고세균 세포, 단일-세포 진핵 유기체, 식물 세포, 무척추 동물로부터의 세포 또는 척추동물로부터의 세포에 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물. 제10 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 DNA는 염색체 DNA인 것을 특징으로 하는 조성물. 제10 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 형질도입 도메인은 Cas9 폴리펩타이드의 아미노 말단에 공유적으로 결합되고, 상기 단백질 형질도입 도메인은 Cas9 폴리펩타이드의 사이토졸로부터 세포의 소기관 내로의 가로지름을 촉진하는 것을 특징으로 하는 조성물. 제10 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 형질도입 도메인은 Cas9 폴리펩타이드의 카르복실 말단에 공유적으로 결합되고, 상기 단백질 형질도입 도메인은 Cas9 폴리펩타이드의 사이토졸로부터 세포의 소기관 내로의 가로지름을 촉진하는 것을 특징으로 하는 조성물. 제10 항 내지 제16 항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 폴리펩타이드와 단일-분자 DNA-표적화 RNA는 시험관 내 또는 생체 외 세포에 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물. 단일 분자 DNA-표적화 RNA 또는 상기 DNA-표적화 RNA를 인코딩하는 DNA 폴리뉴클레오타이드로서, 단일-분자 DNA-표적화 RNA는 (a) 표적 DNA에서 표적 서열에 대해 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA-표적화 분절 및 (b) Cas9 단백질과 상호작용하는 단백질-결합 분절을 포함하고, 여기서 단백질-결합 분절은 혼성화되어 이중 가닥 RNA(dsRNA) 듀플렉스를 형성하는 뉴클레오타이드의 두 개의 상보성 스트레치를 포함하며, 상기 dsRNA 듀플렉스는 tracrRNA 및 CRISPR RNA(crRNA)의 상보성 뉴클레오타이드를 포함하고, 뉴클레오타이드의 상기 두 개의 상보성 스트레치는 개재 뉴클레오타이드에 의해 공유적으로 결합되는 단일-분자 DNA-표적화 RNA. 제18 항에 있어서, 상기 dsRNA 듀플렉스는 8 염기쌍 (bp) 내지 30 bp의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 단일-분자 DNA-표적화 RNA. 제18 항 또는 제19 항에 있어서, 단백질-결합 분절의 dsRNA 듀플렉스를 형성하기 위해 혼성화되는 뉴클레오타이드들 사이의 % 상보성이 70%보다 큰 것을 특징으로 하는 단일-분자 DNA-표적화 RNA. 제18 항 내지 제20 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 DNA는 박테리아 세포, 고세균 세포, 단일-세포 진핵 유기체, 식물 세포, 무척추 동물로부터의 세포 또는 척추동물로부터의 세포에 존재하는 것을 특징으로 하는 단일-분자 DNA-표적화 RNA. 제18 항 내지 제20 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 DNA는 염색체 DNA인 것을 특징으로 하는 단일-분자 DNA-표적화 RNA. (a) (i) 표적 DNA에서 서열에 대해 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA-표적화 분절 및 (ii) Cas9 폴리펩타이드와 상호작용하는 단백질-결합 분절을 포함하고, 여기서 단백질-결합 분절은 혼성화되어 이중 가닥 RNA(dsRNA) 듀플렉스를 형성하는 뉴클레오타이드의 두 개의 상보성 스트레치를 포함하며, 상기 dsRNA 듀플렉스는 tracrRNA 및 CRISPR RNA(crRNA)의 상보성 뉴클레오타이드를 포함하고 뉴클레오타이드의 상기 두 개의 상보성 스트레치는 개재 뉴클레오타이드에 의해 공유적으로 결합되며, 상기 DNA-표적화 RNA를 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열이 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 단일-분자 DNA-표적화 RNA를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열; 및, 임의로 (b) 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는, 상기 Cas9 폴리펩타이드를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열 을 포함하는 하나 이상의 핵산. 제23 항에 있어서, 상기 핵산은 하나 이상의 재조합 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 하나 이상의 핵산. 제23 항 또는 제24 항에 있어서, 상기 dsRNA 듀플렉스는 8 염기쌍 (bp) 내지 30 bp의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 하나 이상의 핵산. 제23 항 내지 제25 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질-결합 분절의 dsRNA 듀플렉스를 형성하기 위해 혼성화되는 뉴클레오타이드들 사이의 % 상보성이 70%보다 큰 것을 특징으로 하는 하나 이상의 핵산. 제23 항 내지 제26 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 DNA는 박테리아 세포, 고세균 세포, 단일-세포 진핵 유기체, 식물 세포, 무척추 동물로부터의 세포 또는 척추동물로부터의 세포에 존재하는 것을 특징으로 하는 하나 이상의 핵산. 제23 항 내지 제26 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 DNA는 염색체 DNA인 것을 특징으로 하는 하나 이상의 핵산. (a) Cas9 폴리펩타이드 또는 상기 Cas9 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 및 (b) 단일-분자 DNA-표적화 RNA 또는 상기 단일-분자 DNA-표적화 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 키트로서, 여기서 단일-분자 DNA-표적화 RNA는 (i) 표적 DNA에서 서열에 대해 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA-표적화 분절 및 (ii) 상기 Cas9 폴리펩타이드와 상호작용하는 단백질-결합 분절을 포함하고, 여기서 단백질-결합 분절은 혼성화되어 이중 가닥 RNA(dsRNA) 듀플렉스를 형성하는 뉴클레오타이드의 두 개의 상보성 스트레치를 포함하며, 상기 dsRNA 듀플렉스는 tracrRNA 및 CRISPR RNA(crRNA)의 상보성 뉴클레오타이드를 포함하고, 뉴클레오타이드의 상기 두 개의 상보성 스트레치는 개재 뉴클레오타이드에 의해 공유적으로 결합되며, (a)와 (b)는 동일 또는 별도의 용기에 들어 있는 키트. 제29 항에 있어서, 표적 DNA는 박테리아 세포, 고세균 세포, 단일-세포 진핵 유기체, 식물 세포, 무척추 동물로부터의 세포 또는 척추동물로부터의 세포에 존재하는 것을 특징으로 하는 키트. 제29 항에 있어서, 표적 DNA는 염색체 DNA인 것을 특징으로 하는 키트. 환자의 치료적 처치 방법에 사용하기 위한, 제10 항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제18 항 내지 제22 항 중 어느 한 항의 단일-분자 DNA-표적화 RNA 또는 제23 항 내지 제28 항 중 어느 한 항의 하나 이상의 핵산. |
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| 说明书全文 | |||||||
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