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一株转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌及其构建方法与应用
申请号	CN201510008195.9	申请日	2015-01-07	公开(公告)号	CN104531599A	公开(公告)日	2015-04-22
申请人	南京大学;			发明人	杨柳燕; 王鑫; 陈旭; 张文; 李丽; 王爱丽; 吴丹;
摘要	本发明公开了一株转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌，它是导入了来源于其自身的多聚磷酸盐激酶Ppk1基因的弗氏柠檬酸杆菌。该弗氏柠檬酸杆菌基因组DNA中只有多聚磷酸盐激酶基因Ppk1，并且Ppk1基因和外切聚磷酸酶基因Ppx的调控方式为双顺反共转录。具备以上特征的细菌均可通过以宿主菌自身为受体表达其自身来源的Ppk1基因来提高聚磷能力。本发明还公开了上述转聚磷基因弗氏柠檬酸杆菌的构建方法和在废水除磷中应用。本发明得到的转聚磷基因弗氏柠檬酸杆菌具有去磷能力强的特点。
权利要求	1.一株转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌，其特征在于，它是以弗氏柠檬酸杆菌为宿主，并导入了宿主自身的多聚磷酸盐激酶Ppk1。 2.根据权利要求1所述的转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌，其特征在于，所述的弗氏柠檬酸杆菌的基因组DNA中只有Ppk1一种多聚磷酸盐激酶基因，且该Ppk1基因在基因组上与外切聚磷酸酶基因Ppx的调控方式为双顺反子共转录。 3.根据权利要求1所述的转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌，其特征在于，所述的弗氏柠檬酸杆菌为弗氏柠檬酸杆菌ATCC 8090，所述的多聚磷酸盐激酶Ppk1基因的GenBank号为ANAV01000007.1。 4.权利要求1所述的转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)提取弗氏柠檬酸杆菌的基因组DNA； (2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，PCR扩增得到其自身来源的多聚磷酸盐激酶Ppk1基因； (3)用T4连接酶将步骤(2)得到的多聚磷酸盐激酶Ppk1基因连接到T-Vector pMD19载体上，得到T-Ppk1质粒； (4)用限制性内切酶双酶切T-Ppk1质粒和广宿主表达质粒pBBR1MCS-2，得到Ppk1基因片段和线性化的pBBR1MCS-2； (5)用T4连接酶将步骤(4)得到的Ppk1基因片段与线性化的pBBR1MCS-2连接，得到连接有Ppk1基因的pBBR1MCS-Ppk1质粒； (6)以弗氏柠檬酸杆菌为受体菌，将步骤(5)得到的pBBR1MCS-Ppk1质粒通过电转化的方法导入受体菌，得到转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌。 5.权利要求1所述的转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌在废水除磷中的应用。 6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的废水，其中磷含量为0.1～20mg/L。 7.一种提高菌株在废水中聚磷能力的方法，其特征在于，该方法是以基因组上只有Ppk1一种多聚磷酸盐激酶基因的菌株为宿主菌，该宿主菌中Ppk1基因在其基因组上与外切聚磷酸酶基因Ppx的调控方式为双顺反子共转录，通过PCR的方法获得该宿主菌的Ppk1基因，并构建到表达质粒中，最后将连接有Ppk1基因的表达质粒转化该宿主菌，得到转聚磷基因的宿主菌，所述的宿主菌为：鲍氏不动杆菌、丙酮丁醇梭菌、盐红螺菌、亚硝化单胞菌、沙雷氏菌或希瓦氏菌。
说明书全文	一株转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌及其构建方法与应用技术领域 [0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌及其构建方法与应用。背景技术 [0002] 在淡水水体中，控制或减轻富营养化很大程度有赖于控制磷营养元素的输入。输入水体的含磷营养物的来源是多方面的，包括自然过程和人类活动，但是真正引起水体内磷过量而导致水体富营养化的原因主要还是人类活动。在我国含磷污染物主要来源为生活污染源、农业污染源、畜禽污染源及工业污染源。为解决磷污染所带来的危害，在污水进入水体前进行有效处理，降低排放污水中的磷浓度十分必要。 [0003] 目前污水除磷技术主要分为两种，即化学除磷和生物除磷。在化学除磷技术中，以化学沉淀法用的最多，其基本思路为在污水处理流程中的不同环节投加价格便宜的化学沉淀剂，这些沉淀剂一般都有絮凝功能，沉淀剂与污水中的磷酸盐反应凝聚成颗粒状或非溶解性的絮凝沉淀，从而将溶解性的磷去除。化学除磷具有操作简单、去除率高、运行稳定等优点，但是对于磷浓度较低的城市污水而言，欲将低浓度的磷酸盐以化学沉淀的形式从水溶液中分离，投加过量的化学沉淀剂是保障出水水质的基本条件，因此该法存在投药量大、处理费用高、产生的化学污泥量大且富含有机质等弊端，不利于其在实际污水处理过程中的应用。生物除磷技术主要来源于50年代末60年代初Srinath等人在生产运行中观察到的超量吸磷现象，经过多年系统全面的基础研究、生产性研究及工程运行总结，形成了几种主流的除磷工艺，主要包括A/O工艺、Phoredox(Bardenpho)工艺、氧化沟工艺以及序批式活性污泥法(SBR)等，无论上述何种工艺利用的都是生物超量积累磷的原理。污水中磷的生物去除主要有两种方式：一是微生物正常生长所需要的磷，随着生物体的排除而去除；二是通过厌氧和好氧的交替运行使聚磷微生物(Phosphorus accumulating organisms，PAOs)在厌氧条件下分解多聚磷酸盐(Polyphosphate，Polyp)的同时聚集聚β-羟基丁酸(Poly-β-hydroxybutyric acid，PHB)，在好氧条件下分解PHB以获得能量用于主动吸收磷酸盐，并以Polyp的形式储存在体内，随着生物体的排除而去除。目前世界各国大规模污水处理厂常用的除磷法主要是生物除磷，尤其是生物强化除磷法(Enhanced biological Phosphorus removal，EBPR)，因其具有污泥产生量少、不使用化学物质和运行经济等特征。 [0004] Polyp是由3-1000多个不等的正磷酸盐基团通过类似于腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine triphosphate，ATP)中的高能磷酸键连接而成的线性多聚体，它广泛存在于细菌、真菌等低等单细胞生物和高等哺乳动物细胞中。尽管到目前为止，这种充满了高能磷酸键的化合物的确切生理功能还未被完全认识清楚，但可以肯定的是它与多种生物功能密切相关，这些功能包括：(1)磷酸盐及高能磷酸键的储藏库；(2)二价阳离子的螯合剂；(3)与核糖体蛋白相互作用促进翻译过程，并可能与错译的纠正有关；(4)促进严谨反应(Stringent response)等； [0005] 据目前所知，多条代谢通路和Polyp的合成相关，其中最为广泛接受的观点是多数微生物中Polyp的合成是由其基因组编码的多聚磷酸盐激酶(Polyphosphate kinase，Ppk)来催化完成。Ppk包括两个两个家族，Ppk1和Ppk2，它们各自催化以下两种可逆反应： [0006] [0007] [0008] Ppk1和Ppk2除了底物偏好性不同以外，最显著的区别在于Ppk1倾向于Polyp的合成，而Ppk2更倾向于Polyp的水解。 [0009] 由于最先在大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)中发现Ppk(属于Ppk1家族)，其相关的编码基因已被克隆，其翻译成的Ppk1蛋白已被纯化，加之许多学者想通过强化表达该基因的方法来实现生物强化除磷，目前已有E.coli的Ppk1基因在E.coli中表达并获得显著效果的相关报道，但鉴于E.coli身份的特殊性，其环境应用有待商榷。发明内容 [0010] 本发明所要解决的技术问题是，提供一株转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌，能高效去除废水中的磷。 [0011] 本发明还要解决的技术问题是，提供上述转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌的构建方法及其在废水除磷中的应用。 [0012] 本发明最后要解决的技术问题是，提供一种提高与弗氏柠檬酸杆菌具有相似聚磷基因特征的细菌的聚磷能力的细菌生物修饰策略和方法。 [0013] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方法： [0014] 一株转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌，它是以弗氏柠檬酸杆菌为宿主，并导入了宿主自身的多聚磷酸盐激酶Ppk1。 [0015] 其中，所述的弗氏柠檬酸杆菌的基因组DNA中只有Ppk1一种多聚磷酸盐激酶基因，且该Ppk1基因在基因组上与外切聚磷酸酶基因Ppx的调控方式为双顺反子共转录。 [0016] 其中，所述的弗氏柠檬酸杆菌为弗氏柠檬酸杆菌ATCC 8090，所述的多聚磷酸盐激酶Ppk1基因的GenBank号为ANAV01000007.1。 [0017] 上述的转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌的构建方法，包括如下步骤： [0018] (1)弗氏柠檬酸杆菌多聚磷酸盐激酶Ppk1基因的获取： [0019] 根据NCBI数据库中提供的Citrobacter freundii ATCC 8090(弗氏柠檬酸杆菌ATCC 8090)“whole genome shotgun sequence”，设计两条引物，引物序列如下：SEQ ID NO.3：正向引物(命名为CFPPKF)：5’-GGGGTACCAatgggtcaggaaaagctatacatcg-3’，SEQ ID NO.4：反向引物(命名为CFPPKR)：5’-CCCAAGCTTttagtcaggttgctcgagtgatttg-3’，[0020] 以弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii ATCC 8090基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增条件为：95℃5min，98℃10Sec，68℃2min，30个循环，72℃5min，得到Ppk1基因片段； [0021] (2)构建T-Ppk1质粒： [0022] 将步骤(1)得到的Ppk1基因片段利用PCR产物回收试剂盒回收，对Ppk1基因片段进行加A反应，再次回收后用T4连接酶将其与T-Vector pMD19(Simple)载体进行连接，得到T-Ppk1质粒，将其热击转化E.coli DH5α感受态细胞，在含有100μg/ml Amp的LB平板上进行筛选，提取质粒验证后，交由测序公司测定插入片段序列，利用Bio-Edit 软件进行序列分析； [0023] (3)构建pBBR1MCS-Ppk1质粒： [0024] 使用限制性核酸内切酶Kpn I和Hind III酶切T-Ppk1质粒，将测序正确的弗氏柠檬酸杆菌Ppk1基因片段从T-Vector pMD19(Simple)载体上双酶切下来，使用凝胶回收试剂盒回收该目的片段，用T4连接酶将该目的片段与经过同样双酶切并回收的广宿主表达载体pBBR1MCS-2相连接，得到pBBR1MCS-Ppk1质粒，将该质粒热击转化E.coliDH5α感受态细胞，在含有50μg/ml Kana的LB平板上进行筛选，提取质粒双酶切验证后，再次交由测序公司测定插入片段序列，并用Bio-Edit软件进行序列分析以确保序列正确。 [0025] (4)弗氏柠檬酸杆菌电转化感受态细胞的制备： [0026] 将弗氏柠檬酸杆菌野生型菌株ATCC8090(命名为：CF-WT)于LB平板上划线，37℃静置培养12hr以获取单菌落。挑取CF-WT单菌落于3ml LB培养基中，37℃，200rmp振荡培养12hr。按1:100(V/V)的接种比例，将CF-WT接种于50ml LB培养基中，37℃，200rmp振荡培养至OD600＝0.35。将所获得的培养物冰浴30min，期间不时地轻轻摇动，以保证培养物充分冷却。在4℃和2500rpm，离心10min弃上清以收集菌体。以30ml冰浴预冷的无菌去离子水重悬菌体，4℃，2500rpm，离心10min，弃上清。再重复悬浮一次，并弃尽上清。以1ml10％(V/V)冰浴预冷的甘油重悬菌体，并分装成100μl/1.5ml离心管，置于冰上备用。 [0027] (5)转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌的构建: [0028] 使用电转化的方法将所构建好的含有Citrobacter freundii Ppk1基因的广宿主表达载体pBBR1MCS-2，转入弗氏柠檬酸杆菌ATCC 8090中，在含有50μg/ml Kana的LB平板上进行筛选，能从中提取出该表达载体的菌株即为转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌。 [0029] 上述转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌在废水除磷中的应用也在本发明的保护范围之内。 [0030] 其中，所述的废水，其中磷含量为0.1～20mg/L。 [0031] 一种提高菌株在废水中聚磷能力的方法，该方法是以基因组上只有Ppk1一种多聚磷酸盐激酶基因的菌株为宿主菌，该宿主菌中Ppk1基因在其基因组上与外切聚磷酸酶基因Ppx的调控方式为双顺反子共转录，通过PCR的方法获得该宿主菌的Ppk1基因，并构建到表达质粒中，最后将将连接有Ppk1基因的表达质粒转化该宿主菌，得到转聚磷基因的宿主菌，所述的宿主菌为鲍氏不动杆菌、丙酮丁醇梭菌、盐红螺菌、亚硝化单胞菌、沙雷氏菌或希瓦氏菌。 [0032] 有益效果： [0033] 1、本发明通过PCR获得来源于Citrobacter freundii ATCC 8090的Ppk1基因，并将该基因片段通过酶切连接构建到广宿主表达载体pBBR1MCS-2上，得到pBBR1MCS-Ppk1质粒，再将pBBR1MCS-Ppk1质粒转化Citrobacter freundii ATCC 8090得到转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌。 [0034] 2、本发明得到的转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌在含磷的废水中的最大OD值达0.58左右，而没有转聚磷基因的对照菌株的最大OD值只能达到0.47左右，因此，转聚磷基因有利于弗氏柠檬酸杆菌在含磷废水中生存和聚磷，从而有效去除废水中磷。 [0035] 3、本发明构建得到的转聚磷基因弗氏柠檬酸杆菌对废水中磷的去除能力比已经报道的大肠杆菌BL-PPK菌株的去除能力提高了35％。附图说明 [0036] 图1Citrobacter freundii Ppk1基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。 [0037] 图2pBBR1MCS-2空载载体以及与Citrobacter freundii Ppk1连接后的琼脂糖凝胶电泳图。 [0038] 图3生物修饰弗氏柠檬酸杆菌在合成废水中生长曲线。 [0039] 图4添加生物修饰弗氏柠檬酸杆菌合成废水中磷浓度的变化。 [0040] 图5生物修饰弗氏柠檬酸杆菌(CF-MPPK)胞内异染粒染色图片。 [0041] 图6Pseudomonas putida KT2440基因组DNA中Ppx和Ppk1的结构图。具体实施方式 [0042] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。 [0043] 以下实施例中所用的菌株和质粒来源如下： [0044] (1)大肠杆菌E.coli DH5α由本实验室保藏； [0045] (2)弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC)，菌种保藏编号10296，其ATCC保藏编号8090(American Type Culture Collection，ATCC，美国标准菌种收藏所)； [0046] (3)质粒T-Vector pMD19(Simple)：购自宝生物工程(大连)有限公司(TARAKA)； [0047] (4)质粒pBBR1MCS-2：广宿主表达载体，由本实验室保藏。 [0048] 以下实施例中所用的酶及其他试剂的来源如下： [0049] 限制性内切酶、连接酶、Taq DNA聚合酶、Prime STAR DNA聚合酶、4种dNTP预混液购自宝生物工程(大连)有限公司(TARAKA)； [0050] Tryptone和Yeast extract购自英国OXOID公司； [0051] 抗生素购自上海生工生物工程有限公司； [0052] 其余常规化学试剂均为国产分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司； [0053] PCR产物纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司； [0054] 细菌基因组DNA抽提试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司； [0055] 引物由上海生工生物工程有限公司代为合成。 [0056] 实施例1：转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌的构建。 [0057] (1)弗氏柠檬酸杆菌Ppk1基因的PCR扩增： [0058] 根据NCBI数据库中提供的Citrobacter freundii ATCC 8090“whole genome shotgun sequence”，GenBank登录号:ANAV01000007.1，设计两条引物-正向引物(命名为CFPPKF)：5’-GGGGTACCAatgggtcaggaaaagctatacatcg-3’，反向引物(命名为CFPPKR)：5’-CCCAAGCTTttagtcaggttgctcgagtgatttg-3’，以Citrobacter freundii ATCC 8090基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增条件为：95℃5min，98℃10Sec，68℃2min，30个循环， 72℃5min。 [0059] (2)弗氏柠檬酸杆菌Ppk1基因的序列测定分析： [0060] 将PCR产物清洁回收进行加A反应，再次清洁回收后与T-Vector pMD19(Simple)载体进行连接，得到T-Ppk1质粒，将其热击转化E.coli DH5α感受态细胞，在含有100μg/ml Amp的LB平板上进行筛选，提取质粒验证后，交由南京思普金生物科技有限公司测定插入片段序列，利用Bio-Edit软件进行序列分析。 [0061] (3)表达载体的构建： [0062] 使用限制性核酸内切酶Kpn I和Hind III将测序正确的Citrobacter freundii Ppk1基因片段从T-Vector pMD19(Simple)载体上双酶切下来，使用凝胶回收试剂盒回收该目的片段，将该目的片段与经过同样双酶切并回收的广宿主表达载体pBBR1MCS-2相连接，得到pBBR1MCS-Ppk1质粒，再将其热击转化E.coli DH5α感受态细胞，在含有50μg/ml Kana的LB平板上进行筛选，提取质粒双酶切验证后，再次交由南京思普金生物科技有限公司测定插入片段序列，并用Bio-Edit软件进行序列分析以确保序列正确。 [0063] (4)弗氏柠檬酸杆菌电转化感受态细胞的制备： [0064] 将Citrobacter freundii野生型菌株(命名为：CF-WT)于LB平板上划线，37℃静置培养12hr以获取单菌落。挑取CF-WT单菌落于3ml LB培养基中，37℃，200rmp振荡培养12hr。按1:100(V/V)的接种比例，将CF-WT接种于50ml LB培养基中，37℃，200rmp振荡培养至OD600＝0.35。将所获得的培养物冰浴30min，期间不时地轻轻摇动，以保证培养物充分冷却。在4℃和2500rpm，离心10min弃上清以收集菌体。以30ml冰浴预冷的无菌去离子水重悬菌体，4℃，2500rpm，离心10min，弃上清。再重复悬浮一次，并弃尽上清。以1ml 10％(V/V)冰浴预冷的甘油重悬菌体，并分装成100μl/1.5ml离心管，置于冰上备用。 [0065] (5)转聚磷基因弗氏柠檬酸杆菌及其对照菌株的构建： [0066] 使用电转化的方法将步骤(3)所构建好的含有弗氏柠檬酸杆菌Ppk1基因的广宿主表达载体pBBR1MCS-2，转入弗氏柠檬酸杆菌ATCC 8090中，在含有50μg/ml Kana的LB平板上进行筛选，能从中提取出该表达载体的菌株即为转聚磷基因弗氏柠檬酸杆菌(命名为CF-MPPK)。 [0067] 使用同样方法，将空载的广宿主表达载体pBBR1MCS-2，转入弗氏柠檬酸杆菌ATCC8090中，在含有50μg/ml Kana的LB平板上进行筛选，能从中提取出该空载表达载体的菌株即为用于对照的Citrobacter freundii(命名为：CF-M)。 [0068] 实施例2：弗氏柠檬酸杆菌Ppk1基因的PCR扩增结果。 [0069] 根据NCBI数据库中提供的Citrobacter freundii ATCC 8090(whole genome shotgun sequence)GenBank登录号:ANAV01000007.1所设计的引物从弗氏柠檬酸杆菌ATCC 8090基因组DNA中扩增出了大小为2067bp的Ppk1基因片段(详细序列见序列表SEQ ID NO.1)，如图1所示，条带位置正确，同时将测序结果使用Bio-Edit软件与NCBI数据库中报道的序列进行比对，其碱基序列也完全吻合。 [0070] 实施例3：弗氏柠檬酸杆菌Ppk1基因表达载体的构建结果。 [0071] 广宿主表达载体pBBR1MCS-2的全长为5144bp(详细序列见序列表SEQ ID NO.2)，如图2所示，在该表达载体的多克隆位点插入Citrobacter freundii 2067bp的Ppk1基因片段后，载体明显变大，经双酶切和测序比对，序列也完全正确。 [0072] 实施例4：CF-MPPK菌株在合成废水中的生长以及除磷效果测定。 [0073] (1)将CF-WT于LB平板上划线以获取单菌落，分别将CF-MPPK和CF-M于含有50μg/ml Kana的LB平板上划线，37℃静置培养12hr以获取单菌落。 [0074] (2)挑取CF-WT单菌落于3mlLB培养基，37℃，200rpm振荡培养12hr；分别挑取CF-MPPK和CF-M单菌落于含有50μg/ml Kana的3mlLB培养基，37℃，200rpm振荡培养12hr。 [0075] (3)按1:100(V/V)的接种比例，将CF-WT接种于20ml LB培养基，37℃，200rpm振荡培养12hr；按1:100(V/V)的接种比例，分别将CF-MPPK和CF-M接种于含有50μg/ml Kana的20ml LB培养基，37℃，200rpm振荡培养12hr。 [0076] (4)分别测定培养后的CF-WT、CF-MPPK、CF-M的OD600数值，取适当体积的菌液(该体积按LB培养基中OD600值折算，使接种后合成废水中起始0D600值在0.2左右)，分别于10ml的无菌离心管中，室温，5000rpm离心5min收菌，弃上清后，再以5ml的无菌去离子水重悬菌体，室温，5000rpm离心5min收菌，弃上清后再以同样的方法洗涤菌体一次。 [0077] (5)以1ml的合成废水培养基重悬菌体，将CF-WT接种至100ml合成废水培养基中，37℃，200rpm振荡培养12hr，以同样的方法分别将CF-MPPK和CF-M接种至含有50μg/ml Kana的合成废水培养基中，37℃，200rpm振荡培养12hr，期间对于三种菌株的培养液每隔两个小时取一次样，分别测定各菌株的OD600数值，以及合成废水上清中的磷含量。 [0078] 实施例5：在合成废水中生物修饰弗氏柠檬酸杆菌生长曲线。 [0079] 合成废水的配方如下：葡萄糖0.3g、Tryptone 0.1g、Yeast extract 0.01g、无水乙酸钠0.15g、氯化钠0.05g、七水合硫酸镁0.262g、三水合磷酸氢二钾1.472g、氯化铵0.18g、去离子水1L，115℃灭菌30min备用，其总磷含量为20mg/L。 [0080] 由图3可见，各菌株以初始OD值约为0.20在合成废水培养基中生长时，弗氏柠檬酸杆菌ATCC 8090即CF-WT和含有空载载体的菌株即CF-M生长幅度较接近，最大OD值均只能达到0.47左右，而表达了Citrobacter freundii Ppk1基因的菌株即CF-MPPK生长幅度明显大于前两者，最大OD值达0.58左右，这与之前有学者报道的在外源营养物下降时，聚磷能够促进大肠杆菌生长的结果相类似。通过表达Citrobacter freundii Ppk1基因有利于弗氏柠檬酸杆菌聚磷。 [0081] 实施例6：合成废水中生物修饰弗氏柠檬酸杆菌除磷效果。 [0082] 合成废水中总磷的测定方法参见《中华人民共和国国家标准GB11893-89》。 [0083] 由图4可见，各菌株在磷含量为20mg/L的合成废水中生长时，弗氏柠檬酸杆菌ATCC 8090即CF-WT和含有空载载体的菌株即CF-M除磷效果远低于表达了Citrobacter freundii Ppk1基因的菌株即CF-MPPK，经过12hr的培养，前两者上清中磷含量在19mg/L左右小幅波动，而后者上清中的磷含量则已经降至约3mg/L。 [0084] 实施例7：转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌菌株胞内聚磷颗粒染色。 [0085] Polyp的改良Albert染色法：按常规方法制片；用甲液染5min，倾去甲液，水洗一次，风干；用乙液染1min，水洗一次，风干；使用油镜镜检；其中异染粒呈蓝黑色，菌体其他部分呈绿色。 [0086] 在第10h，分别取合成废水中培养的CF-WT、CF-MPPK和CF-M菌液各0.5ml于1.5ml离心管中，12000rpm离心2min，弃尽上清，以1ml去离子水重悬菌体，12000rpm离心2min，弃尽上清，再以同样的方法洗涤菌体一次，最后以0.1ml去离子水重悬菌体，按常规方法制片后，进行异染粒(即Polyp颗粒)染色，以油镜观察菌体形态及其胞内聚磷异染粒。 [0087] 由图5可见，弗氏柠檬酸杆菌ATCC 8090即CF-WT和含有空载载体的菌株即CF-M经改良Albert法染色后，其胞内未见蓝黑色的异染颗粒，仅看到绿色的菌体，而表达了Citrobacter freundii Ppk1基因的菌株即CF-MPPK，胞内尤其是两端有明显异染颗粒，即Polyp颗粒，这也与菌株在合成废水中除磷情况相一致。 [0088] 实施例8：不同聚磷菌聚磷能力比较。 [0089] OD600指的是某种溶液在600nm 波长处的吸光值，它的一个重要应用就是利用细菌的吸光来测量细菌培养液的浓度，OD600值通常与细菌的生物量成正相关。在评估一种细菌的聚磷能力时，除了要考察含磷培养体系中磷含量的减少这样一种表观的间接的指标外，聚磷菌胞内Polyp的含量也应纳入聚磷能力的评价体系中，而且应当作为一个最重要的指标，因为它最直接地反应了聚磷菌聚磷能力的大小。因此，为了相对准确地反映一株聚磷菌聚磷能力的大小，以培养基中磷削减量为“分子”，以聚磷菌的生物量即OD600值为“分母”，这个值越大则表明该菌株的聚磷能力越强。根据申请号为201210033343.9和申请号为200610038917.6的两篇中国专利分别构建了BL-PPK和KT4PPK两株菌，并将上述两株菌与本发明构建的CF-MPPK菌株的聚磷能力进行比较(如表1所示)。由于Ppk1基因首先在大肠杆菌中被发现，因此，利用大肠杆菌表达Ppk1基因并用于废水除磷已经取得了显著的效果，而BL-PPK菌株也是目前已知的聚磷效果最好的菌株。从表1中可以看出本发明构建的CF-MPPK菌株与BL-PPK菌株相比，其聚磷能力提高了约35％。 [0090] 表1不同聚磷菌聚磷能力比较 [0091] [0092] 据文献报道，根据基因组DNA中Ppk基因的分布情况可以将细菌分为3类：(1)基因组DNA中仅存在Ppk1基因，如Escherichia coli、Clostridium acetobutylicum、Neisseria meningitidis等；(2)基因组 DNA 中仅存在Ppk2 基因，如 Bacillus thuringiensis、Kineococcus radiotolerans、Nitrospira multiformis等；(3)基因组DNA中同时存在Ppk1和Ppk2基因，如Pseudomonas putida、Myxococcus xanthus、Frankia alni等。目前使用类似方法并报道有显著聚磷效果的大肠杆菌E.coli DH5α即属于第一类，而与大肠杆菌在细菌学分类上非常接近的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，经实验证实，使用该方法未能使其具备显著的聚磷效果，通过对NCBI数据库中基因组DNA全序列分析发现Enterobacter cloacae基因组DNA中同时存在Ppk1和Ppk2基因。对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的模式种KT2440，使用同样的方法进行改造，也未能使其具备显著的聚磷效果，而KT2240是基因组DNA中同时存在Ppk1和Ppk2基因的代表菌株。因此，宿主菌只有Ppk1基因是生物修饰菌是否具有聚磷能力的前提。 [0093] 分别将表达Citrobacter freundii Ppk1基因、Enterobacter cloacae Ppk1基因和Pseudomonas putida KT2440Ppk1基因的E.coli DH5α菌株进行了同样的合成废水除磷试验，均未见明显的聚磷效果。尽管Ppk基因在细菌中广泛存在，同时其基因序列中也存在保守区，但不同种之间还是存在一定的差异。Citrobacter freundii、Enterobacter cloacae、Pseudomonas putida KT2440与E.coli DH5αPpk1聚磷激酶的氨基酸序列同源性分别为96％、94％和34％，即使是高同源性的Ppk1在不同的宿主中也存在显著的表达差异性，因此，宿主菌对自身的Ppk1基因具备较强的识别和适应能力。在构建聚磷菌株时选用来源于宿主自身的Ppk1基因，将更加有利于宿主菌聚磷。 [0094] 宿主菌基因组DNA中外切聚磷酸酶基因(Exopolyphosphatase，Ppx)与Ppk1基因的调控方式为双顺反共转录(Co-transcribed bicistronic)。根据已有文献以及NCBI数据库中提供的基因组DNA序列分析，Escherichia coli和Citrobacter freundii两者的Ppx与Ppk1基因在其基因组DNA中形成的是Co-transcribed bicistronic结构，这显著区别于基因组DNA中同时存在Ppk1和Ppk2的模式菌株Pseudomonas putida KT2440，如图6所示，KT2440的Ppx与Ppk1基因紧密相邻且在其3’部分重叠。这可能也是在Pseudomonas putida KT2440中表达其自身来源的Ppk1基因而未能获得明显聚磷效果的原因之一。因此，宿主菌基因组DNA中外切聚磷酸酶基因(Exopolyphosphatase，Ppx)与Ppk1基因的调控方式为双顺反共转录(Co-transcribed bicistronic)是保证具有高效除磷的生物学调控基础。

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