一种烟草腋芽生长调控基因NtIPT1及其克隆方法与应用 |
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| 申请号 | CN201610915741.1 | 申请日 | 2016-10-21 | 公开(公告)号 | CN106497946A | 公开(公告)日 | 2017-03-15 |
| 申请人 | 云南省烟草农业科学研究院; | 发明人 | 王丙武; 李文正; 高玉龙; 宋中邦; 李永平; 王燃; 刘勇; 焦芳婵; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了 烟草 腋芽 生长调控基因NtIPT1及其克隆方法与应用，烟草腋芽生长调控基因NtIPT1核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示，编码的 氨 基酸序列如SEQ ID：No.2所示。本发明还公开了烟草腋芽生长调控基因NtIPT1的克隆方法，具体步骤包括：A、确定NtIPT1基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtIPT1基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物；E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。通过调控烟草腋芽生长调控基因NtIPT1的表达，可降低打顶后烟草腋芽的发育长度和重量，从而有望降低烟用抑芽剂使用，为生产绿色优质烟叶和降低人工成本提供基因资源。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种烟草腋芽生长调控基因NtIPT1，其特征在于所述的烟草腋芽生长调控基因NtIPT1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。 |
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| 说明书全文 | 一种烟草腋芽生长调控基因NtIPT1及其克隆方法与应用技术领域[0001] 本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草腋芽生长调控基因NtIPT1及其克隆方法与应用。 背景技术[0002] 烟草（Nicotiana tabacum）是重要的经济作物，是茄科一年生草本植物。打顶抹芽是优质烤烟种植过程中一项重要的生产技术措施。烟草在一定的生长时期必须打顶，而打顶后会萌生大量的侧芽。侧芽耗费营养，会降低烟叶的品质和产量，因此必须抹掉侧芽。人工抹芽耗费人力和物力，提高了烟叶生产成本。打顶后施用化学药剂可抑制腋芽生长，降低了烟叶生产劳动强度。但化学药剂需要成本，且会造成环境污染。本发明以发现打顶后产生侧芽（腋芽）的相关基因为突破口，通过生物技术创建无侧芽、少侧芽或小侧芽的烟草，则有可能从根本上或大幅度解决上述问题，从而实现在烟草生长量、烟叶品质、环保等方面均有较大提升。 [0003] 异戊烯基转移酶（Isopentenyl-transferase）是细胞分裂素生物合成的限速酶，细胞分裂素（Cytokinin，CTK）是促进细胞分裂的激素，在植物生长发育过程中行使重要功能，如参与细胞分裂、光合作用、衰老及营养代谢等过程。细胞分裂素从化学角度看主要分为两类，一类是在天然细胞分裂素异戊烯腺嘌呤 N6 位上进行取代，侧链通常为芳香环衍生物或类异戊二烯基，包括6-呋喃甲基腺嘌呤（KT）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）等，称嘌呤型细胞分裂素；另一类为苯基脲型细胞分裂素，即N，N'-二苯基脲（DPU）以及一些苯基脲的衍生物，如噻重氮苯基脲、N-（4-吡啶基）N'-苯基脲、N-苯基-N'-（2-氯-4-吡啶基）脲等。随着拟南芥（Arabidopsis）基因组测序工作的完成，编码IPT的基因家族也被证实，包括9个成员AtIPT1AtIPT9，据报道除AtIPT2和AtIPT9以外，其他7个基因能够编码大肠杆菌中细胞分裂素的~生物合成，烟草（中国）基因组测序工作业已完成，但少有报道。我们在对烟草异戊烯基转移酶基因家族（NtIPTs）进行了广泛理论研究和应用实践，现发现烟草异戊烯基转移酶基因1（NtIPT1）在烟草打顶后具有促进侧芽（腋芽）生长的多方面的生理作用，通过植物基因工程技术控制烟草打顶后侧芽生长发育方面具有生产应用重要意义，也使植物激素的基因工程在遗传育种中的应用方面展现了新的作用。 [0004] 国际上一些知名烟草公司和研究机构正采用生物技术和基因工程技术对烟草无腋芽少腋芽品种进行研究，以提高烟草品质，减少对烟草打顶后化学药剂的施用，以降低烟叶生产劳动强度、化学药剂成本和环境污染。目前，我国也提出了无腋芽优质烟的开发计划，为烟草无腋芽少腋芽品种研究提供了无限契机。随着烟草无腋芽少腋芽品种研究的深入，必将使我国烟草腋芽控制迈上新台阶，为我国烟叶的健康和可持续发展奠定基础。因此，开发一种利用生物技术手段创制无腋芽少腋芽品种的候选基因，通过基因操作减少烟草腋芽是非常必要的。 发明内容[0005] 本发明的第一目的在于提供一种烟草腋芽生长调控基因NtIPT1；第二目的在于提供所述的烟草腋芽生长调控基因NtIPT1的克隆方法；第三目的在于提供所述的烟草腋芽生长调控基因NtIPT1的应用。 [0007] 本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：A、确定NtIPT1基因序列； （1）利用同源基因拟南芥At IPT1序列搜索NCBI烟草基因组数据库，得到烟草NtIPT1的核苷酸序列，该核苷酸序列的NCBI号为XM_016617583.1；利用此序列设计基因克隆引物： 正向引物：5′- AACCTTTTCTTTCTCCAAAACG -3′； 反向引物：5′- CAAAACTGGCGATCGATTACG -3′； B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA； C、根据NtIPT1基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液，10mM dNTP，2U的Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase，加入特异性引物的正反向引物各1μM，PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，60℃，30秒，72℃，40秒，30个循环；72℃延伸7分钟；回收和纯化PCR产物； D、纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下： 4μL纯化产物+1μL salt solution +1μL PCR-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连好的载体通过热激转化进入大肠杆菌，加液体培养基震荡培养后涂到含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养， 长出菌后挑取菌落进行培养，培养后取2ml菌液提取质粒，进行质粒PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。 [0008] 本发明的第三目的是这样实现的，所述的烟草腋芽生长调控基因NtIPT1在获得降低打顶后烟草产生腋芽的发育长度和重量的转基因植株中的应用。即所述的烟草腋芽生长调控基因NtIPT1用于抑制打顶后腋芽的生长。 [0009] 本发明利用同源克隆技术从烟草中得到一个烟草腋芽生长调控基因NtIPT1，具体步骤为：利用同源基因拟南芥AtIPT1序列搜索NCBI烟草基因组数据库，得到烟草NtIPT1的核苷酸序列（NCBI号：XM_016617583.1）；利用此序列信息设计基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtIPT1基因序列；利用农杆菌介导的遗传转化方法获得NtIPT1基因的RNAi植株，对NtIPT1进行功能验证，结果表明抑制NtIPT1基因的表达可以控制烟草侧芽生长发育（包括腋芽发生长度、重量）。NtIPT1基因的发现，为通过调控基因的表达，控制烟草侧芽生长发育，为生产绿色优质烟叶提供了基因资源。附图说明 [0010] 图1为利用引物对NtIPT1F/NtIPT1R扩增NtIPT1基因结果，扩增产物1176bp；图2为TOPO-NtIPT1载体PCR鉴定，所用引物对为NtIPT1F/NtIPT1R，扩增产物为969 bp； 图3为 TOPO-NtIPT1载体酶切鉴定，利用BamH I和XhoI双酶切，可以获得1000bp左右的目的条带； 图4为NtIPT1基因RNAi载体片段PCR扩增结果，所用引物对为IPTRNAiF/IPTRNAiR，扩增产物为200 bp； 图5为RNAi 载体TOPO -NtIPT1的酶切验证，BamH I和XhoI双酶切后，可以将200bp左右的（目的条带）反向重复单元切下； 图6为NtIPT1 RNAi烟草腋芽生长大小，Vector Control（VC）为转空载体对照，其余为转基因株系； 图7为NtIPT1 RNAi烟草腋芽生长重量，Vector Control（VC）为转空载体对照，其余为转基因株系。 具体实施方式[0011] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。 [0012] 本发明所述的烟草腋芽生长调控基因NtIPT1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。 [0013] 所述的烟草腋芽生长调控基因NtIPT1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。 [0014] 本发明所述的烟草腋芽生长调控基因NtIPT1的克隆方法，包括以下步骤：A、确定NtIPT1基因序列； （1）利用同源基因拟南芥At IPT1序列搜索NCBI烟草基因组数据库，得到烟草NtIPT1的核苷酸序列，该核苷酸序列的NCBI号为XM_016617583.1；利用此序列设计基因克隆引物： 正向引物：5′- AACCTTTTCTTTCTCCAAAACG -3′； 反向引物：5′- CAAAACTGGCGATCGATTACG -3′； B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA； C、根据NtIPT1基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液，10mM dNTP，2U的Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase，加入特异性引物的正反向引物各1μM，PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，60℃，30秒，72℃，40秒，30个循环；72℃延伸7分钟；回收和纯化PCR产物； D、纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下： 4μL纯化产物+1μL salt solution +1μL PCR-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连好的载体通过热激转化进入大肠杆菌，加液体培养基震荡培养后涂到含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养， 长出菌后挑取菌落进行培养，培养后取2ml菌液提取质粒，进行质粒PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。 [0015] C步骤中所述的特异性引物引物为：正向引物：5′- AACCTTTTCTTTCTCCAAAACG -3′； 反向引物：5′- CAAAACTGGCGATCGATTACG -3′。 [0016] D步骤中所述的培养基为：称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g 溶解于1L 蒸馏水中，高温灭菌（121℃，25min）后使用。 [0017] 本发明所述的烟草腋芽生长调控基因NtIPT1的应用为所述的烟草腋芽生长调控基因NtIPT1在获得降低打顶后烟草产生腋芽的发育长度和重量的转基因植株中的应用。即所述的烟草腋芽生长调控基因NtIPT1用于抑制打顶后腋芽的生长。 [0018] 所述用于获得降低打顶后烟草产生腋芽的发育长度和重量的转基因植株的方法包括以下步骤：A、构建RNAi载体： a、以pCR®-BluntII-TOPO载体为中间载体、PK7GW1Wg2为表达载体构建NtIPT1基因的RNAi 载体，构建引物为： NtIPT1-RNAiF: 5’-GGATCCCGCCGGAAAATCAAGACTGT-3’， NtIPT1-RNAiR: 5’-CTCGAGACTGCAAGTGAAGCCATGTT-3’， NtIPT1-RNAiF中GGATCC处为BamH I酶切位点；NtIPT1-RNAiR中CTCGAG处为Xho I酶切位点； b、以NtIPT1阳性克隆TOPO质粒DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体积为50μL，包括： 200ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液，10mM dNTP，2U的Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase，加入NtIPT1-RNAiF引物、NtIPT1-RNAiR引物各1μM，PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，55℃，30秒，72℃，30秒，30个循环；72℃延伸7分钟；回收和纯化PCR产物； c、回收目的片段产物与TOPO载体连接：通过试剂盒反应与TOPO载体连接。连接体系与过程如下： 4μL纯化产物+1μL salt solution +1μL PCR®-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴 30min，将连好的载体通过热激转化进入大肠杆菌，加培养基震荡培养后涂到含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养。 长出菌后挑取菌落进行培养，培养后取2ml菌液提取质粒，进行质粒PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序； d、入门克隆pENTRTM2B-NtIPT1RNAi的构建：用上步测序对的TOPO质粒和pENTRTM2B空载体做酶切反应：BamH I + XhoI双酶切TOPO质粒和pENTRTM2B-ccdB得到目的基因片段和载体片段pENTRTM2B，切胶回收后进行连接、连接体系：连接反应总体积为10μL，含酶切目的片段的切胶回收产物4μL，pENTRTM2B（BamHI+XhoI双酶切）载体1μL，10 × T4 buffer1μL，T4 Ligase 1μL，灭菌双蒸水3μL，混匀，室温反应2小时，转化入大肠杆菌感受态细胞，加培养基震荡培养后涂到含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养，提取质粒进行PCR检测和酶切检测，以验证目的基因片段是否已经插入载体片段，入门载体是否构建成功。 [0019] e、通过LR反应得到植物表达载体：挑选检测正确的入门克隆与植物表达载体pK7GW1Wg2 (Destination clone)进行LR反应，具体反应如下：体系与过程如下：1）连上2B载体的入门克隆(50-150ng )1-7μL + 0.5μL Destination Vector + TE Buffer(up to 8μL)； 2）上述体系混匀，冰浴2min,轻弹2次； 3）加入2μL LR CloneaseTMⅡ enzyme Mix 到上述体系，轻弹，混匀，离心，25℃水浴 1h； 4）加入1μL Proteinase K 轻弹，混匀，37℃水浴10min； 通过热激转化转入大肠杆菌，加入培养基震荡培养后涂含100mg/L 壮观霉素的LB平板上，得到植物表达载体，挑菌提质粒后，以载体质粒为模板，用两对引物（T35SF1/P35SR1、IntronF2/P35SR2）进行PCR检测，用LA taq体系进行扩增，反应体系包括：200ng质粒DNA，10×LA反应缓冲液，10mM dNTP，2U的LA taq DNA Polymerase，加入正反向引物各1μM，PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：94℃，5分钟；94℃，30秒，55℃，30秒， 72℃，2分钟，35个循环；72℃延伸7分钟；检测重组质粒的正确性，理论上由T35SF1/P35SR1引物扩增的片段大小为1.7 kb，由IntronF2/P35SR2引物扩增的片段大小为750bp ，同时满足两个条件，则表明表达载体构建成功，将检测对的质粒进行测序比对，进一步验证； 其中两对引物（T35SF1/P35SR1、IntronF2/P35SR2）为： T35SF1：5’-AGGTCACTGGATTTTGGTTTTA-3’ P35SR1：5’-CTATCGTTCAAGATGCCTCTGC-3’ IntronF2：5’-ATTGGTGGCTCAAATCATAGAA-3’ P35SR2：5’-AGGACAGTAGAAAAGGAAGGTG-3’ B、农杆菌转化： 从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞，在冰上溶解，并加入重组表达载体PK7G- NtIPT1 4μL；将混合物分别放入液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟，再冰浴2分钟，向混合物中加入1mL LB液体培养基，28℃、220rpm培养3 4小时；培养物涂布于含有壮观霉素~ 100mg/L和利福平25mg/L的LB固体培养基上，28℃倒置培养2 3天，可见含有目的载体的农~ 杆菌克隆； C、RNAi载体导入烟草、培养转基因植株： a、挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有壮观霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2 3天；刮取划线菌斑接菌于含有壮观霉素和利福平的MS培养基中，28℃，220rpm震荡~ 培养，菌液浓度达到OD=0.5 0.8时进行侵染，得到含目标载体的农杆菌菌体；将菌体收集到~ 离心管中，6,000rpm离心5分钟富集菌体，弃上清，再用20ml液体MS培养基重悬菌体，得到含目标载体的农杆菌悬浮菌液； b、将烟草叶片置于500mL广口瓶中， 加入适量75%乙醇，漂洗1min；倒掉乙醇，加入0.1%的HgCl2溶液，置摇床上室温振荡15 30分钟；倒掉溶液，用无菌水冲洗6遍； ~ c、将烟草叶片取出，用灭菌吸水纸洗去表面液体，取无菌叶片用剪刀切成1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片分别放入含目标载体的无菌MS液体培养基悬浮菌液中，静置 15 20min；取出烟草叶片，用无菌滤纸吸去多余菌液，于加入6-BA 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L的~ MS培养基中25℃暗培养两天；把烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，于温室条件下分化培养；分化培养基为加入6-BA 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L、Kan 100mg/L、头孢霉素 500mg/L的MS培养基，每2 3周将其转移到新的培养基中，切口处逐渐长出愈伤组织，最后分~ 化出芽； d、将长至3 5cm的芽切下，转入MS培养基诱导生根，生根后的转基因植株由生根培养基~ 中取出，用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中； e、转基因植株经NPTII基因特异引物进行PCR验证，鉴定转基因阳性植株。 [0020] C步骤b中所述的0.1%的HgCl2溶液配制方法为称取升汞0.1克，用少许酒精溶解，再加水定容至100毫升。 [0021] 下面以具体实施例对本发明做进一步说明：实施例1 ——NtIPT1基因的分离克隆 利用同源基因拟南芥At IPT1序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtIPT1的基因序列，具体步骤为：利用同源基因拟南芥AtIPT1序列搜索NCBI烟草数据库，得到烟草NtIPT1的序列登录号XM_016617583.1，根据该序列设计克隆基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtIPT1基因序列；其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其中140～ 1108bp为该基因的编码区，包含969bp的开放阅读框；编码322个氨基酸，如序列表SEQIDNO.2所示。 [0023] 取2μg RNA进行反转录，利用PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（TAKARA）试剂盒进行基因组DNA去除并反转录（按试剂盒操作手册操作）。 [0024] 将反转录得到的第一链cDNA作为模板，用于PCR扩增NtIPT1基因全长，并设计特性行引物如下：正向引物：NtIPT1F：5′- AACCTTTTCTTTCTCCAAAACG -3′； 反向引物：NtIPT1R：5′- CAAAACTGGCGATCGATTACG -3′。 [0025] PCR反应体系为50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液，10mM dNTP，2U的Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase，上述引物各1μM。PCR反应在Mastercycler® pro（Eppendorf，德国）扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒， 60℃，30秒，72℃，30秒，30个循环；72℃延伸7分钟。 [0026] 产物经1%（g/mL）的琼脂糖凝胶电泳分离，扩增结果产生一条单一PCR条带，见图1。用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN，德国）回收扩增条带，提取步骤参照试剂盒使用说明。回收纯化的DNA与TOPO载体（Invitrogen ZERO BluntII -TOPO -PCR Cloning kit）连接，按说明书操作。连接产物利用热激法转化大肠杆菌，在含有100mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个克隆测序（大连宝生物工程有限公司）。 [0027] 测序结果表明NtIPT1基因的全长为1176bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，通过测序、比对确定是本发明需要的目的基因，申请人将该基因命名为NtIPT1。NtIPT1基因包括969bp的开放阅读框；编码322个氨基酸。 [0028] 实施例2 ——抑制表达（RNAi）载体构建a、以PCR®-BluntII-TOPO载体为中间载体、PK7GW1Wg2为表达载体构建NtIPT1基因的RNAi 载体，构建引物为： NtIPT1-RNAiF: 5’-GGATCCCGCCGGAAAATCAAGACTGT-3’， NtIPT1-RNAiR: 5’-CTCGAGACTGCAAGTGAAGCCATGTT-3’， NtIPT1-RNAiF中GGATCC处为BamH I酶切位点；NtIPT1-RNAiR中CTCGAG处为XhoI酶切位点； b、以NtIPT1阳性克隆TOPO质粒DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体积为50μL，包括： 200ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液，10mM dNTP，2U的Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase，加入NtIPT1-RNAiF引物、NtIPT1-RNAiR引物各1μM，PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，55℃，30秒，72℃，30秒，30个循环；72℃延伸7分钟；回收和纯化PCR产物； c、回收目的片段产物与TOPO载体连接：通过试剂盒反应与TOPO载体连接。连接体系与过程如下： 4μL纯化产物+1μL salt solution +1μL PCR®-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴 30min。将连好的载体通过热转化进入大肠杆菌，加培养基震荡培养后涂到含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养。 长出菌后挑取菌落进行培养，培养后取2ml菌液提取质粒，进行质粒PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序； d、入门克隆pENTRTM2B-NtIPT1RNAi的构建：用上步测序对的TOPO质粒和pENTRTM2B空载体做酶切反应：BamH I+XhoI双酶切TOPO质粒和pENTRTM2B-ccdB得到目的基因片段和载体片段pENTRTM2B，切胶回收后进行连接、连接体系：连接反应总体积为10μL，含酶切目的片段的切胶回收产物4μL，pENTRTM2B（BamHI+XhoI双酶切）载体1μL，10× T4 buffer1μL，T4 Ligase 1μL，灭菌双蒸水3μL，混匀，室温反应2小时，转化入大肠杆菌感受态细胞，加培养基震荡培养后涂到含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养，提取质粒进行PCR检测和酶切检测，以验证目的基因片段是否已经插入载体片段，入门载体是否构建成功。 [0029] e、通过LR反应得到植物表达载体：挑选检测正确的入门克隆与植物表达载体pK7GW1Wg2 (Destination clone)进行LR反应，具体反应如下：体系与过程如下：1）连上2B载体的入门克隆(50-150ng )1-7μL + 0.5μL Destination Vector + TE Buffer(up to 8μL)； 2）上述体系混匀，冰浴2min,轻弹2次； TM 3）加入2μL LR Clonease Ⅱ enzyme Mix 到上述体系，轻弹，混匀，离心，25℃水浴 1h； 4）加入1μL Proteinase K 轻弹，混匀，37℃水浴10min； 通过热激转化转入大肠杆菌，加入培养基震荡培养后涂含100mg/L 壮观霉素的LB平板上。得到植物表达载体，挑菌提质粒后，以载体质粒为模板，用两对引物（T35SF1/P35SR1、IntronF2/P35SR2）进行PCR检测，用LA taq体系进行扩增，反应体系包括：200ng质粒DNA，10×LA反应缓冲液，10mM dNTP，2U的LA taq DNA Polymerase，加入正反向引物各1μM，PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：94℃，5分钟；94℃，30秒，55℃，30秒， 72℃，2分钟，35个循环；72℃延伸7分钟；检测重组质粒的正确性，理论上由T35SF1/P35SR1引物扩增的片段大小为1.7 kb，由IntronF2/P35SR2引物扩增的片段大小为750bp ，同时满足两个条件，则表明表达载体构建成功，将检测对的质粒进行测序比对，进一步验证。 [0030] 其中两对引物（T35SF1/P35SR1、IntronF2/P35SR2）为：T35SF1：5’-AGGTCACTGGATTTTGGTTTTA-3’ P35SR1：5’-CTATCGTTCAAGATGCCTCTGC-3’ IntronF2：5’-ATTGGTGGCTCAAATCATAGAA-3’ P35SR2：5’-AGGACAGTAGAAAAGGAAGGTG-3’ 实施例3 ——烟草的遗传转化 （1）表达载体转化农杆菌 从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞，在冰上溶解，并加入重组表达载体PK7G- NtIPT1 4μL；将混合物分别放入液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟，再冰浴2分钟，向混合物中加入1mL LB液体培养基，28℃、220rpm培养3 4小时；培养物涂布于含有壮观霉素~ 100mg/L和利福平25mg/L的LB固体培养基上，28℃倒置培养2 3天，可见含有目的载体的农~ 杆菌克隆； （2）烟草转化 a、挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有壮观霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2 3天；刮取划线菌斑接菌于含有壮观霉素和利福平的MS培养基中，28℃，220rpm震荡~ 培养，菌液浓度达到OD=0.5 0.8时进行侵染，得到含目标载体的农杆菌菌体；将菌体收集到~ 离心管中，6,000rpm离心5分钟富集菌体，弃上清，再用20ml液体MS培养基重悬菌体，得到含目标载体的农杆菌悬浮菌液； b、将烟草叶片置于500mL广口瓶中， 加入适量75%乙醇，漂洗1min；倒掉乙醇，加入0.1%的HgCl2溶液，置摇床上室温振荡15 30分钟；倒掉溶液，用无菌水冲洗6遍； ~ c、将烟草叶片取出，用灭菌吸水纸洗去表面液体，取无菌叶片用剪刀切成1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片分别放入含目标载体的无菌MS液体培养基悬浮菌液中，静置 15 20min；取出烟草叶片，用无菌滤纸吸去多余菌液，于加入6-BA 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L的~ MS培养基中25℃暗培养两天；把烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，于温室条件下分化培养；分化培养基为加入6-BA 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L、Kan 100mg/L、头孢霉素 500mg/L的MS培养基，每2 3周将其转移到新的培养基中，切口处逐渐长出愈伤组织，最后分~ 化出芽； d、将长至3 5cm的芽切下，转入MS培养基诱导生根，生根后的转基因植株由生根培养基~ 中取出，用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中； e、转基因植株经NPTII基因特异引物PCR验证扩增，鉴定转基因阳性植株。 [0031] 实施例4 ——转基因植株打顶试验转基因植株移栽到一次性花盆后，生长16天后，打顶，测定各腋芽的长度和重量，结果见图6、图7。RNAi植株与空载体对照Vector Control（VC）相比，腋芽长度和重量均降低约 50%。上述结果表明，NtIPT1基因负责控制烟草腋芽生长的长度及重量，通过对该基因的遗传操作，可以降低烟草腋芽的生长，该基因的开发利用有利于减少烟叶生产中抑芽剂的使用。 |
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