[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3及其编码基因和应用。

[0002] 波罗蜜(Artocarpus heterophyllus Lam.)属于桑科水果类植物，主要种植于热带、亚热带区域。果实香味浓郁，酸甜可口，深受我国南方消费者的青睐。波罗蜜不仅是一种特色水果资源，其枝叶组织富含一类特殊结构的黄酮类物质，即异戊烯基类黄酮。该种黄酮类物质比常见结构的黄酮类物质生物活性更强，例如其在抑制肿瘤细胞增殖活性、免疫调节活性等方面，均比没有异戊烯基化的黄酮类物质更显著。波罗蜜组织中异戊烯基类黄酮的含量不仅高，而且结构种类丰富，目前已发现有二十余种不同结构形式的异戊烯基类黄酮。由此可见，波罗蜜既是丰富的异戊烯基类黄酮天然资源，也是类黄酮异戊烯基转移酶的丰富资源。异戊烯基类黄酮在肿瘤等疾病治疗方面具有非常重要的价值，具有广泛的应用前景。因此，利用菠萝蜜固有的天然优势，通过生物技术的手段来开发一种生物合成异戊烯基类黄酮的方法将具有重要的产业价值。

[0003] 本发明的第一个目的是提供一种类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3及其编码基因AhFDT3。

[0004] 本发明的类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0005] 本发明还提供了编码上述类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3的类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0006] 本发明的第二个目的是提供类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3在制备异戊烯基类黄酮中的应用。

[0007] 所述的应用优选是将芹菜素加入表达类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3的酿酒酵母菌液中，经类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3催化产生异戊烯基芹菜素。

[0008] 所述的应用优选是以类黄酮和异戊烯基供体作为底物，经类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3催化产生异戊烯基类黄酮。

[0009] 优选，所述的催化，其反应体系的pH值为7～9，反应温度为20～40℃。

[0010] 优选，所述的类黄酮为芹菜素，所述的异戊烯基供体为二甲基丙烯基焦磷酸，经类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3催化产生异戊烯基芹菜素。

[0011] 优选，所述的类黄酮为山奈酚，所述的异戊烯基供体为二甲基丙烯基焦磷酸，经类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3催化产生异戊烯基山奈酚。

[0012] 本发明从菠萝蜜中克隆得到类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT3，其编码的类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3具有良好的催化合成异戊烯基类黄酮的活性。通过利用类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT3构建表达载体转化酿酒酵母，获得超量表达类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3的酿酒酵母；利用其菌液或微粒体催化异戊烯基供体和类黄酮底物合成异戊烯基类黄酮，转化率可高达27％，产物纯度可达76-90％。本发明为异戊烯基类黄酮的生物合成提供了一种新的方法，具有操作简便，反应污染小，产物纯度高等优势。附图说明

[0013] 图1是异戊烯基芹菜素的一级质谱图。

[0014] 图2是异戊烯基芹菜素的二级质谱图。

[0015] 图3是酿酒酵母阳性菌的菌落PCR产物电泳图。

[0016] 图4是异戊烯基山奈酚的一级质谱图。

[0017] 图5是异戊烯基山奈酚的二级质谱图。

[0018] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

[0019] 下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行。

[0020] 实施例1：克隆类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT3、构建超表达载体及转化酿酒酵母

[0021] 提取波罗蜜叶片的 RNA，采用逆转录酶M-MLV，逆转录反应合成的cDNA。以 该cDNA为 模 板，采 用正 向引 物GCCACCATGGCTCAAGTTGG，反向 引 物TATGAGTGGAAATATTATATACTCTGCAT，TakaRa公司Ex Taq DNA聚合酶，进行PCR扩增；PCR条件为：94℃，5min；94℃，45s、56℃，1min、72℃，1.5min；35个循环；72℃延伸10min。采用琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，将目的片段送交测序。经测序分析，克隆得到类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其含有1191个碱基，编码的蛋白命名为类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3，共396个氨基酸，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0022] 连接类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT3至超表达载体pYes2.1TOPO(购自Invitrogen公司，货号K4150-01)上，连接反应条件为：类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT3、质粒pYes2.1TOPO、1.2M NaCl、0.06M MgCl2混合后，室温放置30min完成连接反应，获得重组质粒(类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT3插入到超表达载体pYes2.1TOPO后的重组质粒)。然后将重组质粒再转化至酿酒酵母感受态细胞中，转化条件为：向酵母感受态细胞中加入2μL重组质粒、5μL鲑鱼精DNA，混匀；加入600μL转化液(转化液配方为：1mL 50％PEG，125μL 10×TE，125μL 10×LiAc)，30℃、100rpm摇床转化30min；加入70μL DMSO(二甲基亚砜)，42℃热激15min；冰浴放置2min后13000rpm离心5s，加
200μL 1×TE悬浮细胞，涂布SC-U抑制平板，30℃培养3～5天。菌落PCR筛选重组质粒成功转化至酿酒酵母细胞的阳性菌，筛选方法为：挑选单个菌落转移至50μL无菌水，
100℃加热5min，离心去除细胞碎片；取10μL上清液，加入5μL Ex Taq DNA聚合酶缓冲液、1μL 10mM dNTPs，1μL正向引物GCCACCATGGCTCAAGTTGG，1μL来自质粒序列的反向引物ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT，0.5μL Ex Taq DNA聚合酶，31.5μL无菌水，混合；PCR程序为：94℃，5min；94℃，40s；56℃，40s；72℃，1.5min；35个循环；72℃延伸10min。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，图3的M为marker，1为阳性菌，该阳性菌能够扩增出目的片段，表明类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT3插入到超表达载体pYes2.1TOPO后的重组质粒成功转化至酿酒酵母细胞，再经测序验证确认，由此得到将类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT3插入到超表达载体pYes2.1TOPO后的重组质粒成功转化至酿酒酵母细胞的阳性菌，命名为酿酒酵母pYes2.1TOPO-AhFDT3。对酿酒酵母pYes2.1TOPO-AhFDT3进行大量培养，首先挑酿酒酵母pYes2.1TOPO-AhFDT3转移至50mL SC-U抑制培养基(2％葡萄糖为碳源)，30℃，200rpm，培养至对数生长期；离心收集细胞，用SC-U诱导培养基(2％半乳糖，
1％棉子糖为碳源)稀释至OD600＝0.4，30℃，200rpm，培养24h。用SC-U诱导培养基培养酿酒酵母pYes2.1TOPO-AhFDT3，诱导其超量表达类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3，即获得超量表达类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3的酿酒酵母菌液。

[0023] 实施例2：合成类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT3、构建超表达载体及转化酿酒酵母

[0024] 采用全合成的方法直接合成类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT3全长序列(具体如SEQ ID NO.1所示)，按照实施例1的方法连接类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT3至超表达载体pYes2.1TOPO上，再转化至酿酒酵母感受态细胞中，得到酿酒酵母pYes2.1TOPO-AhFDT3。将酿酒酵母pYes2.1TOPO-AhFDT3进行大量培养，诱导超量表达类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3，得到超量表达类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3的酿酒酵母菌液。

[0025] 实施例3：异戊烯基芹菜素的生物合成

[0026] 1.合成异戊烯基芹菜素

[0027] 在实施例1的超量表达类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3的酿酒酵母菌液中加入500μM芹菜素，25℃反应48小时后，采用体积分数90％乙醇溶液提取，乙醇相通过C18反相柱(16mm×460mm)纯化，以甲醇：水(50/50～100/0)洗脱，收集甲醇/水体积比为90/10的洗脱组分，得到化合物1(异戊烯基芹菜素)。

[0028] 2.化合物1(异戊烯基芹菜素)的结构鉴定

[0029] 化合物1可溶于甲醇，一级质谱结果显示[M+H]+m/z＝339.1，如图1所示，表明该化合物分子量为338，比芹菜素多出一个异戊烯基的分子量。二级质谱产生了两个碎片，m/z分别为283.1和165.1，如图2所示，证明该异戊烯基连接在芹菜素的A环上。由此确认化合物1为异戊烯基芹菜素。

[0030] 采用该本实施例的方法合成异戊烯基芹菜素的转化率为11％，纯度为76％。

[0031] 实施例4：异戊烯基芹菜素的生物合成

[0032] 在实施例1的超量表达类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3的酿酒酵母菌液中加入500μM芹菜素，35℃反应2小时后，采用体积分数60％乙醇溶液提取，通过C18反相柱(16mm×460mm)纯化，以甲醇：水(50/50～100/0)洗脱，收集甲醇/水体积比为90/10的洗脱组分，得到异戊烯基芹菜素。采用本实施例的方法合成异戊烯基芹菜素的转化率为6％，纯度为82％。

[0033] 实施例5：异戊烯基芹菜素的生物合成

[0034] 在实施例1的超量表达类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3的酿酒酵母菌液中加入500μM芹菜素，30℃反应24小时后，采用体积分数80％乙醇溶液提取，通过C18反相柱(16mm×460mm)纯化，以甲醇：水(50/50～100/0)洗脱，收集甲醇/水体积比为90/10的洗脱组分，得到异戊烯基芹菜素。采用本实施例的方法合成异戊烯基芹菜素的转化率为19％，纯度为79％。

[0035] 实施例6：异戊烯基芹菜素的生物合成

[0036] 离心收集实施例2的超量表达类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3的酿酒酵母菌液中2+
的菌株，提取微粒体；取100μg微粒体，加入100mM Tris-HCl(pH7.0)、10mM Mg 、500μM DMAPP(二甲基丙烯基焦磷酸)、500μM芹菜素，20℃反应0.5小时后，采用乙酸乙酯萃取反应液，乙酸乙酯相通过C18反相柱(16mm×460mm)纯化，以甲醇：水(50/50～100/0)洗脱，收集甲醇/水体积比为90/10的洗脱组分，得到异戊烯基芹菜素(该化合物的结构确定同实施例3)。采用本实施例的方法合成异戊烯基芹菜素的转化率为19％，纯度为90％。

[0037] 实施例7：异戊烯基芹菜素的生物合成

[0038] 离心收集实施例1的超量表达类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3的酿酒酵母菌液中2+
的菌株，提取微粒体；取100μg微粒体，加入100mM Tris-HCl(pH9.0)、10mM Mg 、500μM DMAPP(二甲基丙烯基焦磷酸)、500μM芹菜素，40℃反应24小时后，采用乙酸乙酯萃取反应液，乙酸乙酯相通过C18反相柱(16mm×460mm)纯化，以甲醇：水(50/50～100/0)洗脱，收集甲醇/水体积比为90/10的洗脱组分，得到异戊烯基芹菜素。采用本实施例的方法合成异戊烯基芹菜素的转化率为12％，纯度为89％。

[0039] 实施例8：异戊烯基芹菜素的生物合成

[0040] 离心收集实施例1的超量表达类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3的酿酒酵母菌液中2+
的菌株，提取微粒体；取100μg微粒体，加入100mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM Mg 、500μM DMAPP(二甲基丙烯基焦磷酸)、500μM芹菜素，30℃反应24小时后，采用乙酸乙酯萃取反应液，乙酸乙酯相通过C18反相柱(16mm×460mm)纯化，以甲醇：水(50/50～100/0)洗脱，收集甲醇/水体积比为90/10的洗脱组分，得到异戊烯基芹菜素。采用本实施例的方法合成异戊烯基芹菜素的转化率为25％，纯度为87％。

[0041] 实施例9：异戊烯基山奈酚的生物合成

[0042] 1.合成异戊烯基山奈酚

[0043] 离心收集实施例1的超量表达类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT3的酿酒酵母菌液中2+
的菌株，提取微粒体；取100μg微粒体，加入100mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM Mg 、500μM DMAPP(二甲基丙烯基焦磷酸)、500μM山奈酚，30℃反应24小时后，采用乙酸乙酯萃取反应液，乙酸乙酯相通过C18反相柱(16mm×460mm)纯化，以甲醇：水(50/50～100/0)洗脱，得到化合物2(异戊烯基山奈酚)。

[0044] 2.化合物2(异戊烯基山奈酚)的结构鉴定

[0045] 化合物2可溶于甲醇，一级质谱结果显示[M+H]+m/z＝355.1，如图3所示，表明该化合物2分子量为354，比山奈酚多出一个异戊烯基的分子量。二级质谱产生了一个碎片，m/z为299.1，如图4所示，表明由于异戊烯基的断裂产生的山奈酚碎片。由此确定化合物2为异戊烯基山奈酚。

[0046] 采用本实施例的方法合成异戊烯基山奈酚的转化率为27％，纯度为85％。