用于生产萜烯的方法 |
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| 申请号 | CN201380039531.5 | 申请日 | 2013-05-13 | 公开(公告)号 | CN104736708A | 公开(公告)日 | 2015-06-24 |
| 申请人 | VTT科技研究中心; | 发明人 | K·布罗曼恩; M·托伊瓦里; T·纳卡里-塞特勒; L·鲁奥霍恩; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及用于在 真菌 中生产萜烯的方法，包括以下步骤：(a)提供在宿主细胞中的修饰的萜烯 生物 合成基因簇，其中所述簇的一个或多个天然存在的基因或启动子已被取代、截短或移除；(b)提供在所述宿主细胞中的转录因子，所述转录因子激活萜烯生物合成基因簇；(c)在允许所述激活簇的转录因子表达的条件下培养所述宿主；和任选(d)回收由此产生的萜烯产物。 | ||||||
| 权利要求 | 1.用于在真菌中生产萜烯的方法，所述方法包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 用于生产萜烯的方法发明领域 [0002] 相关领域的描述 [0003] 萜烯是具有多种药学和工业应用的一大类化合物。萜烯可作为潜在的药物或药物前体、生物活性化合物或燃料和化学品。这些应用的实例是抗疟的倍半萜紫穗槐二烯(amorphadiene)、抗癌的二萜紫杉醇和倍半萜法呢烯，其可作为燃料和作为化学品的前体。单萜，例如柠檬烯，具有作为喷气燃料成分的应用。 [0004] 萜烯是从宽范围的生物体中的五碳前体分子合成的一类生物生成的分子。萜烯是纯的碳氢化合物，而萜类化合物可含有一个或多个氧原子。术语萜烯和萜类化合物可互换使用。萜类化合物仅在植物和某些微生物中少量天然产生。然而，微生物生产是生产多种萜烯的吸引人的替代。尤其是真菌具有低营养需求，可以抵抗木质纤维素水解产物上的抑制剂，能够使用多种碳源，并且也适合大规模生产，因此提供了所探求的成本合算的方式以生产萜烯化合物。已经通过在异源/组成型启动子下的途径中表达某些基因而工程改造了若干微生物，用于萜烯生产。 [0005] 这些经遗传改造的微生物宿主中的一个问题就是因生物体中存在的天然活性所致的低产量的结果或产生副产物。 [0006] 编码生物合成途径中的连续步骤的基因倾向于在染色体上簇集在一起形成“基因簇”。簇集程度在生物体内部和之间是高度可变的。次级代谢物是对生物体正常生长而言并非必需的化合物。它们的作用是在生态相互作用中作为防御化合物或信号转导分子。许多次级代谢物都具有吸引人的生物学性能，例如作为抗生素、抗癌药、杀虫剂、免疫抑制剂和除草剂。在细菌中，控制这些化合物的生物合成的基因簇集在事实上是很普遍的。然而，真核基因组也含有功能相关的、但并非同源的基因簇[Osbourn，2010]。 [0007] 很多用于次级代谢物合成的簇可以在丝状真菌中找到。与从先前鉴定的代谢物所预测的基因簇相比，丝状生物包含多得多的用于次级代谢物生物合成的基因簇。次级代谢的基因簇是用于代谢物生产的自含式的盒。它们含有编码产生不同类型的次级代谢物的骨架结构的酶的基因，所述酶例如非核糖体肽合成酶(NRPS)酶、聚酮合酶(PKS)和萜烯合酶，其称为“标签”基因/酶。这些簇也含有用于修剪修饰次级代谢物骨架的酶的基因，所述酶例如氧化还原酶、甲基转移酶、酰基转移酶和糖基转移酶。在某些情况下，次级代谢簇也包括用于途径-特异性调节剂的基因和/或途径终端产物抗性的基因[Osboum，2010]。 [0008] 次级代谢簇的表达通常处于环境和/或发育控制之下并且是由复杂的调控级联所介导，所述级联将信号传递给途径-特异性开关。Zn(II)2Cys6-型转录因子的作用是通过上调簇集基因的转录而作为次级代谢物簇的途径-特异性激活物。次级代谢物基因的簇集具有在染色质水平上促进调控的潜力。某些次级代谢物簇内的基因的特定顺序和位置可提供有助于确定基因活化的时间和顺序的结构框架。已经提出该过程组织贯穿途径中的酶步骤的连续的底物通道[Roze等人，2007]。功能相关基因的簇集的优势是需要共同调节生物合成或发育途径中的一组基因控制的连续步骤。簇集促进了一组生物合成基因的最佳调控。 [0009] 已经证实基因间隔区和染色体定位在优化基因表达中起作用。许多次级代谢物簇位于染色体的亚端粒区，其中异染色质转录受到位置调控。位于亚端粒区的某些簇显示出受到通用转录激活物例如LaeA或AreA的调节，其响应环境刺激以释放异染色质区用于翻译。在这些区中的基因转录在正常生长条件下沉默。当外源基因随机整合到宿主生物的基因组上时，位置转录调控可在靶基因的基因表达中发挥作用[Palmer等人，2010]。 [0010] 除了随机整合的转化DNA造成的基因破坏所导致的不可预见的多效性外，已经提出某些染色体位置比其他位置更加有利于异源表达，也许是因为与局部调节元件的特定相互作用，或更常见的是在正常高度表达的基因附近的活性天然转录[Davis等人，1991]。当从其原始基因座上被取代时，某些在空间或时间上被调控的曲霉基因，例如黄曲霉毒素簇[Chiou等人，2002]和分生孢子-特异性基因[Miller等人，1987]，显示出在调控反应中的巨大变化，并且也已报道了对异源表达的基因座作用[Verdoes等人，1995]。 [0011] 在Lubertozzi & Kiesling发表的论文中，将来自黄花蒿(Artemisia annua)的紫穗槐二烯合酶基因转化到构巢曲霉中。在他们的方法中，与在大肠杆菌中相同的表达实验相比，在构巢曲霉中的产物特异性大大降低。猜测其原因为其它构巢曲霉次生代谢产物基因的干扰背景活性，而大肠杆菌中不存在这些基因，或者缺乏将萜类化合物碳骨架修饰为紫穗槐二烯所需的支持性酶活性。 [0012] Bok等人公开了在构巢曲霉中laeA的过表达诱导许多次级代谢物簇，包括推定的萜类化合物簇。 [0013] WO 2002024865(Holzman)描述了使用位于洛伐他汀簇之外的Zn2(II)Cys6-转录激活物对洛伐他汀生产的调节。 [0014] WO 2001 021779(DSM)公开了在丝状真菌中激活β-内酰胺生产的簇特异性转录激活物BlaR的鉴定、克隆和过表达。 [0015] WO 1999 025735描述了嵌合转录因子的过表达，以增加次级代谢物的产生。 [0016] Sakai等人已将红曲霉(Monascus)的橘霉素生物合成基因簇引入米曲霉(Aspergillus oryzae)中。他们通过进一步引入由曲霉trpC启动子控制的多拷贝的激活物基因ctnA而能够增加橘霉素的产量。 [0017] Chiang等人已经能够通过用诱导型启动子取代转录激活物的启动子而在构巢曲霉中活化其它沉默聚酮簇。 [0018] WO 2006 014837提出了具有例如不同萜烯合酶的宿主细胞的遗传修饰，以获得类异戊二烯前体或类异戊二烯化合物。 [0019] WO 2010104763公开了使用编码萜烯合酶的核酸生产萜烯和萜类化合物。该发明描述了在调节区(启动子)下的基因表达，但不用基因簇。 [0020] 同样，WO 2008039499公开了包含编码萜烯合酶的核苷酸序列的核酸，WO 0240694公开了具体包含紫杉烷合成途径的表达载体，WO 2007140339公开了经由生物合成途径生产类异戊二烯。 [0021] US 2009/0137014 A1描述了用微生物从乙醇中生产紫穗槐-4，11-二烯或法呢烯。WO08133658描述了通过酿酒酵母和大肠杆菌从糖类中生产单萜。有若干其它专利/专利申请，例如WO 2008045555，其中使用微生物生产法呢烯。 [0022] 也描述了在工程化微生物中生产单萜(Carter，Peters & Croteau2003)。他们发现表达来自绿薄荷的柠檬烯合酶的大肠杆菌，生产低浓度的柠檬烯。通过在大肠杆菌中过表达来自挪威云杉(Picea abies)的单萜环化酶3-蒈烯环化酶，形成单萜柠檬烯、α-蒎烯、月桂烯、桧烯、3-蒈烯、α-萜品烯、β-水芹烯、α-萜品烯和萜品油烯的混合物(Reiling等人.2004)。 [0023] 倍半萜的生物合成的生产也描述于Kimura M.等人(2007)。 [0024] 因此，用于生产萜烯的生物合成途径是已知的。然而，所引用的出版物中无一公开特别激活属于萜烯生物合成途径的基因簇的转录因子的过表达。尤其是，这些出版物都没有教导替换簇的某些基因以获得不同的萜烯产物，或导致表达水平的改变。 [0025] 生物合成途径中的关键性基因的表达水平的平衡可以影响产物的结果和生物体本身的活力。很多时候，基因产物的充足将导致对其表达的抑制。表征了许多这样的负反馈环，例如Bergmann等人(2007)，其中描述了基因簇的单个基因的过表达通常导致对同一簇的另一基因产物的限制。另外，中间体的积累可以负面调节特定途径的后续步骤。因此，对于生物合成途径基因，最高可达到的基因表达不一定与所述途径的终产物的最高得率相关。因此，重要的是发现负责生物合成中的特定步骤的各基因的最佳表达水平。通过使用生物合成基因的引入启动子，这可能是困难的。 [0026] 现有技术解决方案的缺点在于难以获得萜烯的高产物得率。另外的缺点是通过微生物发酵得到的产物通常包含大量不确定的副产物和其它不需要的化合物。另外，每个基因都不得不具有自身的调节区(启动子)。总之，存在对获得较高得率的富集产物而无实质量的副产物的萜烯生产方法的需求。 [0027] 本发明的目标和概述 [0028] 本发明目的是提供用于通过微生物发酵生产萜烯的方法，并具有将产物代谢物从天然产生的某一种变为另一种的选项。优选地，同时使产物得率得以改善或者至少维持在可接受水平，并且产物为富集的。特别地，目的是提供这样的方法，其中真菌固有的转录调节能力用于将萜烯生物合成基因的转录调节维持在最佳水平，以在微生物宿主中生产多种具有商业价值的萜烯化合物。 [0029] 这些和其它目的通过下文描述和要求保护的本发明来实现。 [0030] 本发明的第一方面是用于在真菌中生产萜烯的方法。该方法包括以下步骤： [0031] (a)提供在宿主细胞中的修饰的萜烯生物合成基因簇，所述基因簇具有天然存在的萜烯生物合成基因和启动子，其中一个或多个这些基因或启动子已被取代、截短或移除； [0032] (b)提供在所述宿主细胞中的转录因子，使得所述转录因子与天然或修饰的启动子中的一个操作性连接以增加其表达，所述转录因子激活具有萜烯生物合成基因的修饰的萜烯生物合成基因簇和与所述基因操作性连接的调节区； [0033] (c)在允许所述激活簇的转录因子表达的条件下培养所述宿主；和 [0034] (d)任选回收由此产生的萜烯产物。 [0035] 依照该方面，提供具有生物合成基因簇的天然启动子、和任选能够激活所述修饰的基因簇的合适转录因子的额外拷贝的宿主细胞。 [0036] 本发明的第二方面是修饰的萜烯生物合成基因簇。所述簇的特征在于其基本上包含推定地编码以下的基因： [0037] (a)Zn(II)2Cys6-型转录因子(AN1599)；单萜合酶(例如γ-萜品烯合酶、柠檬烯合酶、萜品油烯合酶、桉油醇合酶或β-水芹烯合酶或倍半萜合酶(例如α-法呢烯合酶、紫穗槐二烯合酶、杜松烯合酶、石竹烯合酶或红没药烯合酶)或二萜合酶(例如ent-海松-8(14)，15-二烯(ent-pimara-8(14)，15-diene)合酶AN1594、紫杉二烯合酶、贝壳杉烯合酶、fusicoccadiene合酶、casbene合酶或松香二烯合酶)；GGPP-合酶(AN1592)或GPP合酶或FPP合酶、HMG-CoA还原酶(AN1593)，和 [0038] (b)任选翻译延伸因子1-γ(AN1595)、细胞色素P450(AN1598)、短链脱氢酶(AN1596)、与甲基转移酶具有一些相似性的推定蛋白(AN1597)、与所述基因操作性连接的调节区和任选AAA家族ATP酶(AN1591)和 [0039] (c)与条目(a)的基因和与条目(b)的任选基因操作性连接的调节区。 [0040] Zn(II)2Cys6型转录因子(即AN1599)，是天然存在于萜烯生物合成基因簇内的转录因子，能够调节位于该生物合成途径的所有基因。原本位于簇内部或与簇接近的转录因子是优选的，这是因为其可被容易地鉴定。然而，转化到同源或异源宿主中后，插入的与簇相关的转录因子的基因组位置不是关键性的。 [0041] 本发明的第三方面是用于在真菌中生产多种萜烯的如本文所述的修饰的萜烯生物合成基因簇的调节区。 [0042] 本发明的第四方面是以SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的序列为特征的转录因子的用途。在一个优选的实施方案中，与SEQ ID NO：52的同一性程度为82％、85％、87％、90％、92％、95％、98％或甚至99％。 [0043] 本发明的第五方面是构巢曲霉用于生产多种萜烯的用途。 [0044] 本发明第六方面是可用于本发明方法的生产宿主。根据本发明，所述宿主包含上述的萜烯生物合成途径基因簇和任选引入的与启动子操作性连接的转录因子，其中一个或多个基因或它们的启动子已被交换、截短或移除，其中所述转录因子能够激活萜烯生物合成基因簇。在这方面使用的引入的与启动子操作性连接的转录因子意指，与未经修剪用于本发明范围内的宿主相比，宿主细胞还携带(除可能的内源转录因子和启动子外)与启动子操作性连接的转录因子的一个或多个拷贝。引入的转录因子和启动子可以是与宿主同源或异源的。任选地，引入的与转录因子操作性连接的启动子可用于指导该转录因子的转录。另外引入的启动子可以是与宿主同源或异源的。 [0045] 本文所述的所谓的“AN1599转化体”或“AN1599转化体菌株”或“oe：AN1599”是构巢曲霉菌株，其具有处于组成型活性的gpdA-启动子下的Zn(II)2Cys6转录因子AN1599的额外拷贝。表达构建体的整合位点和拷贝数是未知的。本文所述的所谓的“gpdA＞AN1599”是构巢曲霉菌株，其具有靶向基因簇的组成型活性的gpdA-启动子以调节转录因子AN1599的表达。 [0046] 术语“修饰的簇”意图指一个或多个基因或这些基因簇的调节区已被改变或移除。因此，萜烯簇中的基因是可交换的。例如，可将萜烯合酶(AN1594)替换为任何单萜、二萜或倍半萜的合酶以生产单萜、二萜或倍半萜。同样，GGPP-合酶(AN1592)基因可被GPP或FPP合酶编码基因替换，以促进例如单萜合成。同样，可改变簇中的任何基因以促进优化的萜烯生产。同样，可改变该簇的生物合成基因的任何启动子以促进优化表达。该方法得益于经协调和调节的表达所致的簇组构。 [0047] 基因缺失的效应可有益于次级代谢物的生产。GDH1所编码的NADPH-依赖性谷氨酸脱氢酶的缺失被认为是在酵母中改进倍半萜生物合成的最佳靶基因[Asadollahi]。也已经报道了生物合成基因簇的单个基因的缺失以增加其它类型的次级代谢物的生产。在构巢曲霉中，在DHMBA的生物合成基因簇中的细胞色素P450基因缺失之后，提高了聚酮2，4-二羟-3-甲基-6-(2-氧丙基)苯甲醛(DHMBA)的生产[Gerke]。诸如这些的修饰可用于本发明。 [0048] 另外其它类型的修饰例如基因截短可增加萜烯生产。在酵母中，导致萜烯前体生产的甲羟戊酸(MVA)途径经历了复杂的反馈调节，其中HMG-CoA还原酶作为主要调节靶标[Dimster-Denk等人，1994]。HMG-CoA还原酶催化HMG-CoA向甲羟戊酸转化，并且在转录和转录后水平上被调节。从酵母HMG-CoA还原酶同工酶1(HMG1)中移除N-末端调节结构域，阻止了基于甾体的MVA途径负反馈，并因此增加了用于其它类异戊二烯途径的异戊烯基二磷酸的供应[Donald等人，1997]。在重组酿酒酵母(S.cerevisiae)中该截短的HMG-CoA还原酶的使用增加了青蒿酸的生产[Ro等人，2006]。酵母HMG-CoA还原酶(tHMG1)的截短形式的表达以及与中国红豆杉(T.chinensis)香叶基香叶基二磷酸合酶和中国红豆杉紫杉二烯合酶的组合，导致在酿酒酵母中的紫杉二烯生产的显著增加[Engels等人，2008]。诸如这些的修饰可以用于本发明。 [0049] 除了簇基因中的修饰外，其它调节剂的其它修饰可以协同使用。另外，基于簇的表达可以用来自组成型启动子的基因表达来补充。 [0050] 除了遗传操纵外，生长条件(例如碳源或氮源、温度、pH、培养时间)的优化可以用于增加特定萜烯化合物的生产。 [0051] 簇中的某些基因可以是可有可无的，因此这些位置可以用于增加有益于增加萜烯生产的任何生物合成基因(例如上述的那些或其它)的表达。 [0054] 图1.显示了在构巢曲霉FGSC A4染色体VII：1271985-1299880中的天然存在的二萜合酶簇的染色体区。图片使用Genome Browser工具修改自曲霉基因组数据库(Arnaud等人)。基因簇由基因AN1592-AN1599和任选基因AN1590和AN1591组成。 [0055] 图2.是用于随机整合转化的转录因子AN1599(SEQ ID NO：4)的构巢曲霉表达载体的示意图。 [0056] 图3.显示与FGSC A4野生型真菌相比，在AN1599转化体中的未修饰的萜烯基因簇区中的13个基因的表达水平。用qPCR(灰色棒)和DNA阵列(黑色棒)测定表达水平。qPCR结果中的误差线代表了三个单独样品各自三次技术重复的平均值的标准误差(SEM，n＝9)。DNA阵列数据代表平均值的比较，使用student′s t-检验的99％置信水平，p值≤0.01。qPCR和DNA阵列分析都表明转录因子AN1599(L)的过表达导致未修饰的二萜簇区域中的7个基因的显著上调。簇中的基因编码GGPP-合酶AN1592(E)、HMG-CoA还原酶AN1593(F)、ent-海松-8-(14)，15-二烯合酶AN1594(G)、延伸因子1-γ AN1595(H)、短链脱氢酶AN1596(I)、保守的推定蛋白AN1597(J)、细胞色素P450 AN1598(K)和Zn(II)2Cys6型转录调节剂AN1599(L)；并且，任选基因AN1590(C)和AN1591(D)。 [0057] 图4.是FGSC A4野生型和AN1599转化体真菌的SPME气相色谱图。基线约2000的上图显示FGSC A4菌株的光谱，无显著的峰。下部AN1599菌株的图在约36分钟的保留时间显示主峰。 [0058] 图5.是在AN1599转化体的SPME/GC分析分离的主峰的质谱。质谱匹配Palisade Complete 600K质谱文库化合物ent-海松-8(14)，15-二烯。 [0059] 图6.显示FGSC A4和AN1599转化体菌株提取物的GC/MS数据。 [0060] 图7.是用于γ-萜品烯生产的酿酒酵母表达载体的示意图。在此情况下，单萜合酶是来自温州蜜柑(Citrus unshiu)并且为了酿酒酵母而进行密码子优化的γ-萜品烯合酶。 [0061] 图8.是用于γ-萜品烯生产的酿酒酵母表达载体的示意图。在此情况下，单萜合酶是来自温州蜜柑并且为了构巢曲霉而进行密码子优化的γ-萜品烯合酶。 [0062] 图9.是酿酒酵母表达载体B1181的示意图。 [0063] 图10.是在组成型PGK1启动子下表达为了酿酒酵母而优化的γ-萜品烯合酶(C.unshiu)的酿酒酵母提取物的SPME气相色谱图。该图表明γ-萜品烯合酶的主要产物是γ-萜品烯。 [0064] 图11.是用于表达截短的酿酒酵母3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶(HMG1)的酿酒酵母表达载体的示意图。 [0065] 图12.是酿酒酵母表达载体B1184的示意图。 [0066] 图13.是用于将构巢曲霉gpdA启动子引入所述簇以调节转录因子AN1599的转录的载体的示意图。 [0067] 图14.是用于将AN1594替换为来自温州蜜柑的γ-萜品烯合酶的载体的示意图。可将构建体中的萜烯合酶基因改为任何单萜合酶(例如柠檬烯合酶、桉油醇合酶或蒈烯合酶)。 [0068] 图15.是用于将AN1592替换为挪威云杉香叶基二磷酸(GPP)合酶的载体的示意图。可将构建体中的合酶基因改为任何GPP合酶或具有合适的GPP合酶副活性的合酶。 [0069] 图16.是用于将AN1594替换为来自栽培苹果(Malus X domestica)的α-法呢烯合酶的载体的示意图。可将构建体中的合酶基因改为任何倍半萜合酶(例如紫穗槐二烯合酶、杜松烯合酶、石竹烯合酶或红没药烯合酶)。 [0070] 图17.是用于将AN1592替换为酿酒酵母法呢基二磷酸(FPP)合酶ERG20的载体的示意图。可将构建体中的合酶基因改为任何FPP合酶或具有合适的FPP合酶副活性的合酶。 [0071] 图18.是用于将AN1594替换为来自中国红豆杉的紫杉二烯合酶的载体的示意图。可将构建体中的合酶基因改为任何二萜合酶(例如贝壳杉烯合酶、fusicoccadiene合酶、casbene合酶或松香二烯合酶)。 [0072] 图19.是构巢曲霉二萜簇基因的缺失盒载体的示意图。在这种情况下，缺失的基因是AN1598。可以扩增侧翼区以缺失任何基因(例如AN1591、AN1590、AN1595、AN1596或AN1597)。 [0073] 图20.是用于将AN1594替换为来自藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)的赤霉素合酶的载体的示意图。可将构建体中的合酶基因改为任何二萜合酶(例如贝壳杉烯合酶、fusicoccadiene合酶、casbene合酶或松香二烯合酶)。 [0074] 图21.是A772(对照)、A772 oe：AN1599(AN1599过表达菌株)和A772 oe：AN1599；AN1594：：Gfcps/KS(AN1599过表达菌株，其中将海松二烯合酶基因，AN1594，替换为藤仓赤霉的赤霉素合酶，Gfcps/KS)的提取物的GC-MS色谱图。在对照菌株A772中未见主要产物峰，而过表达AN1599的菌株的主要产物峰是ent-海松-8(14)，15-二烯。当将合酶基因替换为赤霉素合酶时，主要产物峰是贝壳杉-16-烯，它是藤仓镰刀菌古巴基(copalyl)合酶/贝壳杉烯合酶Gfcps/KS基因的特定产物。 [0075] 图22.是A772(对照)、A772 oe：AN1599(AN1599过表达菌株)和A772 oe：AN1599；Gfcps/KS(AN1599过表达菌株，其具有随机整合的藤仓赤霉的赤霉素合酶Gfcps/KS)的提取物的GC-MS色谱图。该菌株中的赤霉素合酶具有AN1594启动子。在对照菌株A772中未见主要产物峰，而过表达AN1599的菌株的主要产物峰是ent-海松-8(14)，15-二烯。当将赤霉素合酶基因随机整合到基因组中，但在AN1594启动子调控之下时，可见两个主要产物峰。所述峰是ent-海松-8(14)，15-二烯(其是海松二烯合酶(AN1594)的产物)和贝壳杉-16-烯(其是藤仓镰刀菌古巴基合酶/贝壳杉烯合酶Gfcps/KS基因的特定产物)。海松二烯合酶基因缺失所致的二萜基因簇的进一步修饰导致特异性贝壳杉烯的产生。 [0076] 图23.是构巢曲霉海松二烯合酶基因AN1594的缺失盒载体的示意图。 [0077] 本发明优选实施方案的描述 [0078] 本发明涉及用于通过真菌的遗传操作而调节所述真菌的次级代谢物生产的方法。公开了利用双核锌簇，Zn(II)2Cys6，-蛋白显著增加有用的次级代谢物生产的方法。术语双核锌簇蛋白(ZBC-蛋白)意指编码具有Cys-(Xaa)2-Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)5-16-Cys-(Xaa)2-Cys-(Xaa)6-8-Cys作为其结构的一部分的蛋白的任何基因。一般而言，本发明方法包括在真菌中表达双核锌簇蛋白。Zn(II)2Cys6-型转录因子具有结合两个锌原子的非常保守的富含半胱氨酸的结构域。该DNA结合结构域识别靶基因启动子区域中各种取向的CGG三联体。 [0079] AN1599多肽是一种ZBC-蛋白，并且能够特别用作微生物中ent-海松-8(14)，15-二烯化合物生产的途径特异性转录因子。其特征在于包含SEQ ID NO：52的至少一部分的氨基酸序列。 [0080] 在本发明中，利用所述转录因子的过程被修饰以还提供其它产物化合物。 [0081] 使用本发明的方法，提供了上游关键前体合成基因，用于类异戊二烯合成的HMG-CoA还原酶和用于萜类化合物骨架合成的GGPP-合酶或替代的合酶，以及终产物修饰所需酶的激活。通过过表达转录激活物，我们可获得途径中所有必需基因的最佳表达水平。 [0082] 在本发明中，利用了转录因子激活修饰的萜烯基因簇的能力。簇基因之一是甲羟戊酸途径的关键的前体合成基因，萜烯生产所需的HMG-CoA还原酶。没有从簇上将该还原酶移除，但可以修饰该酶以增加萜烯生产。修饰可包括截短基因以抑制可能的反馈抑制。 [0083] 按照本发明的实施方案，将基因簇的GGPP-合酶编码基因变为GPP-合酶编码基因以促进GPP合成，用于单萜生产。 [0084] 按照另一实施方案，将二萜合酶编码基因变为单萜合酶编码基因以促进单萜合成。 [0085] 同样，可以通过改变二萜合酶编码基因而修饰萜烯簇以促进另一种萜烯的生产，所述另一种萜烯例如倍半萜或并非上述的天然产物ent-海松-8(14)，15-二烯的不同的二萜。 [0086] 按照再一实施方案，同时改变GGPP合酶编码基因和二萜合酶编码基因。 [0087] 或者，可将二萜合酶编码基因变为倍半萜合酶编码基因并将GGPP合酶编码基因变为FPP合酶编码基因以促进倍半萜烯合成。 [0088] 可将转录因子的调节区变为另一启动子。所述启动子可以是具有组成型活性的启动子或诱导型启动子。组成型活性启动子的实例包括gpdA(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子、pkiA(丙酮酸激酶)启动子和trpC(色氨酸生物合成)启动子。诱导型启动子的实例包括alcA/alcR(醇脱氢酶)、glaA(葡糖淀粉酶)启动子和niiA/niaD(亚硝酸/硝酸还原酶)、sucA(β-呋喃果糖苷酶)启动子、amdS(乙酰胺酶)启动子和xylP(木聚糖内切酶)启动子。所述启动子可以是细胞同源或异源的。在本实施中，未将额外拷贝的转录因子引入细胞中。在一个实施方案中，也可引入额外拷贝的转录因子。 [0089] 位于簇内的基因的功能用BLAST[Altschul等人，1997]和pfam软件程序使用同源检索来预测。所述簇含有编码HMG-CoA还原酶的基因，该酶是在甲羟戊酸途径中的类异戊二烯前体生产所需的限速酶。在酵母中，HMG-CoA还原酶在转录和转录后水平上都经历了复杂的反馈调节[Dimster-Denk等人，1994]。来自酿酒酵母的HMG-CoA还原酶同工酶1(HMG1)的N-末端调节结构域是基于甾体的MVA途径负反馈的靶标[Donald等人，1997]。 构巢曲霉的二萜-基因簇中的HMG-CoA还原酶AN1593缺乏该N-末端区。这有益于本发明范围内的萜烯生产。所述簇还含有GGPP合酶AN1592的编码基因，该酶结合类异戊二烯部分以形成二萜类化合物骨架的前体。这进一步改进了萜烯生产。 [0090] 在通常的二萜合成中，编码ent-贝壳杉烯/ent-古巴基(ent-kaurene/ent-copalyl)型合酶的萜烯合酶基因进行两个连续的环化步骤，首先从GGPP前体 形成ent-古巴基二磷酸，然后从古巴基二磷酸形成二萜化合物海松二烯。细胞色素P450(AN1598)、短链脱氢酶(AN1596)和位于簇内的推定蛋白(AN1597)可发挥修饰酶功能，进行氧化/还原反应和官能团至二萜结构的加成。在蛋白合成期间，翻译延伸因子1-γ在延伸循环中发挥中心作用。翻译延伸因子1-γ(AN1595)的编码基因位于簇内。AAA+ATP酶的成员发挥分子伴侣、蛋白酶的ATP酶亚基、解旋酶或核酸刺激的ATP酶的功能。除保守的α-β-α核心结构域结构和P-环NTP酶的Walker A和B基序外，AAA+蛋白还包含若干独特特征。推定的ATP酶(AN1591)的编码基因位于生物合成簇区内。 [0091] 编码选择标记基因和与启动子操作性连接的转录因子AN1599多肽以及终止子的表达盒，可用于通过如下改进在微生物例如丝状真菌例如构巢曲霉、黑曲霉(Aspergillus niger)、费希新萨托菌(Neosartorya fisheri)、犬小孢子菌(Microsporum canis)或里氏木霉(Trichoderma reesei)中的萜烯的生产，特别是海松二烯化合物的生产：通过用包含与启动子操作性连接的转录因子和终止子的表达盒转化生物体，并选择具有选择标记和与非转化细胞相比增加的萜烯化合物生产的转化细胞。转化的宿主(其为产生萜烯的微生物)可用于通过发酵生产萜烯化合物，并且萜烯化合物可任选自细胞或生长培养基中分离。 [0092] 萜烯产物可以是任何萜烯，例如单萜、倍半萜、二萜或三萜。然而，单萜和倍半萜是优选的，单萜是最优选的萜烯产物类型。 [0093] 在本发明的一个实施方案中，萜烯或萜类化合物通过激活萜烯途径在真菌中生产。基本想法是过表达明确已知激活属于萜烯例如海松二烯生物合成途径的基因簇的正转录因子并且改变/和或修饰簇内的基因/和或启动子，以促进想要的萜烯(其优选并非海松二烯)的有效生产。整个基因簇的转录上调将克服向单个宿主生物中引入用于各个生物合成途径基因的多个过表达构建体的难题。与其中多个基因被外源性地引入宿主并上调的传统系统相比，该方法获益于能够在宿主生物中上调萜烯化合物生产所必需的所有基因的特异性转录激活物。已经指出，具有多个外源基因的生物的产物结果将依赖于每个引入基因的单独表达水平。平衡表达水平以获得最佳产物得率可以是复杂的。同时优化多个外源基因的表达在许多情况下将产生所谓的瓶颈效应，其中一个基因的转录激活不足将限制产物得率，无论途径中其余基因获得多高的上调。当多个具有相似终产物的生物合成途径被激活时，存在的前体库(pool)被引导至具有最高表达水平的合酶基因的生物合成途径。在我们的DNA阵列研究中发现宿主转录组中的整体变化，显示当萜烯簇(在此情况下未修饰的簇)被激活时多个其它次级代谢产物基因簇下调[Bromann等人，2012]。在AN1599转化体中仅检测到少量副产物。浓缩的主要产物和高得率为工业用途和针对预期应用可能的进一步纯化提供了优良材料。在本发明中证实，当萜烯基因簇中存在的基因被改变时，这些论证也是真的。然而，不排除因为天然和引入的基因的不同特定活性而可需要表达水平优化。簇内有其它位置可作为“保留”位置，以优化表达和活性水平。这样的基因可以是可有可无的，因此这些位置可用于增加用于增加萜烯生产所必需的任何生物合成基因的表达。 [0094] 按照本发明的特别优选的实施方案，基因修饰仅限于以下这些，其中： [0095] -将天然基因簇的GGPP-合酶编码基因变为GPP-合酶编码基因， [0096] -将GGPP合酶编码基因变为FPP合酶编码基因， [0097] -将二萜合酶编码基因变为单萜合酶编码基因，和 [0098] -将二萜合酶编码基因变为倍半萜合酶编码基因， [0099] -将二萜合酶编码基因变为另一二萜合酶编码基因， [0100] 和不使用表达水平优化。 [0101] 在这方面，术语萜烯意指由异戊二烯单元(CH2＝C(CH3)-CH＝CH2)构建的碳氢化合物。因此萜烯碳水化合物具有分子式(C5H8)n，并且根据异戊二烯单元的数目将其分为：半萜、单萜、倍半萜、二萜、三萜和四萜。在一个实施方案中，所述萜烯为萜类化合物，其是碳骨架被修饰的萜烯。在一个实施方案中，所述萜烯是单萜或倍半萜。γ-萜品烯、柠檬烯、伞花烃和桉油醇是优选的实施方案。这些小萜烯产物是非常有价值的制药工业材料。 [0102] 在这方面，术语“允许表达的条件”意指其中激活簇的转录因子(例如AN1599)在组成型启动子下或在诱导型启动子下并且微生物在诱导剂存在下培养的条件。 [0103] 在一个实施方案中，条目的宿主细胞携带具有萜烯生物合成基因的萜烯生物合成基因簇，并且其中将合适的启动子引入所述细胞中。该启动子将会与转录因子AN1599操作性连接并将调节其转录。 [0104] 在一个实施方案中，条目的宿主细胞携带具有萜烯生物合成基因的萜烯生物合成基因簇，并且其中将基因簇的转录因子(尤其是AN1599)与合适的启动子操作性连接并转化到所述细胞中。 [0105] 在其它实施方案中，将具有萜烯生物合成基因的萜烯生物合成基因簇转化到宿主细胞中。所述宿主可以是与所述簇异源或同源的。 [0106] 激活转录因子AN1599的引入的启动子可以是与宿主细胞同源或异源的。它可以是组成型或诱导型启动子。 [0107] 与启动子操作性连接并激活具有萜烯生物合成基因的萜烯生物合成基因簇的转录因子，可以是与宿主细胞和/或所述基因簇同源或异源的。转化后，宿主菌株可具有所述转录因子和启动子的一个或多个拷贝。 [0108] 可优选与合适的启动子操作性连接的转录因子的定点转化、单个基因的转化和/或整个簇的转化或途径基因与调节区的转化，以阻断不需要的宿主基因的转录或提高合成途径基因的转录。 [0109] 在一个实施方案中，生产宿主包含编码转运蛋白的基因。转运蛋白可在萜烯途径簇内，其对于宿主可为天然的，或为引入的异源或同源转运体。转运体可以是活性转运体或经促进扩散而运作。其可促进离子或小分子通过膜，例如增加萜烯的分泌。本领域的技术人员充分理解的是，转运体可增加所需产物的生产。例如，若干PDR型转运体以及主要易化子超家族(MFS)的转运体在生产青蒿酸的酿酒酵母菌株中上调。这些转运体可增加萜烯产物的输出[Ro等人，2008]。 [0110] 用DNA阵列实验，我们注意到在其中萜烯生物合成途径被激活的AN1599转化体菌株中许多转运体和转移酶的转录上调[Bromann等人，2012]。前体和终产物的有效转运将可能有益于真菌中次级代谢物的生产。 [0111] 转录因子(例如AN1599)可通过激活途径基因(上调)而激活萜烯生物合成途径。AN1599调节剂(例如AN1599)也可抑制其它途径的基因。 [0112] 在这方面，转录因子(例如AN1599)能够上调整个萜烯途径，甚至当该途径的基因簇被如上所述地修饰时。途径的激活增加所需终产物的量并且减少杂质包括中间体。转录因子例如AN1599的位置不受限制。在一个实施方案中，使用天然AN1599启动子，在另一个实施方案中，将转录因子AN1599和与AN1599操作性连接的启动子随机转化到宿主细胞中，在另一个实施方案中，转化为是定点的。因此，生产宿主将在簇内具有天然转录因子，和任选与位于基因组别处的启动子操作性连接的所述转录因子的另外一个/多个拷贝。在一个实施方案中，将启动子引入基因簇中以调节簇内天然转录因子的表达。在一个实施方案中，将启动子引入基因簇内以调节簇内天然转录因子的表达并且任选与启动子操作性连接的所述转录因子的另外一个/多个拷贝位于基因组别处。 [0113] 多个真菌转录因子的N-末端区域包含富含半胱氨酸的基序，所述基序涉及DNA的锌-依赖性结合。该区域形成双核的Zn簇，其中两个Zn原子通过六个Cys残基结合。在转录因子AN1599中，氨基酸45-86形成保守的Zn(II)2Cys6 DNA-结合结构域。 [0114] 共有序列haCdnCrkkKvKCda...kkPaCsnCkklnleCtfyse [0115] 匹配 +aC++Cr+Kv+Cd+ +P C+C+k++++C++ [0116] AN1599 45-86 [0117] RACQSCRASKVRCDQPNPGMP-CLRCQKSGKPCVDAAS [0118] AN1599保守的Zn(II)2Cys6 DNA-结合结构域的Pfam(pfam.janelia.org/)序列比对。 [0119] 在一个实施方案中，转录因子具有序列SEQ ID NO：52，或与SEQ ID NO：52显示至少80％同一性的序列。在一个优选的实施方案中，转录因子具有以SEQ ID NO：52或与SEQ ID NO：52显示至少85％、88％、90％、92％、95％、98％同一性的序列为特征的序列。 [0120] 启动子应适合宿主，并且优选在培养条件下有效的。通常启动子与生产宿主同源但也可使用异源启动子。启动子可为组成型或诱导型启动子。当终产物或一种或多种中间体对生产宿主有害或有毒时，诱导型启动子特别有利，并且优选控制表达。合适的组成型活性的启动子的实例为例如以下启动子：构巢曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpdA)启动子、丙酮酸激酶(pkiA)启动子和色氨酸生物合成基因(trpC)启动子。合适的诱导型启动子的实例包括硝酸还原酶(niaD)启动子、醇脱氢酶(alcA)启动子、葡糖淀粉酶(glaA)、蔗糖-诱导型启动子或β-呋喃果糖苷酶(sucA)启动子、乙酰胺酶(amdS)启动子和异源诱导型启动子例如产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)木聚糖内切酶(xylP)启动子。 [0121] 宿主细胞可为与编码转录因子的一个或多个基因、启动子和基因簇异源或同源的。可使用任何生产宿主但优选宿主为微生物细胞例如真菌、酵母或细菌，更优选真菌，并且又更优选丝状真菌。合适的真菌宿主的实例为曲霉、青霉(Penicillium)、木霉(Trichoderma)、脉孢菌(Neurospora)、镰刀菌(Fusarium)和新萨托菌(Neosartorya)。在一个实施方案中，宿主为曲霉、青霉或木霉，并且在优选的实施方案中为构巢曲霉。特别优选的宿主为与簇同源的构巢曲霉。在一个实施方案中，宿主细胞为构巢曲霉FGSC A4。在一个实施方案中，宿主细胞是构巢曲霉A1155。在一个实施方案中，宿主细胞是构巢曲霉A772。 [0122] 在实验部分，我们描述了AN1599转化体菌株，所述菌株为已经转化而在组成型活性的gpdA-启动子下携带Zn(II)2Cys6转录因子AN1599基因的额外拷贝的构巢曲霉菌株FGSC A4或A772。外源基因产物(SEQ ID NO：4)用PciI线性化或外源基因产物(SEQ ID NO：4)片段经PCR扩增并转化入宿主菌株的宿主基因组。表达构建体的整合位点和拷贝数目是未知的。我们还描述了gpdA＞AN1599菌株，其是已经转化而在基因簇中携带引入构巢曲霉gpdA启动子的构巢曲霉菌株FGSC A4、A772或A1155。在gpdA＞AN1599菌株中的gpdA启动子紧接着位于生物合成基因簇中的AN1599的ORF的5’端被插入，其中所述启动子调节AN1599的表达。 [0123] 转化构建体的克隆可通过本领域已知的方法进行，转化和转化体的选择可通过本领域已知的方法进行。一个实例是通过原生质体转化并使用草铵膦选择。一个实例是通过原生质体转化并使用5-磷酸-乳清酸选择。一个实例是通过生物射弹(biolistic particle bombardment)转化。当表达盒整合到宿主的染色体DNA时获得稳定的转化。整合可以靶向特定基因组基因座或可随机整合。然而，附加体质粒和其它非整合的构建体也在本发明内。 [0124] 基因簇为一组用于编码某一产物的生物合成所需蛋白的两个或更多个基因。在本发明的一个实施方案中，萜烯生物合成基因簇获自物种曲霉、新萨托菌或小孢子菌(Microsporus)，优选构巢曲霉、黑曲霉、费希新萨托菌或犬小孢子菌。最优选构巢曲霉，特别是构巢曲霉FGSC A4、A1155或A772。 [0125] 在另一个实施方案中，簇基本上包含编码具有下列特征的蛋白的基因： [0126] SEQ ID NO：52或与SEQ ID NO：52(AN1599)具有至少80％、优选至少85％、90％、95％或甚至98％程度的同一性的序列，或其活性片段； [0127] SEQ ID NO：47或与SEQ ID NO：47(AN1594)具有至少88％、90％、95％或甚至98％程度的同一性的序列，或其活性片段； [0128] SEQ ID NO：46或与SEQ ID NO：46(AN1593)具有至少90％、优选至少95％、97％或甚至98％程度的同一性的序列，或其活性片段； [0129] SEQ ID NO：45或与SEQ ID NO：45(AN1592)具有至少86％、优选至少90％、95％、97％或甚至98％程度的同一性的序列，或其活性片段，或相应的GPP合酶、FPP合酶，或具有合适的GPP和/或FPP副活性的另一合酶； [0130] SEQ ID NO：48或与SEQ ID NO：48(AN1595)具有至少90％、优选至少93％、95％、97％、98％或甚至99％程度的同一性的序列，或其活性片段； [0131] SEQ ID NO：51或与SEQ ID NO：51(AN1598)具有至少94％、优选至少95％、97％或甚至98％程度的同一性的序列，或其活性片段； [0132] SEQ ID NO：49或与SEQ ID NO：49(AN1596)具有至少90％、优选至少93％、95％、97％、98％或甚至99％程度的同一性的序列，或其活性片段； [0133] SEQ ID NO：50或与SEQ ID NO：50(AN1597)具有至少90％、优选至少93％、95％、97％、98％或甚至99％程度的同一性的序列，或其活性片段 [0134] 和任选 [0135] SEQ ID NO：44或与SEQ ID NO：44(AN1591)具有至少50％、优选至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或甚至95％程度的同一性的序列，或其活性片段， [0136] 和与所述基因操作性连接的调节区，例如SEQ ID NO：43或与所述SEQ ID NO：43具有至少40％、优选至少50％、60％、70％、80％或甚至90％程度的同一性而无编码所述蛋白的部分的序列。 [0137] 在另一个实施方案中，簇包含编码如上文所列出和表征的蛋白的基因。在另一个实施方案中，簇由编码如上文所列出和表征的蛋白的基因组成。在再一个实施方案中，簇包含编码如上文所列出和表征的蛋白(AN1599)、(AN1594)、(AN1593)、(AN1592)、(AN1595)、(AN1598)、(AN1596)和(AN1597)的基因。在再一个实施方案中，簇由编码如上文所列出和表征的蛋白(AN1599)、(AN1594)、(AN1593)、(AN1592)、(AN1595)、(AN1598)、(AN1596)和(AN1597)的基因组成。 [0138] “活性片段”意指具有完成蛋白典型功能所需的所有部分的片段。 [0139] 在这方面，短语“基本上包含”意指至少包含编码萜烯生产所需蛋白的基因。在这方面应至少包含编码Zn(II)2Cys6-型转录因子(AN1599)，萜烯合酶(例如单萜、倍半萜、二萜)，HMG-CoA还原酶(AN1593)，GPP、FPP和GGPP-合酶中的一个的基因，以及与所述基因操作性连接的调节区。 [0140] 因此，也可使用簇片段。这样的簇片段优选基本上包含编码具有下列特征的蛋白的基因： [0141] SEQ ID NO：52或与SEQ ID NO：52(AN1599)具有至少80％、优选至少85％、90％、95％或甚至98％程度的同一性的序列， [0142] SEQ ID NO：47或与SEQ ID NO：47(AN1594)具有至少88％、90％、95％或甚至98％程度的同一性的序列，或相应的单萜合酶、倍半萜合酶或二萜合酶，SEQ ID NO：46或与SEQ ID NO：46(AN1593)具有至少90％、优选至少95％、97％或甚至98％程度的同一性的序列，[0143] SEQ ID NO：45或与SEQ ID NO：45(AN1592)具有至少86％、优选至少90％、95％、97％或甚至98％程度的同一性的序列，或相应的GPP、FPP合酶，或具有合适的GPP和/或FPP副活性的另一合酶，和与所述基因操作性连接的调节区例如SEQ ID NO：43或与所述SEQ ID NO：43具有至少40％、优选至少50％、60％、70％、80％或甚至90％程度的同一性的序列。 [0144] 生物合成途径基因簇内基因的组构不是关键的，例如构巢曲霉和费希新萨托菌携带各自的基因但基因次序是不同的，由此这些都同样是优选的。 [0145] 因此，可以使用所述簇片段或簇基因的任何组合。 [0146] 此外，按照本发明，改变了基因簇内的一个或多个基因。如上所述，可将改变引入天然宿主、异源宿主中，引入到完整簇中或引入到部分簇中。如上所述，可将处于合适启动子下的转录因子，优选AN1599，靶向到基因组或随机整合到基因组中。另外，可将启动子靶向至调节簇内的天然位置的AN1599表达。在此，可将启动子插入并连接AN1599的ORF上游。引入的启动子可以是诱导型或组成型的。引入的启动子可以是与宿主异源或同源的。 [0147] 在一个实施方案中，将萜烯合酶(AN1594)变为单萜合酶。合酶可以是但不限于，(+)-柠檬烯合酶(AF514287，区：47-1867，来自柠檬(Citrus limon))、(AY055214，区：48-1889；藿香(Agastache rugosa))；(-)-柠檬烯合酶(DQ195275；区：1-1905，北美云杉)、(AF006193，区：73-1986；北美冷杉(Abies grandis))、(MHC4SLSP，区：29-1828；留兰香(Mentha spicata))、γ-萜品烯合酶(AF514286，区：30-1832，来自柠檬)、(BAD27258，区166-1803，来自温州蜜柑)、(BAD27259，区166-1803，来自温州蜜柑)；萜品油烯合酶(AY906866，区：10-1887；花旗松(Pseudotsuga menziesii))；β-水芹烯合酶(AF139205，区：34-1926；北美冷杉)；桉油醇合酶(希腊鼠尾草(S.fruticosa)SfCinS1，DQ785793)。 在一个实施方案中，将萜烯合酶(AN1594)变为单萜合酶。合酶可以是但不限于，(+)-柠檬烯合酶(AF514287，区：47-1867，柠檬)、(AY055214，区：48-1889；藿香)、(AAG01140，荆芥(Schizonepeta tenuifolia))；(-)-柠檬烯合酶(DQ195275；区：1-1905，北美云杉(Picea sitchensis))、(AF006193，区：73-1986；北美冷杉)、(MHC4SLSP，区：29-1828； 留兰香)、(AAG01140，荆芥)、(ABI21837，大麻(Cannabis sativa))、(AAG31438，白苏(Perilla frutescens))、(AAS47694，挪威云杉)；γ-萜品烯合酶(AF514286，区：30-1832，柠檬)、(BAD27258，区166-1803，温州蜜柑)、(BAD27259，区166-1803，温州蜜柑)；β-水芹烯合酶(AF139205，区：34-1926；北美冷杉)；1，8-桉油醇合酶(AAU01970，拟南芥(Arabidopsis thaliaha))、(BAD91045，温州蜜柑)、(ABP88782，Nicotiana suaveolens)、(AAC26016，鼠尾草(Salvia officinalis))、(希腊鼠尾草(Salvia fruticosa)SfCinS1，DQ785793)；β-蒎烯合酶(AAB71085，北美冷杉)、(AAK58723，黄花蒿)、(AAM53945，柠檬)、(BAD27260，温州蜜柑)、(AAS47692，挪威云杉)；α-蒎烯合酶(ABI21838，大麻)、(CAD57092，欧洲草莓(Fragaria vesca))、(AAP72020，北美云杉)、(AAO61225，火炬松(Pinus taeda))、(AAO61228，火炬松)；α-萜品醇合酶(ACC66282，洋玉兰(Magnolia grandiflora))、(AAO61227，火炬松)、(ACF24767，檀香(Santalum album))、(AAS79351，葡萄(Vitis vinifera))、(AAS79352，葡萄)、(AAL59230，玉米(Zea mays))、(ABR09292，玉米)、(AAX07267，花旗松)；萜品油烯合酶(AY906866，区：10-1887；花旗松)、(AAV63792，罗勒(Ocimum baslilcum))、(AAF61454，北美冷杉)；E)-b-罗勒烯合酶(AAO42614，金鱼草(Antirrhinum majus))、(NP_189209，拟南芥)、(AAN65379，拟南芥)、(BAD91046，温州蜜柑)、(AAT86042，百脉根(Lotus japonicus))、(ABY65110，棉豆(Phaseolus lunatus))；月桂烯合酶(AAB71084，北美冷杉)、(AAO41727，金鱼草)、(AAO41726，金鱼草)、(AAG09310，拟南芥)、(AAX69064，普通番茄(Lycopersicon esculentum))、(AAV63791，罗勒)、(AAF76186，白苏)、(AAS47696，挪威云杉)、(CAC41012，Quercus ilex)；(+)-(3S)-芳樟醇合酶(ABR24418，金鱼草)、(AAO85533，拟南芥)、(AAC49395，仙女扇(Clarkia brewerii))、(CAD57081，草莓(Fragaria ananassa))、(CAD57106，草莓)、(EU596453，亚洲栽培稻(Oryza sativa))；(-)-(3R)-芳樟醇合酶(AAF13357，黄花蒿)、(AAF13356，黄花蒿)、(ABB73045，薰衣草(Lavandula angustivolia))、(AAX69063，普通番茄)、(AAL99381，柠檬薄荷(Mentha citrata))、(AAV63789，罗勒)、(AAS47693，挪威云杉)；香叶醇合酶(CAD29734，细毛樟(Cinnamomum tenuipilum))、(AAR11765，罗勒)、(AAY88965，柠檬紫苏(Perilla citriodora))、(ABB30218，白苏)；莰烯合酶(AAB70707，北美冷杉)；葑醇合酶(AAV63790，罗勒)；(+)-3-蒈烯合酶(AAO73863，挪威云杉)、(AAM89254，狭长叶鼠尾草(Salvia stenophylla))；(+)-桧烯合酶(AAC26018，鼠尾草)、(ABH07678，Salvia pornifera)； (+)-冰片基合酶(AAC26017，鼠尾草)或以上任何的同源物。优选单萜合酶是γ-萜品烯合酶。 [0148] 萜烯合酶的载体可包含编码用于萜烯合酶的纯化或检测的标签的核酸。所述标签可以是但不限于，His-6标签、c-myc表位、血凝素(HA)标签、FLAG表位、Strep-TAGII、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、生物素标签、绿色荧光蛋白(GFP)或黄色荧光蛋白(YFP)。 [0149] 在另一个实施方案中，其中萜烯合酶(AN1594)被单萜合酶取代的构建体/菌株伴随有其中GGPP-合酶(AN1592)被GPP合酶或具有合适的GPP副活性的合酶取代的构建体。GPP合酶可以是但不限于：(AF513111；北美冷杉)、(AF513112，北美冷杉)、(AY534686，金鱼草)、(AY534687；金鱼草)、(Y17376；拟南芥)、(AE016877，Locus AP11092；蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)；ATCC 14579)、(AJ243739；甜橙(Citrus sinensis))、(AY534745；仙女扇)、(AY953508；Ips pini)、(DQ286930；普通番茄)、(AF182828；胡椒薄荷(Mentha x piperita)、(AF182827；胡椒薄荷)、(MP1249453；胡椒薄荷)、(PZE431697，Locus CAD24425；Paracoccus zeaxanthinifaciens)、(AY866498；库洛胡黄连(Picrorhiza kurrooa))、(AY351862；葡萄)和(AF203881，Locus AAF12843；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis))。 [0150] 在一个实施方案中，将萜烯合酶(AN1594)变为另一二萜合酶例如紫杉二烯合酶(GI：1354138，短叶红豆杉(Taxus brevifolia))、(GI：156106768，曼地亚红豆杉(Taxus x media))、(GI：71796850，南方红豆杉(Taxus wallichiana var.mairei))、(GI：83596264，东北红豆杉(Taxus cuspidate))；赤霉素合酶(GI：6009475，藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi (藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)))；fusicoccadiene合酶；贝壳杉烯合酶(GI：239750080，丹参(Salvia miltiorrhiza))、(GI：226531621，玉米)；Gasbene合酶(GI：606417，蓖麻(Ricinus communis))；松香二烯合酶或任何上述的同源物。 [0151] 在一个实施方案中，将萜烯合酶(AN1594)变为倍半萜合酶例如红没药烯合酶(AAC24192，北美冷杉)、(NP_193064，拟南芥)、(NP_193066，拟南芥)、(AAX07266，花旗松)；紫穗槐-4，11-二烯合酶(CAB94691，黄花蒿)、(AAF61439，黄花蒿)、(AAF98444，黄花蒿)；杜松烯合酶(AAA93064，树棉(Gossypium arboreum))；杜松烯合酶(AAA93065，树棉)、(CAA65289，树棉)、(AAC12784，陆地棉(Gossypium hirsutum))、(AAF74977，陆地棉)、(AAV63787，罗勒)；法呢烯合酶(ABX83201，甜瓜(Cucumis melo))、(AAB95209，胡椒薄荷)、(AAS47697，挪威云杉)、(AAX07265，花旗松)；(E)-b-石竹烯合酶(AAO85539，拟南芥)；(E)-b-石竹烯合酶(AAL79181，黄花蒿)、(AAV36464，蒺藜苜蓿(Medicago truncatula))、(EU596454，亚洲栽培稻)、(ABJ16553，亚洲栽培稻)、(ABY79206，玉米)、(ABY79209，二倍体玉米(Zea diploperennis))、(ABY79210，委委特南戈类玉米(Zea m.huehuetenangensis))、(ABY79211，大 刍草(Zea luxurians))、(ABY79212，玉米 )、(ABY79213，玉米)、(ABY79214，多年生玉米(Zea perennis))或任何以上的同源物。 [0152] 在另一个实施方案中，其中萜烯合酶(AN1594)被倍半萜合酶取代的构建体/菌株伴随有其中GGPP-合酶(AN1592)被FPP合酶或具有合适的FPP副活性的合酶取代的构建体。 [0153] 如本文中所使用的，术语“同一性”是指两个氨基酸序列之间从相应基因编码的第一个氨基酸至最后一个氨基酸彼此相互比较的总体同一性。用于本发明目的，同一性优选借助已知的计算机程序使用标准算法确定。这样的程序的实例是NCBI BLAST、BLASTp(已知蛋白序列、氨基酸的比较)、BLASTn(核酸序列比较)、BLASTx(翻译的核酸序列与已知蛋白序列的比较)。 [0154] 在这方面，术语“萜烯生物合成基因”意指编码萜烯环化酶/合酶的基因和编码在萜烯生产和/或修饰中必需的/必不可少的蛋白的基因。 [0155] HMG-CoA还原酶是类异戊二烯前体生物合成中的限速酶，因此对萜烯的合成是必不可少的。因此，编码该还原酶的基因，即编码SEQ ID NO：46或与SEQ ID NO：46(AN1593)具有至少90％、优选至少95％、97％或甚至98％程度的同一性的序列的基因，也是必不可少的。所有或任何簇基因都可以被取代或截短。此外，任何簇基因都可以移除。进行这些修饰主要是为了增加所需萜烯化合物的生产。 [0156] 充足的前体分子合成关键性地影响所需代谢物的得率。增加生物合成基因的量而不激活上游的前体合成将不影响产物的得率。当前体途径也被激活时，可能获得靶代谢物的最佳生产水平。 [0157] 当启动子的功能导致转录时，两个DNA序列是操作性连接的。操作性连接是这样的连接：其中将一个序列以使得该序列在调节序列的影响或控制下表达的方式连接到一个或多个调节序列。 [0158] 在这方面簇基因的调节区在宿主生物中天然存在。转录控制区与编码区天然关联。这些调节区在转录因子的影响或控制下。例如，转录因子AN1599的DNA结合结构域识别生物合成簇区域(SEQ ID NO：43)中的靶基因的启动子区内的各种取向的CGG三联体或其它序列段，因此激活所述基因的转录。对于各个基因尚未鉴定影响转录因子结合的CGG三联体或其它序列段。然而，所鉴定的簇内的启动子区对于转录因子AN1599造成的转录激活是特异性的。SEQ ID NO：43内包含的天然存在的调节区可与表达的转录因子一起使用以促进簇内ORF的转录。调节区可包含各种元件，例如启动子、增强子、阻遏子或调节转录或翻译的其它序列。调节区相对于宿主生物可为异源的(外源)或同源的(内源)。本文所述簇基因(SEQ ID NO：43)的调节区相对于所述基因的编码区为内源的以及天然存在的。 [0159] 用于本文所述转录因子AN1599的过表达的启动子是同源的但非天然存在的。启动子与编码序列操作性连接。用于转录因子的过表达的启动子也可为异源的。如本文所使用的，术语“异源启动子”和“异源控制区”指天然与特定核酸通常不关联的启动子和其它控制区，或是来自并非宿主的生物体的启动子和其它控制区。本文所述过表达AN1599的真菌菌株还包含天然与AN1599的编码区关联的天然调节区。AN1599转录因子通过其天然调节区而上调的机制是未知的。AN1599通过其天然存在的调节区的激活引起的本文所述基因簇的激活在本发明实施方案内。 [0160] 在生物合成基因簇中，酶/蛋白编码区之间的调节区包括启动子、终止子和各种调节因子能够连接的区域。本文中可互换使用的术语“DNA调节序列”、“控制元件”和“调节元件”指在宿主细胞中提供和/或调节编码序列的表达和/或编码多肽的生产的转录和翻译控制序列，例如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、终止子、蛋白降解信号等。在一个实施方案中调节区为以SEQ ID NO：43或与所述SEQ ID NO：43具有至少40％、优选至少50％、60％、70％、80％或甚至90％程度的同一性而无编码合成蛋白的部分的序列为特征的那些。 [0161] 使用转录因子用于生产单萜类化合物、优选γ-萜品烯、柠檬烯、伞花烃或桉油醇，亦是本发明的实施方案。 [0162] 一个实施方案是构巢曲霉FGSC A4、A1155或A772用于使用本文描述和在实验部分针对FGSC A4所说明的方法生产萜烯的用途。 [0164] 实施例1.鉴定构巢曲霉中的二萜簇。 [0165] 按照Bromann等人(2012)所述鉴定选择的簇。从构巢曲霉FGSC A4基因组搜索具有InterPro结构域IPR008949“萜类化合物合酶”和IPR008930“萜类化合物环化酶”的基因。为了寻找具有用于次级代谢的正调节剂和特征性基因的潜在的萜烯生物合成基因簇，在萜烯合酶基因周围的20kb基因组区中搜索InterPro结构域IPR001138“真菌转录调节蛋白”、IPR002403“细胞色素P450，E-类，IV组”和IPR001128“细胞色素P450”。相似的簇也存在于费希新萨托菌、犬小孢子菌、里氏木霉、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、棒曲霉(Aspergillus clavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲霉、米曲霉、土曲霉(Aspergillus terreus)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)中，并且在以下物种中对萜类化合物簇作图：棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、白色假丝酵母(Candida albicans)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、球毛壳(Chaetomium globosum)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、芽殖酵母(Saccharomyces castellii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、Phanerochaete chrysosporium、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巩膜核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、Stagonospora nodorum、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)和米根霉(Rhizopus oryzae)。 [0166] 图1显示二萜合酶簇的染色体区域。图使用Genome Browser工具修改自曲霉基因组数据库[Amaud等人，2006]。 [0167] 实施例2.转录因子AN1599的真菌表达载体的克隆。 [0168] 基因组DNA通过将300-500mg在YES-培养基上生长过夜的FGSC A4菌丝体匀浆而提取。向含有菌丝体的2mL小瓶中加入500μL玻璃珠(酸洗涤的玻璃珠，目录号G8772，Sigma)、500μL 1x TE-缓冲液，pH 7.5和500μL苯酚-氯仿-异戊醇，并在Fast Prep-匀浆器中以速度6匀浆25秒。通过在4℃15000rpm离心5分钟分离水层，并加入650μL苯酚-氯仿-异戊醇。根据DNA的苯酚萃取和乙醇沉淀方案(分子生物学的通用方案)继续从水相纯化DNA。DNA的浓度用Nanodrop(Thermo Scientific)测量。 [0169] AN1599(SEQ ID NO：1)的可读框(ORF)使用43ng自构巢曲霉FGSC A4提取的基因组DNA作为模板用PCR扩增。在50μL总体积中正义和反义引物的引物浓度均为300nM。PCR根据制造商的方案用扩增高保真PCR系统(Expand High Fidelity PCR System)(目录号11，732，650，001，Roche)进行。构巢曲霉AN1599的PCR中使用的引物为SEQ ID NO： 2和SEQ ID NO：3。寡核苷酸以0.025级(scale)合成并通过在Sigma-Aldrich上脱盐纯化。 [0170] AN1599的扩增在热循环仪中用下列参数进行：95℃5分钟，1个循环；94℃15秒，68℃30秒和72℃2分钟，30个循环；72℃7分钟，1个循环，并在+4℃冷却。片段在琼脂糖凝胶上检验，并根据制造商的方案克隆入pCR 2.1 TOPO-载体(目录号K4510-20，TOPO TA 试剂盒(含有pCR 2.1 TOPO-载体)，Invitrogen)。全长的基因组AN1599使 用SpeI(目录号R0133S，New England Biolabs，Inc.)从pCR2.1 TOPO-载体消化，并将片段克隆入pKB1-载体的SpeI位点。证实了AN1599 ORF在pKB1中的定向。 [0171] pKB1-载体通过将PCR-扩增的草铵膦抗性基因bar加入修饰的pAN52-1NotI-载体(Kuorelahti等人)的NotI位点而构建。bar-片段已经从pTJK1(Jones等人)PCR扩增并在片段的两端加入NotI位点。片段在bar-抗性基因的上游包含构巢曲霉trpC启动子。转化前证实pKB1中的构建体AN1599的序列(SEQ ID NO：4)。AN1599的表达载体的示意图见图2。该载体用于随机整合转化。 [0172] 实施例3.AN1599转化体菌株的产生。 [0173] 将构巢曲霉菌株FGSC A4 Glasgow野生型(veA+)(Fungal Genetics Stock Center，School of Biological Sciences，University of Missouri，Kansas City，5007 Rockhill Road，Kansas City，MO 64110，USA)的分生孢子接种在YES-培养基[每升dH2OTM含20g Bacto 酵母提取物(目录号212750，Becton，Dickinson and Company)、40g蔗糖TM (Calbiochem目录号573113)和30g Difco 明胶(目录号214340，Becton，Dickinson and Company)]并在+24℃在摇瓶中250rpm生长过夜。将FGSC A772(galD5；pyrG89；acrA1； chaA1)在添加有10mM尿嘧啶和10mM尿苷的YES-培养基中在+37℃在摇瓶中250rpm生长过夜。构巢曲霉FGSC A4和A772菌丝体通过无菌Miracloth过滤，并用+37℃dH2O和室温柠檬酸盐缓冲液[0.8M KCl，0.05M柠檬酸钠，pH 5.8]漂洗。过滤的FGSC A4菌丝体重悬在100mL添加1mM二硫苏糖醇的室温柠檬酸盐缓冲液中，并加入50mL 3％酶-溶液[1.5g来自哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的水解酶，目录号L1412，Sigma/50mL柠檬酸盐缓冲液]。在+30℃于100rpm振摇达2.5小时进行原生质体化，酶处理期间在50分钟和1.5小时的时间点时在显微镜下监测原生质体形成。悬浮液在冰上冷却10分钟，然后通过无菌Miracloth过滤至无菌瓶中，并将原生质体悬浮液转移至50mL锥形管中。原生质体在桌面离心机中于+4℃1500xg离心5分钟，弃去上清液。沉淀的原生质体用冷GTC-缓冲液[1M葡萄糖，50mM CaCl2，10mM Tris-HCl，pH 5.8]洗涤，在桌面离心机中于+4℃1500xg离心5分钟，并重悬在600μL GTC中。加入600μL 40％甘油，并将原生质体-80℃保存直至转化。 按照同样方式制备来自FGSC A772菌丝体的原生质体，但使用1mg/mL Caylase C4(目录号Case C4-10，Cayla)作为原生质体化的酶，不用二硫苏糖醇。将原生质体重悬于[1.2M山梨醇，10mM CaCl2，10mM Tris-HCl，pH 7.5]并加入50uL PEG溶液[25％PEG6000，50mM，10mM Tris-HCl，pH 7.5]到每200uL原生质体中。将原生质体-80℃保存直至转化。 [0174] 用于FGSC A4转化的选择平板用改良的基本培养基(MM)(Kaminskyj)制备。1升MMTM添加有1mL Triton x-100(目录号93418，Fluka Analytical)、18g Difco Agar Noble(目录号214230，Becton，Dickinson and Company)和200μg/mL的草铵膦(目录号45520，草铵膦， Sigma-Aldrich)。高压灭菌后将草铵膦加入冷却的溶液中。转化中 使用的顶层琼脂在添加2％琼脂和200μg/mL草铵膦的基本培养基中在没有Triton x-100情况下制备。选择MM-平板也用于随后转化体的选择。 [0175] 用TrMM[1.5％KH2PO4，0.4％NH4SO4，2％葡萄糖，1M山梨醇，微量元素，1.8％agar noble]制备平板用于A772转化。 [0176] 将FGSC A4原生质体悬浮液在冰上融化，并将400μL悬浮液转移至15mL管中。用2mL冷GTC洗去甘油，并将原生质体悬浮在180μL冷GTC中。20μg表达质粒用PciI(目录号R0655S，New England Biolabs Inc.)在+37℃线性化1.5小时。加入dH2O直至100μL、 10μL 3M NaAc(醋酸钠)，pH 4.8和275μL 94％EtOH后，将线性化的DNA在-80℃沉淀 15分钟。沉淀的DNA通过在+4℃在15000rpm离心5分钟收集，用70％EtOH洗涤，并重悬在20μL GTC中。将DNA加入原生质体，并通过轻敲管混合。将50μL PEG-溶液[25％PEG6000，50mM CaCl2，10mM Tris-HCl，pH 7.5]与原生质体和DNA混合，并将管在冰上孵育 20分钟。加入2mL PEG-溶液，并将转化溶液转移至15mL小瓶中。将小瓶在室温孵育5分钟，加入4mL RT GTC，通过将管颠倒而混合。6mL+55℃顶层琼脂中补充有1.2mg草铵膦并将其加至6mL转化混合物中。通过颠倒混合小瓶，并将含有转化的原生质体的顶层琼脂倒在选择性基本培养基(MM)-平板上。 [0177] 将FGSC A772原生质体在冰上融化。用于转化的DNA用引物SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91并使用SEQ ID NO：4为模板经PCR扩增。PCR扩增的DNA用DpnI处理并用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化或用乙醇沉淀。将5μg DNA与7μL 100mM亚精胺混合并在室温下孵育5-10分钟。加入DNA-亚精胺混合物并混合到125μL原生质体/PEG-溶液中以达到亚精胺终浓度为5mM。将混合物在冰上孵育30分钟。加入1mL PEG溶液并混合并将原生质体在室温下孵育20分钟。加入10mL融化+55℃TrMM顶层琼脂[1.5％KH2PO4，0.4％NH4SO4，2％葡萄糖，1M山梨醇，微量元素，3％agar noble]，补充草铵膦至在终体积30mL中达终浓度400μg/mL，并将原生质体铺在TrMM板上。 [0178] 用于FGSC A4的平板在+30℃孵育，并将用于FGSC A772的平板在+37℃孵育，直到转化菌落可见。将来自转化平板的菌落挑至选择MM-平板上，稀释至单核化的菌落，用PCR从所选克隆的基因组验证表达构建体的插入。用于检验表达盒的正义引物为SEQ ID NO：5，基因特异性的反义引物对于构巢曲霉AN1599为SEQ ID NO：6。经PCR证实的阳性克隆TM 在马铃薯葡萄糖平板[每升dH2O中含37g Difco 马铃薯葡萄糖琼脂]上生长直至收集孢子。转化体真菌的孢子收集至0.8％NaCl、0.025％Tween-20和20％甘油中，并在-80℃保存。 [0179] 实施例4.在FGSC A4背景中的AN1599转化体菌株的表达分析。 [0180] 在构巢曲霉AN1599转化体和FGSC A4中用qPCR定量测定AN1599基因组区域中13个基因的表达，以查看哪些基因响应转录因子的过表达。将AN1599转化体和FGSC A4在YES-培养基中在摇瓶中在+30℃250rpm培养至汇合。通过真空过滤将菌丝体收获到无菌Miracloth(#475855，Calbiochem)，用+37℃dH2O漂洗，并舀取3个批次的100μL各培养物到1.5mL微量离心管中，在液氮中快速冷冻并贮存于-80℃直到RNA提取。 [0181] 从每一转化体培养物中进行3次RNA提取以在具有样品制剂内的统计学变化。RNA从100μL冷冻的菌丝体中提取，所述菌丝体在450μL添加b-巯基乙醇的RLT-缓TM 冲液( Plant Mini Kit，目录号74904，Qiagen)中使用杵和电动混合器(VWR Disposable Pestle，目录号47747-358，Pellet Mixer，目录号47747-370)均质化。样品用QiaShredder柱( Plant Mini Kit，目录号74904，Qiagen)进一步均质化，并且 RNA提取方案按照 Plant mini Kit-方案继续。RNA纯化-方案前在DNA酶消化 RNA后使用RNase-Free DNase Set(目录号79254，Qiagen)从样品中除去基因组DNA。使用Nanodrop(Thermo Scientific)对RNA进行分光光度法定量测定，并且用琼脂糖凝胶电泳检验RNA的质量。 [0182] 按照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(目录号04 897030 001，Roche)的方案用5μg总RNA作为模板进行cDNA的合成。cDNA在-20℃保存直至分析。每个样品用3个重复检测，以查看定量PCR反应设置中的变化。实时定量PCR分析反应使用480SYBR Green I Master mix(目录号04887352001，Roche)的方案设置，并 在 480 Instrument(Roche)中分析。在 480white Multiwell Plate 96(目录号04729692001，Roche)中使用0.5μM浓度的引物制备15μL的反应物。 [0183] AN1588的表达用引物SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8检查，AN1589用引物SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10检查，AN1590用引物SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12检查，AN1591用引物SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14检查，AN1592用引物SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16检查，AN1593用引物SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18检查，AN1594用引物SEQ ID NO： 19和SEQ ID NO：20检查，AN1595用引物SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22检查，AN1596用引物SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24检查，AN1597用引物SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26检查，AN1598用引物SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28检查，AN1599用引物SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30检查，和AN1600用引物SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32检查。β-肌动蛋白的表达用SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34检查。 [0184] PCR参数是：预孵育：以4.4℃/s的变温速率在95℃5分钟；扩增50个循环：95℃10秒，变温速率为4.4℃/s，55℃10秒，变温速率为2.2℃/s，72℃10秒，变温速率为 4.4℃/s；解链曲线：95℃5秒，变温速率为4.4℃/s，65℃1分钟，变温速率为4.4℃/s，然后持续至97℃；40℃冷却10秒，变温速率为1.5℃/s。 [0185] 所有表达值用β-肌动蛋白的表达标准化，并将构巢曲霉AN1599转化体的倍数比与构巢曲霉FGSC A4野生型真菌的倍数比相比较。每个引物组的效率自模板cDNA的连续稀释液计算，表达倍数比使用pfaffl-公式(Pfaffl)定量测定。结果见图3。 [0186] 对AN1599转化体也进行DNA阵列分析，使用通过Nimblegen制造的用户设计的DNA阵列芯片，使用Custom Eukaryotic 12x135K阵列格式。在DNA阵列设计中的10597个转录本的序列来源是：ftp.ensemblensemblgenomes.org/pub/fungi/release4/fasta/aspergillus_nidu lans/cdna/Aspergillus_nidulans.CADRE2.4.cdna.all.fa.gz.。完整基因组的序列来源是：ftp.ensemblgenomes.org/pub/fungi/release-4/embl/aspergillus_nidulans/Aspergillus_nidulans.0.dat.gz.。 [0187] 对于DNA阵列，对FGSC A4和AN1599转化体菌株二者，接种三个50mL的培养物。培养物在添加明胶的YES-培养基中在250rpm振摇培养箱中于+37℃生长过夜。生长期间监测每个培养瓶的pH变化，在pH值5.76-5.94时从培养物中获取用于DNA阵列的样品。该pH范围对应于构巢曲霉的早期对数生长期(数据未给出)。FGSC A4在21.5小时达到对数生长期，AN1599转化体菌株在26小时达到对数生长期。菌丝体通过无菌Miracloth过滤，将三个100μL的湿菌丝体样品从每个菌株的两个单独的培养瓶中舀出至微量离心管中，每个菌株获得总共6个重复，总共12个样品。将菌丝体在液氮中冷冻，总RNA如在实施例 5中所述纯化。RNA品质用Agilent Technologies的Agilent 2100 Bioanalyzer的标准方案评估。通过RocheNimblegen进行cDNA合成、探针杂交、扫描和初步分析。 [0188] DNA阵列数据用DNASTAR的ArrayStar程序分析。使用用Student′s T-检验测量的99％显著性水平计算表达倍数变化。所有倍数变化差异的P值≤0.01。萜烯生物合成基因簇的表达谱在图3中用定量实时PCR的结果描述。DNA阵列结果与簇基因的qPCR数据一致。 [0189] 用定量实时PCR和DNA阵列表达分析鉴定属于推定的二萜次级代谢产物簇的基因。簇内的基因是AN1592(SEQ ID NO：35)、AN1593(SEQ ID NO：36)、AN1594(SEQ ID NO：37)、AN1595(SEQ ID NO：38)、AN1596(SEQ ID NO：39)、AN1597(SEQ ID NO：40)、AN1598(SEQ ID NO：41)、AN1599(SEQ ID NO：1)和推定的AN1591(SEQ ID NO：42)；和任选AN1590和AN1591。包含第一个推定的簇基因AN1591的1499个碱基长的启动子区和最后一个推定的簇基因AN1599的1499个碱基长的终止子区的基因簇的完整基因组序列(SEQ ID NO：43)，是26775个碱基长。 [0190] 此外，使用NCBI BLASTp-程序评价推定的萜烯簇内的基因产物的同源性。 [0191] 表1.显示在BLASTp(蛋白-蛋白BLAST)检索(具有非冗余的蛋白序列(nr)作为数据库)中使用推导的氨基酸序列获得的最接近的匹配。 [0192] [0193] 实施例5.在FGSC A4背景中的AN1599转化体菌株的气相色谱质谱(GC/MS)分析。 [0194] 在2ml添加3％明胶的YES-培养基中接种AN1599转化体和FGSC A4的分生孢子，并在15mL的培养瓶中于+30℃250rpm振摇生长44小时。接种不同量的分生孢子以在培养结束时获得AN1599转化体和FGSC A4野生型对照-样品二者相似的汇合。对具有匹配汇合的培养物进行固相微提取(SPME)-GC/MS分析。 [0195] 将样品转移至气密的SPME-小瓶。用100μm PDMS纤维在+80℃进行提取1小时。提取后，分析物在气相色谱的注射器中于+250℃在5分钟内解除吸附。分析物在25mx0.2mm的Ultra 2毛细管柱(相厚为0.33μm)上分离。温度程序为：+40℃保持1分钟，9℃/min上升至130℃，接着2℃/min上升至+230℃，保持1分钟。MS以电子碰撞模式在70eV操作，扫描范围m/z 40-550。化合物通过使用PAL谱库鉴定。 [0196] 对于AN1599转化体真菌，SPME-气相色谱在35.841分钟的保留时间显示主峰。该峰在FGSC A4对照中不存在(图4)。通过其质谱进一步分析该峰为96％品质的ent-海松-8(14)，15-二烯(图5)。ent-海松-8(14)，15-二烯的化学结构示于以下。 [0197] [0198] ent-海松-8(14)，15-二烯的化学结构。分子式C20 H32，分子量272，46808g/mol，IUPAC名称：(4aS，4bS，7S，10aS)-7-乙烯基-1，1，4a，7-四甲基-3，4，4b，5，6，9，10，10a-八氢-2H-菲和5β，9β，10α，13α-海松-8(14)，15-二烯。 [0199] 用GC/MS也分析了构巢曲霉AN1599转化体和FGSC A4菌株两者的提取物。将培养物在200mL补充3％明胶的YES-培养基中培养至汇合。菌丝体通过无菌Miracloth过滤，包入铝箔中并在液氮中冷冻。菌丝体沉淀在-80℃保存直至用研钵和杵在液氮中均质。将粉状的菌丝体称重，并将2g菌丝体用20mL己烷∶乙酸乙酯(1∶1)在100mL玻璃锥形瓶中室温超声水浴1小时萃取。通过在4℃1500rpm离心样品5分钟分离己烷：乙酸乙酯-提取物的溶剂相。 [0200] 用分裂模式(分裂比率10∶1)将1μl体积的提取物注射入连接质量选择检测器(Mass Selective Detector)的Agilent 6890气相色谱中。分析物在尺寸 25mx0.32mmx0.17μm的HP-1毛细管柱上分离。温度程序在100℃开始，保持0.5分钟，然后以10℃/min的速率上升至最终温度320℃，保持25分钟。载气(He)的流速为1.3mL/min(恒定流速模式)。注射器和MS源的温度分别为260℃和230℃。MS以电子碰撞模式在 70eV用全扫描模式m/z 40-550操作。结果见图6。这些结果与化合物峰A的SPME/GC-MS分析一致。 [0201] 实施例6.γ-萜品烯合酶在酿酒酵母中的克隆和表达。 [0202] 使用 标准 分 子生 物学 方 法，构 建质 粒B1181+CitMTLS61_Sc(图7) 和B1181+CitMTLS61_An(图8)，在介于酿酒酵母PGK1启动子和终止子之间含有来自温州蜜柑的γ-萜品烯合酶编码基因SEQ ID NO：53(GI：49659441，γ-萜品烯合酶)。合成的基因对于得自GenScript(USA)的酿酒酵母SEQ ID NO：54或黑曲霉SEQ ID NO：55进行密码子优化。使用PCR引物SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57(对于酿酒酵母优化的基因)和SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59(对于黑曲霉优化的基因)扩增γ-萜品烯合酶编码基因。得到的片段用BamHI切割并将所得片段连接到介于YEplac195+PGK1PT的PGK1启动子和终止子之间的BglII位点(B1181，图9)。将得到的质粒引入酿酒酵母CEN.PK113-17A菌株，得到菌株H-γ-terpSc和H-γ-terpAn。将质粒B1181引入菌株CEN.PK113-17A，产生对照菌株。用乙酸锂方法进行酵母转化。 [0203] 为了测定γ-萜品烯合酶活性，将酵母菌株在50ml SCD-ura培养基上培养。收集细胞，洗涤并用玻璃珠破碎。在含有200uM GPP，20mM Tris HCl pH 7.8，2mM MgCl2，2mM MnSO4，磷酸酶抑制剂合剂2(Sigma)和细胞提取物的反应混合物中测定γ-萜品烯合酶活性。通过加入底物(GPP)并立即关闭SPME-GC-MS小管开始反应。将小管在30℃孵育1,5小时，随后在室温下孵育大约10小时，然后如实施例5所述进行SPME-GC-MS分析。也测定无底物的同样的样品作为对照。 [0204] 将具有对酿酒酵母密码子优化和对黑曲霉密码子优化的γ-萜品烯合酶编码基因的两种构建体，在酿酒酵母中以活性形式表达。SPME-GC-MS分析显示γ-萜品烯是主要产物(92％)。γ-萜品烯的化学结构示于以下。 [0205] [0206] γ-萜品烯的化学结构。分子量：136.23404[g/mol]。分子式：C10H16。 [0207] 在表达空载体的对照菌株的细胞提取物中或无GPP作为底物的反应物中未见γ-萜品烯。 [0208] 实施例7.在酿酒酵母中克隆HMG-CoA还原酶的编码基因并生产γ-萜品烯。 [0209] 使用标准分子生物学方法，构建质粒B1184+trHMG1(图11)，其含有3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶(截短的酿酒酵母HMG-CoA还原酶SEQ ID NO：89)编码基因，而在酿酒酵母PGK1启动子和终止子之间没有来自酿酒酵母的靶向信号(SEQ ID NO：60)。使用PCR引物SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62自酿酒酵母基因组DNA扩增所述基因。得到的片段用BamHI切割并将所得片段连接到细菌载体pUC19中的BamHI位点。用BamHI自pUC19+trHMG1构建体释放基因片段并将其克隆到介于YEplac181+PGK1PT的PGK1启动子和终止子之间的BglII位点(B1184，图12)。将得到的质粒与实施例7中所述的γ-萜品烯质粒(对于酿酒酵母进行密码子优化的γ-萜品烯合酶)一起引入酿酒酵母CEN.PK113-17A菌株中。对于对照，将分别给予在无尿嘧啶或亮氨酸的情况下生长的能力的空载体B1181和B1184(图12)，转化到CEN.PK113-17A菌株中。 [0210] 将得到的酵母菌株在SCD-ura-leu培养基上培养2天。收获细胞并将其在SPME-GC-MS小管中悬浮到体积500ul 0.9％NaCl中，并加入葡萄糖至浓度为20g/l。盖紧盖子并将小管在30℃孵育，振摇250rpm/min。按照实施例5中所述用SPME-GC-MS测定所形成的产物。 [0211] SPME-GC-MS分析显示在表达γ-萜品烯合酶和HMG-CoA还原酶编码基因的菌株中形成γ-萜品烯，而在表达空载体的对照菌株中未见γ-萜品烯。 [0212] 实施例8.克隆构建体以将构巢曲霉gpdA启动子引入二萜基因簇区域。 [0213] 使用引物SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64，自pKB1克隆载体，经PCR扩增构巢曲霉gpdA启动子。自按照实施例2中用于FGSC A4基因组DNA所述而分离的AN1599转化体菌株基因组DNA，经PCR扩增AN1599的5’侧翼区和启动子交换构建体的3’区(AN1599 ORF)。150ng基因组DNA用作模板。用于5’侧翼PCR的引物是SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66。用于3’区的引物是SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：68。扩增在热循环仪中用以下参数进行：98℃30秒，1个循环；98℃5秒，67℃30秒和72℃45秒，35个循环；72℃7分钟，1个循环，并在+4℃冷却。按照制造商的方案用 High-Fidelity DNA聚合酶(Thermo Scientific)进行PCR。使用引物SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71，从为AN1593设计的敲除盒[Colot等人2006]经PCR扩增具有其自身启动子和终止子的烟曲霉pyrG(seq ID NO：69)。该盒来自Fungal Genetics Stock Center。将对应于gpdA启动子的5’区的345个碱基的同源DNA区克隆到载体中，侧接烟曲霉pyrG基因，用于从最终转化体菌株中移除pyrG。用酵母重组，将片段装配到pRS426酵母/大肠杆菌穿梭载体。质粒gpdA＞AN1599(图13，SEQ ID NO：72)用作模板，用于转化的PCR扩增(在载体中，所需启动子得自构巢曲霉，载体的其余部分得自大肠杆菌、酿酒酵母和烟曲霉)。 [0214] 实施例9.将gpdA启动子片段转化到构巢曲霉A772和A1155中。 [0215] 使用引物SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74在热循环仪中用以下参数进行转化片段的扩增：94℃2分钟，1个循环；94℃15秒，62℃30秒和72℃6分钟，35个循环；72℃7分钟，1个循环，并在+4℃冷却。A772和A1155(pyrG89；pyroA4；nku：bar)真菌菌株在补充有3％明胶、10mM尿嘧啶、10mM尿苷和吡哆醇(对于A1155)的YES培养基中培养。菌株在+37℃培养过夜并按照实施例3中对于A772所述而进行原生质体化。混合5ug DNA并转化到250uL原生质体。将15μL 100mM亚精胺与DNA混合并在室温下孵育5-10分钟。加入DNA-亚精胺混合物并混合到250μL原生质体/PEG溶液，以达到亚精胺终浓度为5mM。将DNA与100mM亚精胺混合，以达到终浓度为5mM的原生质体。将DNA和原生质体在冰上孵育30分钟并加入1ml PEG溶液。将混合物在室温下孵育20分钟并加入含有10mM尿嘧啶、10mM尿苷和吡哆醇(对于A1155)的3％顶层琼脂并将原生质体铺在TrMM板上。将平板在+37孵育直到形成可见菌落。从单个子囊孢子分离各菌落并用PCR检查阳性。通过将转化体铺到含有1.5g/L 5-磷酸乳清酸(5-FOA)、10mM尿嘧啶、10mM尿苷和吡哆醇(对于菌株A1155)的TrMM板上，移除pyrG基因。如实施例4所述用qPCR检查AN1599的过表达和簇基因的激活。如实施例5所述用GC-MS分析证实海松二烯的产生。 [0216] 实施例10.用于将AN1594交换为γ-萜品烯合酶或另一单萜合酶(SEQ ID NO：75)的构建体的克隆。 [0217] 通过GenScript(USA)对来自温州蜜柑的γ-萜品烯合酶进行对于黑曲霉的密码子优化和合成。用合适的引物经PCR扩增所述合酶并将其克隆到含有用于替换AN1594基因座的侧翼区的载体中。将编码乳清苷-5′-磷酸脱羧酶的烟曲霉pyrG基因用于选择在未补充尿嘧啶和尿苷时生长的转化体。将AN15943’侧翼区的同源DNA区克隆到载体中侧接烟曲霉pyrG基因，用于从最终转化体菌株中移除pyrG。最终构建体(图14，SEQ ID NO：75)用作模板，用于转化片段(含有得自温州蜜柑的载体的所需基因)的PCR扩增。 [0218] 实施例11.将γ-萜品烯交换构建体片段转化至构巢曲霉A772和A1155。 [0219] 使用引物SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77在热循环仪中用以下参数进行转化片段的扩增：94℃2分钟，1个循环；94℃15秒，66℃30秒和68℃5分钟，35个循环；68℃7分钟，1个循环，并在+4℃冷却。FGSC A772和A1155(pyrG89；pyroA4；nku：bar)真菌菌株在补充有3％明胶、10mM尿嘧啶、10mM尿苷和吡哆醇(对于A1155)的YES培养基中培养。菌株在+37℃培养过夜并按照实施例3中对于A772所述而进行原生质体化。混合5ug DNA并转化到250uL原生质体。将15μL 100mM亚精胺与DNA混合并在室温下孵育5-10分钟。 加入DNA-亚精胺混合物并混合到250μL原生质体/PEG溶液，以达到亚精胺终浓度为5mM。 将DNA与100mM亚精胺混合，以达到终浓度为5mM的原生质体。将DNA和原生质体在冰上孵育30分钟并加入1ml PEG溶液。将混合物在室温下孵育20分钟并加入含有10mM尿嘧啶、10mM尿苷和吡哆醇(对于A1155)的3％顶层琼脂并将原生质体铺在TrMM板上。将平板在+37孵育直到形成可见菌落。从单个子囊孢子分离各菌落并用PCR检查阳性。通过将转化体铺到含有1.5g/L 5-磷酸乳清酸(5-FOA)、10mM尿嘧啶、10mM尿苷和吡哆醇(对于菌株A1155)的TrMM板上，移除pyrG基因。如实施例5所述用GC-MS分析证实γ-萜品烯的产生。 [0220] 实施例12.用于将AN1592交换为GPP-合酶(SEQ ID NOs：80和81)的构建体的克隆以及表达GPP合酶和额外的γ-萜品烯合酶的构巢曲霉菌株的产生。 [0221] 通过GenScript(USA)对来自挪威云杉的GPP合酶进行对于酿酒酵母的密码子优化和合成。用合适的引物经PCR扩增所述合酶并将其克隆到含有用于替换AN1592基因座(SEQ ID NO：82，其中所需基因得自挪威云杉)的侧翼区的载体中。将编码乳清苷-5′-磷酸脱羧酶的烟曲霉pyrG基因用于选择在未补充尿嘧啶和尿苷时生长的转化体。将AN15923’侧翼区的同源DNA区克隆到载体中侧接烟曲霉pyrG基因，用于从最终转化体菌株中移除pyrG。最终构建体(图15，SEQ ID NO：59)用PmlI消化并转化到亦过表达AN1599转录因子的构巢曲霉原生质体中并转化到表达γ-萜品烯合酶基因的菌株中(描述于实施例 11)。如实施例9和11所述进行转化程序。根据在TrMM板上的生长而选择转化体并通过PCR证实其整合到正确的基因组基因座上。通过将转化体铺到含有1.5g/L 5-磷酸乳清酸(5-FOA)、10mM尿嘧啶、10mM尿苷和吡哆醇(对于菌株A1155)的TrMM板上，移除pyrG基因。 [0222] 实施例13.用于将AN1593交换为改进的/截短的HmG-CoA还原酶的构建体的克隆。 [0223] 用合适的引物经PCR扩增实施例7所述的酿酒酵母截短的HMG1还原酶并将其克隆到含有用于替换AN1593基因座的侧翼区的载体中。将编码乳清苷-5′-磷酸脱羧酶的烟曲霉pyrG基因用于选择在未补充尿嘧啶和尿苷时生长的转化体。将AN1593 3’侧翼区的同源DNA区克隆到载体中侧接烟曲霉pyrG基因，用于从最终转化体菌株中移除pyrG。最终构建体用PmlI消化并转化到亦表达γ-萜品烯合酶基因(描述于实施例11)和或者亦表达GPP合酶(实施例12)的构巢曲霉原生质体中。如实施例9和11所述进行转化程序。根据在TrMM板上的生长而选择转化体并通过PCR证实其整合到正确的基因组基因座上。通过将转化体铺到含有1.5g/L 5-磷酸乳清酸(5-FOA)、10mM尿嘧啶、10mM尿苷和吡哆醇(对于菌株A1155)的TrMM板上，移除pyrG基因。 [0224] 实施例14.用于将AN1594交换为α-法呢烯合酶(SEQ ID NO：79)的构建体的克隆。 [0225] 从GenScript(USA)获得作为合成基因的来自苹果(Malus x domestica)的倍半萜合酶α-法呢烯合酶。用合适的引物经PCR扩增所述合酶并将其克隆到含有用于替换AN1594基因座的侧翼区的载体中。将编码乳清苷-5′-磷酸脱羧酶的烟曲霉pyrG基因用于选择在未补充尿嘧啶和尿苷时生长的转化体。将AN1594 3’侧翼区的同源DNA区克隆到载体中侧接烟曲霉pyrG基因，用于从最终转化体菌株中移除pyrG。最终构建体(图16，SEQ ID NO：78)用作PCR中的模板(具有得自苹果的载体的所需基因)。使用引物SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77在热循环仪中用以下参数进行转化片段的扩增：94℃2分钟，1个循环；94℃15秒，66℃30秒和68℃5分钟，35个循环；68℃7分钟，1个循环，并在+4℃冷却。将片段转化到过表达AN1599和或者也过表达FPP合酶(实施例15，SEQ ID NO：86)的构巢曲霉原生质体中。如实施例9和11所述进行转化程序。根据在TrMM板上的生长而选择转化体并通过PCR证实其整合到正确的基因组基因座上。通过将转化体铺到含有1.5g/L 5-磷酸乳清酸(5-FOA)、10mM尿嘧啶、10mM尿苷和吡哆醇(对于菌株A1155)的TrMM板上，移除pyrG基因。 [0226] 实施例15.用于将AN1592交换为FPP-合酶的构建体的克隆。 [0227] 从GenScript(USA)获得作为合成基因的来自酿酒酵母的FPP合酶。用合适的引物经PCR扩增所述合酶并将其克隆到含有用于替换AN1592基因座(SEQ ID NO：88，具有得自酿酒酵母的载体的所需基因)的侧翼区的载体中。将编码乳清苷-5′-磷酸脱羧酶的烟曲霉pyrG基因用于选择在未补充尿嘧啶和尿苷时生长的转化体。将AN1592 3’侧翼区的同源DNA区克隆到载体中侧接烟曲霉pyrG基因，用于从最终转化体菌株中移除pyrG。最终构建体(图17，SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87)用PmlI消化并转化到也过表达AN1599转录因子的构巢曲霉原生质体中并转化到表达γ-萜品烯合酶基因的菌株中(描述于实施例11)。如实施例9和11所述进行转化程序。根据在TrMM板上的生长而选择转化体并通过PCR证实其整合到正确的基因组基因座上。通过将转化体铺到含有1.5g/L 5-磷酸乳清酸(5-FOA)、10mM尿嘧啶、10mM尿苷和吡哆醇(对于菌株A1155)的TrMM板上，移除pyrG基因。 [0228] 实施例16.用于将AN1594交换为二萜合酶紫杉二烯合酶(SEQ ID NO：83和84)的构建体的克隆。 [0229] 从GenScript(USA)获得作为合成基因的来自中国红豆杉的二萜合酶紫杉二烯合酶。用合适的引物经PCR扩增所述合酶并将其克隆到含有用于替换AN1594基因座的侧翼区的载体中。将编码乳清苷-5′-磷酸脱羧酶的烟曲霉pyrG基因用于选择在未补充尿嘧啶和尿苷时生长的转化体。将AN1594 3’侧翼区的同源DNA区克隆到载体中侧接烟曲霉pyrG基因，用于从最终转化体菌株中移除pyrG。最终构建体(图18，SEQ ID NO：85，具有得自中国红豆杉的载体的所需基因)用作PCR中的模板。使用引物SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77在热循环仪中用以下参数进行转化片段的扩增：94℃2分钟，1个循环；94℃15秒，66℃30秒和68℃5分钟，35个循环；68℃7分钟，1个循环，并在+4℃冷却。将片段转化到过表达AN1599和或者也过表达FPP合酶(实施例15)的构巢曲霉原生质体中。如实施例9和11所述进行转化程序。根据在TrMM板上的生长而选择转化体并通过PCR证实其整合到正确的基因组基因座上。通过将转化体铺到含有1.5g/L 5-磷酸乳清酸(5-FOA)、10mM尿嘧啶、10mM尿苷和吡哆醇(对于菌株A1155)的TrMM板上，移除pyrG基因。 [0230] 实施例17.用于将AN1594交换为赤霉素合酶(SEQ ID NO：94)的构建体的克隆。 [0231] 用引物SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：93，从藤仓镰刀菌(藤仓赤霉)SEQ ID NO：99的cDNA经PCR扩增二萜合酶赤霉素合酶(GI：6009475，SEQ ID NO：99(DNA)，SEQ ID NO：100(蛋白))并将其克隆到含有用于替换AN1594基因座的侧翼区的载体中。将编码乳清苷-5′-磷酸脱羧酶的烟曲霉pyrG基因用于选择在未补充尿嘧啶和尿苷时生长的转化体。 将AN1594 3’侧翼区的同源DNA区克隆到载体中侧接烟曲霉pyrG基因，用于从最终转化体菌株中移除pyrG。最终构建体(图20，SEQ ID NO：94，具有得自藤仓镰刀菌的载体的所需基因)用作PCR中的模板。两个PCR片段进行转化。5’片段用SEQ ID NO：95和SEQ ID NO： 96扩增，3’片段用SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：98扩增。金微粒上包被有经PCR扩增的DNA片段并且使用本领域已知的方法通过生物射弹递送(biolistic particle delivery)转化过表达AN1599(A772oe：AN1599)的构巢曲霉A772的分生孢子。根据在TrMM板上的生长而选择转化体。 [0232] 实施例18.用于簇基因的缺失盒的克隆。 [0233] 使用FGSC A4基因组DNA作为模板，通过扩增来自有待缺失的基因的5’区和3’区的大约1,500碱基对片段，克隆用于簇基因的缺失盒。将侧翼克隆到具有编码乳清苷-5′-磷酸的烟曲霉pyrG基因的载体中。将对应于有待缺失的簇基因的3’侧翼区的大约500个碱基的同源DNA区克隆到载体中侧接烟曲霉pyrG基因，用于从最终转化体菌株中移除pyrG。最终构建体(图19)用作转化片段的PCR扩增的模板，或将片段用PmlI切去。 将片段转化到过表达AN1599和或者也过表达其它修饰的基因的构巢曲霉原生质体中。如实施例9和11所述进行转化程序。根据在TrMM板上的生长而选择转化体并通过PCR证实其整合到正确的基因组基因座上。通过将转化体铺到含有1.5g/L 5-磷酸乳清酸(5-FOA)、 10mM尿嘧啶、10mM尿苷和吡哆醇(对于菌株A1155)的TrMM板上，移除pyrG基因。 [0234] 实施例19.γ-萜品烯的生产 [0235] 如比较实施例1中所述，用SPME/GC-MS分析和用GC/MS分析得自实施例11、12或13的构巢曲霉转化体。对于GC/MS分析，将培养物在200mL添加3％明胶的YES-培养基中培养至汇合。菌丝体通过无菌Miracloth过滤，包入铝箔中并在液氮中冷冻。菌丝体沉淀在-80℃保存直至用研钵和杵在液氮中均质。将粉状的菌丝体称重，并将2g菌丝体用20mL己烷∶乙酸乙酯(1∶1)在100mL玻璃锥形瓶中室温超声水浴1小时萃取。通过在 4℃1500rpm离心样品5分钟分离己烷：乙酸乙酯-提取物的溶剂相。 [0236] 用分裂模式(分裂比率10∶1)将1μl体积的提取物注射入连接质量选择检测器(Mass Selective Detector)的Agilent 6890气相色谱中。分析物在尺寸 25mx0.32mmx0.17μm的HP-1毛细管柱上分离。温度程序在100℃开始，保持0.5分钟，然后以10℃/min的速率上升至最终温度320℃，保持25分钟。载气(He)的流速为1.3mL/min(恒定流速模式)。注射器和MS源的温度分别为260℃和230℃。MS以电子碰撞模式在 70eV用全扫描模式m/z 40-550操作。 [0237] 实施例20.α-法呢烯的生产 [0238] 如比较实施例1中所述，用GC/MS分析得自实施例16的构巢曲霉转化体。对于GC/MS分析，将培养物在200mL添加3％明胶的YES-培养基中培养至汇合。菌丝体通过无菌Miracloth过滤，包入铝箔中并在液氮中冷冻。菌丝体沉淀在-80℃保存直至用研钵和杵在液氮中均质。将粉状的菌丝体称重，并将2g菌丝体用20mL己烷∶乙酸乙酯(1∶1)在100mL玻璃锥形瓶中室温超声水浴1小时萃取。通过在4℃1500rpm离心样品5分钟分离己烷∶乙酸乙酯-提取物的溶剂相。 [0239] 用分裂模式(分裂比率10∶1)将1μl体积的提取物注射入连接质量选择检测器(Mass Selective Detector)的Agilent 6890气相色谱中。分析物在尺寸 25mx0.32mmx0.17μm的HP-1毛细管柱上分离。温度程序在100℃开始，保持0.5分钟，然后以10℃/min的速率上升至最终温度320℃，保持25分钟。载气(He)的流速为1.3mL/min(恒定流速模式)。注射器和MS源的温度分别为260℃和230℃。MS以电子碰撞模式在 70eV用全扫描模式m/z 40-550操作。 [0240] α-法呢烯的化学结构示于以下。 [0241] [0242] α-法呢烯的化学结构。分子量：204.35106[g/mol] [0243] 分子式：C15H24。 [0244] 实施例21.紫杉二烯的生产 [0245] 如比较实施例1中所述，用GC/MS分析得自实施例14或15的构巢曲霉转化体。对于GC/MS分析，将培养物在200mL添加3％明胶的YES-培养基中培养至汇合。菌丝体通过无菌Miracloth过滤，包入铝箔中并在液氮中冷冻。菌丝体沉淀在-80℃保存直至用研钵和杵在液氮中均质。将粉状的菌丝体称重，并将2g菌丝体用20mL己烷∶乙酸乙酯(1∶1)在100mL玻璃锥形瓶中室温超声水浴1小时萃取。通过在4℃1500rpm离心样品5分钟分离己烷∶乙酸乙酯-提取物的溶剂相。 [0246] 用分裂模式(分裂比率10∶1)将1μl体积的提取物注射入连接质量选择检测器(Mass Selective Detector)的Agilent 6890气相色谱中。分析物在尺寸 25mx0.32mmx0.17μm的HP-1毛细管柱上分离。温度程序在100℃开始，保持0.5分钟，然后以10℃/min的速率上升至最终温度320℃，保持25分钟。载气(He)的流速为1.3mL/min(恒定流速模式)。注射器和MS源的温度分别为260℃和230℃。MS以电子碰撞模式在 70eV用全扫描模式m/z 40-550操作。 [0247] 紫杉-4(5)，11(12)-二烯的化学结构示于以下。 [0248] [0249] 紫杉-4(5)，11(12)-二烯的化学结构。分子量：272.4681[g/mol] [0250] 分子式：C20H32。 [0251] 实施例22.用修饰的萜烯簇生产贝壳杉-16-烯(贝壳杉烯)。 [0252] 将得自实施例3的在A772背景(A772 oe；AN1599)中的构巢曲霉菌株A772和AN1599转化体菌株用作对照菌株。将得自实施例17的构巢曲霉转化体和对照菌株接种在2mL添加3％明胶的YES培养基中并在15mL的培养瓶中于+30℃250rpm振摇生长44小 时，然后用SPME-GC/MS分析。挥发性和半挥发性化合物的提取用预先条件化的(250℃， 30min)100μm PDMS纤维(Sulpelco，USA)在+80℃进行45分钟。提取后，分析物在气相色谱(Agilent 7890A GC System；Palo Alto，CA，USA)的不分流注射器(流速14.9mL/min)连同MS检测器(带有Triple-Axis检测器的Agilent 5975C inert MSD；Palo Alto，CA，USA)和SPME自动进样器(Gerstel MPS；Gerstel GmbH & Co.KG，Germany)中于+250℃在 5分钟内解除吸附。 [0253] 分析物在15mx0.25mm的Rtx-5MS毛细管柱(相厚为0.25μm)(Restek，PA，USA)上分离。温度程序开始是在50℃保持1分钟，接着10℃/min上升至最终温度270℃，此时保温7分钟。MSD以电子碰撞模式在70eV操作，全扫描范围m/z 40-550。离子源温度为230℃，界面为240℃。化合物通过比较Palisade Complete 600K Mass Spectral Library(Palisade Mass Spectrometry，USA)上的质谱而鉴定。 [0254] 在对照菌株A772中未见主要产物峰，而过表达AN1599的菌株的主要产物峰是ent-海松-8(14)，15-二烯。当将合酶基因改变为赤霉素合酶时，主要产物峰是贝壳杉-16-烯，它是藤仓镰刀菌古巴基合酶/贝壳杉烯合酶Gfcps/KS基因的特定产物。 [0255] 贝壳杉-16-烯的化学结构示于以下。 [0256] [0257] 贝壳杉-16-烯(贝壳杉烯)的化学结构。分子量：272.46808[g/mol] [0258] 分子式：C20H32。 [0259] 实施例23.用赤霉素合酶的随机插入和AN1594启动子生产贝壳杉-16-烯(贝壳杉烯)。 [0260] 将得自实施例3的在A772背景(A772 oe：AN1599)中的构巢曲霉菌株A772和AN1599转化体菌株用作对照菌株。将得自实施例17的构巢曲霉随机整合转化体和对照菌株接种在2mL添加3％明胶的YES培养基中并在15mL的培养瓶中于+30℃250rpm振摇生长44小时，然后用SPME-GC/MS分析。挥发性和半挥发性化合物的提取用预先条件化的(250℃，30min)100μm PDMS纤维(Sulpelco，USA)在+80℃进行45分钟。提取后，分析物在气相色谱(Agilent 7890A GC System；Palo Alto，CA，USA)的不分流注射器(流速14.9mL/min)连同MS检测器(带有Triple-Axis检测器的Agilent 5975C inert MSD；Palo Alto，CA，USA)和SPME自动进样器(Gerstel MPS；Gerstel GmbH & Co.KG，Germany)中于+250℃在5分钟内解除吸附。 [0261] 分析物在15mx0.25mm的Rtx-5MS毛细管柱(相厚为0.25μm)(Restek，PA，USA)上分离。温度程序开始是在50℃保持1分钟，接着10℃/min上升至最终温度270℃，此时保温7分钟。MSD以电子碰撞模式在70eV操作，全扫描范围m/z 40-550。离子源温度为230℃，界面为240℃。化合物通过比较Palisade Complete 600K Mass Spectral Library(Palisade Mass Spectrometry，USA)上的质谱而鉴定。 [0262] 在对照菌株A772中未见主要产物峰，而过表达AN1599的菌株的主要产物峰是ent-海松-8(14)，15-二烯。当将赤霉素合酶基因随机整合到基因组中，但在AN1594启动子调控之下时，可见两个主要产物峰。所述峰是ent-海松-8(14)，15-二烯(其是海松二烯合酶(AN1594)的产物)和贝壳杉-16-烯(其是藤仓镰刀菌古巴基合酶/贝壳杉烯合酶Gfcps/KS基因的特定产物)。海松二烯合酶基因缺失所致的二萜基因簇的修饰导致特异性贝壳杉烯的产生。 [0263] 实施例24.海松二烯合酶(AN1594)缺失载体(SEQ ID NO：101)的克隆。 [0264] 将来自实施例10的γ-萜品烯交换载体(SEQ ID NO：75)用NotI消化并在琼脂糖凝胶电泳和DNA提取后移除γ-萜品烯合酶片段。将剩余载体用T4 DNA连接酶重新连接并用作模板，用于缺失片段PCR。用SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：98，用最终构建体(图23，SEQ ID NO：101)作为模板，将转化片段经PCR扩增，DpnI处理和乙醇沉淀。 [0265] 实施例25.从A772 oe：AN1599；Gfcps/KS菌株中删除AN1594海松二烯合酶。 [0266] 用5μg经PCR扩增的DNA进行转化。金微载体上包被有该DNA并且使用本领域已知的方法通过生物射弹递送进行转化。海松二烯基因簇的这一修饰以及在AN1594启动子调控下的随机整合的赤霉素合酶导致特异性贝壳杉-16-烯的生产。 [0267] 参考文献： [0268] Altschul等人(1997)，Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs.(空位BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白数据库搜索程序)，Nucleic Acids Res.，Sep1；25(17)：3389-402. 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