构成有机体生物膜的膜脂的状态随着外界温度下降而由液晶态变为 固态。这个改变称为“相分离”。相分离涉及生物膜特性的变化。据信 膜脂在固态时丧失物质透性选择力，这样使生物膜不能发挥其基本功 能，从而使细胞受到损伤(低温损伤)。
膜脂相转变的温度——在该温度下膜脂由液晶态变为固态，主要取 决于与脂相连的脂肪酸酰基的不饱和程序(碳链中双键的数目)。与之 相连的二个脂肪酸酰基团都是饱和脂肪酸残基的脂类分子其相转换温 度高于室温，而与之相连的脂肪酸酰基团至少带有一个双键的脂类分子 的相转换温度则低于0℃(Santaren，J.F.等，Biochim.Biophys. Acta，687：231，1982)。
通常一个脂肪酸中的双键位置从羧基末端碳原子数至出现该双键处 碳原子并以数标示在符号Δ之后。总的双键数目置于总碳原子数之后并 用冒号分开。例如亚麻酸记为18：2Δ9，12，可用相列结构式代表：
      CH3(CH2)4CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7COOH在某些情况下，双键位置从脂肪酸甲基端碳原子数至有双键碳原子处并 以数标示在符号ω之后。
在高等植物的膜脂中只有磷脂酰甘油(PG)含有相对大量的饱和分 子，这就强烈暗示PG的相转换导致植物低温损伤(Murata，N.等，Plant Cell Physiol.23：1071，1982；Roughan P.G.，Plant Physiol.，77：740，1985)，而PG的分子组成则取决于存在于叶绿 体中的甘油-3-磷酸酰基转移酶(以下称为ATase)的特异性底物。 (Frentzen，M.等，Eur.J.Biochem.，129：629，1983；Murata， N.，Plant Cell Physiol.，24：81，1983；Frentzen，M.等， Plant Cell Physial.，28：1195，1988)。
Nishizawa等实验显示，把从一种抗冻植物拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)中获得的ATase基因引入烟草并表达，PG中饱和类分子含 量下降，因而赋予植株较其野生型具有更高的抗寒冻性 (PCT/JP92/00024，1992)。然而植物本身也有ATase，即使在外源ATase 大量表达时仍不可避免地与内源ATase产生竞争，从而使得这些外源 ATase的效应被减弱。例如，烟草转化体表达拟南芥菜ATase最多的一 个克隆的叶中PG的饱和分子含量为28％，这比烟草野生型低8％，但 却比拟南芥菜野生型高8％(PCT/JP92/00024，1992)。
在质体中产生的多数酰基-ACP通常包括16∶0-ACP及18∶1 -ACP，据信它们的比例相等。在某些组织中，16∶0-ACP及18∶0 -ACP的比例高于18∶1-ACP的比例(Toriyama，S.等，Plant Cell Physial.，29：615，1988)。在这些组织中，很难通过运用外源ATase 酶使饱和类分子品种含量下降至满意的水平。
光合兰细菌(蓝绿藻)的膜脂组成与构成高等植物叶绿体膜系统的 脂类相似(Murata，N.等，in the“The Biochemistry of Plants”，Academic Press，1987)。在蓝绿藻中，与膜脂相连的脂 肪酸的不饱和程度是由具有使这些脂相连脂肪酸去饱和能力的酶类所 控制。目前已知仅能向脂相连的脂肪酸中引入一个双键的构巢组囊藻 (Anacystis nidulans)(聚球藻(Synechococcus)PCC 7942)对 寒冻敏感(Ono，T.等，Plant Physiol.，67：179，1981)，而至 少能引入两个双键的集胞藻(Synechocystis)PCC 6803则对寒冻有抗 性(Wada，H.等，Plant Cell Physiol.，30：971，1898)。
蓝绿藻中所有脂肪酸的去饱和酶均以脂类为其底物通过与底物反 应将双键引入到脂相连的脂肪酸中。因此，由16∶0/16∶0-及18∶ 0/16∶0等饱和分子品种组成的蓝绿藻膜脂中的PG、SQDG、MGDG、DGDG 之类脂肪酸分子中可以被引入顺式双键(Murata，N.等，在“The Biochemistry of Plants”，Academic Press，1987)。在这方面， 高等植物与蓝绿藻有着很大的差别，它们所具有的脂肪酸去饱和酶能在 硬脂酰-ACP(18∶0-ACP)的Δ9位置引入双键却不能在合成的由16∶ 0/16∶0(及少量的18∶0/16∶0-)等饱和分子品种组成的PG或 SQDG中引入双键。
目前已知在构巢组囊藻(Anacystis nidulans)中引入并表达集 胞藻属(Synechocystis)PCC 6803的Δ12去饱和酶基因能产生非构巢 组囊藻内源存在的16∶2Δ9，12，从而赋予对寒冻敏感的构巢组囊藻 (Anacystis nidulans)以对寒冻的抗性(Wada，H.等，Nature，347： 200，1990)。
迄今由蓝绿藻中所获得的去饱和酶基因有Δ6去饱和酶(Reddy，A. S.等，Plant Mol.Biol.，27：293，1993)及Δ12去饱和酶(Wada， H.等，Mature，347：200，1990)基因。然而，Δ6和Δ12去饱和酶 不能分别地在脂肪酸Δ6和Δ12位置上去饱和，除非在其Δ9位置上引 入一个双键。而且，只有Δ9及Δ12位置上脂肪酸去饱和之后，Δ15 去饱和酶才能使该脂肪酸在Δ15位上发生去饱和。因此，一旦将能在Δ 9位置使脂肪酸去饱和的酶类基因引入到高等植物并使之表达，它们应 该能够降低高等植物中饱和分子品种的含量从而授予高等植物抗寒冻 性。然而能在Δ9位使饱和脂肪酸去饱和的酶类基因至今还没有得到。
所以，本发明的目的之一是提供在Δ9位置具有饱和脂肪酸去饱和 化能力的酶类基因及含有上述基因部分的多核苷酸。
另一目的即是提供含有在饱和脂肪酸Δ9位置上具有去饱和能力的 酶类基因的载体或含有该基因部分的多核苷酸的载体。
本发明进一步的目的是提供由Δ9位去饱和酶基因或含有该基因部 分的多核苷酸转化的植物细胞及植株。

发明者们由于通过不同的研究实现了上述目标，他们成功地从组囊 藻(Anacystis)属的蓝绿藻基因组DNA中克隆了编码Δ9去饱和酶基 因，获得了整合该基因的载体DNA，并以这种载体DNA转化了植物细胞， 而且还使细胞分化以再生植株，这样赋予植物以抗寒冻性。本发明是基 于以下发现而实现的。本发明主要内容如下： (1)基因，其编码的蛋白质具有在Δ9位置使脂相连脂肪酸去饱和化的 活性。 (2)在(1)中所述基因或含有部分该基因的多核苷酸，其中蛋白质具 有在Δ9位置使脂相连的脂肪酸去饱和活性，含有基本上如SEQ ID No. 4中所示的氨基酸序列。 (3)在(1)所述基因或含有部分该基因的多核苷酸，其中编码具有能 在Δ9位置使脂相连的脂肪酸去饱和化的蛋白质的基因是含有SEQ ID No.3所示碱基序列的DNA链。 (4)含有按照(1)-(3)项中任何一项所述的基因或包括部分该基 因的多核苷酸的载体。 (5)用(1)-(3)中任何一项所述的基因或包括部分该基因的多核 苷酸转化的植物细胞。 (6)一种通过(5)中所述植物细胞分化而再生植株的创制方法。 (7)用(1)-(3)中任何一项所说的基因或包括其部分基因的多核 苷酸转化的植物。
附图简述
图1显示des 9 var片段编码氨基酸序列与小鼠硬脂酰-辅酶A 去饱和酶(NSCD2)的氨基酸序列的比较。在图1中，：表明两个序列 中有相同的氨基酸；说明两个序列中有着性质相似的氨基酸；X则表 示有高度同源性。
图2是一个以des 9 var片段作探针的构巢组囊藻基因组DNA在 Southern分析中的放射自显影的电泳图。
图3表示插入的DNA片段：λ5，λ15及p15X之间的关系。粗箭 头表示蛋白质的编码位置及方向。细箭头表示测序位置及方向。
图4显示des 9 nid片段编码氨基酸序列与小鼠硬脂酰-辅酶A 去饱和酶(MSCD2)氨基酸序列的比较。比较方式与图1相同。
图5中两幅照片显示了在转化烟草植株低温处理后对其生物学形态 的影响。左图表示为用去饱和酶基因转化烟草低温处理后结果，右图表 示的是用pBI 121转化烟草低温处理后结果。
实现本发明的优选实施方案
在背景说明中已提及本发明的Δ9去饱和酶是在蓝绿藻中内源存在 的一种酶。Δ9去饱和酶的化学结构与小鼠(Kaestner，K.H.等，J. Biol.Chem.，264：14755，1989)、大鼠(Mihora，K.，J.Biochem.， 108：1022，1990)及酵母(Stukey，J.E.等，J.Biol.Chem.，265： 20144，1990)等的硬脂酰-辅酶A去饱和酶有局部相似之处，但作整 体看则差别很大。而且它的化学结构与已知的能在Δ6、Δ12对脂相连 脂肪酸有去饱和能力的蓝绿藻酶类及有同样功能的在ω3位去饱和的高 等植物酶类(Yadav，N.S.等，Plant physiol.，103：467，1993) 相比则全然不同。在这里本发明的基因是从天然原料中得到，而蓝绿藻 可作为原材料。所用蓝绿藻包括组囊藻属，集胞藻属及鱼腥藻 (Anabaena)属等但并不仅限于这几属。为使高等植物中饱和分子去饱 和化，基于以下原因倾向使用组囊藻型Δ9去饱和酶(Murata，N.等， Plant Cell Physiol.，33：933，1992，属于组囊藻属的I型蓝 绿藻，而不使用鱼腥藻及集胞藻型去饱和酶。
集胞藻PCC 6803及多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)中几乎 所有的膜脂上sn-1及sn-2位置均分别地被18碳原子(C18)及16 碳原子(C16)的脂肪酸所占有(Sato，N.等，Biochim.Biophys.Acto， 710：279，1982；Wada，H.等，Plant Cell Physiol.，30：971， 1989)。另一方面，构巢组囊藻中几乎所有膜脂的sn-1及sn-2位置 都由C16所占有(Bishop，D.G.等，Plant Cell Physiol.，27： 1593，1986)。因此，可以相信鱼腥藻及集胞藻中Δ9去饱和酶具有以 18∶0/16∶0分子品种为底物使sn-1位置上18∶0。去饱和成为 18∶1Δ9的反应活性，而组囊藻中Δ9去饱和酶则具有以16∶0/16∶ 0分子品种为底物使sn-1位置上16∶0去饱和成为16∶1Δ9的反 应活性。考虑到高等植物含有大量的16∶0/16∶0类饱和分子品种， 那么以去饱和高等植物中饱和分子品种为目的则选取组囊藻 (Anacystis)型Δ9去饱和酶比选取鱼腥藻及集胞藻型Δ9去饱和酶更 为合适。
以下实例将显示本发明的基因包括编码含有基本上如SEQ ID No： 4中所示的氨基酸序列的Δ9去饱和酶基因以及除简并密码子以外的能 编码同一多肽片段的简并异构体。本发明中基因主要是用DNA链形式。 基本上在SEQ ID No：4展示的氨基酸序列不仅包括在SEQ ID No： 4中所展示的氨基酸序列，而且也包括上述序列经过部分删除、替换及 增补等修饰之后所产生的而仍保留有Δ9去饱和酶活性的序列。
本发明的基因可从前述的蓝绿藻细胞用已知任何常规技术来制 备。
制备本发明基因的过程简述如下：培养蓝绿藻细胞，收集细胞，用 常规的已知技术如乙醇沉淀或其他方法制备基因组DNA，以基因组DNA 为基础构建基因文库，从文库中选择目的基因的克隆并使之扩增。
用于构建基因文库的载体包括任何常规载体特例的包括噬菌体例 如λDASH II(Stratagene)，噬菌体柯斯质粒如PWE 15，(Stratagene)， 噬菌体质粒如pBluesoipt II(Stratagene)等。本发明的基因可用针 对某一载体特定类别的常规方法引入到这些载体中。
本发明所引入的基因的克隆即从如此制备的基因文库中筛选获 得。
筛选克隆的方法包括任何已知的常规方法，如噬斑杂交和菌落杂 交，运用抗体的免疫学筛选法以及运用核苷酸探针的噬菌斑杂交法及菌 落杂交法。核苷酸探针选择法的优化准则是所选用探针的部分碱基序列 经估测应与本发明基因序列相似(例如，图1中所示编码MSCD2中260 -295处氨基酸序列的碱基序列)。
本发明在选得的克隆中基因的碱基序列可用常规的Maxam- Gilbert方法(Maxam-Gilbert，Methods Enzymol.，65：499， 1980)及应用M13噬菌体的双脱氧链终止法(Massing，J.等，Gene，19： 269，1982)进行确定和证实。
Δ9去饱和酶的实际表达可以用例如Wada等(J.Bacteriol.，175： 6056，1993)法加以证实。
本发明基因一旦测序，就可以用商业上能得到的DNA合成仪采用任 何一种已知的常规方法例如亚磷酸酯方法进行合成。
具有Δ9去饱和酶活性的本发明基因或含有基因部分片段的多核苷 酸可从筛选所得的克隆中分离，整合进到欲引入宿主植物的载体，把该 载体引入植物细胞并在植株中表达Δ9去饱和酶，从而赋予植株抗寒冻 性。
引入基因的植物种类无特别限制。
为引入基因所构建的载体应适合于Δ9去饱和酶基因在植物中稳定 地表达。更准确地说，启动子、编码翻译调控区的DNA序列、编码转移 至叶绿体处肽的DNA序列、具备Δ9去饱和酶活性的本发明基因或含有 基因部分的多核苷酸、编码终止密码子及一个终止子的DNA序列，它们 均需整合至适当的位置。在构建导入除本发明的基因以外的基因各种元 件时可应用任何常规的已知元件。编码转移至叶绿体处肽的DNA序列的 优选实例是豌豆核-1，5-二磷酸羧基酶小亚基的基因。启动子实例是 花椰菜花叶病毒35S启动子。终止子实例是胭脂碱合成酶终止子。
基因导入植物细胞的方法包括各种已知的常规方法，这些方法的描 述见“植物基因转化和基因表达；实验指南”，Draper，J.等，Blackwell Scientific Publications，1988。典型的方法包括应用病毒及杆菌 的生物学方法，如电穿孔的物理化学方法，聚乙二醇法及显微注射方法 等等。在这些方法中应用农杆菌对诸如烟草类的双子叶植物是最好的， 因为使用它能保证稳定的转化。应用农杆菌的方法包括应用一种野生型 肿瘤质粒作为中间过渡载体的方法(Nature，287(1980)p.654；Coll， 32(1983)p.1033；EMBO J.，3(1984)p.1525)，使用T-DNA 上肿瘤形成基因区缺陷的载体作为中介载体的方法(EMBO J.，2 (1983)p.2143；Bio/Technology，3(1985)，p.629)以及双元 载体等(Bio/Technology，1(1983)p.262；Nature，303(1983) p.179；Nucl.Acids Res.，12(1984)p.8711)。以上任一方法 均可使用。以农杆菌感染植物方法的范例包括直接接种至培养细胞，与 原生质体共培养以及叶-圆盘等方法。其中叶-圆盘方法依据其直接、 简便并产生大量转化植株的能力、是优选的方法。
为获得再生植株，转化的植物细胞可以在已知培养基如Muroshige -Skoog培养基中培养，这种培养基补充以有选择性的抗生素、植物生 物激素及其它试剂。长出根的幼菌要移植至土壤中使其长成完整植株。
生长成熟的转化植株可通过如下步骤检测其抗寒冻性：
被测植株在不会受到寒冻损伤的温度下培养生长(如25℃)，然后 转移至低温处(例如4℃)短暂生长(如一周)。植物所受损伤，可以 检测如萎黄及繁育力下降。或者比较它与对照植株的生长情况。
本发明现在将用如下的实施例进行详细说明，但这些实施例决不意 味要限制本发明应用范围。
〔实施例1〕多变鱼腥藻Δ12去饱和酶基因(des A)上游开放阅 读框架侧翼DNA片段的克隆
多变鱼腥藻IAM M-3由东京大学分子及细胞生物科学研究所提 供。在约100ml的BG-11培养基中生长(“Plant Molecular Biology”，Shaw，C.H.ed.，p.279 IRL PRESS，1988)。该培 养物在25℃、1000lux荧光灯照射下以120rpm速率振荡使细菌充分 生长。培养液在室温下用5000g离心10分钟收集沉淀的细胞。
为制备基因组DNA，细胞在50ml溶液A(500mM Tris-HCl 1mM EDTA，pH8.0)中悬浮，清洗后再离心收集沉淀的细胞。随后细胞在 15ml溶液B(50mM Tris-HCl，20mM EDTA，50mM NaCl，0.25M蔗 糖，pH8.0)中悬浮。然后加入40mg溶菌酶(Sigma)至溶液B使之溶 解，把混合液置于37℃振荡1小时。再向该振荡培养物中加入蛋白酶K (15mg)及SDS(终浓度为1％)并使混合液在37℃振荡过夜。继续向 振荡培养物中加入NaClO4至终浓度为1M，再加20ml氯仿/异丙醇(24∶ 1)。所得混合物振荡10分钟后离心收集水相。用氯仿/异戊醇重复抽 提之后，向所得水相中加入50ml乙醇，基因组DNA制备物可用玻璃棒 缠绕之后收集获得。DNA制备物以20ml溶液A溶解并加入NaCl至终浓 度为0.1M。加入RNA酶至终浓度为50mg/ml，所得混合物在37℃温育1 小时。随后以等体积的由溶液A饱和的苯酚抽提两次，并加乙醇至水相 收集沉淀的基因组DNA。以70％乙醇清洗后使之溶解于1ml的溶液A中 以获得多变鱼腥藻的基因组DNA溶液。
Sakamoto等报道在Δ12去饱和酶基因上游存在有开放阅读框架 (ORF)侧翼序列，他们在关于从多变鱼腥藻中一个膜脂相连饱和脂肪 酸Δ12去饱和酶基因的克隆的报告里推测上述序列与去饱和酶有某种 关系(日本植物生理学家年会报告摘要3aF04，1993)。但ORF的功能 未被鉴定。发明者对ORF及其功能有兴趣。他们注意到ORF处DNA链的 三个碱基序列并合成了四个引物(SEQ ID Nos：5-8)，以此引物用 多变鱼腥藻基因组DNA作为模板进行聚合酶链式反应。
这四个引物中，有SEQ ID Nos：5-6的碱基序列的引物编码正 义链而SEQ ID Nos：7-8的碱基序列的引物则编码反义链。SEQ ID Nos：6-7的碱基序列是来源于同一氨基酸序列。由上述正义链及反义 链各选一种构成一对引物并用这总共有四种引物组合完成聚合酶链式 反应。向反应液(100μl)中加入引物(每种20μM)及多变鱼腥藻基因 组DNA(1μg)，反应用Gene Amp PCR试剂盒进行(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)。完成聚合酶链式反应共进行35个循环，每一循环包括 95℃(1分钟)，45℃(1分钟)及72℃(2分钟)。在第一个循环中， 95℃保持3分钟。反应结束之后，把反应液(10μl)放在2％琼脂糖凝 胶上电泳以分析合成的DNA。分析结果表明在以SEQ ID Nos：6和8 作为引物组合所合成DNA中作为被检测的主带具有预期长度(约 190bp)的DNA片段。该DNA片段(以下称为des 9 var)以Klenow片 段处理形成平头末端，然后克隆进入质粒pTZ18R(Pharmacia)的SmalI 位点，随后以荧光DNA测序仪测定碱基序列(Applied Biosystems)。 测得的碱基顺序表示在SEQ ID No：1中。由此碱基序列所推测的氨 基酸序列(SEQ ID No：2)与小鼠硬脂酰-辅酶A去饱和酶有相当高 的同源性(见图1示des 9 var片段编码的氨基酸序列与小鼠硬脂酰 -辅酶A去饱和酶(MSCO2)相应序列的比较)。
随后以des 9 var片段为探针对构巢组囊藻基因组DNA作Southern 杂交分析。分别用三种限制性内切酶XhoI、PstI及BamHI切割构巢 组囊藻基因组DNA(约0.1μg)。所产生DNA片段用在0.8％琼脂糖凝胶 上电泳进行分离，然后印迹至尼龙膜上(Hybond-N+；Amersham)。DNA 探针用Multiprime DNA标记试剂盒(Amersham)以〔α-32P〕dCTP 标记。DNA探针在反应液中与尼龙膜于55℃共同温育反应16小时，反 应液中包括6×SSPE(1×SSPE为10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)，1mM EDTA及0.15M NaCl混合液)、0.2％SDS、100μg/ml鲱鱼精DNA。处 理后所得尼龙膜以2×SSC(1×SSE由0.15M NaCl、15mM柠檬酸钠组 成)在室温下振荡15分钟进行清洗共清洗二次，再以0.1×SSC于40 ℃振荡15分钟共清洗二次，然后进行放射自显影进行分析。结果表明 以任何限制性内切酶切割基因组DNA都只能检测出一个DNA片段(见图 2)，在图2中“Non”表示基因组DNA用任何限制性内切酶酶切)。
〔实施例2〕构巢组囊藻基因组DNA中与des 9 var片段有高度同 源的DNA链的克隆
构巢组囊藻R2-SPc培养物由东京大学分子及细胞生物科学研究 所提供，其基因组DNA制备方法与前述多变鱼腥藻中所用方法相同。把 基因组DNA(约100μg)以Sau 3AI部分酶解，并按照“Molecular Cloning，2rd edition，pp.2.85-2.87(Sambrook，J.等，eds.， Cold Spring Harbor Laboratory，1987)所述进行蔗糖密度梯度 离心收集长度约为9-23kbp的DNA片段。把所得DNA片段克隆到用 BamHI及HingIII切割后的Lambda噬菌体载体λDASH II (Stratagene)然后包装成为噬菌体颗粒以产生构巢组囊藻基因组文 库。取大肠杆菌p2392用噬菌体(文库)感染后在直径约为15cm含有 NZYM-琼脂的平板上培养。共形成100,000个噬菌斑，然后将它们印 迹至尼龙膜上(Hybond-N+；Amersham)。同上面Southern分析方法 一样，des 9 var片段仍用〔α-32P〕dCTP标记并与所得尼龙膜反应， 用放射自显影检测阳性噬菌斑，最终筛选出30个有不同信号强度的噬 菌体克隆，从中选出12个克隆。用常规方法从每个克隆中提取噬菌体 DNA。所得DNA用几种限制性内切酶切割后在0.8％琼脂糖凝胶上电泳 分离，随后印迹至尼龙膜上。该尼龙膜用上述筛选过程中的Southern 印迹技术在相同的条件下进行分析，并比较与探针杂交的DNA片段的长 度与信号强度。结果是λ5及λ15这两个克隆显示最强的信号。因为这 两个克隆已被插入DNA片段长度为11和15kbp，据估算可认为它们的 长度足能包含预期OPF的整个片段。插入这两个克隆的每个DNA用几种 限制性内切酶切割后作Southern印迹分析。结果显示以XhoI切割的两 个克隆的DNA所产生的片段中均有约5kbp片段杂交带。把这个片段的 DNA亚克隆进入pBluescript SK-(Stratagene)XhoI位点，产生含 有源于λ5及λ15DNA片段的质粒p5X及p15X。制作了p5X及p15X的 详细酶切图谱并加以比较。该图表明p5X及p15X含有同样的基因组DNA 片段(见图3显示的λ5及λ15中插入DNA的相关性，矩形阴影部分表 示在筛选中与des 9 var探针杂交的DNA片段。粗箭头表示des 9 nid (下面将要提到)区域及正义链的方向。细箭头表示带有des 9 nid区 域的测序方向。5kbp、1.25kbp及0.5kbp的线条是左边图的尺寸标记。 限制性内切酶的缩写意义如下：B，BamHI；H，HindIII；N，NotI；Hp， HpaI；RI，EcoRI；RV，EcoRV；S，SalI；P，PstI；X，XhoI)。
用限制性内切酶或ExoIII从p15X制备缺失质粒，约有2kbp的DNA 片段的碱基顺序含有与能与des 9 var杂交区域，它的顺序由荧光DNA 测序仪测定(见图3)。从结果估计这个片段包含834bp(des 9 nid) 的ORF，它编码278个氨基酸(SEQ ID No：4)。这个氨基酸序列与 前面从多变鱼腥藻克隆的des 9 var片段编码的相应氨基酸序列(SEQ ID No：2)有80％同源性。运用核酸及氨基酸序列分析软件GENETYX (Software Development)及EMBL和DDBJ的核酸及氨基酸序列资料 库检索高度同源氨基酸序列。插索结果显示des 9 nid与小鼠硬脂酰 -辅酶A去饱和酶有30％的一般同源性，但其部分区域则与小鼠去饱和 酶有极高的同源性(见图4显示的des 9 nid与小鼠硬脂酰-辅酶A 去饱和酶氨基酸序列比较结果)，这暗示所得的des 9 nid应能编码 一个使饱和脂肪酸去饱和的酶。
〔实施例3〕测定des 9 nid基因在大肠杆菌中表达的活性
构巢组囊藻去饱和酶只具有Δ9去饱和酶活性或者说它具有在Δ9 位使脂相连的饱和脂肪酸去饱和的能力(Bishop，D.G.等，Plant Cell Physiol.，27：1593，1986)。因此，尝试在大肠杆菌中表 达des 9 nid编码的多肽并测量它的活性。
因为由p15X直接表达较困难，故构建了在大肠杆菌中表达的载 体。具体地说，选择pET3a(Novagen)作为载体并将des 9 nid克隆 进入它的NdeI及BamHI位点之间，这样通过如下的步骤处理就不用在 des 9 nid编码的氨基末端加上额外的氨基酸：
为了刚好在des 9 nid编码蛋白质的C末端下游加上一个BamHI 位点，以包括碳末端在它们之间的两个碱基序列进行聚合酶链式反应。 具体地说以p15X作为模板，用下面的两个引物完成PCR，得到约140bp 的产物。 正义引物：5’-ACGTCATGGCCTGCAGT(下划线处为PstI位点)(SEQ ID No：9) 反义引物：5’-CGCGGATCCTTAGTTGTTTGGAGACG(下划单线为BamHI位 点，下划双线为终止密码子)(SEQ ID No：10)
把产物亚克隆到pUCl9的SmaI位点并验证碱基序列的正确性。这 样在所得质粒的BamHI位点下游又产生一个EcoRI位点。随后该质粒用 EcoRI及PstI切割。同时p15X也用同样的限制性内切酶从而在终止密 码子下游引入一个BamHI位点。质粒再以SalI切割，然后在四种脱氧 核苷酸存在情况下用DNA聚合酶Klenow片段进行填充反应(fill-in reaction)，随后用HindIII切割。把由下面两个人工合成的DNA片段 组成的接头插入到所得的质粒上，从而在氨基末端引入一个NdeI位点。 接头是下列两种DNA等摩尔量的混合物。 5’-CATATGACCCTTGCTATCCGACCCA(下面划线处为NdeI位点)(SEQ ID No：11)和 5’-AGCTTGGGTCGGATAGCAAGGGTCATATG(下划单线为NdeI位点，下划双 线为HindIII位点部分)(SEQ ID No：12)。
把所得质粒(p Des 9 Nde)导入到感受态的大肠杆菌菌株BL21 (DE3)(Novagen)细胞中，这些感受态细胞可通过常规方法制备 (Molecular Cloning，pp.250-251，1982)。转化的BLDESI菌 株可通过选择氨苄青霉素抗性获得。
把BLDSI菌株及含有pET3a的BL21菌株(BLI)接种到100ml M9 培养基(M9含有200μg/ml氨苄青霉素，4mg/ml葡萄糖10μM Fecl3， 0.5μg/ml维生素B1，1mg/ml酪蛋白水解产物)中在37℃培养。该继 续培养直至培养液混浊度在波长600mM达到0.5 O.D.为止，在培养 液中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM。把细胞继续培 养1小时以诱导Δ9去饱和酶的表达。收集大肠杆菌沉淀并用1.2％NaCl清洗，随后提取脂类。采用Blight和Dyed Can J.Biochem.Physiol.， 37：911，1959)的方法提取脂类，将脂类置完全密闭的容器中在85 ℃与5％盐酸甲醇溶液(2.5ml)反应2.5小时以产生甲基化的脂肪酸。 产物脂肪酸甲基酯用己烷(2.5ml)抽提4次后用氮气除去溶剂使之浓 缩。用气相色谱分析脂肪酸甲基酯。与标准脂肪酸甲基酯的保留时间的 比较鉴别相应的脂肪酸。采用Chromatopack C-RTA Plus(Shimadzu Corp.)进行定量分析。结果如下面表1。 表1.大肠杆菌中脂肪酸组成 菌株         16∶0    16∶1    18∶1Δ11   其它 BL1(0小时)    47       20       29          4 BL1(1小时)    50       17       29          4 BLDES1(0小时) 44       22       30          4 BLDES1(1小时) 40       28       28          4 表中小时表示用IPTG诱导蛋白质的时间
结果显示BLDES1菌株中16∶1含量上升，表明本发明的基因有去 饱和16∶0的活性。
上述两种菌株在补充有0.1M硬脂酸的M9培养基中生长并按上述相 同方式进行比较。与BL菌株不同，BLDES1不仅产生16∶1，也能产生 18∶1Δ9。这表明由des 9 nid基因编码多肽既能以16∶0也能以 18∶0为底物产生不饱和脂肪酸。
〔实施例4〕des 9 nid基因导入烟草植株来自构巢组囊藻的des 9 nid基因按如下方法整合进入烟草植株 (1)植物中表达的载体质粒的构建
把质粒pDes9Nde用SacI及SalI切割以产生一个保存在两个限制 性内切酶酶切位点之间的des 9 nid基因片段。用HindIII及SphI 从带有豌豆RubisCo基因(Schreicher等，EMBO J.4，25(1985)) 的pSNIP 9克隆中切下叶绿体转运序列，并把其克隆进入用相同限制 性内切酶切割的pUC118质粒中，从而生成在转运序列下游含有多克隆 位点的pTRA3质粒。这个质粒的HingIII位点用Klenow酶切开和填平， 接着插入一个XbaI连接物(linker)(pTRA3X)。质粒pTRA3X用SalI 及SacI双酶切并插入经同样双酶切得到的des 9 nid基因片段 (pTRA3Xdes9)。在pTRA3Xdes9质粒中，des 9 nid基因随着RubisCo 的转运序列将会在同一阅读框架里被翻译。该质粒用SacI及XbaI双 酶切后插入到下列的植物载体中。植物表达型双元载体pBI 121 (Clonetech)用SacI及XbaI双酶裂解以产生β-葡萄糖醛酸酶(β -glucuronidase)基因的质粒pBI(-GUS)。把上面制备的转移基因 插入质粒pBI(-GUS)中花椰菜花叶病毒35S启动子及胭脂碱合成酶 (NOS)终止子之间以构成导入植株的载体(pBI 121(-GUS)Rbsc- des9)。 (2)将pBI 121(-GUS)Rbsc-des导入农杆菌
把根癌农杆菌LBA4404(Clonetech)接种于50ml YEB培养基(每 升中含5g牛肉浸膏，1g酵母提取物，1g蛋白胨和5g蔗糖，2mM MgSO4(pH7.4))中置28℃培养24小时。把经过培养的溶液在4℃，3000rpm 离心20分钟以收集细胞。细胞用10ml/mM Hepes-KOH(pH 7.4)清 洗3次再以3ml 10％甘油清洗。然后把这些细胞用3ml 10％甘油悬浮 而制成为导入DNA的农杆菌细胞。
由此制备的细胞溶液(50μl)及质粒pBI 121(-GUS)Rbsc-des9 (1μg)放置在小池中并用电穿孔仪器基因脉冲发生仪(Gene Pulser) (BioRad)，在25μf，2500V，200Ω条件下进行电脉冲处理从而将质粒 DNA导入农杆菌中。把细胞溶液转移至Eppendonf离心管中并加入800 μ的SOC培养基(每升含20g胰蛋白胨，5g酵母提取物和0.5g NaCl， 补充2.5mM KCl，10mM MgSO4，10mM MgCl2和20mM葡萄糖(pH7.0)。 细胞在28℃静置培养1.5小时。培养液(50μl)接种至补充有100ppm 卡那霉素的YEB琼脂培养基(琼脂浓度1.2％)中在28℃培养2天。
从所产生的菌落中挑选分隔良好的菌落并从挑选得的菌落通过碱 法制备质粒DNA。此质粒DNA以适当的限制性内切酶进行酶解。所产生 的DNA片段用在1％琼脂糖凝胶上电泳进行分离并以32P-标记的des 9 nid基因片段作探针作Southern印迹分析；从而证明农杆菌细胞中含 有质粒pBI 121(-GUS)Rbsc-des9。此根癌农杆菌细胞缩写为 “ALBBSDES”。 (3)烟草的转化
把ALBBSDES细胞株在加有50ppm卡那霉素的LB液体培养基中置 28℃振荡培养2小时。取培养液(1.5ml)在10,000rpm离心3分钟收 集细胞。然后用1ml LB培养液清洗细胞以去除卡那霉素。另外也可把 细胞液在10,000rpm离心3分钟收集细胞。然后用1.5ml LB培养液 重新悬浮细胞以制备成感染用细胞液。
为感染烟草，取其幼叶在0.5％次氯酸钠水溶液中浸10分钟。随 后以灭菌水清洗叶片3次再以灭菌滤纸擦拭以准备待感染的叶片标本。 叶片用无菌手术以刀切成每个为1cm2的小片。把这些小片置于农杆菌的 溶液中并使其背面朝上，温和振荡2分钟。然后把小叶片放置于灭菌过 的滤纸上以除去过剩的农杆菌。将Whatman No.1滤纸(φ7.0cm)置 MS-B5培养基(含有1.0ppm苄基腺嘌呤0.1ppm及0.8％琼脂)平板上 (Murashige，T.and Skoog，F.Plant Physiol.，15：473 (1962))，并将叶子标本的每一小片背面朝上放在滤纸上。该平板用 封口膜密封后，叶片在25℃下以16小时光照、8小时黑暗的周期培养2 天。随后，把叶片转移到补充有250ppm calforan及100ppm卡那霉 素的MS-B5培养基上并在相同的条件下培养以去除农杆菌。另外，可 把叶片放置在平板底部补充有250ppm Calforan和100ppm卡那霉素 的MS-B5培养基中并在相同条件下培养7天。同时，叶片周边形成愈 伤组织并且小芽生长开始。再培养另外的10天后，把伸展的芽放置在 补充有250 calforan及100rpm卡那霉素的MS-HF培养基(无苄基腺 嘌呤和萘乙酸的MS-B5培养基)。培养10天后，选择生根的芽枝作为 卡那霉素耐受的转化体并移栽至盛有并补充250ppm calforan的MS- HF培养基的植物盆中。
〔实施例5〕转化的烟草基因组的Southern及Northern分析
由卡那霉素耐受的烟草中提取DNA并通过Southern及Northern 印迹技术验证预期基因的导入及表达。基因组DNA的提取方法依照手册 (Rogers，S.O.&Bendich，A.J.：Plant Molecular Biology Manual A6；1(1988))中的CTAB方法进行。简述如下，取烟草叶(2g) 在液氮中研磨，并以CTAB提取缓冲液提取基因组DNA。把DNA(10μg) 用EcoRI及XbaI酶解后在0.7％琼脂糖凝胶上电泳，用0.4N NaOH使 分离的DNA片段印迹至尼龙膜上(Hybond N+；Amersham)来源自质粒 pTRA3Xdes9的含有去饱和酶基因的转运序列为探针与该该膜在65℃杂 交16小时，以此证明预期基因导入烟草基因组中。
由烟草叶(约2g)中提取RNA并分析确证转基因的表达。这些步 骤包括用硫氰酸胍提取poly(A)＋RNA(Nagy，F.等，Plant Molecular Biology Manual B4；1(1988))并在含甲醛琼脂糖凝胶中电泳。把 RNA印迹至尼龙膜(Hybond N+；Amersham)并与上述Southern印迹 方法的同样条件下进行杂交分析。在RNA量表达不同的转化体中选RNA 表达含量最高的进行分析脂肪酸。
〔实施例6〕转化的烟草植株中脂类的脂肪酸分析
在实例5中经验证有高RNA表达的烟草转化植株以及pBI 121转化 的对照烟草植株，按如下的方法提取它们叶中的磷脂酰甘油PG及硫代 异鼠李糖基二酰基甘油(SQDG)等脂类。分析它们的脂肪酸组成。至于 部分转化体及非转化体的根内脂类也加以分析。 (1)总脂类的提取
脂类的提取采用Bligh-Dyer方法(Can.J.Biochem.Physiol.， 37：911，1959)。取2g湿重叶(或当根部分作样品时取1g)以刀切 碎并加20ml氯仿/甲醇(1∶2，体积比)。用匀浆器打碎叶片并静置 15分钟。把氯仿(12ml)及蒸馏水(12ml)加至打碎的叶片中并剧烈 振荡。该混合物在4℃，3,000rpm下离心30分钟以分离水层及有机层。 收集有机层(下层)后加入适量的乙醇。溶剂在旋转蒸发器中30℃减压 蒸发。残留物用2ml氯仿/甲醇(1∶4，体积比)溶解以制备总脂类提 取物。部分该总脂提取物以5％盐酸甲醇溶液按下面方法处理以生成甲 基化脂肪酸。 (2)脂类的分级分离
取2.5ml DEAE-Toyopearl 650C(TOSOH)悬浮液与25ml 1M醋 酸钠水溶液(pH7.0)混合以制备其醋酸型。所得悬浮液依次用蒸馏水、 甲醇清洗并在甲醇中悬浮。把该悬浮液装柱(内径1.5cm)中使其高度 达1.5cm并以50ml氯仿/甲醇(1∶4，体积比)清洗。
随后，将脂类总提取物上柱。用50ml氯仿/甲醇(1∶4，体积比) 洗脱甘油(MGDG)、双半乳糖双酰甘油(DGDG)、磷脂酰乙醇胺(PE) 及磷脂酰胆碱(PC)以制备中性脂(MGDG，DGDG，PE，PC)部分。然后 用5ml乙酸洗脱出磷脂酰丝氨酸(PS)，并再用20ml氯仿/甲醇(1∶4， 体积比)洗去醋酸。而含有PG，SPDG及磷脂酰肌醇(PI)的部分则可 由50ml氯仿、甲醇、10M乙酸铵(20∶80∶0.2，体积比)溶液抽提 获得。该分级部分抽提液中加入乙醇(15ml)后溶剂经在减压下蒸发尽。 把残留物在0.2ml氯仿/甲醇(2∶1，体积比)中溶液以制备酸性脂类 部分(PG、SQDG及PI)。
MGDG、DGDG、PE及PC通过硅酸柱层析(Iatrobeads，Iatoron Laboratories Inc.)作进一步分级分离。更准确地说，把样品溶于氯 仿(1ml)并上样至用氯仿平衡的柱，依次用氯仿/丙酮(4∶1)、丙 酮及甲醇洗脱，凭此，用丙酮把糖脂(MGDG、DGDG)洗脱而用甲醇把磷 脂(PC及PE)洗脱下来。 (3)用薄层层析(TLC)分离纯化PG及脂肪酸分析
由步骤(2)所得各分部液在硅胶-TLC板#5721(Merck)上分离。 分离酸性脂类以氯仿/丙酮/甲醇/醋酸/水(50∶20∶10∶15∶5， 体积比)作为展层液，而分离中性脂类则以氯仿/甲醇/水(70∶21∶3， 体积比)作为展层液。通过TLC分离后，喷上樱草灵(primulin)(溶 于丙酮的80％溶液)使在紫外光下产生荧光。通过与标准脂类比较迁移 率来判断脂类分部液中的各类脂分。产生荧光的脂类与硅胶共同刮下后 置有螺旋帽的试管中。当判断脂类的脂肪酸组成时，脂中加入3ml 5％ 盐酸甲醇溶液然后使该混合物在完全密闭状态下于85℃反应2小时以 产生甲基化脂肪酸。同时为了检测sn-1及sn-2位置的脂肪酸组成， 从刮下硅胶加入5ml氯仿/甲醇(2∶1)混合溶液中收集脂类并使之干 燥。在脂中加入1ml 50mM TrisCl(pH7.2)及0.05％Triton X- 100，混合物剧烈振荡以分散脂类。在该分散液中加入来自特勒麦根霉 (Rhizopus delemar)的脂酶(2500U；Boehringer)，并把混合物 在37℃保持30分钟使在sn-1位置上选择性释放脂肪酸。在反应产物 浓缩后，未反应脂类、溶解脂类及自由脂肪酸通过薄层层析，以氯仿/ 丙酮/甲醇/醋酸/水(10∶4∶2∶3∶1)作展层剂使之分离开。这 些物质从硅胶中回收并如前述方法一样与盐酸甲醇溶液反应以产生甲 基化脂肪酸。所得脂肪酸甲基酯用3ml己烷抽提3次后再在减压下蒸发 尽溶剂使之浓缩。通过气相色谱分析脂肪酸甲基酯。用与标准脂肪酸甲 基酯保留时间相比较鉴定这些脂肪酸。定量分析则通过 (Chromatopnck)C-R7A plus(Shimadzu Corp.)进行。关于总脂 类、PG及其它代表性脂类的结果分别地展示在表2、表3及表4中。这 些表中表示的平均分析数值对照是2个，平均的转化体是2个或3个单 独的转化体平均的。 表2.叶中总脂类的脂肪酸分析结果 植株     16∶0 16∶1 16∶2 16∶3 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3  ∑16∶0＋18∶0 对照植株   17    3     1     4     3     1     9     63     20 转化植株   10    12    1     5     1     2     14    56     11 表3.PG中脂肪酸分析结果 植株              16∶0  16∶1t  16∶1c  18∶0  18∶1  18∶2  18∶3 ∑16∶0＋18∶0＋16∶1t PG对照植株          32     37      0       1      5      10     14              70 转化植株            18     37      8       0      10     12     15              55 表4.其它脂类中脂肪酸分析结果
植株          16∶0  16∶1   16∶2   16∶3  18∶0  18∶1  18∶2 18∶3 ∑16∶0+18∶0 SQDG对照植物        51     1       0       0      3      2      7     36        54
转化植株        36     22      0       0      0      4      9     28        36 MGDG对照植株        7      0       1       9      1      2      4     76        8
转化植株        3      9       1       10     0      1      5     69        3 DGDG对照植物        19     0       0       0      3      1      4     73        22
转化植株        9      13      0       1      0      1      5     70        9 PC对照植物          28     0       0       0      5      1      21    44        33
转化植株        19     12      0       0      3      4      40    23        22 PE转化植株          20     0       0       0      3      1      6     70        23
对照植物        18     10      0       0      2      2      31    38        20 PI转化植株          48     1       0       0      2      1      11    37        50
对照植物        44     7       0       0      1      2      18    28        45
PG所联接脂肪酸分析结果揭示在表达来自构巢组囊藻脂肪酸去饱 和酶转化过的烟草植株中，16∶0(棕榈酸)含量大量下降而顺式16∶ 1含量则增加，同时18∶0几乎减少为零(在对照中有少量的18∶0) 而18∶1则上升。因此，对照烟草植株中饱和脂肪酸含量(16∶0＋ 16∶1反式＋18∶0(硬脂酸))为70％而由未饱和酶基因转化的烟 草植株中则显著地下降到55％。对PG中sn-1、sn-2位置的相应分 析结果表明多于98％的sn-2位置被饱和脂肪酸(16∶0或16∶1顺 式)所占有，由导入基因新产生的16∶1则全部出现在sn-1位置。 所以，很明显由去饱和酶基因转化的烟草中PG的sn-1位置上饱和脂 肪酸含量变得极小。总而言之，在sn-1、sn-2位置上由饱和脂肪酸 构成的饱和分子类数量大大减少，从而根据脂类的分子种类组成可判断 该烟草植株变成具有明显抗寒冻性表型的植株。
至于其它脂类，如MGDG、DGDG、SQDG、PC、PE和PC等，很明显可 见16∶0下降而16∶1则相应上升约10％，18∶0的去饱和程度也 有增加。在MGDG和DGDG中，16∶1主要在sn-1位置产生，但在sn -2位置也能检测出少量16∶1。主要在叶绿体上出现MGDG、DGDG、 SQDG及PG等脂类的去饱和程度，发现在高等植物叶绿体中表达蓝绿藻 构巢组囊藻的去饱和酶也获得极大的提高。这四类存在于构巢组囊藻质 膜上的脂类能作为去饱和酶的底物是有很大的可能性。令人奇怪的是 PC、PE及PI中棕榈酸及硬脂酸也能发生去饱和，而构巢组囊藻质膜却 缺乏这些脂类，但它们在高等植物却主要存在叶绿体外。
在本例中，转化烟草植株的脂类分析证明源自构巢组囊藻的脂肪酸 去饱和酶可在诸如转化烟草类高等植物中以极高的效率使几乎所有脂 类中16∶0和18∶0发生去饱和。
根内总脂类的脂肪酸分析结果见表5。 表5.根内总脂类的脂肪酸分析结果 植株                16∶0 16∶1 16∶2 16∶3 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3  ∑16∶0＋18∶0 非转化植株            26    0     0     0      5    2     47    21      31 转化植株              17    13    0     0      2    4     58    6       19
结果显示源自构巢组囊藻的脂肪酸去饱和酶不仅是能催化叶中16∶ 0和18∶0的去饱和作用，而且也能对根中的16∶0和18∶0发挥同 样作用，这暗示本发明中脂肪酸去饱和酶基因不仅能改善植物抗寒冻 性，而且也可能增加不饱和脂肪酸的含量，使得它能在以植物为原材料 生产油料产品的工业中得到应用。
〔实施例7〕检测转基因烟草植株抗寒冻性
通过RNA表达实验及脂类分析实验判定为有希望的转化体自花传 粉后收集其下一代的种子。部分种子栽培于添有800ppm卡那霉素MS- HF培养基中，以16＋时光照和8小时黑暗的光照周期在25℃培养2周。 选择卡那霉素耐受的幼苗。把这些幼苗移植于植物盒中并再培养4周。 以pBI 121质粒转化的植株也按上述步骤重复(对照)。
这些植株在连续光照条件下用4℃低温处理11天，然后置25℃培 养2天。结果，在对照植株(以pBI 121转化的植株)可见明显的叶子 呈波状及萎黄，而转化植株则无任何损伤。据此可以认为抗寒冻性能够 通过引入去饱和酶基因得到改善。 工业应用性
导入本发明的编码Δ9去饱和酶基因能够赋予植物抗寒冻性，且植 株内不饱和脂肪酸含量也能被增加。
本申请是申请日为1994年12月28日的申请号为94195032.8的中 国发明专利申请的分案申请。
   序列表    SEQ ID NO：1的信息    长度：196碱基对    类型：核酸    链型：双链    拓扑结构：线性    分子类型：基因组DNA    最初来源：    生物：多变鱼腥藻    藻株：IAM M-3    序列描述：SEQ ID NO：1： GCT CTG GGG TTG TTG CTG TTA TAT CTA GGC GGG TGG TCT TTT GTG GTC TGG GGA GTT TTC TTT CGC ATC GTT TGG GTT TAC CAC TGT ACT TGG TTG GTA AAC AGC GCT ACC CAT AAG TTT GGC TAC CGC ACC TAT GAT GCT GGT GAC AGA TCC ACT AAC TGT TGG TGG GTA GCT GTC CTA GTG TTT GGT GAA GGT T    SEQ ID NO：2的信息    长度：65氨基酸    类型：氨基酸    拓扑结构：线性    分子类型：肽    最初来源：    生物：多变鱼腥藻    藻株：IAM M-3    序列描述：SEQ ID NO：2：
Ala Leu Gly Leu Leu Leu Leu Tyr Leu Gly Gly Trp Ser Phe Val Val Trp Gly Val Phe Phe Arg Ile Val Trp Val Tyr His Cys Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Thr His Lys Phe Gly Tyr Arg Thr Tyr Asp Ala Gly Asp Arg Ser Thr Asn Cys Trp Trp Val Ala Val Leu Val Phe Gly Glu Gly    SEQ ID NO：3的信息    长度：837碱基对    类型：核酸    链型：双链    拓扑结构：线性    分子类型：基因组DNA    最初来源：    生物：构巢组囊藻    藻株：R2-SPc    序列描述：SEQ ID NO：3： ATG ACC CTT GCT ATC CGA CCC AAG CTT GCC TTC AAC TGG CCG ACC GCC CTG TTC ATG GTC GCC ATT CAC ATT GGA GCA CTG TTA GCG TTC CTG CCG GCC AAC TTT AAC TGG CCC GCT GTG GGC GTG ATG GTT GCG CTG TAT TAC ATT ACC GGT TGT TTT GGC ATC ACC CTA GGC TGG CAC CGG CTA ATT TCG CAC CGT AGC TTT GAA GTT CCC AAA TGG CTG GAA TAC GTG CTG GTG TTC TGT GGC ACC TTG GCC ATG CAG CAC GGC CCG ATC GAA TGG ATC GGT CTG CAC CGC CAC CAT CAC CTC CAC TCT GAC CAA GAT GTC GAT CAC CAC GAC TCC AAC AAG GGT TTC CTC TGG AGT CAC TTC CTG TGG ATG ATC TAC GAA ATT CCG GCC CGT ACG GAA GTA GAC AAG TTC ACG CGC GAT ATC GCT GGC GAC CCT GTC TAT CGC TTC TTT AAC AAA TAT TTC TTC GGT GTC CAA GTC CTA CTG GGG GTA CTT TTG TAC GCC TGG GGC GAG GCT TGG GTT GGC AAT GGC TGG TCT TTC GTC GTT TGG GGG ATC TTC GCC CGC TTG GTG GTG GTC TAC CAC GTC ACT TGG CTG GTG AAC AGT GCT ACC CAC AAG TTT GGC TAC CGC TCC CAT GAG TCT GGC GAC CAG TCC ACC AAC TGC TGG TGG GTT GCC CTT CTG GCC TTT GGT GAA GGC TGG CAC AAC AAC CAC CAC GCC TAC CAG TAC TCG GCA CGT CAT GGC CTG CAG TGG TGG GAA TTT GAC TTG ACT TGG TTG ATC ATC TGC GGC CTG AAG AAG GTG GGT CTG GCT CGC AAG ATC AAA GTG GCG TCT CCA AAC AAC TAA    SEQ ID NO：4的信息    长度：278氨基酸    类型：氨基酸    拓扑结构：线性    分子类型：肽    最初来源：    生物：构巢组囊藻    藻株：R2-SPc    序列描述：SEQ ID NO：4： Met Thr Leu Ala Ile Arg Pro Lys Leu Ala Phe Asn Trp Pro Thr Ala Leu Phe Met Val Ala Ile His Ile Gly Ala Leu Leu Ala Phe Leu Pro Ala Asn Phe Asn Trp Pro Ala Val Gly Val Met Val Ala Leu Tyr Tyr Ile Thr Gly Cys Phe Gly Ile Thr Leu Gly Trp His Arg Leu Ile Ser His Arg Ser Phe Glu Val Pro Lys Trp Leu Glu Tyr Val Leu Val Phe Cys Gly Thr Leu Ala Met Gln His Gly Pro Ile Glu Trp Ile Gly Leu His Arg His His His Leu His Ser Asp Gln Asp Val Asp His His Asp Ser Asn Lys Gly Phe Leu Trp Ser His Phe Leu Trp Met Ile Tyr Glu Ile Pro Ala Arg Thr Glu Val Asp Lys Phe Thr Arg Asp Ile Ala Gly Asp Pro Val Tyr Arg Phe Phe Asn Lys Tyr Phe Phe Gly Val Gln Val Leu Leu Gly Val Leu Leu Tyr Ala Trp Gly Glu Ala Trp Val Gly Asn Gly Trp Ser Phe Val Val Trp Gly Ile Phe Ala Arg Leu Val Val Val Tyr His Val Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Thr His Lys Phe Gly Tyr Arg Ser His Glu Ser Gly Asp Gln Ser Thr Asn Cys Trp Trp Val Ala Leu Leu Ala Phe Gly Glu Gly Trp His Asn Asn His His Ala Tyr Gln Tyr Ser Ala Arg His Gly Leu Gln Trp Trp Glu Phe Asp Leu Thr Trp Leu Ile Ile Cys Gly Leu Lys Lys Val Gly Leu Ala Arg Lys Ile Lys Val Ala Ser Pro Asn Asn    SEQ ID NO：5的信息    长度：18碱基对    类型：核酸    链型：单链    拓扑结构：线性    分子类型：其它核酸、合成DNA    序列描述：SEQ ID NO：5：    ATGACAATTG CTACTTCA SEQ ID NO：6的信息 长度：15碱基对 类型：核酸 链型：单链 拓扑结构：线性 分子类型：其它核酸、合成DNA 序列描述：SEQ ID NO：6： GCTCTGGGGT TGTTG SEQ ID NO：7的信息 长度：15碱基对 类型：核酸 链型：单链 拓扑结构：线性 分子类型：其它核酸、合成DNA 序列描述：SEQ ID NO：7： CAACAACCCC AGAGC SEQ ID NO：8的信息 长度：18碱基对 类型：核酸 链型：双链 拓扑结构：线性 分子类型：其它核酸、合成DNA 序列描述：SEQ ID NO：8： RTGRTGRTTR TTRTGCCA SEQ ID NO：9的信息 长度：17碱基对 类型：核酸 链型：单链 拓扑结构：线性 分子类型：其它核酸、合成DNA 序列描述：SEQ ID NO：9： ACGTCATGGC CTGCAGT SEQ ID NO：10的信息 长度：26碱基对 类型：核酸 链型：单链 拓扑结构：线性 分子类型：其它核酸、合成DNA 序列描述：SEQ ID NO：10： CGCGGATCCT TAGTTGTTTG GAGACG SEQ ID NO：11的信息 长度：25碱基对 类型：核酸 链型：单链 拓扑结构：线性 分子类型：其它核酸、合成DNA 序列描述：SEQ ID NO：11： CATATGACCC TTGCTATCCG ACCCA SEQ ID NO：12的信息 长度：29碱基对 类型：核酸 链型：单链 拓扑结构：线性 分子类型：其它核酸、合成DNA 序列描述：SEQ ID NO：12： AGCTTGGGTC GGATAGCAAG GGTCATATG