重组△9脱氢酶以及编码该酶的基因

本发明涉及能将连接到甘油脂上的一种饱和脂肪酸，硬脂酸 转化为一种不饱和脂肪酸，油酸的重组Δ9脱氢酶，以及涉及编码该 酶的离体基因。

蓝藻细菌的Δ9脱氢酶是一种将连接到甘油脂上的硬脂酸转化 为油酸，以及将连接到甘油的C-1上的软脂酸转化为棕榈油酸的酶。

在蓝藻细菌中，已经证明脂肪酸的去饱和过程是通过在碳链的 Δ9位点引入一个双键开始，接着在Δ12位上引入双键，随后在Δ6 或Δ15位引入双键。Δ9脱氢酶是一种重要的酶，它与一系列去饱 和反应的第一个步骤有关，并且与在硬脂酸或棕榈酸的碳链的Δ9 位引入双键的反应有关，其中的碳链连接在甘油脂上。该反应需要 依赖于铁氧还蛋白和NADPH的还原力。

另一方面，已有人报道将双键引入到没有结合甘油脂的硬脂酸 的Δ9的酶，在动物细胞质中为硬脂酰CoA脱氢酶，在植物叶绿体中 该酶是硬脂酰ACP(酰基-载体蛋白)脱氢酶。这些酶的DNA序列已得 到测定。

蓝藻细菌的Δ9脱氢酶的特征在于将连接至甘油脂上的棕榈酸 或硬脂酸转化为不饱和脂肪酸，而上文中提到的动物和植物中的两 种Δ9脱氢酶不能催化该反应。为了鉴别该酶底物特异性的决定因 子，应在分子水平上分析几种类型的蓝藻细菌Δ9脱氢酶。

生物膜的相转变温度取决于组成膜的极性脂类中不饱和脂肪 酸的含量；因此，相转变温度随着未饱和脂肪酸含量的增加而降低。 已经报道，在较低温度时蓝藻细菌中不饱和脂肪酸的量增加，暗示着 细胞膜中脂肪酸的组分也与植物的低温忍受性有关。因此，可以认 为脂肪酸脱氢酶的表达是受低温调节的。为了探讨调节表达的机 理，需要分离相关基因。

鉴于上述理由，分离蓝藻细菌的Δ9脱氢酶基因是必需的，但是 除了从异项圈蓝藻(Anabaena Variabilis)中分离外，尚没有分离 该基因的其他报道。

为了分析蓝藻细菌的Δ9脱氢酶，本发明人已在分子水平上进行 了广泛的研究，并且利用Synechocystis PCC 6803基因组文库分离 到蓝细菌Synechocystis sp.PCC 6803Δ9脱氢酶的基因组DNA克 隆。这步工作使本发明达到了目的。

因此，本发明的关键在于由序列表中的SEQ ID NO：1表示的 氨基酸序列代表的Δ9脱氢酶，以及编码该酶的离体基因。

下文中将对本发明进行详细描述。

在本发明中，蓝藻细菌(例如Synechocystis sp.PCC 6803) 是光能自养型生长的，用玻璃珠破碎细胞，通过苯酚萃取和乙醇沉 淀，提取基因组DNA。

用限制性酶(例如Sau 3A)部分消化完整的基因组DNA并且连 接到噬菌体载体(例如λDASH II)以产生基因组文库，该基因组文 库通过噬菌斑杂交进行筛选，其中以蓝藻细菌异项圈藻的Δ9脱氢酶 的编码区(下文中将它简略为des C(A)用作为探针。从阳性噬菌斑中 提取噬菌体DNA。用限制酶消化后，使用des C(A)的0.75kb.p.DNA 片段作为探针进行 Southern杂交。采用二脱氧链终止方法对与探针DNA进行杂交的 DNA片段进行序列分析。

得到的DNA片段的碱基序列以及由此推导出的氨基酸序列显 示于序列表中的SEQ ID NO：1。

本发明还包括通过从显示于SEQ ID NO：1的序列缺失，替代或 迭加一个或多个氨基酸或核苷酸而得到的衍生物，条件是由该DNA 片段编码的多肽的Δ9脱氢酶活性不受影响。

然后检查该合成的基因与del C(A)的同源性从而识别出该基 因为Δ9脱氢酶基因族的一个新成员。该新基因在大肠杆菌中表达 后可以测定Δ9脱氢酶的活性。通过提取用离体基因转化的大肠杆 菌的膜，加入铁氧还蛋白，NADPH和硬脂酸，并且测定油酸的形成来 分析Δ9脱氢酶活性。

Knoell和Knappe，Eur.J.Biochem.50，245-252(1974) 报道了在大肠杆菌中存在铁氧还蛋白，一种电子供体。通过将该离 体基因连接到大肠杆菌的表达载体上，用诱导能编码Δ9脱氢酶的 DNA进行表达的载体转化大肠杆菌，并且检测产生的油酸，来证实酶 活性。

例如将合成的Δ9脱氢酶基因导入到植物细胞中后可以与能 在植物细胞中表达的一个启动子(如CaMV 35s等)以及一个终止 子(例如NOS等)相连接从而产生一个嵌合基因，然后将它连接至 大肠杆菌质粒(例如pUC19，pBR322等)上，扩增，并利用电击 穿方法导入到一种植物细胞中。通过将该基因连接到农杆菌的Ti 质粒或Ri质粒或通过利用这二种质粒作为二元载体，借助于农杆菌 还可以将该基因转移到多种植物中。基因转化后可导致脂肪酸组 分的变化以改善对低温的忍耐性。

本发明所述的蓝藻细菌的编码Δ9脱氢酶的基因可用于改善动 物，植物和微生物的脂肪酸组分并且通过转化可用于制备能忍受低 温的动物，植物或生物体。

下列实施例进一步阐明本发明，但本发明并不限制于这些实 施例，这些实施例包括在本发明范围中。

                         实施例

(1)Synechocystis PCC 6803基因组DNA的提取

将300ml的SynechocyStis PCC 6803(从巴斯德培养物收集 中心获得)培养物(730nm处的吸光率为5至10之间)以4,500×g离心 6分钟。收集1-2克细胞。向1克细胞中加入2ml碘化钠溶液(4克碘 化钠/2ml蒸馏水)并且通过振荡悬浮。将悬浮液在37℃培养20分 钟，并加入蒸馏水至终体积为40ml，将得到的溶液以10,000×g离 心10分钟。将沉淀加到10ml的DNA萃取缓冲液(50mM Tris-HCL( PH8.5)，50mM氯化钠和5mM EDTA)和1.5ml的溶菌酶溶液( 50mg/ml)中，并在37℃培养45分钟。向该混和物中加入1ml的10％(W/ V)N-十二烷酰肌氨酸，并且再保温20分钟，在此期间将破碎细胞溶 液吸移几次以便减少溶液的粘性。向该破碎细胞溶液中加入3ml的 溴化乙锭溶液(10mg/ml)，并且加入蒸馏水到最终重量为23克。向 该溶液中加入21克氯化铯并将混和物以45,000×g离心20小时。 通过与1-丁醇重复混和，从含有重新获得染色体DNA的溶液中除去 溴化乙锭后，将染色体DNA溶液在4升无菌水中透析90分钟。透析后， 用等体积的苯酚萃取得到的DNA，然后用等体积的氯仿萃取，并用乙 醇沉淀。通过离心收集沉淀的DNA，再用70％乙醇洗涤，干燥，并溶于 100μl缓冲溶液(10mM Tris-HCL(PH7.5)/0.1mM EDTA)中。

(2)筛选Synechocystis PCC 6803基因组文库。 用限制性内切酶Sau 3A部分消化Synechocystis PCC 6803基因组 DNA，并连接到噬菌体载体-λDASH II的Bam HI位点。在用大肠杆菌 感染含有Synechocystis PCC 6803基因组DNA的噬菌体后，利用异 项圈藻的des C基因的编码区的0.75kbDNA片段作为探针将2500噬 菌斑进行噬菌斑杂交。从与探针杂交的噬菌斑中选出22个克隆并 且提取噬菌体DNA。用Hind III消化Synechocystis PCC 6803的整 个基因组DNA并且利用上文中描述的同样探针进行Southern杂交分 析，最后检测到6.0kb谱带。在阳性克隆中，选出含有6.0kb Hind III片段再克隆到质粒模本II kS(+)的Hind III位点。

(3)Synechocystis PCC 6803的Δ9脱氢酶基因(desC)的分 离。

提取含有Hind III片段的质粒DNA，并利用限制性核酸内切酶 Pst I，Bam HI，EcoRI，SpeI和Apa I制备该DNA的物理图谱。而且， 用上述限制性核酸内切酶消化该质粒DNA并且利用含有在噬菌斑杂 交中使用的desC基因的DNA片段作为探针以限定一个同源区而完成 Sourthern杂交分析。

采用二脱氧链终止方法将该限定的区域进行测序从而找到了 由975个碱基组成的蛋白质编码区(下文中简称为＂ORF＂)。该基因 与异项圈藻的desC(A)有64％氨基酸同源。将各种蓝藻细菌的Δ12脱 氢酶基因进行比较结果为，Synechocystis PCC 6803(Wada et al. Nature，347，200-203(1990))与异项圈藻(Sakamoto et al，Plant. Mol.Biol.24，643-650(1994))有59％同源，与Synechococcus Pcc 7002(Sakamoto et al.Plant.Mol.Biol.24，643-650(1994))有 57％同源，上述情况表明在该分离到的ORF与异项圈藻的desC(A)之 间有高度同源性。该ORF与大鼠及酵母的硬脂酰CoA脱氢酶分别有 31％和30％同源性(大鼠Thiede et al.，J.Biol.Chem.261，13230 -13235(1986)；酵母：Stukey et al.，J.Biol.Chem.，265，20144 -20149)。从这些结果可得出结论，该分离到的ORF是 Synechocystis PCC 6803的Δ9脱氢酶基因(desC)。Synechocystis PCC 6803 desC的碱基序列和由此推导出的氨基酸序列列于序列 表中的SEQ ID NO：1。

(4)构建表达载体以及在大肠杆菌中表达Δ9脱氢酶

通过PCR扩增前面获得的含有desC的5′-半区域的0.5kb片段 并且连接到质粒模本II(pBS II)。将该DNA片段再克隆到含有 desC编码区的3′-半区域的质粒pBS II/H6上得到合成质粒pBS II /desC。用Spe I消化pBS II/desC并且将含有编码区的1.1kb DNA 片断连接到pET 3a载体的Nhe I位点，其中该DNA片段定位于T7噬菌 体启动子的下游，得到pET 3a/desC质粒。为了进行比较，将 pET3a/desC和不含desC基因的pET3a转化到大肠杆菌BL21(DE3) pLysS。将每个转化子培养于含有硬脂酸的LB培养基直到OD600为0. 6。并且在有或无1mM IPTG时继续培养1小时。通过离心收集细胞， 用1.2％Nacl溶液洗涤，并且通过离心再次收集。

(5)分析大肠杆菌单个脂类的脂肪酸组分

采用Bligh和Dyer的方法(Can.J.Biochem.Physiol，37，911 -917(1959))从收集到的大肠杆菌中提取脂类。采用在CHCL3/CH3OH/CH3COOH(65∶25∶10)展开的硅胶薄层层析法将提取到的脂类分 离为PE(磷脂酰乙醇胺)，PG(磷脂酰甘油)和CL(心磷脂)的单个脂类。 在分离之后，用小刀将含有单个脂类的硅胶刮下，在5％HCL/甲醇中 85℃进行甲醇分解5.5小时。用2ml的正已烷萃取合成的甲酯，浓 缩后，采用气相色谱法分离，测定单个脂类的含量(表1)。

在无硬脂酸的培养基中生长的大肠杆菌产生的所有脂类中的 硬脂酸的浓度低于1％。而在含有硬脂酸的培养基中生长时硬脂酸 浓度约10％。作为对照研究，在用pET3a转化的大肠杆菌中，IPTG诱 导前和后，油酸量并不增加，在任何单脂类中其含量低于2％(表1)。 另一方面，在用pET3a/desC转化的大肠杆菌中，由于IPTG的诱导作 用，油酸的量与诱导前相比增加到2-3倍(6-10％)(表1)。棕榈酸，棕 榈油酸16∶1(a)和异油酸18∶1(11)的量设有改变。

 表1将desC基因导入到大肠杆菌后

    在单个脂类中脂肪酸成分的改变 脂种类                                      脂肪酸

               14∶0    16∶0    16∶1(9)    18∶0    18∶1(9)    18∶1(11) 诱导作用之前                         (mol％) pET3a   PE(78％)         2        31±2    25±1       14±2    t           25±1   PG(21％)         1        27±2    17±1       16±1    1           36±1   CL(1％)          1        32±1    14±1       19±2    2           32±2 pET3a/decC   PE(80％)         3±1     34±1    24±1       10±1    2           26±1   PG(19％)         1        31±1    17±1       10±1    3±1        36±1   CL(1％)          0        30±1    11±1       10±2    5±1        39±1 IPTG诱导1小时 pET3a   PE(82％)         4±1     36±3    24±1       11±2    t           23±3   PG(17％)         1        30±2    15±1       14±1    1           39±1   CL(1％)          1        36±1    12±1       16±2    1           33±2 pET3a/desC   PE(74％)         3±1     33±1    24±1       9±1     6±1        24±1   PG(21％)         1        30±1    19±1       8±1     10±1       31±1   CL(5％)          1        27±1    18±1       8±1     10±1       36±1

表中数值是从三种单独培养的培养物获得的。

t：痕量(低于0.5％)

(6)分析甘油主链的各个结合位点的脂肪酸成分

采用上面描述的方法，从由IPTH诱导的大肠杆菌中提取脂肪 酸，由硅胶薄层层析法分离PE和PG。使用德列马根霉的脂酶，根据 Fischer等人的方法(Hoppe-Seyler′s Z。physiol.CHem.354， 1151-1123(1973))选择性地将它们水解。在甲醇分解后，采用 气相色谱测定脂肪酸甲基酯的量。

在用pET3a转化大肠杆菌的对照试验中，无论在PE或PG情况下， 在连接到甘油主链的C-1位脂肪酸中油酸的比例低于0.5％。另一方 面，在用pET3a/desc转化的大肠杆菌中，分别在PE或PG的情况，在连 接到甘油主链的C-1位的脂肪中油酸的比例分别增加到11％和18％( 表2)。但是，连接在C-2位点时没有区别。棕榈酸，棕榈油酸和异油 酸的比例没有改变。

上述这些结果表明，分离到的编码Δ9脱氢酶的基因将连接到 磷酯脂的C-1位的硬脂酸转化为不饱和酸(不管是极性残基与否)。

          表2在用desC基因转化的大肠杆菌

           细胞的单脂类中脂肪酸的位点分布 脂种类                                      脂肪酸 (位置)             14∶0    16∶0    16∶1(9)    18∶0    18∶1(9)    18∶1(11)

                                 (mol％) pET3a   PE(C-1)          1        68       6           16       t           5

(C-2)          3        4        42          6        1           41   PG(C-1)          1        51       12          16       t           20

(C-2)          1        8        18          11       3           58 pET3a/desC   PE(C-1)          1        61       7           9        11          11

(C-2)          3        5        41          9        1           37   PG(C-1)          1        51       16          1        18          14

(C-2)          1        7        22          18       2           48 表中数值是从三个独自培养的培养物获得的。数值的偏差为小于 2％。

t：痕量(小于0.5％)

参考实施例：编码异项圈藻Δ9脱氢酶的基因的分离

(1)基因组DNA的提取

将300ml的异项圈藻菌株M-3(从Institute of AppliedMicrobiology University of Tokyo获得)培养物(在 730nm处吸光度为5-10之间)以4,500×g离心6分钟。收集1-2克细 胞。向1克细胞中加入2ml的碘化钠溶液(4克碘化钠/2ml蒸馏水)， 并且振荡悬浮。将悬浮液在37℃保温20分钟，加入蒸馏水至终体 积为40ml，将最后的溶液以10,000×g离心10分钟。将沉淀重新 悬浮于10ml的DNA萃取缓冲液(50mM Tris-HCL(PH8.5)，50mM氯化 钠和5mMEDTA)和5ml的溶菌酶溶液(50mg/ml)，并在37℃保温45分钟。 向该混和物中加入1ml的10％(W/V)N-月桂酰肌氨酸，再保温20分钟， 此期间将破碎细胞溶液吸移几次以便降低该溶液的粘滞度。向该 破碎细胞溶液中加入3ml溴化乙锭溶液(10mg/ml)，加入蒸馏水到最 终重量为23克。向该溶液中加入21克氯化铯，并将该混和物以 45,000×g离心20小时。重复用正丁醇混和，从含有重新得到的的 染色体DNA的溶液中除去溴化乙锭之后，将该染色体DNA溶液在4升 蒸馏水中透析90分钟。透析完成之后，用等体积苯酚，然后用等体 积氯仿萃取得到的DNA，并用乙醇沉淀。通过离心收集沉淀的DNA并 用70％乙醇洗涤，干燥，并溶于100μl的缓冲液(10mM Tris-HCL( PH7.5)/0.1mMEDTA)。

(2)分离异项圈藻的Δ12脱氢酶基因(desA)

用限制性内切酶Sau 3A部分地消化按上述方法得到的异项圈 藻DNA，并连接到噬菌体载体-λDASH II的BamHI位点。将含有异项 圈藻的基因组DNA的λ噬菌体感染大肠杆菌之后，利用含有 Sycechocystis PCC 6803的Δ12脱氢酶基因(desA)的1.1kbHinc II-Spe I DNA片段作为探针对3.5×103噬菌斑进行噬菌斑杂交试 验。随机地从与该探针杂交的噬菌斑中选出三个克隆。提取噬菌 体DNA，用限制性核酸内切酶Hinc II消化，利用上面描述的相同探针 进行Southern杂交分析。在二个噬菌体DNA中，发现存在与该探针 杂交的2.1kb谱带。对其中之一进行检查进一步鉴定出所述基因。

鉴定基因按如下所述进行：用限制性核酸内切酶EcoR I消化 噬菌体DNA，并进行Southern杂交以证明一个7kb的片段与该探针同 源。将该7kb片段连接到在大肠杆菌和Synechococcus PCC7942之 间穿梭的穿梭载体pUC303(Kuhlemier et al.，Plasmid 10.156- 163(1983))的EcoR I位点从而获得pUC303/7-kb。

由于Synechococcus PCC 7942具有16∶0，16∶1，18∶0和18∶1的 脂肪酸，但不具有16∶2和18∶2的脂肪酸。该菌株被认为缺失了Δ 12脱氢酶基因。已有人报道，Synechococcus PCC 6803的desA基因 导入到Synechococcus PCC 7943导致产生16∶2和18∶2的不饱和脂 肪酸(Wada et al.，1990 ibid)。然后采用Williams & Szalay， Gene，24，37-51(1983)的方法用pUC303/7-kb转化Synechococcus PCC7942。将PCC7942培养于50ml的BG-11液体培养基中至浓度为 5-8×107/ml，并以4,500×g于室温下离心10分钟。用BG-11培养 基再次洗涤沉淀的细胞，通过离心收集，并重悬于BG-11培养基中至 终浓度为1-2×109个细胞/ml。向该0.1ml的细胞悬浮液中加入 0.1μg的DNA，在光照条件下缓慢振荡1小时。在含有10μg/ml的链 霉素的BG--11琼脂培养基中，以1-5×107个细胞/平板的密度在 黑暗中，30℃条件下将转化细胞生长16小时，进一步在光照条件下 生长8小时。将0.5ml的1mg/ml链霉素滴加到琼脂培养基之后，选择 出产生绿色信号的链霉素抗性转化细胞。

将转化体培养于100ml的BG-11培养基中，以4,500×g离心 10分钟并冻干。将干燥细胞加到含有5％HCL(W/W)的10ml甲醇中，并 在85℃加热2.5小时进行甲醇分解。用3ml的正己烷提取得到的脂 肪酸甲酯三次。通过蒸发移走正己烷后，将该样品再溶解于0.1ml 正己烷中。吸取该样品溶液的一份试样，通过气相色谱法分析该样 品的脂肪酸甲酯组分。

Synechococcus PCC 7942野生型菌株不含有不饱和的18∶2 脂肪酸，而用pUC303/7-kb转化的细胞产生的18∶2不饱和脂肪酸占 总脂肪酸的1％，因此，可以得出结论，异项圈藻的desA基因存在于7 -kbEcoR I片段中。

用限制性核酸内切酶Cla I，Spe I和Hind III消化7-kbEcoR I片段绘制物理图谱。而且，通过Sou thern杂交反应而鉴别与 Synechocystis PCC 6803的desA同源的区域，并且采用双脱氧链 终止方法进行测序。由于存在由1053个碱基组成的开放式阅读框 架(ORF)并且特别提到在该ORF的氨基酸序列中是有与 Synechocystis PCC 6803高度同源(大于80％)的三个区域，因此结 论是该ORF是异项圈藻的desA基因。

(3)分离异项圈藻的Δ9脱氢酶基因(desC(A))

对5′上游异项圈藻desA基因的碱基序列进行测定结果表明在 约1.2kb内存在由819个碱基组成的开放式阅读框架(ORF)。由于该 ORF产物的氨基酸序列与大鼠和酵母的硬脂酰CoA脱氢酶分别有31％ 和29％的同源性。从而可得出结论该ORF是异项圈藻的Δ9脱氢酶基 因(desC(A))。异项圈藻desC(A)的碱基序列以及由此推导出的氨 基酸序列描述于序列表的SEQ ID NO：2中。

                    序列表

(1)一般资料

  (i)申请人：TOHOKU ELECTRIC POWER COMPANY， INCORPORATED MITSUBISHI CORPORATION

      MITSUBI SHI KASEI CORPORATION

  (ii)发明名称：重组Δ9脱氢酶和编码该酶的基因

  (iii)序列数：2

  (iv)通讯的地址：

     (A)地址：TOHOKU ELECTRIC POWER COMPANY，

               INCORPORATED

     (B)街道：7-1，Ichibancho 3-chome，

                     Aoba-ku

     (C)城市：Sendai

     (D)国家：日本

     (E)邮编：980

  (V)计算机可读形式：

     (A)存储盘类型：Floppy盘

     (B)计算机：IBM PC兼容

     (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

     (D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.25

  (Vi)本申请资料：

     (A)申请号：

     (B)申请日：

     (C)分类：

  (Viii)代理人/代理机构资料：

     (A)姓名：

(2)SEQ ID NO：1的资料：

  (i)序列特征：

     (A)长度：957

     (B)类型：核酸

     (C)股数：双

     (D)几何结构：线性

  (ii)分子类型：基因组DNA

  (Vi)原始来源：

     (A)生物体：Synechocystis PCC 6803

  (ix)特征

     (A)姓名/关键词：CDS

     (B)位置：1..954

     (C)识别方法：S

  (Xi)序列描述：SEQ ID NO：1 ATG TTA AAC CCA TTA AAC ATT GAA TAC CTA TAT TTA AGC AAA CTT TTT      48 Met Leu Asn Pro Leu Asn Ile Glu Tyr Leu Tyr Leu Ser Lys Leu Phe GAC AAT AGT TTA ATC GTT TTT AAC AAG CGC CAA TTA TTC CGT TTT TTC      96 Asp Asn Ser Leu Ile Val Phe Asn Lys Arg Gln Leu Phe Arg Phe Phe GTT AGG TTT TTT TTC ATG ACT GCT GCT CTT CCC AAC GAT TCC AAG CCC      144 Val Arg Phe Phe Phe Met Thr Ala Ala Leu Pro Asn Asp Ser Lys Pro AAG TTG ACT CCA GCT TGG ACT GTG ATC TTC TTT TTT ACC TCC ATT CAT      192 Lys Leu Thr Pro Ala Trp Thr Val Ile Phe Phe Phe Thr Ser Ile His TTG GTG GCC CTG TTG GCT TTC CTG CCC CAG TTT TTC AGT TGG AAA GCA      246 Leu Val Ala Leu Leu Ala Phe Leu Pro Gln Phe Phe Ser Trp Lys Ala GTG GGG ATG GCT TTC TTG CTC TAT GTA ATT ACC GGC GGC ATT GGC ATT      288 Val Gly Met Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ile Thr Gly Gly Ile Gly Ile ACT TTA GGT TTT CAC CGT TGT ATT TCC CAC CGC AGT TTC AAT GTT CCT      336 Thr Leu Gly Phe His Arg Cys Ile Ser His Arg Ser Phe Asn Val Pro AAA TGG TTA GAG TAT ATT TTC GTA ATC TGT GGC ACC CTA GCC TGT CAG      384 Lys Trp Leu Glu Tyr Ile Phe Val Ile Cys Gly Thr Leu Ala Cys Gln GGG GGC GTA TTT GAG TGG GTC GGC TTA CAC CGT ATG CAC CAC AAA TTT      432 Gly Gly Val Phe Glu Trp Val Gly Leu His Arg Met His His Lys Phe TCT GAC ACC ACC CCG GAT CCC CAC GAT TCT AAT AAG GGT TTT TGG TGG      480 Ser Asp Thr Thr Pro Asp Pro His Asp Ser Asn Lys Gly Phe Trp Trp AGT CAC ATC GGC TGG ATG ATG TTT GAA ATT CCT GCT AAA GCT GAT ATT      528 Ser His Ile Gly Trp Met Met Phe Glu Ile Pro Ala Lys Ala Asp Ile CCC CGC TAC ACC AAG GAT ATC CAA GAC GAT AAA TTT TAT CAA TTT TGC      576 Pro Arg Tyr Thr Lys Asp Ile Gln Asp Asp Lys Phe Tyr Gln Phe Cys CAG AAT AAT CTA ATT CTT ATC CAG GTC GCC CTA GGC TTG ATT TTA TTT      624 Gln Asn Asn Leu Ile Leu Ile Gln Val Ala Leu Gly Leu Ile Leu Phe GCC TTA GGG GGC TGG CCC TTC GTT ATT TGG GGC ATT TTT GTC CGC CTA      672 Ala Leu Gly Gly Trp Pro Phe Val Ile Trp Gly Ile Phe Val Arg Leu GTG TTT GTT TTC CAC TTC ACT TGG TTT GTC AAC AGT GCC ACC CAT AAG      720 Val Phe Val Phe His Phe Thr Trp Phe Val Asn Ser Ala Thr His Lys TTC GGC TAC GTT AGC CAT GAA TCC AAT GAT TAT TCC CGC AAT TGT TGG      768 Phe Gly Tyr Val Ser His Glu Ser Asn Asp Tyr Ser Arg Asn Cys Trp TGG GTA GCA TTG TTA ACT TTC GGT GAA GGT TGG CAC AAT AAT CAC CAC      816 Trp Val Ala Leu Leu Thr Phe Gly Glu Gly Trp His Asn Asn His His GCC TAT CAG TAC TCT GCT CGC CAT GGT TTG CAA TGG TGG GAA GTG GAT      864 Ala Tyr Gln Tyr Ser Ala Arg His Gly Leu Gln Trp Trp Glu Val Asp TTA ACT TGG ATG ACC ATT AAA TTC CTA TCT TTG CTG GGG TTA GCC AAG      912 Leu Thr Trp Met Thr Ile Lys Phe Leu Ser Leu Leu Gly Leu Ala Lys GAT ATT AAA CTT CCT CCG GAA ACT GCG ATG GCC AAC AAA GCC TAG          957 Asp Ile Lys Leu Pro Pro Glu Thr Ala Met Ala Asn Lys Ala

(2)SEQ ID NO：2的资料：

  (i)序列特征：

     (A)长度：819

     (B)类型：核酸

     (C)股数：双

     (D)几何结构：线性

  (ii)分子类型：基因组DNA

  (Vi)原始来源：

     (A)生物体：异项圈藻

  (ix)特征

     (A)姓名/关键词：CDS

     (B)位置：1..816

     (C)识别方法：P

  (Xi)序列描述：SEQ ID NO：2 ATG ACA ATT GCT ACT TCA ACT AAA CCT CAA ATC AAC TGG GTA AAT ACC      48 Met Thr Ile Ala Thr Ser Thr Lys Pro Gln Ile Asn Trp Val Asn Thr CTA TTT TTC CTT GGG CTA CAC ATC GGC GCT TTG TTT GCC TTT ATC CCT      96 Leu Phe Phe Leu Gly Leu His Ile Gly Ala Leu Pha Ala Phe Ile Pro AGT AAC TTC AGC TGG GCG GCA GTT GGT GTG GCT TTA TTG CTT TAC TGG      144 Ser Asn Phe Ser Trp Ala Ala Val Gly Val Ala Leu Leu Leu Tyr Trp ATC ACT GGT GGT TTG GGT ATT ACC TTA GGC TTT CAT CGC CTT GTT ACC      192 Ile Thr Gly Gly Leu Gly Ile Thr Leu Gly Phe His Arg Leu Val Thr CAC CGC AGT TTT CAG ACT CCC AAG TGG TTG GAA TAT TTT CTA GTG CTT      240 His Arg Ser Phe Gln Thr Pro Lys Trp Leu Glu Tyr Phe Leu Val Leu TGC GGG ACT CTC GCT TGT CAA GGA GGG CCA ATC GAG TGG GTC GGT ACA      288 Cys Gly Thr Leu Ala Cys Gln Gly Gly Pro Ile Glu Trp Val Gly Thr CAT CGC ATT CAT CAT TTA CAT TCC GAT ACT GAT CCA GAT CCC CAT GAT      336 His Arg Ile His His Leu His Ser Asp Thr Asp Pro Asp Pro His Asp TCT AAT AAA GGT TTC TGG TGG AGC CAT ATT GGT TGG CTA ATT TAT CAC      384 Ser Asn Lys Gly Phe Trp Trp Ser His Ile Gly Trp Leu Ile Tyr His TCT CCC TCC CAC GCT GAT GTT CCT CGG TTC ACC AAA GAT ATT GCC GAA      432 Ser Pro Ser His Ala Asp Val Pro Arg Phe Thr Lys Asp Ile Ala Glu GAC CCA GTC TAT CAG TTT TTA CAG AAA TAT TTC ATT TTT ATC CAG ATT      480 Asp Pro Val Tyr Gln Phe Leu Gln Lys Tyr Phe Ile Phe Ile Gln Ile GCT CTG GGG TTG TTG CTG TTA TAT CTA GGC GGG TGG TCT TTT GTG GTC      528 Ala Leu Gly Leu Leu Leu Leu Tyr Leu Gly Gly Trp Ser Phe Val Val TGG GGA GTT TTC TTT CGC ATC GTT TGG GTT TAC CAC TGT ACT TGG TTG      576 Trp Gly Val Phe Phe Arg Ile Val Trp Val Tyr His Cys Thr Trp Leu GTA AAC AGC GCT ACC CAT AAG TTT GGC TAC CGC ACC TAT GAT GCT GGT      624 Val Asn Ser Ala Thr His Lys Phe Gly Tyr Arg Thr Tyr Asp Ala Gly GAC AGA TCC ACT AAC TGT TGG TGG GTA GCT GTC CTA GTG TTT GGT GAA      672 Asp Arg Ser Thr Asn Cys Trp Trp Val Ala Val Leu Val Phe Gly Glu GGT TGG CAC AAC AAC CAC CAC GCT TTT CAA TAT TCA GCT CGT CAC GGG      720 Gly Trp His Asn Asn His His Ala Phe Gln Tyr Ser Ala Arg His Gly TTG GAA TGG TGG GAA GTT GAT CTG ACT TGG ATG ACA GTG CAA TTG CTG      768 Leu Glu Trp Trp Glu Val Asp Leu Thr Trp Met Thr Val Gln Leu Leu CAA ATA CTC GGT TTA GCA ACT AAT GTC AAA CTA GCA GAC AAA AAG CAG      816 Gln Ile Leu Gly Leu Ala Thr Asn Val Lys Leu Ala Asp Lys Lys Gln TAA                                                                  819