原生藻菌的转化方法 |
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| 申请号 | CN201180058322.6 | 申请日 | 2011-09-30 | 公开(公告)号 | CN103415611B | 公开(公告)日 | 2016-08-10 |
| 申请人 | 国立大学法人九州大学; 国立大学法人宫崎大学; 学校法人甲南学园; 日本水产株式会社; | 发明人 | 坂口圭史; 滨口理惠; 松田高宜; 伊东信; 长野直树; 林雅弘; 本多大辅; 冲田裕司; 杉本慎一; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供一种通过基因工程破坏基因或者抑制基因表达来得到不饱和 脂肪酸 产生能 力 提高的原生藻菌的转化方法。所述原生藻菌的转化方法其特征在于，所述原生藻菌的转化方法为通过基因工程对原生藻菌的基因进行破坏或者表达抑制，特别是来自原生藻菌的选自金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）、Parietichytrium sarkarianum、破囊壶菌（Thraustochytrium roseum）或者Parietichytrium sp.中的被破坏或抑制表达的基因是脂肪酸 生物 合成相关基因。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种原生藻菌的转化方法，其特征在于， |
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| 说明书全文 | 原生藻菌的转化方法技术领域[0001] 本发明涉及原生藻菌的转化方法，其特征在于，通过基因工程对原生藻菌的基因进行破坏和/或表达抑制。特别是，涉及对脂肪酸生物合成相关基因进行破坏和/或表达抑制的转化方法、由此进行的原生藻菌的脂肪酸组成的改变方法、使原生藻菌中积蓄大量脂肪酸的方法以及不饱和脂肪酸含量增加的原生藻菌、从这些不饱和脂肪酸含量增加的原生藻菌中生产不饱和脂肪酸的方法等。 背景技术[0002] 多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）是动物以及人类的营养中的重要成分。由于如二十碳五烯酸（EPA）或者二十二碳六烯酸（DHA）这样的ω3多不饱和脂肪酸（也称为n-3多不饱和脂肪酸）在包括幼儿大脑的发育、眼睛的机能、激素以及其它的信号物质的合成以及心血管障碍、癌症和糖尿病的预防在内的健康状况方面产生各种作用（非专利文献1、2），因此，这些多不饱和脂肪酸是人类的营养中的重要成分。基于上述理由，制造多不饱和脂肪酸成为必要。 [0003] 另一方面，已知被分类为网粘菌（Labyrinthula）类的微生物可以制造多不饱和脂肪酸。在属于破囊壶菌科的微生物中，已经报道有使用裂殖壶菌属的微生物的含有多不饱和脂肪酸的磷脂的制造方法（专利文献1），具有二十二碳六烯酸生产能力的破囊壶菌（Thraustochytrium）属的微生物（专利文献2）等。由于这些不饱和脂肪酸使得强化食物和/或饲料成为可能，因此，特别需要这些不饱和脂肪酸的，特别是在真核生物体系中的简便并且经济的制造方法。 [0004] 在网粘菌类中，作为外源基因的导入方法，已经报道有对于裂殖壶菌（Schizochytrium）属的特定的菌株（在现有的分类体系（非专利文献3）中属于 Aurantiochytrium属（非专利文献4））的方法（专利文献3、4）。另外，作为通过转化使脂肪酸组成发生变化的方法，已知有破坏聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS）基因，其结果脂肪酸组成有变化的例子（非专利文献5），但是，至今未知有操作构成延长酶（elongase）/去饱和酶路径的酶来使脂肪酸组成变化的报道。在这样的状况下，本发明者们发现：将延长酶/去饱和酶基因导入各种网粘菌类中，使脂肪酸组成发生变化，并且已经进行了专利申请（专利文献5）。 [0005] 现有技术文献 [0006] 专利文献 [0007] 专利文献1：日本特开2007-143479号公报 [0008] 专利文献2：日本特开2005-102680号公报 [0009] 专利文献3：日本特开2006-304685号公报 [0010] 专利文献4：日本特开2006-304686号公报 [0011] 专利文献5：国际专利公开WO2011/037207号公报 [0012] 专利文献6：国际专利公开WO1997/011094号公报 [0013] 专利文献7：美国专利公开US2005/0014231号公报 [0014] 专利文献8：日本特表2007-532104号公报 [0015] 非专利文献 [0016] 非专利文献1：Poulos A.,Lipids,30,1-14(1995) [0017] 非专利文献2：Horrocks L.A.and Yeo Y.K.,Pharmacol Res.,40,211-225(1999)[0018] 非专利文献3：Yokoyama R.,Honda D.,Mycoscience,48,199-211(2007) [0019] 非专利文献4：第60届日本生物工学会大会演讲要点集，p136(2008) [0020] 非专利文献5：Lippmeier J.C.et al.,Lipids,44(7),621-630(2009) [0021] 非专利文献6：Tonon T.et al.,FEBS Lett.,553,440-444(2003) [0022] 非专利文献7：Thompson J.D.et al.,Nucleic Acids Res.,22,4673-4680(1994)[0023] 非专利文献8：Yazawa K.,Lipids,31,Supple.297-300(1996) [0024] 非专利文献9：Jiang X.et al.,Wei Sheng Wu Xue Bao.,48(2),176-183(2008)[0025] 非专利文献10：PEREIRA S.L.et al.,Biochem.J.,378,665-671(2004) [0026] 非专利文献11：Prasher D.C.et al.,Gene,111(2),229-233(1992) [0027] 非专利文献12：Chalfie M.et al.,Science,263,802-805(1994) [0028] 非专利文献13：Southern P.J.,and Berg,P.,J.Molec.Appl.Gen.,1,327-339(1982) [0029] 非专利文献14：Saitou N.et al.,Mol.Biol.Evol.,4,406-425(1987) [0030] 非专利文献15：Ausubel F.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Unit 13(1994) [0031] 非专利文献16：Guthrie C.,Fink G.et al.,Methods in Enzymology：Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Volume 194(1991) [0032] 非专利文献17：Abe E.,et al.,J.Biochem,142,31561-31566(2006) [0033] 非专利文献18：《生物实验说明第2卷基因分析的基础》，p117-128，秀润社，1995年发行 [0034] 非专利文献19：日本农艺化学会会志,77,2,150-153(2003) [0035] 非专利文献20：《生物实验说明第2卷基因分析的基础》，p63-68，秀润社，1995年发行 [0036] 非专利文献21：Sanger,F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci,74,5463(1977) [0037] 非专利文献22：Meyer,A.,et al.J.Lipid Res.,45,1899-1909(2004) [0038] 非专利文献23：Cigan and Donahue,1987;Romanos et al.,1992 [0039] 非专利文献24：Qiu,X.,et al.J.Biol.Chem.,276,31561-6(2001) 发明内容[0041] 发明所要解决的技术问题 [0042] 本发明的目的在于，为了提高原生藻菌的有用物质的产生能力而通过基因工程对原生藻菌的基因进行破坏和/或表达抑制来进行转化。本发明的目的在于，通过基因工程对原生藻菌的有用物质的产生所涉及的基因进行破坏和/或表达抑制，改变有用物质的产生能力，由此提供改变原生藻菌产生的脂肪酸组成的方法、使原生藻菌中积蓄大量脂肪酸的方法、不饱和脂肪酸的制造方法、不饱和脂肪酸含量增加的原生藻菌、由这些不饱和脂肪酸含量增加的原生藻菌生产不饱和脂肪酸。根据本发明，可以提供改变原生藻菌产生的脂肪酸组成以及使原生藻菌积蓄大量脂肪酸的方法，从而能够高效地制造多不饱和脂肪酸。 [0043] 解决技术问题的技术手段 [0044] 本发明者们鉴于上述现有技术的情况专心研究，其结果，为了提高原生藻菌产生多不饱和脂肪酸的能力，通过基因工程对原生藻菌的基因进行破坏和/或表达抑制来进行转化上取得了成功，进一步，发现了通过基因工程对原生藻菌的基因进行破坏和/或表达抑制来进行原生藻菌产生的脂肪酸组成的改变的方法，以及使该转化原生藻菌中积蓄大量不饱和脂肪酸的方法，并通过进一步深入进行其实用化的研究、开发，至此完成本发明。 [0045] 本发明的主要内容是以下的（1）至（12）所记载的原生藻菌的转化方法。 [0046] （1）一种原生藻菌的转化方法，其特征在于，所述原生藻菌的转化方法为通过基因工程对原生藻菌的基因进行破坏和/或表达抑制。 [0047] （2）上述（1）所述的原生藻菌的转化方法，其中，原生藻菌为网粘菌类。 [0048] （3）上述（2）所述的原生藻菌的转化方法，其中，网粘菌类为属于网粘菌属（Labyrinthula）、交链孢霉属（Althornia）、Aplanochytrium属、Japonochytrium属、Labyrinthuloides属、裂殖壶菌属（Schizochytrium）、Aurantiochytrium属、破囊壶菌属（Thraustochytrium）、吾肯氏壶菌属（Ulkenia）、Oblongichytrium属、Botryochytrium属、Parietichytrium属或者Sicyoidochytrium属的微生物。 [0049] （4）上述（3）所述的原生藻菌的转化方法，其中，微生物为金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）、Parietichytrium sarkarianum、破囊壶菌（Thraustochytrium roseum）、Parietichytrium sp.或者裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）。 [0050] （5）上述（4）所述的原生藻菌的转化方法，其中，微生物为金黄色破囊壶菌ATCC 34304、Parietichytrium sarkarianum SEK 364（FERM BP-11298）、破囊壶菌ATCC 28210、Parietichytrium sp.SEK358（FERM BP-11405）、Parietichytrium sp.SEK571（FERM BP- 11406）或者裂殖壶菌TY12Ab（FERM ABP-11421）。 [0051] （6）上述（1）～（5）中任一项所述的原生藻菌的转化方法，其中，原生藻菌的基因是脂肪酸生物合成相关基因。 [0052] （7）上述（6）所述的原生藻菌的转化方法，其中，脂肪酸生物合成相关基因为与聚酮合成酶、脂肪酸链长伸长酶和/或脂肪酸不饱和化酶相关的基因。 [0053] （8）上述（7）所述的原生藻菌的转化方法，其中，脂肪酸链长伸长酶为C20延长酶。 [0054] （9）上述（7）所述的原生藻菌的转化方法，其中，脂肪酸不饱和化酶为Δ12去饱和酶。 [0055] （10）上述（1）～（9）中任一项所述的原生藻菌的转化方法，其特征在于，通过基因工程对原生藻菌的基因进行破坏的方法为，通过电穿孔或者基因枪法导入功能缺损型的基因或者缺失编码基因的区域的DNA片段。 [0056] （11）上述（1）～（10）中任一项所述的原生藻菌的转化方法，其特征在于，通过基因工程对原生藻菌的基因进行表达抑制的方法为反义法或者RNA干涉。 [0057] （12）上述（1）～（11）中任一项所述的原生藻菌的转化方法，其特征在于，进一步导入与脂肪酸不饱和化酶相关的基因。 [0058] （13）上述（12）所述的原生藻菌的转化方法，其中，与脂肪酸不饱和化酶相关的基因为ω3去饱和酶。 [0059] 另外，本发明的主要内容是以下的（14）至（26）中记载的原生藻菌的脂肪酸组成的改变方法。 [0060] （14）一种原生藻菌的脂肪酸组成的改变方法，其特征在于，所述原生藻菌的脂肪酸组成的改变方法为通过基因工程对原生藻菌的基因进行破坏和/或表达抑制。 [0061] （15）上述（14）所述的原生藻菌的脂肪酸组成的改变方法，其中，原生藻菌为网粘菌类。 [0062] （16）上述（15）所述的原生藻菌的脂肪酸组成的改变方法，其中，网粘菌类为属于网粘菌属（Labyrinthula）、交链孢霉属（Althornia）、Aplanochytrium属、Japonochytrium属、Labyrinthuloides属、裂殖壶菌属（Schizochytrium）、Aurantiochytrium属、破囊壶菌属（Thraustochytrium）、吾肯氏壶菌属（Ulkenia）、Oblongichytrium属、Botryochytrium属、Parietichytrium属或者Sicyoidochytrium属的微生物。 [0063] （17）上述（16）所述的原生藻菌的脂肪酸组成的改变方法，其中，微生物为金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）、Parietichytrium sarkarianum、破囊壶菌（Thraustochytrium roseum）、Parietichytrium sp.或者裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）。 [0064] （18）上述（17）所述的原生藻菌的脂肪酸组成的改变方法，其中，微生物为金黄色破囊壶菌ATCC34304、Parietichytrium sarkarianum SEK364（FERM BP-11298）、破囊壶菌ATCC28210、Parietichytrium sp.SEK358（FERM BP-11405）、Parietichytrium sp.SEK571（FERM BP-11406）或者裂殖壶菌TY12Ab（FERM ABP-11421）。 [0065] （19）上述（14）～（18）中任一项所述的原生藻菌的脂肪酸组成的改变方法，其中，原生藻菌的基因为脂肪酸生物合成相关基因。 [0066] （20）上述（19）所述的原生藻菌的脂肪酸组成的改变方法，其中，脂肪酸生物合成相关基因为与聚酮合成酶、脂肪酸链长伸长酶和/或脂肪酸不饱和化酶相关的基因。 [0067] （21）上述（20）所述的原生藻菌的脂肪酸组成的改变方法，其中，脂肪酸链长伸长酶为C20延长酶。 [0068] （22）上述（21）所述的原生藻菌的脂肪酸组成的改变方法，其中，脂肪酸不饱和化酶为Δ12去饱和酶。 [0069] （23）上述（14）～（22）中任一项所述的原生藻菌的脂肪酸组成的改变方法，其特征在于，通过基因工程对原生藻菌的基因进行破坏的方法为，通过电穿孔或者基因枪法导入功能缺损型的基因或者缺失编码基因的区域的DNA片段。 [0070] （24）上述（14）～（23）中任一项所述的原生藻菌的脂肪酸组成的改变方法，其特征在于，通过基因工程对原生藻菌的基因进行表达抑制的方法为反义法或者RNA干涉。 [0071] （25）上述（14）～（24）中任一项所述的原生藻菌的脂肪酸组成的改变方法，其特征在于，进一步导入与脂肪酸不饱和化酶相关的基因。 [0072] （26）上述（25）所述的原生藻菌的脂肪酸组成的改变方法，其中，与脂肪酸不饱和化酶相关的基因为ω3去饱和酶。 [0073] 另外，本发明的主要内容是以下的（27）至（29）中记载的使原生藻菌中积蓄大量脂肪酸的方法。 [0074] （27）一种使原生藻菌中积蓄大量脂肪酸的方法，其中，通过上述（14）～（26）中任一项所述的方法使原生藻菌中积蓄大量脂肪酸。 [0075] （28）上述（27）所述的方法，其中，脂肪酸为不饱和脂肪酸。 [0076] （29）上述（28）所述的方法，其中，不饱和脂肪酸为碳原子数为18～22的不饱和脂肪酸。 [0077] 另外，本发明以以下的（30）中记载的脂肪酸为要点。 [0078] （30）一种脂肪酸，其中，所述脂肪酸从通过上述（27）～（29）中任一项所述的方法得到的积蓄有大量脂肪酸的原生藻菌中取得。 [0079] 另外，本发明的主要内容是以下的（31）至（43）中记载的经过转化的原生藻菌。 [0080] （31）一种原生藻菌，其中，所述原生藻菌以脂肪酸组成的改变为目的通过基因工程对该基因进行破坏和/或表达抑制来被转化。 [0081] （32）上述（31）所述的原生藻菌，其中，所述原生藻菌为网粘菌类。 [0082] （33）上述（32）所述的原生藻菌，其中，网粘菌类为属于网粘菌属（Labyrinthula）、交链孢霉属（Althornia）、Aplanochytrium属、Japonochytrium属、Labyrinthuloides属、裂殖壶菌属（Schizochytrium）、Aurantiochytrium属、破囊壶菌属（Thraustochytrium）、吾肯氏壶菌属（Ulkenia）、Oblongichytrium属、Botryochytrium属、Parietichytrium属或者Sicyoidochytrium属的微生物。 [0083] （34）上述（33）所述的原生藻菌，其中，微生物为金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）、Parietichytrium sarkarianum、破囊壶菌 （Thraustochytrium roseum）、Parietichytrium sp.或者裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）。 [0084] （35）上述（34）所述的原生藻菌，其中，微生物为金黄色破囊壶菌ATCC 34304、Parietichytrium sarkarianum SEK 364（FERM BP-11298）、破囊壶菌ATCC 28210、Parietichytrium sp.SEK358（FERM BP-11405）、Parietichytrium sp.SEK571（FERM BP-11406）或者裂殖壶菌TY12Ab（FERM ABP-11421）。 [0085] （36）上述（31）～（35）中任一项所述的原生藻菌，其中，原生藻菌的基因为脂肪酸生物合成相关基因。 [0086] （37）上述（36）所述的原生藻菌，其中，脂肪酸生物合成相关基因为与聚酮合成酶、脂肪酸链长伸长酶和/或脂肪酸不饱和化酶相关的基因。 [0087] （38）上述（36）所述的原生藻菌，其中，脂肪酸链长伸长酶为C20延长酶。 [0088] （39）上述（37）所述的原生藻菌，其中，脂肪酸不饱和化酶为Δ12去饱和酶。 [0089] （40）上述（31）～（39）中任一项所述的原生藻菌，其特征在于，通过基因工程对原生藻菌的基因进行破坏的方法为，通过电穿孔或者基因枪法导入功能缺损型的基因或者缺失编码基因的区域的DNA片段。 [0090] （41）上述（31）～（40）中任一项所述的原生藻菌，其特征在于，通过基因工程对原生藻菌的基因进行表达抑制的方法为反义法或者RNA干涉。 [0091] （42）上述（31）～（41）中任一项所述的原生藻菌，其特征在于，进一步导入与脂肪酸不饱和化酶相关的基因。 [0092] （43）上述（42）所述的原生藻菌，其中，与脂肪酸不饱和化酶相关的基因为ω3去饱和酶。 [0093] 发明的效果 [0094] 根据本发明，目的在于，为了提高原生藻菌的有用物质的产生能力而通过基因工程对原生藻菌的基因进行破坏和/或表达抑制来进行转化。通过基因工程对原生藻菌的有用物质的产生所涉及的基因进行破坏和/或表达抑制来改变有用物质的产生能力，可以提供使原生藻菌中积蓄大量脂肪酸的方法、不饱和脂肪酸的制造方法、不饱和脂肪酸含量增加的原生藻菌、由这些不饱和脂肪酸含量增加的原生藻菌生产不饱和脂肪酸、改变原生藻菌产生的脂肪酸组成以及使原生藻菌中积蓄大量脂肪酸的方法，从而能够高效地制造多不饱和脂肪酸。附图说明 [0095] 图1表示实施例2-2中的扩增来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304（T.aureum ATCC 34304）的延长酶基因的RACE的结果。[符号的简单说明]1：使用合成套头特异性寡核苷酸、以及简并寡核苷酸elo-R的5’-RACE；2：使用合成套头特异性寡核苷酸、以及简并寡核苷酸elo-F的3’-RACE；3：仅使用elo-R的5’-RACE（阴性对照）；4：仅使用elo-F的3’-RACE（阴性对照）；5：仅使用合成套头特异性寡核苷酸的5’-RACE（阴性对照）；6：仅使用合成套头特异性寡核苷酸的3’-RACE（阴性对照）。 [0096] 图2表示实施例2-3中的来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304（T.aureum ATCC34304）的Δ6/Δ9延长酶以及Δ5/Δ6延长酶（TaELO1和TaELO2）的分子系统树。 [0097] 图3表示实施例2-8中的导入了KONeor的转化体的评价。（A）表示将基因组DNA作为模板通过PCR进行的转化体的评价中使用的寡核苷酸引物对。[符号的简单说明]（1）Neor检测引物（SNeoF和SNeoR）（；2）KO确认1（KO Pro F SmaI和KO Term R SmaI）；（3）KO确认2（E2 KO ProF EcoRV和SNeoR）；（4）EO确认3（SNeoF和E2KO Term R EcoRV）；（5）TaELO2检测（E2 HindIII和E2 XbaI）。（B）表示将基因组DNA作为模板通过PCR进行的转化体的评价中的琼脂糖电泳图。[符号的简单说明]1、5、9、13、17：转化体；2、6、10、14、18：野生菌株；3、7、11、15、19：将KONeor作为模板；4、8、12、16：没有模板；另外，在泳道序号上记载有使用的寡核苷酸引物对（1）～（5）。 [0098] 图4表示实施例2-9中的通过印迹杂交（Southern blotting）确认TaELO2的复制数的结果。[符号的简单说明]1：基因组DNA（2.5μg），BamHi处理；2：BglII处理；3：EcoRI处理；4：EcoRV处理；5：HindIII处理；6：KpnI处理；7：SmaI处理；8：XbaI处理；9：阳性对照（positive control）（用1ng的E2 KO ProF EcoRV和E2 KO Term R EcoRV扩增的PCR产物。 包含TaELO2）。 [0099] 图5表示实施例2-10中的导入了TKONeor的转化体通过印迹杂交进行的评价。（A）检测野生型等位基因或者TKONeor导入产生的变异等位基因的印迹杂交的模式图。（B）表示印迹杂交的结果。[符号的简单说明]1：金黄色破囊壶菌野生菌株（2.5μg的基因组DNA）；2、3：TKONeor导入转化体（2.5μg的基因组DNA）；4：阳性对照（用50ng的E2 KO ProF EcoRV和E2KO Term R EcoRV扩增的PCR产物。包含TaELO2）。 [0100] 图6表示实施例2-12中将再导入KOub600Hygr得到的转化体的基因组DNA作为模板通过PCR进行的评价。（A）表示使用的寡核苷酸引物对。[符号的简单说明（] 1）TaELO2 ORF检测（SNeoF和SNeoR）；（2）KO确认（E2 KO Pro F EcoRV和ubi-hygro R）。（B）使用KO确认的寡核苷酸引物对（1）的PCR的琼脂糖电泳图。箭形符号表示确认有特异性产物的扩增，推断为TaELO2缺损纯合子的转化体。（C）表示在鉴定为TaELO2缺损纯合子的转化体中，使用TaELO2 ORF检测的寡核苷酸引物对（2）的PCR的琼脂糖电泳图。[符号的简单说明]1：将KOub600Hygr作为模板；2：野生株。 [0101] 图7表示实施例2-12中再导入KOub600Hygr得到的转化体通过印迹杂交进行的评价。（A）表示检测野生型等位基因、KONeor导入产生的变异等位基因、以及KOub600Hygr导入产生的变异等位基因的印迹杂交的模式图。（B）表示印迹杂交的结果。[符号的简单说明]1、9：野生株2-8；以及10-16：TaELO2缺损纯合子。 [0102] 图8表示实施例2-12中检测TaELO2的印迹杂交的结果。[符号的简单说明]1：野生株2-5：T TaELO2缺损纯合子。 [0103] 图9表示实施例2-12中检测TaELO2 mRNA的RT-PCR的琼脂糖电泳的结果。[符号的简单说明]1-4：TaELO2缺损纯合子；5：野生菌株6-9：TaELO2缺损纯合子，将总RNA作为模板（阴性对照）；10：野生菌株，将总RNA作为模板（阴性对照）；11：将野生菌株基因组DNA作为模板（阳性对照）。 [0104] 图10表示实施例2-13中野生菌株以及TaELO2缺损纯合子的脂肪酸组成比较的结果。 [0105] 图11表示含有亚克隆的来自pcDNA 3.1 Myc-His载体的SV40终止子序列的质粒。 [0106] 图12表示融合PCR中使用的引物和产物的模式图。最终产物为来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304（Thraustochytrium aureum ATCC34304）的ubiquitin启动子和人工合成新霉素抗性基因融合后的序列。 [0107] 图13表示制得的人工合成新霉素抗性基因的BglII盒。 [0108] 图14表示融合PCR中使用的引物和产物的模式图。最终产物为来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的ubiquitin启动子和来自pcDNA3.1/Hygro的潮霉素抗性基因融合后的序列。 [0109] 图15表示制得的来自pcDNA 3.1/Hygro的潮霉素抗性基因的BglII盒。 [0110] 图16表示含有克隆的Parietichytrium属C20延长酶序列的质粒。 [0111] 图17表示在图16记载的质粒的Parietichytrium属C20延长酶序列中插入BglII位点的质粒。 [0112] 图18表示制得的Parietichytrium属C20延长酶基因打靶载体（2种）。作为抗药性标记，具有新霉素抗性基因（pRH85）或者潮霉素抗性基因（pRH86）。 [0113] 图19表示显示Parietichytrium sarkarianum SEK364的C20延长酶基因破坏菌株鉴定中使用的PCR用引物的位置以及预想的产物的模式图。 [0114] 图20表示将Parietichytrium sarkarianum SEK364基因组DNA作为模板通过PCR进行的C20延长酶基因破坏的评价。[符号的说明]+/+：Parietichytrium sarkarianum SEK364野生型菌株；+/-：来自Parietichytrium sarkarianum SEK364的C20延长酶基因第1条等位基因同源重组体；-/-：来自Parietichytrium sarkarianum SEK364的C20延长酶基因破坏菌株。 [0115] 图21表示Parietichytrium sarkarianum SEK364野生型菌株以及C20延长酶基因破坏菌株的脂肪酸组成的比较。白柱和黑柱分别表示野生型菌株和基因破坏菌株的脂肪酸组成。其值为平均值±标准差的值。 [0116] 图22表示将Parietichytrium sarkarianum SEK364野生型菌株作为100%时的C20延长酶基因破坏菌株的脂肪酸比例。 [0117] 图23表示融合PCR中使用的引物和产物的模式图。最终产物为来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的18S rDNA、来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的EF1α启动子、人工合成新霉素抗性基因以及来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的EF1α终止子融合后的序列。 [0118] 图24表示克隆图23中连接的DNA片段的一部分后的质粒。包含来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的18S rDNA的靠EcoRI位点3’侧的一部分序列、来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的EF1α启动子、人工合成新霉素抗性基因、以及来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的EF1α终止子的靠NcoI位点5’侧的一部分序列。 [0119] 图25表示制得的金黄色破囊壶菌ATCC 34304 PKS路径关联基因orfA的打靶载体。作为抗药性标记，具有新霉素抗性基因。 [0120] 图26表示包含金黄色破囊壶菌ATCC 34304 PKS路径关联基因orfA的上游序列、来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的ubiquitin启动子、潮霉素抗性基因的质粒。 [0121] 图27表示制得的金黄色破囊壶菌ATCC 34304 PKS路径关联基因orfA的打靶载体。作为抗药性标记，具有潮霉素抗性基因。 [0122] 图28表示显示金黄色破囊壶菌ATCC 34304的PKS路径关联基因orfA破坏菌株鉴定中使用的印迹杂交分析用探针的位置、以及表示预想的基因片段的尺寸的模式图。 [0123] 图29表示显示使用金黄色破囊壶菌ATCC 34304基因组DNA通过印迹杂交法进行的PKS路径关联基因orfA基因破坏的评价。[符号的说明]T.au：金黄色破囊壶菌ATCC 34304野生型菌株；+/-：来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的PKS路径关联基因orfA第1条等位基因同源重组体；-/-：来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的PKS路径关联基因orfA基因破坏菌株。 [0124] 图30表示金黄色破囊壶菌ATCC 34304野生型菌株以及PKS路径关联基因orfA基因破坏菌株的脂肪酸组成的比较。白柱和黑柱分别表示野生型菌株和基因破坏菌株的脂肪酸组成。其值为平均值±标准差的值。 [0125] 图31表示将金黄色破囊壶菌ATCC 34304野生型菌株作为100%时的PKS路径关联基因orfA基因破坏菌株的脂肪酸比例。 [0126] 图32表示融合PCR中使用的引物和产物的模式图。最终产物为来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的ubiquitin启动子和来自pTracer-CMV/Bsd/lacZ的杀稻瘟菌素抗性基因融合后的序列。 [0127] 图33表示制得的来自pTracer-CMV/Bsd/lacZ的杀稻瘟菌素抗性基因BglII盒。 [0128] 图34表示融合PCR中使用的引物和产物的模式图。最终产物为来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的ubiquitin启动子和增强型GFP基因（clontech公司制造）融合后的序列。 [0129] 图35表示融合PCR中使用的引物和产物的模式图。最终产物为来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的ubiquitin启动子、增强型GFP基因（clontech公司制造）以及来自pcDNA3.1 Zeo（+）的Zeocin抗性基因融合后的序列。 [0130] 图36表示制得的增强型GFP-Zeocin抗性融合基因的BglII盒。 [0131] 图37表示含有克隆的金黄色破囊壶菌ATCC 34304 C20延长酶序列以及周边序列的质粒。 [0132] 图38表示在图37记载的质粒中使金黄色破囊壶菌ATCC 34304C20延长酶序列完全地缺失并且插入BglII位点的质粒。 [0133] 图39表示制得的金黄色破囊壶菌ATCC 34304 C20延长酶基因打靶载体（2种）。作为抗药性标记，具有杀稻瘟菌素抗性基因（pRH43）或者增强型GFP-Zeocin抗性融合基因（pRH54）。 [0134] 图40表示在金黄色破囊壶菌ATCC 34304 PKS路径（orfA基因）破坏菌株的C20延长酶基因破坏菌株的鉴定中使用的印迹杂交分析用探针的位置、以及表示预想的基因片段的尺寸的模式图。 [0135] 图41表示使用金黄色破囊壶菌ATCC 34304基因组DNA通过印迹杂交法进行的C20延长酶基因破坏的评价。[符号的说明]T.au：金黄色破囊壶菌ATCC 34304野生型菌株；-/-：来自金黄色破囊壶菌ATCC34304的PKS路径（orfA基因）和C20延长酶基因的双重破坏菌株。 [0136] 图42表示金黄色破囊壶菌ATCC 34304野生型菌株以及PKS路径（orfA基因）与C20延长酶基因的双重破坏菌株的脂肪酸组成的比较。白柱和黑柱分别表示野生型菌株和基因破坏菌株的脂肪酸组成。其值为平均值±标准差的值。 [0137] 图43表示将金黄色破囊壶菌ATCC 34304野生型菌株作为100%时的PKS路径（orfA基因）和C20延长酶基因的双重破坏菌株的脂肪酸比例。 [0138] 图44表示融合PCR中使用的引物和产物的模式图。最终产物为来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的ubiquitin启动子和来自异枝水霉（Saprolegnia diclina）的ω3去饱和酶（desaturase）基因序列以及金黄色破囊壶菌ATCC 34304的ubiquitin终止子融合后的序列。 [0139] 图45表示将图33记载的杀稻瘟菌素抗性基因BglII盒的一个BglII位点置换为KpnI位点的质粒。 [0140] 图46表示制得的来自异枝水霉的ω3去饱和酶基因表达质粒。作为抗药性标记，具有杀稻瘟菌素抗性基因。 [0141] 图47表示显示在来自异枝水霉的ω3去饱和酶基因的基因组插入确认中使用的PCR引物的位置的模式图。 [0142] 图48表示来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304 PKS路径（orfA基因）破坏菌株的转化菌株的评价。[符号的说明]泳道1～2：转化体。 [0143] 图49表示金黄色破囊壶菌ATCC 34304 PKS路径（orfA基因）破坏菌株的对照菌株以及ω3去饱和酶基因导入菌株的脂肪酸组成的比较。白柱和黑柱分别表示对照菌株和ω3去饱和酶基因导入菌株的脂肪酸组成。其值为平均值±标准差的值。 [0144] 图50表示将金黄色破囊壶菌ATCC 34304 PKS路径（orfA基因）破坏菌株作为100%时的ω3去饱和酶基因导入菌株的脂肪酸比例。 [0145] 图51表示克隆包含来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的C20延长酶的序列的pRH59的图。 [0146] 图52表示克隆来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的C20延长酶内包含BglIi位点的序列的pRH64的图。 [0147] 图53表示克隆来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的C20延长酶内包含Ubiquitin启动子、新霉素抗性基因、SV40终止子的序列的pRH65，以及克隆来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的C20延长酶内包含Ubiquitin启动子、潮霉素抗性基因、SV40终止子的序列的pRH66的图。 [0148] 图54表示PCR中的野生菌株等位基因以及敲除菌株（knockout strain）的预想片段尺寸。 [0149] 图55表示PCR中的野生菌株等位基因和敲除菌株的检测结果。 [0150] 图56表示野生菌株和C20延长酶敲除菌株的脂肪酸组成。白柱和黑柱分别表示野生菌株和菌株的脂肪酸组成。 [0151] 图57表示野生菌株和敲除菌株的脂肪酸组成的比较。 [0152] 图58表示含有克隆的金黄色破囊壶菌ATCC 34304株的Δ4去饱和酶基因上游1071bp～Δ4去饱和酶基因内1500bp的序列的质粒。 [0153] 图59表示使图58记载的质粒的Δ4去饱和酶基因上游60bp和Δ4去饱和酶基因内包含起始密码子的556bp的序列（616bp，序列号：205）缺失，并且在缺失部分插入BglII位点的质粒。 [0154] 图60表示制得的金黄色破囊壶菌ATCC 34304株的Δ4去饱和酶基因打靶载体（2种）。作为耐药性标记，具有杀稻瘟菌素抗性基因（pTM6）或者增强型GFP-Zeocin抗性融合基因（pTM8）。 [0155] 图61表示显示在金黄色破囊壶菌ATCC 34304 PKS路径（orfA基因）破坏菌株的Δ4去饱和酶基因破坏菌株的鉴定中使用的PCR用引物的物质以及预想的产物的模式图。 [0156] 图62表示将金黄色破囊壶菌ATCC 34304株基因组DNA作为模板通过PCR进行的Δ4去饱和酶基因破坏的评价。[符号的说明]+/+：来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的PKS路径（orfA基因）破坏株；+/-：来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304来源的PKS路径（orfA基因）破坏株的第1条Δ4去饱和酶基因等位基因同源重组体；-/-：来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的PKS路径（orfA基因）和Δ4去饱和酶基因的双重破坏菌株。 [0157] 图63表示金黄色破囊壶菌ATCC 34304野生型菌株和PKS路径（orfA基因）与Δ4去饱和酶基因的双重破坏菌株的脂肪酸组成的比较。白柱和黑柱分别表示野生型菌株和基因破坏菌株的脂肪酸组成。 [0158] 图64表示将金黄色破囊壶菌ATCC 34304野生型菌株设定为100%时的PKS路径（orfA基因）和Δ4去饱和酶基因的双重破坏菌株的脂肪酸比例。 [0159] 图65表示将Parietichytrium sp.SEK358株基因组DNA作为模板通过PCR进行的C20延长酶基因破坏的评价。[符号的说明]+/+：Parietichytrium sp.SEK358野生型菌株；-/-：来自Parietichytrium sp.SEK358株的C20延长酶基因破坏菌株。 [0160] 图66表示Parietichytrium sp.SEK358野生型菌株和来自Parietichytrium sp.SEK358株的C20延长酶基因破坏菌株的脂肪酸组成的比较。白柱和黑柱分别表示野生型菌株和基因破坏菌株的脂肪酸组成。 [0161] 图67表示将Parietichytrium sp.SEK358野生型菌株设定为100%时的来自Parietichytrium sp.SEK358株的C20延长酶基因破坏菌株的脂肪酸比例。在 Parietichytrium sp.SEK358野生型菌株中，该脂肪酸检测范围以下的情况下用斜线表示。 [0162] 图68表示将Parietichytrium sp.SEK571株基因组DNA作为模板通过PCR进行的C20延长酶基因破坏的评价。[符号的说明]+/+：Parietichytrium sp.SEK571野生型菌株；-/-：来自Parietichytrium sp.SEK571株的C20延长酶基因破坏菌株。 [0163] 图69表示Parietichytrium sp.SEK571野生型菌株和来自Parietichytrium sp.SEK571株的C20延长酶基因破坏株的脂肪酸组成的比较。白柱和黑柱分别表示野生型菌株和基因破坏菌株的脂肪酸组成。 [0164] 图70表示将Parietichytrium sp.SEK571野生型菌株设定为100%时的来自Parietichytrium sp.SEK571株的C20延长酶基因破坏菌株的脂肪酸比例。 [0165] 图71表示TΔ12d与来自假微型海链藻（Thalassiosira pseudonana）、Micromonas sp和三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）的Δ12去饱和酶基因的推测氨基酸序列的多序列比对。[符号的说明]下线部分：组氨酸盒。 [0167] 图73表示TΔ12d KO打靶载体构建方案。 [0168] 图74表示通过Split marker法进行的以有效取得同源重组体为目的的同源重组片段的调制方案。 [0169] 图75表示将野生菌株、破坏了TΔ12d的第1个等位基因的菌株、以及TΔ12d破坏菌株（破坏了2个等位基因的菌株）中的各个基因组DNA作为模板通过PCR，扩增潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因以及TΔ12d基因的结果。[符号的说明]M：λHindIII digest/X174HincII digest；W：野生菌株（wild-type）；S1～S3：第1等位基因敲除（1st allele knock-out）菌株；D1～D3：第2等位基因敲除（2nd allele knock-out）菌株。 [0170] 图76表示在野生菌株、破坏了TΔ12d的第1个等位基因的菌株、以及TΔ12d破坏菌株中，通过RT-PCR检测潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因以及TΔ12d基因的mRNA的结果。[符号的说明]M：λHindIII digest/φX174HincII digest；W：野生菌株（wild-type）；S1～S3：第1等位基因敲除（1st allele knock-out）菌株；D1～D3：第2等位基因敲除（2nd allele knock-out）菌株。 [0171] 图77表示在野生菌株、破坏了TΔ12d的第1个等位基因的菌株、以及TΔ12d破坏菌株中的印迹杂交的结果。 [0172] 图78表示在野生菌株、破坏了TΔ12d的第1个等位基因的菌株、以及TΔ12d破坏菌株中，比较OD600和通过干燥菌体重量测定的增值率的结果。 [0173] 图79表示在野生菌株、破坏了TΔ12d的第1个等位基因的菌株、以及TΔ12d破坏菌株中的各脂肪酸组成的比例。[符号的说明]星号：p<0.01时具有显著性差异（n=3）。 [0174] 图80表示在野生菌株、破坏了TΔ12d的第1个等位基因的菌株、以及TΔ12d破坏菌株中每干燥菌体的各脂肪酸量。[符号的说明]星号：p<0.01时具有显著性差异（n=3）。 [0175] 图81表示使用杀稻瘟菌素抗性基因，改变图39记载的金黄色破囊壶菌C20延长酶基因打靶载体（pRH43）并且插入BamHI位点的质粒。 [0176] 图82表示改变图81记载的质粒并且插入有KpnI位点的质粒。 [0177] 图83表示制得的金黄色破囊壶菌C20延长酶基因打靶并且来自水霉的ω3去饱和酶表达载体。作为耐药性标记，具有杀稻瘟菌素抗性基因。 [0178] 图84表示显示在金黄色破囊壶菌PKS路径（orfA基因）破坏株的C20延长酶基因破坏并且来自水霉的ω3去饱和酶表达株的鉴定中使用的印迹杂交分析用探针的位置以及预想的基因片段的尺寸的模式图。 [0179] 图85表示通过使用金黄色破囊壶菌ATCC 34304基因组DNA的印迹杂交法的C20延长酶基因破坏并且来自水霉的ω3去饱和酶表达株的评价。[符号的说明]PKSKO：来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的PKS路径（orfA基因）破坏株；+/-：来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的PKS路径（orfA基因）破坏株中第1条C20延长酶基因的等位基因同源重组体；-/-：来自金黄色破囊壶菌的PKS路径（orfA基因）与C20延长酶基因的双重破坏并且来自水霉的ω3去饱和酶表达株。 [0180] 图86表示金黄色破囊壶菌ATCC 34304野生型菌株、和PKS路径（orfA基因）与C20延长酶基因的双重破坏并且来自水霉的去饱和酶表达株的脂肪酸组成的比较。白柱和黑柱分别表示野生型菌株和基因破坏菌株的脂肪酸组成。 [0181] 图87表示将金黄色破囊壶菌ATCC 34304野生型菌株设定为100%时的PKS路径（orfA基因）与C20延长酶基因的双重破坏并且来自水霉的ω3去饱和酶表达株的脂肪酸比例。 [0182] 图88表示来自水霉的ω3去饱和酶表达载体制作的基础中使用的质粒。 [0183] 图89表示在图88记载的质粒中插入有来自水霉的ω3去饱和酶表达KpnI盒的质粒。 [0184] 图90表示在图89记载的质粒中插入作为耐药性标记的潮霉素抗性基因，制得的来自水霉的表达载体。 [0185] 图91表示显示在来自水霉的ω3去饱和酶基因的基因组插入确认中使用的PCR引物的位置的模式图。 [0186] 图92表示来自Parietichytrium sp.SEK571 C20延长酶基因破坏株的转化株的评价。[符号的说明]泳道1～2：转化体。 [0187] 图93表示Parietichytrium sp.SEK571野生型菌株和、C20延长酶基因破坏并且来自水霉的ω3去饱和酶表达株的脂肪酸组成的比较。白柱和黑柱分别表示野生型菌株和转化株的脂肪酸组成。 [0188] 图94表示将Parietichytrium sp.SEK571野生型菌株设定为100%时的C20延长酶基因破坏并且来自水霉的ω3去饱和酶表达株的脂肪酸比例。 [0189] 图95表示克隆含有来自裂殖壶菌（Schizochytrium）属的C20延长酶基因的序列的pRH70的图。 [0190] 图96表示克隆来自裂殖壶菌（Schizochytrium）属的C20延长酶内含有BglII位点的序列的pRH71的图。 [0191] 图97表示克隆来自裂殖壶菌（Schizochytrium）属的C20延长酶内含有Ubiquitin启动子、新霉素抗性基因、SV40终止子的序列的pRH73，以及克隆来自裂殖壶菌（Schizochytrium）属的C20延长酶内含有Ubiquitin启动子、潮霉素抗性基因、SV40终止子的序列的pKS-SKO的图。 [0192] 图98表示PCR中野生株等位基因和敲除株的预想片段尺寸。 [0193] 图99表示RCR中野生株等位基因和敲除株的检测结果。 [0194] 图100表示野生株和C20延长酶敲除株的脂肪酸组成。白柱和黑柱分别表示野生株和株的脂肪酸组成。 [0195] 图101表示野生株和敲除株的脂肪酸组成的比较。 具体实施方式[0196] 近年来，对于脂质的生理活性和药理作用的研究不断进展，出现了对于不饱和脂肪酸的代谢中各种化学物质的变化及其作用的阐述。特别是饱和脂肪酸、单烯酸、不饱和脂肪酸的营养学上优选的比率，二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等来自鱼油的ω3类（也称为n-3类）脂肪酸和以亚油酸为中心的来自植物的ω6类（也称为n-6类）脂肪酸的比率在与疾病的关联中受到重视。然而，由于动物脂肪酸不饱和化酶（去饱和酶，desaturase）的缺失或者低下，因此，必须将一部分不饱和脂肪酸作为食物来摄取。将这些脂肪酸称为必须脂肪酸（或者维生素F），亚油酸（LA）、γ-亚麻酸（GLA）、花生四烯酸（AA或ARA）属于此类。 [0197] 在不饱和脂肪酸的生成中，称为脂肪酸不饱和化酶（去饱和酶）的酶参与其中。脂肪酸不饱和化酶（去饱和酶）中有以下两种类型：（1）从脂肪酸的羰基开始在确定的位置形成双键（也称为不饱和键）的类型（例如，Δ9去饱和酶，将其羰基碳原子作为第一个碳原子的情况下，在第9个位置形成双键。）以及（2）从脂肪酸的甲基末端开始在特定的位置形成双键的类型（例如，ω3去饱和酶，将甲基末端作为第一个位置的情况下，在第3个位置形成双键），已知通过重复进行这些去饱和酶的双键的生成（不饱和化），和由几个不同的延长酶进行的链延长，由此可以生物合成不饱和脂肪酸。例如，Δ9去饱和酶通过将在体内由棕榈酸合成或者从外部直接摄取的硬脂酸不饱和化来合成油酸（OA）。另外，Δ6、Δ5、Δ4去饱和酶是如花生四烯酸（AA）、二十碳五烯酸（EPA）、以及二十二碳六烯酸（DHA）这样的多不饱和脂肪酸合成中必需的脂肪酸不饱和化酶（去饱和酶）。 [0198] 另一方面，在属于原生藻菌的网粘菌类（Labyrinthulomycetes）中存在破囊壶菌科（也称为破囊壶菌科）（Thraustochytriaceae）和网粘菌科（Labyrinthulaceae）这两个科。这些微生物作为积蓄花生四烯酸、EPA、DTA、DPA、DHA等多不饱和脂肪酸的微生物而被知晓。 [0199] 本发明涉及原生藻菌的转化方法，其特征在于，通过基因工程对原生藻菌的基因进行破坏或者表达抑制。特别是，使得对与脂肪酸生物合成相关的基因进行破坏或表达抑制的转化方法、由此进行的原生藻菌的脂肪酸组成的改变方法、使原生藻菌积蓄大量脂肪酸的方法以及不饱和脂肪酸含量增加的原生藻菌、由这些不饱和脂肪酸含量增加的原生藻菌生产不饱和脂肪酸的方法的开发、提供成为可能。 [0200] 本发明包括操作构成原生藻菌的延长酶/去饱和酶路径的酶使原生藻菌产生的脂肪酸组成变化，特别是可以通过（1）脂肪酸链长延长酶基因的破坏和/或表达抑制，（2）聚酮合成酶基因的破坏和/或表达抑制（，3）脂肪酸不饱和化酶的破坏和/或表达抑制，（3）聚酮合成酶基因、脂肪酸链长延长酶基因、或者脂肪酸不饱和化酶中的两者或者全部破坏和/或表达抑制（，4）脂肪酸链长延长酶基因的破坏和/或表达抑制以及脂肪酸不饱和化酶基因的导入（，5）聚酮合成酶基因的破坏和/或表达抑制以及脂肪酸不饱和化酶基因的导入，（6）脂肪酸不饱和化酶的破坏和/或表达抑制以及脂肪酸不饱和化酶基因的导入（，6）聚酮合成酶基因、脂肪酸链长延长酶基因、或者脂肪酸不饱和化酶中的两者或者全部的破坏和/或表达抑制以及脂肪酸不饱和化酶基因的导入，从而改变原生藻菌产生的脂肪酸组成。 [0201] 以下，对本发明进行更详细地说明。 [0202] [微生物] [0203] 作为本发明的脂肪酸改变方法中使用的微生物，只要是被认为可能通过对与脂肪酸合成相关的基因进行破坏和/或表达抑制来改变脂肪酸组成的原生藻菌就没有特别地限定，但是特别优选以网粘菌类为对象。作为网粘菌类，可以列举属于网粘菌属（Labyrinthula）、交链孢霉属（Althornia）、Aplanochytrium属、Japonochytrium属、Labyrinthuloides属、裂殖壶菌属（Schizochytrium）、破囊壶菌属（Thraustochytrium）、或者吾肯氏壶菌属（Ulkenia）、Aurantiochytrium属、Oblongichytrium属、Botryochytrium属、Parietichytrium属、或者Sicyoidochytrium属的微生物。 [0204] 另外，学术上Labyrinthuloides解释为Aplanochytrium的同物异名（Leander,Celeste A.& David Porter,Mycotaxon,vol.76,439-444(2000）） [0205] 作为本发明中使用的网粘菌类，优选属于破囊壶菌属（Thraustochytrium）以及Parietichytrium的微生物，其中特别优选可以列举金黄色破囊壶菌、Parietichytrium sarkarianum、破囊壶菌（Thraustochytrium roseum），具体来说，可以列举金黄色破囊壶菌ATCC34304、Parietichytrium sarkarianum SEK364（FERM BP-11298）、破囊壶菌ATCC 28210、Parietichytrium sp.SEK358（FERM BP-11405）、或者Parietichytrium sp.SEK571（FERM BP-11406）的菌株。金黄色破囊壶菌ATCC 34304和破囊壶菌ATCC 28210保藏在ATCC，一般分开出售。Parietichytrium sarkarianum SEK364株是按照以下方法得到的，将在石垣岛·吹通川的河口区域收集的表层水10mL放入试管中，添加松花粉在室温下放置。7天后将松花粉涂布于无菌琼脂培养基（2g葡萄糖、1g蛋白胨、0.5g酵母提取物、0.2g氯霉素、15g琼脂、100mL蒸馏水、900mL海水）上，分离并培养5天后出现的菌落，重复多次，分离菌体。该菌株在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心（茨城县筑波市东1-1-1中央第6）以保藏号（FERM BP-11298）于平成22年9月24日国际保藏，可以从那里得到该菌株。 Parietichytrium sp.SEK358株是按照以下方法得到的，将在石垣岛·宫良川可口区域采集的海水样品用与上述同样的方法培养，分离菌体。该菌株在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心（茨城县筑波市东1-1-1中央第6）以保藏号（FERM BP-11405）于平成23年8月11日国际保藏，可以从那里得到该菌株。Parietichytrium sp.SEK571株是按照以下方法得到的，将由西表岛·后良川河口区域采集的海水样品用与上述同样的方法培养，分离菌体。该菌株在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心（茨城县筑波市东1-1-1中央第6）以保藏号（FERM BP-11406）于平成23年8月11日国际保藏，可以从那里得到该菌株。裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）TY12Ab株是按照以下的方法得到的，由在种子岛的沿岸收集的枯叶用与上述同样的方法培养，分离菌体。该菌株在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心（茨城县筑波市东1-1-1中央第6）以保藏号（FERM ABP- 11421）于平成23年9月29日国际保藏，可以从那里得到该菌株。 [0206] [与脂肪酸生物合成相关的基因] [0207] 本发明中的脂肪酸生物合成相关基因只要是原生藻菌，特别是在网粘菌类中与脂肪酸生物合成相关的酶的基因就没有特别地限定。作为这样的基因，可以列举聚酮合成酶基因、脂肪酸链长延长酶（延长酶）基因、或者脂肪酸不饱和化酶基因。在本发明中，将这些基因中的任一个或者两个同时作为通过基因工程进行破坏或者表达抑制的对象。此时，作为基因破坏和/或表达抑制的对象的基因，在该原生藻菌中如果聚酮合成酶产生所希望的脂肪酸以外的脂肪酸的情况下，例如该开放阅读框架成为对象。另外，如果是脂肪酸链长延长酶，则与将希望的脂肪酸变换为其它脂肪酸的酶相关的基因成为对象，例如在需求二十碳五烯酸（EPA）时，可以对与将二十碳五烯酸变换为二十二碳六烯酸（DPA）相关的脂肪酸链长延长酶的基因，具体来说C20延长酶基因进行破坏和/或表达抑制。另外，如果是脂肪酸不饱和化酶，则与将希望的脂肪酸变换为其它脂肪酸的酶相关的基因成为对象，例如，在需求油酸的时候，可以对与将油酸变换为亚油酸相关的脂肪酸不饱和化酶的基因，具体来说Δ12去饱和酶基因进行破坏和/或表达抑制。另外，也可以根据希望的脂肪酸对关于聚酮合成酶基因、脂肪酸链长延长酶（延长酶）基因、或者脂肪酸不饱和化酶中的两者或者全部的基因进行破坏和/或表达抑制。 [0208] 进一步，也可以如上所述在已通过基因工程进行了基因破坏和/或表达抑制的转化株中导入与脂肪酸生物合成相关的基因。此时，作为导入的基因，与生物合成所希望的脂肪酸的酶相关的基因成为对象，例如，在需求二十碳五烯酸的时候，可以导入将花生四烯酸（AA）变换为二十碳五烯酸的脂肪酸不饱和化酶的基因，具体来说ω3去饱和酶基因。 [0209] [聚酮合成酶以及脂肪酸链长延长酶] [0210] 聚酮合成酶（聚酮合成酶，polyketide synthase，PKS）为催化发酵剂基质（乙酰基-CoA、脂肪酸CoA酯、苯甲酰CoA、香豆酰基CoA）上多次缩合伸长链基质（丙二酰CoA等）的反应的酶，通常作为与植物或真菌等二次代谢产物的生物合成相关的酶而被知晓，在某种生物中报道了也与多不饱和脂肪酸的生物合成相关。例如，海洋细菌希瓦氏菌（Shewanella）通过该酶生产二十碳五烯酸（EPA）（非专利文献8）。某种原生藻菌中也已知聚酮合成酶同样地与多不饱和脂肪酸的生物合成相关，另外，网粘菌类中也明确有该基因序列。例如，如专利文献7所记载的，裂殖壶菌（Schizochytrium）属的网粘菌的聚酮合成酶基因由OrfA、OrfB、OrfC这3个开放阅读框架构成。另外，如专利文献8所记载的，吾肯氏壶菌（Ulkenia）属的网粘菌的聚酮合成酶基因也具有3个开放阅读框架。 [0211] 另外，本发明的脂肪酸链长延长酶（延长酶，elongase）只要是具有延长脂肪酸的链长的功能的酶就没有特别地限定，优选可以列举C18延长酶基因、C20延长酶基因。所述C18延长酶基因、C20延长酶基因为将碳原子数为18、20的脂肪酸分别延长2个碳原子成为碳原子数为20、22的脂肪酸的延长酶，这些脂肪酸链长延长酶广泛存在于各种生物中，报道有在原生藻菌中也存在这些脂肪酸链长延长酶，例如破囊壶菌（Thraustochytrium）属的网粘菌类中也存在（非专利文献9）。C18延长酶催化由γ-亚麻酸（GLA）向高-γ-亚麻酸（DGLA）的转化以及由硬脂四烯酸向二十碳四烯酸（ETA）的转化。C20延长酶催化从花生四烯酸（AA）向二十二碳四烯酸（DTA）的转化以及从二十碳五烯酸（EPA）向n-3二十二碳五烯酸（DPA，22:5n-3）的转化。 [0212] 因此，例如，在需求硬脂四烯酸（STA）的时候，可以对与将硬脂四烯酸转化为二十碳四烯酸（ETA）相关的脂肪酸链长延长酶的基因，具体来说C18延长酶基因进行破坏和/或表达抑制。另外，例如，在需求二十碳五烯酸（EPA）的时候，可以对与将二十碳五烯酸转化为二十二碳五烯酸（DPA）相关的脂肪酸链长延长酶的基因，具体来说C20延长酶基因进行破坏和/或表达抑制。进一步，在该原生藻菌中如果通过聚酮合成酶生物合成希望以外的脂肪酸的情况下，可以对聚酮合成酶基因进行破坏和/或表达抑制。另外，在非专利文献5中显示裂殖壶菌（Schizochy trium）属的网粘菌破坏了聚酮合成酶基因的菌株失去生物合成二十二碳六烯酸的能力，在添加多不饱和脂肪酸的培养基以外的培养基中不能生长的结果。然而，在本发明中，即使某种网粘菌破坏聚酮合成酶基因，在没有添加多不饱和脂肪酸的培养基中也能够生长，从而通过上述的基因的破坏或表达抑制可以得到希望的多不饱和脂肪酸。 [0213] [脂肪酸不饱和化酶] [0214] 本发明的脂肪酸不饱和化酶（去饱和酶，desaturase）只要是具有作为脂肪酸不饱和化酶的功能的物质，就没有特别地限定。作为脂肪酸不饱和化酶基因，虽然并不特别地限制于动物来源、植物来源等的来源，可以优选的列举Δ4去饱和酶基因、Δ5去饱和酶基因、Δ6去饱和酶基因、Δ12去饱和酶基因、ω3去饱和酶基因等的脂肪酸不饱和化酶基因，这些可以单独使用或者联合使用。所述Δ4去饱和酶基因、Δ5去饱和酶基因、Δ6去饱和酶基因、Δ12去饱和酶基因是从脂肪酸的末端羧基的碳（δ末端）数起，各自在第4、第5、第6、第12个碳原子处形成不饱和键的物质，作为这些脂肪酸不饱和化酶基因，具体地可以列举例如来自微细藻类的Δ4去饱和酶基因（非专利文献6）。进一步，具体来说，作为Δ5去饱和酶基因，可以列举来自金黄色破囊壶菌的Δ5去饱和酶，来自于破囊壶菌ATCC 26185、盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）、大鼠（Rattus norvegicus）、小鼠（Mus musculus）、人（Homo sapiens）、土壤线虫（Caenorhabditis elegans）、利什曼原虫（Leishmania major）的Δ5去饱和酶等。另外，作为Δ12去饱和酶，可以列举来自粉核油球藻（Pinguiophyceae）Pinguiochrysis pyriformis的Δ12去饱和酶、来自真菌和原虫的Δ12去饱和酶。ω3去饱和酶是从脂肪酸的碳链的甲基末端数起，在第3个位置处形成双键的物质，例如可以列举来自水霉的ω3去饱和酶（非专利文献10）等。Δ5去饱和酶，例如催化从二高-γ-亚麻酸（DGLA）向花生四烯酸（AA）的转化以及从二十碳四烯酸（ETA）向二十碳五烯酸（EPA）的转化。Δ6去饱和酶，例如催化从亚油酸（LA）向γ-亚麻酸（GLA）的转化以及从α-亚麻酸（ALA）向硬脂四烯酸（STA）的转化。ω3去饱和酶催化从花生四烯酸向二十碳五烯酸的转化。另外，亚油酸（LA）可以由油酸（OA）通过Δ12去饱和酶进行生产。 [0215] [产生的不饱和脂肪酸] [0216] 通过在原生藻菌内表达的脂肪酸不饱和化酶生成的不饱和脂肪酸是例如，碳原子数为18～22的不饱和脂肪酸。根据使用的脂肪酸不饱和化酶的种类或脂肪酸基质的种类不同而不同，但是可以优选地列举二十二碳六烯酸（DHA）或二十碳五烯酸（EPA），除此以外可以列举α-亚麻酸（ALA）、十八碳四烯酸（OTA，18:4n-3）、二十碳四烯酸（ETA，20:4n-3）、n-3二十二碳五烯酸（DPA，22:5n-3）、二十四碳五烯酸（TPA，24:5n-3）、二十四碳六烯酸（THA，24:6n-3）、亚油酸（LA）、γ-亚麻酸（GLA）、二十碳三烯酸（20:3n-6）、花生四烯酸（AA）、n-6二十二碳五烯酸（DPA，22:5n-6）等。 [0217] [脂肪酸生物合成相关酶基因源] [0218] 本发明中可以用作聚酮合成酶、脂肪酸链长延长酶（延长酶）和/或脂肪酸不饱和化酶基因源的生物并不限定特别的属、种或者株，只要是具有多不饱和脂肪酸生产能力的生物，任意的物质都可以使用。这些生物例如只要是微生物，可以从公知的微生物保藏机构容易地得到。作为这样的微生物，可以列举属于南极菌属（Moriterlla）的细菌Moritella marina MP-1株（ATCC15381）等，作为去饱和酶和延长酶基因源的例子以下说明对于使用该菌株的情况的方法。然而，在此所示的方法能够适用于从具有去饱和酶/延长酶路径的全部生物物种分离其构成基因的去饱和酶和延长酶基因的时侯。 [0219] 为了从MP-1株分离去饱和酶和/或延长酶基因，需要推测在其各自的目标酶基因的氨基酸序列中的保守区域。例如，已知在去饱和酶中有一个细胞色素b5区域和3个组氨酸盒，在延长酶中有2个组氨酸盒通过生物物种保留。更具体地说，通过使用clustal w程序（非专利文献7）的多序列比对比较来自各种生物物种的已知去饱和酶或者延长酶基因的氨基酸序列，能够推测出目标酶的保守区域。进一步，通过多序列比对比较在已知的来自其它生物的去饱和酶和/或延长酶中具有相同底物特异性的去饱和酶或者延长酶基因的氨基酸序列，能够推测具有相同底物特异性的去饱和酶和/或延长酶中的特异性保守区域。接着，基于推测的保守区域制备各种简并寡核苷酸引物，通过进行以来自MP-1株的cDNA文库为模板的PCR、RACE法等，扩增来自MP-1株的目标基因的部分序列。接着，将得到的扩增产物克隆于质粒载体中之后，通过常规方法确定碱基序列，通过与已知的酶基因比较，确认从MP-1株的目标酶基因的一部分可以分离。为了取得目标酶基因的全长，通过以得到的部分序列作为探针的杂交法进行筛选，或者进行使用从目标基因的部分序列制得的寡核苷酸引物的RACE法。 [0220] 聚酮合成酶可以参考专利文献7中记载的PUFA PKS的序列，通过常规的方法克隆。 [0221] [其它基因源] [0222] GFP（绿色荧光蛋白）参考非专利文献11或者非专利文献12，EGFP（增强型GFP）参考专利文献6，新霉素抗性基因参考非专利文献13。 [0223] [原生藻菌的脂肪酸生物合成相关基因的破坏] [0224] 作为原生藻菌的脂肪酸生物合成相关基因的破坏方法，可以使用现有的对微生物进行基因破坏的方法，可以列举将重组表达载体导入细胞进行转化的方法。 [0225] 例如，在破坏金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）的基因的情况下，首先，通过常规方法从金黄色破囊壶菌中提取基因组DNA，制作基因组库。接着，基于作为破坏对象的目标基因的DNA序列，设定基因组步行（genome walking）用引物，将制得的基因组库作为模板进行PCR，取得金黄色破囊壶菌的目标基因的上游序列以及下游序列。将取得的序列作为基因破坏时的同源重组区域配置于两侧，在其间插入用于选择的药剂标记基因。将该DNA线状化，用基因枪法导入到金黄色破囊壶菌，在含有药剂的板上培养约1周。从获得了耐药性的细胞中通过常规方法提取基因组DNA，用PCR法或者印迹杂交法进行同源重组株的鉴定。由于金黄色破囊壶菌为2倍体，因此，用基因枪法将线状化的DNA导入细胞中，重复2次直至鉴定同源重组株的工序，由此可以得到目标基因被破坏的金黄色破囊壶菌。在目标基因为2个以上的情况下，通过重复以上的操作，可以得到2个以上的目标基因被破坏的菌株。此时，由于金黄色破囊壶菌为2倍体，因此，需要对每1个基因准备2种选择标记。 [0226] 另外，例如，在破坏Parietichytrium sarkarianum的C20延长酶的情况下，首先，通过常规方法从Parietichytrium属中提取基因组DNA，解读基因组。检索与已知的C20延长酶基因同源性高的基因序列，用PCR扩增该基因序列的起始密码子至终止密码子。在基因序列的大致中央通过突变导入法插入限制酶位点，在该限制酶位点中插入用于选择的药剂标记基因盒。将该DNA线状化，用基因枪法导入到Parietichytrium sarkarianum SEK364，在含有药剂的板上培养约1周。通过常规方法从获得了耐药性的细胞中提取基因组DNA，用PCR法进行同源重组株的鉴定。由于Parietichytrium sarkarianum SEK364是2倍体，因此，通过重复2次将线状化的DNA用基因枪法导入到细胞中，直至鉴定同源重组株的工序，可以得到C20延长酶基因被破坏的Parietichytrium sarkarianum SEK364。此时，由于Parietichytrium sarkarianum SEK364是2倍体，因此，需要准备2种选择标记。另外，例如，在破坏来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的OrfA破坏株的Δ4去饱和酶的情况下，首先，通过常规方法从金黄色破囊壶菌ATCC34304中提取基因组DNA，解读基因组。检索与已知的Δ4去饱和酶同源性高的基因序列，用PCR扩增从该基因序列的上游区域至终止密码子附近。通过突变导入法，在缺失包含起始密码子的ORF的一部分的同时，插入限制酶位点，在该限制酶位点插入用于选择的药剂标记基因盒。将该DNA线状化，用基因枪法导入到来自金黄色破囊壶菌ATCC34304的OrfA破坏株，在含有药剂的板上培养约1周。从获得有耐药性的细胞中通过常规方法提取基因组DNA，用PCR法进行同源重组株的鉴定。由于金黄色破囊壶菌ATCC 34304是2倍体，因此，通过重复2次将线状化的DNA用基因枪法导入到细胞中，直至鉴定同源重组株的工序，从而可以得到Δ4去饱和酶基因被破坏的来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的OrfA破坏株。此时，由于金黄色破囊壶菌ATCC 34304是2倍体，因此，需要准备2种选择标记。 [0227] 另外，为了破坏破囊壶菌（Thraustochytrium roseum）的C20延长酶，使用金黄色破囊壶菌的C20延长酶基因序列。从金黄色破囊壶菌中通过常规方法提取基因组DNA，用PCR扩增C20延长酶基因的起始密码子至终止密码子。通过突变导入法在基因序列的大致中央插入限制酶位点，在该限制酶位点插入用于选择的药剂标记基因盒。将该DNA线状化，用基因枪法导入到金黄色破囊壶菌中，在含有药剂的板上培养约1周。通过常规方法从获得了耐药性的细胞中提取基因组DNA，用PCR进行同源重组株的鉴定。由于金黄色破囊壶菌是2倍体，因此，通过重复2次将线状化的DNA用基因枪法导入到细胞中，直至鉴定同源重组株的工序，从而可以得到C20延长酶基因被破坏的金黄色破囊壶菌。此时，由于金黄色破囊壶菌是2倍体，因此，需要准备2种选择标记。 [0228] 对于本发明中的原生藻菌的脂肪酸生物合成相关基因的破坏的详细情况，在实施例中具体地记载。另外，作为转化对象的原生藻菌也没有特别地限定，如上所述，可以将网粘菌类列举为优选的例子。 [0229] 例如，为了破坏Parietichytrium sp.SEK358株的C20延长酶，使用实施例3-6中制得的Parietichytrium属C20延长酶基因打靶载体。将该DNA线状化，用基因枪法导入到Parietichytrium sp.SEK358株中，在含有药剂的板上培养约1周。通过常规方法从获得了耐药性的细胞中提取基因组DNA，用PCR法进行同源重组株的鉴定（参照实施例9）。另外，例如，为了破坏Parietichytrium sp.SEK571株的C20延长酶，使用实施例3-6中制得的Parietichytrium属C20延长酶基因打靶载体。将该DNA线状化，用基因枪法导入到Parietichytrium sp.SEK571株中，在含有药剂的板上培养约1周。通过常规方法从获得了耐药性的细胞中提取基因组DNA，用PCR法进行同源重组株的鉴定（参照实施例10）。 [0230] 作为表达载体没有特别地限定，可以列举插入有基因的重组表达载体。在重组表达载体的制作中，可以使用质粒、噬菌体或者粘粒等，但是没有特别地限定。另外，制作方法也可以使用公知的方法。载体的具体种类没有特别地限定，可以适当选择在宿主细胞中能够表达的载体。即，根据宿主细胞的种类，为了确实地使基因表达而选择适当的启动子序列，将该启动子序列与本发明的基因组合入各种质粒等作为表达载体使用即可。载体可以使用环状或者线状化后的物质。表达载体中优选至少含有一个选择标记。作为这样的选择标记，可以列举营养要求性标记、耐药性标记、荧光蛋白质标记、或者这些的融合标记等，例如，作为营养要求性标记，可以列举二氢叶酸还原酶基因等；作为耐药性标记，可以列举新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、Zeocin抗性基因等；作为荧光蛋白质标记，可以列举GFP、增强型GFP（EGFP）等；另外，作为融合标记，例如可以列举使荧光蛋白质标记和耐药性标记融合后的标记，具体来说，GFP融合Zeocin抗性基因等。如果使用这些选择标记，能够确认本发明所涉及的聚核苷酸是否导入到宿主细胞，进一步确认其在宿主细胞中是否确实地表达。或者，也可以将本发明所涉及的脂肪酸不饱和化酶作为融合多肽表达，例如，可以使用GFP作为标记，使本发明所涉及的脂肪酸不饱和化酶作为GFP融合多肽表达。 [0231] 作为用于基因破坏的基因导入方法，优选使用电穿孔或者基因枪。在本发明中，通过破坏脂肪酸生物合成相关基因，与破坏该基因前比较，细胞的脂肪酸组成发生变化。即，通过破坏脂肪酸生物合成相关基因，可以得到脂肪酸组成改变的效果。进一步，通过在这样破坏了脂肪酸生物合成相关酶基因的原生藻菌中导入脂肪酸不饱和化酶基因，也可以更多地得到希望的脂肪酸。此时，作为进一步导入的脂肪酸不饱和化酶基因，优选导入ω3去饱和酶基因。 [0232] 通过原生藻菌的转化，可以得到产生的脂肪酸组成发生改变的原生藻菌（微生物）。该脂肪酸生物合成相关基因被破坏而成的原生藻菌，例如可以用于制造不饱和脂肪酸。在不饱和脂肪酸的制造中，可以使用上述产生的脂肪酸组成被改变的原生藻菌，对于其它的工序、制造设备·器具等各条件没有特别地限定。在不饱和脂肪酸的制造中包括培养通过上述的改变方法产生的脂肪酸组成被改变的微生物的工序，利用微生物和其它的培养基，制造不饱和脂肪酸。 [0233] 上述细胞的培养条件（培养基、培养温度、通气状态等）可以根据细胞的种类或目标不饱和脂肪酸的种类、其量等来适当设定。另外，本发明中的不饱和脂肪酸也指含有不饱和脂肪酸的物质，其含量、纯度、形状、组成等没有特别地限定。即，在本发明中，脂肪酸组成被改变的细胞或其培养基本身也可以视为不饱和脂肪酸。另外，可以进一步包括从该细胞或者培养基精制不饱和脂肪酸的工序。作为精制不饱和脂肪酸的方法，可以使用公知的作为以不饱和脂肪酸为起始的脂质（含有复合脂质）的精制方法。 [0234] [使原生藻菌大量积蓄不饱和脂肪酸的方法] [0235] 通过培养转化的本发明的原生藻菌达成使原生藻菌中积蓄不饱和脂肪酸。例如，用通常使用的固体培养基或者液体培养基等培养。此时，作为使用的培养基，例如，作为碳源的葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、甘油等，另外，作为氮源的酵母提取物、玉米浆、多聚蛋白胨、谷氨酸钠、尿素、醋酸铵、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、硝酸钠等，以及作为无机盐的磷酸钾等，并且适当组合其它必要成分的培养基，只要是为了培养网粘菌类而通常使用的物质就没有特别地限定，特别优选使用酵母提取物·葡萄糖培养基（GY培养基）。制备培养基之后，将pH调制至3.0～8.0的范围内之后，通过高压灭菌锅杀菌使用。培养可以在10～40℃，优选为15～35℃下以通气搅拌培养、振荡培养或者静置培养进行1～14天。 [0236] 对于回收产生的不饱和脂肪酸，在培养基中生长原生藻菌，处理从该培养基得到的微生物细胞，使其释放细胞内脂质（含有多不饱和脂肪酸的油脂含有物或者多不饱和脂肪酸），从含有该被放出的细胞内脂质的培养基中回收脂质。即，将这样培养的原生藻菌通过离心分离等回收，粉碎细胞，按照规定方法使用适当的有机溶剂提取细胞内的脂肪酸，由此可以得到多不饱和脂肪酸含量增加的油脂。 [0237] 本发明通过培养对脂肪酸生物合成相关基因，具体为聚酮合成酶、脂肪酸链长延长酶和/或脂肪酸不饱和化酶基因进行破坏和/或表达抑制后的转化原生藻菌，可以改变原生藻菌产生的脂肪酸的组成，这是通过对原生藻菌的脂肪酸生物合成相关基因进行破坏和/或表达抑制，在该原生藻菌中进一步不将所希望的脂肪酸转化为其它的脂肪酸地进行积蓄来实现。另外，通过进一步在基因破坏和/或表达抑制的转化原生藻菌中导入脂肪酸不饱和化酶相关基因，强化所希望的脂肪酸的前驱脂肪酸向所希望的脂肪酸转化的转化能力，由此积蓄希望的脂肪酸来实现。 [0238] 另外，本发明的不饱和脂肪酸也包含于各种医药品、食品或者工业制品中，其利用领域没有特别地限定。另外，在含有具有本发明的不饱和脂肪酸的油脂的食品中包括补充剂等的健康食品、食品添加物等。另外，作为工业制品，可以列举以人以外的生物为对象的饲料、薄膜、生物分解性塑料、功能性纤维、润滑油、洗剂等。 [0239] 以下，基于实施例具体地说明本发明，但本发明并没有用以下的实施例进行任何的限定。 [0240] 实施例1 [0241] [网粘菌类和其培养方法·保存方法] [0242] （1）本发明中使用的菌株 [0243] 金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304和破囊壶菌（Thraustochytrium roseum）ATCC 28210从ATCC获得。Parietichytrium sarkarianum SEK 364（FERM BP-11298）、Parietichytrium sp.SEK358（FERM BP-11405）以及 Parietichytrium sp.SEK571（FERM BP-11406）从甲南大学理工学部获得。裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）TY12Ab（FERM ABP-11421）从宫崎大学农学部获得。 [0244] （2）培养基组成 [0245] i．琼脂平板培养基组成 [0246] PDA琼脂平板培养基 [0247] 将0.78%（w/v）土豆右旋糖琼脂培养基（日本制药公司制造）、1.75%（w/v）海洋生物（sea life）（Marine Tech公司制造）、1.21%（w/v）琼脂末（Nacalai Tesque公司制造）混合，在121℃下进行高压灭菌锅灭菌20分钟。充分冷却之后，为了防止细菌污染，以使最终浓度成为100μg/ml的方式添加氨苄青霉素酸钠（Nacalai Tesque公司制造），分注于浅底盘中，在平的地方静置使其固化。 [0248] ii．液体培养基组成 [0249] GY液体培养基 [0250] 将3.18%（w/v）葡萄糖（Nacalai Tesque公司制造）、1.06%（w/v）干燥酵母提取物（Nacalai Tesque公司制造）、1.75%（w/v）海洋生物（Marine Tech公司制造）混合，在121℃下高压灭菌锅灭菌20分钟之后，添加100μg/ml的氨苄青霉素酸钠（Nacalai Tesque公司制造）。 [0251] PD液体培养基 [0252] 将0.48%（w/v）土豆右旋糖（Difco公司制造）、1.75%（w/v）海洋生物（Marine Tech公司制造）混合，在121℃下高压灭菌锅灭菌20分钟之后，添加100μg/ml的氨苄青霉素酸钠（Nacalai Tesque公司制造）。 [0253] （3）培养方法 [0254] i．琼脂平板培养 [0255] 使用铂环或者涂布器接种网粘菌菌体，在25℃下静置培养，由此使菌落出现。关于其次代培养，用铂环取出菌落悬浮于灭菌生理盐水之后，使用铂环或者涂布器涂布该悬浊液来进行次代培养。另外，根据需要通过将平板上的菌体接种于液体培养基，进行向液体培养基的转换。 [0256] ii．液体培养 [0257] 接种网粘菌菌体，使用锥形瓶或者试管以25℃、150rpm的转速一边搅拌一边进行悬浊培养。关于其次代培养，通过相对于新的GY或PD液体培养基添加1/200～1/10的容积的确认增殖的对数增殖期至稳定期的培养液来进行次代培养。另外，根据需要通过将细胞培养液涂布于PDA琼脂平板培养基，进行向琼脂平板培养的转换。 [0258] （4）网粘菌类的保持·保存方法 [0259] 通过加入到次代培养，制备甘油储藏液进行冷冻保存。即，对于使用GY液体培养基的对数增殖期至稳定期的细胞悬浊液，添加最终浓度为15%（v/v）的甘油（Nacalai Tesque公司制造），在-80℃的深冷冰箱中保存。 [0260] 实施例2 [0261] [金黄色破囊壶菌的C20延长酶基因的破坏] [0262] [实施例2-1]来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的总RNA的提取以及mRNA的精制[0263] 通过以3,500×g将使用GY液体培养基的培养第3天的金黄色破囊壶菌ATCC34304培养液离心15分钟，回收其菌体。通过将得到的菌体悬浊于灭菌生理盐水之后进行再离心操作，清洗菌体，用液氮急速冷冻，在研钵中磨碎至粉末状。使用Sepasol RNA I Super（Nacalai Tesque公司制造）从得到的细胞破碎液中提取总RNA。接着，使用Oligotex TM-dT30 [0264] [实施例2-2]通过RACE法分离来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的延长酶基因 [0265] 将被高度保留于延长酶基因的组氨酸盒（His box）作为目标，合成正方向（elo-F，5’-TTY YTN CAY GTN TAY CAY CAY-3’）（序列号：1）和逆方向（elo-R，5’-GCR TGR TGR TAN ACR TGN ARR AA-3’）（序列号：2）的缩聚寡核苷酸。寡核苷酸的合成使用DNA合成机（Applied Biosystems公司制造）进行。接着，使用SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒（clontech公司制造），按照所附的手册分别制作在3’和5’末端附加有合成套头的3’-和5’-RACE cDNA文库。将它们作为模板，使用合成套头特异性寡核苷酸以及所述的缩聚寡核苷酸elo-F以及elo-R进行3’-和5’-RACE[PCR循环：94℃1分钟/94℃30秒,60℃ 30秒,72℃ 3分钟,循环30次/72℃ 10分钟/4℃∞]，确认特异性扩增的3’-和5’-RACE产物的带（图1）。接着，通过1%琼脂糖凝胶将该RACE产物总量供给电泳，用清洁的刀等切出分离的DNA片段，按照非专利文献 20记载的方法从琼脂糖凝胶中提取DNA片段。接着，使用pGEM-T easy Vector（Promega公司制造）进行该DNA片段的TA克隆，通过Sanger等人的方法（非专利文献21）确定它们的碱基序列。具体来说，使用BigDyeR Terminator v3.1Cyele Sequencing Kit以及3130基因分析仪（Applied Biosystems公司制造），按照所附的手册通过染料终止法（dye-terminator method）进行碱基序列确定。 [0266] 其结果，成功地鉴定3’-RACE产物中命名为elo1（序列号：3）以及elo2（序列号：4）的190bp和210bp这2种序列、5’-RACE产物中命名为elo3（序列号：5）的200bp这1种序列。由于这些elo1、elo2以及elo3的序列表现出与各种延长酶基因的序列显著的同源性，因此，表明其为来自金黄色破囊壶菌ATCC34304的延长酶基因的部分序列。此外，关于各个elo1、elo2以及elo3，再次设计寡核苷酸引物，通过RACE尝试获得cDNA序列。以下表示制得的寡核苷酸引物。elo1正方向寡核苷酸引物（elo1-F1，5’-TAT GAT CGC CAA GTA CGC CCC-3’）（序列号：6）和逆方向寡核苷酸引物（elo1-R1，5’-GAA CTG CGTCAT CTG CAG CGA-3’）（序列号：7）、elo2正方向寡核苷酸引物（elo2-F1，5’-TCT CGC CCT CGA CCA CCA AC-3’）（序列号：8）和逆方向寡核苷酸引物（elo2-R1，5’-CGG TGA CCG AGT TGA GGT AGC C-3’）（序列号：9）、elo3正方向寡核苷酸引物（elo3-F1，5’-CAA CCC TTT CGG CCT CAA CAA G-3’）（序列号： 10）和逆方向寡核苷酸引物（elo3-R1，5’-TTC TTG AGG ATC ATC ATG AAC GTG TC-3’）（序列号：11）。 [0267] 使用制得的正方向和逆方向寡核苷酸引物，与上述记载的方法同样地进行RACE和该扩增产物的碱基序列分析。其结果，关于elo1可以得到特异性扩增的3’-和5’-RACE产物，由于它们的重复部分完全一致，因此，明显是1,139bp的elo1cDNA序列（序列号：12）。同样地，关于elo3也可以得到特异性扩增的3’-和5’-RACE产物，由于它们的重复部分完全一致，因此，明显是1,261bp的elo3cDNA序列（序列号：3）。 [0268] 序列分析的结果可知，elo1由编码275氨基酸残基（序列号：14）的825bp的翻译区域（序列号：15）构成，BLAST检索的结果可知，不仅与各种延长酶基因表现出显著的同源性，而且与公知的来自金黄色破囊壶菌的推测Δ5延长酶基因的序列（NCBI accession No.CS486301）完全一致。另一方面，推测elo3由编码317氨基酸残基（序列号：16）的951bp的翻译区域（序列号：17）构成，BLAST检索结果，由于显示与各种延长酶基因显著的同源性，因此，可以确认为来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的推测延长酶基因。另外，在两基因的推测氨基酸序列中发现高度保留于延长酶基因的His box。承接以上的结果，将elo1和elo3基因作为来自金黄色破囊壶菌ATCC 34304的推测延长酶基因，分别命名为TaELO1、TaELO2。 [0269] [实施例2-3]TaELO1和TaELO2的系统树分析 [0270] 各种延长酶根据底物特异性大致分为1.SFA/MUFA延长酶（作用于饱和脂肪酸或者单价不饱和脂肪酸）2.PUFA-延长酶（单步，single-step）（作用于确定链长的多价不饱和脂肪酸）以及3.PUFA延长酶（多步，multi-step）（作用于各种链长的多价不饱和脂肪酸）这三组。如果通过Meyer等（非专利文献22）进行的延长酶的系统分析，可知其底物特异性和系统关系非常一致。 [0271] 因此，根据Meyer等的方法，进行TaELO1、TaELO2、以及来自其它生物的各种延长酶基因的系统分析。具体来说，通过使用CLUSTAL W程序（非专利文献7）的邻接法（非专利文献14）制作分子系统树。其结果，TaELO1和TaELO2明显分类于PUFA-延长酶（单步）的组中，表明其作用于确定链长的多价不饱和脂肪酸（图2）。 [0272] [实施例2-4]将出芽酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为宿主的TaELO1和TaELO2的表达与基因导入株的脂肪酸组成的分析 [0273] 为了将出芽酵母酿酒酵母（S.cerevisiae）作为宿主使TaELO1和TaELO2表达，分别构建表达载体。以下表示其概略。基于TaELO1的翻译区域的序列，制作1对寡核苷酸引物（E1HindIII，5’-ATA AGC TTA AAA TGT CTA GCA ACA TGA GCG CGT GGG GC-3’）（序列号：18）以及（E1XbaI，5’-TGT CTA GAA CGC GCG GAC GGT CGC GAA A-3’）（序列号：19）。E1 HindIII是正方向寡核苷酸引物，在5’末端具有限制酶HindIII部位（AAGCTT）。另外，参考酵母的共识序列（(A/Y)A(A/U)A AUG UCU，下线部分为起始密码子）（非专利文献23），改变TaELO1的起始密码子附近的序列。E1XbaI为逆方向寡核苷酸引物，在5’末端具有XbaI部位（TCTAGA）。 [0274] 同样地，基于TaELO2的翻译区域的序列，制作1对寡核苷酸引物（E2HindIII，5’-TAA AGC TTA AAA TGT CTA CGC GCA CCT CGA AGA GCG CTC C-3’）（序列号：20）以及（E2XbaI，5’-CAT CTA GAC TCG GAC TTG GTG GGG GCG CTT G-3’）（序列号：21）。E2HindIII为正方向寡核苷酸引物，在5’末端具有限制酶HindIII部位。另外，参考酵母的共识序列，改变TaELO2的起始密码子附近的序列。E2 XbaI为逆方向寡核苷酸引物，在5’末端具有XbaI部位。 [0275] 使用以上的2种寡核苷酸引物对，将实施例2-2记载的5’-RACE cDNA文库作为模板进行PCR，在5’末端具有限制酶HindII，在3’末端具有限制酶XbaI位点，扩增起始密码子附近改变为酵母的共识序列的949bp的TaELO1翻译区域（序列号：22）以及967bp的TaELO2翻译区域（序列号：23）。另外，PCR酶为了避免延长错误，使用校正活性高的PrimeSTARR DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 5秒,60℃ 5秒,72℃ 1.5分钟,循环30次/72℃ 7分钟/4℃∞]。 [0276] 接着，用1%琼脂糖凝胶分离扩增的PCR产物之后，切断该DNA片段，从琼脂糖凝胶中提取。进一步，用限制酶HindIII和XbaI处理之后，再次使用琼脂糖凝胶进行精制，使用DNA Ligation Kit [0277] 按照非专利文献15和非专利文献16记载的方法，通过醋酸锂法将构建的2种表达载体和pYES2/CT导入到出芽酵母酿酒酵母（S.cerevisiae），进行转化体的挑选。接着，按照Qiu等的方法（非专利文献24）培养得到的转化体（pYEEL01导入株、pYEEL02导入株以及mock导入株），进行来自菌体的脂肪酸的提取和甲酯化。但是，在培养基中作为Δ9延长酶的底物以最终浓度为0.2mM添加α-亚麻酸（ALA，C18:3Δ9，12，15）以及亚油酸（LA，C18:2Δ9，12），作为Δ6延长酶的底物以最终浓度为0.2mM添加硬脂四烯酸（STA，C18:4Δ6，9，12，15）和γ-亚麻酸（GLA，C18:3Δ6，9，12），作为Δ5延长酶的底物以最终浓度为0.2mM添加二十碳五烯酸（EPA，C20:5Δ5，8，11，14，17）以及花生四烯酸（AA，C20:4Δ5，8，11，14）的基础上，进行培养。接着，按照Abe等的方法（非专利文献17），进行甲酯化脂肪酸的气相色谱（GC）分析。在GC分析中使用气相色谱仪GC-2014（岛津制作所制造），在柱：HR-SS-10（30m×0.25mm，信和化工公司制造），柱温：150℃→（5℃/min）→220℃（10min），载气：He（1.3mL/min）的条件下进行。 [0278] 其结果可知，在pYEEL01导入株中，显示在将硬脂四烯酸（STA）转化为二十碳四烯酸（ETA，C20:4Δ8，11，14，17），将γ-亚麻酸（GLA）转化为二高γ-亚麻酸（DGLA，C20:3Δ8，11，14）的宿主（mock导入株）中没有的Δ6延长酶活性，另一方面，还显示将α-亚麻酸（ALA）转化为二十碳四烯酸（ETrA，C20:3Δ11，14，17）、将亚油酸（LA）转化为二十碳二烯酸（EDA，C20:3Δ11，14）的Δ9延长酶活性，将二十碳五烯酸（EPA）转化为ω3二十二碳五烯酸（ω 3DPA，C22:5Δ7，10，13，16，19)、将花生四烯酸（AA）转化为二十二碳四烯酸（DTA，C22:4Δ7， 10，13，16）的Δ5延长酶活性（表1）。 [0279] 另外，可知在pYEEL02导入株中，显示在将EPA转化为ω3DPA（C22:5Δ7，10，13，16，19）、将AA转化为DTA的宿主中没有的Δ5延长酶活性，另一方面，显示将STA转化为ETA、将GLA转化为DGLA的Δ6延长酶活性（表1）。由以上的结果可以确认，TaELO1为Δ6/Δ9/Δ5延长酶，TaELO2为Δ5/Δ6延长酶，通过实施例2-3、图2中所示的系统树分析显示与TaELO1和TaELO2的底物特异性预想不同的结果。 [0280] 表1： [0281] LA添加(0.2mM) ALA添加(0.2mM) [0282] [0283] GLA添加(0.2mM) SLA添加(0.2mM) [0284] [0285] ARA添加(0.2mM) EPA添加(0.2mM) [0286] [0287] 转化效率(%)=100×产物（面积）/底物（面积）+产物（面积） （n=1） [0288] [实施例2-5]通过PCR基因组步行法取得TaELO2 ORF上游和下游区域 [0289] 在用于破坏TaELO2的打靶载体中，通过PCR基因组步行法进行作为同源重组部位的TaELO2 ORF上游和下游区域的取得。以下表示其概要。 [0290] 将使用GY液体培养基培养第3天的金黄色破囊壶菌ATCC 34304菌体用液氮急速冷冻，用研钵粉碎至粉末状，按照非专利文献18中记载的方法提取基因组DNA之后溶解于适当量的TE中。基因组DNA的量和纯度的检测通过O.D.260和O.D.280测定来进行。接着，使用TaKaRa LA PCRTM体外克隆试剂盒（TAKARA BIO INC.制造），按照所附的指南用各种限制酶切断的基因组DNA中附加具有限制酶位点的盒序列构建基因组DNA库。接着，将制得的基因组DNA库作为模板，基于TaELO2的序列使用正方向寡核苷酸引物E2XbaI（实施例2-4记载。序列号：21）和elo3-F1（实施例2-2记载。序列号：10）、或者逆方向寡核苷酸引物E2HindIII（实施例2-4记载。序列号：20）和elo3-R1（实施例2-2记载。序列号：11），与试剂盒附属的盒序列互补的寡核苷酸引物一起按照所附的指南进行巢式PCR（nested PCR）。其结果，成功取得1,122bp的TaELO2 ORF上游序列（序列号：24）和1,204bp的TaELO2 ORF下游序列（序列号：25）。 [0291] [实施例2-6]将Neor作为选择标记的TaELO2打靶载体的构建 [0292] 通过融合PCR（fusion PCR）制作连接有TaELO2上游序列/人工合成Neor/TaELO2 ORF下游序列的DNA片段。以下表示使用的寡核苷酸引物。·KO Pro F SmaI(31mer：5’-CTC CCG GGT GGA CCT AGC GCG TGT GTC ACC T-3’)(序列号：26)·Pro R(25mer：5’-GGT CGC GTT TAC AAA GCA GCG CAG C-3’)(序列号：27)·SNeo F(52mer;5’-GCT GCG CTG CTT TGT AAA CGC GAC CAT GAT TGA ACA GGA CGG CCT TCA CGC T-3’)(序列号：28)·SNeoR(52mer;5’-TCG GGA GCC AGC CGG AAA CAG GTT CAA AAG AAC TCG TCC AGG AGG CGG TAG A-3’)(序列号：29)·Term F(23mer：5’-ACC TGT TTC CGG CTG GCT CCC GA-3’)(序列号： 30)·KO Term R SmaI(27mer：5’-ATC CCG GGG CCG AGA ACG GGG TCG CCC-3’)(序列号： 31) [0293] 在这些寡核苷酸引物中，KO Pro F SmaI/Pro R用于将实施例2-5中记载的金黄色破囊壶菌ATCC34304基因组DNA作为模板的TaELO2 ORF上游序列的扩增，SNeo F/SNeo R用于将人工合成Neor作为模板的人工合成Neor的扩增，Term F/KO Term R SmaI用于将实施例2-5中记载的金黄色破囊壶菌ATCC34304基因组DNA作为模板的TaELO2 ORF下游序列的扩增。另外，PCR反应条件将改性温度设为98℃10秒，退火和伸长反应根据引物的Tm和扩增产物的长度进行适当调节。 [0294] 其结果，成功连接2,696bp（序列号：32）的TaELO2 ORF上游序列/人工合成Neor/TaELO2 ORF下游序列，将使用pGEM-T easy Vector（Promega公司制造）将其TA克隆化的物质作为敲除载体，取名pTKONeor。 [0295] [实施例2-7]TKONeor导入到金黄色破囊壶菌（T.aureum）ATCC34304 [0296] 将实施例2-6中制得的人工合成Neor作为选择标记的TaELO2打靶载体，pTKONeor作为模板，使用1对寡核苷酸引物KO Pro F SmaI（实施例2-6，序列号：26）/KO Term R SmaI（实施例2-6，序列号：31）以及PrimeSTAR HS DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造），扩增TaELO2 ORF上游序列/人工合成Neor/TaELO2 ORF下游序列[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 3分钟,循环30次/68℃ 10分钟/4℃∞]，使用1%琼脂糖凝胶进行电泳之后提取该DNA片段，乙醇沉淀之后将其溶解于适当量的TE中。DNA片段的量和纯度的检测通过O.D.260和O.D.280测定进行。将得到的DNA片段以下称呼为TKONeor。 [0297] 接着，通过基因枪法进行DNA的打入操作。即，使用GY液体培养基，以25℃、150rpm将金黄色破囊壶菌（T.aureum）ATCC 34304培养至对数增殖期中期～后期之后，3,500×g、4℃下离心10分钟，除去上层清液。接着，将得到的菌体以成为原培养液的100倍浓缩的方式再悬浊于GY液体培养基中，将其中20μl份的细胞悬浊液在含有1mg/ml G418（Nacalai Tesque公司制造）的直径为5cm的PDA琼脂平板培养基上薄薄地均匀涂布成直径3cm左右，使之干燥。相对于此，使用PDS-1000/He体系（BioRad公司制造），在靶距-6cm、真空-26inches Hg、微载体大小-0.6μm、爆破膜（Rupture disk）（射入压）-1,100psi的条件下进行打入操作。其后，在PDA琼脂平板培养基中滴加100μl的PD液体培养基，重新扩大菌体，进行静置培养。其结果以4.7x101cfu/μg DNA的效率得到赋予了G418抗性能力的转化体。 [0298] [实施例2-8]将导入有TKONeor的转化体的基因组DNA作为模板的PCR [0299] 用牙签取出转化体7菌落之后，在含有0.5mg/ml G418（Nacalai Tesque公司制造）的GY液体培养基中接种。多次次代之后，用实施例2-5记载的方法从菌体中提取基因组DNA，乙醇沉淀之后溶解于适当量的TE中。提取的基因组DNA的量和纯度的检测通过O.D.260和O.D.280测定来进行。接着，将得到的转化体以及野生株的基因组DNA作为模板，使用各寡核苷酸引物对进行PCR。使用的寡核苷酸引物对为以下的引物对（图3A）。 [0300] (1)Neor检测-SNeoF（实施例2-6记载。序列号：28）和SNeoR（实施例2-6记载。序列号：29）， [0301] (2)KO确认1-KO Pro F SmaI（实施例2-6记载。序列号：26）和KO Term R SmaI（实施例2-6记载。序列号：31） [0302] (3)KO确认2-E2KO ProF EcoRV（30mer：5’-GGA TAT CCC CCG CGA GGC GAT GGC TGC TCC-3’）（序列号：33）和SNeoR [0303] (4)KO确认3–SneoF和E2KO Term R EcoRV（30mer：5’-TGA TAT CGG GCC GCG CCC TGG GCC GTA GAT-3’）（序列号：34） [0304] (5)TaELO2扩增-E2HindIII（实施例2-4记载。序列号：20）和E2XbaI（实施例2-4记载。序列号：21） [0305] 其结果确认，分析的7克隆中6克隆为通过随机整合的转化体，1克隆通过同源重组TaELO2ORF向Neor置换（图3B，泳道9、13）。然而，同时可知TaELO1ORF扩增（图3B，泳道17）。以上结果表明，金黄色破囊壶菌（T.aureum）ATCC34304为2倍体以上或者TaELO2为多拷贝基因的可能性。 [0306] [实施例2-9]通过印迹杂交确认TaELO1的拷贝数 [0307] 以下的实验按照《DIG说明书集[日语版]8th，Roche Applied Science》（非专利文献25）记载的方法进行。即，用各种限制酶切断野生株的基因组DNA之后，供给到每1泳道每2.5μg使用0.7%的SeaKemR GTGR agarose（TAKARA BIO INC.制造）的电泳。在尼龙薄膜（HybondTM-N+，GE Healthcare公司制造）将其转移，与使用PCR DIG Probe Synthesis Kit（Roche Applied Science公司制造）制得的DIG标记探针在48℃、16hr下使之杂交。用于制作DIG标记探针的1对寡核苷酸引物为TaELO2det F（25mer：5’-GTA CGT GCT CGG TGT GAT GCT GCT C-3’）（序列号：35）和TaELO2det R（24mer：5’-GCG GCG TCC GAA CAG GTA GAG CAT-3’）（序列号：36）[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,65℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 7分钟/4℃∞]。杂交后的探针的检测使用显色法（NBT/BCIP溶液）进行。 [0308] 其结果表明，由于用各种限制酶处理过的泳道全部检测出单一条带（图4），因此，TaELO2为单拷贝基因。由此给出了金黄色破囊壶菌（T.aureum）ATCC34304为2倍体以上。 [0309] [实施例2-10]导入了TKONeor的转化体通过印迹杂交进行的评价 [0310] 用实施例2-9记载的方法进行印迹杂交。即，使用用1对寡核苷酸引物uprobe F（35mer：5’-ATC CGC GTA TAT ATC CGT AAA CAA CGG AAC ATT CT-3’）（序列号：37）和uprobe R（26mer：5’-CTT CGG GTG GAT CAG CGA GCG ACA GC-3’）（序列号：38）通过PCR[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,65℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 7分钟/4℃∞]扩增的DIG标记探针，对于用EcoRV和PstI消化的野生株和转化体的基因组DNA使用显色法（NBT/BCIP溶液）进行印迹杂交。在该情况下，野生型等位基因检测出约1.2kbp的DNA片段，通过同源重组TaELO2ORF置换为Neor的变异等位基因中检测出约2.5kbp的DNA片段（图5A）。 [0311] 转化体中在检测出变异型等位基因的同时还检测出野生型等位基因的条带（图5B）的分析结果表明，金黄色破囊壶菌（T.aureum）ATCC34304为2倍体以上。 [0312] [实施例2-11]将Hygr作为选择标记的TaELO2打靶载体的构建 [0313] 为了破坏残留的野生型等位基因，进行将Hygr作为选择标记的TaELO2打靶载体的构建。 [0314] 首先，通过融合PCR进行金黄色破囊壶菌（T.aureum）ATCC34304来源的Ubiquitin启动子序列和Hygr的连接。以下表示使用的寡核苷酸引物。·ubi-600p F（27mer：5’-GCC GCA GCG CCT GGT GCA CCC GCC GGG-3’）（序列号：39）·ubi-hygro R（59mer：5’-TCG CGGG TGA GTT CAG GCT TTT TCA TGT TGG CTA GTG TTG CTT AGG TCG CTT GCT GCT G-3’）（序列号：40）·ubi-hygro F（57mer;5’-AGC GAC CTA AGC AAC ACT AGGC CAA CAT GAA AAA GCC TGA ACT CAC CGC GAC GTC TG-3’）（序列号：41）·hygro R（29mer;5’-CTA TTC CTT TGC CCT CGG ACG AGT GCT GG-3’）（序列号：42） [0315] 在这些寡核苷酸引物中，ubi-600p F/ubi-hygro R用于将实施例2-5所记载的金黄色破囊壶菌（T.aureum）ATCC34304基因组DNA作为模板进行的金黄色破囊壶菌（T.aureum）ATCC34304来源的Ubiquitin启动子序列的扩增。ubi-hygro F/hygro R用于将pcDNA 3.1 Zeo（Invitrogen）作为模板进行的人工合成Hygr的扩增。另外，PCR反应条件将改性温度设为98℃10秒，退火和伸长反应根据引物的Tm和扩增产物的长度进行适当调节。 [0316] 其结果，成功地连接1,636bp（序列号：43）的金黄色破囊壶菌（T.aureum）ATCC 34304来源的Ubiquitin启动子序列/Hygr，将使用pGEM-T easy Vector（Promega公司制造）将其TA克隆化的物质取名为pTub600Hygr。 [0317] 接着，将pTub600Hygr作为模板，使用PrimeSTAR HS DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造），使用1对寡核苷酸引物ubi-600p F NheI（33mer：5’-GTG CTA GCC GCA GCG CCT GGT GCA CCC GCC GGG-3’）（序列号：44）和hygro R XbaI（37mer：5’-GTT CTA GAC TAT TCC TTT GCC CTC GGA CGA GTG CTG G-3’）（序列号：45）进行PCR[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 3分钟,循环30次/68℃ 10分钟/4℃∞]，制备在5’末端附加有NheI、3’末端附加有XbaI的金黄色破囊壶菌（T.aureum）ATCC34304来源的Ubiquitin启动子序列/Hygr DNA片段。另外，将实施例2-6记载的pTKONeor作为模板，使用PrimeSTAR HS DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造），使用1对寡核苷酸引物KO vec F XbaI（37mer：5’-GTT CTA GAC CTG TTT CCG GCT GGC TCC CGA GCC ATG C-3’）（序列号：46）和KO vec R NheI（40mer：5’-GTG CTA GCG GTC GCG TTT ACA AAG CAG CGC AGC AAC AGA A-3’）（序列号：47）进行PCR[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 3分钟,循环30次/68℃ 10分钟/4℃ ∞]，除去实施例2-6记载的pTKONeor的Neor，制备在3’末端附加有NheI、在5’末端附加有XbaI位点的直链状载体。用限制酶NheI和XbaI将两DNA片段消化之后，使用琼脂糖凝胶进行精制，使用Ligation Convinience Kit（Nippon Gene公司制造）构建环状载体。 [0318] 将构建的Hygr作为选择标记的TaELO2打靶载体将pGEM-T easy Vector（Promega公司制造）作为基本骨架，作为插入序列具有3,537bp（序列号：48）的TaELO2ORF上游序列/金黄色破囊壶菌（T.aureum）ATCC 34304来源的Ubiquitin启动子序列/Hygr/TaELO2 ORF下游序列。将其命名为pTKOub600Hygr。 [0319] [实施例2-12]KOub600Hygr的再导入和将基因组DNA作为模板通过PCR、印迹杂交、RT-PCR进行的转化体的评价 [0320] 将构建的Hygr作为选择标记的TaELO2打靶载体pTKOub600Hygr（实施例2-11记载）作为模板，使用1对寡核苷酸引物KO Pro F SmaI（实施例2-6，序列号：26）/KO Term R SmaI（实施例2-8，序列号：31）和PrimeSTAR HS DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造），扩增TaELO2ORF上游序列/金黄色破囊壶菌（T.aureum）ATCC 34304来源的Ubiquitin启动子序列/Hygr/TaELO2ORF下游序列[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 3.5分钟,循环30次/68℃ 10分钟/4℃∞]，将得到的DNA片段命名为KOub600Hygr。将其相对于实施例2-6中得到的转化体用同样的方法导入，在含有1mg/ml G418（Nacalai Tesque公司制造）的PDA琼脂平板培养基上静置培养24小时之后，回收菌体，继续在含有1mg/ml G418（Nacalai Tesque公司制造）和2mg/ml潮霉素B（和光纯药工业公司制造）的PDA琼脂平板培养基上静置培养，得到多数转化体（导入效率：1.02x103cfu/μg DNA）。 [0321] 取出其中50克隆，在含有1mg/ml G418（Nacalai Tesque公司制造）和2mg/ml潮霉素B（和光纯药工业公司制造）的GY液体培养基中多次次代培养之后，用与实施例2-5记载的同样的方法提取基因组DNA，乙醇沉淀之后溶解于适当量的TE中。提取的基因组DNA的量和纯度的检测通过O.D.260和O.D.280测定进行。接着，将得到的转化体以及野生株的基因组DNA作为模板，使用各种寡核苷酸引物对进行PCR[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 1分钟,循环30次/68℃10分钟/4℃ ∞]。使用的寡核苷酸引物对如下所示（图6A）。 [0322] （1）TaELO2ORF检测–SneoF（实施例2-6记载。序列号：28）和SNeoR（实施例2-6记载。序列号：29） [0323] （2）KO确认-E2KO Pro F EcoRV（实施例2-8记载。序列号：33）和ubi-hygro R（实施例2-11记载。序列号：40） [0324] 其结果表明，分析的50克隆中，14克隆为以置换TaELO2 ORF的形态进行了同源重组的转化体（图6B，箭形符号）。另外，关于这些克隆，确认TaELO2ORF没有扩增（图6C）。 [0325] 接着，进行使用实施例2-10记载的方法的印迹杂交。即，使用1对寡核苷酸引物uprobe F（序列号：37）和uprobe R（序列号：38）使用制得的DIG标记探针，对用EcoRV和PstI消化的野生株和转化体的基因组DNA进行使用了显色法（NBT/BCIP溶液）的印迹杂交。在该情况下，野生型等位基因检测出约1.2kbp的DNA片段，通过同源重组TaELO2 ORF置换为Neor的变异等位基因中检测出约2.5kbp的DNA片段，通过同源重组TaELO2 ORF置换为Hygr的变异等位基因中检测出约1.9kbp的DNA片段（图7A）。 [0326] 分析的结果，得到的转化体中约2.5kbp的野生型等位基因的条带消失，取而代之，TaELO2 ORF置换为Hygr新检测出约1.9kbp的变异等位基因的条带（图7B）。 [0327] 同样地，使用1对寡核苷酸引物TaELO2probe F（30mer：5’-ATG GCG ACG CGC ACC TCG AAG AGC GCT CCG-3’）（序列号：49）和TaELO2probe R（30mer：5’-AGG ATC ATC ATG AAC GTG TCG CTC CAG TCG-3’）（序列号：50），调制用PCR[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,65℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 7分钟/4℃ ∞]检测TaELO2的DIG标记探针，对用EcoRV消化的野生株和转化体（克隆1、8、9、10）的基因组DNA进行使用了显色法（NBT/BCIP溶液）的印迹杂交。在该情况下，TaELO2作为约2.5kbp的DNA片段被检测出（图7A）。 [0328] 分析的结果可知，相对于在野生株中检测出TaELO2（图8，泳道1），在转化体中完全没有检测出（图8，泳道2-5）。 [0329] 进一步，为了用mRNA水平验证TaELO2破坏，通过RT-PCR进行TaELO2 mRNA的检测。从使用GY液体培养基培养第3天的野生株以及转化体（泳道1、8、9、10）的菌体中与实施例2- 1的情况同样地使用Sepasol RNA I Super（Nacalai Tesque公司制造）提取总RNA。接着使用RNeasy Mini Kit（QIAGEN公司制造）按照所附的指南使用Recombinant DNase I（TAKARA BIO INC.制造）在37℃下将50μg清除后的总RNA处理1小时，进行污染的基因组DNA的分解除去。接着，将得到的总RNA作为模板，使用oligo(dT)primer（Novagen公司制造）和PrimeScript Reverse Transcriptase（TAKARA BIO INC.制造），按照所附的手册调制单链cDNA文库。进一步，将得到的单链cDNA文库作为模板，使用1对寡核苷酸引物E2HindIII（实施例2-4记载。序列号：20）和E2XbaI（实施例2-4记载。序列号：21）以及LA taq Hot Start Version（TAKARA BIO INC.制造）扩增TaELO2ORF[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 1分钟,循环30次/68℃ 10分钟/4℃∞]。 [0330] 其结果可知，在转化体（克隆1、8、9、10）中完全没有检测到野生株中检测到的TaELO2mRNA（图9，泳道5）（图9，泳道1-4）。 [0331] 由以上的结果可知，成功地取得完全破坏了TaELO2的TaELO2缺损纯合子。另外，由该结果可以判断，金黄色破囊壶菌（T.aureum）ATCC34304为2倍体。 [0332] [实施例2-13]野生株和TaELO2缺损纯合子的脂肪酸组成的比较 [0333] 通过甲酯化的脂肪酸的GC分析进行实施例2-12中得到的TaELO2缺损纯合子和野生株的脂肪酸组成的比较。即，用GY液体培养基培养5天之后回收TaELO2缺损纯合子和野生株的菌体，用实施例2-4记载的方法进行来自菌体的脂肪酸的提取和甲酯化以及GC分析。GC分析中使用气相色谱仪GC-2014（岛津制作所制造），在柱：HR-SS-10（30m×0.25mm，信和化工公司制造），柱温：150℃→（5℃/min）→220℃（10min），载气：He（1.3mL/min）的条件下进行。 [0334] 其结果，在TaELO2缺损纯合子中，作为TaELO2的底物的EPA量增加至野生株的2倍左右，并且观察到下游的代谢产物的DHA量的减少（图10）。 [0335] 在网粘菌中，通过破坏构成去饱和酶/延长酶路径的基因改变了脂肪酸组成的例子是由本发明首次提出的。即，不仅明确表示网粘菌金黄色破囊壶菌（T.aureum）中的去饱和酶/延长酶路径与PUFA生物合成相关，而且意味着通过敲除该构成基因，可以改变脂肪酸组成。可以预想将来通过组合了外来去饱和酶/延长酶基因的过表达或者PUFA-PKS基因的敲除等的PUFA生物合成路径的人工构建，可以分子培育选择性地大量生产产业上有用的PUFA的网粘菌类。 [0336] 实施例3 [0337] [Parietichytrium sarkarianum的C20延长酶基因的破坏] [0338] [实施例3-1]SV40终止子序列的亚克隆 [0339] 将pcDNA 3.1 Myc-His vector作为模板，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增SV40终止子序列。使用的PCR引物如下所述，RHO58设定于SV40终止子序列上并且包含BglII和BamHI接头序列。RHO52设定于SV40终止子序列上，并且包含BglII序列。[RHO58：34mer：5’-CAG ATC TGG ATC CGC GAA ATG ACC GAC CAA GCG A-3’（序列号：51）、RHO52：24mer：5’-ACG CAA TTA ATG TGA GAT CTA GCT-3’（序列号：52）]。在下述的条件下扩增之后，克隆于pGEM-T easy vector（Promega公司制造）。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,60℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 1分钟]。用大肠杆菌扩增之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。将其命名为pRH27。 [0340] 在图11中表示含有亚克隆的SV40终止子序列（342bp，序列号：53）的质粒（pRH27）。 [0341] [实施例3-2]人工合成新霉素抗性基因盒的制作 [0342] 用GY培养基培养金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304，将对数增殖期后期的细胞在4℃下以3,500×g离心5分钟，制成小球，用液氮冷冻后破碎。苯酚提取细胞破碎液之后，使之乙醇沉淀，将沉淀溶解于TE溶液。将溶解于TE溶液的核酸在37℃下RNase处理30分钟，分解RNA，再次苯酚提取之后，使之乙醇沉淀，将沉淀溶解于TE溶液中。测定A260/280，算出DNA浓度。 [0343] 将其作为模板，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer（TAKARA BIO INC.制造）扩增ubiquitin启动子序列（619bp，序列号：54）。使用的PCR引物如下所述，RHO53设定于ubiquitin启动子序列上并且含有BglII接头序列。TKO1含有ubiquitin启动子序列和人工合成新霉素抗性基因序列。[RHO53：36mer：5’-CCC AGA TCT GCC GCA GCG CCT GGT GCA CCC GCC GGG-3’（序列号：55）、TKO1：58mer：5’-CGT GAA GGC CGT CCT GTT CAA TCA TGT TGG CTA GTG TTG CTT AGG TCG CTT GCT GCT G-3’（序列号：56）。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 1分钟,循环30次/68℃ 1分钟]。 [0344] 将人工合成新霉素抗性基因序列作为模板，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer（TAKARA BIO INC.制造）扩增人工合成新霉素抗性基因序列（826bp，序列号：57）。使用的PCR引物如下所述，TKO2包含ubiquitin启动子序列和人工合成新霉素抗性基因序列。RHO57包含人工合成新霉素抗性基因序列，并且具有BglII接头序列。[TKO2：54mer：5’-AGC GAC CTA AGC AAC ACT AGC CAA CAT GAT TGA ACA GGA CGG CCT TCA CGC TGG-3’（序列号：58）、RHO57：26mer：5’-CAG ATC TCA AAA GAA CTC GTC CAG GA-3’（序列号：59）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 1分钟,循环30次/68℃ 1分钟]。 [0345] 将序列号54和57作为模板，按照非专利文献19记载的方法使用RHO53（序列号：55）和RHO57（序列号：59）进行融合PCR。酶使用LA taq Hot start version（TAKARA BIO INC.制造），在PCR循环：94℃ 2分钟/94℃ 20秒,55℃ 30秒,68℃ 1分钟,循环30次/68℃ 1分钟（但是，从55℃到68℃为1℃/10秒）的条件下扩增之后，用BglII消化（图12）。 [0346] 将这样融合的金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC34304来源的ubiquitin启动子-人工合成新霉素抗性基因序列（1395bp，序列号：60）用BglII消化，将其与实施例3-1记载的pRH27的BamHI位点接合。用大肠杆菌扩增得到的质粒之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。将其命名为pRH31。 [0347] 在图13中表示制得的人工合成新霉素抗性基因盒（pRH31）。 [0348] [实施例3-3]潮霉素抗性基因盒的制作 [0349] 将金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304基因组DNA作为模板，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer（TAKARA BIO INC.制造）扩增ubiquitin启动子序列（617bp，序列号：61）。使用的PCR引物如下所述，RHO53设定于ubiquitin启动子序列上，并且包含BglII接头序列。KSO8包含ubiquitin启动子序列和潮霉素抗性基因序列。[RHO53：36mer：5’-CCC AGA TCT GCC GCA GCG CCT GGT GCA CCC GCC GGG-3’（实施例3-2记载。序列号：55）、KSO8：58mer：5’-TCG CGG TGA GTT CAG GCT TTT TCA TGT TGG CTA GTG TTG CTT AGG TCG CTT GCT GCT G-3’（序列号：62）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,68℃ 2分钟,循环30次/68℃ 2分钟]。 [0350] 将pcDNA3.1/Hygro（invitrogen公司制造）作为模板，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer（TAKARA BIO INC.制造）扩增潮霉素抗性基因（1058bp，序列号：63）。使用的PCR引物如下所述，KSO7包含ubiquitin启动子序列和潮霉素抗性基因序列。RHO56包含潮霉素抗性基因，并且具有BglII接头序列。[KSO7：56mer：5’-AGC GAC CTA AGC AAC ACT AGC CAA CAT GAA AAA GCC TGA ACT CAC CGC GAC GTC TG-3’（序列号：64）、RHO56：36mer：5’-CAG ATC TCT ATT CCT TTG CCC TCG GAC GAG TGC TGG-3’（序列号： 65）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,68℃ 2分钟,循环30次/68℃ 2分钟]。 [0351] 将序列号61和63作为模板，按照非专利文献19记载的方法使用RHO53（实施例3-2记载。序列号：55）和RHO56（序列号：65）进行融合PCR。酶使用LA taq Hot start version（TAKARA BIO INC.制造），在下述的条件下扩增之后，用BglII消化。[PCR循环：94℃ 2分钟/94℃ 20秒,55℃ 30秒,68℃ 1分钟,循环30次/68℃ 1分钟（但是，从55℃到68℃为1℃/10秒）（图14）。 [0352] 将这样融合的金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC34304来源的ubiquitin启动子-pcDNA3.1/Hygro（invitrogen公司制造）来源的潮霉素抗性基因（1625bp，序列号：66）用BglII消化，将其与实施例3-1、图11记载的pRH27的BamHI位点接合。 用大肠杆菌扩增得到的质粒之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。将其命名为pRH32。 [0353] 在图15中表示制得的人工合成新霉素抗性基因盒（pRH32）。 [0354] [实施例3-4]Parietichytrium属C20延长酶基因的克隆 [0355] 提取用实施例3-2记载的方法提取Parietichytrium sarkarianum SEK364基因组DNA，解读基因组。 [0356] 将保留于C20延长酶基因的区域作为目标，合成正方向（PsTaELO2F1；5’-CCT TCG GCG CTC CTC TTA TGT ATG T-3’）（序列号：67）、和逆方向（PsTaELO2R2；5’-CAA TGC AAG AGG CGA ACT GGG AGA G-3’）（序列号：68）的寡核苷酸。接着，将用实施例3-2记载的方法制得的Parietichytrium sarkarianum SEK364基因组DNA作为模板，使用LA taq Hot start version（TaKaRa）进行使用了寡核苷酸PsTaELO2F1和PsTaELO2R2的PCR[PCR循环：98℃1分钟/98℃ 10秒,60℃ 30秒,72℃ 1min,循环30次/72℃7分钟/4℃∞]。将得到的特异性扩增产物凝胶精制，通过直接测序分析其碱基序列，由于显示与已知的C20延长酶基因的序列显著的同源性，因此，表明其为Parietichytrium sarkarianum SEK364来源的C20延长酶基因的部分序列。 [0357] 接着，与实施例2-2的情况同样地，通过3’和5’RACE进行Parietichytrium sarkarianum SEK364来源的C20延长酶基因的克隆。首先，设计正方向寡核苷酸引物（PsRACE F1；5’-TGG GGC TCT GGA ACC GCT GCT TAC G-3’）（序列号：69）和（PsRACE F2；5’-CTT CCA GCT CTC CCA GTT CGC CTC T-3’）（序列号：70）、逆方向寡核苷酸引物（PsRACE R1；5’-CGG GTT GTT GAT GTT GAG CGA GGT G-3’）（序列号：71）和（PsRACE R2；5’-CCC ACG CCA TCC ACG AGC ACA CCA C-3’）（序列号：72）。接着，通过SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech公司制造）将制得的cDNA文库作为模板，进行使用了合成套头特异性寡核苷酸以及所述的寡核苷酸PsRACE F1或PsRACE R1的3’-和5’-RACE[PCR循环： 94℃ 30秒循环5次/94℃ 30秒,70℃ 30秒,72℃ 3min,循环5次/94℃ 30秒,68℃ 30秒,72℃ 3分钟,循环25次/4℃∞]。接着，将得到的两PACE产物作为模板，进行使用了合成套头特异性寡核苷酸以及所述的寡核苷酸PsRACEF2或PsRACE R2的巢式PCR[PCR循环：94℃ 1分钟/94℃ 30秒,68℃ 30秒,72℃ 3min,循环25次/72℃ 10分钟/4℃ ∞]。将得到的特异性产物凝胶精制，使用了pGEM-T easy Vector（Promega公司制造）的TA克隆化之后，分析碱基序列，其结果确认，为Parietichytrium sarkarianum SEK364来源的C20延长酶基因。 [0358] 进一步，将用实施例3-2记载的方法提取的Parietichytrium属的基因组DNA作为模板，通过LA taq Hot start version（TAKARA BIO INC.制造）扩增包含C20延长酶基因序列的序列（957bp，序列号：73）。使用的PCR引物如下所述，RHO153包含起始密码子，并且具有BamHI位点作为接头序列。RHO154含有终止密码子，并且具有BamHI位点作为接头序列。[RHO153：32mer：5’-CCC GGA TCC ATG GCA GCT CGC GTG GAG AAA CA-3’（序列号：74）、RHO154：33mer：5’-CCC GGA TCC TTA CTG AGC CTT CTT GGA GGT CTC-3’（序列号：75）]。 [PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 1分钟,循环30次/68℃ 2分钟]。 [0359] 得到的DNA片段克隆于pGEM-T easy vector，用大肠杆菌扩增之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。 [0360] 克隆Parietichytrium属C20延长酶基因936bp（序列号：76）。将其命名为pRH80（图16）。以序列号：77表示氨基酸序列。 [0361] [实施例3-5]用于制作Parietichytrium属C20延长酶基因打靶载体的基础质粒的制作 [0362] 将实施例3-4中制作的pRH80（图16）作为模板，以将BglII位点插入C20延长酶基因序列中间部分的方式准备反向设定的引物对（primer set），用PrimeSTAR Max DNA Polymerase（TAKARA BIO INC.制造）进行扩增。使用的PCR引物如下所述，都具有BglII接头序列。[RHO155：26mer：5’-ACA AAG ATC TCG ACT GGA CCG ACA CC-3’（序列号：78）、RHO156：27mer：5’-AGT CGA GAT CTT TGT CAG GAG GTG GAC-3’（序列号：79）]。[PCR循环：98℃2分钟/98℃10秒,56℃15秒,72℃1分钟,循环30次/72℃1分钟]。在上述条件下扩增之后，用BglII消化之后，进行自身连接。连接后的样品用大肠杆菌扩增之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。将其命名为pRH83。以序列号：80表示插入有BglII位点的C20延长酶基因序列935bp。 [0363] 将制得的用于制作Parietichytrium属C20延长酶基因打靶载体的基础质粒（pRH83）表示于图17中。 [0364] [实施例3-6]打靶载体的制作（人工合成新霉素抗性基因和潮霉素抗性基因）[0365] 用BglII消化实施例3-2记载的pRH31（图13），将含有人工合成新霉素抗性基因盒的DNA片段连接于实施例3-5记载的pRH83（图17）的BglII位点。将其命名为pRH85。 [0366] 用BglII消化实施例3-3记载的pRH32（图15），将含有潮霉素抗性基因盒的DNA片段连接于实施例3-5记载的pRH83（图17）的BglII位点。将其命名为pRH86。 [0367] 在图18中表示制得的2种打靶载体（pRH85和86）。 [0368] [实施例3-7]C20延长酶基因打靶载体导入 [0369] 将实施例3-6中制得的2种打靶载体作为模板，将RHO153（实施例3-4记载，序列号：74）和RHO154（实施例3-4记载，序列号：75）用作引物，通过PrimeSTAR Max DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增基因。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,68℃ 2分钟,循环30次/68℃ 2分钟]。苯酚氯仿提取、氯仿提取之后，使DNA乙醇沉淀，将沉淀溶解于0.1×TE。测定A260/280，算出DNA浓度。将实施例3-6记载的pRH85（图18）作为模板时得到的导入片段为 2661bp，并且成为Parietichytrium属C20延长酶上半段序列-SV40终止子序列-人工合成新霉素抗性基因序列-ubiquitin启动子序列-Parietichytrium属C20延长酶下半段序列的排列（序列号：81）。将实施例3-6记载的pRH86（图18）作为模板时得到的导入片段为2892bp，并且成为Parietichytrium属C20延长酶上半段序列-SV40终止子序列-潮霉素抗性基因序列-ubiquitin启动子序列-Parietichytrium属C20延长酶后半的排列（序列号：82）。 [0370] 在GY培养基中培养Parietichytrium sarkarianum SEK364株4天，用于基因导入处于对数增殖期的细胞。相对于OD600=1～1.5当量的细胞，通过基因枪法（微载体：0.6微米的金粒子，靶距：6cm，室真空（chamber vacuum）：26mmHg，爆破膜（Rupture disk）：1,550PSI）导入0.625μg的DNA片段。基因导入的细胞在24小时的恢复时间之后，涂布于PDA琼脂平板培养基（含有2mg/ml G418或者含有2mg/ml潮霉素）。其结果，每1次打入得到10～20个耐药性菌株。 [0371] [实施例3-8]C20延长酶基因基因打靶同源重组体的鉴定 [0372] 用实施例3-2记载的方法从Parietichytrium sarkarianum SEK364株以及C20延长酶基因杂同源重组体（hetero homologous recombinant）、C20延长酶基因同源重组体（homo homologous recombinant）（基因破坏株）中提取基因组DNA之后，测定A260/280，算出DNA浓度。将其作为模板，使用LA taq Hot start version（TAKARA BIO INC.制造）进行基因组结构确认的PCR。将使用的引物的位置、用于扩增的组合、扩增产物的预想尺寸表示于图19中。RHO184设定于C20延长酶上游，RHO185设定于下游，RHO142和RHO143设定于人工合成新霉素抗性基因上，RHO140和RHO141设定于潮霉素抗性基因上。[RHO140：20mer：5’-GGT TGA CGG CAA TTT CGA TG-3’（序列号：83）、RHO141：22mer：5’-CCT CCT ACA TCG AAG CTG AAA G-3’（序列号：84）、RHO142：21mer：5’-CTT CTC GGG CTT TAT CGA CTG-3’（序列号：85）、RHO143：22mer：5’-TAA GGT CGG TCT TGA CAA ACA G-3’（序列号：86）、RHO184：24mer：5’-AGT AGT CCC CGA TTT GGT AGT TGA-3’（序列号：87）、RHO185：22mer：5’-GGC AGA GAG CAA AAA CAC GAG C-3’（序列号：88）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 4分钟,循环30次/68℃ 7分钟]。 [0373] 可以得到野生型等位基因（Wt allele）中没有扩增，人工合成新霉素抗性基因等位基因（NeoR allele）以及潮霉素抗性基因等位基因（HygR allele）中没有扩增的C20延长酶敲除株（图20）。 [0374] [实施例3-9]通过C20延长酶破坏产生的脂肪酸组成的变化 [0375] 在GY培养基中培养Parietichytrium sarkarianum SEK364和基因破坏株。将对数增殖期后期的细胞在4℃下以3,000rpm离心10分钟，制成小球，在0.9%NaCl中悬浊、清洗。接着，在4℃下以3,000rpm离心10分钟，将小球在灭菌水中悬浊、清洗。将其进一步以3,000rpm离心10分钟，除去上层清液，冷冻干燥。 [0376] 在冷冻干燥后的细胞中加入2ml氢氧化钾甲醇溶液（7.5%KOH in95% methanol），涡流之后，用超声波粉碎菌体（80℃、30分钟）。接着，加入500μl的灭菌水涡流之后，加入2ml的正己烷涡流。接着，以3,000rpm离心10分钟，除去上层。再次加入2ml正己烷涡流，以3,000rpm离心10分钟，除去上层。在残留的下层中添加1ml的6N HCl，涡流之后，加入2ml正己烷涡流。接着，以3,000rpm离心10分钟，回收上层。再次加入2ml正己烷进行涡流，以3, 000rpm离心10分钟，回收上层。用氮气浓缩蒸发回收的上层。在浓缩蒸发的样品中加入2ml的3N HCl甲醇溶液，在80℃下培养一晚。 [0377] 将样品冷却至室温，添加1ml的0.9%NaCl。接着，加入2ml正己烷进行涡流。以3,000rpm离心10分钟，回收上层。再次加入2ml正己烷进行涡流，以3,000rpm离心10分钟，回收上层。在回收的上层中少量添加无水硫酸钠之后，进行涡流。以3,000rpm离心10分钟，回收上层。用氮气浓缩蒸发回收的上层。将浓缩蒸发的样品溶解于0.5ml正己烷中，将1μl供给GC分析。在GC分析中使用气相色谱仪GC-2014（岛津制作所制造），在柱：HR-SS-10（30m× 0.25mm，信和化工公司制造），柱温：150℃→（5℃/min）→220℃（10min），载气：He（1.3mL/min）的条件下进行。 [0378] 其结果，如果敲除Parietichytrium sarkarianum SEK364中的C20延长酶的话，碳链长22以上的脂肪酸减少，碳链长20的脂肪酸增加（图21）。图22中表示将野生型菌株设为100%时的比例。这些结果，花生四烯酸增加至约10倍，EPA增加至约8倍，另外，DPA减少至约 1/4，DHA减少至约1/5。 [0379] 实施例4 [0380] [金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）的PUFA PKS路径相关基因：OrfA的破坏] [0381] [实施例4-1]PUFA PKS路径相关基因：OrfA的上游序列的克隆 [0382] 用实施例3-2记载的方法从金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC34304中提取基因组DNA之后，测定A260/280，算出DNA浓度。使用其，并且使用LA PCRTM体外克隆试剂盒（TAKARA BIO INC.制造），制作基因组盒文库。在专利文献7中记载的PUFA PKS路径相关基因：OrfA上设定PCR lower primer[RHO20：23mer：5’-CGA TGA AAG GTC ACA GAA GAG TC-3’（序列号：89）]，与上述记载的试剂盒附属盒文库组合，扩增DNA[1st PCR循环：98℃2分钟/98℃ 30秒,56℃ 30秒,72℃ 4分钟,循环30次/72℃分钟]。接着，将1st PCR扩增产物稀释100倍，组合PCR lower primer[RHO20]以及上述记载的试剂盒附属嵌套引物，扩增DNA[2nd PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,56℃ 30秒,72℃ 4分钟,循环30次/72℃ 5分钟]。得到的DNA片段克隆于pGEM-T easy vector，用大肠杆菌扩增之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。 [0383] 克隆含有OrfA的上游3,181bp（序列号：90）的3,377bp（序列号：91）的DNA片段。3,181bp作为OrfA的上游DNA序列信息明确。 [0384] [实施例4-2]PUFA PKS路径相关基因：OrfA的下游序列的克隆 [0385] 将实施例4-1中制得的基因组盒文库用作模板。在专利文献7中记载的PUFA PKS路径相关基因：OrfA上设定PCR upper primer[RHO21：21mer：5’-CAG GGC GAG CGA GTG TGG TTC-3’（序列号：92）]，用实施例4-1记载的方法扩增DNA。将得到的DNA片段克隆于pGEM-T easy vector，用大肠杆菌扩增之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。克隆含有OrfA的下游1,160bp（序列号：93）的1, 204bp的DNA片段（序列号：94）。 [0386] 在序列号94上再次制作PCR upper primer[RHO28：20mer：5’-TGA TGC CGA TGC TAC AAA AG-3’（序列号：95）]，用实施例4-1记载的方法扩增DNA。将得到的DNA片段克隆于pGEM-T easy vector，用大肠杆菌扩增之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。 [0387] 进一步，克隆含有下游序列的1,488bp的DNA片段（序列号：96）。作为OrfA的下游DNA序列信息明显总计2,551bp（序列号：97）。 [0388] [实施例4-3]PUFA PKS路径相关基因：OrfA打靶载体的制作 [0389] 将金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC34304的基因组DNA作为模板，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增18S rDNA序列（1835bp，序列号：98）。使用的PCR引物如下所述，TMO30设定于18S rDNA序列上。TMO31含有18S rDNA序列和EF1α启动子序列。[TMO30：30mer：5’-CGA ATA TTC CTG GTT GAT CCT GCC AGT AGT-3’（序列号：99）、TMO31：46mer：5’-GTA ACG GCT TTT TTT GAA TTG CAG GTT CAC TAC GCT TGT TAG AAA C-3’（序列号：100）]。[PCR循环：98℃ 10秒/98℃ 10秒,58℃ 30秒, 72℃ 2分钟,循环30次/72℃ 2分钟]。另外，将金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC34304基因组DNA作为模板，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增EF1α启动子序列（661bp，序列号：101）。使用的PCR引物如下所述，TMO32包含 18S rDNA序列和EF1α启动子序列。TMO33包含EF1α启动子序列和人工合成新霉素抗性基因序列。[TMO32：46mer：5’-GGT TTC CGT AGT GAA CCT GCA ATT CAA AAA AAG CCG TTA CTC ACA T-3’（序列号：102）、TMO33：46mer：5’-GCG TGA AGG CCG TCC TGT TCA ATC ATC TAG CCT TCC TTT GCC GCT G-3’（序列号：103）]。[PCR循环：98℃ 10秒/98℃ 10秒,58℃ 30秒, 72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 1分钟]。 [0390] 将人工合成新霉素抗性基因作为模板，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增人工合成新霉素抗性基因序列（835bp，序列号：104）。使用的PCR引物如下所述，TMO34包含EF1α启动子序列和人工合成新霉素抗性基因序列。TMO35包含人工合成新霉素抗性基因序列和EF1α终止子序列。[TMO34：45mer：5’-CAT CGG CAA AGG AAG GCT AGA TGA TTG AAC AGG ACG GCC TTC ACG-3’（序列号：105）、TMO35：46mer：5’-GCG CAT AGC CGG CGC GGA TCT CAA AAG AAC TCG TCC AGG AGG CGG T-3’（序列号：106）]。 [PCR循环：98℃ 10秒/98℃ 10秒,58℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 1分钟]。 [0391] 另外，将金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304基因组DNA作为模板，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增EF1α终止子序列（1249bp，序列号：107）。使用的PCR引物如下所述，TMO36包含人工合成新霉素抗性基因序列和EF1α终止子序列。TMO37设定于EF1α终止子中。[TMO36：46mer：5’-TCC TGG ACG AGT TCT TTT GAG ATC CGC GCC GGC TAT GCG CCC GTG C-3’（序列号：108）、TMO37：30mer：5’-CAC TGC AGC GAA AGA CGG GCC GTA AGG ACG-3’（序列号：109）]。[PCR循环：98℃ 10秒/98℃ 10秒,58℃ 30秒,72℃ 2分钟,循环30次/72℃ 2分钟]。 [0392] 将序列号98、101、104、107作为模板，按照非专利文献19记载的方法进行融合PCR。对于酶使用LA taq Hot start version（TAKARA BIO INC.制造）。在初次扩增中，使用TMO30（序列号：99）和TMO33（序列号：103）的对、TMO34（序列号：105）和TMO37（序列号：109）的对。第2次的扩增使用TMO30（序列号：99）和TMO37（序列号：109）的对。对于PCR反应的条件，将改性温度设为98℃10秒，退火和伸长反应根据引物的Tm值和扩增片段的长度适当调节（图23）。 [0393] 用T.aureum18S rDNA中的EcoRI位点和T.aureum EF1α终止子中的NcoI位点切出上述连接的DNA片段（图23，序列号：110，4453bp），重新连接于来自pGEM-T easy vector的载体。将其命名为pRH5（图24）。 [0394] 将金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304基因组DNA作为模板，在实施例4-1中明确的上游序列（序列号：90以及专利文献7中记载的PUFA PKS路径相关基因：OrfA）中设定PCR引物，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增DNA。通过该扩增，得到1218bp的DNA片段（序列号：111）。将其作为打靶载体的5’同源区域。使用的PCR引物如下所述，分别附加作为接头序列的EcoRI位点或者HindIII位点。[RHO33：32mer：5’-CCC GAA TTC GGA CGA TGA CTG ACT GAC TGA TT-3’（序列号：112）、RHO34：28mer：5’-CCC AAG CTT GTC TGC CTC GGC TCT TGG T-3’（序列号：113）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,57℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 3分钟]。 [0395] 将金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304基因组DNA作为模板，在实施例4-2中明确的下游序列（序列号：97）中设定PCR引物，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer（TAKARA BIO INC.制造）扩增DNA。通过该扩增，得到1000bp的DNA片段（序列号：114）。将其作为打靶载体的3’同源区域。使用的PCR引物如下所述，都附加接头序列NcoI位点。[RHO29：28mer：5’-CCC CCA TGG TGT TGC TGT GGG ATT GGT C-3’（序列号：115）、RHO30：30mer：5’-CCC CCA TGG CTC GGT TAC ATC TCT GAG GAA-3’（序列号：116）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,57℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 3分钟]。 [0396] 将扩增的上游序列连接于图24记载的pRH5中的EcoRI位点和HindIII位点。将扩增的下游序列连接于NcoI位点。将该载体命名为pRH21。 [0397] 在图25中表示使用制得的人工合成新霉素抗性基因的打靶载体（pRH21）。 [0398] [实施例4-4]PUFA PKS路径相关基因：OrfA打靶载体的制作（潮霉素抗性基因）[0399] 将实施例3-3记载的pRH32（图15）作为模板，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer（TAKARA BIO INC.制造）扩增ubiquitin启动子-潮霉素抗性基因片段（1632bp，序列号：117）。使用的PCR引物如下所述，RHO59设定在ubiquitin启动子上，附加接头序列HindIII位点。RHO60具有包含潮霉素抗性基因序列的终止密码子、接头序列SphI、SalI。[RHO59：36mer：5’-CCC AAG CTT GCC GCA GCG CCT GGT GCA CCC GCC GGG-3’（序列号：118）、RHO60：43mer：5’-CCC GCA TGC GTC GAC TAT TCC TTT GCC CTC GGA CGA GTG CTG G-3’（序列号：119）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,68℃ 2分钟,循环30次/68℃ 2分钟]。 [0400] 将扩增的片段连接于实施例4-3记载的pRH21（图25）的HindIII以及SphI位点（图26，pRH30）。 [0401] 将金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304基因组DNA作为模板，使用实施例4-2中明确的下游序列（序列号：97）中制作的PCR引物，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer（TAKARA BIO INC.制造）扩增DNA。通过该扩增，得到1000bp的DNA片段（序列号：120）。将其作为打靶载体的3’同源区域。使用的PCR引物如下所述，都附加接头序列SalI位点。[RHO61：29mer：5’-CCC GTC GAC GTG TTG CTG TGG GAT TGG TC-3’（序列号：121）、RHO62：29mer：5’-CCC GTC GAC TCG GTT ACA TCT CTG AGG AA-3’（序列号：122）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,57℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 3分钟]。 [0402] 将扩增的下游序列连接于pRH30（图26）的SalI位点。将其命名为pRH33。将使用制得的潮霉素抗性基因的打靶载体（pRH33）表示于图27中。 [0403] [实施例4-5]PUFA PKS路径相关基因：OrfA打靶载体导入 [0404] 将实施例4-3和4-4中制得的打靶载体作为模板，使用RHO30（实施例4-3记载。序列号：116）以及RHO33（实施例4-3记载。序列号：112）作为引物，通过PrimeSTAR Max DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增基因。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,60℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 3分钟]。进行苯酚氯仿提取、氯仿提取之后，使DNA乙醇沉淀，将沉淀溶解于0.1×TE中。测定A260/280，算出DNA浓度。将实施例4-3记载的pRH21（图25）作为模板时得到的导入片段为3705bp，并且成为金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA基因上游-EF1α启动子序列-人工合成新霉素抗性基因序列-金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA基因下游的排列（序列号：123）。将实施例4-4记载的pRH33（图27）作为模板时得到的导入片段为3826bp，并且成为金黄色破囊壶菌 （Thraustochytrium aureum）OrfA基因上游-ubiquitin启动子序列-潮霉素抗性基因序列-金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA基因下游的排列（序列号：124）。 [0405] 在GY培养基中培养金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC34304株4天，将处于对数增殖期的细胞用于基因导入。相对于OD600=1～1.5当量的细胞，通过基因枪法（微载体：0.6微米的金粒子，靶距：6cm，室真空（chamber vacuum）：26mmHg，爆破膜（Rupture disk）：1,100PSI）导入0.625μg的DNA片段。基因导入的细胞在4～6小时的恢复时间之后，涂布于PDA琼脂平板培养基（含有2mg/ml G418或者含有2mg/ml潮霉素）。其结果，每1次射入得到100～200个耐药性菌株。 [0406] [实施例4-6]PUKA PKS路径相关基因：OrfA基因打靶同源重组体的鉴定 [0407] 用实施例3-2记载的方法从金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304以及杂同源重组体、同源重组体（PKS路径相关基因破坏株）中提取基因组DNA之后，测定A260/280，算出DNA浓度。 [0408] 用限制酶切断基因组DNA之后，供给到每1孔每约2～3μg为0.7%SeaKem GTG琼脂糖凝胶（TAKARA BIO INC.制造）。将其在尼龙膜上转移，与使用DIG系统（Roche Applied Science公司制造）制得的探针在54℃下使之杂交16小时。用于制作探针的引物如下所述。5’侧[RHO37：22mer：5’-GAA GCG TCC CGT AGA TGT GGT C-3’（序列号：125）、RHO38：21mer： 5’-GCC CGA GAG GTC AAA GTA CGC-3’（序列号：126）]、3’側[RHO39：20mer：5’-GCG AGC CCA GGT CCA CTT GC-3’（序列号：127）、RHO40：22mer：5’-CAG CCC GAT GAA AAA CTT GGT C-3’（序列号：128）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,60℃ 30秒、72℃ 2分钟,循环30次/72℃ 3分钟]。使用的限制酶和探针的位置表示于图28中。使用显色法（NBT/BCIP溶液）进行杂交后的探针的检测。 [0409] 5’侧和3’侧的分析中都在耐药性基因发生同源重组时以预先预想的尺寸观察到条带（图29）。 [0410] [实施例4-7]通过PUFA PKS路径相关基因：OrfA的破坏脂肪酸组成的变化 [0412] 将脂肪酸组成的变化表示于图30中。图31中表示将野生型菌株设为100%时的比例。该结果可知，如果破坏金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）中的PUFA PKS路径相关基因：OrfA，可以发现DPA倾向增加（C22：5n-6），DHA倾向减少（C22：6n-3）。 [0413] 实施例5 [0414] [金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA破坏株的C20延长酶基因的破坏] [0415] [实施例5-1]金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）C20延长酶基因的上游序列的克隆 [0416] 将实施例4-1中制得的基因组盒文库用作模板。在实施例2-5记载的C20延长酶基因上游序列（序列号：40）上制作PCR lower primer[RHO71：22mer：5’-GGG AGC GCA GGG AAA ACG GTC T-3’（序列号：129）]，与实施例4-1记载的试剂盒附属盒引物组合扩增基因[1st PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,56℃ 30秒,72℃ 4分钟,循环30次/72℃ 5分钟]。接着，将1st PCR扩增产物稀释100倍，将PCR lower primer[RHO72：20mer：5’-CCA GCC CAC GTC GTC GGA GC-3’（序列号：130）]以及实施例4-1记载的试剂盒附属嵌套引物组合，扩增基因[2nd PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,56℃ 30秒,72℃ 4分钟,循环30次/72℃ 5分钟]。将得到的DNA片段克隆于pGEM-T easy vector，用大肠杆菌扩增之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。 [0417] 克隆含有C20延长酶基因的上游-3277bp～-981bp的区域的2297bp的DNA片段（序列号：131）。 [0418] [实施例5-2]C20延长酶基因的下游序列的克隆 [0419] 将实施例4-1中制得的基因组盒文库用作模板。在实施例2-5记载的C20延长酶基因下游序列（序列号：25）上制作PCR upper primer[RHO87：23mer：5’-GCC GCT CAT GCC CAC GCT CAA AC-3’（序列号：132）]，与实施例4-1记载的试剂盒附属盒引物组合扩增基因[1st PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,56℃ 30秒,72℃ 4分钟,循环30次/72℃ 5分钟]。接着，将1st PCR扩增产物稀释100倍，将PCR lower primer[RHO73：23mer：5’-CTT TCG GCT GCC AGG AAT CTA CG-3’（序列号：133）]以及实施例4-1记载的试剂盒附属嵌套引物组合，扩增基因[2nd PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,56℃ 30秒,72℃ 4分钟,循环30次/72℃ 5分钟]。将得到的DNA片段克隆于pGEM-T easy vector，用大肠杆菌扩增之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。 [0420] 克隆含有C20延长酶基因的下游1,106bp～3,294bp的区域的2,189bp的DNA片段（序列号：134）。 [0421] [实施例5-3]杀稻瘟菌素抗性基因盒的制作 [0422] 将来自金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304的基因组DNA作为模板，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer（TAKARA BIO INC.制造）扩增ubiquitin启动子序列（618bp，序列号135）。使用的PCR引物如下所述，并且RHO53设定于ubiquitin启动子序列上，包含BglII接头序列（实施例3-2，序列号：55）。RHO48含有杀稻瘟菌素抗性基因作为ubiquitin启动子序列。[RHO48：58mer：5’-CTT CTT GAG ACA AAG GCT TGG CCA TGT TGG CTA GTG TTG CTT AGG TCG CTT GCT GCT G-3’（序列号：136）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 1分钟,循环30次/68℃ 1分钟]。 [0423] 将pTracer-CMV/Bsd/lacZ作为模板，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer扩增杀稻瘟菌素抗性基因（432bp，序列号：137）。使用的PCR引物如下所述，并且RHO47含有Ubiquitin启动子序列和杀稻瘟菌素抗性基因序列。RHO49含有杀稻瘟菌素抗性基因序列，并且具有BglII接头序列。[RHO47：54mer:5’-AGC GAC CTA AGC AAC ACT AGC CAA CAT GGC CAA GCC TTT GTC TCA AGA AGA ATC-3’（序列号138）、RHO49：38mer：5’-CCC AGA TCT TAG CCC TCC CAC ACA TAA CCA GAG GGC AG-3’（序列号：139）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 1分钟,循环30次/68℃ 1分钟]。 [0424] 将序列号135和137作为模板，按照非专利文献19记载的方法使用RHO53（实施例3-2，序列号：55）以及RHO49（序列号：139）进行融合PCR。酶使用LA taq Hot start version（TAKARA BIO INC.制造），在下述的条件下扩增之后，用BglII消化。[PCR循环：94℃ 2分钟/ 94℃ 20秒,55℃ 30秒,68℃ 1分钟,循环30次/68℃ 1分钟。但是，从55℃到68℃设定为1℃/10秒（]图32）。 [0425] 用BglII消化这样融合的金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC34304来源的ubiquitin启动子-pTracer-CMV/Bsd/lacZ来源的杀稻瘟菌素抗性基因（1000bp，序列号：140），将其连接于实施例3-1记载的pRH27（图11）的BamHI位点。用大肠杆菌扩增得到的质粒之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。将其命名为pRH38。 [0426] 将制得的杀稻瘟菌素抗性基因盒（pRH38）表示于图33中。 [0427] [实施例5-4]GFP融合Zeocin抗性基因盒的制作 [0428] 将来自金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304的基因组DNA作为模板，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer（TAKARA BIO INC.制造）扩增ubiquitin启动子序列（812bp，序列号：141）。使用的PCR引物如下所述，并且TMO38设定于ubiquitin启动子序列上。TMO39含有ubiquitin启动子序列和增强型GFP基因序列。[TMO38：29mer：5’-TCG GTA CCC GTT AGA ACG CGT AAT ACG AC-3’（序列号：142）、TMO39：41mer： 5’-TCC TCG CCC TTG CTC ACC ATG TTG GCT AGT GTT GCT TAG GT-3’（序列号：143）]。 [PCR循环：98℃ 10秒/98℃ 10秒,58℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 1分钟]。 [0429] 将增强型GFP基因序列（clontech公司制造）作为模板，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增增强型GFP基因序列（748bp，序列号：144）。使用的PCR引物如下所述，并且TMO40含有ubiquitin启动子序列和增强型GFP基因序列。RHO91含有增强型GFP序列和Zeocin抗性基因序列。[TMO40：41mer：5’-ACC TAA GCA ACA CTA GCC AAC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GA-3’（序列号：145）、RHO91：58mer：5’-GAA CGG CAC TGG TCA ACT TGG CGT CCA TGC CGA GAG TGA TCC CGG CGG CGG TCA CGA A-3’（序列号：146）]。[PCR循环：98℃ 10秒/98℃ 10秒,58℃ 30秒,72℃ 2分钟,循环30次/72℃ 2分钟]。 [0430] 将序列号141和144作为模板，按照非专利文献19记载的方法通过LA taq Hot start version（TAKARA BIO INC.制造）进行融合PCR。对于引物使用TMO38（序列号：142）以及RHO91（序列号：146），条件为PCR循环：94℃ 2分钟/94℃ 20秒,55℃ 30秒,68℃ 2分钟,循环30次/68℃ 2分钟（但是，从55℃到68℃为1℃/10秒）（图34，1519bp，序列号：147）。 [0431] 将序列号147作为模板，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增ubiquitin启动子序列-增强型GFP基因序列（1319bp，序列号：148）。使用的引物如下所述。RHO53（实施例3-2，序列号：55）含有ubiquitin启动子序列，并且具有BglII位点。RHO91（序列号：146）含有增强型GFP序列以及Zeocin抗性基因序列。[PCR循环：98℃ 2分钟/ 98℃ 10秒,68℃ 2分钟,循环30次/68℃ 2分钟]。 [0432] 将pcDNA3.1Zeo(+)作为模板，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增Zeocin抗性基因序列（408bp，序列号：149）。RHO92含有增强型GFP序列以及Zeocin抗性基因序列。RHO64含有Zeocin抗性基因序列，并且具有BglII位点。[RHO92：54mer：5’-CGC CGC CGG GAT CAC TCT CGG CAT GGA CGC CAA GTT GAC CAG TGC CGT TCC GGT-3’（序列号：150）、RHO64：38mer：5’-CCC AGA TCT CAG TCC TGC TCC TCG GCC ACG AAG TGC AC-3’（序列号：151）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 1分钟,循环30次/68℃ 1分钟]。 [0433] 将序列号148和149作为模板，按照非专利文献19记载的方法通过LA taq Hot start version（TAKARA BIO INC.制造）进行融合PCR。对于引物使用RHO53（实施例3-2，序列号：55）以及RHO64（序列号：151），条件为PCR循环：94℃ 2分钟/94℃ 20秒,68℃ 2分钟,循环30次/68℃ 2分钟（但是，从55℃到68℃为1℃/10秒）（图35）。 [0434] 用BglII消化这样融合的金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304来源的ubiquitin启动子-增强型GFP基因-pcDNA3.1Zeo(+)来源的Zeocin抗性基因（图35，1677bp，序列号：152），将其连接于实施例3-1记载的pRH27（图11）的BamHI位点。用大肠杆菌扩增得到的质粒之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。将其命名为pRH51。 [0435] 将制得的GFP融合Zeocin抗性基因盒（pRH51）表示于图36中。 [0436] [实施例5-5]作为用于制作C20延长酶基因打靶载体的基础的质粒制作 [0437] 将金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC34304作为模板，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造），用PCR法扩增C20延长酶基因以及其周边序列（2884bp，序列号：153）。使用的PCR引物如下所述，并且都含有EcoRI接头序列，KSO9设定在C20延长酶基因上游（序列号：24）中，KSO10设定于C20延长酶基因下游（序列号：25）。[KSO9：50mer：5’-CCC GAA TTC ACT AGT GAT TCT CCC GGG TGG ACC TAG CGC GTG TGT CAC CT-3’（序列号：154）、KSO10：40mer：5’-CCC GAA TTC GAT TAT CCC GGG GCC GAG AAC GGG GTC GCC C-3’（序列号：155）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 3.5分钟,循环30次/68℃ 10分钟]。酶使用PrimeSTAR HS DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造），扩增，用EcoRI消化之后，克隆于pBluescript(SK（) stratagene公司制造）载体EcoRI位点。 用大肠杆菌扩增之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列（图37）。 [0438] 将图37记载的质粒作为模板，为了缺失C20延长酶基因序列部分并且插入BglII位点（1939bp，序列号：156），准备逆向设定的引物对，用PrimeSTAR Max DNA Polymerase（TAKARA BIO INC.制造）进行扩增。使用的PCR引物如下所述，并且都具有BglII接头序列。[RHO69：38mer：5’-CCC AGA TCT ACC TGT TTC CGG CTG GCT CCC GAG CCA TG-3’（序列号： 157）、RHO70：38mer：5’-CCC AGA TCT GGT CGC GTT TAC AAA GCA GCG CAG CAA CA-3’（序列号：158）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 1.5分钟,循环30次/68℃ 1.5分钟]。 在上述条件下扩增之后，用BglII消化之后，进行自身连接。自身连接的样品用大肠杆菌扩增之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。将其命名为pRH40。 [0439] 将制得的作为用于制作C20延长酶基因打靶载体的基础的质粒（pRH40）表示于图38中。 [0440] [实施例5-6]打靶载体的制作（杀稻瘟菌素抗性基因以及GFP融合Zeocin抗性基因） [0441] 用BglII消化实施例5-3记载的pRH38（图33），将含有杀稻瘟菌素抗性基因盒的DNA片段连接于实施例5-5记载的pRH40（图38）的BglII位点。将其命名为pRH43。 [0442] 用BglII消化实施例5-4记载的pRH51（图36），将含有Zeocin抗性基因盒的DNA片段连接于实施例5-5记载的pRH40（图38）的BglII位点。将其命名为pRH54。 [0443] 将制得的2种打靶载体（pRH43和pRH54）表示于图39中。 [0444] [实施例5-7]C20延长酶基因打靶载体导入到金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA破坏株 [0445] 将实施例5-6中制得的2种打靶载体作为模板，使用KSO11和KSO12作为引物，通过PrimeSTAR Max DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增基因。KSO11设定于金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）C20延长酶基因上游，KSO12设定于于金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）C20延长酶基因下游。[KSO11：31mer：5’-CTC CCG GGT GGA CCT AGC GCG TGT GTC ACC T-3’（序列号：159）、KSO12：27mer：5’-ATC CCG GGG CCG AGA ACG CCC TCG CCC-3’（序列号：160）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,68℃ 2分钟,循环30次/68℃ 2分钟]。进行苯酚氯仿提取、氯仿提取之后，使DNA乙醇沉淀，将沉淀溶解于0.1×TE。测定A260/280，算出DNA浓度。将实施例5-6记载的pRH43（图39）作为模板时得到的导入片段为3215bp，并且成为金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）C20延长酶基因上游-ubiquitin启动子-杀稻瘟菌素抗性基因序列-SV40终止子序列-金黄色破囊壶菌 （Thraustochytrium aureum）C20延长酶基因下游的排列（序列号：161）。将实施例5-6记载的pRH54（图39）作为模板时得到的导入片段为3887bp，并且成为金黄色破囊壶菌 （Thraustochytrium aureum）C20延长酶基因上游-ubiquitin启动子-增强型GFP基因序列-Zeocin抗性基因序列-SV40终止子序列-金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）C20延长酶基因下游的排列（序列号：162）。 [0446] 在GY培养基中培养实施例4记载的PUFA PKS路径相关基因：OrfA基因破坏株4天，将处于对数增殖期的细胞用于基因导入。相对于OD600=1～1.5当量的细胞，通过基因枪法（微载体：0.6微米的金粒子，靶距：6cm，室真空（chamber vacuum）：26mmHg，爆破膜：1,100PSI）导入0.625μg的DNA片段。基因导入的细胞在4～6小时的恢复时间之后，涂布于PDA琼脂平板培养基（含有2mg/ml G418或者含有2mg/ml潮霉素）。其结果，每1次射入得到100～ 200个耐药性菌株。 [0447] [实施例5-8]C20延长酶基因基因打靶同源重组体的鉴定 [0448] 用实施例3-2记载的方法，从金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）以及金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA破坏株的C20延长酶基因的破坏株中提取基因组DNA之后，测定A260/280，算出DNA浓度。 [0449] 用限制酶切断基因组DNA之后，在每1孔每约2～3μg为0.7%SeaKem GTG琼脂糖凝胶（TAKARA BIO INC.制造）中进行电泳。将其在尼龙薄膜上转移，与使用DIG系统（Roche Applied Science公司制造）制得的探针一起在51℃下杂交16小时。用于制作探针的引物如下所述。5’侧[RHO94：21mer：5’-ACG TCC GCT TCA AAC ACC TCG-3’（序列号：163）、RHO95：24mer：5’-TCG GAA CAA CTG GAA CAA CTA AAG-3’（序列号：164）]、3’侧[RHO96：22mer：5’-ATG TCG CTC TCC TTC TTC TCA G-3’（序列号：165）、RHO97：21mer：5’-TCG GCT CCT GGA AAG TGC TCT-3’（序列号：166）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,58℃ 30秒、72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 3分钟]。使用的限制酶以及探针的位置表示于图40中。杂交后的探针的检测使用显色法（NBT/BCIP溶液）进行。 [0450] 5’侧和3’侧的分析中都以耐药性基因发生同源重组时预先预想的尺寸观察到条带（图41）。通过该实验可知，金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304株即使缺失PKS路径相关基因：OrfA以及C20延长酶基因也不会成为营养要求性。 [0451] [实施例5-9]通过金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA破坏株中的C20延长酶基因的破坏产生的脂肪酸组成的变化 [0452] 用实施例3-9记载的方法，培养、冷冻干燥金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304以及基因破坏株之后，将脂肪酸甲酯化，使用GC分析。在GC分析中使用气相色谱仪GC-2014（岛津制作所制造），在柱：HR-SS-10（30m×0.25mm，信和化工公司制造），柱温：150℃→（5℃/min）→220℃（10min），载气：He（1.3mL/min）的条件下进行。 [0453] 将脂肪酸组成的变化表示于图42中。另外，在图43中表示将野生型菌株设定为100%时的比例。 [0454] 该结果为，如果破坏金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA破坏株的C20延长酶基因，则C20：4n-6(AA)增加至约8倍，C20：5n3(EPA)增加至约4倍，C22：6n-3(DHA)减少至约1/5倍。 [0455] 实施例6 [0456] [金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA破坏株的ω3去饱和酶基因的表达] [0457] [实施例6-1]水霉（异枝水霉（Saprolegnia diclina））来源的ω3去饱和酶基因的克隆和基因表达质粒的制作 [0458] 用实施例3-2记载的方法从金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304中提取基因组DNA之后，测定A260/280，算出DNA浓度。将其作为模板，通过LA Taq with GC Buffer（TAKARA BIO INC.制造，Buffer II使用）扩增ubiquitin启动子序列（longer）（812bp，序列号：167）。使用的PCR引物如下所述，并且TMO42设定于ubiquitin启动子序列上较RHO53（实施例3-2，序列号：55）上游，并且含有KpnI接头序列。TMO43含有ubiquitin启动子序列和异枝水霉（Saprolegnia diclina）来源的ω3去饱和酶基因序列。 [TMO42：29mer：5’-TCG GTA CCC GTT AGA ACG CGT AAT ACG AC-3’（序列号：168）、TMO43： 45mer：5’-TTC GTC TTA TCC TCA GTC ATG TTG GCT AGT GTT GCT TAG GTC GCT-3’（序列号：169）]。[PCR循环：96℃ 2分钟/98℃ 20秒,60℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 1分钟]。 [0459] 接着，用每1L含有31.8gD-葡萄糖、10.6g酵母提取物的培养基（用去离子水调节）培养异枝水霉（Saprolegnia diclina）。在4℃下以3,500×g将对数增殖期后期的细胞离心5分钟，制成小球，用液氮冷冻粉碎。将细胞粉碎液苯酚提取之后，使之乙醇沉淀，将沉淀溶解于TE溶液中。将溶解于TE溶液的核酸在37℃下RNase处理30分钟，分解RNA，再次苯酚提取之后，使之乙醇沉淀，将沉淀溶解于TE溶液中。测定A260/280，算出DNA纯度以及浓度。将这样得到的异枝水霉（Saprolegnia diclina）的基因组DNA作为模板，通过LA Taq with GC Buffer（TAKARA BIO INC.制造，Buffer II使用）扩增异枝水霉（Saprolegnia diclina）来源的ω3去饱和酶基因序列（1116bp，序列号：170）。使用的PCR引物如下所述，并且TMO44含有ubiquitin启动子序列和异枝水霉（Saprolegnia diclina）来源的ω3去饱和酶基因序列。TMO45含有异枝水霉（Saprolegnia diclina）来源的ω3去饱和酶基因序列以及ubiquitin终止子。[TMO44：43mer：5’-CCT AAG CAA CAC TAG CCA ACA TGA CTG AGG ATA AGA CGA AGG T-3’（序列号：171）、TMO45：40mer：5’-ATA CTA CAG ATA GCT TAG TTT TAG TCC GAC TTG GCC TTG G-3’（序列号：172）]。[PCR循环：96℃ 2分钟/98℃ 20秒,60℃ 30秒,72℃ 1分30秒,循环30次/72℃ 1分30秒]。 [0460] 将金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304基因组DNA作为模板，通过LA Taq with GC Buffer（TAKARA BIO INC.制造，Buffer II使用）扩增ubiquitin终止子序列（614bp，序列号：173）。使用的PCR引物如下所述，并且TMO46含有异枝水霉（Saprolegnia diclina）来源的ω3去饱和酶基因序列以及ubiquitin终止子。TMO47设计于ubiquitin终止子序列上，并且含有KpnI接头序列。[TMO46：44mer：5’-CCA AGG CCA AGT CGG ACT AAA ACT AAG CTA TCT GTA GTA TGT GC-3’（序列号：174）、TMO47：45mer：5’-TCG GTA CCA CCG CGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACT GCA GTT-3’（序列号：175）]。[PCR循环：96℃ 2分钟/98℃ 20秒,60℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 1分钟]。 [0461] 将序列号167、170、173作为模板，按照非专利文献19记载的方法使用TMO42（序列号：168）和TMO47（序列号：175）进行融合PCR。酶使用LA Taq with GC Buffer（TAKARA BIO INC.制造，Buffer II使用），在下述的条件下进行扩增。[PCR循环：96℃ 2分钟/98℃ 20秒,55℃ 30秒,68℃ 3分钟,循环30次/68℃ 3分钟。但是，从55℃到68℃为1℃/10秒]（图44， 2463bp，序列号：176）。 [0462] 将实施例5-3记载的pRH38（图33）作为模板，使用RHO84（序列号：177，序列后述）和RHO52（实施例3-1，序列号：52）进行PCR。RHO84设定于ubiquitin启动子上，并且具有KpnI接头序列。RHO52设定于SV40终止子序列上，并且具有BglII接头。酶使用LA taq Hot start version，在下述的条件下扩增之后，克隆于pGEM-T easy vector。[RHO84：36mer：5’-CCC GGT ACC GCC GCA GCG CCT GGT GCA CCC GCC GGG-3’（序列号：177）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 1分30秒,循环30次/68℃ 3分钟]。用大肠杆菌扩增之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。将其命名为pRH45（图45）。 [0463] 在图44中用KpnI消化融合后的金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304来源的ubiquitin启动子-异枝水霉（Saprolegnia diclina）来源的ω3去饱和酶基因-金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304来源的ubiquitin终止子（序列号：176），将其连接于pRH45（图45）的KpnI位点。用大肠杆菌扩增得到的质粒之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。将其命名为pRH48。 [0464] 将制得的异枝水霉（Saprolegnia diclina）来源的ω3去饱和酶表达质粒（pRH48）表示于图46中。 [0465] [实施例6-2]水霉来源的ω3去饱和酶表达质粒导入到金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA破坏株 [0466] 将实施例6-1中制得的打靶载体作为模板，使用TMO42（序列号：168）以及RHO52（实施例3-1，序列号：52）作为引物，通过PrimeSTAR Max DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增DNA。[PCR循环：94℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环5次/94℃ 30秒,70℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环5次/94℃ 30秒,68℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环25次/72℃2分钟]。通过1.0%琼脂糖回收扩增产物，使之乙醇沉淀，将沉淀溶解于0.1×TE中。测定A260/280，算出DNA浓度。通过PCR得到的导入片段为3777bp，并且成为ubiquitin启动子-ω3去饱和酶基因-ubiquitin终止子-ubiquitin启动子-杀稻瘟菌素抗性基因-SV40终止子序列的排列（序列号：178）。 [0467] 在GY培养基中培养实施例4中制得的金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA破坏株4天，将处于对数增殖期的细胞用于基因导入。相对于OD600=1～1.5当量的细胞，通过基因枪法（微载体：0.6微米的金粒子，靶距：6cm，室真空（chamber vacuum）： 26mmHg，爆破膜（Rupture disk）：1,100PSI）导入0.625μg的DNA片段。基因导入的细胞在4～ 6小时的恢复时间之后，涂布于PDA琼脂平板培养基（含有2mg/ml杀稻瘟菌素）。其结果，每1次射入得到20～30个的耐药性菌株。 [0468] [实施例6-3]水霉来源的ω3去饱和酶基因表达株的取得 [0469] 用实施例3-2记载的方法，从实施例3中制得的金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA破坏株以及ω3去饱和酶基因表达株中提取基因组DNA之后，测定A260/280，算出DNA浓度。将其作为模板，使用LA taq Hot start version进行基因组结构确认的PCR。将使用的引物的位置、用于扩增的组合、扩增产物的预想尺寸表示于图 47中。TMO42（实施例6-1，序列号：168）设定于ubiquitin启动子上，RHO49（实施例5-3，序列号：139）设定于杀稻瘟菌素抗性基因上。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 4分钟,循环30次/68℃ 7分钟]。 [0470] 可以确认有扩增至预想的尺寸的条带（图48）。可以分离将导入的表达片段稳定地导入到基因组的菌株。 [0471] [实施例6-4]通过PUFA PKS路径破坏株的ω3去饱和酶表达变化脂肪酸组成 [0472] 用实施例3-9记载的方法，对实施例4中制得的金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA破坏株以及实施例6-3中制得的ω3去饱和酶表达株进行培养、冷冻干燥之后，将脂肪酸甲酯化，使用GC进行分析。在GC分析中使用气相色谱仪GC- 2014（岛津制作所制造），在柱：HR-SS-10（30m×0.25mm，信和化工公司制造），柱温：150℃→（5℃/min）→220℃（10min），载气：He（1.3mL/min）的条件下进行。该结果可知，在ω3去饱和酶表达株中可以发现n-6系列的脂肪酸减少，n-3系列的脂肪酸增加的倾向（图49）。在图50中表示将野生型菌株设定为100%时的比例。 [0473] 这些结果为，花生四烯酸减少至约1/7，DPA减少至约1/10，另外，EPA、DHA都增加至约3倍。 [0474] 实施例7 [0475] [破囊壶菌（Thraustochytrium roseum）的C20延长酶基因的破坏] [0476] [实施例7-1]破囊壶菌（T.roseum）来源的C20延长酶基因的克隆 [0477] 将保留于破囊壶菌（Thraustochytrium roseum）ATCC 28210株的C20延长酶基因的区域作为目标，合成正方向（ELO20F，5’-ATH GAR TWY TKB RTI TTY GTI CA-3’）（序列号：179）以及逆方向（ELO20R，5’-TAR TRI SWR TAC ATI ADI AMR TG-3’）（序列号：180）的缩聚寡核苷酸。接着，将用与实施例2-5记载的方法同样的方法提取的破囊壶菌（T.roseum）基因组DNA作为模板，进行使用了Advantage 2Polymerase Mix（Clontech公司制造）的PCR[PCR循环：94℃ 1分钟/94℃ 30秒,55℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 7分钟/4℃ ∞]。通过2%琼脂糖电泳分离得到的特异性产物之后，精制，使用pGEM-Teasy Vector（Promega公司制造）进行该DNA片段的TA克隆之后，分析其碱基序列。其结果表明，由于显示与已知的破囊壶菌（T.roseum）来源的C20延长酶基因的序列极其高的序列同源性，因此，为破囊壶菌（T.roseum）来源的C20延长酶基因的部分序列。 [0478] 接着，与实施例2-2的情况同样地，通过3’和5’RACE进行破囊壶菌（T.roseum）来源的C20延长酶基因的克隆。首先，设计以下所示的寡核苷酸引物。正方向寡核苷酸引物（8F1；5’-CTG ACA AAG TTT CTC GAC TGG AGC GAC A-3’）（序列号：181）、逆方向寡核苷酸引物（8R1；5’-TAC GCG GCG GTG CCC GAG CCC CAG-3’）（序列号：182）和（8R2；5’-TGC CGA TCG TTG CGT GGT GGA ACA CCT G-3’）（序列号：183）。接着，将通过SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒（clontech公司制造）制得的cDNA文库作为模板，进行使用了合成套头特异性寡核苷酸以及所述的寡核苷酸8F1或者8R1的3’-或者5’-RACE[PCR循环：94℃ 30秒循环5次/94℃ 30秒,70℃ 30秒,72℃ 3分钟,循环5次/94℃ 30秒,68℃ 30秒,72℃ 3分钟,循环25次/4℃ ∞]。进一步，在5’RACE中，将得到的RACE产物作为模板，进行使用了合成套头特异性寡核苷酸、以及所述的寡核苷酸8R2的巢式PCR[PCR循环：94℃ 1分钟/94℃ 30秒,68℃ 30秒,72℃ 3分钟,循环25次/72℃ 10分钟/4℃ ∞]。将得到的两特异性产物凝胶精制，使用pGEM-T easy Vector（Promega公司制造）进行TA克隆化之后，分析碱基序列，其结果，与实施例2-2记载的金黄色破囊壶菌（T.aureum）ATCC 34304来源的C20延长酶（TaELO2）（序列号：16）完全一致。 [0479] 因此，接着，合成扩增推测翻译区域的正方向（8ORF F；5’-ATG GCG ACG CGC ACC TCG AA-3’）（序列号：184）以及逆方向（8ORF R；5’-TTA CTC GGA CTT GGT GGG GGC G-3’）（序列号：185）的寡核苷酸，将破囊壶菌（T.roseum）基因组DNA作为模板，进行使用了Advantage GC 2 polymerase Mix（Clontech）的PCR[PCR循环：94℃ 1分钟/94℃ 30秒,65℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 7分钟/4℃ ∞]。将得到的特异性产物凝胶精制，通过直接测序进行碱基序列分析，其结果为，破囊壶菌（T.roseum）来源的C20延长酶基因与TaELO2相同。由以上的结果可以判断，本序列与金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）C20延长酶的序列完全一致。将其碱基序列表示为序列号：186，将氨基酸序列表示为序列号：187。 [0480] [实施例7-2]用于制作C20延长酶基因打靶载体的基础质粒的制作 [0481] 用GY培养基培养金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304株。将对数增殖期后期的细胞在4℃下以3,500×g离心5分钟，制成小球，用液氮冷冻后粉碎。将细胞粉碎液苯酚提取之后，使之乙醇沉淀，将沉淀溶解于TE溶液中。将溶解于TE溶液的核酸在37℃下RNase处理30分钟，分解RNA，再次苯酚提取之后，使之乙醇沉淀，将沉淀溶解于TE溶液中。测定A260/280，算出DNA浓度。将其作为模板，通过LA taq Hot start version（TAKARA BIO INC.制造）扩增含有C20延长酶基因序列的序列（3193bp，序列号：188）[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 1分钟,循环30次/68℃ 2分钟]。使用的PCR引物为实施例 2-8记载的E2KO ProF EcoRV（序列号：33）以及E2KO TermR EcoRV（序列号：34）。将得到的DNA片段克隆于pGEM-T easy vector（Promega公司制造），用大肠杆菌扩增之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。将其命名为pRH59（图51）。 [0482] 将制得的pRH59（图51）作为模板，以在C20延长酶基因序列中间部分插入BglII位点的方式准备逆向设定的引物对，用PrimeSTAR Max DNA Polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增。使用的PCR引物如下所述，并且都具有BglII接头序列。[RHO120：27mer：5’-GAC AAA GAT CTC GAC TGG AGC GAC CAC-3’（序列号：189）、RHO121：27mer：5’-GTC GAG ATC TTT TGT CAG GAG GTG CAC-3’（序列号：190）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,56℃ 15秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 1分钟]。在上述条件下扩增之后，用BglII消化之后，进行自身连接。连接后的样品用大肠杆菌扩增之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。将其命名为pRH64。将插入有BglII位点的C20延长酶基因序列951bp表示为序列号：191。 [0483] 将制得的用于制作破囊壶菌（Thraustochytrium roseum）C20延长酶基因打靶载体的基础质粒（pRH64）表示于图52中。 [0484] [实施例7-3]打靶载体的制作（人工合成新霉素抗性基因以及潮霉素抗性基因）[0485] 用BglII消化实施例3-2记载的pRH31（图13），将含有人工合成新霉素抗性基因盒的DNA片段连接于实施例7-2记载的pRH64（图52）的BglII位点。将其命名为pRH65。 [0486] 用BglII消化实施例3-3记载的pRH32（图15），将含有潮霉素抗性基因盒的DNA片段连接于实施例7-2记载的pRH64（图52）的BglII位点。将其命名为pRH66。 [0487] 将制得的2种打靶载体（pRH65和pRH66）表示于图53中。 [0488] [实施例7-4]C20延长酶基因打靶载体的导入 [0489] 将实施例7-2中制得的2种打靶载体作为模板，将含有翻译起始点的正方向引物（RHO130：5’-ATG GCG ACG CGC ACC TCG AAG AG-3’）（序列号：192）以及含有翻译终止点的逆方向引物（RHO131：5’-TTA CTC GGA CTT GCT GGG GGC GC）（序列号：193）用作引物，通过PrimeSTAR GXL polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增基因。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,60 30秒,72℃ 3分钟,循环30次]。苯酚氯仿提取、氯仿提取之后，使DNA乙醇沉淀，将沉淀溶解于0.1×TE。测定A260/280，算出DNA浓度。将实施例7-3记载的pRH65（图53）作为模板时得到的导入片段为2655bp，并且成为金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）C20延长酶上半段序列-SV40终止子序列-人工合成新霉素抗性基因序列-ubiquitin启动子序列-金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）C20延长酶下半段序列的排列（序列号：194）。将实施例7-3记载的pRH66（图53）作为模板时得到的导入片段为2887bp，并且成为金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）C20延长酶上半段序列-ubiquitin启动子序列-潮霉素抗性基因序列-SV40终止子序列-金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）C20延长酶下半段序列的排列（序列号：195）。 [0490] 在GY培养基中培养破囊壶菌（Thraustochytrium roseum）株7天，将处于对数增殖期的细胞用于基因导入。相对于OD600=1～1.5当量的细胞，通过基因枪法，在微载体：0.6微米的金粒子，靶距：6cm，室真空（chamber vacuum）：26mmHg，爆破膜（Rupture disk）：900PSI的条件下导入0.625μg的DNA片段。基因导入的细胞在24小时的恢复时间之后，涂布于PDA琼脂平板培养基（含有2mg/ml G418或者含有2mg/ml潮霉素）。 [0491] 其结果，每1次射入得到20个左右的耐药性菌株。 [0492] [实施例7-5]C20延长酶基因基因打靶同源重组体的鉴定 [0493] 对于破囊壶菌（Thraustochytrium roseum）ATCC 28210株、C20延长酶基因杂同源重组体、以及C20延长酶基因同源重组体（基因破坏株）用GY培养基培养之后，将得到的细胞在4℃下以3,000rpm离心10分钟，制成小球，悬浊于20μl的SNET溶液[20mM Tris-HCl，pH8.0，5mM NaCl，0.3% SDS，200μg/ml Proteinase K（Nacalai Tesque公司制造）]之后，在55℃、6h/99.9℃下用5分钟将细胞溶解。将得到的细胞溶解液稀释100倍的物质作为模板，使用Mighty Amp DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）进行基因组结构确认的PCR。将使用的引物的位置、用于扩增的组合、扩增产物的预想尺寸表示于图54中。RoseumF设定于C20延长酶上游，RoseumR设定于下游，NeoF和NeoR设定于人工合成新霉素抗性基因上，HygF和HygR设定于潮霉素抗性基因上。[RoseumF：26mer：5’-GCT CGG CTG GAA GTT GAG TAG TTT GC-3’（序列号：196）、RoseumR：24mer：5’-TCT TTC TTC GTC GAC GTC CCA CTG-3’（序列号：197）、NeoF：24mer：5’-ATG ATT GAA CAG GAC GGC CTT CAC-3’（序列号：198）、NeoR： 24mer：5’-TCA AAA GAA CTC GTC CAG GAG GCG-3’（序列号：199）、HygF：24mer：5’-ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACC GCG-3’（序列号：200）、HygR：25mer：5’-CTA TTC CTT TGC CCT CGG ACG AGT G-3’（序列号：201）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,60℃ 15秒,68℃ 4分钟,循环30次]。 [0494] 在野生型等位基因（Wt allele）中没有扩增，可以得到人工合成新霉素抗性基因等位基因（NeoR allele）以及潮霉素抗性基因等位基因（HygR allele）中具有扩增的C20延长酶敲除株（图55）。 [0495] [实施例7-6]通过C20延长酶破坏产生的脂肪酸组成的变化 [0496] 在GY培养基中培养破囊壶菌（Thraustochytrium roseum）ATCC28210株和基因破坏株。将对数增殖期后期的细胞在4℃下以3,000rpm离心10分钟，制成小球，在0.9%NaCl中悬浊、清洗。接着，在4℃下以3,000rpm离心10分钟，将小球在灭菌水中悬浊、清洗。将其以3,000rpm离心10分钟，除去上层清液，冷冻干燥。在冷冻干燥后的细胞中加入2ml氢氧化钾甲醇溶液（7.5%KOH in95%methanol），涡流之后，用超声波粉碎菌体（80℃、30分钟）。加入500μl的灭菌水涡流之后，加入2ml的正己烷涡流。接着，以3,000rpm离心10分钟，除去上层。再次加入2ml正己烷涡流，以3,000rpm离心10分钟，除去上层。在残留的下层中添加1ml的6N HCl，涡流之后，加入2ml正己烷涡流。接着，以3,000rpm离心10分钟，回收上层。再次加入2ml正己烷进行涡流，以3,000rpm离心10分钟，回收上层。用氮气浓缩蒸发回收的上层。在浓缩蒸发的样品中加入2ml的3N HCl甲醇溶液，在80℃下培养一晚。 [0497] 将样品冷却至室温，添加1ml的0.9%NaCl。接着，加入2ml正己烷进行涡流。以3,000rpm离心10分钟，回收上层。再次加入2ml正己烷进行涡流，以3,000rpm离心10分钟，回收上层。在回收的上层中少量添加无水硫酸钠之后，进行涡流。以3,000rpm离心10分钟，回收上层。用氮气浓缩蒸发回收的上层。将浓缩蒸发的样品溶解于0.2ml正己烷中，将2μl供给GC分析。在GC分析中使用气相色谱仪GC-2014（岛津制作所制造），在柱：HR-SS-10（30m× 0.25mm，信和化工公司制造），柱温：150℃→（5℃/min）→220℃（10min），载气：He（1.3mL/min）的条件下进行。 [0498] 该结果为，如果敲除破囊壶菌（Thraustochytrium roseum）的C20延长酶，则碳链长为20的脂肪酸增加（图56）。在图57中表示将野生型菌株设定为100%时的比例。 [0499] 这些结果为，花生四烯酸增加至约1.2倍，EPA增加至约1.6倍，DPA增加至约1.2倍以及DHA增加至约1.5倍。 [0500] 实施例8 [0501] 金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304 OrfA破坏株中的Δ4去饱和酶基因的破坏 [0502] [实施例8-1]金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC34304株的Δ4去饱和酶基因上游1071bp～Δ4去饱和酶基因内1500bp的序列的克隆 [0503] 解读用实施例3-2中记载的方法提取的金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC34304株的基因组DNA，检索与已知的Δ4去饱和酶同源性高的基因序列。基于该检索结果，设计2种PCR引物。TMO3为位于金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304株的Δ4去饱和酶基因上游1071～1049bp的序列，并且TMO4为从起始密码子开始数位于1477～1500bp的蛋白质编码区域内的序列。[TMO3：23mer：5’-GGC GGA GCG AAG TGT GAA AGT TA-3’（序列号：202）、TMO4：24mer：5’-GCG ACA GCA TCT TGA AAT AGG CAG-3’（序列号：203）]。使用这2种引物，将金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC34304株的基因组DNA作为模板，通过LA taq Hot start version（TAKARA BIO INC.制造）扩增金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC34304株的Δ4去饱和酶基因上游1071～Δ4去饱和酶基因内1500bp的序列（2571bp，序列号：204）。扩增条件如下所述。 [PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 20秒,60℃ 30秒,72℃ 3分钟,循环30次/72℃ 8分钟]。得到的DNA片段克隆于pGEM-T easy vector，用大肠杆菌扩增之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。将其命名为pTM1（图58）。 [0504] [实施例8-2]作为用于制作Δ4去饱和酶基因打靶载体的基础的质粒的制作 [0505] 将实施例8-1中制作的pTM1（图58）作为模板，以使Δ4去饱和酶基因上游60bp以及含有Δ4去饱和酶基因内的起始密码子的556bp的序列（616bp，序列号：205）缺失并且在缺失部分产生BglII位点的方式准备逆向设定的引物对。TMO7、TMO8都包含BglIi序列。在扩增中使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase（TAKARA BIO INC.制造）。[TMO7：25mer：5’-CAG GAG ATC TCC AAG TCG CGA TTC A-3’（序列号：206）、TMO8：26mer：5’-CTT GGA GAT CTC CTG CCC GTC CCG AA-3’（序列号：207）]。[PCR循环：98℃ 3分钟/98℃ 10秒,55℃ 15秒,72℃ 30秒,循环30次/72℃ 30秒]。在上述条件下扩增之后，在琼脂糖中迁移精制。将得到的DNA片段导入大肠杆菌进行扩增，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。将其命名为pTM2。 [0506] 将制得的作为用于制作Δ4去饱和酶基因打靶载体的基础的质粒（pTM2）表示于图59中。 [0507] [实施例8-3]打靶载体的制作（杀稻瘟菌素抗性基因和GFP融合Zeocin抗性基因）[0508] 用BglII消化实施例5-3记载的pRH38（图33），将含有杀稻瘟菌素抗性基因盒的DNA片段连接于实施例8-2记载的pTM2（图59）的BglII位点。将其命名为pTM6。 [0509] 用BglII消化实施例5-4记载的pRH51（图36），将含有GFP融合Zeocin抗性基因盒的DNA片段连接于实施例8-2记载的pTM2（图59）的BglII位点。将其命名为pTM8。 [0510] 将制得的2种打靶载体（pTM6和8）表示于图60中。 [0511] [实施例8-4]Δ4去饱和酶基因打靶载体向金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA破坏株的导入 [0512] 将实施例8-3中制得的2种打靶载体作为模板，使用TMO3（实施例8-1记载。序列号：202）以及TMO4（实施例8-1记载。序列号：203）作为引物，通过PrimeSTAR HS DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增基因。[PCR循环：98℃ 3分钟/98℃ 10秒,55 5秒, 72℃ 4分钟,循环30次/72℃ 3分钟]。苯酚氯仿提取、氯仿提取之后，使DNA乙醇沉淀，将沉淀溶解于0.1×TE。测定A260/280，算出DNA浓度。将实施例8-3记载的pTM6（图60）作为模板时得到的导入片段为3264bp，并且成为金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）Δ4去饱和酶基因上游-SV40终止子序列-杀稻瘟菌素抗性基因序列-ubiquitin启动子-金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）Δ4去饱和酶基因内的序列的排列（序列号：208）。将实施例8-3记载的pTM8（图60）作为模板时得到的导入片段为3935bp，并且成为金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）Δ4去饱和酶基因上游-SV40终止子序列-Zeocin抗性基因序列-增强型GFP基因序列-ubiquitin启动子-金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）Δ4去饱和酶基因内的序列的排列（序列号：209）。 [0513] 在GY培养基中培养实施例4记载的PUFA PKS路径相关基因：OrfA基因破坏株4天，将处于对数增殖期的细胞用于基因导入。相对于OD600=1～1.5当量的细胞，通过基因枪法（微载体：0.6微米的金粒子，靶距：6cm，室真空（chamber vacuum）：26mmHg，爆破膜（Rupture disk）：1,100PSI）导入0.625μg的DNA片段。基因导入的细胞在4～6小时的恢复时间之后，涂布于PDA琼脂平板培养基（含有2mg/ml Zeocin或者含有2mg/ml杀稻瘟菌素）。其结果，每1次射入得到100～200个的耐药性菌株。 [0514] [实施例8-5]Δ4去饱和酶基因基因打靶同源重组体的鉴定 [0515] 用实施例3-2记载的方法，从金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）以及金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA破坏株的Δ4去饱和酶基因的破坏株中提取基因组DNA之后，测定A260/280，算出DNA浓度。将其作为模板，使用Mighty Amp DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）进行基因组结构确认的PCR。将使用的引物的位置、用于扩增的组合、扩增产物的预想尺寸表示于图61中。TMO1设定于Δ4去饱和酶基因基因上游，TMO2设定于Δ4去饱和酶基因基因下游，RHO198和RHO49（实施例5-3记载。序列号：139）设定于杀稻瘟菌素抗性基因上，RHO128设定于增强型GFP基因上，RHO64（实施例5-4记载。序列号：151）设定于Zeocin抗性基因上。[TMO1：23mer：5’-AAA AGA ACA AGC CCT CTC CTG GA-3’（序列号：210）、TMO2：23mer：5’-GAG GTT TGT ATG TTC GGC GGT TT-3’（序列号：211）、RHO198：26mer：5’-TGG GGG ACC TTG TGC AGA ACT CGT GG-3’（序列号：212）、RHO128：22mer：5’-GAC CTA CGG CGT GCA GTG CTT C-3’（序列号：213）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 4分30秒,循环30次/68℃ 4分钟]。可以在野生型等位基因（Wt allele）中没有扩增，杀稻瘟菌素抗性基因等位基因（BlaR allele）以及Zeocin抗性基因等位基因（ZeoR allele）中有扩增的Δ4去饱和酶基因敲除株（图62）。通过该实验可知，金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304株即使缺失PKS路径相关基因：OrfA和Δ4去饱和酶基因，也不会成为营养要求性。 [0516] [实施例8-6]通过金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA破坏株的Δ4去饱和酶基因的破坏产生的脂肪酸组成的变化 [0517] 用实施例3-9记载的方法，培养、冷冻干燥金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304以及基因破坏株之后，将脂肪酸甲酯化，使用GC进行分析。在GC分析中使用气相色谱仪GC-2014（岛津制作所制造），在柱：HR-SS-10（30m×0.25mm，信和化工公司制造），柱温：150℃→（5℃/min）→220℃（10min），载气：He（1.3mL/min）的条件下进行。 [0518] 将脂肪酸组成的变化表示于图63中。另外，在图64中表示将野生型菌株设定为100%时的比例。 [0519] 该结果为，如果破坏金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA破坏株的Δ4去饱和酶基因，则积蓄了C22:4n-6(DTA)和C22:5n-3(DPA)，而几乎没有生物合成C22:5n-6(DPA)和C22:6n-3(DHA)。 [0520] 实施例9 [0521] Parietichytrium sp.SEK358株的C20延长酶基因的破坏 [0522] [实施例9-1]C20延长酶基因打靶载体向Parietichytrium sp.SEK358株的导入[0523] 将用实施例3-6记载的pRH85（图18）制得的打靶载体作为模板，使用RHO153（实施例3-4记载，序列号：74）以及RHO154（实施例3-4记载，序列号：75）作为引物，通过PrimeSTAR Max DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增基因。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃30秒,68℃ 2分钟,循环30次/68℃ 2分钟]。苯酚氯仿提取、氯仿提取之后，使DNA乙醇沉淀，将沉淀溶解于0.1×TE。测定A260/280，算出DNA浓度。将实施例3-6记载的pRH85（图18）作为模板时得到的导入片段为2661bp，并且成为Parietichytrium属C20延长酶上半段序列-SV40终止子序列-人工合成新霉素抗性基因序列-ubiquitin启动子序列-Parietichytrium属C20延长酶下半段序列的排列（实施例3-7记载，序列号：81）。在GY培养基中培养 Parietichytrium sp.SEK358株3天，将处于对数增殖期的细胞用于基因导入。相对于OD600=1～1.5当量的细胞，通过基因枪法（微载体：0.6微米的金粒子，靶距：6cm，室真空（chamber vacuum）：26mmHg，爆破膜（Rupture disk）：900PSI）导入0.625μg的DNA片段。基因导入的细胞在24小时的恢复时间之后，涂布于含有0.5mg/ml G418的PDA琼脂平板培养基。其结果，每 1次射入得到10～30个耐药性菌株。 [0524] [实施例9-2]C20延长酶基因基因打靶同源重组体的鉴定 [0525] 用实施例3-2记载的方法，从Parietichytrium sp.SEK358株以及C20延长酶基因破坏株中提取基因组DNA之后，测定A260/280，算出DNA浓度。将其作为模板，使用Mighty Amp DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）进行基因组结构确认的PCR。将使用的引物的位置、用于扩增的组合、扩增产物的预想尺寸表示于实施例3-8记载、图19中。 [0526] RHO184（实施例3-8记载。序列号：87）设定于C20延长酶上游，RHO185（实施例3-8记载。序列号：88）设定于下游，RHO142（实施例3-8记载。序列号：85）和RHO143（实施例3-8记载。序列号：86）设定于人工合成新霉素抗性基因上。[PCR循环：98℃2分钟/98℃10秒,68℃2分钟,循环30次/68℃7分钟]。 [0527] 可以得到野生型等位基因（Wt allele）中没有扩增，在人工合成新霉素抗性基因等位基因（NeoR allele）中有扩增的C20延长酶敲除株（图65）。 [0528] [实施例9-3]通过C20延长酶破坏改变脂肪酸组成 [0529] 用实施例3-9记载的方法，培养、冷冻干燥Parietichytrium sp.SEK358株以及基因破坏株之后，将脂肪酸甲酯化，使用GC分析。在GC分析中使用气相色谱仪GC-2014（岛津制作所制造），在柱：HR-SS-10（30m×0.25mm，信和化工公司制造），柱温：150℃→（5℃/min）→220℃（10min），载气：He（1.3mL/min）的条件下进行。 [0530] 将脂肪酸组成的变化表示于图66中。另外，在图67中表示将野生型菌株设定为100%时的比例。其结果为，如果敲除Parietichytrium sp.SEK358株中的C20延长酶，则碳链长为22以上的脂肪酸减少，碳链长为20的脂肪酸增加。具体来说，花生四烯酸增加至约7倍，EPA增加至约11倍，另外，DPA减少至约1/15，DHA减少至约1/8。 [0531] 实施例10 [0532] Parietichytrium sp.SEK571株中的C20延长酶基因的破坏 [0533] [实施例10-1]C20延长酶基因打靶载体向Parietichytrium sp.SEK571株中的导入 [0534] 将用实施例3-6记载的pRH85（图18）制得的打靶载体作为模板，使用RHO153（实施例3-4记载，序列号：74）以及RHO154（实施例3-4记载，序列号：75）作为引物，通过PrimeSTAR Max DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增基因。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃30秒,68℃ 2分钟,循环30次/68℃ 2分钟]。苯酚氯仿提取、氯仿提取之后，使DNA乙醇沉淀，将沉淀溶解于0.1×TE。测定A260/280，算出DNA浓度。将实施例3-6记载的pRH85（图18）作为模板时得到的导入片段为2661bp，并且成为Parietichytrium属C20延长酶上半段序列-SV40终止子序列-人工合成新霉素抗性基因序列-ubiquitin启动子序列-Parietichytrium属C20延长酶下半段序列的排列（实施例3-7记载，序列号：81）。在GY培养基中培养 Parietichytrium sp.SEK571株3天，将处于对数增殖期的细胞用于基因导入。相对于OD600=1～1.5当量的细胞，通过基因枪法（微载体：0.6微米的金粒子，靶距：6cm，室真空（chamber vacuum）：26mmHg，爆破膜（Rupture disk）：1550PSI）导入0.625μg的DNA片段。基因导入的细胞在24小时的恢复时间之后，涂布于含有0.5mg/ml G418的PDA琼脂平板培养基。其结果，每 1次射入得到5～15个耐药性菌株。 [0535] [实施例10-2]C20延长酶基因基因打靶同源重组体的鉴定 [0536] 用实施例3-2记载的方法，从Parietichytrium sp.SEK571株以及C20延长酶基因破坏株中提取基因组DNA之后，测定A260/280，算出DNA浓度。将其作为模板，使用Mighty Amp DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）进行基因组结构确认的PCR。将使用的引物的位置、用于扩增的组合、扩增产物的预想尺寸表示于实施例3-8记载的图19中。 [0537] RHO184（实施例3-8记载。序列号：87）设定于C20延长酶上游，RHO185（实施例3-8记载。序列号：88）设定于下游，RHO142（实施例3-8记载。序列号：85）和RHO143（实施例3-8记载。序列号：86）设定于人工合成新霉素抗性基因上。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 2分钟,循环30次/68℃ 7分钟]。 [0538] 可以得到野生型等位基因（Wtallele）中没有扩增，在人工合成新霉素抗性基因等位基因（NeoR allele）中有扩增的C20延长酶敲除株（图68）。 [0539] [实施例10-3]通过C20延长酶破坏改变脂肪酸组成 [0540] 用实施例3-9记载的方法，培养、冷冻干燥Parietichytrium sp.SEK571株以及基因破坏株之后，将脂肪酸甲酯化，使用GC分析。在GC分析中使用气相色谱仪GC-2014（岛津制作所制造），在柱：HR-SS-10（30m×0.25mm，信和化工公司制造），柱温：150℃→（5℃/min）→220℃（10min），载气：He（1.3mL/min）的条件下进行。 [0541] 将脂肪酸组成的变化表示于图69中。另外，在图70中表示将野生型菌株设定为100%时的比例。其结果为，如果敲除Parietichytrium sp.SEK571株中的C20延长酶，则碳链长为22以上的脂肪酸减少，碳链长为20的脂肪酸增加。具体来说，花生四烯酸增加至约4倍，EPA增加至约8倍，另外，DPA减少至约1/12，DHA减少至约1/12。 [0542] 实施例11 [0543] 金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304来源的Δ12去饱和酶基因的破坏 [0544] [实施例11-1]金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC34304来源的Δ12去饱和酶基因的分离 [0545] 将金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304的基因组DNA作为模板，通过使用了正方向寡核苷酸引物Tw3-F1(22mer：5’-ATG TGC AAG GTC GAT GGG ACA A-3’)（序列号：214）以及逆方向寡核苷酸引物Tw3-R1(22mer：5’-TCA CAA ACA TCG CAG CCT TCG G-3’（) 序列号：215）的PCR（使用酶：LA taq Hot Start Version，TaKaRa公司制造，PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,53℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 7分钟/4℃ ∞），扩增金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304来源的Δ12去饱和酶基因。其结果，取得具有编码395氨基酸（序列号：216）的1,185bp（序列号：217）的ORF的新基因序列。 在该基因的氨基酸序列中保留有去饱和酶共通保留的，构建活性部位的3个组氨酸盒（图 71）。另外，Blast检索的结果为，由于与假微型海链藻（Thalassiosira pseudonana）、Micromonas sp和三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）来源的Δ12去饱和酶基因以氨基酸水平显示41%、44%、41%高的同源性（图71），因此，强烈表明本基因为金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC34304来源的Δ12去饱和酶基因。以下，将本基因称为TΔ 12d。 [0546] [实施例11-2]将出芽酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为宿主的TΔ12d的表达和基因导入株的脂肪酸组成的分析 [0547] 将金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304的基因组DNA作为模板，通过进行使用了正方向寡核苷酸引物Tw3-Hind3-F(30mer：5’-GGA AGC TTA TGT GCA AGG TCG ATG GGA CAA-3’（) 序列号：218）以及逆方向寡核苷酸引物Tw3-Xba1-R(29mer：5’-TTC TAG ACT AGA GCT TTT TGG CCG CAC GC-3’（) 序列号：219）的PCR（使用酶：LA taq Hot Start Version，TaKaRa公司制造，PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,53℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 7分钟/4℃ ∞），制备在TΔ12d的两端附加有HindIII和XbaI位点的DNA片段。接着，通过将该DNA片段导入pYES2/CT载体的HindIII/Xba I位点，构建TΔ12d的表达载体、pYESTD12。接着，通过醋酸锂法将pYESTD12和pYES2/CT分别导入酵母中。进行得到的TΔ12d过表达株（pYESTD12导入株）的脂肪酸组成的GC分析，在相当于LA（C18:2Δ9,12）和C16:2Δ9,12的保留时间的位置上确认有mock导入株（pYES2/CT导入株）中没有发现的新的峰。在图72中表示GC分析的流程图、以及每干燥菌体的脂肪酸量。另一方面，确认TΔ12d过表达株没有显示相对于其它脂肪酸[LA、GLA（C18:3Δ6,9,12）、C20:2Δ11,14、DGLA（C20:3Δ8,11,14）、ARA（C20:4Δ5,8,11,14）、DTA（C22:4Δ7,10,13,16）]的变换活性。由以上的结果明确表示，TΔ12d为金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC34304来源的Δ12去饱和酶基因。 [0548] [实施例11-3]TΔ12d打靶载体的构建 [0549] 将金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304的基因组DNA作为模板，通过PCR（使用酶：PrimeSTAR GXL，TaKaRa公司制造，PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,53℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 7分钟/4℃ ∞）扩增TΔ12d ORF上游以及下游序列1,001bp。使用的正方向和逆方向寡核苷酸引物为TD12d-up-F(23mer：5’-AGT CAG CCC AGG CAC CGA TGA CG-3’)（序列号：220）和TD12d-up-R(39mer：5’-AGC CAG AGC TAG ATC TCT TGT GCT CCT TTT CAA TCC TTT-3’（) 序列号：221）、TD12d-down-F（39mer：5’-GGA GCA CAA GAG ATC TAG CTC TGG CTC AAG GGA CAC CGT-3’）（序列号：222）和TD12d-down-R（24mer：5’-CAC AGA AAC TGC CTT CAC GGG TCT-3’）（序列号：223）。接着，以在中间导入BglII位点的形式通过融合PCR连接得到的两DNA片段，将其导入（Promega公司制造）。接着，通过在得到的载体的BglII位点上导入实施例3-3记载的潮霉素抗性基因盒以及实施例5-3记载的杀稻瘟菌素抗性基因盒，构建TΔ12d KO打靶载体，将各个命名为pTD12dKOHyg和pTD12dKOBla。以上的TΔ12d KO打靶载体构建系统表示于图73中。 [0550] [实施例11-4]对于金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC34304的TΔ12d打靶载体的导入和TΔ12d破坏株的取得 [0551] 为了通过Split marker法有效地取得同源重组体，将pTD12dKOHyg作为模板，通过PCR[使用酶：LA taq Hot Start Version，TaKaRa公司制造，PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,60℃ 30秒,72℃ X分钟(X=1分钟/kbp),循环30次/72℃ 7分钟/4℃ ∞]，扩增2个同源重组片段（图74），用基因枪法将其导入金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC 34304。用于扩增同源重组片段的正方向和逆方向寡核苷酸引物为TD12d-up-F（序列号： 220）和Hyg-Knock-R（24mer：5’-TGT TAT GCG GCC ATT GTC CGT CAG-3’）（序列号：224）、Hyg-Knock-F（24mer：5’-TGC GAT CGC TGC GGC CGA TCT TAG-3’）（序列号：225）和TD12d-down-R（序列号：223）。其结果，取得破坏了TΔ12d第一个等位基因的同源重组体。接着，将pTD12dKOBla作为模板，使用正方向和逆方向寡核苷酸引物TD12d-up-F（序列号：220）和TD12d-down-R（序列号：223），通过PCR（使用酶：LA taq Hot Start Version，TaKaRa公司制造）[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,60℃ 30秒,72℃ 3分钟,循环30次/72℃ 7分钟/4℃ ∞]扩增为了破坏第2个等位基因的同源重组片段，将其导入破坏了第1个等位基因的同源重组体。TΔ12d的完全破坏通过将以下所示的基因组DNA作为模板的PCR和RT-PCR检测潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因以及TΔ12d，或者通过杂交进行验证。 [0552] 图75表示破坏了TΔ12d的第1个等位基因的菌株和TΔ12d破坏株（破坏了2个等位基因的菌株）中通过将各个基因组DNA作为模板的PCR扩增潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因以及TΔ12d的结果。 [0553] 由该结果表明，TΔ12d破坏株确认有导入的同源重组片段中所含的潮霉素抗性基因以及杀稻瘟菌素抗性基因的扩增，但是没有发现破坏的TΔ12d的扩增。另外，用于扩增潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因以及TΔ12d的正方向和逆方向寡核苷酸引物为Hyg-F(26mer：5’-ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACC GCG AC-3’（) 序列号：226）和Hyg-R（25mer：5’-CTA TTC CTT TGC CCT CGG ACG AGT G-3’）（序列号：227）、Bla-F(27mer：5’-ATG GCC AAG CCT TTG TCT CAA GAA GAA-3’）（序列号：228）和Bla-R(30mer：5’-TTA GCC CTC CCA CAC ATA ACC AGA GGG CAG-3’（) 序列号：229）、Tw3-F1（序列号：214）和Tw3-R1（序列号：215）。 [0554] 另外，在图76中表示野生株、破坏了TΔ12d的第1个等位基因的菌株以及TΔ12d破坏株中，通过RT-PCR检测潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因以及TΔ12d的mRNA的结果。由该结果表明，TΔ12d破坏株被检测出导入的同源重组片段中所含的潮霉素抗性基因和杀稻瘟菌素抗性基因mRNA，但是没有检测出破坏的TΔ12d mRNA。另外，使用的引物与将基因组DNA作为模板的PCR相同。 [0555] 进一步，将金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC34304的基因组DNA作为模板，调制2个DIG标记探针，进行使用了它们的印迹杂交。另外，用于调制DIG标记探针的正方向和逆方向寡核苷酸引物为KO up-probe-F1（23mer：5’-GGG GTC GGC CGG TGC AGC CTT AG-3’）（序列号：230）和KO up-probe-R1（24mer：5’-GGC GGT CAG CGA TCG GTC GGA CTC-3’）（序列号：231）、以及KO down-probe-F3（23mer：5’-GCT TGC GGC TCC TGT TGG GTG AC-3’）（序列号：232）和KO down-probe-R3（23mer：5’-ACG CCT GGC TGC CCA CCA TAA AC-3’）（序列号：233）。 [0556] 其结果，在TΔ12d破坏株中确认野生型等位基因的条带（上游侧2,028bp，下游侧2,334bp）的消失，取而代之检测出含有潮霉素抗性基因和杀稻瘟菌素抗性基因的同源重组片段（上游侧5,880和5,253bp，下游侧1,496和2,334bp）的条带（图77）。 [0557] 根据将以上的基因组DNA作为模板的PCR、RT-PCR以及印迹杂交的结果，明确表明TΔ12d的破坏。 [0558] [实施例11-5]TΔ12d破坏株的表达型分析 [0559] 将在250ml的GY液体培养基中培养5天的菌体各个回收10ml，测定OD600nm下的吸光度（n=3）。进一步，回收测定后的菌体，用灭菌超纯水清洗1次之后，进行冷冻干燥，测定用干燥器干燥1小时后的干燥菌体重量（n=3）。其结果发现，野生株与破坏了第1个等位基因的菌株和TΔ12d破坏株在增殖方面没有显著不同（图78）。接着，进行野生株与破坏了第1个等位基因的菌株和TΔ12d破坏株的脂肪酸组成的GC分析。 [0560] 其结果，观察到较多的脂肪酸组成的变化，特别是在TΔ12d破坏株中显著地观察到C18:1n9（OA）的积蓄。在图79中表示脂肪酸组成的比例，在图80中表示每1mg干燥菌体的脂肪酸量。 [0561] 实施例12 [0562] 金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC34304OrfA基因破坏株中C20延长酶基因破坏和ω3去饱和酶基因的表达 [0563] [实施例12-1]C20延长酶基因打靶载体并且水霉来源的ω3去饱和酶表达载体的制作（杀稻瘟菌素抗性基因） [0564] 将实施例5-6记载的pRH43（图39）作为模板，以使缺失2个限制酶KpnI位点并且在缺失部分产生BamHI位点的方式准备逆向设定的引物对。RHO189、RHO190都包含BamHI序列。在扩增中使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase（TAKARA BIO INC.制造）。[RHO189：28mer： 5’-TTA GCG GGA TCC CAA TTC GCC CTA TAG T-3’（序列号：234）、RHO190：27mer：5’-AAT TGG GAT CCC GCT AAG TAT CTC CCG-3’（序列号：235）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,55℃ 15秒,72℃ 40秒,循环31次/72℃ 1分钟]。在上述条件下扩增之后，在琼脂糖中迁移精制。将得到的DNA片段导入大肠杆菌进行扩增，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。将其命名为pRH101（图81）。 [0565] 将pRH101作为模板，以插入限制酶KpnI位点的方式准备逆向设定的引物对。RHO191、RHO192都包含KpnI序列。在扩增中使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase（TAKARA BIO INC.制造）。[RHO191：28mer：5’-AGA TCT GGT ACC GCA GCG CCT GGT GCA C-3’（序列号：236）、RHO192：27mer：5’-GCT GCG GTA CCA GAT CTG GTC GCG TTT-3’（序列号：237）]。 [PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,55℃ 15秒,72℃ 40秒,循环31次/72℃ 1分钟]。在上述条件下扩增之后，在琼脂糖中迁移精制。将得到的DNA片段导入大肠杆菌进行扩增，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。将其命名为pRH102（图82）。 [0566] 用KpnI消化实施例6-1记载的pRH48（图46），将含有水霉来源的ω3去饱和酶表达盒的DNA片段连接于pRH102（图82）的KpnI位点。将其命名为pRH103。 [0567] 将制得的C20延长酶基因打靶并且水霉来源的ω3去饱和酶表达载体pRH103表示于图83中。 [0568] [实施例12-2]C20延长酶基因打靶并且水霉来源的ω3去饱和酶表达载体向金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA破坏株的导入 [0569] 将实施例5-6记载的C20延长酶基因打靶载体pRH54（图39）作为模板，将KSO11（实施例5-7记载，序列号：159）和KSO12（实施例5-7记载，序列号：160）用作引物，通过PrimeSTAR Max DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增基因。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,68℃ 2分钟,循环30次/68℃ 2分钟]。将其苯酚氯仿提取、氯仿提取之后，使DNA乙醇沉淀，将沉淀溶解于0.1×TE。测定A260/280，算出DNA浓度。此时得到的导入片段为3887bp，并且成为金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）C20延长酶基因上游-ubiquitin启动子-增强型GFP基因序列-Zeocin抗性基因序列-SV40终止子序列-金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）C20延长酶基因下游的排列（实施例5-7记载，序列号： 162）。用限制酶BamHI消化实施例12-1记载的C20延长酶基因打靶并且水霉来源的ω3去饱和酶表达载体pRH103（图83），苯酚氯仿提取、氯仿提取之后，使DNA乙醇沉淀，将沉淀溶解于 0.1×TE。测定A260/280，算出DNA浓度。此时得到的导入片段为5611bp，并且成为金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）C20延长酶基因上游-ubiquitin启动子-水霉来源的ω 3去饱和酶基因序列-ubiquitin终止子-ubiquitin启动子-杀稻瘟菌素抗性基因序列-SV40终止子序列-金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）C20延长酶基因下游的排列（序列号：238）。 [0570] 在GY培养基中培养实施例4记载的PUFA PKS路径相关基因：OrfA基因破坏株4天，将处于对数增殖期的细胞用于基因导入。相对于OD600=1～1.5当量的细胞，通过基因枪法（微载体：0.6微米的金粒子，靶距：6cm，室真空（chamber vacuum）：26mmHg，爆破膜（Rupture disk）：1,100PSI）导入0.625μg的DNA片段。基因导入的细胞在4～6小时的恢复时间之后，涂布于PDA琼脂平板培养基（含有20mg/ml Zeocin或者含有0.2mg/ml杀稻瘟菌素）。其结果，得到20～60个耐药性菌株。 [0571] [实施例12-3]在基因组中插入有C20延长酶基因打靶并且水霉来源的ω3去饱和酶表达载体的同源重组体的鉴定 [0572] 用实施例3-2记载的方法，从金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）PUFA PKS路径相关基因：OrfA破坏株以及金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA破坏株的C20延长酶基因的第1条等位基因同源重组体以及破坏株中提取基因组DNA之后，测定A260/280，算出DNA浓度。 [0573] 用限制酶切断基因组DNA之后，在每1孔每约2～3μg为0.7%SeaKem GTG琼脂糖凝胶（TAKARA BIO INC.制造）中进行电泳。将其在尼龙薄膜上转移，与使用DIG系统（Roche Applied Science公司制造）制得的探针一起在51℃下杂交16小时。5’侧的探针制作中使用RHO94（实施例5-8记载，序列号163）以及RHO95（实施例5-8记载，序列号164）。3’侧的探针制作中使用RHO96（实施例5-8记载，序列号165）以及RHO97（实施例5-8记载，序列号166）。扩增条件如下所述，并且扩增中使用LA taq Hot start version（TAKARA BIO INC.制造）。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,58℃ 30秒、72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 3分钟]。使用的限制酶以及探针的位置表示于图84中。杂交后的探针的检测使用显色法（NBT/BCIP溶液）进行。5’侧和3’侧的分析中都观察到耐药性基因发生同源重组时预先预想的尺寸的条带（图85）。 [0574] [实施例12-4]通过金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA破坏株中C20延长酶基因破坏并且水霉来源的ω3去饱和酶表达产生的脂肪酸组成的变化 [0575] 用实施例3-9记载的方法，培养、冷冻干燥金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）ATCC34304野生型菌株以及PKS路径（orfA基因）和C20延长酶基因双重破坏并且水霉来源的ω3去饱和酶表达株之后，将脂肪酸甲酯化，使用GC分析。在GC分析中使用气相色谱仪GC-2014（岛津制作所制造），在柱：HR-SS-10（30m×0.25mm，信和化工公司制造），柱温：150℃→（5℃/min）→220℃（10min），载气：He（1.3mL/min）的条件下进行。 [0576] 将脂肪酸组成的变化表示于图86中。另外，在图87中表示将野生型菌株设定为100%时的比例。 [0577] 该结果为，如果破坏金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）OrfA破坏株的C20延长酶基因并且使水霉来源的ω3去饱和酶表达，则C20:4n-6(AA)增加至约6倍，C20:5n3(EPA)增加至约10倍，C22:6n-3(DHA)减少至约1/16倍。 [0578] 实施例13 [0579] Parietichytrium sp.SEK571C20延长酶基因破坏株中ω3去饱和酶基因的表达[0580] [实施例13-1]将潮霉素作为耐药性标记的水霉来源的ω3去饱和酶表达质粒的制作 [0581] 在制作将潮霉素作为耐药性标记的水霉来源的ω3去饱和酶表达质粒的时候，在pGEM-T easy vector上亚克隆Parietichytrium属C20延长酶上游序列（904bp，序列号：239）以及Parietichytrium属C20延长酶下游序列（721bp，序列号：240），将改变了部分限制酶位点的质粒PRH107（图88）用作基础。表示pRH107的全部序列（4592bp，序列号：241）用于参考。作为该表达质粒制作的基础的序列由于本实验中细胞导入时没有积极地使用，因此，在进行与其类似的实验时，作为用作基础的载体未必需要使用pRH107。在进行与其类似的实验时，可以代用具有每一处接近KpnI位点和BamHI位点的特征的克隆载体。此时，由于KpnI位点和BamHI位点之间的序列作为ω3去饱和酶基因表达盒和耐药性基因表达盒间的接头被导入到细胞中，因此，两者之间的长度可以较短。本实施例中Parietichytrium属C20延长酶下游序列37bp（序列号：242）与其相当。 [0582] 用KpnI消化实施例6-1记载的pRH48（图46），将含有水霉来源的ω3去饱和酶基因盒的DNA片段连接于pRH107（图88）的KpnI位点。将其命名为pRH108（图89）。 [0583] 用BglII消化实施例3-3记载的pRH32（图15），将含有潮霉素抗性基因盒的DNA片段连接于pRH108（图89）的BamHI位点。将其命名为pRH109（图90）。 [0584] [实施例13-2]水霉来源的ω3去饱和酶表达质粒导入到Parietichytrium sp.SEK571C20延长酶基因破坏株 [0585] 将实施例13-1中制得的pRH109（图90）作为模板，将TMO46（实施例6-1，序列号：168）以及RHO52（实施例3-1，序列号：52）用作引物，通过PrimeSTAR Max DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）扩增DNA。[PCR循环：94℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环5次/94℃ 30秒, 70℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环5次/94℃ 30秒,68℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环25次/72℃ 2分钟]。通过1.0%琼脂糖凝胶回收扩增产物，使之乙醇沉淀，将沉淀溶解于0.1×TE。测定A260/ 280，算出DNA浓度。通过PCR得到的导入片段为4448bp，并且成为ubiquitin启动子-ω3去饱和酶基因-ubiquitin终止子-ubiquitin启动子-潮霉素抗性基因序列-SV40终止子序列的排列（序列号：243）。 [0586] 在GY培养基中培养实施例10中制得的Parietichytrium sp.SEK571C20延长酶基因破坏株3天，将处于对数增殖期的细胞用于基因导入。相对于OD600=1～1.5当量的细胞，通过基因枪法（微载体：0.6微米的金粒子，靶距：6cm，室真空（chamber vacuum）：26mmHg，爆破膜（Rupture disk）：1550PSI）导入0.625μg的DNA片段。基因导入的细胞在24小时的恢复时间之后，涂布于PDA琼脂平板培养基（含有1.0mg/ml潮霉素）。其结果，每1次射入得到5～20个耐药性菌株。 [0587] [实施例13-3]水霉来源的ω3去饱和酶基因表达株的取得 [0588] 用实施例3-2记载的方法，从实施例10中制得的Parietichytrium sp.SEK571C20延长酶基因破坏株以及ω3去饱和酶基因表达株中提取基因组DNA之后，测定A260/280，算出DNA浓度。将其作为模板，使用LA taq Hot start version进行基因组结构确认的PCR。将使用的引物的位置、用于扩增的组合、扩增产物的预想尺寸表示于图91中。RHO90（27mer：5’-CGT TAG AAC GCG TAA TAC GAC TCA CTA–3’序列号：244）设定于ubiquitin启动子上，RHO141（实施例3-8，序列号：84）设定于潮霉素抗性基因上。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,68℃ 4分钟,循环30次/68℃ 7分钟]。 [0589] 可以确认扩增到预想的尺寸的条带（图92）。可以分离将导入的表达片段稳定地导入到基因组的菌株。 [0590] [实施例13-4]通过Parietichytrium sp.SEK571 C20延长酶基因破坏株中ω3去饱和酶表达产生的脂肪酸组成的变化 [0591] 用实施例3-9记载的方法，培养、冷冻干燥Parietichytrium sp.SEK571株以及ω3去饱和酶基因表达株之后，将脂肪酸甲酯化，使用GC分析。在GC分析中使用气相色谱仪GC-2014（岛津制作所制造），在柱：HR-SS-10（30m×0.25mm，信和化工公司制造），柱温：150℃→（5℃/min）→220℃（10min），载气：He（1.3mL/min）的条件下进行。 [0592] 该结果为，在ω3去饱和酶表达株中发现n-6系列的脂肪酸减少，倾向于增加n-3系列的脂肪酸（图93）。在图94中表示将野生型菌株设定为100%时的比例。这些结果为，花生四烯酸减少至约1/2，EPA增加至约1.4倍。 [0593] 实施例14 [0594] 裂殖壶菌（Schizochytrium）属的C20延长酶基因的破坏 [0595] [实施例14-1]裂殖壶菌（Schizochytrium）属来源的C20延长酶基因的克隆 [0596] 将从裂殖壶菌（Schizochytrium）属提取的基因组DNA作为模板，通过使用了含有BamHI位点的正方向寡核苷酸引物RHO134（32mer：5’-CCC GGA TCC ATG GTG GCC AGC GAG GTG CTC AG-3’）（序列号：245）和含有BamHI位点的逆方向寡核苷酸引物RHO135（34mer：5’-CCC GGA TCC TTA GTC GCG CTT GAG CTC AGC ATC C-3’）（序列号：246）的PCR（使用酶：LA taq Hot Start Version，TaKaRa公司制造，PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,53℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 7分钟/4℃ ∞），扩增裂殖壶菌（Schizochytrium）属来源的C20延长酶基因。将得到的两特异性产物凝胶精制，克隆于pGEM-T easy vector（Promega公司制造），用大肠杆菌扩增之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。将其命名为pRH70（图95）。分析碱基序列，其结果，取得具有编码315氨基酸（序列号：247）的945bp（序列号：248）的ORF的新基因序列。 [0597] [实施例14-2]作为用于制作C20延长酶基因打靶载体的基础的质粒的制作 [0598] 将实施例14-1中制作的pRH70（图95）作为模板，以在C20延长酶基因序列中间部分插入BglII位点的方式准备逆向设定的引物对，用PrimeSTAR Max DNA Polymerase（TAKARA BIO INC.制造）进行扩增。使用的PCR引物如下所述，并且都具有BglII接头序列。[RHO136：25mer：5’-CAT CGA GAT CTT CGT GTT TGT CCA C-3’（序列号：249）、RHO137：25mer：5’-ACG AAG ATC TCG ATG CGG GCG TCC C-3’（序列号：250）]。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒, 56℃ 15秒,72℃ 1分钟,循环30次/72℃ 1分钟]。在上述条件下扩增之后，用BglII消化之后，进行自身连接。连接后的样品用大肠杆菌扩增之后，使用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（BECKMAN COULTER公司制造）确认序列。将其命名为pRH71。以序列号：251表示插入有BglII位点的C20延长酶基因序列945bp。 [0599] 将制得的用于制作裂殖壶菌（Schizochytrium）属C20延长酶基因打靶载体的基础质粒（pRH71）表示于图96中。 [0600] [实施例14-3]打靶载体的制作（人工合成新霉素抗性基因和潮霉素抗性基因）[0601] 用BglII消化实施例2-2记载的pRH31（图13），将含有人工合成新霉素抗性基因盒的DNA片段连接于实施例14-2记载的pRH71（图96）的BglII位点。将其命名为pRH73。 [0602] 用BglII消化实施例2-3记载的pRH32（图15），将含有潮霉素抗性基因盒的DNA片段连接于实施例14-2记载的pRH71（图96）的BglII位点。将其命名为pKS-SKO。 [0603] 将制得的2种打靶载体（pRH73和pKS-SKO）表示于图97中。 [0604] [实施例14-4]C20延长酶基因打靶载体的导入 [0605] 将实施例14-3中制得的2种打靶载体作为模板，将含有翻译起始点的正方向引物（SorfF：20mer：5’-AGA TGG TGG CCA GCG AGG TG-3’）（序列号：252）以及含有翻译终止点的逆方向引物（SorfR：25mer：5’-TTA GTC GCG CTT GAG CTC AGC ATC C-3’）（序列号：253）用作引物，通过PrimeSTAR GXL polymerase扩增基因。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 30秒,60℃ 30秒,72℃ 3分钟,循环30次]。苯酚氯仿提取、氯仿提取之后，使DNA乙醇沉淀，将沉淀溶解于0.1×TE。测定A260/280，算出DNA浓度。将实施例14-3记载的pRH73（图97）作为模板时得到的导入片段为2644bp，并且成为裂殖壶菌（Schizochytrium）属C20延长酶上半段序列-SV40终止子序列-人工合成新霉素抗性基因序列-ubiquitin启动子序列-裂殖壶菌（Schizochytrium）属C20延长酶下半段序列的排列（序列号：254）。将实施例14-3记载的pKS-SKO（图97）作为模板时得到的导入片段为2881bp，并且成为裂殖壶菌 （Schizochytrium）属C20延长酶上半段序列-ubiquitin启动子序列-潮霉素抗性基因序列-SV40终止子序列-裂殖壶菌（Schizochytrium）属C20延长酶下半段序列的排列（序列号： 255）。 [0606] 在GY培养基中培养裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）TY12Ab株7天，将处于对数增殖期的细胞用于基因导入。相对于OD600=1～1.5当量的细胞，通过基因枪法，在微载体：0.6微米的金粒子，靶距：6cm，室真空（chamber vacuum）：26mmHg，爆破膜（Rupture disk）：1100PSI的条件下导入0.625μg的DNA片段。基因导入的细胞在24小时的恢复时间之后，涂布于PDA琼脂平板培养基（含有2mg/ml G418或者含有2mg/ml潮霉素）。 [0607] 其结果，每1次射入得到20个左右的耐药性菌株。 [0608] [实施例14-5]C20延长酶基因基因打靶同源重组体的鉴定 [0609] 对于裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）TY12Ab株（FERM ABP-11421）、C20延长酶基因杂同源重组体、以及C20延长酶基因同源重组体（基因破坏株）用GY培养基培养之后，将得到的细胞在4℃下以3,000rpm离心10分钟，制成小球，悬浊于20μl的SNET溶液[20mM Tris-HCl，pH8.0，5mM NaCl，0.3%SDS，200μg/ml Proteinase K（Nacalai Tesque公司制造）]之后，在55℃、6h/99.9℃下用5分钟将细胞溶解。将得到的细胞溶解液稀释10倍的物质作为模板，使用Mighty Amp DNA polymerase（TAKARA BIO INC.制造）进行基因组结构确认的PCR。将使用的引物的位置、扩增产物的预想尺寸表示于图98中。引物以实施例14-4中使用的SorfE以及SorfR的组合进行。[PCR循环：98℃ 2分钟/98℃ 10秒,60℃ 15秒,68℃ 4分钟,循环30次]。 [0610] 可以得到在野生型等位基因（Wt allele）中没有扩增，人工合成新霉素抗性基因等位基因（NeoR allele）以及潮霉素抗性基因等位基因（HygR allele）中具有扩增的C20延长酶敲除株（图99）。 [0611] [实施例14-6]通过C20延长酶破坏产生的脂肪酸组成的变化 [0612] 在GY培养基中培养裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）TY12Ab株和基因破坏株。将对数增殖期后期的细胞在4℃下以3,000rpm离心10分钟，制成小球，在0.9%NaCl中悬浊、清洗。接着，在4℃下以3,000rpm离心10分钟，将小球在灭菌水中悬浊、清洗。将其以3,000rpm离心 10分钟，除去上层清液，冷冻干燥。在冷冻干燥后的细胞中加入2ml氢氧化钾甲醇溶液（7.5% KOH in 95% methanol），涡流之后，用超声波粉碎菌体（80℃、30分钟）。 [0613] 加入500μl的灭菌水涡流之后，加入2ml的正己烷涡流。接着，以3,000rpm离心10分钟，除去上层。再次加入2ml正己烷涡流，以3,000rpm离心10分钟，除去上层。在残留的下层中添加1ml的6N HCl，涡流之后，加入2ml正己烷，进行涡流。接着，以3,000rpm离心10分钟，回收上层。再次加入2ml正己烷进行涡流，以3,000rpm离心10分钟，回收上层。用氮气浓缩蒸发回收的上层。在浓缩蒸发的样品中加入2ml的3N HCl甲醇溶液，在80℃下培养一晚。 [0614] 将样品冷却至室温，添加1ml的0.9%NaCl。加入2ml正己烷进行涡流。以3,000rpm离心10分钟，回收上层。再次加入2ml正己烷进行涡流，以3,000rpm离心10分钟，回收上层。在回收的上层中少量添加无水硫酸钠之后，进行涡流。以3,000rpm离心10分钟，回收上层。用氮气浓缩蒸发回收的上层。将浓缩蒸发的样品溶解于0.2ml正己烷中，将2μl供给GC分析。在GC分析中使用气相色谱仪GC-2014（岛津制作所制造），在柱：HR-SS-10（30m×0.25mm，信和化工公司制造），柱温：150℃→（5℃/min）→220℃（10min），载气：He（1.3mL/min）的条件下进行。 [0615] 该结果为，如果敲除裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）TY12Ab株的C20延长酶，则碳链长为20的脂肪酸增加（图100）。在图101中表示将野生型菌株设定为100%时的比例。 [0616] 这些结果为，花生四烯酸变化至约1.7倍，EPA变化至约1.3倍，DPA(n-6)变化至约1.1倍以及DHA变化至约0.9倍。 [0617] 产业上利用的可能性 [0618] 根据本发明，可以提供通过原生藻菌的基因破坏和/或表达抑制的原生藻菌的转化方法、改变原生藻菌产生的脂肪酸组成、以及使原生藻菌积蓄大量脂肪酸的方法，从而能够高效地制造多不饱和脂肪酸。 |
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