用于在转基因生物中产生多不饱和脂肪酸的方法

本发明涉及通过将编码具有Δ5延伸酶活性的多肽的核酸导入生物体，在生物中产生多不饱和脂肪酸的方法。这些核酸序列，根据需要与编码脂肪酸生物合成或脂代谢的多肽的其它核酸序列一起可有利地在生物中表达。特别有利的核酸序列是编码Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ12去饱和酶和/或Δ6延伸酶活性的核酸序列。这些去饱和酶和延伸酶有利地来源于海链藻属(Thalassiosira)、裸藻属(Euglena)或Ostreococcus。本发明还涉及产生具有含量升高的长链多不饱和脂肪酸的油类和/或三酰甘油酯的方法。

在优选的实施方案中，本发明进一步涉及产生不饱和ω3脂肪酸的方法和产生具有含量升高的不饱和脂肪酸尤其具有超过三个双键的ω3脂肪酸的甘油三酯的方法。本发明涉及转基因生物的产生，优选地为转基因植物或转基因微生物的产生，所述的转基因生物由于本发明方法中使用的延伸酶和去饱和酶，有利地与ω3去饱和酶类共同的表达，具有含量升高的不饱和ω3脂肪酸、具有ω3双键的油类或脂类，其中所述的ω3去饱和酶例如来自真菌腐霉科(Pythiaceae)如疫霉属(Phytophthora)，例如致病疫霉(Phytophthora infestans)属和种的真菌，或来自藻类如草绿藻科(Prasinophyceae)，例如Ostreococcus属，特别是Ostreococcus tauri属和种的藻类，或来自硅藻如海链藻属，特别是假矮海链藻(Thalassiosirapseudonana)属和种的硅藻。

本发明进一步涉及核酸序列、包含本发明核酸序列的核酸构建体、载体和生物、包含核酸序列和/或核酸构建体的载体并且涉及含有以上提及的核酸序列、核酸构建体和/或载体的转基因生物。

本发明的一部分还涉及根据本发明方法产生的油、脂类和/或脂肪酸和它们的用途。本发明还涉及不饱和脂肪酸和具有含量升高的不饱和脂肪酸的甘油三酯以及它们的用途。

脂肪酸和三酰甘油酯在食品工业、动物营养、化妆品和药学领域内具有多种应用。根据它们是否为游离饱和或不饱和脂肪酸或为具有含量升高的饱和或不饱和脂肪酸的三酰甘油酯，这些脂肪酸和三酰甘油酯适合迥然不同的应用。因为哺乳动物不能产生多不饱和脂肪酸，所以多不饱和脂肪酸例如亚油酸和亚麻酸为哺乳动物必需。故多不饱和ω3脂肪酸和ω6脂肪酸是动物和人类营养的重要构成要素。

鉴于多不饱和长链ω3脂肪酸在健康领域包括儿童脑发育、眼的功能性、激素和其它信号物质的合成以及心血管疾病、癌症和糖尿病的预防的多种作用，多不饱和长链ω3脂肪酸例如二十碳五烯酸(EPA，C20:5Δ5，8，11，14，17)或二十二碳六烯酸(DHA，C22:6Δ4，7，10，13，16，19)是人类营养的重要成分(Poulos，A，Lipids 30：1-14，1995；Horrocks，LA和YeoYK，Pharmacol Res 40：211-225，1999)。这是为什么需要产生多不饱和长链脂肪酸的的原因。

鉴于目前人类食物的组成，向食物中添加优先地发现于鱼油中的多不饱和ω3脂肪酸极为重要。因此例如将多不饱和脂肪酸如二十二碳六烯酸(DHA，C22:6Δ4，7，10，13，16，19)或二十碳五烯酸(EPA，C20:5Δ5，8，11，14，17)添加至婴儿配制方中以改善营养价值。据称不饱和脂肪酸DHA对脑功能的发育和维持有积极影响。

下文中多不饱和脂肪酸称作PUFA、PUFAs、LCPUFA或LCPUFAs(poly unsaturated fatty acids，PUFA，long chain polyunsaturated fatty acids，LCPUFA)。

多种脂肪酸和甘油三酯主要从微生物如被孢霉属(Mortierella)和Schizochytrium中获得或从产油植物如大豆、油菜籽、藻类如隐甲藻属(Crypthecodinium)或褐指藻属(Phaeodactylum)和其它生物中获得，其中所述多种脂肪酸和甘油三酯通常以其三酰甘油酯(＝甘油三酯＝三酰甘油)形式获得。然而这些脂肪酸和甘油三酯也能从动物如鱼中获得。游离脂肪酸有利地通过水解制备。极长链多不饱和脂肪酸例如DHA、EPA、花生四烯酸(ARA，C20:4Δ5，8，11，14)、二高γ-亚麻酸(C20:3Δ8，11，14)或二十二碳五烯酸(DPA，C22:5Δ7，10，13，16，19)不能在油料作物例如油菜籽、大豆、向日葵或红花中合成。这些脂肪酸的常规天然来源是鱼如鲱鱼、鲑鱼、沙丁鱼、雄鲑、鳗鲡、鲤鱼、鳟鱼、大比目鱼、鲭鱼、梭鲈或金枪鱼或藻类。

根据目的用途，具有饱和或不饱和脂肪酸的油为优选。例如在人类营养中，具有不饱和脂肪酸尤其具有多不饱和脂肪酸的脂类为优选。据称多不饱和ω3脂肪酸对血液中胆固醇水平具有正面影响并且因此正面地影响心脏病的预防可能性。通过向食物中添加这些ω3脂肪酸可显著降低心脏病、中风或高血压的风险。ω3脂肪酸也正面影响与免疫性疾病如类风湿性关节炎有关的炎性过程，尤其是慢性炎性过程。因此将它们添加至食品，尤其食用性食品中或应用于药品。由于我们日常的饮食摄入，ω6脂肪酸如花生四烯酸往往不利地影响与这些风湿性疾病相关的这类功能紊乱。

ω3和ω6脂肪酸是称作类二十烷酸的组织激素如前列腺素的前体，其中这类组织激素自二高γ亚麻酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸衍生，同时ω3和ω6脂肪酸也是凝血噁烷和白三烯的前体，而凝血噁烷和白三烯衍生自花生四烯酸和二十碳五烯酸。形成自ω6脂肪酸的类二十烷酸(称作PG2系列)通常促进了炎性反应，而ω3脂肪酸来源的类二十烷酸(称作PG3系列)具有很少或没有促炎效应。

鉴于多不饱和脂肪酸的积极特征，过去从未停止尝试获得参与合成这些脂肪酸或甘油三酯的基因以便在不饱和脂肪酸的含量经改变的多种生物中产生油。因而WO 91/13972和它的美国等同公开描述了Δ9去饱和酶。WO 93/11245要求了Δ15去饱和酶的权利并且WO 94/11516要求了Δ12去饱和酶的权利。而且其它去饱和酶在例如EP-A-0550162、WO 94/18337、WO 97/30582、WO 97/21340、WO 95/18222、EP-A-0794250、Stukey等，J.Biol.Chem.，265，1990：20144-20149、Wada等，Nature 347，1990：200-203或Huang等，Lipids 34，1999：649-659中得到了描述。然而迄今多种去饱和酶的生物化学特征描述得仍不充分，因为这些酶作为膜结合蛋白严重阻碍了对它们的分离和特征描述(McKeon等，Methods in Enzymol.71，1981：12141-12147，Wang等，Plant Physiol.Biochem.，26，1988：777-792)。原则上将膜结合的去饱和酶通过导入合适的生物并随后通过分析起始物质和产物而分析酶活性来表征。Δ6去饱和酶在WO 93/06712、US 5614393、US5614393、WO 96/21022、WO 00/21557和WO 99/27111中描述并且这种酶用于转基因生物中产生脂肪酸的中请在WO 98/46763、WO 98/46764和WO98/46765中描述。在本上下文中，多种去饱和酶的表达和多不饱和脂肪酸的形成也在WO 99/64616或WO 98/46776中进行了描述和要求权利。就去饱和酶的表达效率和这种表达效率对多不饱和脂肪酸形成的影响而言，必须指出单一去饱和酶的表达如迄今所述仅仅获得了低含量的不饱和脂肪酸/脂类如γ-亚麻酸和硬脂艾杜糖酸(stearidonic acid)。此外通常获得的是ω3和ω6脂肪酸的混合物。

尤其适合用于产生PUFA的微生物是微藻如三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、Porphiridium某些种、破囊壶菌属(Thraustochytrium)某些种、Schizochytrium种或隐甲藻属某些种、纤毛虫例如棘尾虫属(Stylonychia)或豆形虫属(Colpidium)、真菌如被孢霉、虫霉菌属(Entomophthora)和毛霉属(Mucor)和/或藓类如剑叶藓属(Physcomitrella)、角齿藓属(Ceratodon)和地钱属(Marchantia)(R.Vazhappilly和F.Chen(1998)Botanica Marina 41：553-558；K.Totani和K.Oba(1987)Lipids 22：1060-1062；M.Akimoto等，(1998)Appl.Biochemistry and Biotechnology 73：269-278)。株系的选择已经导致了所讨论的多种微生物突变株系的开发，这些突变株系产生了包括PUFA在内的一系列目标化合物。然而对株系进行突变并选择具有改善特定分子如多不饱和脂肪酸产生的株系是一个费时且困难的过程。这就是为什么只要可能就优选如上所述的重组方法的原因。

然而目的多不饱和脂肪酸如DPA、EPA或ARA在以上提到的微生物的协助下仅仅可有限量地产生并且通常根据所用的微生物，这些脂肪酸作为如EPA、DPA或ARA的脂肪酸混合物获得。

讨论了花生四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)(图1)合成的多种合成途径。因此，EPA或DHA通过聚酮化合物途径在海生细菌如弧菌(Vibrio sp.)或希瓦菌(Shewanella sp.)中产生(Yu，R.等，Lipids 35：1061-1064，2000；Takeyama，H.等，Microbiology 143：2725-2731，1997)。

另一个备选策略是改变去饱和酶和延伸酶的活性(Zank，T.K.等，PlantJournal 31：255-268，2002；Sakuradani，E.等，Gene 238：445-453，1999)。经Δ6去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶和Δ4去饱和酶修饰的上述途径是哺乳动物中的Sprecher途径(Sprecher 2000，Biochim.Biophys.Acta 1486：219-231)。实施进一步的延伸步骤而非Δ4去饱和过程以产生C24，随后通过进一步Δ6-去饱和作用和最终的β-氧化作用产生了C22的链长度。由于调节机制未知，故称作Sprecher的途径(见图1)并不适于植物和微生物中的生产。

这类多不饱和脂肪酸可根据它们的去饱和形式分为两个大类，即ω6或ω3脂肪酸，其中这些脂肪酸在代谢和功能性活性方面有差异(图1)。

ω6代谢途径的起始物质是脂肪酸亚油酸(18:2Δ9，12)而ω3途径经亚麻酸(18:3Δ9，12，15)进行。亚麻酸通过ω3去饱和酶的活性形成(Tocher等，1998，Prog.Lipid Res.37，73-117；Domergue等，2002，Eur.J.Biochem.269，4105-4113)。

哺乳动物及人类没有相应的去饱和酶活性(Δ12和ω3去饱和酶)并且必须通过食物摄入这类脂肪酸(必需脂肪酸)。生理上重要的多不饱和脂肪酸花生四烯酸(ARA，20:4Δ5，8，11，14)，一种ω6脂肪酸及两种ω3脂肪酸二十碳五烯酸(EPA，20:5Δ5，8，11，14，17)和二十二碳六烯酸(DHA，22.6Δ4，7，10，13，17，19)从这类前体开始通过依次的去饱和酶以及延伸酶反应合成。ω3脂肪酸在心血管疾病(Shimikawa 2001，World Rev.Nutr.Diet.88，100-108)、Entzündungen(Calder 2002，Proc.Nutr.Soc.61，345-358)和关节炎(Cleland和James 2000，J.Rheumatol.27，2305-2307)的治疗应用中表现了如上所述的治疗活性、

因此就营养生理而言在合成多不饱和脂肪酸时，成功实现ω6合成途径和ω3合成途径间的转化(见图1)以产生更多ω3脂肪酸是重要的。多种使C18:2、C22:4或C22:5脂肪酸去饱和的ω3去饱和酶的酶活性已在文献中描述(见图1)。然而已经由生物化学所描述的去饱和酶无一能使ω6合成途径中广泛类型的底物转化为ω3合成途径中相应的脂肪酸。

因而对适于产生ω3多不饱和脂肪酸的ω3去饱和酶的需求一直十分迫切。所有已知的植物和蓝细菌ω3去饱和酶可用亚油酸为底物使C18脂肪酸去饱和，但是不能使任何C20或C22脂肪酸去饱和。

已知真菌Saprolegnia dicilina具有使C20多不饱和脂肪酸去饱和的ω3去饱和酶[Pereira等2004，Biochem.J.378(Pt 2)：665-71]。然而，这种ω3去饱和酶的缺点是不能使任何C18或C22PUFA如ω6合成途径中重要脂肪酸C18:2、C22:4或C22:5脂肪酸去饱和。更为不利的是这种酶不能使任何结合至磷脂的脂肪酸去饱和。这种酶仅仅转化辅酶A-脂肪酸酯。

脂肪酸按照2或4个C原子通过延伸酶加以延伸对于分别产生C20和C22PUFA极其重要。这个过程经历4个步骤。第一步是通过酮酰基辅酶A合成酶(KCS，此处以下称为延伸酶)使丙二酸单酰辅酶A和脂肪酸酰基辅酶A缩合。随后是一个还原步骤(酮酰基辅酶A还原酶，KCR)、一个脱水步骤(脱水酶)和一个最后的还原步骤(烯酰辅酶A还原酶)。据推测延伸酶的活性影响了这个过程整体的特异性和速率(Millar和Kunst，1997 Plant Journal 12：121-131)。

过去已进行了获取延伸酶基因的多次尝试。Millar和Kunst，1997(Plant Journal 12：121-131)并且Millar等1999，(Plant Cell 11：825-838)描述了用于合成单不饱和长链脂肪酸(C22:1)的植物延伸酶的特征和用于合成在植物中形成蜡的极长链脂肪酸(C28～C32)的植物延伸酶的特征。关于花生四烯酸和EPA合成的描述可在例如WO0159128、WO0012720、WO02077213和WO0208401中找到。多不饱和C24脂肪酸的合成在例如Tvrdik等，2000，JCB 149：707-717或WO0244320中得到描述。

迄今仍未描述在天然不产生DHA(C22:6n-3)的生物中用于产生DHA的特异性延伸酶。目前只描述了可提供C20或C24脂肪酸的延伸酶。迄今没有Δ5延伸酶活性的描述。

高等植物包含多不饱和脂肪酸如亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)。但ARA、EPA和DHA在所有高等植物的种子油中完全找不到或仅少量发现(E.Ucciani：Nouveau Dictionnaire des Huiles Végétales[NewDictionary of Vegetable oils].Technique&Documentation-Lavoisier，1995.ISBN：2-7430-0009-0)。然而在高等植物，优选在油料作物例如油菜籽、亚麻子、向日葵和大豆产生LCPUFA将是有利的因为有可能经济地获得大量高质量的LCPUFA用于食品工业、动物营养和药用目的。为实现此目标，编码LCPUFA生物合成酶基因通过重组方法向油料作物中导入并且在其中表达这些基因是有利的。例如这些基因编码例如Δ6去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶或Δ4去饱和酶。这些基因可有利地从产生LCPUFA并且使LCPUFA掺入膜或三酰甘油酯的微生物和低等植物中分离。因此已有可能从藓类植物展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)中分离Δ6去饱和酶基因并且从展叶剑叶藓和秀丽线虫(C.elegans)中分离Δ6延伸酶基因。

包含并表达编码LCPUFA生物合成酶的基因并且由此产生LCPUFA的第一个转基因植物例如在DE-A-10219203(用于在植物中产生多不饱和脂肪酸的方法)中得到首次描述。然而这些植物仅以需要进一步优化而用于目前工厂中油料加工的量产生了LCPUFA。

为实现以这类多不饱和脂肪酸强化食物和/或饲料，用于产生尤其是在真核细胞系统内产生这类多不饱和脂肪酸的简单、廉价的方法极为需要。

因此本发明的一个目标是提供适于合成LCPUFA的其他基因或酶，尤其提供具有Δ5-延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ12去饱和酶或Δ6去饱和酶活性的基因以产生多不饱和脂肪酸。本发明的又一个目标是提供有可能自ω6脂肪酸转化为ω3脂肪酸的基因或酶。本发明的另一个目标是开发在生物中，有利地在真核生物中，优选地在植物或微生物中产生多不饱和脂肪酸的方法。这个目标通过本发明的用于转基因生物中产生式I化合物的方法实现，其中以所述转基因生物的总脂类含量为基础，这种转基因生物具有至少1％重量含量的式I化合物，其中式I化合物为：

所述的方法包括如下步骤：

a)将至少一个编码Δ9延伸酶和/或Δ6去饱和酶活性的核酸序列导入生物体，以及

b)将至少一个编码Δ8去饱和酶和/或Δ6延伸酶活性的核酸序列导入生物体，以及

c)将至少一个编码Δ5去饱和酶活性的核酸序列导入生物体，以及

d)将至少一个编码Δ5延伸酶活性的核酸序列导入生物体，以及

e)将至少一个编码Δ4去饱和酶活性的核酸序列导入生物体，并且在此方法中式I的变量和取代基的含义如下：

R1＝羟基、辅酶A(硫酯)、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血二磷脂酰甘油、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰肌醇、鞘碱(sphingo base)或式II的基团，

其中在所述的式II中

R2＝氢、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血二磷脂酰甘油、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰肌醇或饱和或不饱和的C2～C24烷基羰基，

R3＝氢、饱和或不饱和的C2～C24烷基羰基，或R2和R3彼此独立地是式Ia的基团：

其中所述的式Ia中

n＝2、3、4、5、6、7或9，m＝2、3、4、5或6并且p＝0或3。

式I中的R1为羟基、辅酶A(硫酯)、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血二磷脂酰甘油、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰肌醇、鞘碱或式II的基团。

以上提及的基团R1总是与式I的硫酯形式化合物结合。

式II中的R2为氢、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血二磷脂酰甘油、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰肌醇或饱和或不饱和C2～C24烷基羰基。

可提及的烷基是包含一个或多个双键的取代或未取代、饱和或不饱和的C2～C24烷基羰基链如乙基羰基、正丙基羰基、正丁基羰基、正戊基羰基、正己基羰基、正庚基羰基、正辛基羰基、正壬基羰基、正癸基羰基、正十一烷基羰基、正十二烷基羰基、正十三烷基羰基、正十四烷基羰基、正十五烷基羰基、正十六烷基羰基、正十七烷基羰基、正十八烷基羰基、正十九烷基羰基、正二十烷基羰基、正二十二烷基羰基或正二十四烷基羰基。包含一个或多个双键的饱和或不饱和C10～C22烷基羰基如正癸基羰基、正十一烷基羰基、正十二烷基羰基、正十三烷基羰基、正十四烷基羰基、正十五烷基羰基、正十六烷基羰基、正十七烷基羰基、正十八烷基羰基、正十九烷基羰基、正二十烷基羰基、正二十二烷基羰基或正二十四烷基羰基为优选的。尤其优选包含一个或多个双键的饱和和/或不饱和C10～C22烷基羰基如C10烷基羰基、C11烷基羰基、C12烷基羰基、C13烷基羰基、C14烷基羰基、C16烷基羰基、C18烷基羰基、C20烷基羰基或C22烷基羰基。非常尤其优选包含一个或多个双键的饱和或不饱和C16～C22烷基羰基如C16烷基羰基、C18烷基羰基、C20烷基羰基或C22烷基羰基。这些有利的基团可以包含二、三、四、五或六个双键。脂肪酸链中具有20或22个碳原子的尤其优选的基团包含多达六个双键，有利地包含三、四、五或六个双键，尤其优选地包含五或六个双键。以上提到的所有基团均衍生自相应的脂肪酸。

式II中的R3为氢、饱和或不饱和的C2～C24烷基羰基。

可提及的烷基是包含一个或多个双键的取代或未取代、饱和或不饱和的C2～C24烷基羰基链例如乙基羰基、正丙基羰基、正丁基羰基、正戊基羰基、正己基羰基、正庚基羰基、正辛基羰基、正壬基羰基、正癸基羰基、正十一烷基羰基、正十二烷基羰基、正十三烷基羰基、正十四烷基羰基、正十五烷基羰基、正十六烷基羰基、正十七烷基羰基、正十八烷基羰基、正十九烷基羰基、正二十烷基羰基、正二十二烷基羰基或正二十四烷基羰基。优选包含一个或多个双键的饱和或不饱和C10～C22烷基羰基例如正癸基羰基、正十一烷基羰基、正十二烷基羰基、正十三烷基羰基、正十四烷基羰基、正十五烷基羰基、正十六烷基羰基、正十七烷基羰基、正十八烷基羰基、正十九烷基羰基、正二十烷基羰基、正二十二烷基羰基或正二十四烷基羰基。尤其优选包含一个或多个双键的饱和和/或不饱和C10～C22烷基羰基例如C10烷基羰基、C11烷基羰基、C12烷基羰基、C13烷基羰基、C14烷基羰基、C16烷基羰基、C18烷基羰基、C20烷基羰基或C22烷基羰基。非常尤其优选包含一个或多个双键的饱和或不饱和C16～C22烷基羰基如C16烷基羰基、C18烷基羰基、C20烷基羰基或C22烷基羰基。这些有利的基团可包含二、三、四、五或六个双键。在脂肪酸链中具有20或22个碳原子的尤其优选的基团包含多达六个双键，有利地包含三、四、五或六个双键，尤其优选地包含五或六个双键。以上提到的所有基团均衍生自相应的脂肪酸。

以上提及的R1、R2和R3基团可以被羟基和/或环氧基取代和/或可以包含三键。

本发明的方法中所产生的多不饱和脂肪酸有利地包含至少两个，有利地包含三、四、五或六个双键。这些脂肪酸尤其有利地包含四、五或六个双键。方法中所产生的脂肪酸在脂肪酸链中有利地具有18、20或22个C原子；这些脂肪酸在脂肪酸链中优选地包含20或22个碳原子。饱和的脂肪酸通过方法中所用核酸有利地得以小程度地反应至或者完全未得到反应。小程度应当理解为与多不饱和脂肪酸相比，饱和脂肪酸以低于5％的活性、有利地以低于3％、尤其有利地以低于2％、非常尤其有利地以低于1、0.5、0.25或0.125％的活性反应。这些已经产生的脂肪酸可以在方法中作为单个产物产生或在脂肪酸混合物中出现。

本发明方法中所用的核酸序列是编码具有Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶和/或Δ4去饱和酶活性的多肽的经分离的核酸序列。

本发明方法中有利使用的核酸序列是那些编码具有Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶或Δ4去饱和酶活性的多肽的核酸序列，这些核酸序列选自：

a)具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：183中所示序列的核酸序列，或

b)作为遗传密码简并结果可由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：132或SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138或SEQ ID NO：184中所示氨基酸序列衍生的核酸序列，或

c)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：183中所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：132or SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138或SEQ ID NO：184在氨基酸水平具有至少40％同一性的多肽或者/并且具有Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶或Δ4去饱和酶活性。

式I和II中的取代基R2或R3有利地并彼此独立地是饱和或不饱和的C18～C22烷基羰基，这些取代基尤其有利地彼此独立地是具有至少两个双键的不饱和的C18、C20或C22烷基羰基。

方法中一个优选实施方案的特征在于将这样的核酸序列额外地导入生物体，其中所述核酸序列编码具有ω3去饱和酶活性的多肽，选自：

a)具有SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：105中所示序列的核酸序列，或

b)作为遗传密码简并结果可由SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：106中所示的氨基酸序列衍生的核酸序列，或

c)SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：105中所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：106在氨基酸水平具有至少60％同一性的多肽并且具有ω3去饱和酶活性。

在另一个优选实施方案中，方法包括向生物体中额外地导入这样的核酸序列，其中所述核酸序列编码具有Δ12去饱和酶活性的多肽，选自：

a)具有SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：109中所示序列的核酸序列，或

b)作为遗传密码简并结果可由SEQ ID NO：108或SEQ ID NO：110中所示的氨基酸序列衍生的核酸序列，或

c)SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：109中所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQ ID NO：108或SEQ ID NO：110在氨基酸水平具有至少60％同一性的多肽并且具有Δ12去饱和酶活性。

以上提及的Δ12去饱和酶序列可与方法中所用的并且编码Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶和/或Δ4去饱和酶的核酸序列共同使用，单独或与ω3去饱和酶序列联合使用。

表1显示了核酸序列、来源生物和序列ID号

  No.   生物体   活性  序列号   1.   细小裸藻(Euglena gracilis)   Δ8-去饱和酶  SEQ ID NO：1   2.   绿光等鞭金藻(Isochrysis galbana)   Δ9-延伸酶  SEQ ID NO：3   3.   三角褐指藻(Phaedodactylum tricornutum)   Δ5-去饱和酶  SEQ ID NO：5   4.   角齿藓(Ceratodon pupureus)   Δ5-去饱和酶  SEQ ID NO：7   5.   展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)   Δ5-去饱和酶  SEQ ID NO：9   6.   破囊壶菌属中的种(Thraustrochytrium sp.)   Δ5-去饱和酶  SEQ ID NO：11   7.   高山被孢霉(Mortierella alpina)   Δ5-去饱和酶  SEQ ID NO：13   8.   秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)   Δ5-去饱和酶  SEQ ID NO：15   9.   琉璃苣(Borago officinalis)   Δ6-去饱和酶  SEQ ID NO：17   10.   角齿藓   Δ6-去饱和酶  SEQ ID NO：19   11.   三角褐指藻   Δ6-去饱和酶  SEQ ID NO：21   12.   展叶剑叶藓   Δ6-去饱和酶  SEQ ID NO：23   13.   秀丽隐杆线虫   Δ6-去饱和酶  SEQ ID NO：25   14.   展叶剑叶藓   Δ6-延伸酶  SEQ ID NO：27   15.   破囊壶菌属中的种   Δ6-延伸酶  SEQ ID NO：29

  No.   生物体   活性  序列号   16.   致病疫霉(Phytopthera infestans)   Δ6-延伸酶  SEQ ID NO：31   17.   高山被孢霉   Δ6-延伸酶  SEQ ID NO：33   18.   高山被孢霉   Δ6-延伸酶  SEQ ID NO：35

  19.   秀丽隐杆线虫   Δ6-延伸酶   SEQ ID NO：37   20.   细小裸藻   Δ4-去饱和酶   SEQ ID NO：39   21.   破囊壶菌属中的种   Δ4-去饱和酶   SEQ ID NO：41   22.   假矮海链藻(Thalassiosira pseudonana)   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：43   23.   假矮海链藻   Δ6-延伸酶   SEQ ID NO：45   24.   寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：47   25.   寇氏隐甲藻   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：49   26.   虹鳟(Oncorhynchus mykiss)   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：51   27.   虹鳟   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：53   28.   假矮海链藻   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：59   29.   假矮海链藻   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：61   30.   假矮海链藻   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：63   31.   鲜黄破囊壶菌(Thraustrochytrium aureum)   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：65   32.   Ostreococcus tauri   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：67   33.   Ostreococcus tauri   Δ6-延伸酶   SEQ ID NO：69   34.   有粉报春(Primula farinosa)   Δ6-去饱和酶   SEQ ID NO：71   35.   高穗花报春(Primula vialii)   Δ6-去饱和酶   SEQ ID NO：73   36.   Ostreococcus tauri   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：75   37.   Ostreococcus tauri   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：77   38.   Ostreococcus tauri   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：79   39.   Ostreococcus tauri   Δ6-延伸酶   SEQ ID NO：81

  19.   秀丽隐杆线虫   Δ6-延伸酶   SEQ ID NO：37   40.   破囊壶菌属中的种   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：83   41.   假矮海链藻   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：85   42.   致病疫霉   ω3-去饱和酶   SEQ ID NO：87   43.   Ostreococcus tauri   Δ6-去饱和酶   SEQ ID NO：89

  44.   Ostreococcus tauri   Δ5-去饱和酶   SEQ ID NO：91   45.   Ostreococcus tauri   Δ5-去饱和酶   SEQ ID NO：93   46.   Ostreococcus tauri   Δ4-去饱和酶   SEQ ID NO：95   47.   假矮海链藻   Δ6-去饱和酶   SEQ ID NO：97   48.   假矮海链藻   Δ5-去饱和酶   SEQ ID NO：99   49.   假矮海链藻   Δ5-去饱和酶   SEQ ID NO：101   50.   假矮海链藻   Δ4-去饱和酶   SEQ ID NO：103   51.   假矮海链藻   ω3-去饱和酶   SEQ ID NO：105   52.   Ostreococcus tauri   Δ12-去饱和酶   SEQ ID NO：107   53.   假矮海链藻   Δ12-去饱和酶   SEQ ID NO：109   54.   Ostreococcus tauri   Δ6-延伸酶   SEQ ID NO：111   55.   Ostreococcus tauri   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：113   56.   非洲爪蟾(Xenopus laevis)(BC044967)   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：117   57.   玻璃海鞘(Ciona intestinalis)(AK112719)   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：119   58.   细小裸藻   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：131   59.   细小裸藻   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：133   60.   拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：135   61.   拟南芥菜   Δ5-延伸酶   SEQ ID NO：137   62.   三角褐指藻   Δ6-延伸酶   SEQ ID NO：183

方法中所产生的多不饱和脂肪酸有利地结合膜脂类和/或三酰甘油酯，但是也可以在生物中以游离脂肪酸或与其它脂肪酸酯的结合形式出现。在本上下文中，它们可作为“纯的产物”或者有利地以多种脂肪酸的混合物或不同甘油酯的混合物的形式出现。三酰甘油酯中所结合的多种脂肪酸可由具有4至6个C原子的短链脂肪酸、具有8至12个C原子的中等链脂肪酸或14至24个C原子的长链脂肪酸衍生，优选从长链脂肪酸衍生，更为优选地从具有18、20和/或22个C原子的长链多不饱和脂肪酸衍生。

本发明的方法有利地产生了在脂肪酸酯中具有至少两个双键，有利地在脂肪酸酯中具有至少三个、四个、五个或六个双键，尤其有利地在脂肪酸酯中具有至少五个或六个双键的多不饱和C18、C20和/或C22脂肪酸分子的脂肪酸酯并且有利地导致亚油酸(LA，C18:2Δ9，12)、γ亚麻酸(GLA，C18:3Δ6，9，12)、硬脂艾杜糖酸(SDA，C18:4Δ6，9，12，15)、二高γ亚麻酸(DGLA，20:3Δ8，11，14)、ω3花生四烯酸(ETA，C20:4Δ5，8，11，14)、花生四烯酸(ARA，C20:4Δ5，8，11，14)、二十碳五烯酸(EPA，C20:5Δ5，8，11，14，17)、ω6二十二碳五烯酸(C22:5Δ4，7，10，13，16)、ω6二十二碳四烯酸(C22:4Δ7，10，13，16)、ω3二十二碳五烯酸(DPA，C22:5Δ7，10，13，16，19)、二十二碳六烯酸(DHA，C22:6Δ4，7，10，13，16，19)或这些脂肪酸混合物的合成，优选导致ARA、EPA和/或DHA的合成。非常尤其优选产生了ω3脂肪酸如EPA和/或DHA。

具有多不饱和的C18、C20和/或C22脂肪酸分子的脂肪酸酯可以油或脂的形式，例如以化合物如鞘脂类、磷酸甘油酯、脂、糖脂例如糖鞘脂类、磷脂例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或二磷脂酰甘油、单酰甘油酯、二酰甘油酯、三酰甘油酯或者其它脂肪酸酯例如乙酰基辅酶A酯的形式分离，其中所述的脂肪酸酯包含源于已用来制备脂肪酸酯的生物体的具有至少两个、三个、四个、五个或六个双键，优选地具有五个或六个双键的多不饱和脂肪酸；这些脂肪酸酯优选地以其二酰甘油酯、三酰甘油酯和/或以磷脂酰胆碱的形式，尤其优选地以三酰甘油酯的形式分离。除了这些酯以外，多不饱和脂肪酸也可以作为游离的或结合于其它化合物中的脂肪酸在生物，有利地在植物中存在。通常以上提到的多种化合物(脂肪酸酯和游离脂肪酸)在生物体中以如下的大致分布出现，即以多种化合物的总体计为100％重量，甘油三酯占80至90％重量、二酰甘油占2至5％重量、单酰甘油占5至10％重量、游离脂肪酸占1至5％重量、磷脂占2至8％重量。

本发明的方法产生了LCPUFA，其中所产生的LCPUFA的含量以转基因生物，优选地以转基因植物中的总脂肪酸为基础占至少3％重量、有利地占至少5％重量，优选地占至少8％重量，尤其优选地占至少10％重量、最为优选地占至少15％重量。在本上下文中仅仅提到两个例子，将宿主生物中的C18和/或C20脂肪酸转化了至少10％、优选地至少20％、尤其优选地至少30％、最优选地至少40％以产生相应的产物如DPA或DHA是有利的。这些脂肪酸有利地以结合的形式产生。在本发明方法中所用的核酸的辅助下，这些不饱和脂肪酸可以在已经有利地产生的甘油三酯的sn1、sn2和/或sn3位置处定位。由于多个反应步骤在本发明的方法中通过起始化合物亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)实施，故方法的终产物例如花生四烯酸(ARA)，二十碳五烯酸(EPA)、ω6二十二碳五烯酸或DHA不能作为绝对纯的产物获得；在终产物中总是出现微小痕量的前体。例如假设亚油酸和亚麻酸两者均在起始生物和起始植物中出现，则终产物如ARA、EPA或DHA作为混合物出现。以所讨论终产物的量为基础，前体应当有利地不超过20％重量、优选地不超过15％重量、尤其优选地不超过10％重量，最优选地不超过5％重量。有利地，根据本发明的方法，仅仅结合的或作为游离酸的ARA、EPA或仅DHA作为转基因植物中的终产物得到产生。如果同时产生化合物ARA、EPA和DHA，它们有利地以至少1∶1∶2(EPA∶ARA∶DHA)、有利地以至少1∶1∶3、优选地以至少1∶1∶4、尤其优选地以1∶1∶5的比率得到产生。

由本发明的方法所产生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物有利地包含6至15％的棕榈酸、1至6％的硬脂酸、7-85％的油酸、0.5至8％的11-十八碳烯酸、0.1至1％的花生酸、7至25％的饱和脂肪酸、8至85％的单不饱和脂肪酸和60至85％的多不饱和脂肪酸，每种情况均以100％为基础并且以生物中总脂肪酸含量为基础。以总脂肪酸含量为基础，在脂肪酸酯或脂肪酸混合物出现的有利多不饱和脂肪酸优选地是至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1％的花生四烯酸。而且通过本发明方法所产生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物有利地包含选自芥酸(13-二十二碳烯酸)、苹婆酸(9，10-亚甲基十八碳-9-烯酸)、锦葵酸(8，9-亚甲基十七碳-8-烯酸)、大风子油酸(环戊烯十二烷酸)、呋喃脂肪酸(9，12-环氧十八碳-9，11-二烯酸)、斑鸠菊酸(9，10-环氧十八碳-12-烯酸)、果脂酸(6-十八碳炔酸)、6-十九碳炔酸、santalbic acid(反11-十八碳烯-9-炔酸)、6，9-十八碳烯炔酸、pyrulic acid(反10-十七烯-8-炔酸)、crepenyninic acid(9-十八烯-12-炔酸)、13，14-二氢oropheic acid、十八碳-13-烯-9，11-二炔酸、伞形花子油酸(顺-6-十八烯酸)、9顺，12反-十八碳二烯酸、金盏花素酸(calendulicacid)(8反10反12顺-十八碳三烯酸)、梓甙酸(catalpic acid)(9反11反13顺-十八碳三烯酸)、桐酸(9顺11反13反-十八碳三烯酸)、jacaric acid(8顺10反12顺-十八碳三烯酸)、石榴酸(9顺11反13顺-十八碳三烯酸)、麦饼树酸(9顺11反13反15顺-十八碳四烯酸)、皮诺敛酸(pinolenicacid)(全-顺-5，9，12-十八碳三烯酸)、laballenic acid(5，6-十八碳二烯丙二烯酸)、蓖麻油酸(12-羟油酸)和/或革盖菌素酸(coriolic acid)(13-羟-9顺，11反-十八碳二烯酸)的脂肪酸。上述脂肪酸通常有利地仅在本发明方法所产生的脂肪酸酯或脂肪酸的混合物中痕量地存在，这就是说，以总脂肪酸为基础，它们的存在小于30％、优选地小于25％、24％、23％、22％或21％、尤其优选地低于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％或5％，非常尤其优选地小于4％、3％、2％或1％。在本发明更为优选的形式中，以总脂肪酸为基础，这些上述脂肪酸的存在小于0.9％、0.8％、0.7％、0.6％或0.5％，尤其优选地小于0.4％、0.3％、0.2％、0.1％。以总脂肪酸为基础，由本发明方法所产生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物有利地包含小于0.1％和/或无丁酸、无胆固醇、无鰶鱼酸(二十二碳五烯酸，C22:5Δ4，8，12，15，21)以及无尼生酸(二十四碳六烯酸，C23:6Δ3，8，12，15，18，21)。

当脂肪酸以GC分析检测时，与非转基因的起始生物如酵母、藻类、真菌或植物如拟南芥(arabidopsis)或亚麻子相比较，由于核酸序列或在方法中所用的核酸序列，多不饱和脂肪酸的产量可获得至少50％、有利地为至少80％、尤其有利地为至少100％、极其有利地为至少150％的提高(见实施例)。

化学纯的多不饱和脂肪酸或脂肪酸组合物也能通过以上描述的方法合成。为达此目的，脂肪酸或脂肪酸组合物按照已知的方法如通过提取、蒸馏、结晶、层析或这些方法的组合从生物如微生物或植物，或从其中生物已经在其内或其上生长的培养基，或从生物和培养基中分离。这些化学纯的脂肪酸或脂肪酸组合物有利地在食品工业、化妆品应用并且尤其在药学领域内应用。

原则上在本发明方法中用于产生的合适生物可以是任何生物如微生物、非人类动物或植物。

合适的植物原则上是能合成脂肪酸的所有植物如所有双子叶或单子叶植物、藻类或藓类。有利的植物选自Adelotheciaceae、漆树科(Anacardiaceae)、菊科(Asteraceae)、伞形科(Apiaceae)、桦木科(Betulaceae)、紫草科(Boraginaceae)、十字花科(Brassicaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、番木瓜科(Caricaceae)、大麻科(Cannabaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、隐甲藻科(Crypthecodiniaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、牛毛藓科(Ditrichaceae)、胡颓子科(Elaeagnaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、牻牛儿苗科(Geraniaceae)、禾本科(Gramineae)、核桃科(Juglandaceae)、樟科(Lauraceae)、豆科(Leguminosae)、亚麻科(Linaceae)、裸藻科(Euglenaceae)、草绿藻科或蔬菜植物或装饰性植物如万寿菊属(Tagetes)。

可提到的例子是选自以下的植物：Adelotheciaceae如剑叶藓属，例如展叶剑叶藓的属和种、漆树科如黄连木属(Pistacia)、芒果属(Mangifera)、腰果属(Anacardium)例如阿月混子(Pistacia vera[阿月混子实])、芒果(Mangifer indica[芒果])或腰果(Anacardiumoccidentale[腰果])的属和种、菊科如金盏花属(Calendula)、红蓝花属(Carthamus)、矢车菊属(Centaurea)、菊苣属(Cichorium)、菜蓟属(Cynara)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、Locusta、万寿菊属、缬草属(Valeriana)例如金盏花(Calendula officinalis[普通金盏花])、红花(Carthamus tinctorius[红花])、矢车菊(Centaurea cyanus[矢车菊])、菊苣(Cichorium intybus[菊苣])、洋蓟(Cynara scolymus[朝鲜蓟])、向日葵(Helianthus annus[向日葵])、莴苣(Lactuca sativa)、皱叶莴苣(Lactuca crispa)、芋(Lactuca esculenta)、毒莴苣的某些种(Lactuca scariola L.ssp.Sativa)、Lactuca scariola L.var.integrata、Lactuca scariola L.var.integrifolia、莴苣romana亚种(Lactuca sativasubsp.Romana)、Locusta communis、莴苣缬草(Valeriana locusta [沙拉蔬菜])、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、万寿菊(Tagetes erecta)或细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)[非洲或法国金盏花]的属和种、伞形科如胡萝卜属(Daucus)例如胡萝卜(Daucus carota[胡萝卜])的属和种、桦木科如榛属(Corylus)例如欧洲榛(Corylus avellana)或榛子(Coryluscolurna[榛子])的属和种、紫草科如琉璃苣属(Borago)例如琉璃苣(Borago officinalis[琉璃苣])的属和种、十字花科如芸苔属(Brassica)、亚麻荠属(Camelina)、Melanosinapis、白芥属(Sinapis)、拟南芥属(Arabadopsis)例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜青属某些种(Brassicarapa ssp.[油菜籽])、野生欧白芥(Sinapis arvensis)、芥菜(Brassicajuncea)、Brassica juncea var.juncea、皱叶芥菜(Brassica juncea var.crispifolia)、大叶芥菜(Brassica juncea var.foliosa)、黑芥(Brassicanigra)、Brassica sinapioides、亚麻荠(Camelina sativa)、芥菜(Melanosinapis communis[芥菜])、甘蓝(Brassica oleracea[饲用甜菜])或拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)的属和种、凤梨科如凤梨属(Anana)、Bromelia(菠萝)例如菠萝(Anana comosus)、Ananas ananas或Bromeliacomosa[菠萝]的属和种、番木瓜科如番木瓜属(Carica)例如番木瓜(Carica papaya[番木瓜])的属和种、大麻科如大麻属(Cannabis)例如大麻(Cannabis sativa[大麻])的属和种、旋花科如番薯属(Ipomea)、旋花属(Convolvulus)例如甘薯(Ipomoea batatus)、提琴叶牵牛花(Ipomoea pandurata)、Convolvulus batatas、Convolvulus tiliaceus、Ipomoea fastigiata、Ipomoea tiliacea、三裂叶薯(Ipomoea triloba)或Convolvulus panduratus[甜薯、番薯]的属和种、藜科如甜菜属(Betavulgaris)例如甜菜(Beta vulgaris)、Beta vulgaris var.altissima、甜菜普通变种(Beta vulgaris var.vulgaris)、Beta maritima、甜菜宿根变种Beta vulgaris var.perennis、Beta vulgaris var.Conditiva或Beta vulgarisvar.esculenta[甜菜]的属和种、隐甲藻科如隐甲藻属例如寇氏隐甲藻(Cryptecodinium cohnii)的属和种、葫芦科如南瓜属(Cucurbita)例如笋瓜(Cucurbita maxima)、灰子南瓜(Cucurbita mixta)、西葫芦(Cucurbita pepo)或南瓜(Cucurbita moschata[西葫芦/南瓜])的属和种、桥弯藻科(Cymbellaceae)如Amphora、桥弯藻属(Cymbella)、Okedenia、褐指藻属(Phaeodactylum)、仰叶藓属(Reimeria)例如三角褐指藻的属和种、牛毛藓科(Ditrichaceae)如牛毛藓属、高地藓属(Astomiopsis)、角齿藓属(Ceratodon)、Chrysoblastella、牛毛藓属(Ditrichum)、对叶藓属(Distichium)、Eccremidium、Lophidion、Philibertiella、丛毛藓属(Pleuridium)、石缝藓属(Saelania)、毛齿藓属(Trichodon)、Skottsbergia，例如以下的属和种：Ceratodonantarcticus、Ceratodon columbiae、Ceratodon heterophyllus、角齿藓(Ceratodon purpurascens)、Ceratodon purpureus、Ceratodonpurpureus ssp.convolutus、Ceratodon purpureus ssp.Stenocarpus、角齿藓圆叶变种(Ceratodon purpureus var.Rotundifolius)、Ceratodonratodon、疣蒴角齿藓(Ceratodon stenocarpus)、Chrysoblastellachilensis、Ditrichum ambiguum、Ditrichum brevisetum、皱波牛毛藓(Ditrichum crispatissimum)、卷叶牛毛藓(Ditrichum difficile)、Ditrichum falcifolium、扭叶牛毛藓(Ditrichum flexicaule)、Ditrichumgiganteum、牛毛藓(Ditrichum heteromallum)、Ditrichum lineare、Ditrichum lineare、Ditrichum montanum、Ditrichum montanum、黄牛毛藓(Ditrichum pallidum)、Ditrichum punctulatum、细叶牛毛藓(Ditrichum pusillum)、细叶牛毛藓扭叶变种(Ditrichum pusillum var.tortile、Ditrichum rhynchostegium)、Ditrichum schimperi、Ditrichumtortile、对叶藓(Distichium capillaceum)、小对叶藓(Distichiumhagenii)、斜蒴对叶藓(Distichium inclinatum)、Distichium macounii、Eccremidium  floridanum、Eccremidium  whiteleggei、Lophidionstrictus、尖叶丛毛藓(Pleuridium acuminatum)、Pleuridiumalternifolium、Pleuridium holdridgei、Pleuridium mexicanum、Pleuridium ravenelii、丛毛藓(Pleuridium subulatum)、石缝藓(Saelaniaglaucescens)、Trichodon borealis、毛齿藓(Trichodon cylindricus)或Trichodon cylindricus var.oblongus、胡颓子科如胡颓子属(Elaeagnus)例如油橄榄(Olea europaea[橄榄])的属和种、杜鹃花科如山月桂属(Kalmia)例如阔叶山月桂(Kalmia latifolia)、狭叶山月桂(Kalmiaangustifolia)、小叶山月桂(Kalmia microphylla)、沼泽山月桂(Kalmiapolifolia)、西洋山月桂(Kalmia occidentalis)、Cistus chamaerhodendros或山月桂(Kalmia lucida [山月桂])的属和种、裸藻科如囊胞藻属(Ascoglena)、变胞藻属(Astasia)、胶柄藻属(Colacium)、Cyclidiopsis、裸藻属、拟裸藻属(Euglenopsis)、Hyalaphacus、克氏藻属(Khawkinea)、鳞孔藻属(Lepocinclis)、扁裸藻属(Phacus)、陀螺藻属(Strombomonas)、囊裸藻属(Trachelomonas)例如细小裸藻的属和种；大戟科如木薯属(Manihot)、Janipha、麻风树属(Jatropha)、蓖麻属(Ricinus)例如木薯(Manihot utilissima)、Janipha manihot、Jatropha manihot、Manihot aipil、甜木薯(Manihot dulcis)、Manihotmanihot、Manihot melanobasis、木薯(Manihot esculenta[木薯])或蓖麻(Ricinus communis[蓖麻])的属和种、豆科如豌豆属(Pisum)、合欢属(Albizia)、Cathormion、Feuillea、Inga、Pithecolobium、金合欢属(Acacia)、含羞草属(Mimosa)、Medicajo、大豆属(Glycine)、扁豆属(Dolichos)、菜豆属Phaseolus、大豆属(Soybean)例如豌豆(Pisumsativum)、饲料豌豆(Pisum arvense)、Pisum humile[豌豆]、Albiziaberteriana、合欢(Albizia julibrissin)、阔荚合欢(Albizia lebbeck)、Acacia berteriana、Acacia littoralis、Albizia berteriana、Albizziaberteriana、Cathormion  berteriana、Feuillea  berteriana、Ingafragrans、Pithecellobium berterianum、Pithecellobium fragrans、Pithecolobium  berterianum、Pseudalbizzia  berteriana、Acaciajulibrissin、Acacia nemu、Albizia nemu、Feuilleea julibrissin、Mimosajulibrissin、Mimosa speciosa、Sericanrda julibrissin、阔荚金合欢(Acacia lebbeck)、Acacia macrophylla、大叶合欢(Albizia lebbeck)、Feuilleea lebbeck、大叶含羞草(Mimosa lebbeck)、Mimosa speciosa、紫苜蓿(Medicago sativa)、野苜蓿(Medicago falcata)、杂交苜蓿(Medicagovaria)[紫花苜蓿]、大豆(Glycine max)、镰扁豆(Dolichos soja)、宽叶蔓豆(Glycine gracilis)、大豆(Glycine hispida)、大菜豆(Phaseolusmax)、Soja hispida或Soja max[大豆]的属和种、葫芦藓科(Funariaceae)如Aphanorrhegma、Entosthodon、葫芦藓属(Funaria)、剑叶藓属(Physcomitrella)、立碗藓属(Physcomitrium)例如Aphanorrhegma serratum、Entosthodon attenuatus、Entosthodonbolanderi、Entosthodon  bonplandii、Entosthodon  californicus、Entosthodon drummondii、Entosthodon jamesonii、Entosthodonleibergii、Entosthodon neoscoticus、Entosthodon rubrisetus、Entosthodon spathulifolius、Entosthodon tucsoni、美国葫芦藓(Funariaamericana)、Funaria bolanderi、齿叶葫芦藓(Funaria calcarea)、加利福尼亚葫芦藓(Funaria californica)、Funaria calvescens、皱叶葫芦藓(Funaria convoluta)、Funaria flavicans、Funaria groutiana、葫芦藓(Funaria hygrometrica)、葫芦藓北极变种(Funaria hygrometrica var.Arctica)、葫芦藓暖地变种(Funaria hygrometrica var.Calvescens)、葫芦藓皱叶变种(Funaria hygrometrica var.Convoluta)、Funariahygrometrica var.muralis、Funaria hygrometrica var.utahensis、小口葫芦藓(Funaria microstoma)、Funaria microstoma var.obtusifolia、刺边葫芦藓(Funaria muhlenbergii)、Funaria orcuttii、Funariaplano-convexa、Funaria polaris、Funaria ravenelii、Funaria rubriseta、Funaria serrata、Funaria sonorae、Funaria sublimbatus、Funariatucsoni、加利福尼亚剑叶藓(Physcomitrella californica)、展叶剑叶藓、Physcomitrella readeri、Physcomitrium australe、加利福尼亚立碗藓(Physcomitrium californicum)、Physcomitrium collenchymatum、Physcomitrium coloradense、Physcomitrium cupuliferum、Physcomitrium drummondii、红蒴立碗藓(Physcomitriumeurystomum)、Physcomitrium flexifolium、Physcomitrium hookeri、Physcomitrium hookeri var.serratum、隐蒴立碗藓(Physcomitriumimmersum)、Physcomitrium  kellermanii、Physcomitriummegalocarpum、梨蒴立碗藓(Physcomitrium pyriforme)、Physcomitriumpyriforme var.serratum、Physcomitrium rufipes、Physcomitriumsandbergii、Physcomitrium subsp haericum、华盛顿立碗藓(Physcomitrium washingtoniense)的属和种、牻牛儿苗科(Geraniaceae)如天竺葵属(Pelargonium)、椰子属(Cocos)、Oleum例如椰子(Cocosnucifera)、茶麇子天竺葵(Pelargonium grossularioides)或椰子油(Oleumcocois[椰子])的属和种、禾本科如甘蔗属(Saccharum)例如甘蔗(Saccharum officinarum)的属和种、胡桃科如胡桃属(Juglans)、Wallia例如胡桃(Juglans regia)、Juglans ailanthifolia、山核桃(Juglanssieboldiana)、灰核桃(Juglans cinerea)、Wallia cinerea、Juglansbixbyi、加州黑核桃(Juglans californica)、印度黑核桃(Juglanshindsii)、Juglans intermedia、Juglans jamaicensis、大核桃(Juglansmajor)、Juglans microcarpa、黑核桃(Juglans nigra)或胡桃(Wallianigra)[胡桃]的属和种、樟科如鳄梨属(Persea)、月桂属(Laurus)例如月桂(Laurus nobilis[bay])、鳄梨(Persea americana)、鳄梨油(Perseagratissima)或Persea persea[avocado]的属和种、豆科如落花生属(Arachis)例如落花生(Arachis hypogaea[花生])的属和种、亚麻科如Adenolinum属例如亚麻(Linum usitatissimum)、Linum humile、奥地利亚麻(Linum austriacum)、Linum bienne、窄叶亚麻(Linumangustifolium)、泻亚麻(Linum catharticum)、金黄亚麻(Linumflavum)、大花亚麻(Linum grandiflorum)、Adenolinum grandiflorum、刘易斯亚麻(Linum lewisii)、那旁亚麻(Linum narbonense)、宿根亚麻(Linum perenne)、宿根亚麻刘易斯变种(Linum perenne var.lewisii)、Linum pratense或亚麻子(Linum trigynum[亚麻子])的属和种、Lythrarieae如石榴属(Punica)例如石榴(Punica granatum[pomegranate])的属和种、锦葵科(Malvaceae)如棉属(Gossypium)例如陆地棉(Gossypium hirsutum)、树棉(Gossypium arboreum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)或瑟伯棉(Gossypium thurberi[棉])的属和种、地钱科(Marchantiaceae)如地钱属(Marchantia)例如Marchantia berteroana、Marchantia foliacea、大孢地钱(Marchantia macropora)的属和种、芭蕉科(Musaceae)如芭蕉属(Musa)例如香蕉(Musa nana)、小果野蕉(Musa acuminata)、大蕉(Musa paradisiaca)、芭蕉属的某些种(Musa spp.[banana])的属和种、柳叶菜科(Onagraeeae)如Camissonia属、月见草属(Oenothera)例如月见草(Oenothera biennis)或夜来香(Camissonia brevipes[月见草])的属和种、棕榈科(Palmae)如油棕属(Elaeis)，例如以下的属和种：油棕(Elaeis guineensis[油棕榈])、罂粟科(Papaveraceae)如罂粟属(Papaver)，例如以下的属和种：东方罂粟(Papaver orientale)、虞美人(Papaver rhoeas)、长荚罂粟(Papaver dubium[罂粟])、胡麻科(Pedaliaceae)如胡麻属(Sesamum)例如胡麻(Sesamum indicum[sesame])的属和种、胡椒科(Piperaceae)如胡椒属(Piper)、Artanthe、草胡椒属(Peperomia)、Steffensia例如树胡椒(Piper aduncum)、Piperamalago、狭叶胡椒(Piper angustifolium)、大胡椒(Piper auritum)、萎叶(Piper betel)、荜澄茄(Piper cubeba)、荜菝(Piper longum)、胡椒(Piper nigrum)、假荜拔(Piper retrofractum)、Artanthe adunca、Artanthe elongata、长胡椒(Peperomia elongata)、Piper elongatum、Steffensia elongata[cayenne pepper]的属和种、禾本科(Poaceae)如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、高梁属(Sorghum)、须芒草属(Andropogon)、绒毛草属(Holcus)、黍属(Panicum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea(maize))、小麦属(Triticum)例如大麦(Hordeum vulgare)、芒颖大麦草(Hordeum jubatum)、鼠大麦草(Hordeum murinum)、短芒大麦草(Hordeum secalinum)、栽培二棱大麦(Hordeum distichon)、Hordeum aegiceras、六列大麦(Hordeumhexastichon)、六棱大麦(Hordeum hexastichum)、不规则大麦(Hordeumirregulare)、大麦(Hordeum sativum)、短芒大麦草(Hordeumsecalinum)[大麦]、黑麦(Secale cereale[黑麦])、燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、地中海红燕麦(Avena byzantina)、Avena fatuavar.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida[燕麦])、二色高梁(Sorghumbicolor)、石茅高梁(Sorghum halepense)、甜高梁(Sorghumsaccharatum)、高梁(Sorghum vulgare)、Andropogon drummondii、二色绒毛草(Holcus bicolor)、Holcus sorghum、Sorghum aethiopicum、Sorghum arundinaceum、Sorghum caffrorum、垂穗高梁草(Sorghumcernuum)、工艺高梁(Sorghum dochna)、Sorghum drummondii、硬高粱草(Sorghum durra)、Sorghum guineense、Sorghum lanceolatum、多脉高梁草(Sorghum nervosum)、甜高梁(Sorghum saccharatum)、Sorghum subglabrescens、垂叶高梁草(Sorghum verticilliflorum)、高梁(Sorghum vulgare)、石茅高梁(Holcus halepensis)、Sorghummiliaceum、黍粟(Panicum militaceum[millet])、稻(Oryza sativa)、Oryza latifolia[稻]、玉米(Zea mays[maize])、小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticumhybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum或Triticum vulgare)[小麦]、紫球藻科(Porphyridiaceae)如Chroothece属、Flintiella属、Petrovanella属、紫球藻属(Porphyridium)、Rhodella、Rhodosorus、Vanhoeffenia例如紫球藻(Porphyridiumcruentum)的属和种、山龙眼科(Proteaceae)如澳洲坚果属(Macadamia)例如全缘叶澳洲坚果(Macadamia intergrifolia[macadamia])的属和种、草绿藻科如肾藻属(Nephroselmis)、Prasinococcus、Scherffelia、扁藻属(Tetraselmis)、Mantoniella、Ostreococcus例如绿肾藻(Nephroselmisolivacea)、Prasinococcus capsulatus、Scherffelia dubia、周氏扁藻(Tetraselmis chui)、四鞭毛藻(Tetraselmis suecica)、Mantoniellasquamata、Ostreococcus tauri属和种、茜草科(Rubiaceae)如咖啡属(Coffea)例如咖啡属(Coffea)某些种、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffea canephora)或大果咖啡(Coffea liberica[coffee])、玄参科(Scrophulariaceae)如毛蕊花属(Verbascum)例如以下的属和种：毛瓣毛蕊花(Verbascum blattaria)、东方毛蕊花(Verbascum chaixii)、密叶毛蕊花(Verbascum densiflorum)、Verbascum lagurus、长叶毛蕊花(Verbascum longifolium)、Verbascum lychnitis、Verbascum nigrum、奥林匹克毛蕊花(Verbascum olympicum)、Verbascum phlomoides、紫毛蕊花(Verbascum phoenicum)、Verbascum pulverulentum或毛蕊花(Verbascum thapsus[毛蕊花])、茄科(Solanaceae)如辣椒属(Capsicum)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)例如以下的属和种：辣椒(Capsicum annuum)、Capsicumannuum var.glabriusculum、五色椒(Capsicum frutescens[pepper])、红椒(Capsicum annuum[paprika])、烟草(Nicotiana tabacum)、花烟草(Nicotiana alata)、长头烟草(Nicotiana attenuata)、光烟草(Nicotianaglauca)、Nicotiana langsdorffii、Nicotiana obtusifolia、Nicotianaquadrivalvis、Nicotiana repanda、黄花烟草(Nicotiana rustica)、Nicotiana sylvestris[烟草]、马铃薯(Solanum tuberosum[番茄])、茄(Solanum melongena[eggplant])、番茄(Lycopersicon esculentum)、Lycopersicon lycopersicum、梨形番茄(Lycopersicon pyriforme)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanum lycopersicum)[番茄]、梧桐科(Sterculiaceae)如可可树属(Theobroma)例如可可树(Theobroma cacao[可可])的属和种或山茶科(Theaceae)如山茶属(Camellia)例如大叶茶(Camellia sinensis[茶])的属和种。

有利的微生物例如选自毛壳菌科(Chaetomiaceae)、笄霉科(Choanephoraceae)、隐球酵母科(Cryptococcaceae)、小克银汉霉科(Cunninghamellaceae)、暗梗胞科(Demetiaceae)、从梗胞科(Moniliaceae)、被孢霉科、毛霉科(Mucoraceae)、腐霉科(Pythiaceae)、酵母菌科(Saccharomycetaceae)、水霉科(Saprolegniaceae)、裂殖酵母科(Schizosacharomycetaceae)、粪壳科(Sodariaceae)或瘤座孢科(Tuberculariaceae)科的真菌。

可提到的微生物的例子为选自如下的微生物组：笄霉科如布拉霉属(Blakeslea)、笄霉属(Choanephora)例如三孢布拉霉(Blakesleatrispora)、瓜笄霉(Choanephora cucurbitarum)、漏斗笄霉瓜变种(Choanephora infundibulifera var.Cucurbitarum)的属和种、被孢霉科如被孢霉属例如深黄被孢霉(Mortierella isabellina)、多头被孢霉(Mortierella polycephala)、拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)、葡酒色被孢霉(Mortierella vinacea)、环带被孢霉(Mortierella zonata)的属和种、腐霉科如腐霉属(Phytium)、疫霉属(Phytophthora)例如德巴利腐霉(Pythium debaryanum)、间型腐霉(Pythium intermedium)、畸雌腐霉(Pythium irregulare)、大雄腐霉(Pythium megalacanthum)、侧雄腐霉(Pythium paroecandrum)、Pythium sylvaticum、终极腐霉(Pythium ultimum)、恶疫霉(Phytophthora cactorum)、樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)、柑桔生疫霉(Phytophthora citricola)、柑桔褐腐疫霉(Phytophthora citrophthora)、隐地疫霉(Phytophthoracryptogea)、德雷疫霉(Phytophthora drechsleri)、红瘤疫霉(Phytophthora erythroseptica)、侧生疫霉(Phytophthora lateralis)、大雄疫霉(Phytophthora megasperma)、烟草疫霉(Phytophthoranicotianae)、烟草疫霉寄生变种(Phytophthora nicotianae var.parasitica)、棕榈疫霉(Phytophthora palmivora)、寄生疫霉(Phytophthora parasitica)、丁香疫霉(Phytophthora syringae)的属和种、酵母菌科如汉逊属(Hansenula)、毕赤属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、类酵母属(Saccharomycodes)、亚罗酵母属(Yarrowia)例如异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、加利福尼亚汉逊酵母(Hansenula californica)、加拿大汉逊酵母(Hansenula canadensis)、碎囊汉逊酵母(Hansenula capsulata)、西弗汉逊酵母(Hansenulaciferrii)、葡糖酶汉逊酵母(Hansenula glucozyma)、亨利汉逊酵母(Hansenula henricii)、Hansenula holstii、小汉逊酵母(Hansenulaminuta)、不发酵汉逊酵母(Hansenula nonfermentans)、Hansenulaphilodendri、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、土星汉逊酵母(Hansenula saturnus)、亚膜汉逊酵母(Hansenula subpelliculosa)、魏氏汉逊酵母(Hansenula wickerhamii)、温奇汉逊酵母(Hansenulawingei)、嗜酒毕赤酵母(Pichia alcoholophila)、Pichia angusta、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、二孢毕赤酵母(Pichia bispora)、伯顿毕赤酵母(Pichia burtonii)、加拿大毕赤酵母(Pichia canadensis)、荚膜毕赤酵母(Pichia capsulata)、卡氏毕赤酵母(Pichia carsonii)、聚纤维二糖毕赤酵母(Pichia cellobiosa)、西弗毕赤酵母(Pichia ciferrii)、粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)、发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、葡糖酶毕赤酵母(Pichia glucozyma)、季氏毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、甲虫毕赤酵母(Pichiahaplophila)、Pichia henricii、Pichia holstii、Pichia jadinii、Pichialindnerii、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、微小毕赤酵母微小变种(Pichia minuta var.minuta)、微小毕赤酵母不发酵变种(Pichia minuta var.nonfermentans)、挪威毕赤酵母(Pichia norvegensis)、奥默毕赤酵母(Pichia ohmer)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、Pichiaphilodendri、Pichia pini、多形毕赤酵母(Pichia polymorpha)、栎毕赤酵母(Pichia quercuum)、罗丹毕赤酵母(Pichia rhodanensis)、Pichiasargentensis、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、斯地毕赤酶母(Pichiastrasburgensis)、亚膜毕赤酵母(Pichia subpelliculosa)、帽孢毕赤酵母(Pichia toletana)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichiavini、木糖毕赤酵母(Pichia xylosa)、酸酒酵母(Saccharomyces aceti)、拜耳酵母(Saccharomyces bailii)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、二孢酵母(Saccharomyces bisporus)、好望角酵母(Saccharomycescapensis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、椭圆酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaevar.ellipsoideus)、薛瓦酵母(Saccharomyces chevalieri)、德布尔酵母(Saccharomyces delbrueckii)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces drosophilarum、雅致酵母(Saccharomyces elegans)、椭圆酵母(Saccharomyces ellipsoideus)、发酵性酵母(Saccharomycesfermentati)、Saccharomyces florentinus、脆壁酵母(Saccharomycesfragilis)、异质酵母(Saccharomyces heterogenicus)、橄榄油酵母(Saccharomyces hienipiensis)、荷兰啤酒酵母(Saccharomycesinusitatus)、意大利酵母(Saccharomyces italicus)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、克鲁斯酵母(Saccharomyces krusei)、乳酸酵母(Saccharomyces lactis)、马克斯酵母(Saccharomycesmarxianus)、小椭圆酵母(Saccharomyces microellipsoides)、山地酵母(Saccharomyces montanus)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、橄榄酵母(Saccharomyces oleaceus)、奇异酵母(Saccharomycesparadoxus)、Saccharomyces pastorianus、普地酵母(Saccharomycespretoriensis)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、鲁氏酵母(Saccharomyces rouxii)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、路德类酵母(Saccharomycodes ludwigii)、解脂亚罗酵母(Yarrowialipolytica)、裂殖酵母科(Schizosacharomycetaceae)如裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)例如日本裂殖酵母日本变种(Schizosaccharomyces japonicus var.japonicus)、日本裂殖酵母多变变种(Schizosaccharomyces japonicus var.versatilis)、解苹果酸裂殖酵母(Schizosaccharomyces malidevorans)、八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)、粟酒裂殖酵母解苹果酸变种(Schizosaccharomyces pombe var.malidevorans)、粟酒裂殖酵母粟酒变种(Schizosaccharomyces pombe var.pombe)、破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)如Althornia、Aplanochytrium、Japonochytrium、裂殖壶菌(Schizochytrium)、破囊壶菌属(破囊壶菌)例如聚集裂殖壶菌(Schizochytrium aggregatum)，Schizochytriumlimacinum，红树林裂殖壶菌(Schizochytrium mangrovei)，小裂殖壶菌(Schizochytrium minutum)，八孢裂殖壶菌(Schizochytriumoctosporum)，聚集破囊壶菌(Thraustochytrium aggregatum)，Thraustochytrium amoeboideum，南极破囊壶菌(Thraustochytriumantacticum)，Thraustochytrium arudimentale，鲜黄破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)，Thraustochytrium benthicola，球形破囊壶菌(Thraustochytrium globosum  )，Thraustochytrium  indicum，Thraustochytrium kerguelense，Thraustochytrium kinnei，运动破囊壶菌(Thraustochytrium motivum)，多初级破囊壶菌(Thraustochytriummultirudimentale)，厚皮破囊壶菌(Thraustochytrium pachydermum)，增殖破囊壶菌(Thraustochytrium proliferum)，粉红破囊壶菌(Thraustochytrium roseum)，罗氏破囊壶菌(Thraustochytrium rossii)，Thraustochytrium striatum或Thraustochytrium visurgense的属和种.

更有利的微生物是例如选自芽孢杆菌科(Bacillaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriacae)或根瘤菌科(Rhizobiaceae)的细菌。可能提到的例子为选自如下的微生物：芽孢杆菌科如芽孢杆菌属例如酸热芽孢杆菌(bacillus acidocaldarius)、酸土环脂芽孢杆菌(bacillusacidoterrestris)、嗜碱芽孢杆菌(bacillus alcalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliq uefaciens)、溶淀粉芽孢杆菌(bacillus amylolyticus)、短芽孢杆菌(bacillus brevis)、蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)、环状芽孢杆菌(bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)、球形芽孢杆菌梭形亚种(bacillus sphaericus subsp.fusiformis)、嗜乳糖芽孢杆菌(bacillus galactophilus)、园孢芽孢杆菌(bacillus globisporus)、园孢芽孢杆菌海生亚种(bacillus globisporus subsp.marinus)、嗜盐芽孢杆菌(bacillus halophilus)、缓病芽孢杆菌(bacillus lentimorbus)、迟缓芽孢杆菌(bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)、多粘芽孢杆菌(bacillus polymyxa)、冷解糖芽孢杆菌(bacillus psychrosaccharolyticus)、短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)、球形芽孢杆菌(bacillus sphaericus)、枯草芽孢杆菌斯氏亚种(bacillus subtilis subsp.spizizenii)、枯草芽孢杆菌枯草亚种(bacillussubtilis subsp.subtilis)或苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)的属和种；肠杆菌科例如柠檬酸细菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)或沙雷氏菌属(Serratia)例如无丙二酸柠檬酸菌(Citrobacter amalonaticus)、异型柠檬酸菌(Citrobacter diversus)、弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)、Citrobacter genomospecies、Citrobacter gillenii、中间型柠檬酸菌(Citrobacter intermedium)、柯氏柠檬酸菌(Citrobacter koseri)、Citrobacter murliniae、柠檬酸菌种(Citrobacter sp.)、保科爱德华菌(Edwardsiella hoshinae)、Edwardsiellaictaluri、迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)、Erwinia alni、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、Erwinia ananatis、Erwinia aphidicola、Erwinia billingiae、灭仙人掌欧文氏菌(Erwinia cacticida)、生癌欧文氏菌(Erwinia cancerogena)、大仙人掌欧文氏菌(Erwinia carnegieana)、胡萝卜软腐欧文氏菌黑腐亚种(Erwinia carotovora subsp.atroseptica)、胡萝卜软腐欧文氏菌亚种(Erwinia carotovora subsp.betavasculorum)、胡萝卜软腐欧文氏菌气味亚种(Erwinia carotovora subsp.odorifera)、胡萝卜软腐欧文氏菌wasabiae亚种(Erwinia carotovora subsp.wasabiae)、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、杓兰欧文氏菌(Erwinia cypripedii)、融解欧文氏菌(Erwinia dissolvens)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、野梧桐欧文氏菌(Erwinia mallotivora)、鸡血藤欧文氏菌(Erwiniamilletiae)、流黑欧文氏菌(Erwinia nigrifluens)、超压欧文氏菌(Erwinianimipressuralis)、粉红欧文氏菌(Erwinia persicina)、Erwinia psidii、Erwinia pyrifoliae、栎欧文氏菌(Erwinia quercina)、大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)、生红欧文氏菌(Erwinia rubrifaciens)、柳欧文氏菌(Erwinia salicis)、斯氏欧文氏菌(Erwinia stewartii)、嗜管欧文氏菌(Erwinia tracheiphila)、噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)、非脱羧埃希氏菌(Escherichia adecarboxylata)、Escherichia anindolica、金色埃希氏菌(Escherichia aurescens)、螳螂埃希氏菌(Escherichiablattae)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、大肠埃希氏菌共生变种(Escherichia coli var.Communior)、大肠可变埃希氏菌(Escherichiacoli-mutabile)、福氏埃希氏菌(Escherichia fergusonii)、黑氏埃希氏菌(Escherichia hermannii)、埃希氏菌种(Escherichia sp.)、伤口埃希氏菌(Escherichia vulneris)、产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)、贾氏克雷伯氏菌亚特兰大亚种(Klebsiella edwardsii subsp.Atlantae)、解鸟氨酸克雷伯氏菌(Klebsiella ornithinolytica)、催产克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、植物克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种(Klebsiellapneumoniae subsp.pneumoniae)、克雷伯氏菌种(Klebsiella sp.)、土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)、特氏克雷伯氏菌(Klebsiella trevisanii)、奥博尼沙门氏菌(Salmonella abony)、亚利桑那沙门氏菌(Salmonellaarizonae)、邦戈尔沙门氏菌(Salmonella bongori)、猪霍乱沙门氏菌亚利桑那亚种(Salmonella choleraesuis subsp.arizonae)、猪霍乱沙门氏菌邦戈尔亚种(Salmonella choleraesuis subsp.bongori)、猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种(Salmonella choleraesuis subsp.cholereasuis)、猪霍乱沙门氏菌双亚利桑那亚种(Salmonella choleraesuis subsp.diarizonae)、猪霍乱沙门氏菌豪斯顿亚种(Salmonella choleraesuis subsp.houtenae)、猪霍乱沙门氏菌英迪加亚种(Salmonella choleraesuis subsp.indica)、猪霍乱沙门氏菌萨拉姆亚种(Salmonella choleraesuis subsp.salamae)、达累斯萨拉姆沙门氏菌(Salmonella daressalaam)、肠道沙门氏菌豪斯顿亚种(Salmonella enterica subsp.houtenae)、肠道沙门氏菌萨拉姆亚种(Salmonella enterica subsp.salamae)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、鸡沙门氏菌(Salmonella gallinarum)、海德堡沙门氏菌(Salmonella heidelberg)、巴拿马沙门氏菌(Salmonella panama)、森夫顿堡沙门氏菌(Salmonella senftenberg)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、嗜虫沙雷菌(Serratia entomophila)、无花果沙雷菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷菌(Serratia fonticola)、格式沙雷菌(Serratiagrimesii)、液化沙雷菌(Serratia liquefaciens)、粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)、粘质沙雷菌粘质亚种(Serratia marcescens subsp.marcescens)、海红氏沙雷菌(Serratia marinorubra)、气味沙雷菌(Serratiaodorifera)、普利茅斯沙雷菌(Serratia plymouthensis)、普城沙雷菌(Serratia plymuthica)、变形斑沙雷菌(Serratia proteamaculans)、变形斑沙雷菌解奎宁亚种(Serratia proteamaculans subsp.quinovora)、解奎宁沙雷菌(Serratia quinivorans)或悬钩子沙雷菌(Serratia rubidaea)的属和种；根瘤菌科(Rhizobiaceae)例如农杆菌属(Agrobacterium)、嗜碳杆菌属(Carbophilus)、Chelatobacter、剑菌属(Ensifer)、根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)例如亚特兰农杆菌属(Agrobacterium atlanticum)、Agrobacterium ferrugineum、解明胶农杆菌属(Agrobacterium gelatinovorum)、Agrobacterium larrymoorei、Agrobacterium meteori、放射形农杆菌属(Agrobacterium radiobacter)、发根农杆菌属(Agrobacterium rhizogenes)、悬钩子农杆菌(Agrobacteriumrubi)、星斑农杆菌(Agrobacterium stellulatum)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、Agrobacterium vitis、Carbophiluscarboxidus、Chelatobacter heintzii、剑菌(Ensifer adhaerens)、Ensiferarboris、费氏剑菌属(Ensifer fredii)、Ensifer kostiensis、鸡眼草剑菌属(Ensifer kummerowiae)、Ensifer medicae、苜蓿剑菌属(Ensifer meliloti)、萨赫尔剑菌属(Ensifer saheli)、Ensifer terangae、新疆剑菌属(Ensiferxinjiangensis)、鹰嘴豆根瘤菌(Rhizobium ciceri)、埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)、费氏根瘤菌(Rhizobium fredii)、山羊豆根瘤菌(Rhizobium galegae)、Rhizobium gallicum、Rhizobium giardinii、海南根瘤菌(Rhizobium hainanense)、华癸根瘤菌(Rhizobium huakuii)、胡特根瘤菌(Rhizobium huautlense)、木兰根瘤菌(Rhizobiumindigoferae)、日本根瘤菌属(Rhizobium japonicum)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、黄土根瘤菌(Rhizobium loessense)、百脉根根瘤菌(Rhizobium loti)、羽扇豆根瘤菌(Rhizobium lupini)、地中海根瘤菌属(Rhizobium mediterraneum)、苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)、蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、菜豆根瘤菌(Rhizobiumphaseoli)、放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter)、发根根瘤菌(Rhizobium rhizogenes)、Rhizobium rubi、Rhizobium sullae、天山根瘤菌(Rhizobium tianshanense)、三叶草根瘤菌(Rhizobium trifolii)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、Rhizobium undicola、Rhizobium vitis、粘附中华根瘤菌(Sinorhizobium adhaerens)、Sinorhizobium arboris、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、Sinorhizobium kostiense、鸡眼草中华根瘤菌(Sinorhizobium kummerowiae)、Sinorhizobium medicae、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、莫雷兰中华根瘤菌(Sinorhizobium morelense)、萨赫尔中华根瘤菌(Sinorhizobium saheli)或新疆中华根瘤菌(Sinorhizobium xinjiangense)的微生物。

用于本发明方法的有利微生物的其它例子是原生动物或硅藻，选自：甲藻科(Dinophyceae)、Turaniellidae或Oxytrichidae科，如寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)如三角褐指藻、贻贝棘尾虫(Stylonychiaamytilus)、鬃棘尾虫(Stylonychia pustulata)、Stylonychiaputrina、背状棘尾虫(Stylonychia notophora)、棘尾虫种(Stylonychia sp.)、弯豆形虫(Colpidium campylum)或豆形虫种(Colpidium sp.)的属和种的。

那些有利地在本发明方法中应用的生物是转基因生物如真菌类如被孢霉属或破囊壶菌属、酵母属如酵母或裂殖酵母、藓类如剑叶藓属或角齿藓属、非人动物如隐杆线虫(Caenorhabditis)、藻类如肾藻属、Pseudoscourfielda、Prasinococcus、Scherffelia、扁藻属、Mantoniella、Ostreococcus、隐甲藻属或褐指藻属或植物类如双子叶植物或单子叶植物。尤其有利地在本发明方法中应用的生物属于产油的生物，也即用于产生油的生物、如真菌例如被孢霉属或破囊壶菌属、藻类例如肾藻属、Pseudoscourfielda、Prasinococcus、Scherffelia、扁藻属、Mantoniella、Ostreococcus、隐甲藻属、褐指藻属或者植物，尤其优选包含大量脂类化合物的油籽或油料作物植物，如花生、油菜籽、芸苔、向日葵、红花(Carthamus tinctoria)、罂粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄榄、芝麻、金盏花、石榴、月见草、毛蕊花、大蓟、野玫瑰、榛子、杏仁、澳洲坚果、鳄梨、月桂、西葫芦/南瓜、亚麻籽、大豆、阿月混子、琉璃苣、树(油棕榈树、椰子树或胡桃树)或可耕种的作物例如玉米、小麦、黑麦、燕麦、小黑麦、稻、大麦、棉、木薯、胡椒、万寿菊、茄科植物例如马铃薯、烟草、茄子和番茄、蚕豆属的种、豌豆、紫花苜蓿或灌木(咖啡、可可、茶)、柳属的种和宿生牧草及饲料作物。优选的植物根据本发明是油料作物植物如花生、油菜籽、芸苔、向日葵、红花、罂粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄榄、金盏花、石榴、月见草、西葫芦/南瓜、亚麻子、大豆、琉璃苣、树(油棕榈树、可可树)。尤其优选的植物是含有高C18:2和/或C18:3脂肪酸的植物，如向日葵、红花、烟草、毛蕊花、芝麻、棉、西葫芦/南瓜、罂粟、月见草、胡桃、亚麻子、大麻或大蓟。非常尤其优选的植物是例如红花、向日葵、罂粟、月见草、胡桃、亚麻子或大麻。

因此对于本发明的上述方法而言，除了在方法步骤(a)至(d)中所导入的核酸以及任选地所导入的编码ω3去饱和酶的核酸序列以外，额外地向生物中导入其它编码脂肪酸或脂类代谢的酶的核酸是有利的。

脂肪酸或脂类代谢中的所有基因原则上均可在产生多不饱和脂肪酸的方法中使用，有利地与Δ5延伸酶，Δ6延伸酶和/或ω3去饱和酶组合使用[为了本发明目的，将复数形式理解为包含单数，并且反之亦然]。选自酰基辅酶A脱氢酶、酰基ACP [酰基载体蛋白]去饱和酶、酰基ACP硫酯酶、脂肪酸酰基转移酶、酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶、脂肪酸合成酶、脂肪酸羟化酶、乙酰基-辅酶A羧化酶、酰辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸炔属酶(acetylenase)、脂加氧酶、三酰甘油酯脂肪酶、环丙烯合成酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶的脂肪酸和脂类代谢中的基因有利地与Δ5延伸酶、Δ6延伸酶和/或ω3去饱和酶组合使用。选自Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ6延伸酶或Δ9延伸酶的基因尤其优选地与上述Δ5延伸酶、Δ6延伸酶和/或ω3去饱和酶的基因组合使用，可与单种基因或多种基因组合使用。

与人类延伸酶或来自非人类动物的延伸酶如那些来自大马哈鱼属(Oncorhynchus)、爪蟾(Xenopus)或海鞘(Ciona)的延伸酶比较，本发明的Δ5延伸酶具备有利特性，即它们不使C22脂肪酸延伸为相应的C24脂肪酸。而且它们有利地不转化具有Δ6位置双键的脂肪酸，而上述脂肪酸则由人类延伸酶或来自非人类动物的延伸酶所转化。尤其有利的Δ5延伸酶优选地只转化不饱和C20脂肪酸。这些有利的Δ5延伸酶具有数个推定的跨膜螺旋(5-7个)。有利地，所述Δ5延伸酶仅转化在Δ5位置上具有一个双键的C20脂肪酸，其中优选转化ω3-C20脂肪酸(EPA)。在本发明的一个优选实施方案中，上述Δ5延伸酶具有如此特性即除了Δ5延伸酶活性外，这类酶还有利地没有或仅有较小的Δ6延伸酶活性。相反，人类的延伸酶或来自非人类动物的延伸酶对具有Δ6或Δ5双键的脂肪酸表现了大致相同的活性。将这类有利的延伸酶称作公知的单功能延伸酶。相反，将人类的延伸酶或来自非人类动物的延伸酶称作多功能延伸酶，所述多功能延伸酶除了以上提到的底物之外，还可使例如具有Δ9或Δ11双键的单不饱和C16和C18脂肪酸转化。在酵母喂饲实验中，其中已向酵母中喂饲EPA作为底物，单功能延伸酶有利地使所喂饲的EPA至少15％重量，有利地至少20％重量，尤其有利地至少25％重量转化为二十二碳五烯酸(DPA，C22:5Δ7，10，13，16，19)。若喂饲作为底物的γ-亚麻酸(GLA，C18:3Δ6，9，12)，γ-亚麻酸有利地根本未得到延伸。同样C18:3Δ5，9，12也未得到延伸。在另一个有利的实施方案中，单功能延伸酶将所喂饲GLA以小于60％重量、有利地小于55％重量、尤其优选地小于50％重量，尤其有利地小于45％重量、非常尤其有利地小于40％重量转化为二高γ亚麻酸(C20:3Δ8，11，14)。根据本发明在又一个非常尤其优选的Δ5延伸酶活性实施方案中，GLA未得到转化。

图27和28显示了不同延伸酶经测定的底物特异性、图27显示了非洲爪蛙(Xenopus laevis)(图27A)、玻璃海鞘(Ciona intestinalis)(图27B)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)(图27C)的多功能延伸酶的特异性。所有这些延伸酶均转化了广泛类型的底物。在本发明的方法中，这可能产生了必须由其它酶活性来转化的副产物。这就是为什么这些酶在本发明的方法中较次优选的原因。优选的单功能延伸酶和它们的底物特异性在图28中显示。图28A显示了Ostreococcus tauriΔ5延伸酶特异性。这种酶仅转化在Δ5位置上具有双键的脂肪酸。有利地仅使C20-脂肪酸转化。假矮海链藻Δ5延伸酶显示了相似的高底物特异性(图28C)。OstreococcustauriΔ6延伸酶(图28B)和假矮海链藻Δ6延伸酶(图28D)均有利地仅转化在Δ6位置上具有双键的脂肪酸。有利地仅使C18脂肪酸转化。来自拟南芥菜和细小裸藻的Δ5延伸酶也根据它们的特异性进行了区分。

本发明有利的Δ6延伸酶，也即优选地延伸C18脂肪酸的延伸酶同样根据高特异性进行区分。这类Δ6延伸酶有利地转化在Δ6-位置上具有双键的脂肪酸。尤其有利的Δ6延伸酶有利地转化在分子中具有三个或四个双键的C18脂肪酸，其中所述的脂肪酸必须在Δ6位置上包含一个双键。在本发明的优选实施方案中，这些Δ6延伸酶还具有如下特征：即除了Δ6延伸酶活性外，这些Δ6延伸酶还有利地没有或仅有相对较小的Δ5延伸酶活性。相反，人类的延伸酶或来自非人类动物的延伸酶对具有Δ6或Δ5双键的脂肪酸表现了大致相同的活性。将所述有利的延伸酶称作公知的单功能延伸酶。相反，如以上描述，将人类延伸酶或来自非人类动物的延伸酶称作多功能延伸酶，其中这类酶除了以上提到的底物以外，还可使具有例如Δ9或Δ11双键的单不饱和的C16和C18脂肪酸转化。在酵母喂饲实验中，其中已经向酵母中喂饲EPA作为底物，所述单功能延伸酶有利地转化了所喂饲的α-亚麻酸(ALA，C18:3Δ9，12，15)至少10％重量或转化了所喂饲的γ-亚麻酸(GLA，C18:3Δ6，9，12)至少40％重量，有利地至少20％重量或50％重量，尤其有利地至少25％重量或60％重量。C18:4Δ6，9，12，15(硬脂艾杜糖酸)也尤其有利地得到延伸。在本文中，SDA至少40％重量，有利地至少50％重量，尤其有利地至少60％重量、非常尤其有利地至少70％重量得到转化。尤其有利的Δ6延伸酶对如下底物：C18:1Δ6、C18:1Δ9、C18:1Δ11、C20:2Δ11，14、C20:3Δ11，14，17、C20:3Δ8，11，14、C20:4Δ5，8，11，14、C20:5Δ5，8，11，14，17或C22.4Δ7，10，13，16表现出没有活性或仅表现出极小的活性(转化率小于0.1％重量)

图29和30及表18列出了多种延伸酶经测量的底物特异性。

与已知的ω3去饱和酶相反，本发明的ω3去饱和酶具有有利的特征即它能够使广泛类型的ω6脂肪酸去饱和；可优选地使C20和C22脂肪酸如C20:2、C20:3、C20:4、C22:4或C22:5脂肪酸去饱和。然而也能有利地使更短的C18脂肪酸如C18:2或C18:3脂肪酸去饱和。根据ω3去饱和酶的这些特点，将在生物中有利地将在植物或真菌中的脂肪酸类型由ω6脂肪酸转化至ω3脂肪酸有利地成为可能。本发明的ω3去饱和酶优选地使C20脂肪酸去饱和。这些来自当前脂肪酸库中的脂肪酸至少10％、15％、20％、25％或30％于生物内转化为对应的ω3脂肪酸。ω3去饱和酶对C18-脂肪酸的活性小10倍，即仅仅约1.5至3％的存在于脂肪酸库中的C18-脂肪酸转化为相应的ω3脂肪酸。本发明ω3去饱和酶的优选底物是结合于磷脂中的ω6脂肪酸。以去饱和二高γ-亚麻酸[C20:4Δ8，11，14]为参考，图19清晰显示在去饱和期间，ω3去饱和酶有利地不区别在sn1位置结合或在sn2位置结合的脂肪酸。在磷脂sn1位置结合的脂肪酸和sn2位置结合的脂肪酸均得以去饱和。而且ω3去饱和酶对广泛类型的磷脂如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰肌醇(PIS)或磷脂酰乙醇胺(PE)的转化是有利的。最后，去饱和产物也可在中性脂类(NL)中，也即在甘油三酯中找到。

与已知的Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶和Δ6去饱和酶比较，本发明的Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶和Δ6去饱和酶的优点是它们能够转化结合至磷脂或辅酶A脂肪酸酯的脂肪酸，有利地转化结合至辅酶A脂肪酸酯的脂肪酸。

本发明方法中所用的Δ12去饱和酶有利地将油酸(C18:1Δ9)转化为亚油酸(C18:2Δ9，12)或有利地将C18:2Δ6，9转化为C18:3Δ6，9，12(GLA)。所用Δ12去饱和酶有利地转化结合至磷脂或辅酶A脂肪酸酯的脂肪酸，有利地转化结合至辅酶A脂肪酸酯的那些脂肪酸。

由于本发明方法中所用的核酸的酶活性。其中所述核酸编码具有Δ5延伸酶、Δ6延伸酶和/或ω3去饱和酶活性的多肽，有利地与编码脂肪酸或脂类代谢的多肽如具有Δ4、Δ5、Δ6、Δ8、Δ12去饱和酶或者Δ5、Δ6或Δ9延伸酶活性的其它多肽的核酸序列联合使用，种类广泛的多不饱和脂肪酸可在本发明的方法中产生。根据所选择的生物如本发明方法中所用的有利的植物，多种的多不饱和脂肪酸混合物或单种的多不饱和脂肪酸如EPA或ARA可以以游离或结合形式产生。根据起始植物中优势的脂肪酸组成(C18:2或C18:3脂肪酸)，由C18:2脂肪酸衍生的脂肪酸如GLA、DGLA或ARA；或由C18:3脂肪酸衍生的脂肪酸如SDA、ETA或EPA因此获得。若仅仅亚油酸(LA，C18:2Δ9，12)作为不饱和脂肪酸在方法所用的植物中出现，方法仅能提供作为产物的GLA、DGLA和ARA，所有产物均能以游离的脂肪酸或以结合的形式出现。若仅仅α-亚麻酸(ALA，C18:3Δ9，12，15)作为不饱和脂肪酸在方法所用的植物中如在亚麻籽中存在，方法仅能提供作为产物的SDA、ETA或EPA和/或DHA，如上所述的所有产物均能以游离脂肪酸或以结合形式存在。由于对Δ5延伸酶酶活性的修饰，其有利地与在合成中起作用的Δ4、Δ5、Δ6、Δ12去饱和酶和/或Δ6延伸酶、或Δ4、Δ5、Δ8、Δ12去饱和酶和/或Δ9延伸酶联合使用，可以在以上提及的生物，有利地在以上提及的植物中以定向的方式只产生单个的产物。由于Δ6去饱和酶和Δ6延伸酶的活性，依据起始的植物和不饱和脂肪酸，形成了例如GLA和DGLA或SDA和ETA。DGLA或ETA或这些脂肪酸的混合物优选地形成。若向生物，有利地向植物中额外地导入Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶和Δ4去饱和酶，ARA、EPA和/或DHA额外地形成。这也适用于事先已导入Δ8去饱和酶和Δ9延伸酶的生物。根据在生物或在植物中作为合成起始物质而存在的脂肪酸，仅ARA、EPA或DHA或这些脂肪酸的混合物有利地得到合成。因为涉及生物合成的级联，所讨论的终产物未能在生物中以纯的形态出现。小量的前体化合物总是额外地在终产物中存在。基于终产物DGLA、ETA或其混合物，或者ARA、EPA、DHA或其混合物，有利地以EPA或DHA或其混合物，这些前体化合物小量占小于20％重量、有利地占小于15％重量、尤其有利地占小于10％重量、最有利地占小于5、4、3、2或1％重量。

本发明的核酸所编码的蛋白质对用于DHA合成的两种前体C18:4Δ6，9，12，15和C20:5Δ5，8，11，14，17脂肪酸表现了高度的特异性(前体和DHA的合成见图1)。因此SEQ NO：53编码的蛋白质对带有一个额外ω3双键的Δ6和Δ5脂肪酸表现了特异性(图2)。Δ5延伸酶具备有利地使酰基辅酶A酯的脂肪酸残基延伸2个碳原子的酮酰基辅酶A合成酶活性。

在Δ5延伸酶基因、褐指藻Δ5去饱和酶和裸藻Δ4去饱和酶的辅助下，DHA的合成有可能在酵母(酿酒酵母)中展示(图3)。

用于本发明的Δ5延伸酶、Δ6延伸酶和/或ω3去饱和酶的起始脂肪酸除了直接在生物中产生以外，所述脂肪酸还能自外部添加。因为经济原因在生物中生产为优选。ω3去饱和酶的优选底物是亚油酸(C18:2Δ9，12)、γ-亚麻酸(C18:3Δ6，9，12)、二十碳二烯酸(C20:2Δ11，14)、二高γ-亚麻酸(C20:3Δ8，11，14)、花生四烯酸(C20:4Δ5，8，11，14)、二十二碳四烯酸(C22:4Δ7，10，13，16)和二十二碳五烯酸(C22:5Δ4，7，10，13，15)。

为了在上述用于产生多不饱和脂肪酸含量有利地得到升高的油和/或甘油三酯的方法中提高产量，增加合成脂肪酸的起始产物的量是有利的；这可以例如通过向生物中导入编码Δ12去饱和酶多肽的核酸实现。在产油生物如那些来自十字花科如芸苔属，例如油菜籽；胡颓子科如胡颓子属，例如油橄榄的属和种或豆科如大豆属，例如具有较高油酸的大豆的属和种中这种方法尤其有利。因为这些生物仅有较低的亚油酸(Mikoklajczak等，Journal of the American oils Chemical Society，38，1961，678-681)，以上提到的Δ12去饱和酶用于产生起始物质亚油酸是有利的。

本发明方法中所用的核酸有利地来自植物如藻类，例如草绿藻科的藻类如异毛藻属(Heteromastix)、Mammella、Mantoniella、微单藻属(Micromonas)、肾藻属、Ostreococcus、绿枝藻属(Prasinocladus)、Prasinococcus、Pseudoscourfielda、Pycnococcus、塔胞藻属(Pyramimonas)、Scherffelia、扁藻属例如Heteromastix longifillis、Mamiella gilva、Mantoniella squamata、Micromonas pusilla、绿肾藻(Nephroselmis olivacea)、Nephroselmis pyriformis、圆形肾藻(Nephroselmis rotunda)、Ostreococcus tauri、Ostreococcus sp.、Prasinocladus ascus、Prasinocladus lubricus、Pycnococcus provasolii、Pyramimonas  amylifera、Pyramimonas disomata、Pyramimonasobovata、Pyramimonas  orientalis、Pyramimonas parkeae、Pyramimonas spinifera、Pyramimonas sp.、Tetraselmis apiculata、Tetraselmis carteriaformis、周氏扁藻(Tetraselmis chui)、皱叶扁藻(Tetraselmis convolutae)、Tetraselmis desikacharyi、纤细扁藻(Tetraselmis gracilis)、Tetraselmis hazeni、Tetraselmis impellucida、Tetraselmis inconspicua、Tetraselmis levis、有斑扁藻(Tetraselmismaculata)、Tetraselmis marina、Tetraselmis striata、Tetraselmissubcordiformis、Tetraselmis suecica、Tetraselmis tetrabrachia、Tetraselmis tetrathele、Tetraselmis verrucosa、Tetraselmis verrucosa fo.Rubens或Tetraselmis sp.的属和种或选自裸藻科的藻类如囊胞藻属(Ascoglena)、变胞藻属(Astasia)、胶柄藻属、Cyclidiopsis、裸藻属、拟裸藻属(Euglenopsis)、Hyalophacus、克氏藻属(Khawkinea)、鳞孔藻属、扁裸藻属、陀螺藻属(Strombomonas)或囊裸藻属例如梭形裸藻(Euglena acus)、膝曲裸藻(Euglena geniculata)、细小裸藻、Euglenamixocylindracea、喙状裸藻(Euglena rostrifera)、绿色裸藻(Euglenaviridis)、Colacium stentorium、圆柱囊裸藻(Trachelomonas cylindrica)或旋转囊裸藻(Trachelomonas volvocina)的属和种。所用核酸有利地衍生自裸藻属、Mantoniella或Ostreococcus属的藻类。

更有利的植物是藻类如等鞭金藻属(Isochrysis)或隐甲藻属、藻类/硅藻如海链藻属或褐指藻属、藓类如剑叶藓属或角齿藓属、或者高等植物如报春花科(Primulaceae)例如Aleuritia、Calendula stellata、刺状骨籽菊(Osteospermum spinescens)或Osteospermum hyoseroides、微生物如真菌例如曲霉属(Aspergillus)、破囊壶菌属、疫霉属、虫霉属、毛霉属或被孢霉属，细菌如希瓦氏菌，酵母或动物如线虫例如隐杆线虫、昆虫、蛙、鲍鱼或鱼。本发明经分离的核酸序列有利地源自脊椎动物目的动物。所述核酸序列优选地源自脊椎动物纲；Euteleostomi，辐鳍鱼纲(Actinopterygii)；新鳍鱼亚纲(Neopterygii)；硬骨鱼类(Teleostei)；Euteleostei、原鳍鱼总目(Protacanthopterygii)、鲑形目(Salmoniformes)；鲑科(Salmonidae)或大马哈鱼属(Oncorhynchus)或脊椎动物(Vertebrata)、两栖纲(Amphibia)、无尾两栖目(Anura)、负子蟾科(Pipidae)、非洲爪蟾属或无脊椎动物(Evertebrata)例如原索动物门(Protochordata)、被囊亚门(Tunicata)、海参纲(Holothuroidea)、海鞘科(Cionidae)例如Amaroucium constellatum、Botryllus schlosseri、玻璃海鞘、Molgula citrina、Molgula manhattensis、Perophora viridis或Styela partita。所述核酸尤其有利地源自真菌、动物、或源自植物如藻类或藓类，优选地源自鲑形目如鲑科如鲑属例如来自虹鳟、Trutta trutta或亚东鲑(Salmo trutta fario)的属和种，源自藻类如Mantoniella或Ostreococcus，或源自硅藻如海链藻属或褐指藻属或者源自藻类如隐甲藻属。

本发明的方法有利地包含以上提及的核酸序列或它们的衍生物或同系物，其编码这样的多肽，所述多肽保留了由以上提及的核酸序列所编码的蛋白质的酶活性。这些序列单独地或与编码Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6延伸酶和/或ω3去饱和酶的核酸序列组合而克隆于表达构建体内并用于向生物中导入和在生物中表达。由于它们的构建，这些表达构建体使得可有利地优化合成本发明方法中所产生的多不饱和脂肪酸。

在一个优选的实施方案中，所述方法进一步包括获得细胞或完整生物的步骤，其中所述的细胞或完整生物包含方法中所用的核酸序列，这些细胞和/或生物在所述的方法中由本发明编码Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶，Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6延伸酶和/或ω3去饱和酶的核酸序列、如上所述的基因构建体或载体，单独地或与编码脂肪酸或脂类代谢的蛋白质的核酸序列组合而转化。在一个更优选的实施方案中，所述方法进一步包括从生物或培养物中获得油、脂类或游离脂肪酸的步骤。培养物可采用例如发酵培养物的形式例如在培养微生物如被孢霉、海链藻、Mantoniella、Ostreococcus、酵母或破囊壶菌的情况下或采用植物的温室培养物或田间生长培养物形式。由此所产生的细胞或微生物有利地是产油生物的细胞如油料作物例如花生、油菜籽、卡诺拉油菜(Canola)、亚麻籽、大麻、花生、大豆、红花、大麻、向日葵或琉璃苣的细胞。

在为植物细胞、植物组织或植物器官的情况下，“生长”理解为意指例如在营养培养基内或培养基上培养、或完整植物在基底物上或基底物内的培养例如在水培、盆载培养料内或在可耕地上的培养。

为了本发明目的，“转基因的”或“重组的”意指例如核酸序列、表达盒(基因构建体)或包含核酸序列的载体或由本发明的核酸序列、表达盒或载体所转化的生物，所有通过重组方法产生的构建体中的

a)本发明的核酸序列，或

b)有效地连接于本发明核酸序列的遗传控制序列，例如启动子，或

c)a)和b)

均不处于它们天然的遗传环境中或均已经通过重组方法修饰，对这种修饰而言可采取例如一个或多个核苷酸残基的替代、添加、删除、倒位或插入的形式。将天然遗传环境理解为意指原始生物中的天然基因组位点或染色体位点或在基因组文库中的存在。在为基因组文库的情况下，优选地保留，至少部分保留所述核酸序列的天然遗传环境。所述环境位于所述核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp、优选地至少500bp、尤其优选地至少1000bp、最为优选地至少5000bp的序列长度。天然存在的表达盒-例如所述核酸序列的天然启动子与相应的Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6延伸酶和/或Δ5延伸酶基因的天然存在的组合-当经过非天然、合成的(“人工的”)方法例如通过诱变处理修饰后变成了转基因的表达盒。合适的方法在美国5.565.350或WO001/15815中进行了描述。

用于本发明目的的转基因生物或转基因植物因此理解为意指上述方法中所用的核酸不处于它们在生物的基因组中的天然基因座处，对这类核酸而言可同源或异源性地表达。然而如所提及，转基因也意指即便本发明的核酸处于生物基因组中它们的天然位置上，这种序列相对于天然序列已经过了修饰，和/或天然序列的调节序列已经过了修饰。转基因优选地理解为意指本发明的核酸在基因组内非天然基因座处的表达，即发生了这种核酸的同源表达，或优选地异源表达。优选的转基因生物是真菌如被孢霉或疫霉、藓类如剑叶藓、藻类如Mantoniella、裸藻、隐甲藻或Ostreococcus、硅藻如海链藻或褐指藻或者植物如油料作物。

生物或宿主生物对于本发明方法中所用的核酸、表达盒或载体而言原则上是能够有利地合成脂肪酸尤其不饱和脂肪酸和/或适用于表达重组基因的所有生物。可提到例子是植物如拟南芥、菊科植物例如金盏花或作物植物如大豆、花生、蓖麻油植物、向日葵、玉米、棉、亚麻、油菜籽、椰子、油棕榈、红花(Carthamus tinctorius)或可可豆；微生物如真菌例如被孢霉属、破囊壶菌属、水霉属、疫霉属或腐霉属；细菌如埃希氏菌属或希瓦氏菌属；酵母如酵母属、蓝细菌属、纤毛虫属，藻类如Mantoniella、裸藻属、海链藻属如Ostreococcus；或原生动物如甲藻例如隐甲藻。优选的生物是那些能够天然合成大量油的生物如真菌如高山被孢霉(Mortierella alpina)、Pythium insidiosum、致病疫霉或植物如大豆、油菜籽、椰子、油棕榈、红花、亚麻、大麻、金盏花、蓖麻油植物、花生、可可豆或向日葵，或者酵母如酿酒酵母，并且尤其优选大豆、亚麻、油菜籽、红花、向日葵、金盏花、被孢霉或酿酒酵母。除了以上提到的转基因生物以外，宿主生物原则上还可以是转基因动物，有利地为非人类的动物例如秀丽线虫、玻璃海鞘或非洲爪蟾。

可利用的宿主细胞进一步在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中详述。

可使用的表达株系如那些具有较低蛋白酶活性的株系在Gottesman，S.，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)119-128中描述。

这些株系包括植物细胞和某些组织、器官和植物的所有表型形式中的部分如花药、纤维、根毛、茎、胚、愈伤组织、cotelydon、叶柄、所收获的材料、植物组织、可繁殖的组织和来自实际的转基因植物的和/或可用于产生转基因植物的细胞培养物。

包含本发明方法中所合成的多不饱和脂肪酸的转基因植物能够有利地直接销售而无需分离所合成的油、脂类或脂肪酸。本发明方法的植物罗列如下：完整植物和植物的所有部分、植物器官或植物部分如叶、茎、种子、根、块茎、花药、纤维、根毛、茎、胚、愈伤组织、cotelydons、叶柄、所收获的材料、植物组织、可繁殖的组织和来自实际转基因植物的细胞培养物和/或可用于产生转基因植物的细胞培养物。在本上下文中，种子包含种子的所有部分如种皮、表皮细胞、种子细胞、胚乳或胚组织。本发明方法中所产生的化合物也可以油、脂肪、脂类和/或游离脂肪酸的形式从生物，有利地从植物中分离。由所述方法产生的多不饱和脂肪酸可通过从所生长的作物中或从田野中收获这类生物获得。这可通过对植物部分优选对植物种子的压榨或提取实现。在本上下文中，油、脂肪、脂类和/或游离脂肪酸通过公知的冷敲打(cold-beating)或冷榨可获得而无需加热。为了更容易地破裂植物部分尤其种子，它们事先经过粉碎、蒸热或烘烤。随后经如此方式预处理的种子可用溶剂如温己烷压榨或提取。然后去除溶剂。在为微生物时，微生物在收获后例如可直接提取而无需进一步的加工步骤或在破裂后经技术人员所熟悉的多种方法提取。按照这种方式，可分离所述方法产生的超过96％的化合物。此后所得到的产物经过进一步加工即精制。在该方法中，例如植物黏液和悬浮物首先去除。众知的所谓除去矿泥可通过酶或例如通过加入酸如磷酸而化学-物理性地完成。此后游离脂肪酸用碱例如氢氧化钠溶液处理去除。得到的产物用水彻底洗涤以去除产物中残留的碱，然后干燥。为了除去产物中残留的色素，利用滤土或活性碳漂白产物。最后例如利用蒸汽使产物脱嗅。

通过该方法所产生的PUFA或LCPUFA有利地是C18、C20或C22脂肪酸分子，有利地是C20或C22脂肪酸分子，这些脂肪酸分子具有至少两个双键，优选地具有三、四、五或六个双键。这些C18、C20或C22脂肪酸分子可以以油、脂类或游离脂肪酸的形式从生物中分离。合适的生物是例如以上提到的那些生物。优选的生物是转基因植物。

因此本发明的一个实施方案是通过以上描述的方法产生的油、脂类或脂肪酸或它们的级分，尤其优选含有PUFA并且来自转基因植物的油、脂类或脂肪酸组合物。

如以上所描述，在每一情况下，以100％为基础并且以生物的总脂肪酸含量为基础，这些油、脂类或脂肪酸有利地包含6至15％的棕榈酸、1至6％的硬脂酸、7-85％的油酸、0.5至8％的11-十八碳烯酸、0.1至1％的花生酸、7至25％的饱和脂肪酸、8至85％的单不饱和脂肪酸和60至85％的多不饱和脂肪酸。以总脂肪酸含量为基础，这些脂肪酸酯或脂肪酸混合物中存在的有利的多不饱和脂肪酸优选地为至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1％的花生四烯酸。而且通过本发明方法产生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物有利地包含选自如下的脂肪酸：芥酸(二十二碳烯-13酸)、苹婆酸(9，10-亚甲基十八碳-9-烯酸)、锦葵酸(8，9-亚甲基十七碳-8-烯酸)、大风子油酸(环戊烯十二烷酸)、呋喃脂肪酸(9，12-环氧十八碳-9，11-二烯酸)、斑鸠菊酸(9，10-环氧十八碳-12-烯酸)、果脂酸(6-十八碳炔酸)、6-十九碳炔酸、santalbic acid(反11-十八碳烯-9-炔酸)、6，9-十八碳烯炔酸、pyrulic acid(反10-十七烯-8-炔酸)、crepenyninic acid(9-十八烯-12-炔酸)、13，14-二氢oropheic acid、十八碳-13-烯-9，11-二炔酸、伞形花子油酸(顺-6-十八烯酸)、9顺，12反-十八碳二烯酸、金盏花素酸(8反10反12顺-十八碳三烯酸)、梓甙酸(9反11反13顺-十八碳三烯酸)、桐酸(9顺11反13反-十八碳三烯酸)、iacaric acid(8顺10反12顺-十八碳三烯酸)，石榴酸(9顺11反13顺-十八碳三烯酸)、麦饼树酸(9顺11反13反15顺-十八碳四烯酸)、皮诺敛酸(全-顺-5，9，12-十八碳三烯酸)、laballenic acid(5，6-十八碳二烯丙二烯酸)、蓖麻油酸(12-羟油酸)和/或革盖菌素酸(13-羟-9顺，11反-十八碳二烯酸)。通常上面提到的脂肪酸有利地仅在本发明方法产生的脂肪酸酯或脂肪酸的混合物中痕量地存在，也就是说以总脂肪酸为基础，它们的含量小于30％，优选地小于25％、24％、23％、22％或21％，尤其优选地小于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％或5％、非常尤其优选地小于4％、3％、2％或1％。在本发明更优选的实施方案中，以总脂肪酸为基础，以上这些提到的脂肪酸的含量小于0.9％、0.8％、0.7％、0.6％或0.5％，尤其优选地小于小于0.4％、0.3％、0.2％、0.1％。以总脂肪酸为基础，由本发明方法所产生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物有利地包含小于0.1％和/或无丁酸、无胆固醇、无鰶鱼酸(二十二碳五烯酸，C22:5Δ4，8，12，15，21)以及无尼生酸(二十四碳六烯酸，C23:6Δ3，8，12，15，18，21)。

以生产生物，有利地是植物，尤其优选地是油料作物植物如大豆、油菜籽、椰子、油棕榈、红花、亚麻、大麻、蓖麻、金盏花、花生、可可豆、向日葵或以上提到的其它单子叶或双子叶油料作物植物的总脂肪酸含量为基础，本发明的油、脂类或脂肪酸包含至少0.5％、1％、2％、3％、4％或5％，有利地至少6％、7％、8％、9％或10％，尤其有利地至少11％、12％、13％、14％或15％的ARA或至少0.5％、1％、2％、3％、4％或5％，有利地至少6％或7％，尤其有利地至少8％、9％或10％的EPA和/或DHA。

本发明的又一个实施方案是油、脂、脂肪酸和/或脂肪酸组合物在饲料、食品、化妆品或药品中的用途。本发明的油、脂、脂肪酸或脂肪酸混合物可按照技术人员熟悉的方式与动物来源的其它油、脂类、脂肪酸或脂肪酸混合物例如鱼油混合使用。这些由植物或动物组分所组成的油、脂类、脂肪酸或脂肪酸混合物也可用于制备饲料、食品、化妆品或药品。

术语“油”、“脂类”或“脂肪”理解为意指包含不饱和的、饱和的，优选地已酯化的脂肪酸的脂肪酸混合物。油、脂类或脂肪优选地具有较高多不饱和的游离脂肪酸或有利地具有较高酯化的脂肪酸，特别是亚油酸、γ-亚麻酸、二高γ-亚麻酸、花生四烯酸、α-亚麻酸、硬脂艾杜糖酸、二十二碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸。

酯化的不饱和脂肪酸的量优选地占约30％含量，50％的含量更为优选，60％、70％、80％或更高的含量尤其优选。为了分析，脂肪酸的含量例如可在脂肪酸经酯转换转化为甲酯后通过气相层析测定。油、脂类或脂肪可包含多种其它饱和或不饱和的脂肪酸例如金盏花素酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸等。在油或脂肪中的多种脂肪酸含量可变化，这尤其取决于起始生物。

如上所述，在方法中所产生的有利地具有至少两个双键的多不饱和脂肪酸如上所述是例如鞘脂类、磷酸甘油酯、脂类、糖脂、磷脂、单酰甘油酯、二酰甘油酯、三酰甘油酯或其它脂肪酸酯。

从通过本发明方法制备的有利地具有至少五个或六个双键的多不饱和脂肪酸开始，所存在的多不饱和脂肪酸经碱例如KOH或NaOH水溶液处理，或者有利地于存在醇例如甲醇或乙醇时经酸水解，或者经酶切割释放并且通过例如相分离及随后例如H2SO4的酸化作用而分离。这类脂肪酸也可无需以上描述的加工步骤直接释放。

方法中所用的核酸在导入生物体，有利地导入植物细胞或植物后，可以在单独的质粒中存在或者有利地可以整合入宿主细胞的基因组内。在整合入基因组内的情况下，整合可以是随机的或可通过重组实现，从而所导入的拷贝替代了原来的基因，由此细胞产生的目的化合物是被调节的，或整合可通过运用基因反式而实现，从而这种基因有效地与功能性表达单元连接，其中这个表达单元包含至少一段确保基因表达的序列和至少一段确保功能性转录的基因多聚腺苷酸化的序列。这类核酸通过多重表达盒或构建体有利地向生物中导入以便多重平行表达，有利地向植物中导入以便基因的多重平行种子特异性的表达。

藓类和藻类是唯一已知的产生大量多不饱和脂肪酸如花生四烯酸(ARA)和/或二十碳五烯酸(EPA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)的植物系统。藓类在膜脂中包含PUFA；而藻类、与藻类有关的生物及少数真菌也在三酰甘油酯的级分中聚集了大量的PUFA。这是为什么从三酰甘油酯级分中聚集PUFA的株系所分离的核酸分子尤其有利地用于本发明方法并且因此用于修饰宿主中脂类和PUFA产生系统的原因，特别是修饰植物中如油料作物例如油菜籽、卡诺拉油菜、亚麻籽、大麻、大豆、向日葵和琉璃苣中的脂类和PUFA产生系统。因此这类核酸分子可有利地用于本发明的方法。

有利地适于本发明方法中所用的核酸的底物，其中所述核酸编码Δ12去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ5延伸酶、Δ6延伸酶和/或ω3去饱和酶活性和/或适于所用的其它核酸的底物有利地是C16、C18、或C20脂肪酸，其中所述其它的核酸是编码选自酰基-辅酶A脱氢酶、酰基ACP [酰基载体蛋白]去饱和酶、酰基ACP硫酯酶、脂肪酸酰基转移酶、酰基-辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶(酶)、脂肪酸合成酶、脂肪酸羟化酶、乙酰基辅酶A羧化酶、酰基辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸炔属酶、脂加氧酶、三酰甘油酯脂肪酶、环丙烯合酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶的核酸。方法中作为底物转化的脂肪酸优选地以它们酰基辅酶A酯形式和/或它们的磷脂形式的酯转化的脂肪酸或脂代谢中的多肽。

为产生本发明的长链PUFA，多不饱和C18脂肪酸首先必须通过去饱和酶的酶活性去饱和并且接下来通过延伸酶延伸至少两个碳原子。在一次延伸循环后，延伸酶的酶活性产生了C20脂肪酸并且经过两轮延伸循环后，产生了C22脂肪酸。本发明方法中所用的去饱和酶和延伸酶的活性优选地产生C18、C20和/或C22脂肪酸，在脂肪酸分子中有利地具有至少两个双键，优选地具有三、四、五或六个双键，尤其优选地产生C20和/或C22脂肪酸，在脂肪酸分子中具有至少两个双键，优选地具有三、四、五或六个双键，非常尤其优选地在分子中具有五或六个双键。在第一次去饱和和延伸发生后，可发生进一步的去饱和和延伸步骤例如在Δ5和Δ4位置处的去饱和。尤其优选的本发明方法的产物是二高γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸。在脂肪酸分子中具有至少两个双键的C20脂肪酸可以以游离脂肪酸的形式或以酯的形式如磷脂类、糖脂类、鞘脂类、磷酸甘油酯、单酰甘油酯、二酰甘油酯或三酰甘油酯通过本发明的酶活性加以延伸。

脂肪酸、油、脂类或脂肪在有利使用的植物中优选的生物合成部位例如通常是种子或种子的细胞层，因此对方法中所用的核酸进行种子特异性表达是有意义的。然而显然脂肪酸、油或脂类的生物合成并非限定于种子组织中，同时也可在植物的所有其它部分例如在表皮细胞或在块茎中以组织特异性方式进行。

若微生物如酵母例如酵母属或裂殖酵母属、真菌如被孢霉属、曲霉属、疫霉属、虫霉属、毛霉属或破囊壶菌属、藻类如等鞭金藻属、Mantoniella、裸藻属、Ostreococcus、褐指藻属或隐甲藻属作为本发明方法中的生物使用，这些生物有利地在发酵培养物内生长。

由于本发明编码Δ5延伸酶的核酸的利用，与未重组的不含有这种核酸的生物的野生型比较，方法中产生的多不饱和脂肪酸可增加至少5％，优选地至少10％，尤其优选地至少20％，非常尤其优选地至少50％。

原则上，可以两种不同方式增加在方法所用的生物中由本发明方法产生的多不饱和脂肪酸。游离的多不饱和脂肪酸库和/或由方法产生的酯化多不饱和脂肪酸含量可有利地扩大。转基因生物中酯化的多不饱和脂肪酸库通过本发明方法有利地扩大。

若微生物作为本发明方法中的生物使用，根据宿主生物，将它们按技术人员熟悉的方式生长或培养。微生物一般在液体培养基中生长，其中所述培养基通常含有糖形式的碳源、有机氮源形式的氮源如酵母提取物或盐如硫酸铵、微量元素如铁、锰和镁盐和根据需要含有维生素，该培养基的温度在0℃和100℃之间，优选地在10℃和60℃之间，同时通氧。液体培养基的pH可保持恒定即在培养期间受到调节，或不保持恒定。培养物可以分批式、半分批式或连续地生长。营养物可在发酵开始时提供或半连续或连续性地输入。所产生的多不饱和脂肪酸可从如上描述的生物中通过技术人员所知的方法例如提取、蒸馏、结晶、根据需要以盐沉淀和/或层析分离。为此目的，可有利地事先破裂生物体。

若宿主生物为微生物，本发明的方法有利地在0℃和95℃之间，优选地在10℃和85℃间，尤其优选地在15℃和75℃间，非常尤其优选地在15℃和45℃间实施。

将本发明方法中pH值优选地维持在pH 4和12之间、优选地维持在pH 6和9之间、尤其优选地维持在pH 7和8之间。

本发明的方法可分批式、半分批式或连续地操作。对已知培养方法的综述可在Chmiel的教材(Bioprozeβtechnik 1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik[Bioprocess technology 1.Introduction to Bioprocesstechnology](Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))中或在Storhas的教材(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[Bioreactors andperipheral equipment](Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))中找到。

预备使用的培养基必须符合所讨论的株系的需要。用于各种微生物的培养基的描述可在教材″Manual of Methods für Genaeral Bacteriology″ofthe American Society for Bacteriology(Washington D.C.，USA，1981)中找到。

如以上描述，根据本发明的可使用的这些培养基通常包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。

优选的碳源是糖如单糖、双糖或多糖。极好碳源的例子是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。糖还可以复杂的化合物如糖蜜或其它来自糖蜜三糖化(raffination)的副产物加入培养基。添加多种碳源的混合物也是有利的。其它可能的碳源是油和脂肪例如大豆油、向日葵油、花生油和/或可可脂、脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和/或亚油酸、醇和/或多元醇例如甘油、甲醇和/或乙醇和/或有机酸例如乙酸和/或乳酸。

氮源通常是有机或无机氮化合物或含有这些化合物的物质。氮源的例子包括液体或气体形式的氨或者铵盐如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵、硝酸盐、尿素、氨基酸或者复杂氮源例如玉米浆、大豆粕、大豆蛋白质、酵母提取物、肉膏和其它等。氮源可单独地或作为混合物使用。

可在培养基中存在的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐和硫酸盐。

含无机硫的化合物例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物或有机硫化合物如硫醇和硫醇类可以用作硫源以产生含硫的精细化学品，特别是甲硫氨酸。

磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的钠盐可用作磷源。

鳌合剂可加入培养基以维持溶液中的金属离子。尤其合适的鳌合剂包括二羟基酚如邻苯二酚或原儿茶酸盐和有机酸如柠檬酸。

本发明使用的用于培养微生物的发酵培养基通常也含有其它生长因子如维生素或生长促进剂，包括例如生物素、核黄素、维生素B1、叶酸、烟酸、泛酸盐和吡哆醇。生长因子和盐经常来自复杂的培养基成分如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。更有可能向培养基中加入合适的前体。培养基化合物的明确组分很大程度取决于特定的实验并且单独取决于每个特定的情况。优化培养基的信息可在教材″Applied Microbiol.Physiology，APractical Approach″(Editors P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)pp.53-73，ISBN 0199635773)中找到。生长培养基例如标准1(Merck)或BHI(脑心浸液，DIFCO)等也可从商业供应商处获得。

所有培养基的成分均经加热(1.5巴，121℃20分钟)或过滤灭菌法灭菌。各成分可共同或根据需要分别灭菌。培养基的所有成分可在培养开始时存在或根据需要连续或分批式加入。

培养温度通常在15℃和45℃之间，优选地从25℃至40℃，并且可维持恒定或可在实验期间变动。培养基的pH应该处于5至8.5之间，优选地在7.0附近。用于培养的pH在培养期间可通过加入碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨和液氨或酸性化合物如磷酸或硫酸控制。起泡可使用消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇脂控制。为维持质粒的稳定性，可向培养基中加入合适的具有选择效应的物质如抗生素。需氧条件通过向培养基中导入氧或含氧的气体混合物例如环境空气维持。培养基的温度通常为20℃至40℃并且优选地为25℃至40℃。持续培养直至最大限度地形成目的产物。这个目标通常在10至160小时内达到。

以如此方式所获的发酵培养液，尤其那些含有多不饱和脂肪酸的培养液通常含有7.5至25％重量的干物质。

这种发酵培养液随后可经过进一步加工。生物质根据需要可通过分离法例如离心、过滤、倾析或这些方法的组合从发酵培养基中完全或部分地移出或完全滞留在所述的培养基中。生物质有利地在分离后进行加工。

然而，发酵液也可使用已知的方法例如在旋转蒸发器、薄膜蒸发器、降膜蒸发器的辅助下通过反向渗透或通过纳米过滤加以增稠或浓缩而无需分离细胞。最终这种浓缩的发酵液可经加工以获得存在其中的脂肪酸。

所述方法中所获的脂肪酸也适用于化学合成其它目的的产物。例如它们可单独或彼此联合地用于制备药物、食品、动物饲料或化妆品。

本发明还涉及经分离的编码具有Δ5延伸酶的多肽的核酸序列，其中由所述核酸序列编码的Δ5延伸酶转化在脂肪酸分子中具有至少四个双键的C20脂肪酸，这种C20脂肪酸有利地最终掺入二酰甘油酯和/或三酰甘油酯内。

有利的经分离的核酸序列是编码具有Δ5延伸酶活性的多肽并且编码包含选自具有SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141或SEQ ID NO：142中所示氨基酸序列的氨基酸的核酸序列。

进一步有利的经分离的核酸序列是编码具有Δ5延伸酶活性的多肽并且编码包含选自以下氨基酸序列的联合的核酸序列：

a)SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：115和SEQ IDNO：140或SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：140；或

b)SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：116和SEQ IDNO：142或SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：142；或

c)SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：140或SEQ IDNO：116、SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：142。

序列SEQ ID NO：115(NXXXHXXMYXYYX)、SEQ ID NO：116(HHXXXXWAWW)、SEQ ID NO：139(LHXXHH)、SEQ ID NO：140(TXXQXXQF)、SEQ ID NO：141(DTXFMV)和SEQ ID NO：142(TQAQXXQF)中所示的序列组成了多种延伸酶的保守性区域。上述核酸序列中出现的标注为X的氨基酸的含义在表2中显示(列3)。在多个位置处所优选的氨基酸也可以在该表中(列3)找到。列1指示SEQID NO，列2指示序列中的位置。

表2共有序列中标注为X的氨基酸的含义

 SEQ ID NO：   在序列中  X的位置   氨基酸   优选的氨基酸  115 (NXXXHXXMYXYYX)   2   Ser，Cys，Leu，  Gly   Cys，Leu  115   3   Thr，Phe，Ile，  Ser，Val，Trp，  Gly   Phe，Trp

 SEQ ID NO：   在序列中  X的位置   氨基酸   优选的氨基酸  115   4   Val，Ile   Val，Ile  115   6   Val，Ile，Thr   Val，Ile  115   7   Ile，Phe，Val，  Leu，Cys   Cys，Val  115   10   Ser，Gly，Tyr，  Thr，Ala   Thr，Ser  115   13   Phe，Met，Thr，  Leu，Ala，Gly   Leu  116 (HHXXXXWAWW)   3   Ala，Ser，Thr   Ala，Ser，尤其优选  Ala  116   4   Thr，Met，Val，  Leu，Ile，Ser   Leu，Thr，尤其优选  Leu  116   5   Val，Thr，Met，  Leu，Ile   Ile，Ser，尤其优选Ile

  SEQ ID NO：   在序列中  X的位置   氨基酸   优选的氨基酸   116   6   Val，Met，Leu，  Ile，Ala，Pro，  Ser，Phe   Ile，Ser，尤其优选Ile   139  LHXXHH   3   Val，Tyr，Ile   Val，Thr   139   4   Tyr，Phe   Tyr

  SEQ ID NO：   在序列中  X的位置   氨基酸   优选的氨基酸   140  TXXQXXQF   2   Asn，Asp，Thr，  Gln，Met，Ser，  Ala   Gln   140   3   Thr，Cys，Leu，  Met，Ala，Ile，  Val，Phe   Ala，Met   140   5   Met，Ile，Leu   Met   140   6   Val，Ile，Leu，  Thr，Phe   Leu   141  DTXFMV   3   Leu，Ile，Val，  Tyr，Phe，Ala   Phe   142  TQAQXXQF   5   Met，Ile，Leu   Met，Leu，尤其优选  Met   142   6   Val，Ile，Leu，  Thr，Phe   Leu

尤其有利的Δ5延伸酶包含序列SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：141和/或SEQ ID NO：142中的至少一个序列。

尤其有利的经分离的核酸序列选自以下序列：

a)具有SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63；SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ IDNO：113、SEQ ID NO：131或SEQ ID NO：133中所示序列的核酸序列；

b)作为遗传密码简并性的结果，可从SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：60，SEQ IDNO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68，SEQID NO：76，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：114，SEQ ID NO：132或SEQ ID NO：134中所示氨基酸序列衍生的核酸序列，或

c)SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63；SEQID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：131或SEQ ID NO：133中所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ IDNO：50、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：131或SEQ ID NO：133在氨基酸水平具有至少40％同源性的多肽并且具有Δ5延伸酶活性。

本发明还涉及编码具有Δ6延伸酶活性的多肽的经分离核酸序列，其选自：

a)具有SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：111或SEQ ID NO：183中所示序列的核酸序列，

b)作为遗传密码简并性的结果，可从SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：184中所示氨基酸序列衍生的核酸序列，或

c)SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：111或SEQ ID NO：183中所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：184在氨基酸水平具有至少40％同源性的多肽并且具有Δ6延伸酶活性。

本发明还涉及编码具有ω3去饱和酶活性的多肽的经分离核酸序列，其选自：

a)具有SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：105中所示序列的核酸序列，

b)作为遗传密码简并性的结果，可从SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：106中所示氨基酸序列衍生的核酸序列，或

c)SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：105中所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：106在氨基酸水平具有至少60％同一性的多肽并且具有ω3去饱和酶活性。

本发明还涉及编码具有Δ6去饱和酶活性的多肽的经分离核酸序列，其选自：

a)具有SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：97中所示序列的核酸序列，或

b)作为遗传密码简并性的结果，可从SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：98中所示氨基酸序列衍生的核酸序列，或

c)SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：97中所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：98在氨基酸水平具有至少40％同源性的多肽并且具有Δ6去饱和酶活性。

本发明还涉及编码具有Δ5去饱和酶活性的多肽的经分离核酸序列，其选自：

a)具有SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：101中所示序列的核酸序列，或

b)作为遗传密码简并性的结果，可从SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：102中所示氨基酸序列衍生的核酸序列，或

c)SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：101中所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：102在氨基酸水平具有至少40％同源性的多肽并且具有Δ5去饱和酶活性。

本发明还涉及编码具有Δ4去饱和酶活性的多肽的经分离核酸序列，其选自：

a)具有SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：103中所示序列的核酸序列，或

b)作为遗传密码简并性的结果，可从SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：104中所示氨基酸序列衍生的核酸序列，或

c)SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：103中所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：104在氨基酸水平具有至少40％同源性的多肽并且具有Δ4去饱和酶活性。

本发明还涉及编码具有Δ12去饱和酶活性的多肽的经分离核酸序列，其选自：

a)具有SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：109中所示序列的核酸序列，或

b)作为遗传密码简并性的结果，可从SEQ ID NO：108或SEQ ID NO：110中所示氨基酸序列衍生的核酸序列，或

c)SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：109中所示核酸序列的衍生物，其编码与SEQ ID NO：108或SEQ ID NO：110在氨基酸水平具有至少50％同源性的多肽并且具有Δ12去饱和酶活性。

本发明还涉及包含SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ IDNO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ IDNO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：183的核酸序列的基因构建体，其中根据本发明，所述核酸有效地与一个或多个调节信号连接。此外，脂肪酸或脂类代谢的其它生物合成基因可在基因构建体中存在，其中所述其他生物合成基因选自酰基辅酶A脱氢酶、酰基ACP [酰基载体蛋白]去饱和酶、酰基ACP硫酯酶、脂肪酸酰基转移酶、酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶、脂肪酸合成酶、脂肪酸羟化酶、乙酰辅酶A羧化酶、酰基辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸炔属酶、脂加氧酶、三酰甘油酯脂肪酶、环丙烯合酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶。选自Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ9延伸酶或ω3去饱和酶的脂肪酸或脂类代谢中的生物合成基因有利地额外存在。

本发明方法中所用的全部核酸序列有利地衍生自真核生物如植物、微生物或动物。核酸序列优选地衍生自鳟形目、藻类如Mantoniella，隐甲藻属，裸藻属或Ostreococcus、真菌如疫霉属或者硅藻如海链藻属或褐指藻属。

方法中所用的编码具有ω3去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6延伸酶或Δ9延伸酶活性的蛋白的核酸序列有利地单独导入，或优选地与有可能使所述核酸在生物中，有利地在植物或微生物中表达的表达盒(核酸构建体)组合导入。所述核酸构建体可以包含具有酶活性如Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6延伸酶和/或ω3去饱和酶活性的多于一种的核酸序列。

为了导入方法中所用的核酸，所述核酸有利地通过众知的方式扩增和连接。优选地遵循用于Pfu DNA聚合酶或Pfu/TaqDNA聚合酶混合物的符合规程的程序。引物在考虑所要扩增的序列后选择。引物应当以如此方式有利地选择以便扩增物包含从起始密码子至终止密码子的完整编码序列。扩增物在扩增后便利地加以分析。例如凝胶电泳分离可以实施，然后进行定量和定性分析。此后扩增物可按照标准规程纯化(如Qiagen)。而后一份经纯化的扩增物在随后的克隆步骤中使用。合适的克隆载体通常为技术人员所知。这类载体特别包括那些能够在微生物系统中复制的载体，即那些确保在酵母或真菌中有效克隆和那些有可能稳定转化植物的主要载体。那些特别可提及的载体是适用于T-DNA介导的转化的多种二元和共整合的载体系统。这类载体系统通常以其包含至少为农杆菌介导的转染所需的vir基因和T-DNA分界序列(T-DNA边界)为特征。这类载体系统还有利地包含其它顺式调节区域，如启动子和终止子序列和/或选择标记，其中已合适转化的生物通过选择标记可以鉴定。在共整合载体系统的情况下，vir基因和T-DNA序列在相同载体中排列，而二元系统至少以两个载体为基础，其中一个载体携带了vir基因但没有T-DNA，同时第二个载体携带了T-DNA而无vir基因。因此所提及的后一种载体相对较小，容易在大肠杆菌(E.coli)中和农杆菌中操作和复制。这类二元载体包括来自pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的载体。根据本发明，Bin19、pBI101、pBinAR、pGPTV和pCAMBIA优选使用。二元载体和它们的用途的综述可在Hellens等，Trends in Plant Science(2000)5，446-451中找到。为了制备载体，载体首先以限制性核酸内切酶线性化并且然后按照合适的方式进行酶修饰。此后纯化载体并且将一份纯化的载体用于克隆步骤。在克隆步骤中，使用连接酶将已经酶切割并且根据需要已纯化的扩增物与已按类似方式制备的载体片段克隆。在本上下文中，具体的核酸构建体、或载体或质粒构建体可具有一个或超过一个的编码性基因片段。将编码性基因片段在这些构建体中优选地与调节性序列有效连接。调节性序列尤其包括植物序列，如以上提到的启动子和终止子序列。这类构建体可在微生物，特别在大肠杆菌和根癌农杆菌中于选择性条件下稳定增殖并且有可能向植物或微生物中转移异源DNA。

方法中所用的核酸、发明性核酸和核酸构建体可有利地使用克隆载体向生物如微生物中或有利地向植物中导入，并且因此用于转化植物，如那些在《Plant Molecular Biology and Biotechnology》(1993年佛罗里达CRCPress出版社Boca Raton)第6/7章第71-119页；1993年Academic Press出版社Kung和R.Wu编辑的《Transgenic plants》第1卷《Engineering andUtilization》第15-38页F.F.White的Vectors for Gene Transfer inHigher Plants；1993年Academic Press出版社Kung和R.Wu编辑的《Transgenic plants》第1卷《Engineering and Utilization》第128-143中B.Jen es等，Techniques for Gene Transfer；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225中发表和引用的植物。因此方法中所用的核酸、创新的核酸和核酸构建体和/或载体可用于重组性修饰广泛类型的生物，有利地修饰植物，因此经重组性修饰的植物成为更好和/或更高效的PUFA生产者。

存在一系列可修饰Δ12去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ6去饱和酶和/或ω3去饱和酶蛋白质和方法中所用的其它蛋白质如Δ12去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶或Δ4去饱和酶蛋白质的机制，因此有利的多不饱和脂肪酸在植物、优选在油料作物植物或微生物中的产量、产生和/或产生效率由于经修饰的蛋白质可直接受到影响。Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶或Δ4去饱和酶蛋白质或基因的量或活性可以得到增加，因此产生了更大量的基因产物并且最终产生了更大量的通式I化合物。在向缺乏该化合物生物合成活性和能力的生物中导入相应基因之前，从头(de novo)合成也为可能。这类似地适用于脂肪酸和脂类代谢中的其它去饱和酶或延伸酶或其它酶的组合。利用多种趋异的序列即在DNA水平不同的序列在本上下文中也是有利的，或者利用基因表达的启动子也是有利的，其中所述的启动子可使不同基因的表达随时间过程不同，例如与种子或贮油组织成熟程度相关。

由于向生物中单独导入Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶和/或Δ4去饱和酶基因或与细胞中其它基因组合导入，不但有可能增加指向终产物的生物合成流，而且还有可能增加或产生全新的相应三酰甘油酯的组合物。

同样，可增加其它基因的数量或活性，其中所述的其它基因参与为一种或多种脂肪酸、油、极性和/或中性脂类的生物合成所需的营养素的输入，由此增加这些前体、辅因子或中间体在细胞中或贮存区室中的浓度，从而如以下描述可进一步增强细胞产生PUFA的能力。通过优化参与这类化合物生物合成的一种或多种Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶或Δ4去饱和酶的活性或增加其量，或通过破坏参与这些化合物降解的一种或多种基因的活性，有可能在生物中强化脂肪酸和脂类分子的产量、生产和/或生产效率。

本发明方法中所用的经分离的核酸分子编码这样的蛋白质或其部分，其中所述蛋白质或单个蛋白质或其部分包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138或SEQ ID NO：184中所示的氨基酸序列具有足够的同源性，因此所述蛋白质或其部分保留了Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶或Δ4去饱和酶的活性。由所述核酸分子编码的蛋白质或其部分优选地在生物中，有利地在植物中保留了它们的基本酶活性以及参与代谢细胞膜或脂肪体合成所需的化合物的能力，或参与跨越这类膜的分子运输的能力。所述核酸分子编码的蛋白质有利地具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ  ID  NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138或SEQ ID NO：184中所示氨基酸序列至少约50％、优选地至少约60％并且更优选地至少约70％、80％和90％并且最为优选地至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。为了本发明目的，将同源性或同源的分别理解为意指同一性或同一的。

可计算涵盖整个氨基酸或核酸序列区域的同源性。技术人员可获得基于多种序列比较的多种算法的一系列程序。这里Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法产生了尤其可靠的结果。作为GCG软件包[Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)]的部分的PileUp程序(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins等，CABIOS，51989：151-153)或Gap和BestFit程序[Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48；443-453(1970)和Smith及Waterman(Adv.Appl.Math.2；482-489(1981))用于序列比对。使用GAP程序和如下设置：缺口权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000和平均错配：0.000确定如以上以百分率所示的涵盖全长序列的序列同源性值。除非说明，这些设置总是作为标准设置用于序列比对。

本发明方法中所用的Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶或Δ4去饱和酶的基本酶活性理解为意指与序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：183和它们的衍生物所编码的蛋白质/酶比较，它们保留了至少10％，优选地为20％，尤其优选地为30％和非常尤其地为40％的酶活性并且因此可参与在生物中，有利地为在植物或在植物细胞中，或在分子跨膜运输中合成脂肪酸、脂肪酸酯如二酰甘油酯和/或三酰甘油酯所需的化合物的代谢，这意味着脂肪酸分子中C18，C20或C22碳链在至少两处，有利地在三、四、五或六处位置具有双键。

有利地用于方法的核酸可源自细菌、真菌、硅藻、动物如隐杆线虫或大马哈鱼属或者植物如藻类或者藓类如希瓦氏菌属、剑叶藓属、破囊壶菌属、镰孢属(Fusarium)、疫霉属、角齿藓属、Mantoniella、Ostreococcus、等鞭金藻属、Aleurita、Muscarioides、被孢霉属、琉璃苣属、褐指藻属、隐甲藻属，尤其来自虹鳟、非洲爪蟾、玻璃海鞘、假矮海链藻、Mantoniella squamata、Ostreococcus sp.、Ostreococcus tauri、细小裸藻、展叶剑叶藓、致病疫霉、Fusarium graminaeum、寇氏隐甲藻、角齿藓(Ceratodon purpureus)、球等鞭金藻(Isocrydid galbana)、Aleurita farinosa、破囊壶菌属的种、Muscarioides viallii、高山被孢霉、玻璃莴苣、三角褐指藻、秀丽线虫的属和种或尤其有利地来自虹鳟、细小裸藻、假矮海链藻或寇氏隐甲藻。

可在本发明方法中备选地使用编码Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶或Δ4去饱和酶并且与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：61，SEQ  ID  NO：63，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：105，SEQ ID NO：107，SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：117，SEQ ID NO：119，SEQ ID NO：131，SEQ ID NO：133，SEQ ID NO：135，SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：183中所示核酸序列在严格条件下有利杂交的核酸序列。

方法中所用的核酸序列有利地向表达盒导入，其中所述的表达盒有可能在生物如微生物或植物中表达这种核酸。

为达到此目的，将编码Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶或Δ4去饱和酶的核酸序列与有利地用于增强基因表达的一个或多个调节信号有效地连接。这类调节序列用于使基因和蛋白质特异性表达。根据宿主生物，这可以意味例如仅在导入已经发生后才表达和/或过表达这种基因，或立即表达和/或过表达这种基因。例如这些调节序列采取了诱导物和阻抑物结合的序列形式，因此控制这种核酸的表达。除了这些新的调节序列以外或作为这些序列的替代，这些序列的天然调节元件仍可在实际的结构基因之前存在并且根据需要可以如此方式加以遗传性修饰从而消除了它们的天然调节能力而且增强这些基因的表达。然而这种表达盒(表达构建体＝基因构建体)也可以更为简单地构建，也就是说在核酸序列或其衍生物的前面未插入额外的调节信号而且并不除去天然启动子和其调节功能。作为替代，天然调节序列已经以如此方式突变从而调节不再发生和/或增强了基因的表达。这些经修饰的启动子也可本身以部分序列的形式位于天然基因前(用于本发明核酸序列的一部分的启动子)以增强活性。而且这种基因构建体也可有利地包含与启动子有效连接的一个或多个称作增强子的序列，而这有可能增强核酸序列的表达。额外有利的序列如其它调节元件或终止子序列也可在DNA序列的3′端插入。Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6延伸酶和/或Δ9延伸酶基因可在表达盒(基因构建体)中存在单个或多个拷贝。优选地，仅仅这些基因的单个拷贝存在于每种表达盒中。这种基因构建体或这类基因构建体可在宿主生物中共同表达。在本上下文中，基因构建体可插入在一种或多种载体中并且在细胞中以游离的形式存在，或插入基因组中。当待表达的基因共同存在于一个基因构建体中时，其他基因在基因组中的插入有利的。

在本上下文中，调节序列或调节因子如上所述可优选地积极影响所导入基因的基因表达，从而增强基因表达。因此调节元件的增强过程可通过使用强转录信号如启动子和/或增强子有利地在转录水平上发生。此外例如通过改善mRNA的稳定性，经增强的翻译同样是可能的。

本发明的另一个实施方案是一种或多种这样的基因构建体，其中所述基因构建体包含一个或多个如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ  ID  NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：183所示的序列或其衍生物并且编码如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138或SEQ ID NO：184中所示的多肽。以上提到的Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶或Δ4去饱和酶蛋白质有利地使脂肪酸分子中有利地具有一个、二个、三个、四个、五个或六个双键并且有利地具有18、20或22个碳原子的底物去饱和或延伸。这同样适用于它们的同源物、衍生物或类似物，其与有利地增强基因表达的一个或多个调节信号有效连接。

用于新方法的有利的调节序列在例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR或λ-PL的启动子中存在并且有利地在革兰氏阴性菌中应用。其它有利的调节序列是例如革兰氏阳性启动子amy和SPO2、酵母或真菌启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH或者植物启动子CaMV/35S[Franck等，Cell 21(1980)285-294]、PRP1[Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)]、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或者泛蛋白或菜豆蛋白启动子中存在。可诱导启动子在本上下文中同样是有利的如在EP-A-0388186(苯磺酰胺可诱导)、Plant J.2，1992：397-404(Gatz等，四环素可诱导)、EP-A-0335528(脱落酸可诱导)或WO 93/21334(乙醇或环己醇可诱导)中的启动子。其它合适的植物启动子是马铃薯胞质FBP酶启动子或ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.8，1989，2445)、大豆磷酸核糖焦磷酸酰氨基转移酶启动子(GenbankAccession No.U87999)或在EP-A-0249676中所描述的结节特异性启动子。

尤其有利的启动子是有可能使得在参与脂肪酸生物合成的组织中表达的启动子。种子特异性的启动子如所描述的USP启动子非常尤其有利并且其它启动子如LeB4、DC3、菜豆蛋白或油菜籽蛋白启动子同样如此。进一步更有利的启动子是种子特异性启动子，这种启动子能用于单子叶或双子叶植物并且在US 5,608,152(油菜籽的油菜籽蛋白启动子)、WO 98/45461(拟南芥的油质蛋白启动子)、US 5,504,200(菜豆的菜豆蛋白启动子)WO 91/13980(芸苔的Bce4启动子)、Baeumlein等，Plant J.，2，2，1992：233-239(来自豆科植物的LeB4启动子)中描述。适于单子叶植物的启动子是例如大麦lpt-2或lpt-1启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)、大麦醇溶蛋白启动子和WO 99/16890中所描述的其它合适启动子。

原则上，对于新方法可使用所有天然启动子及其调节序列，如那些如上提及的天然启动子及其调节序列。也可有利地使用合成启动子，可组合或者单独地使用，尤其当这类合成启动子介导了种子特异性表达时，如那些WO 99/16890中所描述的启动子。

为了取得特别高的PUFA含量，尤其在转基因植物中，PUFA生物合成基因应当有利地在油料作物中以种子特异性的方式表达。为实现此目的，可使用种子特异性启动子或在胚和/或在胚乳中活跃的那些启动子。原则上，种子特异性启动子既可从双子叶植物也可从单子叶植物中分离。如下列出了优选的启动子：USP(未知种子蛋白质)和豌豆球蛋白(豌豆((Viciafaba))[等，Mol.Gen Genet.，1991，225(3)]，油菜籽蛋白(油菜籽)[US 5,608,152]、酰基载体蛋白(油菜籽)[US 5,315,001和WO92/18634]、油质蛋白(拟南芥)[WO 98/45461和WO 93/20216]、菜豆蛋白(菜豆)[US 5,504,200]、Bce4[WO 91/13980]、豆球蛋白B4(LegB4启动子)[等，Plant J.，2，2，1992]，Lpt2和lpt1(大麦)[WO95/15389和WO95/23230]、来自稻、玉米和小麦的种子特异性启动子[WO99/16890]、Amy32b、Amy 6-6和aleurain[US 5,677,474]、Bce4(油菜籽)[US 5,530,149]、大豆球蛋白(大豆)[EP 571741]、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(大豆)[JP 06/62870]、ADR12-2(大豆)[WO 98/08962]、异柠檬酸裂合酶(油菜籽)[US 5,689,040]或α淀粉酶(大麦)[EP 781849]。

植物的基因表达也可通过化学可诱导启动子促进(见于综述Gatz1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)。在需要以时间特异性方式进行基因表达时，这种化学可诱导启动子尤其合适。此类启动子的例子是水杨酸可诱导启动子(WO 95/19443)、四环素可诱导启动子(Gatz等(1992)Plant J.2，397-404)和乙醇可诱导启动子。

为确保这类生物合成基因经多个世代后仍然稳定地在转基因植物中整合，编码Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶和/或Δ4去饱和酶并且用于方法中的每种核酸应当在一个独立的启动子，优选地在不同于其它启动子的启动子控制下表达，因为重复序列基序可导致T-DNA不稳定或导致重组事件。在本上下文中，表达盒有利地按如此方式构建从而启动子后是适宜的切割位点，这个切割位点有利地位于多位点接头中以便插入将要表达的核酸，并且根据需要使终止子序列位于这个多位点接头的后面。上述的这种序列重复多次，优选地重复三、四或五次，由此多达五个基因可在一个构建体中组合并导入转基因植物中以便表达。这种序列有利地重复了多至三次。为了表达核酸序列，核酸序列通过例如多位点接头中的合适切割位点在启动子后面插入。每种核酸序列有利地具有自身的启动子并且根据需要具有自身的终止子序列。这类有利的构建体在例如DE 10102337或DE 10102338中公开。然而仍然可在启动子后面并且根据需要在终止子序列前插入多个核酸序列。这里表达盒中所插入核酸的插入位点或其序列并不特别重要，也就是说核酸序列可在表达盒中最先的位置或最末的位置插入而不显著地影响这种核酸序列的表达。不同的启动子例如USP、LegB4或DC3启动子和不同的终止子序列可有利地在表达盒中使用。然而也可在表达盒中只使用一种类型的启动子。但是这可能导致不为所需的重组事件。

如以上所述，已导入基因的转录应当通过位于已导入的生物合成基因3’端的合适终止子序列有利地终止(在终止密码子之后)。在本上下文中，可使用序列的例子是OCS 1终止子序列。如同启动子的情况，对每个基因应该使用不同的终止子序列。

如以上所述，基因构建体还可包含欲导入生物体的其它基因。向宿主生物中导入并且因此表达调节基因如诱导物、阻抑物或酶基因是可能并且有利的，其中这些诱导物、阻抑物或酶因其活性参与了生物合成途径中一种或多种基因的调节。这类调节基因可为异源或同源。而且脂肪酸或脂类代谢中的其它生物合成基因可在核酸构建体或基因构建体中有利地存在；然而这些基因还可以位于一种或多种其它核酸构建体中。优选使用的脂肪酸或脂类代谢中的生物合成基因是选自酰基辅酶A脱氢酶、酰基ACP[酰基载体蛋白]去饱和酶、酰基ACP硫酯酶、脂肪酸酰基转移酶、酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶、脂肪酸合成酶、脂肪酸羟化酶、乙酰基辅酶A羧化酶、酰基辅酶A氧化酶、脂肪酸去饱和酶、脂肪酸炔属酶、脂加氧酶、三酰甘油酯脂肪酶、环丙烯合酶、氢过氧化物裂合酶或脂肪酸延伸酶或它们组合的基因。尤其有利的核酸序列是脂肪酸或脂类代谢中的生物合成基因，这些生物合成基因选自酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶、ω3去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6延伸酶和/或Δ9延伸酶。

在本上下文中，以上提到的核酸或基因可与其它延伸酶和去饱和酶组合在以上提及的表达盒中克隆并在农杆菌属协助下转化植物。

这里调节序列或调节因子可如以上所述优选地积极影响已导入基因的表达，并且因此增强了已导入基因的表达。因此，调节元件的增强可通过使用强转录信号例如启动子和/或增强子有利地在转录水平发生。然而例如通过改善mRNA稳定性同样可增强翻译。原则上，这类表达盒可直接用于导入植物或导入载体。

这些有利的载体优选地表达载体包含编码Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶或Δ4去饱和酶并且用于方法中的核酸，或包含核酸构建体，其中所述核酸单独使用或者与脂肪酸或脂类代谢中的其它生物合成基因如酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶、ω3去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6延伸酶和/或Δ9延伸酶组合。如在本上下文中所用，术语“载体”指这样的核酸分子，其能够运输与这种核酸分子所结合的其它核酸。载体的一个类型是“质粒”，即额外的DNA片段可加以连入的环状双链DNA环。载体的另一个类型是病毒载体，对额外的DNA片段而言有可能向这种病毒的基因组内连接。某些载体能够在已导入这些载体的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制原点的细菌载体)。其它载体当向宿主细胞导入时有利地在宿主细胞的基因组内整合并且因此随宿主基因组一起复制。而且某些载体能够控制与这些载体有效连接的基因的表达。这些载体在本上下文中称为“表达载体”。通常适用于DNA重组技术的表达载体采用了质粒的形式。在本说明书中由于质粒是最常用的载体形式，故“质粒”和“载体”可交互使用。然而本发明还将覆盖具有类似功能的其它形式的表达载体如病毒载体。而且术语“载体”还将包含技术人员熟知的其它载体如噬菌体、病毒如SV40、CMV、TMV、转座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘粒、线形或环形DNA。

有利地在方法中使用的重组表达载体包含具有宿主细胞中适于所用核酸表达的形式的如下所述核酸或以上提及的基因构建体，即所述重组表达载体包含基于用于表达的宿主细胞所选择的一种或多种调节序列，其中这种(类)调节序列有效地与将要表达的核酸序列连接。在重组表达载体中，“有效连接的”意指将目的核苷酸序列与调节序列以如此方式连接即有可能使这种核苷酸序列表达并且它们彼此连接而使这两类序列(例如在体外转录/翻译系统中，或如果载体导入了宿主细胞，在宿主细胞中)都执行了属于各序列的预期功能。术语“调节序列”旨在包含启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。这些调节序列在例如Goeddel：Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，CA(1990)一书中描述或参见：Gruber和Crosby，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy，CRC Press，BocaRaton，Florida，Glick和Thompson编著，Chapter 7，89-108，包括其中引用的参考文献。调节序列包含那些在多种类型的宿主细胞中控制核苷酸序列组成型表达的调节序列和那些控制核苷酸序列仅仅在特定的宿主细胞中于特定条件下直接表达的调节序列。技术人员知道表达载体的设计可依赖多种因素如待转化的宿主细胞的选择、蛋白质的目的表达水平及其它因素。

所用的重组表达载体可设计用于在原核或真核细胞中表达Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶和/或Δ4去饱和酶。为方便起见，载体构建的中间步骤常在微生物中实施，因此这样设计是有利的。例如Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶和/或Δ4去饱和酶基因可使用载体按照如WO 98/01572中所描述的转化方法在细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母和其它真菌细胞(见Romanos，M.A.等(1992)“Foreign geneexpression in yeast：a review”，Yeast 8：423-488：van den Hondel、C.A.M.J.J.等.(1991)“Heterologous gene expression in filamentous fungi”，in：More Gene Manipulations in Fungi，J.W.Bennet和L.L.Lasure编辑，第396-428页：Academic Press：San Diego：和van den Hondel、C.A.M.J.J.&Punt，P.J.(1991)”Gene transfer systems and vectordevelopment for filamentous fungi，in：Applied Molecular Genetics ofFungi，Peberdy，J.F.等编辑，第1-28页Cambridge University Press：Cambridge)、藻类(Falciatore等，1999，Marine Biotechnology.1，3：239-251)、多种类型的纤毛虫：Holotrichia，缘毛亚纲(Peritrichia)，旋毛亚纲(Spirotrichia)，吸管亚纲(Suctoria)，四膜虫(Tetrahymena)，草履虫(Paramecium)，豆形虫(colpidium)，瞬目虫(Glaucoma)，匙口虫(Platyophrya)，Potomacus，Desaturaseudocohnilembus，游仆虫(Euplotes)，Engelmaniella和stylonychia(Stylonychia)，尤其是Stylonychia lemnae并且优选地在多细胞植物的细胞中(见Schmidt，R.和Willmitzer，L.(1988)“High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledonexplants”Plant Cell Rep.：583-586；Plant Molecular Biology andBiotechnology，C Press，Boca Raton，Florida，Chapter 6/7，pp.71-119(1993)；F.F.White，B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，in：Transgenic Plants，第一卷，Engineering and Utilization，Ed.：Kung和R.Wu，Academic Press(1993)，128-43；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225(并且其中所应用的参考文献))表达。合适的宿主细胞在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中详细讨论。作为备选，重组表达载体可例如使用T7-启动子调节序列和T7-聚合酶体外转录和翻译。

在大多数情况下，原核生物中蛋白质的表达涉及使用包含控制融合或非融合蛋白质表达的组成型或可诱导启动子的载体。典型的融合表达载体尤其为pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其中谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白和蛋白A分别与重组靶蛋白融合。

合适的可诱导的非融合大肠杆菌表达载体的例子尤其为pTrc(Amann等(1988)Gene 69：301-315)和pET 11d(1990年加利福尼亚圣迭哥Academic Press出版社《Methods in Enzymology》185的Studier等《GeneExpression Technology》第60-89页)。靶基因自pTrc载体的表达是基于宿主RNA聚合酶自杂合trp-lac融合启动子的转录。靶基因自pET 11d载体的表达是基于经共表达的病毒RNA聚合酶(T7-gn1)所介导的T7-gn10-lac融合启动子的转录，这种病毒RNA聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)的定居λ-原噬菌体提供，其中所述定居λ-原噬菌体携带了受lacUV 5启动子转录控制的T7gn1基因。

其它适用于原核生物的载体为技术人员所知，这类载体是例如大肠杆菌的pLG338、pACYC184、pBR系列如pBR322、pUC系列如pUC18或pUC19、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI，链霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，芽孢杆菌属中的pUB110、pC194或pBD214，棒杆菌属中的pSA77或pAJ667。

在另一个实施方案中，表达载体是酵母表达载体。用于酿酒酵母中表达的载体的例子包含pYeDesaturasec1(Baldari等.(1987)Embo J.6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等(1987)Gene 54：113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)。用于构建适用于其它真菌如丝状真菌的载体和构建方法包含在1991年剑桥大学的剑桥大学出版社J.F.Peberdy等编辑的《Applied Molecular Genetics of fungi》第1-28页，van den Hondel、C.A.M.J.J；和Pun，P.J.的“Gene transfer systems and vector developmentfor filamentous fungi”中或在《More Gene Manipulations in Fungi》[圣迭哥Academic Press出版社J.W.Bennet和L.L.Lasure编辑，第396-428页]中所详细描述的那些载体和方法。其它合适的酵母载体为例如pAG-1、YEp6、YEp13和pEMBLYe23。

作为备选，Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶和/或Δ4去饱和酶可在昆虫细胞中用杆状病毒载体表达。可用于在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒表达载体包含pAc系列(Smith等(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39)。

以上提到的载体仅概略回顾了可能适合的载体。其它的质粒为技术人员所知并且在例如《Cloning vector》(1985年阿姆斯特旦-纽约-牛津Elsevier出版社，Pouwels，P.H.等编辑，ISBN 0444904018)中描述。对于其它合适用于原核及真核细胞的表达系统，见1989年纽约冷泉港ColdSpring Harbor Laboratory出版社，Sambrook，J.、Fritsch，E.F.和Maniatis，T.的《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》第二版第16和第17章中的描述。

在方法的又一个实施方案中，Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶和/或Δ4去饱和酶可在单细胞植物细胞(如藻类)中表达，参见Falciatore等，1999，Marine Biotechnology 1(3)：239-251及其中引用的参考文献，并且可在高等植物的植物细胞中表达(如种子植物例如耕作作物)。植物表达载体的例子包括在1992年Becker，D.、Kemper，E.、Schell，J.和Masterson，R.“New plant binary vectors with selectable markers locatedproximal to the left border”，Plant Mol.Biol.20：1195-1197；和1984年Bevan，M.W.“Binary Agrobacterium vectors for plant transformation”，Nucl.Acids Res.12：8711-8721；在1993年Academic Press出版社Kung和R.Wu编辑的《Transgenic Plants：第1卷Engineering and Utilization》第15-38页的Vectors for Gene Transfer in Higher Plants中所详细描述的那些植物表达载体。

植物表达盒优选地包含能够在植物细胞中控制基因表达并且有效连接的调节序列，如此使每一种序列能够实现它的功能，例如多聚腺苷酸化信号的转录终止功能。优选的多聚腺苷酸化信号是衍生自根癌农杆菌T-DNA如Ti质粒pTiACH5(1984年Gielen等，EMBO J.3期，835等)的基因3的那些多聚腺苷酸化信号，其中已知基因3是章鱼氨酸合酶，或者是那些多聚腺苷酸化信号的等同物，但是所有其它在植物中具有功能性活性的终止子序列同样合适。

由于植物基因表达通常不限于在转录水平，植物表达盒优选地包含其它有效连接的序列如翻译增强子例如超驱动序列，所述的超驱动序列增强烟草花叶病毒5’-非翻译前导序列，这种前导序列提高了蛋白质/RNA比(Gallie等，1987，Nucl.Acids Research 15：8693-8711)。

如以上所述，植物基因表达必须有效地与合适启动子连接，其中这种启动子引发基因以正确的时间过程或以细胞或组织特异性方式表达。可使用的启动子是组成型启动子(Benfey等，EMBO J.8(1989)2195-2202)，例如那些衍生自植物病毒如35S CaMV(Franck等，Cell 21(1980)285-294)、19S CaMV(也见US 5352605和WO 84/02913)的启动子或植物启动子如在US 4,962,028中所描述Rubisco亚单位的启动子。

用于在植物基因表达盒中有效连接的其它优选的序列是靶向序列，其中这种靶向序列为基因产物向该基因产物对应的细胞区室中(见Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15，4(1996)285-423的综述及其引用的参考文献)例如向液泡、细胞核、所有类型质体如造粉体、叶绿体、色质体、胞外空间、线粒体、内质网、油质体、过氧化物酶体和植物细胞的其它区室中导入所需。

如以上所述，植物基因表达还可以通过化学可诱导启动子(见Gatz1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108的综述)实现。当希望基因表达需以时间特异性发生时，化学可诱导启动子尤其适合。这类启动子的例子是水杨酸可诱导启动子(WO 95/19443)、四环素可诱导启动子(Gatz等(1992)Plant J.2，397-404)和乙醇可诱导启动子。

对生物性或非生物应激条件反应的启动子如病原诱导的PRP1基因启动子(Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)361-366)、热诱导的番茄hsp80启动子(US 5,187,267)、冷冻诱导的马铃薯α淀粉酶启动子(WO96/12814)或外伤诱导的pinII启动子(EP-A-0375091)同样适合。

那些在进行脂肪酸、脂类和油生物合成的组织和器官中，在种子细胞如胚乳细胞和发育胚的细胞中引起基因表达的启动子尤其有利。这类合适的启动子是油菜籽的油菜籽蛋白启动子(US 5,608,152)、蚕豆的USP启动子(Baeumlein等，Mol Gengenet，1991，225(3)：459-67)、拟南芥的油质蛋白启动子(WO 98/45461)、菜豆的菜豆蛋白启动子(US 5,504,200)、芸苔属的Bce4启动子(WO 91/13980)或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等，1992，Plant Journal，2(2)：233-9)及在单子叶植物如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等中引起种子特异性表达的启动子。重要的合适启动子是大麦的lpt2或lpt1基因启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或WO 99/16890中所描述来自大麦的大麦醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的谷醇溶蛋白基因、小麦的麦醇溶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高梁的kasirin基因或黑麦的裸麦醇溶蛋白基因的启动子。

引起方法中所用的Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶和/或Δ4去饱和酶的多重平行表达可能尤为所需。这类表达盒可通过同时转化多种单独的表达构建体，或优选地通过在一个载体构建体上组合多种表达盒而产生。同样在每一情况下多种载体可以用多重表达盒转化然后向宿主细胞转移。

因为质体是合成脂类生物合成的前体和某些终产物的区室，同样尤其适合的其它启动子是那些引起质体特异性表达的启动子。这类合适的启动子如病毒RNA聚合酶启动子在WO 95/16783和WO 97/06250中描述以及来自拟南芥的clpP启动子在WO 99/46394中描述。

载体DNA可通过常规的转化或转染技术向原核和真核细胞内导入。术语“转化”和“转染”、接合和转导如在本上下文中所用，旨在包含本领域众知的用于向宿主细胞内导入外源核酸(如DNA)的多种方法，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体转染、天然感受态、化学介导的转移、电穿孔或粒子轰击。适用于转化或转染包括植物细胞在内的宿主细胞的方法可在Sambrook等(1989年纽约冷泉港ColdSpring Harbor Laboratory出版社《Molecular Cloning：A LaboratoryManual》第二版)和其它的实验室教材如1995年新泽西Totowa的HumanaPress出版社《Methods in Molecular Biology》第44卷Gartland和Davey编辑的《Agrobacterium protocols》中找到。

适于摄入本发明的核酸、本发明的基因产物或本发明的载体的宿主细胞是所有原核或真核生物。有利使用的宿主生物是微生物如真菌或酵母或者植物细胞，优选植物或其部分。优选使用真菌、酵母或植物，尤其优选使用植物，非常尤其优选使用具有高脂类化合物的植物如油料作物，例如油菜籽、月见草、大麻、大蓟、花生、卡诺拉油菜、亚麻子、大豆、红花、向日葵、琉璃苣，或植物如玉米、小麦、黑麦、燕麦、小黑麦、稻、大麦、棉、木薯、胡椒、万寿菊，茄科植物如马铃薯、烟草、茄和番茄、豌豆属的种、豌豆、紫花苜蓿，灌木植物(咖啡、可可、茶)，柳属的种、树(油棕榈，椰子)和宿生牧草及饲料作物。本发明尤其优选的植物是油料作物如大豆、花生、油菜籽、卡诺拉油菜、亚麻子、大麻、月见草、向日葵、红花、树(油棕榈、椰子)。

本发明还涉及编码具有Δ5延伸酶活性的多肽的上述经分离核酸序列，其中由这种核酸序列所编码的延伸酶转化具有一个双键的C16和C18脂肪酸并且有利地转化具有一个Δ6双键的多不饱和C18脂肪酸以及具有一个Δ5双键的多不饱和C20脂肪酸。这种延伸酶不延伸C22脂肪酸。

有利的经分离的核酸序列是编码具有Δ5延伸酶活性并且包含选自具有序列SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：139、SEQ IDNO：140、SEQ ID NO：141或SEQ ID NO：142中所示氨基酸序列的多肽的核酸序列。

其它有利的经分离的核酸序列是编码具有Δ5延伸酶活性并且包含选自如下的氨基酸序列组合的多肽的核酸序列：

a)SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：115和SEQ IDNO：140或者SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：140；或

b)SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：116和SEQ IDNO：142或者SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：142；或

c)SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：140或者SEQID NO：116、SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：142。

编码具有Δ5延伸酶活性的多肽的优选核酸序列有利地包含以上提及的氨基酸序列。以上提及的氨基酸序列在表2中较详细地描述。

尤其有利的经分离的核酸序列是选自如下的核酸序列：

a)具有SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63；SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ IDNO：113、SEQ ID NO：131或SEQ ID NO：133中所示序列的核酸序列，

b)作为遗传密码简并性的结果，可从SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：60、SEQ IDNO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：132或SEQ ID NO：134中所示氨基酸序列衍生的核酸序列，或

c)SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63；SEQID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：131或SEQ ID NO：133中所示核酸序列的衍生物，其中这种核酸序列的衍生物编码与SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：84、SEQID NO：86、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：132或SEQ ID NO：134在氨基酸水平具有至少40％同源性的多肽并且具有Δ5延伸酶活性。

本发明还涉及如以下所编号并且编码Δ6延伸酶、ω3去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶或Δ12去饱和酶的核酸序列。

其它有利的经分离的核酸序列是选自如下的核酸序列：

a)具有SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：111或SEQ ID NO：183中所示序列的核酸序列，

b)作为遗传密码简并性的结果，可从SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：184中所示氨基酸序列衍生的核酸序列，或

c)SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：111或SEQ ID NO：183中所示核酸序列的衍生物，其中这种核酸序列的衍生物编码与SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：112或SEQ IDNO：184在氨基酸水平具有至少40％同源性的多肽并且具有Δ6延伸酶活性。

编码具有ω3去饱和酶活性的经分离的核酸序列，其选自：

a)具有SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：105中所示序列的核酸序列，

b)作为遗传密码简并性的结果，可从SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：106中所示氨基酸序列衍生的核酸序列，或

c)SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：105中所示核酸序列的衍生物，其中这种核酸序列的衍生物编码与SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：106在氨基酸水平具有至少60％同源性的多肽并且具有ω3去饱和酶活性.

编码具有Δ6去饱和酶活性的经分离的核酸序列，其选自：

a)具有SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：97中所示序列的核酸序列，或

b)作为遗传密码简并性的结果，可从SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：98中所示氨基酸序列衍生的核酸序列，或

c)SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：97中所示核酸序列的衍生物，其中这种核酸序列的衍生物编码与SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：98在氨基酸水平具有至少40％同源性的多肽并且具有Δ6去饱和酶活性。

编码具有Δ5去饱和酶活性的经分离的核酸序列，其选自：

a)具有SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：99或SEQID NO：101中所示序列的核酸序列，或

b)作为遗传密码简并性的结果，可从SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：100或自SEQ ID NO：102中所示氨基酸序列衍生的核酸序列，或

c)SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：101中所示核酸序列的衍生物，其中这种核酸序列的衍生物编码与SEQ IDNO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：102在氨基酸水平具有至少40％同源性的多肽并且具有Δ5去饱和酶活性。

编码具有Δ12去饱和酶活性的经分离的核酸序列，其选自：

a)具有SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：103中所示序列的核酸序列，或

b)作为遗传密码简并性的结果，可从SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：104中所示氨基酸序列衍生的核酸序列，或

c)SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：103中所示核酸序列的衍生物，其中这种核酸序列的衍生物编码与SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：104在氨基酸水平具有至少40％同源性的多肽并且具有Δ6去饱和酶活性。

编码具有Δ12去饱和酶活性的经分离的核酸序列，其选自：

a)具有SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：109中所示序列的核酸序列，或

b)作为遗传密码简并性的结果，可从SEQ ID NO：108或SEQ ID NO：110中所示氨基酸序列衍生的核酸序列，或

c)SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：109中所示核酸序列的衍生物，其中所述的衍生物编码与SEQ ID NO：108或SEQ ID NO：110在氨基酸水平具有至少50％同源性的多肽并且具有Δ12去饱和酶活性。

本发明以上提及的核酸序源自能合成PUFA的生物如非人类动物、纤毛虫、真菌、植物如藻类或腰鞭毛虫(dinofalgellates)。

以上提及的经分离的核酸序列有利地源自鲑形目、爪蟾科或海鞘科、硅藻的海链藻属或隐甲藻属，或者源自草绿藻科例如Ostreococcus属、或裸藻科如裸藻属、或疫霉科例如疫霉属。

本发明还涉及如以上所述编码具有ω3去饱和酶活性的多肽的经分离核酸序列，其中这种核酸序列所编码的ω3去饱和酶转化具有二、三、四或五个双键的C18、C20和C22脂肪酸并且有利地转化具有二或三个双键的多不饱和C18-脂肪酸和具有二、三或四个双键的C20-脂肪酸。这种ω3去饱和酶也可使具有四个或五个双键的C22-脂肪酸去饱和。

如以上所述，本发明还涉及编码具有Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶和Δ6去饱和酶活性的多肽的经分离核酸序列，其中由这些核酸序列所编码的Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶和Δ6去饱和酶转化具有一、二、三、四或五个双键的C18、C20和C22脂肪酸并且有利地转化具有一、二或三个双键的多不饱和C18脂肪酸如C18:1Δ9、C18:2Δ9，12或C18:3Δ9，12，15，有利地转化具有三或四个双键的多不饱和C20脂肪酸如C20:3Δ8，11，14或C20:4Δ8，11，14，17或有利地转化具有四或五个双键的多不饱和C22脂肪酸如C22:4Δ7，10，13，16或C22:5Δ7，10，13，16，19。这些脂肪酸有利地在磷脂或者辅酶A脂肪酸酯中去饱和，有利地在辅酶A脂肪酸酯中去饱和。

在一个有利的实施方案中，术语“核酸(分子)”如在本上下文中所用还包含位于编码区的3’端和5’端的非翻译序列：位于编码区5’端上游序列的至少500个，优选200个，尤其优选100个核苷酸序列和位于编码区的3’端下游序列的至少100个，优选50个，特别优选20个核苷酸的序列。

“经分离的”核酸分子独立于在这种核酸的天然来源中存在的其它核酸分子。“经分离的”核酸优选地不具备这种核酸所来源的生物的基因组DNA中天然分布于这种核酸两侧的序列(例如位于这种核酸序列的5’端和3’端的序列)。在不同的实施方案中，经分离的Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶或Δ4去饱和酶的核酸分子可包含例如小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，而这些核苷酸序列在来源于这类核酸分子所来源的细胞的基因组DNA中天然地分布在这类核酸分子的两侧。

方法中所用的核酸分子，例如具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：183的核苷酸序列或者其部分的核酸分子可使用分子生物学标准技术和这里提供的序列信息分离。DNA或氨基酸水平的同源序列或同源的保守序列区域例如还可在比较性算法的协助下鉴定。它们可用作杂交探针和用于标准杂交技术(例如在1989年纽约冷泉港Cold Spring Harbor Laboratory出版社《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》第二版所描述的那些探针和标准杂交技术)以分离可用于方法的其它核酸序列。而且包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：183的完整序列或其部分的核酸分子可通过聚合酶链反应分离，其中寡核苷酸引物以这种序列或其部分为基础使用(例如包含完整序列或其部分的核酸分子通过以相同的序列为基础所产生的寡核苷酸引物进行的聚合酶链反应分离)。例如mRNA可从细胞中分离(如通过Chirgwin等(1979)Biochemistry 18：5294-5299的硫氰酸胍提取方法)和通过逆转录酶获得cDNA(例如可以用从Gibco/BRL、Bethesda、MD获得的莫洛尼MLV逆转录酶或可以用从Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL获得的AMV逆转录酶)。用于聚合酶链反应扩增的合成寡核苷酸引物可基于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：183中所示的一种序列产生或在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138或SEQ ID NO：184中详述的氨基酸序列协助下产生。本发明的核酸可使用cDNA或备选地使用基因组DNA作为模板并且使用合适的寡核苷酸引物通过标准PCR扩增技术扩增。所扩增的核酸因此可向合适的载体克隆并且通过DNA序列分析描述特征。与去饱和酶核苷酸序列对应的寡核苷酸可通过标准合成方法如使用自动DNA合成仪产生。

与具有序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：183的Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶或Δ4去饱和酶的核酸序列的同源物意指例如与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：183中所示的核苷酸序列或其同源物、衍生物或类似物或者它们的部分具有至少约50或60％，优选地具有至少约60或70％，更为优选地具有至少约70或80％、90％或95％并且甚至更为优选地具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性或同源性的等位基因变体。具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：183中所示诸核苷酸序列之一或其部分杂交的核苷酸序列的经分离核酸分子可在例如严格条件下进行杂交。根据本发明，将其部分理解为意指至少25个碱基对(bp)、50bp、75bp、100bp、125bp或150bp，优选至少175bp、200bp、225bp、250bp、275bp或300bp，尤其优选350bp、400bp、450bp、500bp或更多的碱基对为杂交所用。全长序列的使用同样是可能并且有利的。等位基因变体尤其包含功能性变体，这种功能性变体可自/向SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：183中所详述序列通过核苷酸的删除、插入或替代而获得，然而即便由于插入了一个或多个核苷酸，预计所合成的最终蛋白质的酶活性仍然有利地得以保留。保留了Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶或Δ4去饱和酶的酶活性的蛋白质，即蛋白质的酶活性基本上未减少意指与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：183所编码的蛋白质比较，这类蛋白质具有至少10％，优选地具有20％，尤其优选地具有30％，非常尤其优选地具有40％的原初酶活性。计算了涵盖整个氨基酸或核酸序列区域的同源性。技术人员可获得基于多种序列比较的多种算法的一系列程序。这里Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法产生了尤其可靠的结果。这里作为GCG软件包[Genetics Computer Group，575 ScienceDrive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)]的部分的PileUp程序(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins等，CABIOS，51989：151-153)或Gap和BestFit程序[Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48；443-453(1970)和Smith及Waterman(Adv.Appl.Math.2；482-489(1981))用于序列比对。使用GAP程序并如下设置：缺口权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000和平均错配：0.000测定了如以上以百分率所示的涵盖全长序列的序列同源性值。除非另有说明，这些设置总是作为标准设置用于序列比对。

SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：183的同源物同样意指例如细菌、真菌和植物的同源物、经截短的序列、编码和非编码的DNA序列的单链DNA或单链RNA。

SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：183的同源物还意指衍生物例如启动子变体。通过交换一个或多个核苷酸、通过(多次)插入和/或(多次)删除可修饰位于所详述的核苷酸序列上游的启动子同时并未不利地影响这种启动子的功能或活性。进一步有可能通过修饰启动子序列增强启动子的活性或者有可能以包括来自异源生物的启动子在内的更为活跃的启动子完全取代这类启动子。

将具有Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ9延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ5延伸酶和/或Δ4去饱和酶活性并且参与脂类和脂肪酸、PUFA辅因子和酶的代谢或参与亲脂化合物跨膜运输的以上提及的核酸和蛋白质分子在本发明的方法中使用，以便在转基因植物有利地在植物如玉米、小麦、黑麦、燕麦、小黑麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、亚麻属的种例如亚麻子或亚麻，芸苔属的种例如油菜籽、卡诺拉油菜和芜箐、胡椒、向日葵、琉璃苣、月见草和万寿菊，茄科的植物例如马铃薯、烟草、茄和番茄，豌豆属的种，豌豆，木薯，紫花苜蓿，灌木植物(咖啡、可可、茶)，柳属的种，树(油棕榈、椰子)和宿生牧草和饲料作物中调节PUFA的产生，所述的调节为直接调节(例如当脂肪酸生物合成中的蛋白质过表达或优化表达对经修饰的生物中脂肪酸的产量、生产和/或生产效率有直接影响时)和/或具有间接影响，然而这种间接效果无论如何总是引起了PUFA产量、生产和/或生产效率的增强或所不需的化合物的减少(例如当调节细胞中脂类和脂肪酸、辅因子和酶的代谢引起了所需化合物的产量、生产和/或生产效率的改变或细胞中目的化合物组分的改变，而这反过来又可影响一种或多种脂肪酸时)。

多种前体分子和生物合成酶的组合导致了多种脂肪酸分子的产生，这决定性地影响了脂类组成，因为多不饱和脂肪酸(PUFA)不仅掺入三酰甘油酯而且也掺入膜脂类。

芸苔科、紫草科、报春花科或亚麻科特别适于产生PUFA如硬脂艾杜糖酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。亚麻籽(linum usitatissimum)尤其有利地适合以本发明所述的核酸序列组合其它去饱和酶和延伸酶用于产生PUFA。

脂类合成可划分为两个阶段：脂肪酸的合成和它们与sn-甘油-3-磷酸的结合及极性首基的添加或修饰。通常用于膜中的脂类包含磷脂类、糖脂类、鞘脂类和磷酸甘油酯。脂肪酸的合成始于通过乙酰基辅酶A羧化酶将乙酰基辅酶A转化为丙二酸单酰辅酶A或通过乙酰基转酰基酶将乙酰基辅酶A转化为乙酰基ACP。这两种产物分子在缩合反应后共同形成了乙酰乙酰基ACP，这种分子经一系列缩合、还原和脱水反应转化，因而获得了具有所需链长度的饱和脂肪酸分子。从这些分子产生不饱和脂肪酸的过程由特异性去饱和酶通过分子氧有氧性地催化，或者无氧性地催化(关于在微生物中合成脂肪酸，见F.C.Neidhardt等(1996)E.coli and Salmonella.ASM Press：Washington，D.C.第612-636页和其中所引用的参考文献；Lengeler等(Ed.)(1999)Biology of Procaryotes.Thieme：Stuttgart，New York和其中的参考文献及Magnuson，K.，等(1993)MicrobiologicalReviews 57：522-542和其中的参考文献)。为进一步实施延伸步骤，所得的与磷脂结合的脂肪酸必须返回至脂肪酸辅酶A酯库。酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶实施此步骤。而且这些酶能够将已延伸的脂肪酸从辅酶A酯再次转移至磷脂。根据需要可以重复这种反应顺序。

用于生物合成PUFA的前体的例子是油酸、亚油酸和亚麻酸。必须将C18碳的脂肪酸延伸至C20和C22以获得二十和二十二链型的脂肪酸。在方法中所用的去饱和酶如Δ12、ω3、Δ4、Δ5、Δ6和Δ8去饱和酶和/或Δ5、Δ6、Δ9延伸酶的协助下，可以获得花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸，有利地获得二十碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸并且可在涉及食品、饲料、化妆品或药品方面的多种用途中应用。以上提到的酶可用于制备脂肪酸分子中具有至少两个双键，有利地具有至少三、四、五或六个双键的C20和/或C22脂肪酸，优选地制备在脂肪酸分子中有利地具有四个、五个或六个双键的C20或C22脂肪酸。去饱和可在延伸所讨论的脂肪酸之前或之后发生。这是为什么去饱和酶活性的产物和其它可能的去饱和延伸步骤的产物产生了具有更高去饱和程度的优选PUFA的原因，包括将C20至C22脂肪酸进一步延伸为如γ-亚麻酸、二高γ-亚麻酸、花生四烯酸、硬脂艾杜糖酸、二十碳四烯酸或二十碳五烯酸的脂肪酸。本发明方法中所用的去饱和酶和延伸酶的底物是C16、C18或C20脂肪酸例如亚油酸、γ-亚麻酸、α-亚麻酸、二高γ-亚麻酸、二十碳四烯酸或硬脂艾杜糖酸。优选的底物是亚油酸、γ-亚麻酸和/或α-亚麻酸、二高γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸或二十碳五烯酸。脂肪酸中具有至少两、三、四、五或六个双键的所合成的C20或C22脂肪酸在本发明的方法中以游离脂肪酸形式或以其酯形式如以其甘油酯形式获得。

将术语“甘油酯”理解为意指用一、二或三个羧基所酯化的甘油(单酰甘油、二酰甘油或三酰甘油)。将“甘油酯”理解为意指多种甘油酯的混合物。甘油酯或甘油酯的混合物可以包含其它添加物例如游离脂肪酸、抗氧化剂、蛋白质、糖类、维生素和/或其它物质。

为了本发明的目的，也将“甘油酯”理解为意指甘油衍生物。除以上所描述的脂肪酸甘油酯以外，这些甘油衍生物还包括甘油磷脂和甘油糖脂。可在本上下文中提到的优选的例子为甘油磷脂如卵磷脂(磷脂酰胆碱)、心磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸和烷基酰基甘油磷脂。

而且随后脂肪酸必须易位至不同的修饰位点并且掺入三酰甘油酯贮藏脂。脂类合成的又一个重要步骤是例如通过甘油脂肪酸酰基转移酶将脂肪酸转移至极性首基(见Frentzen，1998，Lipid，100(4-5)：161-166)。

关于植物脂肪酸生物合成、去饱和、脂类新陈代谢和脂类化合物的膜运输、β氧化、脂肪酸修饰和辅因子、三酰甘油酯贮藏和三酰甘油酯组装的发表物，包括其中的参考文献参见如下文章：1997年JK Setlow编辑的《Genetic Engeneering》19第149-166页Kinney；Ohlrogge和Browse，1995，Plant Cell 7：957-970；Shanklin和Cahoon，1998，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.49：611-641；1996年JK Setlow编辑的《Genetic Engeneering》18第111-13页Voelker；Gerhardt，1992，Prog.Lipid R.31：397-417；Gühnemann-和Kindl，1995，Biochim.Biophys Acta 1256：181-186；Kunau等，1995，Prog.Lipid Res.34：267-342；Rockville美国植物生理学学会1993年Murata和Somerville编辑的《Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and StorageLipids of Plants》第150-158页Stymne等；Murphy和Ross 1998，PlantJournal.13(1)：1-16。

方法中所产生的PUFA包含高等动物不再能合成并且因此必须摄入的一组分子或者高等动物不再能自行足量地合成并且因此必须摄入额外量的一组分子，虽然这类PUFA易于由其它生物例如细菌合成，但是猫不再能合成花生四烯酸。

为了本发明目的将磷脂理解为意指磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油和/或磷脂酰肌醇，有利地为磷脂酰胆碱。术语“产生”或“生产量(productivity)”在本领域内为公知并且包含在特定时间段内和在特定发酵体积内形成的发酵产物(式I化合物)的浓度(例如kg产物每小时每升)。这个术语还包含在植物细胞或植物中的生产量，也即相对于这种细胞或植物中所有脂肪酸含量，方法中所产生的目的脂肪酸的含量。术语“产生效率”包含为获得特定产量所需的时间(如细胞需要用于建立精细化学品的某种流通量速率的时间)。术语产量或产物/碳产量为本领域公知并且包含将碳源转化为产物(即精细化学品)的效率。例如通常将产量表述为每公斤碳源kg产物。通过增加化合物的产量或产生，增加了在特定培养基中经特定时间段所获得这种化合物的分子的量或所获得的该化合物的合适分子的量。术语“生物合成”或“生物合成途径”为本领域所知并且包含例如在多步骤且受强烈调控的过程中通过细胞从中间体合成化合物，优选地合成有机化合物。术语“分解代谢或分解代谢的途径”为本领域所知并且包含例如在多步骤且受强烈调控的过程中由细胞切割化合物，优选地切割有机化合物以产生分解代谢产物(以更为通俗的术语描述，较小的或复杂度较低的分子)。术语代谢为本领域所知并且包含生物中发生的全部生物化学反应。某种化合物的代谢(例如脂肪酸的代谢)因此包含与这种化合物有关的细胞中该化合物全部的生物合成途径、修饰途径和分解途径。

在又一个实施方案中，SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133或SEQ ID NO：183中所代表的本发明的核酸分子衍生物编码与SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134或SEQ ID NO：184的全长氨基酸序列具有至少40％，有利地具有约50或60％，有利地具有至少约60或70％和更优选地具有至少约70或80％、80至90％、90至95％以及最为优选地具有至少约96％、97％、98％、99％或更高同源性(同一性)的蛋白质。计算了涵盖整个氨基酸或核酸序列区域的同源性。作为GCG软件包[Genetics  Computer  Group，575Science  Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)]的部分的PileUp程序(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins等，CABIOS，51989：151-153)或Gap和BestFit程序[Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48；443-453(1970)和Smith及Waterman(Adv.Appl.Math.2；482-489(1981))用于序列比对。使用BestFit程序和如下设置：缺口权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000和平均错配：0.000确定了如以上以百分率所显示的覆盖全序列的序列同源性值。除非另外说明，这些设置总是用作标准设置用于序列比对。

本发明进一步包含由于遗传密码子简并而不同于SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133或SEQ ID NO：183中所示诸核苷酸序列之一并且因此编码与SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133或SEQ ID NO：183中所示那些核苷酸序列编码相同的Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶或Δ6延伸酶的核酸分子(和其部分)。

除了在SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133或SEQ ID NO：183中所示的Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶或Δ6延伸酶以外，技术人员将认识到引起Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶和/或Δ6延伸酶的氨基酸序列改变的DNA序列多态性可在群体中存在。Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶和/或Δ6延伸酶基因中的这类遗传多态性可因为天然变异在群体中的个体之间存在。这些天然变体通常在Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶和/或Δ6延伸酶的核苷酸序列中产生1至5％的变异。本发明将包含这些Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶和/或Δ6延伸酶中的每一种和每一个核苷酸变异以及所导致的氨基酸多态性，它们是天然变异的结果并且不改变这些酶的功能活性。

有利于本发明方法的核酸分子由于与Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ5延伸酶、Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶和/或Δ6延伸酶核酸序列的同源性可以遵循标准杂交技术，使用这些酶的核酸序列或其部分为探针在严格杂交条件下分离。例如本上下文中可使用这样的经分离的核酸分子，其中所述核酸分子长至少15个核苷酸并且与包含SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133或SEQ ID NO：183的核苷酸序列的核酸分子在严格条件下杂交。具有至少25、50、100、200或更多个核苷酸的核酸也可以使用。如本上下文中所用的“在严格条件下杂交”用以描述杂交和洗涤条件，通常彼此具有至少60％同源性的核苷酸序列在这样的条件下可保持相互杂交。优选的杂交条件是这样：彼此具有至少约65％，优选至少约70％和尤其优选至少75％或更高同源性的序列间通常保持相互杂交。这些严格条件为技术人员所知并且在例如1989年N.Y.的John Wiley&Sons出版社的《Current Protocols in Molecular Biology》第6.3.1-6.3.6中描述。一个优选的非限制性严格杂交条件的例子是在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中约45℃时杂交，然后是一个或多个于0.2x SSC、0.1％SDS中50至65℃的洗涤步骤。技术人员知道根据核酸类型和例如当存在有机溶剂时，温度和缓冲剂浓度在杂交条件中是不同的。在“标准杂交条件”下，例如根据核酸类型，杂交温度在0.1至5×SSC(pH 7.2)浓度的缓冲水溶液中处于42℃和58℃之间。如果在以上提到的缓冲液中存在有机溶剂例如50％甲酰胺，标准条件下的杂交温度是大约42℃。对于DNA：DNA杂交体的杂交条件例如是0.1×SSC和20℃至45℃，优选地为30℃至45℃。例如DNA：RNA杂交体的杂交条件是0.1×SSC和30℃至55℃，优选地为45℃至55℃杂交。以上提到的杂交条件通过长约100bp(碱基对)并且G+C含量为50％的核酸在无甲酰胺的情况下测定。技术人员以上面提到的教材或基于如1989年Cold Spring Harbor Laboratory出版社Sambrook等的《Molecular Cloning》；1985年牛津的牛津大学出版社中IRL Press出版社Hames和Higgins编辑《Nucliec AcidHybridization：A Practical Approach》；1991年牛津的牛津大学出版社中IRL Press出版社Brown编辑的《Essential Molecular Biology：A PracticalApproach》所述知道如何确定所需的杂交条件。

为了确定两个氨基酸序列(如SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134或SEQ ID NO：184序列中的一个序列)或两种核酸(例如SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133或SEQ ID NO：183)的同源性(同源性)百分数，将序列书写为使一个序列处于另一个序列下以便优化比较(例如可向一个蛋白质序列或一个核酸序列中导入缺口以便产生与另一个蛋白质或另一个核酸的优化比对)。然后比较相应氨基酸位置上或相应核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。如果一个序列的某个位置由另一个序列相应位置的相同氨基酸残基或相同核苷酸占据，则在此位置上这些分子同源(即氨基酸或核酸“同源性”如在本发明中所用对应于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列间的同源性百分数是两个序列间所共有的位置数目的函数(即同源性％＝相同的位置数目/总位置数目×100)。因此将术语“同源性”和“同源性”视为同义。

编码与SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134或SEQ ID NO：184的蛋白质序列同源的Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ5延伸酶和/或Δ6延伸酶的经分离核酸分子可通过在/向SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133或SEQ ID NO：183的核苷酸序列中导入一个或多个核苷酸的替代、添加或删除而产生，从而将一个或多个氨基酸的替代、添加或删除导入/到所编码的蛋白质中。序列SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133或SEQ ID NO：183之一中的突变可通过标准技术如定点诱变和PCR介导的诱变导入。优选对所预测的一个或多个非关键氨基酸残基进行保守性氨基酸替代。在“保守性氨基酸替代”中，氨基酸残基由具有类似侧链的另一种氨基酸残基替代。本领域中具有类似侧链的氨基酸残基家族已经得到定义。这些家族包含具有碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ5延伸酶或Δ6延伸酶中所预测的非关键氨基酸残基由来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基优选地替换。在另一个实施方案中，这种突变可备选地在编码Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ5延伸酶或Δ6延伸酶的完整序列或其部分中随机导入，如通过饱和诱变导入，并且将由此所得的突变体可通过重组表达此处所描述的Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ5延伸酶或Δ6延伸酶活性而筛选以鉴定保持了Δ12去饱和酶、ω3去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ5延伸酶或Δ6延伸酶活性的突变体。在SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133或SEQ ID NO：183中的序列之一经过诱变后，这种诱变后序列所编码的蛋白质可重组表达，并且所编码蛋白质的活性可经例如本文中所描述的试验测定。

本发明还涉及这样的非人类的转基因生物，其包含本发明的核酸SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133或SEQ ID NO：183或者包含含有本发明这些核酸序列的基因构建体或载体。有利的非人类生物是微生物、非人类动物或植物，尤其优选为植物。

本发明通过以下实施例更详细地说明，这不得解释为作为限制性的说明。本专利申请中所引用的参考文献、专利申请、专利和已公开的专利申请的全部内容此处引用作为参考。

实施例

实施例1：通用的克隆方法

克隆方法例如限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、纯化DNΔ片段、核酸转移至硝酸纤维素膜和尼龙膜、连接DNA片段、转化大肠杆菌细胞、细菌培养和重组DNA的序列分析按照Sambrook等(1989)(Cold SpringHarbor Laboratory Press：ISBN 0-87969-309-6)所描述实施。

实施例2：重组DNA的序列分析

重组DNA分子以ABI激光荧光DNA测序仪按照Sanger(Sanger等(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467)的方法测序。通过聚合酶链反应获得的片段经过测序和核对以避免待表达的构建体中的聚合酶偏差。

实施例3：虹鳟基因的克隆

在对应于本申请所详述的延伸酶基因的蛋白质序列中对保守区域的搜索鉴定了两个在Genebank序列数据库中具有相应基序的序列。

  基因名称   Genbank No.   氨基酸   OmELO2   CA385234，CA364848，CA366480   264   OmELO3   CA360014，CA350786   295

虹鳟的总RNA用来自Qiagen的RNAeasy试剂盒(Valencia，CA，美国)分离。聚腺苷酸化RNA(mRNA)以寡聚-dT-纤维素从这种总RNA中分离(Sambrook等，1989)。这种RNA使用来自Promega的逆转录系统试剂盒进行逆转录并且将所合成的cDNA克隆至载体λZAP(lambdaZAP Gold，Stratagene)。然后根据制造商的说明将所述cDNA去包装以产生质粒DNA。然后将这种cDNA质粒文库用于克隆表达质粒的PCR。

实施例4：用于酵母中异源表达的表达载体的克隆

以下寡核苷酸用于克隆两个在酵母中异源表达的序列的PCR反应：

f：正向引物，r：反向引物

PCR混合物的组成(50μl)：

5.00μl模板cDNA

5.00μl 10×缓冲液(Advantage聚合酶)+25mM MgCl2

5.00μl 2mM dNTP

1.25l每种引物(10pmol/μl)

0.50μl Advantage聚合酶

使用了来自Clontech的Advantage聚合酶。

PCR反应条件：

复性温度：55℃ 1分钟

变性温度：94℃ 1分钟

延伸温度：72℃ 2分钟

循环次数：35

PCR产物与限制性酶HindIII和BamHI 37℃温育2小时。酵母表达载体pYES3(Invitrogen)以同样方式温育。此后经琼脂糖凝胶电泳分离812bp的PCR产物、905bp的PCR产物和载体并且切下相应的DNA片段。然后这些DNA以Qiagen凝胶纯化试剂盒遵循制造商的说明纯化。此后连接载体和延伸酶的cDNA。为此目的，使用了来自Roche的快速连接试剂盒。得到的质粒pYES3-OmELO2和pYES3-OmELO3经测序证实并且通过电穿孔(1500V)转化入酵母株INVSc1(Invitrogen)。pYES3作为对照进行平行转化。此后将酵母在补加了2％葡萄糖的撤除色氨酸的基本培养基上铺板。能在无色氨酸的培养基内生长的细胞包含相应的质粒pYES3、pYES3-OmELO2(SEQ ID NO：51)和pYES3-OmELO3(SEQID NO：53)。在选择后，对每种情况挑选了两个转化体用于进一步的功能性表达。

实施例5：植物中种子特异性表达的表达载体的克隆

生成基于pSUN-USP的另一个转化载体以转化植物。使用以下引物对将NotI切割位点导入编码序列的5′和3′端以实现此目的：

PSUN-OmELO2

正向引物：5′-GCGGCCGCATAATGGCTTCAACATGGCAA(SEQID NO：175)

反向引物：3′-GCGGCCGCTTATGTCTTCTTGCTCTTCCTGTT(SEQ ID NO：176)

PSUN-OMELO3

正向引物：5′-GCGGCCGCataatggagacttttaat(SEQ ID NO：177)

反向引物：3′-GCGGCCGCtcagtcccccctcactttcc(SEQ ID NO：178)

PCR混合物的组成(50μl)：

5.00l模板cDNA

5.00μl 10x缓冲液(Advantage聚合酶)+25mM MgCl2

5.00μl 2mM的dNTP

1.25μl每种引物(10pmol/μl)

0.50μl Advantage聚合酶

使用了来自Clontech的Advantage聚合酶。

PCR反应条件：

复性温度：55℃1分钟

变性温度：94℃1分钟

延伸温度：72℃2分钟

循环次数：35

PCR产物与限制性酶NotI 37℃温育16小时。植物表达载体pSUN300-USP以同样方式温育。此后通过琼脂糖凝胶电泳分离了PCR产物和7624bp的载体并且切下相应的DNA片段。此后这些DNA通过Qiagen凝胶纯化试剂盒遵循制造商说明纯化。此后连接载体和PCR产物。为此目的，使用了来自Roche的快速连接试剂盒。得到的质粒pSUN-OmELO2和pSUN-OmELO3经测序证实。

pSUN300是质粒pPZP的衍生物(Hajdukiewicz，P、Svab，Z、Maliga，P.，(1994)The small versatile pPZP family of Agrobacterium binaryvectors for plant trahsformation.Plant Mol Biol 25：989-994)。通过向pSUN300中插入作为EcoRI片段的USP启动子从pSUN300衍生了pSUN-USP。加A信号是来自根癌农杆菌Ti质粒的章鱼氨酸合酶基因的加A信号(ocs终止子，Genbank Accession V00088)(De Greve，H、Dhaese，P.、Seurinck，J.、Lemmers，M、Van Montagu，M.和Schell，J.Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacteriumtumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase geneJ.Mol.Appl.Genet.1(6)，499-511(1982)。USP启动子对应于第1-684位的核苷酸(Genbank Accession X56240)，其中USP基因非编码区的一部分存在于USP启动子中。684碱基对大小的USP启动子片段以商业上可获得的T7标准引物(Stratagene)和经合成的引物(引物序列：5′-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3′，SEQ ID NO：174)通过遵循标准方法的PCR反应扩增。将PCR片段再用EcoRI/SalI切割并且导入带OCS终止子的pSUN300载体。由此产生了名为pSUN-USP的质粒。这种构建体用于转化拟南芥菜、油菜籽、烟草和亚麻子。

实施例6：从酵母和种子中提取脂类

遗传性修饰对植物、真菌、藻类、纤毛虫的影响或对产生目的产物(例如脂肪酸)的影响可通过将经修饰的微生物或经修饰的植物在合适条件下(例如那些以上所描述的条件下)生长并且分析用于产生升高的目的产物(即脂类或脂肪酸)的培养基和/或细胞性成分而测定。这些分析的技术为技术人员所知并包含光谱学、薄层层析、多种染色方法、酶和微生物学方法以及分析性层析如高效液相层析(例如参见：Ullman，Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，Vol.A2，p.89-90和p.443-613，VCH：Weinheim(1985)；Fallon，A.等人，(1987)“Applications of HPLC in Biochemistry“，在：Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Vol.17一书中；Rehm等人(1993)Biotechnology，Vol.3，Chapter III：“Productrecovery and purification“，p.469-714，VCH：Weinheim；Belter，P.A.等人(1988)Bioseparations：downstream processing for Biotechnology，JohnWiley and Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.(1992)Recovery processesfor biological Materials，John Wiley and Sons；Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.(1988)Biochemical Separations，在：Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，Vol.B3；Chapter 11，p.1-27，VCH：Weinheim一书中；以及Dechow，F.J.(1989)Separation and purification techniques inbiotechnology，Noyes Publications)。

除以上提到的方法，植物脂类可如Cahoon等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(22)：12935-12940和Browse等(1986)Analytic Biochemistry152：141-145所描述从植物材料中提取。脂类或脂肪酸的定性和定量分析由Christie，William W.，Advances in Lipid Methodology，Ayr/Scotland：Oily Press(Oily Press Lipid Library；2)；Christie，William W.，GasChromatography and Lipids.A Practical Guide-Ayr，Scotland：Oily Press，1989，Repr.1992，IX，307pp.(Oily Press Lipid Library；1)；“Progress inLipid Research，Oxford：Pergamon Press，1(1952)-16(1977)在题为Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN的文章中描述。

除了测量发酵的终产物以外，还可分析用于产生目的化合物的代谢途径中的其它成分例如中间体和副产物以测定该化合物的总生产效率。分析方法包括测量培养基中营养物的量(例如糖、碳水化合物、氮源、磷酸盐和其它离子)，测量生物量的组成和增长，分析生物合成途径中的常规代谢物的产生并且测量发酵期间所产生的气体。用于这些测量的标准方法在IRL Press出版社P.M.Rhodes和P.F.Stanbury编辑的《Applied MicrobialPhysiology；A Practical Approach》(ISBN：0199635773)的第103-129页、第131-163页和第165-192页以及其中所引用的参考文献中描述。

一个分析的例子是脂肪酸的分析(缩略语：FAME，脂肪酸甲酯；GC-MS，气液色谱/质谱；TAG，三酰甘油酯；TLC，薄层层析)。

可如Christie及其中的参考文献(1997年Dundee的Oily Press出版社Christie的《Advances on Lipid Methodology》第四版中第119-169页；1998年Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahren[GasChromatography/mass spectrometric methods]，Lipide 33：343-353)所数次描述的那样使用分析性标准方法：GC、GC-MS或TLC清楚无误地检测脂肪酸产物的存在。

欲分析的材料可通过超声处理、玻璃磨中研磨、液氮和研磨或者通过其它可利用的方法加以破碎。这种材料在破碎后必须离心。在蒸馏水中重悬沉淀，100℃加热10分钟，冰上冷却并且再次离心，然后在含0.5M硫酸和2％二甲氧丙烷的甲醇溶液中90℃提取1小时，由此产生了已水解的油和脂类化合物，产生了已转甲基化的脂类。这些脂肪酸甲酯在石油醚中提取并且最后通过使用毛细管柱(Chrompack，WCOT Fused Silica，CP-Wax-52CB，25μm，0.32mm)经20分钟的170℃至240℃之间的温度梯度并且在240℃维持5分钟加以GC分析。得到的脂肪酸甲酯的身份必须使用可从商业来源获得的标准品(即Sigma)确定。

首先通过往返于研杵和研钵之间机械地均化植物材料以使其更便于提取。随后100℃加热10分钟并且在冰上冷却后再次离心。细胞沉淀以1M甲醇硫酸和2％二甲氧丙烷90℃水解一小时并且将脂类转甲基化。得到的脂肪酸甲酯(FAME)在石油醚中抽提。所提取的FAME通过使用毛细管柱(Chrompack，WCOT Fused Silica，CP-Wax-52CB，25μm，0.32mm)的气液色谱经20分钟的170℃至240℃之间的温度梯度并且在240℃维持5分钟加以分析。脂肪酸甲酯的身份通过与相应FAME标准品(Sigma)的比较确认。双键的身份和位置通过使FAME混合物适当地化学性衍生以产生例如4，4-二甲氧噁唑啉衍生物(Christie，1998)经GC-MS进一步分析。

对如实施例4中所描述的质粒pYES3、pYES3-OmELO2和pYES3-OmELO3转化了的酵母进行如下分析：

来自主培养的酵母细胞经离心(100×g、10分钟、20℃)收获并用pH 8.0的100mM NaHCO3洗涤以除去残留的培养基和脂肪酸。脂肪酸甲酯(FAME)由酵母细胞沉淀经酸甲醇分解作用制备。为达此目的，细胞沉淀与2ml的1N甲醇硫酸和2％(v/v)二甲氧丙烷80℃温育1小时。FAME通过石油醚(PE)提取两次。为了除去未衍生的脂肪酸，在每种情况下，有机相以2ml pH 8.0的100mM NaHCO3和2ml蒸馏水洗涤。此后PE相用Na2SO4干燥，在氩气下蒸发并置于100μl PE中。样品在Hewlett-Packard 6850气相色谱火焰电离探测器内的DB-23毛细管柱(30m，0.25mm，0.25μm，Agilent)内分离。GLC分析的条件如下：将炉腔温度设置为以每分钟5℃的速率从50℃升至250℃并且最后250℃维持10分钟(保持)。

通过与相应脂肪酸标准品(Sigma)的保留时间比较鉴定信号。

例如在Napier和Michaelson，2001，Lipids.36(8)：761-766；Sayanova等，2001，Journal of Experimental Botany.52(360)：1581-1585；Sperling等，2001，Arch.Biochem.Biophys.388(2)：293-298和Michaelson等，1998，FEBS Letters.439(3)：215-218中描述了这种方法。

实施例7：OmELO2和OmELO3的功能特征

OmELO2未表现延伸酶活性，而OmELO3表现了对不同底物的明显活性。OmElo3的底物特异性在表达后并且喂饲了多种脂肪酸(图2)后加以测定。所喂饲的底物可大量在所有转基因酵母中检测到。所有转基因酵母均显示合成了作为OmElo3反应产物的新脂肪酸。这意味基因OmElo3的功能性表达已为可能。

图2显示OmElo3具有高度特异地导致带有一个ω3双键的Δ5和Δ6脂肪酸延伸的底物特异性。而且ω6脂肪酸(C18和C20)也可以较低的特异性延伸。OmElo3的最佳底物(高达66％的延伸)是硬脂艾杜糖酸(C18:4ω3)和二十碳五烯酸(C20:5ω3)。

实施例8：酵母中DHA合成的重建。

通过共表达OmElo3与细小裸藻Δ4去饱和酶或通过共表达OmElo3与三角褐指藻Δ5去饱和酶和细小裸藻Δ4去饱和酶由EPA(20:5ω3)或硬脂艾杜糖酸(18:4ω3)开始实施DHA(22:6ω3)生物合成的重建。为达此目的，还构建了表达载体pYes2-EgD4和pESCLeu-PtD5。上述已由pYes3-OtElo3(SEQ ID NO：55)转化的酵母株以pYes2-EgD4或同时以pYes2-EgD4和pESCLeu-PtD5进一步转化。在pYes3-OmELO/pYes2-EgD4株的情况下，经转化的酵母以补加了2％葡萄糖的无色氨酸和尿嘧啶的完全基本培养基琼脂平板选择；在pYes3-OmELO/pYes2-EgD4+pESCLeu-PtD5株的情况下，经转化的酵母以无色氨酸、尿嘧啶和亮氨酸的完全基本培养基琼脂平板选择。如上所示，酶的表达通过加入2％(w/v)半乳糖诱导。培养物进一步15℃温育120小时。

图3显示了已经喂饲了20:5ω3的转基因酵母中的脂肪酸曲线。在已由pYes3-OmElo3载体和空白载体pYes2转化的对照酵母(A)中，20:5ω3经过极高效地延伸以产生22:5ω3(65％延伸)。额外导入的EgΔ4去饱和酶导致22:5ω3转化为22:6ω3(DHA)。转基因酵母中的脂肪酸组成在图5中显示。在共表达OmElo3和EgD4后，酵母中检测到了高达3％的DHA。

在又一个共表达实验中，将OmElo3、EgD4和三角褐指藻Δ5去饱和酶(PtD5)共表达。所述转基因酵母喂饲了硬脂艾杜糖酸(18:4ω3)并且进行了分析(图4)。这些酵母的脂肪酸组成在图5中显示。所喂饲的脂肪酸18:4ω3通过OmElo3延伸以产生20:4ω3(60％延伸)。20:4ω3经过PtD5去饱和以产生20:5ω3。PtD5的活性是15％。而且有可能通过OmElo3将20:5ω3延伸以产生22:5ω3。此后新近合成的22:5ω3经去饱和成为22:6ω3(DHA)。高达0.7％的DHA在这些实验中获得。

从这些实验中可看出本发明中所用的序列OmElo3、EgD4和PtD5适于真核细胞中DHA的产生。

实施例9：转基因植物的产生

a)转基因油菜籽植物的产生(Moloney等，1992，Plant CellReports，8：238-242的改良方法)

根癌农杆菌C58C1：pGV2260或大肠杆菌中的二元载体(Deblaere等，1984，Nucl.Acids.Res.13，4777-4788)可用于产生转基因油菜籽植物。为了转化油菜籽植物(Var.Drakkar，NPZ NordeutschePflanzenzucht，Hohenlieth，Germany)，将阳性转化的农杆菌菌落在补加3％蔗糖(3MS培养基)的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog 1962Physiol.Plant.15，473)中的过夜培养物1∶50稀释而使用。将新近发芽的无菌油菜籽植物的叶柄或下胚轴(在每一情况下约1cm2)与1∶50的农杆菌稀释物在培养皿中共同温育5-10分钟。然后这些叶柄或下胚轴在补加了0.8％Bacto琼脂的3MS培养基上黑暗中25℃共温育3天。然后将这些培养物在16小时光照/8小时黑暗中生长3天并且这种培养按照每周周期继续在补加了1.6g/L葡萄糖的500mg/L Claforan(头孢噻肟钠)、50mg/L卡那霉素、20μM苄氨基嘌呤(BAP)的MS培养基上生长。生长的芽转移至补加了2％蔗糖、250mg/L Claforan和0.8％Bacto琼脂的MS培养基中。若三周后根未发育，向培养基中加入作为生长激素用于生根的2-吲哚基丁酸。

已再生的苗在补加了卡那霉素和Claforan的2MS培养基上获得；生根之后，将这些苗转移至培养料并且在受控的环境箱或温室中生长两周后，以便开花，并且收获成熟的种子及通过脂类分析法分析延伸酶的表达如Δ5延伸酶或Δ6延伸酶活性或ω3去饱和酶活性。具有含量已升高的多不饱和C20和C22脂肪酸的株系可经如此方式鉴定。

b)转基因亚麻子植物的产生

转基因亚麻子植物可通过例如Bell等，1999，In Vitro Cell.Dev.Biol.Plant.35(6)：456-465的方法经粒子轰击产生。亚麻籽通常以例如Mlynarova等(1994)，Plant Cell Report 13：282-285的方法经农杆菌介导的转化作用而转化。

实施例10：从鲜黄破囊壶菌ATCC34304和破囊壶菌属某些种中克隆Δ5延伸酶基因

通过比较本发明中所发现的多种延伸酶的蛋白质序列，有可能确定保守的核酸区域(组氨酸盒：His-Val-X-His-His、色氨酸盒：Met-Tyr-X-Tyr-Tyr)。在这些序列的辅助下筛选了鲜黄破囊壶菌ATCC34304和破囊壶菌属某些种的EST数据库以发现其它的Δ5延伸酶。发现了如下所列的新序列：

  基因名称   核苷酸   氨基酸   BioTaurELO1   828bp   275   TL16y2   831   276

用来自Qiagen的RNAeasy试剂盒(Valencia，CA，美国)分离了鲜黄破囊壶菌ATCC34304和破囊壶菌属某些种的总RNA。以PolyATract分离系统(Promega)从这些总RNA中分离mRNA。这些RNA使用Marathon cDNA扩增试剂盒(BD Biosciences)遵循制造商的说明逆转录并且连接了人工接头。然后将这种cDNA文库用于通过5’和3’RACE(cDNA末端快速扩增)方法PCR克隆表达质粒。

实施例11：用于酵母中异源表达的表达质粒的克隆

以下的寡核苷酸用于PCR反应以克隆酵母中异源表达的序列：

＊f：正向引物，r：反向引物

PCR混合物的组成(50μl)：

5.00μl模板cDNA

5.00μl 10×缓冲液(Advantage聚合酶)+25mM MgCl2

5.00μl 2mM dNTP

1.25μl每种引物(10pmol/μl)

0.50μl Advantage聚合酶

使用了来自Clontech的Advantage聚合酶。

PCR混合物的组成(50μl)：

PCR反应条件：

复性温度：55℃ 1分钟

变性温度：94℃ 1分钟

延伸温度：72℃ 2分钟

循环次数：35

PCR产物BioTaurELO1(见SEQ ID NO：65)和TL16y2(见SEQ IDNO：83)与酵母表达载体pYES2.1-TOPO(Invitrogen)根据制造商说明21℃温育30分钟。这里通过T突出端和拓扑异构酶(Invitrogen)的活性向载体中连接PCR产物。在温育后转化大肠杆菌DH5α细胞。合适的克隆通过PCR鉴定，质粒DNA通过Qiagen DNAeasy试剂盒分离并且经测序证实。正确的序列随后经电穿孔(1500V)转化入酵母株INVSc1(Invitrogen)。以空白载体pYES2.1平行转化作为对照。此后将酵母在补加了2％葡萄糖的无尿嘧啶基本培养基上铺板。能在无尿嘧啶的培养基内生长的细胞包含相应的质粒pYES2.1、pYES2.1-BioTaurELO1和pYES2.1-TL16y2。在选择后，对每种情况挑选两个转化体用于进一步的功能性表达。

实施例12：植物中种子特异性表达的表达载体的克隆

产生了另一个基于pSUN-USP的转化载体以转化植物。为达此目的，利用以下引物对将NotI切割位点导入编码序列的5′和3′端：

PSUN-BioTaurELO1

正向引物：5‘-GCGGCCGCATAATGACGAGCAACATGAGC(SEQID NO：166)

反向引物：3‘-GCGGCCGCTTAGGCCGACTTGGCCTTGGG(SEQID NO：167)

PSUN-TL16y2

正向引物：

5’-GCGGCCGCACCATGGACGTCGTCGAGCAGCAATG(SEQ IDNO：168)

反向引物：

5’-GCGGCCGCTTAGATGGTCTTCTGCTTCTTGGGCGCC(SEQID NO：169)

PCR混合物的组成(50μl)：

5.00μl模板cDNA

5.00μl 10x缓冲液(Advantage聚合酶)+25mM MgCl2

5.00μl 2mM的dNTP

1.25μl每种引物(10pmol/μl)

0.50μl Advantage聚合酶

使用了来自Clontech的Advantage聚合酶。

PCR反应条件：

复性温度：55℃ 1分钟

变性温度：94℃ 1分钟

延伸温度：72℃ 2分钟

循环次数：35

PCR产物与限制性酶NotI 37℃温育16小时。植物表达载体pSUN300-USP以同样方式温育。此后通过琼脂糖凝胶电泳分离了PCR产物和7624bp的载体并且切下相应的DNA片段。此后通过Qiagen凝胶纯化试剂盒遵循制造商说明将DNA纯化。此后将载体和PCR产物连接。为此目的，使用了来自Roche的快速连接试剂盒。得到的质粒pSUN-BioTaurELO1和pSUN-TL16y2经测序证实。

pSUN300是质粒pPZP的衍生物(Hajdukiewicz，P、Svab，Z、Maliga，P.，(1994)The small versatile pPZP family of Agrobacterium binaryvectors for plant transformation.Plant Mol Biol 25：989-994)。通过向pSUN300中插入作为EcoRI片段的USP启动子从pSUN300衍生了pSUN-USP。加A信号是来自根癌农杆菌Ti质粒的章鱼氨酸合酶基因的加A言号(ocs终止子，Genbank Accession V00088)(De Greve，H、Dhaese，P.、Seurinck，J.、Lemmers，M、Van Montagu，M.和Schell，J.Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacteriumtumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase geneJ.Mol.Appl.Genet.1(6)，499-511(1982)。DerUSP启动子对应于第1-684位的核苷酸(Genbank Accession X56240)，其中USP基因非编码区的一部分存在于USP启动子中。以商业上可获得的T7标准引物(Stratagene)和经合成的引物(引物序列：5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3’，SEQ ID NO：165)通过遵循标准方法的PCR反应扩增。这个PCR片段再用EcoRI/SalI切割并且导入带OCS终止子的pSUN300载体。由此产生了名为pSUN-USP的质粒。这种构建体用于转化拟南芥菜、油菜籽、烟草和亚麻子。

如实施例6中所描述从酵母和种子中提取脂类。

实施例13：BioTaurELO1和TL16y2的功能特征

BioTaurELO1的底物特异性在表达和喂饲多种脂肪酸后加以测定(图6)。图6显示了以包含pYes2.1载体(对照)或包含Δ5延伸酶的载体pYes2.1-BioTaurELO1(BioTaur)的酵母株测定功能性和底物特异性的喂饲实验。在两个批量中，将200μM的γ-亚麻酸和二十碳五烯酸喂饲酵母温育培养基并且温育24小时。脂肪酸从酵母中提取之后经转甲基化并且以气相层析分离。从所喂饲的两种脂肪酸获得的延伸产物如箭头所示。

所喂饲的底物可大量地在所有转基因酵母中检测到。全部转基因酵母均显示合成了作为BioTaurELO1反应产物的新脂肪酸。这意味基因BioTaurELO1的功能性表达已为可能。

图6表明BioTaurELO1具有高度特异性地引起带有一个ω3双键的Δ5和Δ6脂肪酸延伸的底物特异性。而且ω6脂肪酸(C18和C20)也进一步地加以延伸。γ-亚麻酸(C18:3ω6)以65.28％的速率转化，硬脂艾杜糖酸(C18:4ω3)以65.66％的速率转化并且二十碳五烯酸(C20:5ω3)以22.01％的速率转化。多个饲喂实验的底物特异性在表3中显示(见本描述的末尾)。

当喂饲GLA和EPA时，GLA的转化率为65.28％。当喂饲等量的GLA和EPA时，EPA的转化率为9.99％。如果仅喂饲EPA，EPA的转化率为22.01％。当喂饲花生四烯酸(ARA)时，花生四烯酸也被转化。花生四烯酸的转化率为14.47％。硬脂艾杜糖酸(SDA)也被转化。在此情况下，硬脂艾杜糖酸转化率为65.66％。

TL16y2的功能性和底物特异性在表达后和喂饲多种脂肪酸后进行了测定了。表4显示了喂饲实验。这个喂饲实验按照例对BioTaurELO1描述的同样方式进行。喂饲的底物可在所有转基因酵母大量地检测到。全部转基因酵母均显示合成了作为TL16y2反应产物的新脂肪酸(图11)。这意味基因TL16y2的功能性表达已为可能。

表4：TL16y2在酵母中的表达

将TL16y2的结果与对照比较，如表4所示，显示出以百分率表示的以下转化率：a)％转化率EPA(250μM)：8％，b)％转化率EPA(50μM)：41％，c)％转化率ARA：20.3％，d)％转化率SDA：79.4％，以及e)％转化率GLA：74.9％。

因此，TL16y2显示Δ5-、Δ6-和Δ8-延伸酶活性。其中对具有Δ6-双键的C18-脂肪酸具有最高活性。根据所喂饲的脂肪酸浓度，接下来延伸具有一个Δ5-或Δ8-双键的C20-脂肪酸。

实施例14：从Ostreococcus tauri中克隆基因

在本申请中所列具有Δ5延伸酶活性或Δ6延伸酶活性的延伸酶基因的辅助下通过搜索蛋白质序列中的保守序列，在Ostreococcus tauri序列数据库(基因组序列)中鉴定了两个具有相应基序的序列。如下是这两个序列：

  基因名称  SEQ ID   氨基酸   OtELO1，(Δ5-延伸酶)  SEQ ID NO：67   300   OtELO2，(Δ6-延伸酶)  SEQ ID NO：69   292

OtElo1与斑马鱼(Danio rerio)延伸酶(GenBank AAN77156；约26％同源性)具有最高的相似性，同时OtElo与剑叶藓Elo(PSE)[约36％同源性]具有最大的相似性(用tBLASTn算法进行比较(Altschul等，J.Mol.Biol.1990，215：403-410)。

克隆程序按如下方式进行：

将稳定期的40ml Ostreococcus tauri培养物离心并且将沉淀在100μl双蒸水中重悬并且-20℃保存。基于PCR法扩增了相关的基因组DNA。相应的引物对以这样的方式选择即引物包含紧接起始密码子的用于高效翻译的酵母共有序列(Kozak，Cell 1986，44：283-292)。在每种情况下，使用1μl解冻的细胞、200μM dNTP、2.5U Taq聚合酶和每种引物100pmol于总计50μl体积中进行OtElo-DNA的扩增。PCR的条件如下：首先95℃变性5分钟，其后为94℃30秒、55℃1分钟和72℃2分钟的30个循环，并且终末延伸步骤为72℃10分钟。

实施例15：用于酵母中异源表达的表达质粒的克隆

为描述Ostreococcus tauri延伸酶的功能特征，将所讨论的诸DNA的可读框克隆至pYE2.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)的半乳糖可诱导GAL1启动子的下游，产生了pOTE1和pOTE2。

酿酒酵母334株分别以载体pOTE1和pOTE2经电穿孔(1500V)转化。空白载体pYES2转化的酵母用作对照。在补加了2％葡萄糖的无尿嘧啶完全基本培养基(CMdum)琼脂平板上选择已转化的酵母。选择后，在每种情况下挑选三个转化体用于进一步的功能性表达。

在每种情况下，为表达Ot延伸酶，以所选择的转化体首先接种由5ml补加了2％(w/v)棉子糖但缺乏尿嘧啶的CMdum培养基组成的预培养基并且以每分钟200转30℃温育2天。然后以预培养物接种5ml补加了2％棉子糖和300μM多种脂肪酸的CMdum(尿嘧啶撤除)液体培养基至OD6000.05。酶的表达通过加入2％(w/v)的半乳糖诱导。培养物进一步20℃温育96小时。

实施例16：用于植物中种子特异性表达的表达质粒的克隆

产生了基于pSUN-USP的另一个转化载体用于转化植物。为达此目的，使用以下引物对向编码序列的5′和3′端导入NotI切割位点。对应的引物序列从OtElo1和OtElo2的5′和3′区域衍生。

PCR混合物的组成(50μl)：

5.00μl模板cDNA

5.00μl 10x缓冲液(Advantage聚合酶)+25mM MgCl2

5.00μl 2mM的dNTP

1.25μl每种引物(10pmol/μl)

0.50μl Advantage聚合酶

使用了来自Clontech的Advantage聚合酶。

PCR反应条件：

复性温度：55℃ 1分钟

变性温度：94℃ 1分钟

延伸温度：72℃ 2分钟

循环次数：35

PCR产物与限制性酶NotI 37℃温育16小时。植物表达载体pSUN300-USP以同样方式温育。此后通过琼脂糖凝胶电泳分离了PCR产物和载体并且切下相应的DNA片段。此后这些DNA通过Qiagen凝胶纯化试剂盒遵循制造商说明纯化。此后连接载体和PCR产物。为此目的，使用了来自Roche的快速连接试剂盒。得到的质粒pSUN-OtELO1和pSUN-OtELO2经测序证实。

pSUN300是质粒pPZP的衍生物(Hajdukiewicz，P、Svab，Z、Maliga，P.，(1994)The sman versatile pPZP family of Agrobacterium binaryvectors for plant transformation.Plant Mol Biol 25：989-994)。通过向pSUN300中插入作为EcoRI片段的USP启动子从pSUN300衍生了pSUN-USP。加A信号是来自根癌农杆菌Ti质粒的章鱼氨酸合酶基因的加A信号(ocs终止子，Genbank Accession V00088)(De Greve，H、Dhaese，P.、Seurinck，J.、Lemmers，M、Van Montagu，M.和Schell，J.Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacteriumtumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase geneJ.Mol.Appl.Genet.1(6)，499-511(1982)。USP启动子对应于第1-684位的核苷酸(Genbank Accession X56240)，其中USP基因非编码区的一部分存在于USP启动子中。684碱基对大小的USP启动子片段以商业上可获得的T7标准引物(Stratagene)和经合成的引物(引物序列：5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3’，SEQ ID NO：164)通过遵循标准方法的PCR反应扩增。这个PCR片段再用EcoRI/SalI切割并且导入带OCS终止子的pSUN300载体。由此产生了名为pSUN-USP的质粒。这种构建体用于转化拟南芥菜、油菜籽、烟草和亚麻子。

实施例17：OtELO1和OtELO2在酵母中的表达

用如实施例15中所述质粒pYES3、pYES3-OtELO1和pYES3-OtELO2转化的酵母按如下方式分析：

来自主培养的酵母细胞经离心(100xg，5分钟，20℃)收获并以pH8.0的100mM NaHCO3洗涤以除去残留的培养基和脂肪酸。脂肪酸甲酯(FAME)从酵母细胞沉淀经酸甲醇分解作用制备。为达此目的，细胞沉淀与2ml的1N甲醇硫酸和2％(v/v)二甲氧丙烷80℃温育1小时。FAME以石油醚(PE)提取两次。在每一情况下，为除去未衍生的脂肪酸，有机相以2ml的pH 8.0的100mM NaHCO3和2ml蒸馏水洗涤。随后PE相以Na2SO4干燥，在氩气下蒸发并置于100μl PE中。样品在装备有火焰电离探测器的Hewlett-Packard 6850气相色谱仪的DB-23毛细管柱(30m，0.25mm，0.25μm，Agilent)中分离。GLC分析条件如下：将炉腔温度设置为以每分钟5℃的速率从50℃升至250°并且最后在250℃维持10分钟(保持)。

通过与相应的脂肪酸标准品(Sigma)的保留时间比较而鉴定信号。例如在Napier和Michaelson，2001，Lipids.36(8)：761-766；Sayanova等，2001，Journal of Experimental Botany.52(360)：1581-1585，Sperling等，2001，Arch.Biochem.Biophys.388(2)：293-298和Michaelson等，1998，FEBS Letters.439(3)：215-218中描述了这种方法。

实施例18：OtELO1和OtELO2的功能特征

OtElo1底物特异性在表达后和在喂饲多种脂肪酸后测定(表5)。所喂饲的底物在全部转基因酵母中可大量地检测到。转基因酵母显示合成了作为OtElo1反应产物的新脂肪酸。这意味基因OtElo1的功能性表达已为可能。

表4表明OtElo1具有窄范围的底物特异性。OtElo1只能延伸C20脂肪酸二十碳五烯酸(图7)和花生四烯酸(图8)，但优选地延伸ω3去饱和的二十碳五烯酸。

表5：

  脂肪酸底物   转化率(％)   16:θ   -   16:1Δ9   -   18:θ   -   18:1Δ9   -   18:1Δ11   -   18:2Δ9，12   -   18:3Δ6，9，12   -   18:3Δ5，9，12   -   20:3Δ8，11，14   -   20:4Δ5，8，11，14   10.8±0.6   20:5Δ5，8，11，14，17   46.8±3.6

  脂肪酸底物   转化率(％)   22:4Δ7，10，13，16   -   22:6Δ4，7，10，13，16，19   -

表5显示了与多种脂肪酸比较，延伸酶OtElo1对于在Δ5位置具有双键的C20-多不饱和脂肪酸的底物特异性。

经载体pOTE1转化的酵母在所述脂肪酸存在的基本培养基中生长。脂肪酸甲酯通过对完整细胞的酸甲醇分解作用合成。随后这些FAME通过GLC分析。每个值显示为平均值(n＝3)±标准差。

OtElo2(SEQ IN NO：81)的底物特异性在表达后和喂饲多种脂肪酸后测定(表6)。所喂饲的底物在全部转基因酵母中可大量地检测到。转基因酵母显示合成了作为OtElo2反应产物的新脂肪酸。这意味基因OtElo2的功能性表达已为可能。

表6：

  脂肪酸底物   转化率(％)   16:0   -   16:1Δ9   -   16:3Δ7，10，13   -   18:θ   -   18:1Δ6   -   18:1Δ9   -   18:1Δ11   -   18:2Δ9，12   -   18:3Δ6，9，12   15.3±   18:3Δ5，9，12   -   18:4Δ6，9，12，15   21.1±

  脂肪酸底物   转化率(％)   20:2Δ11，14   -   20:3Δ8，11，14   -   20:4Δ5，8，11，14   -   20:5Δ5，8，11，14，17   -   22:4Δ7，10，13，16   -   22:5Δ7，10，13，16，19   -   22:6Δ4，7，10，13，16，19   -

表6显示了延伸酶OtElo2相对于多种脂肪酸的底物特异性。

经载体pOTE2转化的酵母在所述脂肪酸存在的基本培养基中生长。脂肪酸甲酯通过对完整细胞的酸甲醇分解作用合成。随后这些FAME通过GLC分析。每个值显示为平均值(n＝3)±标准差。

表3中所示的酶活性清楚表明OtElo2为Δ6-延伸酶。

实施例19：从假矮海链藻中克隆基因

在如本申请中所详述的具有Δ5-延伸酶活性或Δ6-延伸酶活性的延伸酶基因的辅助下通过搜索蛋白质序列中的保守区域，可在假矮海链藻序列数据库(基因组序列)中鉴定到两个具有相应基序的序列。这两个序列如下：

  基因名称   SEQ ID   氨基酸   TpELO1(Δ5-延伸酶)   43   358   TpELO2(Δ5-延伸酶)   59   358   TpELO3(Δ6-延伸酶)   45   272

2L假矮海链藻培养物在f/2培养基中(《Culture of MarineInvertebrate Animals》中(纽约Plenum Press出版Smith，W.L.和ChanleyM.H编辑)中第29-60页Guillard，R.R.L.1975.Culture of phytoplanktonfor feeding marine invertebrates)于80E/cm2光密度下经14天长成。在细胞离心后，RNA用来自Qiagen的RNAeasy试剂盒(Valencia，CA，美国)遵循制造商说明分离。mRNA遵循制造商的说明使用Marathon cDNA扩增试剂盒(BD Biosciences)逆转录并且连接了人工接头。然后此cDNA文库用于通过5’和3’RACE(cDNA末端快速扩增)方法PCR克隆表达质粒。

实施例20：用于酵母中异源表达的表达质粒的克隆

所讨论的引物对以这样方式选择即所述引物具有毗邻起始密码子的用于高效翻译的酵母共有序列(Kozak，Cell 1986，44：283-292)。在每种情况下使用1μl cDNA、200μM dNTP、2.5U Advantage聚合酶和每种引物100pmol于总计50μl体积中实施TpElo DNA的扩增。PCR的条件如下：首先95℃变性5分钟，其后为94℃30秒、55℃1分钟和72℃2分钟的30个循环，并且终末延伸步骤为72℃10分钟。

用于PCR反应的以下寡核苷酸用于克隆在酵母中异源表达的序列

  基因名称和SEQ ID NO：   引物序列   TpELO1(Δ5-延伸酶)，SEQ  ID NO：59   F：5’-accatgtgctcaccaccgccgtc  (SEQ ID NO：158)  R：5’-ctacatggcaccagtaac(SEQ ID NO：159)   TpELO2(Δ5-延伸酶)，SEQ  ID NO：85   F：5’-accatgtgctcatcaccgccgtc  (SEQ ID NO：160)  R：5’-ctacatggcaccagtaac(SEQ ID NO：161)   TpELO3(Δ6-延伸酶)，SEQ  ID NO：45   F：5’-accatggacgcctacaacgctgc  (SEQ ID NO：162)  R：5’ctaagcactcttcttcttt(SEQ ID NO：163)

＊F＝正向引物，R＝反向引物

PCR产物与酵母表达载体pYES2.1-TOPO(Invitrogen)根据制造商说明21℃温育30分钟。这里通过T突出端和拓扑异构酶(Invitrogen)活性向载体连接PCR产物。温育后转化大肠杆菌DH5α细胞。合适的克隆通过PCR鉴定，质粒DNA通过Qiagen DNAeasy试剂盒分离并且经测序证实。然后将正确的序列经电穿孔(1500V)转化入酵母株INVSc1(Invitrogen)。平行转化空白载体pYES2.1作为对照。此后酵母在补加了2％葡萄糖的无尿嘧啶的基本培养基上铺板。因此能够在无尿嘧啶的培养基中生长的细胞包含相应的质粒pYES2.1、pYES2.1-TpELO1、pYES2.1-ELO2和pYES2.1-TpELO3。选择后，在每种情况下挑选了两个转化体用于进一步的功能性表达。

实施例21：克隆用于植物中种子特异性表达的表达质粒

产生了基于pSUN-USP的另一个转化载体用于转化植物。为达此目的，使用以下引物对向编码序列的5′和3′端导入NotI切割位点：

PSUN-TPELO1

正向引物：5‘-GCGGCCGCACCATGTGCTCACCACCGCCGTC(SEQ ID NO：152)

反向引物：3‘-GCGGCCGCCTACATGGCACCAGTAAC(SEQ IDNO：153)

PSUN-TPELO2

正向引物：5‘-GCGGCCGCACCATGTGCTCATCACCGCCGTC(SEQ ID NO：154)

反向引物：3‘-GCGGCCGCCTACATGGCACCAGTAAC(SEQ IDNO：155)

PSUN-TPELO3

正向引物：5‘-GCGGCCGCaccatggacgcctacaacgctgc(SEQ ID NO：156)

反向：3‘-GCGGCCGCCTAAGCACTCTTCTTCTTT(SEQ ID NO：157)

PCR混合物的组成(50μl)：

5.00μl模板cDNA

5.00μl 10x缓冲液(Advantage聚合酶)+25mM MgCl2

5.00μl 2mM的dNTP

1.25μl每种引物(10pmol/μl)

0.50μl Advantage聚合酶

使用了来自Clontech的Advantage聚合酶。

PCR反应条件：

复性温度：55℃ 1分钟

变性温度：94℃ 1分钟

延伸温度：72℃ 2分钟

循环次数：35

PCR产物与限制性酶NotI 37℃温育16小时。植物表达载体pSUN300-USP以同样方式温育。此后通过琼脂糖凝胶电泳分离了PCR产物和7624bp的载体并且切下相应的DNA片段。此后这些DNA通过Qiagen凝胶纯化试剂盒遵循制造商说明纯化。此后连接载体和PCR产物。为此目的，使用了来自Roche的快速连接试剂盒。得到的质粒pSUN-TPELO1、pSUN-TPELO2和pSUN-TPELO3经测序证实。

pSUN300是质粒pPZP的衍生物(Hajdukiewicz，P、Svab，Z、Maliga，P.，(1994)The small versatile pPZP family of Agrobacterium binaryvectors for plant transformation.Plant Mol Biol 25：989-994)。通过向pSUN300中插入作为EcoRI片段的USP启动子从pSUN300衍生了pSUN-USP。加A信号是来自根癌农杆菌Ti质粒的章鱼氨酸合酶基因的加A信号(ocs终止子，Genbank Accession V00088)(De Greve，H、Dhaese，P.、Seurinck，J.、Lemmers，M、Van Montagu，M.和Schell，J.Nucleotide  sequence and transcript map of the Agrobacteriumtumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase geneJ.Mol.Appl.Genet.1(6)，499-511(1982)。USP启动子对应于第1-684位的核苷酸(Genbank Accession X56240)，其中USP基因非编码区的一部分存在于USP启动子中。684碱基对大小的USP启动子片段以商业上可获得的T7标准引物(Stratagene)和经合成的引物(引物序列：5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3’；SEQ ID NO：151)通过遵循标准方法的PCR反应扩增。这个PCR片段再用EcoRI/SalI切割并且导入带OCS终止子的pSUN300载体。由此产生了名为pSUN-USP的质粒。这种构建体用于转化拟南芥菜、油菜籽、烟草和亚麻子。

如实施例6中所描述从酵母和种子中提取脂类。

实施例22：TpELO1、TpELO2和TpELO3在酵母中的表达

用如实施例4中所描述的质粒pYES2、pYES2-TpELO1、pYES2-TpELO2和pYES2-TpELO3转化的酵母按如下方式分析：

来自主培养的酵母细胞经离心(100xg、5分钟、20℃)收获并以pH8.0的100mM NaHCO3洗涤以除去残留的培养基和脂肪酸。脂肪酸甲酯(FAME)从酵母细胞沉淀经酸甲醇分解作用制备。为达此目的，细胞沉淀与2ml的1N甲醇硫酸和2％(v/v)二甲氧丙烷80℃温育1小时。FAME以石油醚(PE)提取两次。在每一情况下，为除去未衍生的脂肪酸，有机相以2ml的pH 8.0的100mM NaHCO3和2ml蒸馏水洗涤。随后PE相以Na2SO4干燥，在氩气下蒸发并置于100μl PE中。样品在装备有火焰电离探测器的Hewlett-Packard 6850气相色谱仪的DB-23毛细管柱(30m，0.25mm，0.25μm，Agilent)中分离。GLC分析条件如下：将炉腔温度设置为以每分钟5℃的速率从50℃升至250°并且最后在250℃维持10分钟(保持)。

信号通过比较相应的脂肪酸标准品(Sigma)的保留时间加以鉴定。例如在Napier和Michaelson，2001，Lipids.36(8)：761-766；Sayanova等，2001，Journal of Experimental Botany.52(360)：1581-1585，Sperling等，2001，Arch.Biochem.Biophys.388(2)：293-298和Michaelson等，1998，FEBS Letters.439(3)：215-218中描述了这种方法。

实施例23：TpELO1和TpELO3的功能特征

TpElo1的底物特异性在表达后和喂饲多种脂肪酸之后测定(图9)。所喂饲的底物在全部转基因酵母中可大量地检测到。转基因酵母显示合成了作为TpElo1反应产物的新脂肪酸。这意味基因TpElo1的功能性表达已为可能。

表7表明TpElo1具有窄范围的底物特异性。TpElo1只能延伸C20脂肪酸二十碳五烯酸(图7)和花生四烯酸，但优选地延伸ω3去饱和的二十碳五烯酸。

已由载体pYES2-TpElo1转化的酵母于所述脂肪酸存在的基本培养基中生长。脂肪酸甲酯通过对完整细胞的酸甲醇分解作用合成。随后这些FAME通过GLC分析。

表7：TpElo1在酵母中的表达。列1和列3是列2(喂饲250μM 20:4Δ5，8，11，14)和列4(喂饲250μM 20:5Δ5，8，11，14，17)的对照反应。

  表达   表达   表达   表达  脂肪酸   1   2   3   4  16:0   18.8   17.8   25.4   25.2  16:1Δ9   28.0   29.8   36.6   36.6  18:0   5.2   5.0   6.8   6.9  18:1Δ9   25.5   23.6   24.6   23.9  20:4Δ5，8，11，14   22.5   23.4   -   -

22:4Δ7，10，13，16  -   0.4   -   - 20:5Δ5，8，11，14，17  -   -   6.6   6.5 22:5Δ7，10，13，16，19  -   -   -   0.9 ％转化率  0   1.7   0   12.2

TpElo3的底物特异性在表达后和在喂饲多种脂肪酸之后测定(图10)。所喂饲的底物在全部转基因酵母中可大量地检测到。转基因酵母显示合成了作为TpElo3反应产物的新脂肪酸。这意味基因TpElo3的功能性表达已为可能。

表8表明TpElo3具有较窄范围的底物特异性。TpElo3只能延伸C18脂肪酸γ-亚麻酸和硬脂艾杜糖酸，但优选地延伸ω3去饱和的硬脂艾杜糖酸。

已由载体pYES2-TpElo3转化的酵母于所述脂肪酸存在的基本培养基中生长。然后，脂肪酸甲酯通过对完整细胞的酸甲醇分解作用合成。随后这些FAME通过GLC分析。

表8：TpElo3在酵母中的表达。列1显示了未饲入的酵母的脂肪酸曲线。列2显示了对照反应。在列3至列6饲入了γ-亚麻酸、硬脂艾杜糖酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸(每种脂肪酸各250μM)。

  脂肪酸   1   2   3   4   5   6   16:0   17.9   20.6   17.8   16.7   18.8   18.8   16:1Δ9   41.7   18.7   27.0   33.2   24.0   31.3   18:0   7.0   7.7   6.4   6.6   5.2   6,0   18:1Δ9   33.3   16.8   24.2   31.8   25.5   26.4   18:2Δ9，12   -   36.1   -   -   -   -   18:3Δ6，9，12   -   -   6.1   -   -   18:4Δ6，9，12，15   -   -   -   1.7   -   20:2Δ11，14   -   0   -   -   -   20:3Δ8，11，14   -   -   18.5   -   -   20:4Δ8，11，14，17   -   -   -   10.0   -

  脂肪酸   1   2   3   4   5   6   20:4Δ5，8，11，14   -   -   -   -   22.5

22:4Δ7，10，13，16  -   -   -   -   0 20:5Δ5，8，11，14，17  -   -   -   -   -   17.4 22:5Δ7，10，13，16，19  -   -   -   -   -   0 ％转化率  0   0   75   85   0   0

实施例24：用于酵母中Pi-ω3Des异源表达的表达质粒的克隆

为了在酵母中异源表达，将Pi-ω3Des的克隆以合适的特异性Pi-ω3Des引物通过PCR克隆至酵母表达载体pYES3。仅仅扩增了这个编码Pi-ω3Des蛋白质的基因的可读框；提供了具备两个向表达载体pYES3中克隆的切割位点的Pi-ω3Des基因可读框。

正向引物：5’-TAAGCTTACATGGCGACGAAGGAGG(SEQ IDNO：149)

反向引物：5’-TGGATCCACTTACGTGGACTTGGT(SEQ ID NO：150)PCR混合物的组成(50μl)：

5.00μl模板cDNA

5.00μl 10×缓冲液(Advantage聚合酶)+25mM MgCl2

5.00μl 2mM dNTP

1.25μl每种引物(10pmol/μl)

0.50μl Advantage聚合酶

使用了来自Clontech的Advantage聚合酶。

PCR反应条件：

复性温度：55℃ 1分钟

变性温度：94℃ 1分钟

延伸温度：72℃ 2分钟

循环次数：35

PCR产物与限制性酶HindIII和BamHI 37℃温育2小时。酵母表达载体pYES3(Invitrogen)以同样方式温育。此后经琼脂糖凝胶电泳分离了1104bp的PCR产物和载体并且切下了相应的DNA片段。然后DNA通过Qiagen凝胶纯化试剂盒遵循制造商说明纯化。此后连接载体和去饱和酶的cDNA。为此目的，使用了来自Roche的快速连接试剂盒。得到的质粒pYES3-Pi-ω3Des经测序证实并且通过电穿孔(1500V)转化入酵母株INVSc1(Invitrogen)。平行转化pYES3作为对照。此后酵母在补加了2％葡萄糖的无色氨酸基本培养基上铺板。能够在无色氨酸的培养基内生长的细胞包含相应的质粒pYES3、pYES3-Pi-ω3Des。选择后，在每种情况下挑选了两个转化体用于进一步的功能表达。

实施例25：用于植物中种子特异性表达的表达质粒的克隆

产生了基于pSUN-USP的另一个转化载体用于转化植物。为达此目的，使用以下引物对向编码序列的5′和3′端导入NotI切割位点：

PSUN-Pi-ω3Des

反向引物：3‘-GCGGCCGCTTACGTGGACTTGGTC(SEQ ID NO：147)

正向引物：5‘-GCGGCCGCatGGCGACGAAGGAGG(SEQ ID NO：148)

PCR混合物的组成(50μl)：

5.00μl模板cDNA

5.00μl 10x缓冲液(Advantage聚合酶)+25mM MgCl2

5.00μl 2mM的dNTP

1.25μl每种引物(10pmol/μl)

0.50μl Advantage聚合酶

使用了来自Clontech的Advantage聚合酶。

PCR反应条件：

复性温度：55℃ 1分钟

变性温度：94℃ 1分钟

延伸温度：72℃ 2分钟

循环次数：35

PCR产物与限制性酶NotI 37℃温育4小时。植物表达载体pSUN300-USP以同样方式温育。此后通过琼脂糖凝胶电泳分离了PCR产物和7624bp的载体并且切下相应的DNA片段。此后这些DNA通过Qiagen凝胶纯化试剂盒遵循制造商说明纯化。此后连接载体和PCR产物。为此目的，使用了来自Roche的快速连接试剂盒。得到的质粒pSUN-Piω3Des经测序证实。

实施例26：Pi-ω3Des在酵母中表达

将如实施例24中所描述的质粒pYES3或pYES3-Pi-ω3Des转化的酵母按如下方式分析：

来自主培养的酵母细胞经离心(100xg，5分钟，20℃)收获并以pH8.0的100mM NaHCO3洗涤以除去残留的培养基和脂肪酸。脂肪酸甲酯(FAME)从酵母细胞沉淀经酸甲醇分解作用制备。为达此目的，细胞沉淀与2ml的1N甲醇硫酸和2％(v/v)二甲氧丙烷80℃温育1小时。FAME以石油醚(PE)提取两次。在每种情况下为除去未衍生的脂肪酸，有机相以2ml的pH 8.0的100mM NaHCO3和2ml蒸馏水洗涤。随后PE相以Na2SO4干燥，在氩气下蒸发并置于100μl PE中。样品在装备有火焰电离探测器的Hewlett-Packard 6850气相色谱仪的DB-23毛细管柱(30m，0.25mm，0.25μm，Agilent)中分离。GLC分析条件如下：将炉腔温度设置为以每分钟5℃的速率从50℃升至250°并且最后在250℃维持10分钟(保持)。

信号通过比较相应的脂肪酸标准品(Sigma)的保留时间加以鉴定。例如在Napier和Michaelson，2001，Lipids.36(8)：761-766；Sayanova等，2001，Journal of Experimental Botany.52(360)：1581-1585，Sperling等，2001，Arch.Biochem.Biophys.388(2)：293-298和Michaelson等，1998，FEBS Letters.439(3)：215-218中描述了这种方法。

实施例27：Pi-ω3Des的功能特征

在表达和喂饲多种脂肪酸后测定Pi-ω3Des的底物特异性(图12至18)。所喂饲的底物在全部转基因酵母中可大量地检测到，证明酵母摄取了这些脂肪酸。转基因酵母显示合成了作为Pi-ω3Des反应产物的新脂肪酸。这意味基因Pi-ω3Des的功能性表达已为可能。

图12表明Pi-ω3Des将亚油酸(18:2ω-6脂肪酸)去饱和为α亚麻酸(18:3ω-3脂肪酸)。脂肪酸甲酯通过对已由空白载体pYES2(图12A)或载体pYes3-Pi-ω3Des(图12B)转化的完整细胞经酸甲醇分解作用合成。酵母于存在C18:2Δ9，12-脂肪酸(300μM)的基本培养基中生长。随后这些FAME通过GLC分析。

图13表明Pi-ω3Des使γ-亚麻酸(18:3ω-6脂肪酸)去饱和为硬脂艾杜糖酸(18:4ω-3脂肪酸)。脂肪酸甲酯通过对已由空白载体pYES2(图13A)或载体pYes3-Pi-ω3De(图13B)转化的完整细胞经酸甲醇分解作用合成。酵母于存在γ-C18:3Δ6，9，12-脂肪酸(300μM)的基本培养基中生长。随后这些FAME通过GLC分析。

图14表明Pi-ω3Des使C20:2-ω-6脂肪酸去饱和为C20:3-ω-3脂肪酸。脂肪酸甲酯通过对已由空白载体pYES2(图14A)或载体pYes3-Pi-ω3De(图14B)转化的完整细胞经酸甲醇分解作用合成。酵母于存在C20:2Δ11，14-脂肪酸(300μM)的基本培养基中生长。随后这些FAME通过GLC分析。

图15表明Pi-ω3Des使C20:3-ω-6脂肪酸去饱和为C20:4-ω-3脂肪酸。脂肪酸甲酯通过对已由空白载体pYES2(图15A)或载体pYes3-Pi-ω3De(图15B)转化的完整细胞经酸甲醇分解作用合成。酵母于存在C20:3Δ8，11，14-脂肪酸(300μM)的基本培养基中生长。随后这些FAME通过GLC分析。

图16表明Pi-ω3Des将花生四烯酸(C20:4-ω-6脂肪酸)去饱和为二十碳五烯酸(C20:4-ω-3脂肪酸)。

脂肪酸甲酯通过对已由空白载体pYES2(图16A)或载体pYes3-Pi-ω3De(图16B)转化的完整细胞经酸甲醇分解作用合成这些酵母于存在C20:4Δ5，8，11，14脂肪酸(300μM)的基本培养基中生长。随后这些FAME通过GLC分析。

图17表明Pi-ω3Des使二十二碳四烯酸(C22:4-ω-6脂肪酸)去饱和为二十二碳五烯酸(C22:5-ω-3脂肪酸)。脂肪酸甲酯通过对已由空白载体pYES2(图17A)或载体pYes3-Pi-ω3De(图17B)转化的完整细胞经酸甲醇分解作用合成。将酵母在C22:4Δ7，10，13，16脂肪酸(300μM)存在时于基本培养基中生长。随后这些FAME通过GLC分析。

Pi-ω3Des对多种脂肪酸的底物特异性可从图18中发现。已由载体pYes3-Pi-ω3Des转化的酵母于存在所述脂肪酸的基本培养基中生长。脂肪酸甲酯通过对完整细胞的酸甲醇分解作用合成。随后这些FAME通过GLC分析。每个值代表为三个测量的平均值。使用下式：[产物]/[产物]+[底物]×100计算转化率(％去饱和)。

如实施例9中所描述，Pi-ω3Des还可用于产生转基因植物。然后可从这些植物的种子中如实施例6中所描述提取脂类。

实施例28：从Ostreococcus tauri克隆去饱和酶基因

在保守基序(His盒，Domergue等人，2002，Eur.J.Biochem.269，4105-4113)的辅助下搜索蛋白质序列中的保守区域可在Ostreococcus tauri序列数据库(基因组序列)中鉴定五个具有相应基序的序列。这些序列如下显示：

  基因名称   SEQ ID   氨基酸   同源性   OtD4   SEQ ID NO：95   536   Δ4-去饱和酶   OtD5.1   SEQ ID NO：91   201   Δ5-去饱和酶   OtD5.2   SEQ ID NO：93   237   Δ5-去饱和酶   OtD6.1   SEQ ID NO：89   457   Δ6-去饱和酶   OtFad2   SEQ ID NO：107   361   Δ12-去饱和酶

使用tBLASTn算法(Altschul等，J.Mol.Biol.1990，215：403-410)实施了发现单个基因间同源性的比对。

按如下方式进行克隆：

将稳定期的40ml Ostreococcus tauri培养物经离心并且沉淀在100μl双蒸水中重悬并-20℃保存。相关的基因组DNA基于PCR法扩增。相应的引物对以如此方式选择即引物包含紧接起始密码子的用于高效翻译的酵母共有序列(Kozak，Cell 1986，44：283-292)。在每一情况下使用1μl解冻的细胞、200μM dNTP、2.5U Taq聚合酶和每种引物100pmol于总计50μl体积中实施了OtDes-DNA的扩增。PCR的条件如下：首先95℃变性5分钟，其后为94℃30秒、55℃1分钟和72℃2分钟的30个循环，并且终末延伸步骤为72℃10分钟。

以下的引物用于PCR：

OtDes6.1正向引物：5’ggtaccacataatgtgcgtggagacggaaaataacg3’(SEQ ID NO：145)

OtDes6.1反向引物：5’ctcgagttacgccgtctttccggagtgttggcc3’(SEQ ID NO：146)

实施例29：酵母中异源表达的表达质粒的克隆

为描述来自Ostreococcus tauri的去饱和酶OtDes6.1(＝Δ6-去饱和酶)的功能特征，将位于pYES2.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)的半乳糖可诱导启动子GAL1上游的DNA可读框克隆，产生了相应的pYES2.1-OtDes6.1克隆，以类似方式可克隆其它Ostreococcus去饱和酶基因。

酿酒酵母334株以载体pYES2.1-OtDes6.1经电穿孔(1500V)转化。由空白载体pYES2转化的酵母用作对照。已转化的酵母在补加了2％葡萄糖的无尿嘧啶的完全基本培养基(CMdum)琼脂平板上选择。选择后，在每一情况下挑选三个转化体用于进一步的功能性表达。

在每一情况下，为表达OtDes6.1去饱和酶，由5ml补加了2％(w/v)棉子糖的尿嘧啶撤除的CMdum培养基组成的预培养基首先以所选择的转化体接种并且每分钟200转30℃温育2天。然后对5ml补加了2％棉子糖和300μM多种脂肪酸的CMdum(尿嘧啶撤除)液体培养基接种预培养物至OD6000.05。酶的表达通过加入2％(w/v)半乳糖诱导。培养物进一步20℃温育96小时。

实施例30：克隆用于植物中种子特异性表达的表达质粒

产生了基于pSUN-USP的另一个转化载体用于转化植物。为达此目的，使用PCR向编码序列的5′和3′端导入NotI切割位点。对应的引物序列从去饱和酶的5′和3′区域衍生。

PCR混合物的组成(50μl)：

5.00μl模板cDNA

5.00μl 10x缓冲液(Advantage聚合酶)+25mM MgCl2

5.00μl 2mM的dNTP

1.25μl每种引物(10pmol/μl)

0.50μl Advantage聚合酶

使用了来自Clontech的Advantage聚合酶。

PCR反应条件：

复性温度：55℃1分钟

变性温度：94℃1分钟

延伸温度：72℃2分钟

循环次数：35

PCR产物与限制性酶NotI 37℃温育16小时。植物表达载体pSUN300-USP以同样方式温育。此后通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物和载体并且切下相应的DNA片段。此后这些DNA通过Qiagen凝胶纯化试剂盒遵循制造商说明纯化。此后连接载体和PCR产物。为此目的，使用了来自Roche的快速连接试剂盒。得到的质粒经测序证实。

pSUN300是质粒pPZP的衍生物(Hajdukiewicz，P、Svab，Z、Maliga，P.，(1994)The small versatile pPZP family of Agrobacterium binaryvectors for plant transformation.Plant Mol Biol 25：989-994)。通过向pSUN300中插入作为EcoRI片段的USP启动子从pSUN300衍生了pSUN-USP。加A信号是来自根癌农杆菌Ti质粒的章鱼氨酸合酶基因的加A信号(ocs终止子，Genbank Accession V00088)(De Greve，H、Dhaese，P.、Seurinck，J.、Lemmers，M、Van Montagu，M.和Schell，J.Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacteriumtumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase geneJ.Mol.Appl.Genet.1(6)，499-511(1982)。USP启动子对应于第1-684位的核苷酸(Genbank Accession X56240)，其中USP基因非编码区的一部分存在于USP启动子中。684碱基对大小的USP启动子片段以商业上可获得的T7标准引物(Stratagene)和经合成的引物(引物序列：5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3’，SEQ ID NO：144)通过遵循标准方法的PCR反应扩增。这个PCR片段再用EcoRI/SalI切割并且导入带OCS终止子的pSUN300载体。由此产生了名为pSUN-USP的质粒。这种构建体用于转化拟南芥菜、油菜籽、烟草和亚麻子。

实施例31：OtDes6.1在酵母中的表达

经质粒pYES2和pYES2-OtDes6.1如实施例4中所描述转化的酵母按如下方式分析：

来自主培养的酵母细胞经离心(100xg，5分钟，20℃)收获并以pH8.0的100mM NaHCO3洗涤以除去残留的培养基和脂肪酸。脂肪酸甲酯(FAME)从酵母细胞沉淀经酸甲醇分解作用制备。为达此目的，细胞沉淀与2ml的1N甲醇硫酸和2％(v/v)二甲氧丙烷80℃温育1小时。FAME以石油醚(PE)提取两次。在每种情况下，为除去未衍生的脂肪酸，有机相以2ml的pH 8.0的100mM NaHCO3和2ml蒸馏水洗涤。随后PE相以Na2SO4干燥，在氩气下蒸发并置于100μl PE中。样品在装备有火焰电离探测器的Hewlett-Packard 6850气相色谱仪的DB-23毛细管柱(30m，0.25mm，0.25μm，Agilent)中分离。GLC分析条件如下：将炉腔温度设置为以每分钟5℃的速率从50℃升至250并且最后在250℃维持10分钟(保持)。

信号通过比较相应的脂肪酸标准品(Sigma)的保留时间加以鉴定。例如在Napier和Michaelson，2001，Lipids.36(8)：761-766；Sayanova等，2001，Journal of Experimental Botany.52(360)：1581-1585，Sperling等，2001，Arch.Biochem.Biophys.388(2)：293-298和Michaelson等，1998，FEBS Letters.439(3)：215-218中描述了这种方法。

实施例32：Ostreococcus去饱和酶的功能特征

去饱和酶的底物特异性可在酵母中表达酶后通过喂饲、使用多种酵母(见克隆去饱和酶基因、酵母表达的实施例)测定。对单种活性测定的描述可在WO 93/11245中对Δ15去饱和酶的描述；WO 94/11516中对Δ12去饱和酶的描述；WO 93/06712、US 5,614,393、US 5,614,393、WO 96/21022、WO 0021557和WO 99/27111中对Δ6去饱和酶的描述；Qiu等，2001，J.Biol.Chem.276，31561-31566对Δ4去饱和酶的描述；Hong等，2002，Lipids 37，863-868对Δ5去饱和酶的描述中找到。

表9显示了OtDes6.1去饱和酶对多种脂肪酸的底物特异性。OtDes6.1的底物特异性在表达后和喂饲多种脂肪酸后测定。所喂饲的底物在全部转基因酵母中可大量地检测到。转基因酵母显示合成了作为OtDes6.1反应产物的新脂肪酸(图20)。这意味着功能性表达了基因OtDes6.1。

用载体pYes2-OtDes6.1转化的酵母于所述脂肪酸存在的基本培养基中生长。脂肪酸甲酯通过对完整细胞的酸甲醇分解作用合成。随后这些FAME通过GLC分析。每个值表示为平均值(n＝3)±标准差。活性是使用公式底物/(底物+产物)＊100]计算的转化率。

表9表明OtDes6.1去饱和酶对油酸和亚油酸(18:2和18:3)具有底物特异性，原因在于这些脂肪酸引起了最高的活性。相反，对油酸(18:1)和棕榈油酸(16:1)的活性基本不显著。优选转化亚油酸和亚麻酸表明这种去饱和酶适合于产生多不饱和脂肪酸。

表9

  底物   活性(％) 16:1Δ9   5.6

  底物   活性(％) 18:1Δ9   13.1 18:2Δ9，12   68.7 18:3Δ9，12，15   64.6

图20表明OtDes6.1转化了亚油酸。FAME通过气相色谱分析。所喂饲的底物(C18:2)转化为γ-C18:3。箭头指示起始材料和形成的产物。

图21表明当存在OtDes6.1时分别使亚油酸(LA)和α-亚麻酸(ALA)转化以产生γ-亚麻酸(GLA)和硬脂艾杜糖酸(STA)(图21A和C)。图21还显示当Δ6去饱和酶OtDes6.1与来自展叶剑叶藓的Δ6延伸酶PSE1(Zank等2002，Plant J.31：255-268)和来自三角褐指藻的Δ5去饱和酶PtD5(Domergue等2002，Eur.J.Biochem.269，4105-4113)共同存在时分别使亚油酸(LA)和α-亚麻酸(ALA)转化以产生二高γ-亚麻酸(DHGLA)和花生四烯酸(ARA，图21B)以及产生二高硬脂艾杜糖酸(DHSTA)和二十碳五烯酸(EPA，图21D)。图21清晰地表明当存在Δ6延伸酶PSE1时几乎定量地使Δ6去饱和酶OtDes6.1的反应产物GLA和STA分别延伸以产生DHGLA和DHSTA。接下来由Δ5去饱和酶PtD5进行去饱和以分别产生ARA和EPA同样是毫无困难的。大约25％-30％的延伸酶产物被去饱和(图21B和D)。

此处的表10为已克隆的Ostreococcus去饱和酶的概览。

实施例33：从假矮海链藻中克隆去饱和酶基因

在保守基序(His盒，参见基序)的辅助下搜索蛋白质序列中的保守区域可在假矮海链藻序列数据库(基因组序列)中鉴定六个具有相应基序的序列。序列如下：

  基因名称   SEQ ID   氨基酸   同源性   TpD4   SEQ ID NO：103   503   Δ-4-去饱和酶   TpD5-1   SEQ ID NO：99   476   Δ-5-去饱和酶   TpD5-2   SEQ ID NO：101   482   Δ-5-去饱和酶   TpD6   SEQ ID NO：97   484   Δ-6-去饱和酶   TpFAD2   SEQ ID NO：109   434   Δ-12-去饱和酶   TpO3   SEQ ID NO：105   418   ω-3-去饱和酶

克隆程序按如下方式进行：

稳定期的40ml假矮海链藻培养物经过离心并且沉淀在100μl双蒸水中重悬并且-20℃保存。相关的基因组DNA基于PCR法扩增。以如此方式选择相应的引物对即引物包含紧接起始密码子的用于高效翻译的酵母共有序列(Kozak，Cell 1986，44：283-292)。在每一情况下使用1μl解冻的细胞、200μM dNTP、2.5U Taq聚合酶和每种引物100pmol于总计50μl体积中实施了TpDes-DNA的扩增。PCR的条件如下：首先95℃变性5分钟，其后为94℃30秒、55℃1分钟和在72℃2分钟的30个循环，并且终末延伸步骤为72℃10分钟。

实施例34：用于酵母中异源表达的表达质粒的克隆

为描述假矮海链藻去饱和酶的功能特征，将所讨论的DNA的可读框克隆于pYES2.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)的半乳糖可诱导启动子GAL1的下游，产生了相应的pYES2.1克隆。

酿酒酵母334株以载体pYES2.1-TpDesatauresen经电穿孔(1500V)转化。经空白载体pYES2转化的酵母作为对照使用。已转化的酵母在补加了2％葡萄糖但缺乏尿嘧啶的完全基本培养基(CMdum)琼脂平板上选择。选择后，每种情况挑选三个转化体用于进一步的功能性表达。

在每一情况下，为了表达Tp去饱和酶，5ml由补加了2％(w/v)棉子糖但缺乏尿嘧啶的CMdum培养基组成的预培养基首先以所选择的转化体接种并且每分钟200转30℃温育2天。然后将5ml补加了2％棉子糖和300μM多种脂肪酸的CMdum(尿嘧啶撤除)液体培养基接种预培养物至OD600 0.05。酶的表达通过加入2％(w/v)半乳糖诱导。培养物在20℃下进一步温育96小时。

实施例35：植物中种子特异性表达的表达质粒的克隆

产生了基于pSUN-USP的另一个转化载体用于转化植物。为达此目的，使用PCR向编码序列的5′和3′端导入NotI切割位点。对应的引物序列从去饱和酶的5′和3′区域衍生。

PCR混合物的组成(50μl)：

5.00μl模板cDNA

5.00μl 10x缓冲液(Advantage聚合酶)+25mM MgCl2

5.00μl 2mM的dNTP

1.25μl每种引物(10pmol/μl)

0.50μl Advantage聚合酶

使用了来自Clontech的Advantage聚合酶。

PCR反应条件：

复性温度：55℃ 1分钟

变性温度：94℃ 1分钟

延伸温度：72℃ 2分钟

循环次数：35

PCR产物与限制性酶NotI 37℃温育16小时。植物表达载体pSUN300-USP以同样方式温育。此后通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物和载体并且切下相应的DNA片段。此后这些DNA通过Qiagen凝胶纯化试剂盒遵循制造商说明纯化。此后连接载体和PCR产物。使用了来自Roche的快速连接试剂盒以便连接。得到的质粒经测序证实。

pSUN300是质粒pPZP的衍生物(Hajdukiewicz，P、Svab，Z、Maliga，P.，(1994)The small versatile pPZP family of Agrobacterium binaryvectors for plant transformation.Plant Mol Biol 25：989-994)。通过向pSUN300中插入作为EcoRI片段的USP启动子从pSUN300衍生了pSUN-USP。加A信号是来自根癌农杆菌Ti质粒的章鱼氨酸合酶基因的加A信号(ocs终止子，Genbank Accession V00088)(De Greve，H、Dhaese，P.、Seurinck，J.、Lemmers，M、Van Montagu，M.和Schell，J.Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacteriumtumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase geneJ.Mol.Appl.Genet.1(6)，499-511(1982)。USP启动子对应于第1-684位的核苷酸(Genbank Accession X56240)，其中USP基因非编码区的一部分存在于USP启动子中。684碱基对大小的USP启动子片段以商业上可获得的T7标准引物(Stratagene)和经合成的引物(引物序列：5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3’；SEQ ID NO：143)通过遵循标准方法的PCR反应扩增。这个PCR片段再用EcoRI/SalI切割并且导入带OCS终止子的pSUN300载体。由此产生了名为pSUN-USP的质粒。这种构建体用于转化拟南芥菜、油菜籽、烟草和亚麻子。

实施例36：Tp去饱和酶在酵母中的表达

如实施例4中所描述由质粒pYES2和pYES2-Tp转化的酵母以如下方式分析：

来自主培养的酵母细胞经离心(100xg，5分钟，20℃)收获并以pH8.0的100mM NaHCO3洗涤以除去残留的培养基和脂肪酸。脂肪酸甲酯(FAME)从酵母细胞沉淀经酸甲醇分解作用制备。为达此目的，细胞沉淀与2ml的1N甲醇硫酸和2％(v/v)二甲氧丙烷80℃温育1小时。FAME以石油醚(PE)提取两次。在每一情况下为除去未衍生的脂肪酸，有机相以2ml的pH 8.0的100mM NaHCO3和2ml蒸馏水洗涤。随后PE相以Na2SO4干燥，在氩气下蒸发并置于100μl PE中。样品在装备有火焰电离探测器的Hewlett-Packard 6850气相色谱仪的DB-23毛细管柱(30m，0.25mm，0.25μm，Agilent)中分离。GLC分析条件如下：将炉腔温度设置为以每分钟5℃的速率从50℃升至250°并且最后在250℃维持10分钟(保持)。

信号通过比较相应的脂肪酸标准品(Sigma)的保留时间加以鉴定。例如在Napier和Michaelson，2001，Lipids.36(8)：761-766；Sayanova等，2001，Journal of Experimental Botany.52(360)：1581-1585，Sperling等，2001，Arch.Biochem.Biophys.388(2)：293-298和Michaelson等，1998，FEBS Letters.439(3)：215-218中描述了这种方法。

实施例37：假矮海链藻去饱和酶的功能特征

去饱和酶的底物特异性可在酵母中表达后通过使用多种酵母的喂饲(见克隆去饱和酶基因、酵母表达的实施例)测定。对单种活性测定的描述可在WO 93/11245中对Δ15去饱和酶的描述；WO 94/11516中对Δ12去饱和酶的描述；WO 93/06712、US 5,614,393、US 5,614,393、WO 96/21022、WO 0021557和WO 99/27111中对Δ6去饱和酶的描述；Qiu等，2001，J.Biol.Chem.276，31561-31566对Δ4去饱和酶的描述；Hong等，2002，Lipids 37，863-868对Δ5去饱和酶的描述中找到。

单种去饱和酶的活性使用公式：底物/(底物+产物)＊100]从转化率计算。

以下表11和12为经克隆的假矮海链藻去饱和酶的概览。

表11：经克隆的海链藻去饱和酶的长度和特征

  去饱和酶   cDNA  (bp)   蛋白质(aa)   Cyt.B5   His盒1   His盒2   His盒3   TpD4   1512   503   HPGG   HDGNH   WELQHMLGHH   QIEHHLFP   TpD5-1   1431   476   HPGG   HDANH   WMAQHWTHH   QVEHHLFP   TpD5-2   1443   482   HPGG   HDANH   WLAQHWTHH   QVEHHLFP   TpD6   1449   484   HPGG   HDFLH   WKNKHNGHH   QVDHHLFP   TpFAD2  (d12)   1305   434   -   HECGH   HAKHH   HVAHHLFH   TpO3   1257   419   -   HDAGH   WLFMVTYLQHH   HVVHHLF

表12：经克隆的去饱和酶的长度、外显子、同源性和同源性

  Des.   GDNA(bp)   外显子1   外显子2   第一Blast Hit   Hom./Iden.   TpD4   2633   496-1314   1571-2260   破囊壶菌D4-des   56％/43％   TpD5-1   2630   490-800   900-2019   褐指藻D5-des   74％/62％   TpD5-2   2643   532-765   854-2068   褐指藻D5-des   72％/61％

  Des.   GDNA(bp)   外显子1   外显子2   第一Blast Hit   Hom./Iden.   TpD6   2371   379-480   630-1982   褐指藻D6-des   83％/69％   TpFAD2   2667   728-2032   -   褐指藻FAD2   76％/61％   TpO3   2402   403-988   1073-1743   隐杆线虫Fad2   49％/28％

来自Ostreococcus和海链藻的Δ12去饱和酶基因也可按以上提及的实施例类似地克隆。

实施例38：从非洲爪蟾和玻璃海鞘中克隆延伸酶基因

在本申请中所详述的具有Δ5-延伸酶活性或Δ6-延伸酶活性的延伸酶基因的辅助下，通过在基因数据库(Genebank)中搜索蛋白质序列内的保守区域(见共有序列SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116)，可鉴定和分离其它生物来源的其它延伸酶。可使用合适的基序分别鉴定非洲爪蟾和玻璃海鞘来源的其它序列。这些序列如下显示：

  基因名称   生物   Genbank No.   SEQ ID  NO：   氨基酸   ELO(Xl)   非洲爪蟾   BC044967   117   303   ELO(Ci)   玻璃海鞘   AK112719   119   290

非洲爪蟾cDNA克隆从NIH(国立健康研究所)[genetic and genomictools for Xenopus research：The NIH Xenopus initiative，Dev.Dyn.225(4)，384-391(2002)]获得。

玻璃海鞘cDNA克隆从Kyoto大学[Satou，Y.，Yamada，L.，Mochizuki，Y.，Takatori，N.，Kawashima，T.，Sasaki，A.，Hamaguchi，M.，Awazu，S.，Yagi，K.，Sasakura，Y.，Nakayama，A.，Ishikawa，H.，Inaba，K.and Satoh，N.“A cDNA resource fromthe basal chordate Ciona intestinalis”JOURNAL  Genesis 33(4)，153-154(2002)]获得。

实施例39：用于酵母中异源表达的表达质粒的克隆

延伸酶DNA在每一情况下以1μl cDNA、200μM dNTP、2.5UAdvantage聚合酶和每种引物100pmol于总计50μl体积中扩增。PCR的条件如下：首先95℃变性5分钟，其后为94℃30秒、55℃1分钟和72℃2分钟的30个循环，并且终末延伸步骤为72℃10分钟。

以下寡核苷酸用于克隆酵母中异源表达的序列的PCR反应：

  基因名称和SEQ ID NO：   引物序列   ELO(X1)SEQ ID NO：121  SEQ ID NO：122   F：5’-AGGATCCATGGCCTTCAAGGAGCTCACATC  R：5’-  CCTCGAGTCAATGGTTTTTGCTTTTCAATGCACCG   ELO(Ci)，SEQ ID NO：123  SEQ ID NO：124   F：5’-TAAGCTTATGGACGTACTTCATCGT  R：5’-TCAGATCTTTAATCGGTTTTACCATT

＊F＝正向引物，R＝反向引物

PCR产物与酵母表达载体pYES2.1-TOPO(Invitrogen)根据制造商说明21℃温育30分钟。这里通过T突出端和拓扑异构酶(Invitrogen)活性向载体连入PCR产物。在温育后转化大肠杆菌DH5α细胞。合适的克隆通过PCR鉴定，质粒DNA通过Qiagen DNAeasy试剂盒分离并且经测序证实。然后将正确的序列经电穿孔(1500V)转化入酵母株INVSc1(Invitrogen)。平行转化空白载体pYES2.1作为对照。此后将酵母在补加了2％葡萄糖的尿嘧啶撤除基本培养基上铺板。能够在无尿嘧啶的培养基中生长的细胞包含相应的质粒pYES2.1、pYES2.1-ELO(Xl)和pYES2.1-ELO(Ci)。选择后，在每种情况下挑选了两个转化体用于进一步的功能性表达。

实施例40：植物中种子特异性表达的表达质粒的克隆

产生了基于pSUN-USP的另一个转化载体用于转化植物。为达此目的，使用以下引物对向编码序列的5′和3′端导入NotI切割位点：

pSUN-ELO(Xl)

正向引物：

5‘-GCGGCCGCACCATGGCCTTCAAGGAGCTCACATC(SEQ ID NO：125)

反向引物：

3‘-GCGGCCGCCTTCAATGGTTTTTGCTTTTCAATGCACCG(SEQ ID NO：126)

pSUN-ELO(Ci)

正向引物：5‘-GCGGCCGCACCATGGACGTACTTCATCGT(SEQ ID NO：127)

反向引物：3‘-GCGGCCGCTTTAATCGGTTTTACCATT(SEQ ID NO：128)

PCR混合物的组成(50μl)：

5.00μl模板cDNA

5.00μl 10x缓冲液(Advantage聚合酶)+25mM MgCl2

5.00μl 2mM的dNTP

1.25μl每种引物(10pmol/μl)

0.50μl Advantage聚合酶

使用了来自Clontech的Advantage聚合酶。

PCR反应条件：

复性温度：55℃ 1分钟

变性温度：94℃ 1分钟

延伸温度：72℃ 2分钟

循环次数：35

PCR产物与限制性酶NotI 37℃温育16小时。植物表达载体pSUN300-USP以同样方式温育。此后通过琼脂糖凝胶电泳分离了PCR产物和7624bp的载体并且切下相应的DNA片段。此后这些DNA通过Qiagen凝胶纯化试剂盒遵循制造商说明纯化。此后连接载体和PCR产物。使用了来自Roche的快速连接试剂盒以便连接。得到的质粒pSUN-ELO(Xl)和pSUN-ELO(Ci)经测序证实。

pSUN300是质粒pPZP的衍生物(Hajdukiewicz，P、Svab，Z、Maliga，P.，(1994)The small versatile pPZP family of Agrobacterium binaryvectors for plant transformation.Plant Mol Biol 25：989-994)。通过向pSUN300中插入作为EcoRI片段的USP启动子从pSUN300衍生了pSUN-USP。加A信号是来自根癌农杆菌Ti质粒的章鱼氨酸合酶基因的加A信号(ocs终止子，Genbank Accession V00088)(De Greve，H、Dhaese，P.、Seurinck，J.、Lemmers，M、Van Montagu，M.和Schell，J.Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacteriumtumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase geneJ.Mol.Appl.Genet.1(6)，499-511(1982)。USP启动子对应于第1-684位的核苷酸(Genbank Accession X56240)，其中USP基因非编码区的一部分存在于USP启动子中。684碱基对大小的USP启动子片段以商业上可获得的T7标准引物(Stratagene)和经合成的引物(引物序列：5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3’；SEQ ID NO：129))通过遵循标准方法的PCR反应扩增。这个PCR片段再用EcoRI/SalI切割并且导入带OCS终止子的pSUN300载体。由此产生了名为pSUN-USP的质粒。这种构建体用于转化拟南芥菜、油菜籽、烟草和亚麻子。

如实施例6所述自酵母和种子提取脂类。

实施例41：ELO(XI)和ELO(Ci)在酵母中的表达

如实施例4中所描述的由质粒pYES2，pYES2-ELO(Xl)和pYES2-ELO(Ci)转化的酵母按如下方式分析：

来自主培养的酵母细胞经离心(100xg，5分钟，20℃)收获并以pH8.0的100mM NaHCO3洗涤以除去残留的培养基和脂肪酸。脂肪酸甲酯(FAME)从酵母细胞沉淀经酸甲醇分解作用制备。为达此目的，细胞沉淀与2ml的1N甲醇硫酸和2％(v/v)二甲氧丙烷80℃温育1小时。FAME以石油醚(PE)提取两次。在每一情况下，为除去未衍生的脂肪酸，有机相以2ml的pH 8.0的100mM NaHCO3和2ml蒸馏水洗涤。随后PE相以Na2SO4干燥，在氩气下蒸发并置于100μl PE中。样品在装备有火焰电离探测器的Hewlett-Packard 6850气相色谱仪的DB-23毛细管柱(30m，0.25mm，0.25μm，Agilent)中分离。GLC分析条件如下：将炉腔温度设置为以每分钟5℃的速率从50℃升至250°并且最后在250℃维持10分钟(保持)。

信号通过比较相应的脂肪酸标准品(Sigma)的保留时间加以鉴定。例如在Napier和Michaelson，2001，Lipids.36(8)：761-766；Sayanova等，2001，Journal of Experimental Botany.52(360)：1581-1585，Sperling等，2001，Arch.Biochem.Biophys.388(2)：293-298和Michaelson等，1998，FEBS Letters.439(3)：215-218中描述了这种方法。

实施例42：ELO(XI)和ELO(Ci)的功能特征

ELO(XI)的底物特异性在表达和在喂饲多种脂肪酸后测定(图22)。所喂饲的底物在全部转基因酵母中可大量地检测到。转基因酵母显示合成了作为ELO(XI)反应产物的新脂肪酸。这意味基因ELO(XI)功能性地得以表达。

表13表明ELO(XI)具有宽泛的底物特异性。C18脂肪酸和C20脂肪酸均得到延伸，优选地观察到了经Δ5和Δ6去饱和的脂肪酸。

经载体pYES2-ELO(Xl)所转化的酵母于存在所述脂肪酸的基本培养基中生长。脂肪酸甲酯通过对完整细胞的酸甲醇分解作用合成。随后这些FAME通过GLC分析。

表13：ELO(Xl)在酵母中的表达。显示了不同起始物质(在每一情况下以250μM喂饲)的转化率。

起始物质  ELO(Xl)对起始物质的转化(％) 16:0   3 16:1Δ9   0 18:0   2 18:1Δ9   0 18:2Δ9，12   3 18:3Δ6，9，12   12 18:3Δ5，9，12   13 18:3Δ9，12，15   3

起始物质 ELO(Xl)对起始物质的转化(％) 18:4Δ6，9，12，15   20 20:3Δ8，11，14   5 20:3Δ11，14，17   13 20:4Δ5，8，11，14   15 20:5Δ5，8，11，14，17   10

起始物质 ELO(Xl)对起始物质的转化(％) 22:4Δ7，10，13，16   0 22:6Δ4，7，10，13，16，19   0

ELO(Ci)的底物特异性在表达和在喂饲多种脂肪酸后测定(图23)。所喂饲的底物在全部转基因酵母中可大量地检测到。转基因酵母显示合成了作为ELO(Ci)反应产物的新脂肪酸。这意味基因ELO(Ci)得到功能性表达。

表14：ELO(Ci)在酵母中的表达。显示了不同起始物质(在每一情况下以250μM喂饲)的转化率。

起始物质 ELO(Ci)对起始物质的转化(％) 16:0   0 16:1Δ9   0 18:0   0 18:1Δ9   0 18:2Δ9，12   23 18:3Δ6，9，12   10

起始物质   ELO(Ci)对起始物质的转化(％) 18:3Δ5，9，12   38 18:3Δ9，12，15   25 18:4Δ6，9，12，15   3 20:3Δ8，11，14   10 20:3Δ11，14，17   8 20:4Δ5，8，11，14   10

起始物质   ELO(Ci)对起始物质的转化(％) 20:5Δ5，8，11，14，17   15 22:4Δ7，10，13，16   0 22:6Δ4，7，10，13，16，19   0

表14表明ELO(Ci)具有宽泛的底物特异性。C18脂肪酸和C20脂肪酸均得到了延伸，优选地观察到了经Δ5和Δ6去饱和的脂肪酸。

经载体pYES2-ELO(Ci)所转化的酵母于存在所述脂肪酸的基本培养基中生长。脂肪酸甲酯通过对完整细胞的酸甲醇分解作用合成。随后这些FAME通过GLC分析。

实施例43：从Ostreococcus tauri克隆基因

在此处所描述的具有Δ5-延伸酶活性或Δ6-延伸酶活性的延伸酶基因的辅助下，通过搜索蛋白质序列中的保守区域，在每种情况下可在Ostreococcus tauri序列数据库(基因组序列)中鉴定2个具有相应基序的序列。序列如下：

  基因名称   SEQ ID   氨基酸   OtELO1，(Δ5-延伸酶)   SEQ ID NO：67   300   OtELO1.2，(Δ5-延伸酶)   SEQ ID NO：113   300

  OtELO2，(Δ6-延伸酶)   SEQ ID NO：69   292   OtELO2.1，(Δ6-延伸酶)   SEQ ID NO：111   292

OtElo1和OtElo1.2表现了与斑马鱼来源(GenBank AAN77156；约26％同源性)的延伸酶最高程度的相似性，而OtElo2和OtElo2.1表现了与剑叶藓Elo(PSE)最高程度的相似性[约36％同源性](用tBLASTn算法进行比对(Altschul等，J.Mol.Biol.1990，215：403-410))。

延伸酶按如下方式克隆：

稳定期的40ml Ostreococcus tauri培养物经过离心并且沉淀在100μl双蒸水中重悬并-20℃保存。相关的基因组DNA基于PCR法扩增。以如此方式选择了相应的引物对即引物携有紧邻起始密码子的用于高效翻译的酵母共有序列(Kozak，Cell 1986，44：283-292)。在每一情况下使用1μl解冻的细胞、200μM dNTP、2.5U Taq聚合酶和每种引物100pmol于总计50μl体积中实施了OtElo-DNA的扩增。PCR的条件如下：首先95℃变性5分钟，其后为94℃30秒、55℃1分钟和72℃2分钟的30个循环，并且终末延伸步骤为72℃10分钟。

实施例44：酵母中异源表达的表达质粒的克隆

为描述Ostreococcus tauri延伸酶的功能特征，将所讨论的DNA的可读框克隆于pYES2.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)的半乳糖可诱导启动子GAL1下游，产生了相应的pOTE1、pOTE1.2、pOTE2和pOTE2.1克隆。

酿酒酵母334株分别以载体pOTE1，pOTE1.2，pOTE2和pOTE2.1经电穿孔(1500V)转化。经空白载体pYES2转化的酵母用作对照。已转化的酵母在补加了2％葡萄糖但缺乏尿嘧啶的完全基本培养基(CMdum)琼脂平板上选择。选择后，在每种情况下挑选三个转化体用于进一步的功能性表达。

为表达Ot延伸酶，在每种情况下对5ml由补加了2％(w/v)棉子糖但缺乏尿嘧啶的CMdum培养基组成的预培养基首先以经选择的转化体接种并且每分钟200转30℃温育2天。然后将5ml补加了2％棉子糖和300μM多种脂肪酸的CMdum(尿嘧啶撤除)液体培养基以预培养物接种至OD6000.05。酶的表达通过加入2％(w/v)半乳糖诱导。培养物进一步20℃温育96小时。

实施例45：植物中种子特异性表达的表达质粒的克隆

产生了基于pSUN-USP的另一个转化载体用于转化植物。为达此目的，使用PCR向编码序列的5′和3′端导入NotI切割位点。对应的引物序列从OtElo1、OtElo1.2、OtElo2和OtElo2.1的5′和3′区域衍生。

PCR混合物的组成(50l)：

5.00μl模板cDNA

5.00μl 10x缓冲液(Advantage聚合酶)+25mM MgCl2

5.00μl 2mM的dNTP

1.25μl每种引物(10pmol/μl)

0.50μl Advantage聚合酶

使用了来自Clontech的Advantage聚合酶。

PCR反应条件：

复性温度：55℃ 1分钟

变性温度：94℃ 1分钟

延伸温度：72℃ 2分钟

循环次数：35

PCR产物与限制性酶NotI 37℃温育16小时。植物表达载体pSUN300-USP以同样方式温育。此后通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物和载体并且切下相应的DNA片段。此后这些DNA通过Qiagen凝胶纯化试剂盒遵循制造商说明纯化。此后连接载体和PCR产物。使用了来自Roche的快速连接试剂盒以便连接。得到的质粒pSUN-OtElIO1、pSUN-OtELO1.2、pSUN-OtELO2和pSUN-OtELO2.2经测序证实。

pSUN300是质粒pPZP的衍生物(Hajdukiewicz，P、Svab，Z、Maliga，P.，(1994)The small versatile pPZP family of Agrobacteriumbinary vectors for plant transformation.Plant Mol Biol 25：989-994)。通过向pSUN300中插入作为EcoRI片段的USP启动子从pSUN300衍生了pSUN-USP。加A信号是来自根癌农杆菌Ti质粒的章鱼氨酸合酶基因的加A信号(ocs终止子，Genbank Accession V00088)(De Greve，H、Dhaese，P.、Seurinck，J.、Lemmers，M、Van Montagu，M.和Schell，J.Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacteriumtumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase geneJ.Mol.Appl.Genet.1(6)，499-511(1982)。USP启动子对应于第1-684位的核苷酸(Genbank Accession X56240)，其中USP基因非编码区的一部分存在于USP启动子中。684碱基对大小的USP启动子片段以商业上可获得的T7标准引物(Stratagene)和经合成的引物(引物序列：5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3’.SEQ ID NO：130)通过遵循标准方法的PCR反应扩增。这个PCR片段再用EcoRI/SalI切割并且插入带OCS终止子的pSUN300载体。由此产生了名为pSUN-USP的质粒。这种构建体用于转化拟南芥菜、油菜籽、烟草和亚麻子。

实施例46：OtElo1、OtElo1.2、OtElo2和OtELO2.2在酵母中的表达

如实施例15中所描述的由质粒pYES3，pYES3-OtELO1，pYES3-OtELO1.2，pYES3-OtELO2和pYES3-OtELO2.2转化的酵母按如下方式分析：

来自主培养的酵母细胞经离心(100xg，5分钟，20℃)收获并以pH8.0的100mM NaHCO3洗涤以除去残留的培养基和脂肪酸。脂肪酸甲酯(FAME)从酵母细胞沉淀经酸甲醇分解作用制备。为达此目的，细胞沉淀与2ml的1N甲醇硫酸和2％(v/v)二甲氧丙烷80℃温育1小时。FAME以石油醚(PE)提取两次。在每一情况下，为除去未衍生的脂肪酸，有机相以2ml的pH 8.0的100mM NaHCO3和2ml蒸馏水洗涤。随后PE相以Na2SO4干燥，在氩气下蒸发并置于100μl PE中。样品在装备有火焰电离探测器的Hewlett-Packard 6850气相色谱仪的DB-23毛细管柱(30m，0.25mm，0.25μm，Agilent)中分离。GLC分析条件如下：将炉腔温度设置为以每分钟5℃的速率从50℃升至250°并且最后在250℃维持10分钟(保持)。

信号通过比较相应的脂肪酸标准品(Sigma)的保留时间加以鉴定。例如在Napier和Michaelson，2001，Lipids.36(8)：761-766；Sayanova等，2001，Journal of Experimental Botany.52(360)：1581-1585，Sperling等，2001，Arch.Biochem.Biophys.388(2)：293-298和Michaelson等，1998，FEBS Letters.439(3)：215-218中描述了这种方法。

实施例47：OtElo1、OtElo1.2、OtElo2和OtELO2.1的功能特征

OtElo1的底物特异性在表达和在喂饲多种脂肪酸后测定(表15)。所喂饲的底物在全部转基因酵母中可大量地检测到。转基因酵母显示合成了作为OtElo1反应产物的新脂肪酸。这意味基因OtElo1得到功能性地表达。

表15表明OtElo1和OtElo1.2具有窄的底物特异性。OtElo1和OtElo1.2只能延伸C20脂肪酸二十碳五烯酸(图24A、24B)和花生四烯酸(图25A、25B)，但是优选延伸ω-3去饱和的二十碳五烯酸。

表15表明同多种脂肪酸比较，延伸酶OtElo1和OtElo1.2对Δ5位置具备双键的C20多不饱和脂肪酸具有底物特异性。

分别由载体pOtElo1和pOtElo1.2转化的酵母在存在所述脂肪酸的基本培养基中生长。脂肪酸甲酯通过对完整细胞的酸甲醇分解作用合成。随后这些FAME通过GLC分析。

OtElo1(SEQ ID NO：81)和OtElo2.1(SEQ ID NO：111)的底物特异性在表达和在喂饲多种脂肪酸后测定(表16)。所喂饲的底物在全部转基因酵母中可大量地检测到。转基因酵母显示合成了作为OtElo2反应产物的新脂肪酸。这意味着功能性表达了基因OtElo2和OtElo2.1。

表15

  脂肪酸底物   转化率(％)  OtElo1   转化率(％)  OtElo1.2   16:θ   -   -

脂肪酸底物   转化率(％)  OtElo1   转化率(％)  OtElo1.2 16:1Δ9   -   - 18:θ   -   - 18:1Δ9   -   - 18:1Δ11   -   - 18:2Δ9，12   -   - 18:3Δ6，9，12   -   - 18:3Δ5，9，12   -   - 20:3Δ8，11，14   -   - 20:4Δ5，8，11，14   10.8±0.6   38.0 20:5Δ5，8，11，14，17   46.8±3.6   68.6 22:4Δ7，10，13，16   -   - 22:6Δ4，7，10，13，16，19   -   -

表16显示了延伸酶OtElo2和OtElo2.1对多种脂肪酸的底物特异性。OtElo2.1的活性明显较高。

已分别由载体pOtElo2和pOtElo2.1转化的酵母在存在所述脂肪酸的基本培养基中生长。脂肪酸甲酯通过对完整细胞的酸甲醇分解作用合成。随后这些FAME通过GLC分析。

在表16中显示的酶活性清楚地表明OtElo2或OtElo2.1是Δ6延伸酶。

表16：

  脂肪酸底物   转化率(％)  OtElo2   转化率(％)  OtELO2.2   16:0   -   -   16:1Δ9   -   -   16:3Δ7，10，13   -   -

18:θ   -   - 18:1Δ6   -   - 18:1Δ9   -   - 18:1Δ11   -   - 18:2Δ9，12   -   - 18:3Δ6，9，12   15.3   55.7 18:3Δ5，9，12   -   - 18:4Δ6，9，12，15   21.1   70.4 20:2Δ11，14   -   - 20:3Δ8，11，14   -   - 20:4Δ5，8，11，14   -   - 20:5Δ5，8，11，14，17   -   - 22:4Δ7，10，13，16   -   - 22:5Δ7，10，13，16，19   -   -

18:θ   -   - 22:6Δ4，7，10，13，16，19   -   -

图24A-D分别显示了OtElo1(B)和OtElo1.2(D)对二十碳五烯酸的延伸。对照(A、C)未显示延伸产物(22:5ω3)。

图25A-D分别显示了OtElo1(B)和OtElo1.2(D)对花生四烯酸的延伸。对照(A、C)未显示延伸产物(22:4ω6)。

实施例48：从细小裸藻和拟南芥菜中克隆基因

在本申请中所详述的具有Δ5延伸酶活性或Δ6延伸酶活性的延伸酶基因的辅助下，通过搜索蛋白质序列中的保守区域，可在序列数据库(Genbank，裸藻EST文库)中鉴定分别来自以南芥菜和细小裸藻的具有相应基序的序列。序列如下：

  基因名称   SEQ ID   氨基酸   EGY1019(细小裸藻)   SEQ ID NO：131   262   EGY2019(细小裸藻)   SEQ ID NO：133   262   At3g06460(拟南芥菜)   SEQ ID NO：135   298

  At3g06470(拟南芥菜)   SEQ ID NO：137   278

将细小裸藻延伸酶按如下方式克隆：

细小裸藻1224-5/25株从Sammlung für Algenkulturen[collection of algal cultures](SAG)获得。该株在培养基II(Calvayrac R和Douce R，FEBS Letters 7：259-262，1970)中于23℃以8小时/16小时光照/黑暗(光照密度35mol s-1m-2)周期生长4天。

用来自Qiagen的RNAeasy试剂盒(Valencia，CA，美国)分离了四日龄的裸藻培养物的总RNA。聚腺苷酸化RNA(mRNA)以寡聚-dT-纤维素从这种总RNA中分离(Sambrook等，1989)。这种RNA使用来自Promega的逆转录系统试剂盒进行逆转录并且将已合成的cDNA克隆入载体λZAP(lambda ZAP Gold，Stratagene)。然后这种cDNA根据制造商的说明去包装以产生质粒DNA，并且对克隆以随机测序方式进行部分测序。mRNA以PolyATract分离系统(Promega)从总RNA中分离。这种mRNA使用Marathon cDNA扩增试剂盒(BD Biosciences)遵循制造商的说明进行逆转录并且连接了人工接头。然后这种cDNA文库用于通过5’和3’RACE(cDNA末端快速扩增)方法的PCR克隆表达质粒。

将拟南芥菜延伸酶按如下方式克隆：

从基因组DNA开始，在每种情况下用于这两个基因的引物衍生自可读框5’和3’端。

将Chrigwin等(1979)的方法用于从拟南芥菜中分离总RNA。21日龄的植物的叶片于液氮中经研杵和研钵捣碎、以破碎缓冲液处理并于37℃温育15分钟。离心后(10分钟、4℃，12000×g)将上清中的RNA以0.02体积3M pH 5.0的乙酸钠和0.75体积乙醇-20℃沉淀5小时。然后经再次离心后，将RNA置于每克起始材料1ml的TES中，并且以1倍体积的酚/氯仿提取一次并且以1倍体积的氯仿再提取一次，以及RNA以2.5M LiCI沉淀。RNA经再次离心并且经80％乙醇洗涤后重悬于水中。cDNA如Sambrook等所描述合成，并且RT-PCR以衍生的引物实施。将PCR产物遵循制造商说明克隆入载体pYES2.1-TOPO(Invitrogen)。

实施例49：酵母中异源表达的表达质粒的克隆

为描述来自拟南芥菜去饱和酶的功能特征，将所讨论的DNA的可读框克隆至pYES2.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)的半乳糖可诱导启动子GAL1下游，产生了相应的pAt60和pAt70克隆。

酿酒酵母334株分别以载体pAt60和pAt70经电穿孔(1500V)转化。经空白载体pYES2.1转化的酵母用作对照。已转化的酵母在补加了2％葡萄糖但缺乏尿嘧啶的完全基本培养基(CMdum)琼脂平板上选择。选择后，在每种情况下挑选三个转化体用于进一步的功能性表达。

为表达At延伸酶，在每种情况下对5ml由补加了2％(w/v)棉子糖但缺乏尿嘧啶的CMdum液体培养基组成的预培养基首先以经选择的转化体接种并且每分钟200转30℃温育2天。

然后5ml补加了2％棉子糖和300μM多种脂肪酸的CMdum(尿嘧啶撤除)液体培养基以预培养物接种至OD6000.05。酶的表达通过加入2％(w/v)半乳糖诱导。培养物进一步20℃温育96小时。

实施例50：pAt60和pAt70在酵母中的表达

如实施例5中所描述的由质粒pYES2.1、pAt60和pAt70分别转化的酵母按如下方式分析：

来自主培养的酵母细胞经离心(100xg，5分钟，20℃)收获并以pH8.0的100mM NaHCO3洗涤以除去残留的培养基和脂肪酸。脂肪酸甲酯(FAME)从酵母细胞沉淀经酸甲醇分解作用制备。为达此目的，细胞沉淀与2ml的1N甲醇硫酸和2％(v/v)二甲氧丙烷80℃温育1小时。FAME以石油醚(PE)提取两次。在每一情况下，为除去未衍生的脂肪酸，有机相以2ml的pH 8.0的100mM NaHCO3和2ml蒸馏水洗涤。随后PE相以Na2SO4干燥，在氩气下蒸发并置于100μl PE中。样品在装备有火焰电离探测器的Hewlett-Packard 6850气相色谱仪的DB-23毛细管柱(30m，0.25mm，0.25μm，Agilent)中分离。GLC分析条件如下：将炉腔温度设置为以每分钟5℃的速率从50℃升至250°并且最后在250℃维持10分钟(保持)。

信号通过比较相应的脂肪酸标准品(Sigma)的保留时间加以鉴定。例如在Napier和Michaelson，2001，Lipids.36(8)：761-766；Sayanova等，2001，Journal of Experimental Botany.52(360)：1581-1585，Sperling等，2001，Arch.Biochem.Biophys.388(2)：293-298和Michaelson等，1998，FEBS Letters.439(3)：215-218中描述了这种方法。

实施例51：pAt60和pAt70的功能特征

延伸酶At3g06460和At3g06470的底物特异性在表达和在喂饲多种脂肪酸后分别测定(表17、图26)。所喂饲的底物在全部转基因酵母中可检测到，转基因酵母显示分别合成了作为At3g06460和At3g06470基因产物的新脂肪酸。这意味这些基因得到了功能性表达。

表17：EPA分别经延伸酶At3g06460和At3g06470延伸。在喂饲250μM EPA之后，分析酵母提取物。

图26显示20:5n-3经延伸酶At3g06470得到了延伸。

实施例52：从三角褐指藻中克隆延伸酶

在本申请中所详述的具有Δ6-延伸酶活性的延伸酶基因的辅助下从蛋白质序列中的保守区域开始，产生了简并引物并且这些引物通过PCR方法用于筛选褐指藻属的cDNA文库：

  引物名   序列  5’-3’方向   相应的氨基酸   Phaelo正向引物1   AA(C/T)CTUCTUTGGCTUTT  (C/T)TA(SEQ ID NO.185)   NLLWLFY   Phaelo反向引物1   GA(C/T)TGUAC(A/G)AA(A/G)   FAQFFVQS

  AA(C/T)TGUG C(A/G)AA  (SEQ ID NO.186)

括号中的核苷酸碱基意指在每种情况下存在的一种或另一种核苷酸碱基的寡核苷酸混合物。

褐指藻属cDNA文库的制备：

2L三角褐指藻UTEX 646培养物在f/2培养基中(1975年纽约PlenumPress出版社(Smith，W.L.和Chanley，M.H.编辑)《Culture of MarineInvertebrate Animals》中第29-60页的Guillard，R.R.L.Culture ofphytoplankton for feeding marine invertebrates)经14天长成35E/cm2光密度。离心后，冷冻的细胞在液氮存在时研成细粉并且在2ml均化作用缓冲液(在0.2M Tris-Cl pH 8.5中的0.33M山梨糖醇、0.3M NaCl、10mMEDTA、10mM EGTA、2％SDS、2％巯基乙醇)中重悬。在加入4ml酚和2ml氯仿后，将混合物45-50℃剧烈振摇15分钟。随后离心该混合物(10分钟×10000g)，并且使用氯仿逐步抽提水相。然后通过加入1/20体积的4M碳酸氢钠沉淀核酸并且加以离心。将沉淀置于80mM Tris硼酸pH 7.0和1mM EDTA中，以8M氯化锂沉淀RNA。RNA沉淀经离心和用70％乙醇洗涤后置于无RNA酶的水中。Poly(A)-RNA以Dynabeads(Dynal，Oslo，Norway)遵循制造商的说明分离，并且第一链cDNA的合成使用来自Roche(Mannheim)的MLV逆转录酶实施。第二链的合成随后以DNA聚合酶I和Klenow片段实施，然后以RNA酶H消化。所述cDNA经过T4DNA聚合酶处理并且随后通过T4连接酶增加了EcoRI/XhoI接头(Pharmacia，Freiburg)。在经过XhoI消化、磷酸化作用和凝胶分离之后，大于300bp的片段遵循制造商说明连接进入噬菌体λZAP Express(荷兰阿姆斯特丹Stratagene)内。在cDNA文库的大量切割和质粒回收后，将质粒文库转化入大肠杆菌DH10B细胞并且用于PCR筛选。

可使用以上提到的简并引物产生具有SEQ ID NO：187的PCR片段。

所述片段以洋地黄毒苷(Roche，Mannheim)标记并且用作筛选噬菌体文库的探针。

使用序列SEQ ID NO：187可获得基因序列SEQ ID NO：183，其构成褐指藻属Δ6-延伸酶的全长RNA分子。

实施例53：酵母中异源表达的表达质粒的克隆

所讨论的引物对以如此方式选择即它们具有紧邻起始密码子的用于高效翻译的酵母共有序列(Kozak，Cell 1986，44：283-292)。PtELO6DNA的扩增在每一情况下使用1μl cDNA、200μM dNTP、2.5U Advantage聚合酶和每种引物100pmol于总计50μl体积中实施。PCR的条件如下：首先95℃变性5分钟，其后为94℃30秒、55℃1分钟和72℃2分钟的30个循环，并且终末延伸步骤为72℃10分钟。

以下寡核苷酸用于克隆在酵母中异源表达的序列的PCR反应

  基因名称和  SEQ ID NO：  引物序列   PtELO6  (SEQ ID NO：183)  F：5’-GCGGCCGCACATAATGATGGTACCTTCAAG (SEQ ID NO：188) R：3’-GAAGACAGCTTAATAGACTAGT (SEQ ID NO：189)

＊F＝正向引物，R＝反向引物

PCR产物与酵母表达载体pYES2.1-TOPO(Invitrogen)根据制造商说明21℃温育30分钟。通过T突出端和拓扑异构酶(Invitrogen)活性向载体连入PCR产物(见SEQ ID NO：192)。在温育后转化大肠杆菌DH5α细胞。合适的克隆通过PCR鉴定，质粒DNA通过Qiagen DNAeasy试剂盒分离并且经测序证实。然后正确的序列经电穿孔(1500V)转化入酵母株INVSc1(Invitrogen)。平行转化空白载体pYES2.1作为对照。此后酵母在补加了2％葡萄糖的无尿嘧啶基本培养基上铺板。能够在无尿嘧啶的培养基中生长的细胞包含相应的质粒pYES2.1和pYES2.1-PtELO6。选择后，在每种情况下挑选了两个转化体用于进一步的功能表达。

实施例54：植物中种子特异性表达的表达质粒的克隆

产生了基于pSUN-USP的另一个转化载体用于转化植物。为达此目的，使用以下引物对向编码序列的5′和3′端导入Not1切割位点：

PSUN-PtELO6

正向引物：5‘-GCGGCCGCACCATGATGGTACCTTCAAGTTA(SEQ ID NO：190)

反向引物：3‘-GAAGACAGCTTAATAGGCGGCCGC(SEQ IDNO：191)

PCR混合物的组成(50μl)：

5.00μl模板cDNA

5.00μl 10x缓冲液(Advantage聚合酶)+25mM MgCl2

5.00μl 2mM的dNTP    

1.25μl每种引物(10pmol/μl)

0.50μl Advantage聚合酶

使用了来自Clontech的Advantage聚合酶。

PCR反应条件：

复性温度：55℃ 1分钟

变性温度：94℃ 1分钟

延伸温度：72℃ 2分钟

循环次数：35

PCR产物与限制性酶NotI 37℃温育16小时。植物表达载体pSUN300-USP以同样方式温育。此后通过琼脂糖凝胶电泳分离了PCR产物和7624bp的载体并且切下相应的DNA片段。此后这些DNA通过Qiagen凝胶纯化试剂盒遵循制造商说明纯化。此后连接载体和PCR产物。使用了来自Roche的快速连接试剂盒以便连接。得到的质粒pSUN-PtELO经测序证实。

pSUN300是质粒pPZP的衍生物(Hajdukiewicz，P、Svab，Z、Maliga，P.，(1994)The small versatile pPZP family of Agrobacteriumbinary vectors for plant transformation.Plant Mol Biol 25：989-994)。通过向pSUN300中插入作为EcoRI片段的USP启动子从pSUN300衍生了pSUN-USP。加A信号是来自根癌农杆菌Ti质粒的章鱼氨酸合酶基因的加A信号(ocs终止子，Genbank Accession V00088)(De Greve，H、Dhaese，P.、Seurinck，J.、Lemmers，M、Van Montagu，M.和Schell，J.Nucleotide sequence  and transcript map of the Agrobacteriumtumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase geneJ.Mol.Appl.Genet.1(6)，499-511(1982)。DerUSP启动子对应于第1-684位的核苷酸(Genbank Accession X56240)，其中USP基因非编码区的一部分存在于USP启动子中。684碱基对大小的USP启动子片段以商业上可获得的T7标准引物(Stratagene)和经合成的引物(引物序列：5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3’；SEQ ID NO：151)通过遵循标准方法的PCR反应扩增。所述PCR片段再用EcoRI/SalI切割并且导入带OCS终止子的pSUN300载体。由此产生了名为pSUN-USP的质粒。这种构建体用于转化拟南芥菜、油菜籽、烟草和亚麻子。

实施例55：PtElo在酵母中的表达

如实施例4中所描述的由质粒pYES2和pYES2-PtELO6转化的酵母按如下方式分析：

来自主培养的酵母细胞经离心(100xg，5分钟，20℃)收获并以pH8.0的100mM NaHCO3洗涤以除去残留的培养基和脂肪酸。脂肪酸甲酯(FAME)从酵母细胞沉淀经酸甲醇分解作用制备。为达此目的，细胞沉淀与2ml的1N甲醇硫酸和2％(v/v)二甲氧丙烷80℃温育1小时。FAME以石油醚(PE)提取两次。在每一情况下为除去未衍生的脂肪酸，有机相以2ml的pH 8.0的100mM NaHCO3和2ml蒸馏水洗涤。随后PE相以Na2SO4干燥，在氩气下蒸发并置于100μl PE中。样品在装备有火焰电离探测器的Hewlett-Packard 6850气相色谱仪的DB-23毛细管柱(30m，0.25mm，0.25μm，Agilent)中分离。GLC分析条件如下：将炉腔温度设置为以每分钟5℃的速率从50℃升至250°并且最后在250℃维持10分钟(保持)。

信号通过比较相应的脂肪酸标准品(Sigma)的保留时间加以鉴定。例如在Napier和Michaelson，2001，Lipids.36(8)：761-766；Sayanova等，2001，Journal of Experimental Botany.52(360)：1581-1585，Sperling等，2001，Arch.Biochem.Biophys.388(2)：293-298和Michaelson等，1998，FEBS Letters.439(3)：215-218中描述了这种方法。

实施例56：PtELO6的功能特征

图29显示了C18:3Δ6，9，12和C18:4Δ6，9，12，15的转化。在每一情况下底物延伸了两个碳原子，分别形成了脂肪酸C20:3Δ8，11，14和C20:4Δ8，11，14，17。PtELO6的底物特异性在表达和在喂饲多种脂肪酸后测定(图30)。所喂饲的底物在全部转基因酵母中可大量地检测到。转基因酵母显示合成了作为PtELO6反应产物的新脂肪酸。这意味PtELO6基因得到功能性的表达。

表18表明PtELO6具有窄的底物特异性。PtELO6只能延伸C18脂肪酸亚油酸、亚麻酸、γ-亚麻酸和硬脂艾杜糖酸，但是优选地延伸ω3去饱和的硬脂艾杜糖酸(见图30)。

喂饲实验：每一情况下喂饲250μM的脂肪酸(粗体)。下划线的脂肪酸为新形成。

表18：PtELO6的底物特异性

喂饲了以下脂肪酸，但是未得到转化。

●18:1Δ6，18:1Δ9，18:1Δ11

●20:2Δ11，14，20:3Δ11，14，17，20:3Δ8，11，14，20:4Δ5，8，11，14，20:5Δ5，8，11，14，17

●22:4Δ7，10，13，16

经载体pYES2-PtELO6转化的酵母在存在所述脂肪酸的基本培养基中生长。脂肪酸甲酯通过对完整细胞的酸甲醇分解作用合成。随后这些FAME通过GLC分析。通过这种方法，获得了在图29和30及表16中所示的结果。

等同物：

文中描述的本发明的特定实施方案的许多等同物可由技术人员仅借助常规实验确定或找到。这些等同物落入本专利权利要求的范围内。