制造必需脂肪酸的非人转基因动物及其用途 |
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| 申请号 | CN201580026992.8 | 申请日 | 2015-03-20 | 公开(公告)号 | CN106413393A | 公开(公告)日 | 2017-02-15 |
| 申请人 | 通用医疗公司; | 发明人 | 康·X·静; | ||||
| 摘要 | 本文所提供的各方面涉及用于改变动物(例如非人动物)中的多不饱和 脂肪酸 含量的组合物和方法。本文还提供了可以将 碳 水 化合物和/或饱和脂肪转化为多不 饱和脂肪酸 (例如，n-6和/或n-3脂肪酸)的转基因动物(例如，非人动物)及其用途。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种非人转基因动物，所述非人转基因动物具有含有可操作地连接至启动子的第一外源和/或异源核酸分子的基因组，其中，所述第一外源和/或异源核酸分子包含：(i)SEQ ID NO.1的核苷酸序列；或(ii)作为SEQ ID NO.1的生物活性变体且与SEQ ID NO.1具有至少约70％的一致性的核苷酸序列，其中，当在所述转基因动物中表达所述第一外源和/或异源核酸分子时，所述转基因动物由饱和脂肪和/或碳水化合物制造n-6脂肪酸。 |
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| 说明书全文 | 制造必需脂肪酸的非人转基因动物及其用途[0001] 相关申请的交叉引用 [0002] 本申请要求35U.S.C.§119(e)规定的2014年3月21日提交的美国临时申请No.61/968,754的权益，通过引用将其内容整体并入本文中。 技术领域[0003] 本文所述的各方面涉及用于改变动物(例如非人哺乳动物)中的多不饱和脂肪酸的含量的组合物和方法。本文还提供了可以将碳水化合物和/或饱和脂肪转化为多不饱和脂肪酸的转基因动物(例如，非人哺乳动物)及其用途。 背景技术[0004] 伴随着增高的ω-6(n-6)脂肪酸摄入和降低的ω-3(n-3)脂肪酸摄入的增高的饱和脂肪和碳水化合物的消费的全球趋势与慢性的危及生命的疾病的升高的发病率相一致，表明我们的饮食结构的改变与当今的健康流行病之间的重要联系(Leaf和Weber(1987) Am.J.Clin.Nutr.45:1048-1053；Cordain,L.等(2005)Am.J.Clin.Nutr.81:341-354)。在哺乳动物中，饱和脂肪可以很容易地由碳水化合物制造，并且在现代西方饮食中，饱和脂肪和碳水化合物都高度丰富(Institute of Medicine of the National Academies.Dietary fats:total fat and fatty acids.In:Dietary reference intakes for energy, carbohydrate,fiber,fat,fatty acids,cholesterol,protein,and amino acids (macronutrients).(2002)Washington,DC:The National Academy Press,pp.335-432)； 相反，ω-3脂肪酸不能被从头合成，也不能由哺乳动物中的其它营养素转化，因此必须从食物来源(例如，鱼油)获得。引文同上。 [0005] 通常，哺乳动物容易通过饮食或者由葡萄糖或氨基酸的内源性合成获得饱和脂肪酸(SFA)(Volpe和Vagelos(1976)Physiol.Rev.56,339-417)，而单不饱和脂肪酸(MUFA)也可以由饮食获得或通过硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD-1)基因由SFA转化(Paton和Ntambi(2009)Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.297:E28-37)。另一方面，n-6和n-3PUFA不能相互转化或在哺乳动物中从头合成，而主要通过饮食获得(Leonard等(2004)Prog.Lipid Res.43:36-54；Gebauer等(2006)Am.J.Clin.Nutr.83,1526s-1535s)。在这一背景下，为了增加必需脂肪酸的组织含量，必须在饮食中加以补充，例如添加植物油(如玉米油、大豆油、红花油等)以获取n-6PUFA或添加鱼油以获取n-3PUFA。 [0006] 对高脂饮食在代谢性疾病的发展中的作用已经进行了广泛的研究(Kuller(1997)J.Am.Diet.Assoc.97:S9-15；Joint WHO/FAO Expert Consultation.(2003)Diet, Nutrition and the Prevention of Chronic Diseases(WHO technical report series 916).World Health Organization,Geneva.pp.81-94)。然而，来自于这些报告的结果的解释往往没有意识到不同类型的脂肪(包括饱和脂肪酸(SFA)；单不饱和脂肪酸(MUFA)；n-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和n-3PUFA)能够分别对研究结果造成不同的影响(Weisburger(1997)J.Am.Diet.Assoc.97,S16-23；Simopoulos(2008)Exp.Biol.Med.233,674-688)。此外，比较营养研究通常利用不同脂肪来源的饮食，引入了可以成为混淆因子的其它变量(Kang (2011)World.Rev.Nutr.Diet.102:22-29)。例如，在补充的油中除n-6脂肪酸或n-3脂肪酸之外的许多其它成分的存在使得难以解释n-6脂肪酸或n-3脂肪酸的真实影响的实验结果。 由于忽视或未能分开特定脂肪的各自的影响，现有的研究往往给出不一致或矛盾的结论，引起了科学家之间的混乱，且公众也是如此。因此，有必要可靠地定义可以用作食物来源以补充必需脂肪酸或用作实验模型以研究与脂肪代谢相关的病症的必需脂肪酸类型的来源 和量。 发明内容 [0007] 本文所述的各方面的实施方式部分基于下述发现：来自低级生命形式(例如，线虫)的δ12脂肪酸去饱和酶基因(fat-2)和n-3脂肪酸去饱和酶基因(fat-1)可以被优化并导入高级生命形式或基因组复杂的动物细胞(例如，哺乳动物细胞)，以生成可以由饱和脂肪和/或碳水化合物制造必需的n-6脂肪酸和n-3脂肪酸的非人动物。根据该发现的一个方面，本发明人已成功地改造出携带经优化的来自作为线虫的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans；C.elegans)的fat-2和fat-1的转基因小鼠，从而使该转基因小鼠(以下称“ω小鼠”)可以由饱和脂肪和/或碳水化合物制造必需的n-6脂肪酸和n-3脂肪酸。进一步地，本发明人已经示出ω小鼠在身体组织中表现出均衡的n-6/n-3脂肪酸比值。例如，当维持缺乏必需脂肪酸的高脂饮食或高碳水化合物的无脂饮食时，ω小鼠表现出n-6脂肪酸和n-3脂肪酸的高的组织水平，比值为～1:1。此外，当野生型(不能制造必需脂肪酸)、fat-2转基因型(只制造n-6脂肪酸而不制造n-3脂肪酸)和ω转基因型(制造n-6脂肪酸和n-3脂肪酸)这三种基因型小鼠被饲喂相同的饮食，它们表现出与许多代谢疾病(例如，肝脏脂肪合成、肠道菌群和低度炎症)相关的特征的独特分布。该发现从而提供了可以内源合成必需的n-6脂肪酸和n-3脂肪酸的新的转基因的非人动物模型，例如用于解决脂肪代谢和疾病，同时还提供了用于增高n-6和n-3这两种必需脂肪酸的产量的创新技术。 [0008] 因此，本文所述的某些方面提供了用于在动物或其细胞(即，除秀丽隐杆线虫以外的细胞，例如但不限于哺乳动物细胞)中有效地改变多不饱和脂肪酸(PUFAs)例如n-6脂肪酸和n-3脂肪酸的含量的组合物和方法。在一些实施方式中，经优化的fat-2和/或fat-1核酸或氨基酸序列或它们的生物活性变体能够可操作地连接至调控序列或者组成型激活的启动子或组织特异性启动子。调控序列不仅包括启动子，还包括增强子或促进核酸表达的其它表达控制序列，例如多聚腺苷酸化信号。本文还描述了可以由饱和脂肪和/或碳水化合物制造n-6脂肪酸和/或n-3脂肪酸的工程化动物细胞(例如，体外的、体内的或离体的)、包含该细胞的转基因非人动物、由这些转基因非人动物获得的食物产品(例如，肉或动物的其它可食用部分(例如，肝、肾、胸腺))以及使用它们的方法。 [0009] 一方面，本文所提供的涉及非人转基因动物，该非人转基因动物具有包含可操作地连接至启动子的第一外源和/或异源核酸分子的基因组，其中，第一外源和/或异源核酸分子包含编码将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为ω-6(或n-6脂肪酸)的酶的核苷酸序列，其中，当在转基因动物内表达第一外源和/或异源核酸分子时，转基因动物由饱和脂肪和/或碳水化合物制造ω-6(或n-6脂肪酸)。在一些实施方式中，与野生动物中的含量相比，当表达第一外源和/或异源核酸分子时，转基因动物中的n-6脂肪酸的含量增高。 [0010] 在一些实施方式中，编码将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的酶的核苷酸序列可以衍生自能够在细胞或动物内由碳水化合物和/或饱和脂肪从头或在体内合成n-6脂肪酸的任何物种。例如，将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的酶可以衍生自无脊椎动物、昆虫、蠕虫、植物、细菌、真菌、鱼、甲壳动物、软体动物、线虫、蓝藻或海藻。 [0011] 仅举例来说，在一些实施方式中，将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的酶可以包括δ12脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体。在一个实施方式中，编码δ12脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体的核苷酸序列可以衍生自蠕虫。在一个实施方式中，编码δ12脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体的核苷酸序列可以衍生自秀丽隐杆线虫。 [0012] 在一些实施方式中，编码δ12脂肪酸去饱和酶的核苷酸序列可以对应于野生型δ12脂肪酸去饱和酶。 [0013] 在一些实施方式中，编码δ12脂肪酸去饱和酶的核苷酸序列可以对应于与野生型δ12脂肪酸去饱和酶相比而言经修饰的δ12脂肪酸去饱和酶。例如，为了使异源基因在宿主中更高表达，可以基于相似基因或等效基因的宿主序列优化核苷酸序列的密码子。在一个实施方式中，为了促进哺乳动物细胞或哺乳动物中的秀丽隐杆线虫fat-2基因的表达，fat-2序列的密码子可以基于哺乳动物去饱和酶序列进行优化。在一个实施方式中，fat-2的经优化的核苷酸序列以SEQ ID NO.1示出。 [0014] 在一些实施方式中，第一外源和/或异源核酸分子可以包含编码δ12脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体的核苷酸序列。δ12脂肪酸去饱和酶的生物活性变体是保留了将碳水化合物和/或饱和脂肪转化为n-6脂肪酸的野生型或经修饰的δ12脂肪酸去饱和酶(例如，由SEQ ID NO.1编码)的足够的生物活性的变体。例如，δ12脂肪酸去饱和酶的生物活性变体可以包括保留了野生型或经修饰的δ12脂肪酸去饱和酶(例如，由SEQ ID NO.1编码)的将碳水化合物和/或饱和脂肪转化为n-6脂肪酸的至少25％或更高的生物活性的该酶的突变或片段。例如，当δ12脂肪酸去饱和酶的片段可以将碳水化合物和/或饱和脂肪转化为n-6脂肪酸且该转化是在相同条件下的野生型或经修饰的酶的效率的至少约25％或更高时，该δ12脂肪酸去饱和酶的片段是全长酶的生物活性变体。δ12脂肪酸去饱和酶的生物活性变体还可以包含一个或多个氨基酸取代(例如，酶序列中的1％、5％、10％、20％、25％或更多的氨基酸残基可以用另一氨基酸残基取代)。这些取代可以构成本领域已知的保守的氨基取代。在一些实施方式中，δ12脂肪酸去饱和酶的生物活性变体可以与野生型或经修饰的δ12脂肪酸去饱和酶(例如，SEQ ID NO.1)具有至少约70％或更高的一致性。 [0015] 在一些实施方式中，当转基因动物中的第一外源和/或异源核酸分子表达时，转基因动物中的n-6脂肪酸与n-3脂肪酸的比值可以大于1:1或更高。 [0016] 在一些实施方式中，非人转基因动物的基因组可以进一步包含第二外源和/或异源核酸分子。在一些实施方式中，第二外源和/或异源核酸分子可以包含编码将至少一种n- 6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的酶的核苷酸序列，其中，当转基因动物中的第一外源和/或异源核酸分子以及第二外源和/或异源核酸分子表达时，转基因动物由饱和脂肪 和/或碳水化合物制造n-3和n-6(其中的至少一些可以被转化为n-3)。在一些实施方式中，与野生动物中的n-3脂肪酸含量相比，当第二外源和/或异源核酸分子表达时，转基因动物中的n-3脂肪酸的含量增高。 [0017] 在一些实施方式中，编码将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的酶的核苷酸序列可以衍生自能够在细胞或动物内由n-6脂肪酸从头或在体内合成n-3脂肪酸的任何物种。例如，将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的酶可以衍生自无脊椎动物、昆虫、蠕虫、植物、细菌、真菌、鱼、甲壳动物、软体动物、线虫、蓝藻或海藻。 [0018] 仅举例来说，在一些实施方式中，将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的酶可以包括n-3脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体。在一个实施方式中，编码n-3脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体的核苷酸序列可以衍生自蠕虫。在一个实施方式中，编码n-3脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体的核苷酸序列可以衍生自秀丽隐杆线虫。 [0019] 在一些实施方式中，编码n-3脂肪酸去饱和酶的核苷酸序列可以对应于野生型n-3脂肪酸去饱和酶。 [0020] 在一些实施方式中，编码n-3脂肪酸去饱和酶的核苷酸序列可以对应于与野生型的n-3脂肪酸去饱和酶相比而言经修饰的n-3脂肪酸去饱和酶。如上文所讨论的，为了使异源基因在宿主中更高表达，可以基于相似基因或等效基因的宿主序列优化核苷酸序列的密码子。在一个实施方式中，为了促进哺乳动物细胞或哺乳动物中的秀丽隐杆线虫fat-1基因的表达，fat-1基因的密码子可以基于哺乳动物去饱和酶序列进行优化。在一个实施方式中，fat-1的经优化的核苷酸序列以SEQ ID NO.2示出。 [0021] 在一些实施方式中，编码将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的酶的第二外源和/或异源核酸分子的核苷酸序列是n-3脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体。在这些实施方式中，n-3脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体的表达可以使转基因动物将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸。因此，携带第一外源和/或异源核酸分子以及第二外源和/或异源核酸分子的转基因动物可以由饱和脂肪和/或碳水化合物制造n-3脂肪酸和n-6脂肪酸(其中的至少一些可以被转化为n-3脂肪酸)。 [0022] n-3脂肪酸去饱和酶的生物活性变体是保留了将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的野生型或经修饰的n-3脂肪酸去饱和酶(例如，SEQ ID NO.2)的足够的生物活性的变体。例如，n-3脂肪酸去饱和酶的生物活性变体可以包括保留了野生型或经修饰的n-3脂肪酸去饱和酶(例如，SEQ ID NO.2)的将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的至少25％或更高的生物活性的该酶的突变或片段。例如，当n-3脂肪酸去饱和酶的片段将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸且该转化是在相同条件下的 野生型或经修饰的酶的效率的至少25％或更高时，该n-3脂肪酸去饱和酶的片段是全长酶的生物活性变体。n-3脂肪酸去饱和酶的生物活性变体还可以包含一个或多个氨基酸取代(例如，酶序列中的1％、5％、10％、20％、25％或更多的氨基酸残基可以用另一氨基酸残基取代)。这些取代可以构成本领域已知的保守的氨基酸取代。在一些实施方式中，n-3脂肪酸去饱和酶的生物活性变体可以与野生型或经修饰的n-3脂肪酸去饱和酶(例如，SEQ ID NO.2)具有至少约70％或更高的一致性。 [0023] 在包含第一外源和/或异源核酸分子以及第二外源和/或异源核酸分子的非人转基因动物的一些实施方式中，当转基因动物中的第一和/或异源核酸分子以及第二外源和/或异源核酸分子表达时，转基因动物中的n-6脂肪酸与n-3脂肪酸的比值可以是约1:1或更低。 [0024] 待进行转基因的“动物”是指在其体内不能从头或在体内制造n-6和/或n-3的任何动物。在一些实施方式中，非人转基因动物可以是脊椎动物。在一些实施方式中，非人转基因动物可以是哺乳动物。在一些实施方式中，非人转基因动物可以选自如下所组成的组：奶牛、小鼠、大鼠、猪、绵羊、山羊、兔、水牛、家禽、牲畜、鱼、鹿或家畜。在一些实施方式中，转基因动物是指大的动物(例如奶牛、猪、绵羊、山羊、兔、鹿、鸡和其它家禽(例如鹅、鸭、雉鸡和母野鸡))和/或鱼或者养殖或栖息于河流、湖泊、溪流或海洋中的其它可食用性动物。在一些实施方式中，转基因动物是非人哺乳动物。在一些实施方式中，转基因动物是鱼。 [0025] 转基因动物、由其衍生的组织或细胞，在无需向它们饲喂可能会向系统中导入额外变量的不同脂肪源的情况下，使得人们能够研究由n-6脂肪酸和/或n-3脂肪酸介导的细胞机制或生物条件。因此，在一些实施方式中，非人转基因动物的基因组可以进一步包含基因修饰。基因修饰可以包括感兴趣的基因的插入、缺失和/或突变。例如，感兴趣的基因可以同与脂肪代谢相关的细胞机制或生物条件相关。在一些实施方式中，基因修饰可以包括宿主基因的修饰。在一些实施方式中，基因修饰可以包括异源基因的表达。例如，异源基因可以是与脂肪代谢通路相关的基因、治疗基因(例如，化疗剂或小分子的受体)或标记基因(例如，编码荧光蛋白、例如绿色荧光蛋白(GFP)或增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的序列)。异源基因可以与本文所述的第一外源和/或异源核酸分子和/或第二外源和/或异源核酸分子(例如，编码fat-2和/或fat-1)共表达(借助于相同或单独的表达载体)。 [0026] 根据所使用的构建体是否包含组成型激活的启动子或组织特异性启动子(例如，在例如骨骼肌细胞、乳腺组织细胞、结肠组织细胞、神经元、视网膜细胞、胰细胞(例如，胰岛细胞)等中激活的启动子)，本文所述的第一外源和/或异源核酸分子和/或第二外源和/或异源核酸分子(例如，编码fat-2和/或fat-1基因)可以在动物体内普遍表达或以组织特异性方式表达。 [0027] 本文所述的转基因动物的细胞和组织可以包含改变的PUFA含量。例如，携带第一外源和/或异源核酸分子以及第二外源和/或异源核酸分子(例如，编码fat-2和fat-1基因)的转基因动物的细胞和组织可以更令人满意地被消费，因为与没有这些基因的转基因动物相比，它们被设计为具有含有高水平的n-3脂肪酸以及低水平的n-6脂肪酸的细胞或组织含量。因此，转基因家畜或动物被作为食物加以消费(例如，被人类或哺乳动物消费)，当转基因家畜或动物被设计为表达将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的第一异源酶以及将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的第二异源酶(例如，分别由fat-2和fat-1基因编码的去饱和酶)时，可以是更优秀或更健康的食物来源。 [0028] 因此，本文所提供的另外的方面涉及由本文所述的非人转基因动物的一个或多个实施方式获得、衍生或加工的食物或食物产品，其中，非人转基因动物携带将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的第一异源基因和将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的第二异源基因。在一个实施方式中，第一异源基因可以包含fat-2基因。在一个实施方式中，第二异源基因可以包含fat-1基因。食物或食物产品的非限制性实例可以包括但不限于：肉、奶、组织、肌腱、油、蛋、乳制品(例如，奶酪)和它们的任何组合。在一些实施方式中，在本文所述的食物产品中，n-6脂肪酸与ω-3脂肪酸的比值可以是约1:1或更低。 [0029] 本文所述的食物或食物产品(例如，由携带fat-2和fat-1两种基因的非人转基因动物获得、衍生或加工的食物或食物产品)可以被提供给健康的个体或者患有n-3脂肪酸缺乏的个体。与n-3脂肪酸缺乏相关的疾病或失调是本领域已知的，包括例如但不限于：肥胖、糖尿病、癌症、心脏疾病、炎症性疾病、神经退行性疾病、神经精神性疾病、骨关节炎、狼疮、非酒精性脂肪性肝疾病、结肠炎和它们的任意组合。因此，本文还提供了治疗与n-3脂肪酸缺乏相关的病症(例如，疾病或失调)的治疗方法。通过向被诊断为患有与n-3脂肪酸缺乏相关的病症(例如，疾病或失调)或具有与n-3脂肪酸缺乏相关的病症的风险的受试者给予本文所述的食物或食物产品(例如，由携带fat-2和fat-1两种基因的非人转基因动物获得、衍生或加工的食物或食物产品)，受试者中的n-3脂肪酸含量可以增加，或者受试者中的n-6脂肪酸与n-3脂肪酸的比值可以降低，从而治疗受试者中的病症。 [0030] 进一步的方面提供了增高非人动物或由其衍生的食物产品中的n-3脂肪酸含量的方法。该方法包括用高碳水化合物和/或高饱和脂肪的饮食饲喂本文所述的非人转基因动物(例如，本文所述的携带fat-2和fat-1两种基因的转基因动物)，所述非人转基因动物将碳水化合物和/或饱和脂肪转化为n-6脂肪酸和n-3脂肪酸。转基因动物可以将来自其饮食的碳水化合物和/或饱和脂肪的至少一部分(例如，至少30％或更多)转化为n-6脂肪酸和n- 3脂肪酸。 [0031] 在一些实施方式中，本文所述的饲喂至转基因动物的饮食可以具有少于30％或更少的PUFA(例如，必需脂肪酸)。在一些实施方式中，饲喂至转基因动物的饮食可以排除任何PUFA或必需脂肪酸。 [0032] 在一些实施方式中，当用高碳水化合物和/或高饱和脂肪的饮食饲喂转基因动物时，转基因动物或由其衍生的食物产品中的n-6脂肪酸与ω-3脂肪酸的比值可以是约1或更少。在一些实施方式中，至少一部分n-6脂肪酸(例如由饮食中的碳水化合物和/或饱和脂肪转化的n-6脂肪酸或直接来自饮食的n-6脂肪酸)不会被转化为n-3脂肪酸。在一些实施方式中，基本上所有的n-6脂肪酸(例如由饮食中的碳水化合物和/或饱和脂肪转化的n-6脂肪酸或直接来自饮食的n-6脂肪酸)转化为n-3脂肪酸。 [0033] 一方面，本文提供的是含有可操作地连接至启动子的第一外源和/或异源核酸分子的转基因构建体，其中，第一外源和/或异源核酸分子含有编码δ12脂肪酸去饱和酶的核苷酸序列(例如，fat-2基因)或其生物活性变体，并且其中，当将转基因构建体导入细胞中时，启动子引导动物细胞中的第一外源和/或异源核酸分子的表达。例如，可以通过显微注射将转基因构建体导入细胞中。 [0034] 在一些实施方式中，第一外源和/或异源核酸分子可以包含：(i)SEQ ID NO.1的核苷酸序列；或者(ii)作为SEQ ID NO.1的生物活性变体且与SEQ ID NO.1具有至少约70％的一致性的核苷酸序列。 [0035] 在一些实施方式中，转基因构建体可以进一步含有第二外源和/或异源核酸分子，第二外源和/或异源核酸分子含有编码将n-6脂肪酸转化为n-3脂肪酸的酶的核苷酸序列。在一些实施方式中，编码将n-6脂肪酸转化为n-3脂肪酸的酶的核苷酸序列可以是编码n-3脂肪酸去饱和酶的核苷酸序列或其生物活性变体。 [0036] 在一些实施方式中，第二外源和/或异源核酸分子可以包含：(i)SEQ ID NO.2的核苷酸序列；或者(ii)作为SEQ ID NO.2的生物活性变体且与SEQ ID NO.2具有至少约70％的一致性的核苷酸序列。 [0037] 在第二外源和/或异源核酸分子存在于本文所述的转基因构建体中的一些实施方式中，第二外源和/或异源核酸分子能够可操作地连接至相同或不同的启动子。当将转基因构建体导入细胞中时，启动子可以引导转基因动物细胞中的第二外源和/或异源核酸的表达。 [0038] 可以导入转基因构建体的动物细胞的实例包括但不限于来自下述动物的动物细胞：奶牛、小鼠、大鼠、猪、绵羊、山羊、鱼、水牛、兔、家禽、牲畜或家畜。 [0039] 本文还提供了确定n-6脂肪酸和/或n-3脂肪酸对与脂肪代谢相关的病症(例如，疾病或失调)的影响的方法。在一些实施方式中，该方法包括：(a)在本文所述的非人转基因动物或者本文所述的由其衍生的细胞或组织中诱导与脂肪代谢相关的病症(例如，疾病或失调)的至少一种表型；(b)用高碳水化合物和/或高饱和脂肪的组合物饲喂非人转基因动物或者由其衍生的细胞或组织；(c)检测来自(b)的非人转基因动物的响应；以及(d)将非人转基因动物的检测到的响应与对照进行比较，其中，非人转基因动物与对照之间的响应方面的不同确定了n-6脂肪酸和/或n-3脂肪酸对病症的影响。 [0040] 在一些实施方式中，与脂肪代谢相关的病症(例如，疾病或失调)的表型可以通过修饰非人转基因动物或者由其衍生的细胞或组织的基因组中的至少一个基因来诱导，其中，该基因与病症相关。基因修饰可以包括例如感兴趣基因的插入、缺失和/或突变。在一些实施方式中，与脂肪代谢相关的病症(例如，疾病或失调)的表型可以通过将转基因动物或者由其衍生的细胞或组织暴露至诱导该病症的试剂来诱导。诱导病症的试剂可以是蛋白 质、肽、核酸、药物、小分子、辐射或它们的任意组合。 [0041] 在用高碳水化合物和/或高饱和脂肪的组合物饲喂本文所述的转基因动物后，可以实施能够用于检测本文所述的非人转基因动物的响应的各种测定法和/或分析。例如，非人转基因动物的响应可以包括与基因组学、代谢组学、脂质组学或蛋白质组学相关的分析物的表达水平。 [0042] 通过将非人转基因动物的检测到的响应与对照进行比较，可以确定n-6脂肪酸和/或n-3脂肪酸对所研究的病症(例如，疾病或失调)的影响。在一些实施方式中，对照可以是饲喂低碳水化合物和/或低饱和脂肪的组合物的本文所述的非人转基因动物或者由其衍生的细胞或组织。在一些实施方式中，对照可以是不能将碳水化合物和/或饱和脂肪转化为n-6脂肪酸和/或n-3脂肪酸的非人动物。在一些实施方式中，对照可以是野生型非人动物。 附图说明[0044] 图1A-图1D示出了fat-2和ω转基因小鼠的基因分型和表型的实验数据以及必需脂肪酸的示意性的制造。图1A是ω小鼠中的由非必需营养物转化为必需脂肪酸的路线图。 在哺乳动物中，碳水化合物可以被转化为饱和脂肪酸(SFA)，而SFA可以通过硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD-1)转化为单不饱和脂肪酸(MUFA)。fat-2和fat-1转基因的引入使得哺乳动物能够进一步分别将MUFA转化为n-6多不饱和脂肪酸(PUFA)、将n-6PUFA转化为n-3PUFA。图1B通过PCR示出了野生型(WT)、fat-2和ω同窝小鼠中的fat-2和fat-1转基因的表达。图1C是部分的气相色谱的示踪，显示出由野生型小鼠(WT，上栏)、fat-2转基因小鼠(Fat-2，中栏)和ω转基因小鼠(ω，下栏)的骨骼肌提取的总脂的脂肪酸分布。所有小鼠皆为10周龄雄性且饲喂相同的高SFA和高碳水化合物以及低n-6PUFA的饮食。图1D是柱形图，显示出来自WT、fat-2和ω小鼠(左栏)的肌肉组织的PUFA的定量，以及各表型之间的n-6/n-3PUFA的比值的比较(右栏)。多种组织中的脂肪酸分布的显著值见表1。数值表示为平均值±标准差(n＝3只/组；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。 [0045] 图2A-图2C是实验数据，该实验数据显示出肝脏脂肪合成在fat-2小鼠中显著增加，而在ω小鼠中下降。三组小鼠饲喂相同的高SFA和高碳水化合物以及低n-6PUFA的饮食约两个月，然后使肝样品接受分析。图2A是示出由油红O染色显示脂质积累的图像。图2B是显示出总的肝TG含量的测量结果的柱形图(n＝4；*P＜0.05，***P＜0.001)。图2C显示出通过PCR测定的SCD-1、FASN、ACC和GAPDH的肝表达(左栏)，以及相对于GAPDH的定量的相对基因表达值(右栏)(n＝3；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。 [0046] 图3A-图3B是显示出具有不同的组织脂肪酸分布的肠道菌群组成的变化的实验数据。图3A显示出大肠杆菌的代表性的平板培养(左栏)和通过肠杆菌的qPCR进行的粪便细菌DNA的定量(右栏)的图。图3B显示出双歧杆菌的代表性的平板培养(左栏)和通过双歧杆菌的qPCR进行的粪便细菌DNA的定量(右栏)的图。数值表示为平均值±标准差(n＝5；*P＜ 0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。 [0047] 图4A-图4B是显示出具有不同的组织脂肪酸分布的三种表型之间的低度慢性炎症的差异状态的柱形图。图4A显示出经多重测定法测量的关键炎性细胞因子的血浆水平(n＝ 5；*P＜0.05，**P＜0.01)。图4B显示出通过鲎变形细胞裂解物测定法测量的LPS的血浆水平(n＝5；*P＜0.05，**P＜0.01)。 [0048] 图5是显示出含有fat-2构建体的pCAGGS质粒的示意图，该质粒可以用于例如显微注射，以产生Fat-2转基因动物。 具体实施方式[0049] 本文所述的各方面的实施方式部分基于下述发现：来自低等生命形式(例如，线虫)的δ12脂肪酸去饱和酶基因(fat-2)和n-3脂肪酸去饱和酶基因(fat-1)可以被优化并导入更高等生命形式或基因组学上复杂的动物细胞(例如，哺乳动物细胞)中，以制造可以由饱和脂肪和/或碳水化合物产生必需的n-6脂肪酸和/或n-3脂肪酸的非人动物。在本发现的一个方面，本发明人已成功地制造了可以从头或在体内将碳水化合物和/或饱和脂肪转化为必需的n-6脂肪酸的fat-2转基因小鼠。在本发现的另一方面，本发明人还成功地工程化出转基因小鼠以携带来自作为线虫的秀丽隐杆线虫(C.elegans)的经优化的fat-2和fat-1两个基因，由此使该转基因小鼠(以下称“ω小鼠”)可以由饱和脂肪和/或碳水化合物制造必需的n-6脂肪酸和n-3脂肪酸。此外，本发明人已经表明ω小鼠在机体组织中表现出均衡的n-6/n-3脂肪酸比值。例如，当坚持用缺乏必需脂肪酸的高脂饮食或高碳水化合物的无脂饮食时，ω小鼠表现出n-6脂肪酸和n-3脂肪酸的高的组织水平，具有比值为～1:1。进一步地，当向三种基因型(野生型(不能制造必需脂肪酸)、fat-2转基因(仅制造n-6脂肪酸而不制造n-3脂肪酸)和ω转基因(制造n-6和n-3两种脂肪酸))小鼠饲喂相同的饮食时，它们表现出与许多代谢疾病(例如，肝脏脂肪生成、肠道菌群和低度炎症)相关的特征的独特分布。 该发现从而提供了可以内源合成必需的n-6脂肪酸和n-3脂肪酸的新的转基因非人动物模 型，例如，用于解决脂肪代谢和疾病，同时提供了用于增加n-6和n-3两种必需脂肪酸的产量的创新技术。 [0050] 因此，本文所述的某些方面提供了用于在动物或其细胞(即，除秀丽隐杆线虫以外的细胞，例如但不限于哺乳动物细胞)中有效地改变多不饱和脂肪酸(PUFAs)(例如n-6脂肪酸和n-3脂肪酸)的含量的组合物和方法。在一些实施方式中，经优化的fat-2和/或fat-1核酸或氨基酸序列或其生物活性变体能够可操作地连接至调控序列、组成型激活的启动子或组织特异性启动子。调控序列不仅涵盖启动子，还涵盖增强子或其它表达控制序列，例如促进核酸表达的多聚腺苷酸化信号。本文还描述了可以由饱和脂肪和/或碳水化合物制造n-6脂肪酸和/或n-3脂肪酸的工程化的动物细胞(例如，体外、体内或离体)、包含该细胞的转基因非人动物、从这些转基因非人动物获得的食物产品(例如，肉或动物的其它可食用部分(例如，肝、肾或胸腺))和使用它们的方法。 [0051] 非人转基因动物 [0052] 本文所述的某些方面涉及可以由饱和脂肪、单不饱和脂肪和/或碳水化合物制造n-6脂肪酸的非人转基因动物。例如，在一个方面，本文所述的是具有包含可操作地连接至启动子的第一外源和/或异源核酸分子的基因组的非人转基因动物，其中，第一外源和/或异源核酸分子含有编码将饱和脂肪、单不饱和脂肪和/或碳水化合物转化为ω-6(或n-6脂肪酸)的酶的核苷酸序列。当转基因动物中的第一外源和/或异源核酸分子表达时，转基因动物由饱和脂肪、单不饱和脂肪和/或碳水化合物制造ω-6(或n-6脂肪酸)。 [0053] 在一些实施方式中，转基因动物中的异源酶将饱和脂肪、单不饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的转化效率可以是至少约30％或更多，包括例如至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多。在一些实施方式中，转基因动物中的异源酶将饱和脂肪、单不饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的转化效率可以是100％。 [0054] 本文所使用的术语“饱和脂肪”是指含有大量饱和脂肪酸的甘油三酯。在一些实施方式中，饱和脂肪可以包括至少约50％或更多的饱和脂肪酸，包括例如至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多、包括高达100％。在一些实施方式中，饱和脂肪可以包含小于5％或更少(包括例如小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％或更少)的多不饱和脂肪酸。在一些实施方式中，饱和脂肪不含任何多不饱和脂肪酸，例如n-3脂肪酸和/或n-6脂肪酸。在一些实施方式中，饱和脂肪可以包含单不饱和脂肪酸，例如，不超过总脂肪酸的50％。一般情况下，饱和脂肪酸在脂肪酸链的单个碳原子之间没有双键。 也就是说，碳原子的链完全被氢原子“饱和”。有许多种天然存在的饱和脂肪酸，它们的区别主要在于碳原子数，例如，从3个碳原子(丙酸)至36个碳原子(三十六碳酸)。在一些实施方式中，饱和脂肪可以具有C8和C22之间的碳链长度。饱和脂肪酸的实例包括但不限于辛酸(C8)、癸酸(C10)、月桂酸(C12)、肉豆蔻酸(C14)、棕榈酸(C16)以及它们的两种或多种的组合。饱和脂肪的实例包括但不限于：椰子油、红花油、葵花籽油和动物脂。饱和脂肪酸的另外的实例包括：棕榈酸酯；硬脂酸酯；肉豆蔻酸酯；以及它们的包含选自羟基、酰氧基、芳氧基、氨基、巯基、磺酸基、硫酸基、膦酸基、磷酸基、二膦酸基、三膦酸基、多膦酸基、二磷酸基、三磷酸基、多磷酸基、磷脂酰基、核苷、低聚糖、多糖和多元醇中的一种或多种基团的无环、环状、杂环和芳香酯衍生物。在室温下，饱和脂肪可以是固体或液体。饱和脂肪可以是天然存在的或合成的。 [0055] 本文所使用的术语“不饱和脂肪酸”是指沿着甘油三酯的碳骨架具有至少一个或多个双键(包括例如至少两个或多个)的甘油三酯。不饱和脂肪酸可以包括单不饱和脂肪酸(或单不饱和脂肪)或多不饱和脂肪酸。 [0056] 本文所使用的术语“单不饱和脂肪酸”是指沿着其碳骨架仅具有一个“双键”的不饱和脂肪酸。在一些实施方式中，双键可以存在于第九个碳原子和第十个碳原子之间，如棕榈酸(16:1)和油酸(18:1)。不饱和脂肪酸一般是沿着其碳骨架具有至少一个或多个双键的脂肪酸。脂肪酸的结构可以用“X:Y”的符号系统来表示，其中，X是碳(C)原子的总数，且Y是双键的数量。 [0057] 本文所使用的术语“多不饱和脂肪酸”(或“PUFAs”)是指沿着碳骨架具有至少两个双键的不饱和脂肪酸。仅通过举例的方式，对于亚油酸(18:2)，双键可以存在于第九个碳原子和第十个碳原子之间以及第十二个碳原子和第十三个碳原子之间；对于α-亚麻酸(18:3)，双键可以存在于第九个碳原子和第十个碳原子之间、第十二个碳原子和第十三个碳原子以及第十五个碳原子和第十六个碳原子之间。 [0058] “PUFAs”可以分为两个主要的家族(取决于最靠近脂肪酸碳链的甲基端的第一个双键的位置(n))。脂肪酸具有两个末端：羧酸(-COOH)末端，一般认为它是链的起点，因此称为“α”；以及甲基(CH3)末端，一般认为它是链的“尾部”，因此称为“ω”。脂肪酸的命名方式由第一个双键的位置决定，从甲基端(即欧米伽(ω-)或n-末端)开始计数。因此，“n-6脂肪酸”或“ω-6脂肪酸”具有从分子的ω(甲基)端的第六碳原子开始的第一个不饱和双键，并且另外具有朝向分子的羧基端的一个或多个双键。n-6脂肪酸的非限制性实例包括：亚油酸、γ-亚麻酸、十八碳三烯酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十四碳四烯酸、二十四碳五烯酸以及它们的两种或多种的组合。 [0059] 相比之下，“n-3脂肪酸”或“ω-3脂肪酸”具有从远离分子的ω端的第三个碳原子开始的第一个不饱和双键，并且另外具有朝向分子的羧基端的一个或多个双键。n-3脂肪酸的非限制性实例包括：十六碳三烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十一碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳五烯酸、二十四碳六烯酸以及它们的两种或多种的组合。 [0060] 本文所使用的术语“碳水化合物”也被称为糖(sugars或saccharides)，是指包含碳、氢和氧的分子或者由碳、氢和氧构成的分子，具有通式Cx(H2O)y。在一些实施方式中，x和y可以大于或等于3。在一些实施方式中，x和y可以分别为3、4、5、6、7、8、9、10或更多。整数x和y可以相同或不同。碳水化合物可以包括单糖、二糖、多糖以及它们的混合物。术语“单糖”一般是不能水解成为任何更简单的碳水化合物的羟基醛或羟基酮。单糖的实例包括但不限于：己糖、右旋糖、葡萄糖、果糖和半乳糖。术语“二糖”是指通过糖苷键连接的两个单糖。二糖的非限制性的实例包括但不限于：蔗糖、麦芽糖、纤维二糖和乳糖。术语“多糖”包括含有超过两个单糖单元的糖。示例性的多糖可以包括但不限于：淀粉(例如，玉米淀粉)。该术语还包括低聚糖(例如但不限于，低聚果糖和甘露寡糖)。该碳水化合物可以是天然存在的或合成的。 [0061] 在一些实施方式中，与野生型或非转基因动物中的n-6脂肪酸含量相比，当含有编码将饱和脂肪、单不饱和脂肪和/或碳水化合物转化为ω-6(或n-6脂肪酸)的酶的核苷酸序列的第一外源和/或异源核酸分子表达时，转基因动物中(例如，机体组织和/或细胞内)的n-6脂肪酸含量增加。在一些实施方式中，与在非转基因动物或野生型动物(例如基因组不含编码将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的酶的第一外源和/或异源核酸分子的动物)中的n-6脂肪酸含量相比，n-6脂肪酸含量的增加可以是至少约30％或更高，包括至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多。在一些实施方式中，与非转基因动物或野生型动物(例如，基因组不含编码将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的酶的第一外源和/或异源核酸分子的动物)中的n-6脂肪酸含量相比，n-6脂肪酸含量的增加可以是至少约1.1倍或更高，包括至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多。 [0062] 在一些实施方式中，编码将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的酶的核苷酸序列可以衍生自在细胞或动物内能够从头或者在体内由碳水化合物和/或饱和脂肪合成n-6脂肪酸的任何物种。例如，将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的酶可以衍生自无脊椎动物、昆虫、蠕虫、植物(例如花生、大豆、油菜籽和亚麻籽)、细菌、真菌、鱼、甲壳动物、软体动物、线虫、蓝藻和海藻。 [0063] 仅举例来说，在一些实施方式中，将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的酶可以包括δ12脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体。在一个实施方式中，编码δ12脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体的核苷酸序列可以衍生自蠕虫。在一个实施方式中，编码δ12脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体的核苷酸序列可以衍生自秀丽隐杆线虫。在一个实施方式中，编码δ12脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体的核苷酸序列可以衍生自花生，Yu等J Genet Genomics.2008；35:679-85。在另一实施方式中，编码δ12脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体的核苷酸序列可以衍生自真菌，Sakuradani等Eur J.Biochem.1999；261:812-20。 [0064] 如本文使用且贯穿于本说明书的，术语“外源”涉及编码并非天然存在于待进行转基因的宿主中的感兴趣的基因(例如，编码fat-2和/或fat-1的核酸)的核苷酸序列在该宿主的基因组中的添加和/或并入。 [0065] 如本文使用且贯穿于本说明书的，术语“异源”涉及导入不同的物种的宿主或细胞中的一个物种的核苷酸序列。异源核酸序列并不会在不同的物种的宿主或细胞中正常地表达或天然地表达。 [0066] 在一些实施方式中，编码将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的酶(例如，δ12脂肪酸去饱和酶)的核苷酸序列可以对应于或衍生自将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的野生型酶(例如，野生型δ12脂肪酸去饱和酶)的核苷酸序列。在一些实施方式中，野生型δ12脂肪酸去饱和酶可以由野生型fat-2基因序列编码。衍生自秀丽隐杆线虫的示例性的野生型fat-2基因序列以SEQ ID NO.5表示。 [0067] 在一些实施方式中，与相应的野生型酶(例如，δ12脂肪酸去饱和酶)的核苷酸序列相比，编码将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的酶(例如，δ12脂肪酸去饱和酶)的核苷酸序列可以是经修饰的核苷酸序列。如本文使用且贯穿于本说明书的，术语“修饰”涉及如下核苷酸序列，该核苷酸序列具有约1％或更多(包括约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％或以上)的不同于编码感兴趣的野生型基因(例如但不限于，δ12脂肪酸去饱和酶)的核苷酸序列的核苷酸且保留了感兴趣的野生型基因(例如但不限于，δ12脂肪酸去饱和酶)的足够的生物活性。例如，为了使待进行转基因的宿主中的异源基因更高表达，编码异源基因的核苷酸序列可以通过优化宿主细胞的密码子使用而加以修饰。在一些实施方式中，当一个或多个天然存在的编码氨基酸序列的密码子被改变但仍然编码相同的氨基酸序列时，该序列被优化以用于宿主细胞。仅举例来说，编码氨基酸残基缬氨酸的表示为“GTT”的一个或多个密码子可以用也编码缬氨酸的CTG替换；编码氨基酸残基精氨酸的表示为“CGT”的一个或多个密码子可以用也编码精氨酸的CGC替换； 等等。该密码子被修饰以包括待向其中插入重组DNA的宿主所优选的密码子。可以将经优化的序列并入本文所述的任何载体和细胞，并用于可以使用野生型序列(例如，如下文所述的fat-2基因和/或fat-1基因)的任何方法。在某些情况下(例如，在转基因动物的制造中)，密码子经优化的序列的使用可能是期望的，例如，用于增加导入转基因动物中的异源基因的表达。优化并不是核酸序列可以被修饰的唯一方法。 [0068] 编码δ12脂肪酸去饱和酶的序列可以包含至少一个经优化的密码子。优化的密码子的数目可以不同。在一些实施方式中，该数目足以改善表达的某些方面(例如，转录的拷贝数)或者足以提高序列的效用。在一些实施方式中，仅修饰一些密码子(例如，1-5个)可以改善序列。在另外的实施方式中，大量的密码子(例如，至少5个以及多达150个)可以被优化。在一些实施方式中，并且不论编码δ12脂肪酸去饱和酶的序列的原始物种，核酸分子可以包含5-10个、10-15个、15-20个、20-25个、25-30个、30-35个、35-40个、40-45个、45-50个、50-55个、55-60个、60-65个、65-70个、70-75个、75-80个、80-85个、85-90个、90-95个、95- 100个、100-105个、105-110个、110-115个、115-120个、120-125个、125-130个、130-135个、 135-140个、140-145个、145-150个、10-125个、25-100个、30-90个、40-80个、50-70个或约60个经优化的密码子。 [0069] 此外，经优化的密码子的位置可以不同。例如，对于秀丽隐杆线虫fat-2基因(例如，如以SEQ ID NO.6所示，其中，ATG是密码子1)，经优化的密码子可见于下述位置的一处或多处(例如，至少1处、至少2处、至少3处、至少4处、至少5处、至少6处、至少7处、至少8处、至少9处、至少10处、至少20处、至少30处、至少40处、至少50处、至少60处、至少70处、至少80处、至少90处、至少95处或更多，包括全部)：位置4、12、14、16、19、22、24、30、38、41、44、48、53、56、59、63、65、74、76、80、85、92、93、95、97、109、111、113、114、117、119、121、124、126、 127、129、130、131、133、134、145、146、156、157、168、161、164、169、172、176、183、184、186、 188、191、199、209、215、221、238、241、242、243、244、249、253、263、267、271、272、274、275、 278、281、284、306、307、315、316、320、321、323、328、333、337、342、344、348、352、354、355、 360、362、364、366、375、376和377。当使用秀丽隐杆线虫fat-2基因以外的去饱和酶编码基因时，密码子可以在这些相同位置的一处或多处(例如，至少1处、至少2处、至少3处、至少4处、至少5处、至少6处、至少7处、至少8处、至少9处、至少10处、至少20处、至少30处、至少40处、至少50处、至少60处、至少70处、至少80处、至少90处、至少95处或更多，包括全部)被优化。在同源基因(例如，植物或真菌的δ12去饱和酶基因)中，优化的位置可以是对应于上述列出的位置的一处或多处(例如，至少1处、至少2处、至少3处、至少4处、至少5处、至少6处、至少7处、至少8处、至少9处、至少10处、至少20处、至少30处、至少40处、至少50处、至少60处、至少70处、至少80处、至少90处、至少95处或更多，包括全部)的位置。 [0070] 在一些实施方式中，经优化的序列可以与野生型序列(例如，秀丽隐杆线虫fat-2基因)具有至少约70％或更多(包括例如至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多)的相似性。在一些实施方式中，经优化的序列可以与野生型序列(例如，秀丽隐杆线虫fat-2基因)具有约80％或更多的相似性。在一些实施方式中，经优化的序列可以与野生型序列(例如，秀丽隐杆线虫fat-2基因)具有约90％或更多的相似性。在一些实施方式中，经优化的序列可以与野生型序列(例如，秀丽隐杆线虫fat-2基因)具有约91％或更多的相似性。 [0071] 在一些实施方式中，为了提高哺乳动物中的秀丽隐杆线虫fat-2基因的表达，秀丽隐杆线虫fat-2基因序列的密码子可以基于哺乳动物去饱和酶序列进行优化。在一个实施方式中，fat-2的经优化的核苷酸序列以SEQ ID NO.1表示，其相应的氨基酸序列以SEQ ID NO.3表示。 [0072] 在一些实施方式中，编码将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的酶的核苷酸序列可以对应于或衍生自δ-12去饱和酶的核苷酸序列。在一些实施方式中，δ-12去饱和酶可以衍生自菠菜(Spinacia oleracea)。在一个实施方式中，δ-12去饱和酶基因可通过以SEQ ID NO.7表示的菠菜FAD2mRNA序列进行编码。 [0073] 第一外源和/或异源核酸分子可以含有编码δ12脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体的核苷酸序列。术语“生物活性变体”是指具有基本上类似于实体或分子的生物活性的生物活性(功能上或结构上)的实体，其为所述实体或分子的功能衍生物。术语“生物活性变体”旨在包括分子的“片段”、“变体”、“类似物”或“化学衍生物”。分子的“片段”是指分子的任何多肽子集。例如具有如同野生型δ12脂肪酸去饱和酶的、将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的活性的δ12脂肪酸去饱和酶的片段也被涵盖在内，以用于本文所述的各方面。分子的“变体”(例如，δ12脂肪酸去饱和酶的“变体”)是指在结构和功能上与整个分子或与其片段基本上相似的分子。如果两个分子具有基本上类似的结构，和/或如果两个分子具有类似的生物活性，则一个分子被称作与另一分子“基本相似”。因此，假如两个分子具有类似的活性，即使一个分子的结构没有在另一分子中被发现，或者如果氨基酸残基的序列或核苷酸序列不一致，根据在本文所使用的该术语，它们被认为是变体。分子的“类似物”(例如δ12脂肪酸去饱和酶的类似物)是指在功能上基本类似于整个分子或其片段的分子。 如在本文所使用的，当分子含有通常不是该分子的一部分的额外的化学部分时，该分子被称作是另一分子的“化学衍生物”。这样的部分可以提高分子的表达水平、酶活性、溶解度、吸收、生物半衰期等。该部分可以选择性地减少分子的毒性、消除或衰减分子的任何不期望的副作用等。可介导这种影响的部分公开于Remington's Pharmaceutical Sciences,18th edition,A.R.Gennaro,Ed.,MackPubl.,Easton,PA(l990)。 [0074] 在一些实施方式中，δ12脂肪酸去饱和酶的生物活性变体可以是保留了本文所述的将碳水化合物和/或饱和脂肪转化为n-6脂肪酸的野生型或经修饰的δ12脂肪酸去饱和酶(例如，由SEQ ID NO.1编码)的足够的生物活性的变体。在一些实施方式中，δ12脂肪酸去饱和酶的生物活性变体可以是保留了野生型或经修饰的δ12脂肪酸去饱和酶的足够的生物活性的变体，以在治疗上或临床上有效(例如，在制造转基因动物、治疗患者、或者进行诊断或其它实验室测试或检测中，变体是有用的)。例如，δ12脂肪酸去饱和酶的生物活性变体可以包括保留了野生型或经修饰的δ12脂肪酸去饱和酶(例如，由SEQ ID NO.1编码)的将碳水化合物和/或饱和脂肪转化为n-6脂肪酸的生物活性的至少约25％或更高(包括例如至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约 95％、至少约98％、至少约99％或更多)的酶的突变体或片段。例如，当δ12脂肪酸去饱和酶的片段可以将碳水化合物和/或饱和脂肪转化为n-6脂肪酸，并且该转化为野生型或经修饰的酶在相同条件下的效率的至少约25％或更高(包括例如至少约30％、至少约40％、至少约 50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约 99％以及高至100％)时，δ12脂肪酸去饱和酶的片段是全长酶的生物活性变体。 [0075] δ12脂肪酸去饱和酶的生物活性变体还可以包含一个或多个氨基酸取代(例如，酶序列中的1％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多的氨基酸残基可以被另一氨基酸残基所取代)。这些取代可以构成本领域已知的保守的氨基酸取代。 [0076] 在一些实施方式中，δ12脂肪酸去饱和酶的生物活性变体可以与野生型或经修饰的δ12脂肪酸去饱和酶(例如，由SEQ ID NO.1编码)的核苷酸序列具有至少约50％或更高(包括例如至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％)的一致性。在一些实施方式中，δ12脂肪酸去饱和酶的生物活性变体可以与野生型或经修饰的δ12脂肪酸去饱和酶(例如，由SEQ ID NO.1编码)的核苷酸序列具有至少约70％的一致性。在一些实施方式中，δ12脂肪酸去饱和酶的生物活性变体可以与野生型或经修饰的δ12脂肪酸去饱和酶(例如，由SEQ ID NO.1编码)的核苷酸序列具有至少约90％的一致性。在一些实施方式中，δ12脂肪酸去饱和酶的生物活性变体可以与野生型或经修饰的δ12脂肪酸去饱和酶(例如，由SEQ ID NO.1编码)的核苷酸序列具有至少约95％的一致性。在一些实施方式中，δ12脂肪酸去饱和酶的生物活性变体可以与野生型或经修饰的δ12脂肪酸去饱和酶(例如，由SEQ ID NO.1编码)的核苷酸序列具有至少约99％的一致性。 [0077] δ12脂肪酸去饱和酶(例如，fat-2)的生物活性变体的生物活性可以通过细胞或动物中的表达进行评估，例如，通过RNA分析、和/或酶测定法、和/或细胞或动物的脂肪酸组成的脂质分析。确定细胞或动物的脂肪酸组成的方法是本领域已知的。实施脂肪酸组成分析的示例性的方法是采用气相色谱法，描述于Kang等,BMC Biochem 2005；6:5以及美国专利7,238,851，以引用的方式将其内容并入本文中。 [0078] 因为功能性的δ12脂肪酸去饱和酶(例如，由fat-2基因编码的δ12脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体)可以将碳水化合物和/或饱和脂肪转化为n-6脂肪酸，所以当将转基因动物或由其衍生的细胞用含有碳水化合物和/或饱和脂肪的组合物饲喂时，携带异源δ12脂肪酸去饱和酶(例如，由fat-2基因编码的δ12脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体)的转基因动物或由该转基因动物衍生的细胞的n-6脂肪酸含量普遍增加。例如，当转基因动物和对照均饲喂包含碳水化合物和/或饱和脂肪的相同组合物时，与没有转基因的动物(对照)相比，具有δ12脂肪酸去饱和酶(例如，由fat-2基因编码的δ12脂肪酸去饱和酶或其生物活性的变体)的异源表达的转基因动物可以显示出机体组织和/或细胞中的n-6脂肪酸含量增加至少30％或更多，包括例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少 95％或更多。在一些实施方式中，当转基因动物和对照均饲喂包含碳水化合物和/或饱和脂肪的相同组合物时，与没有转基因的动物(对照)相比，具有δ12脂肪酸去饱和酶(例如，由fat-2基因编码的δ12脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体)的异源表达的转基因动物可以显示出机体组织和/或细胞中的n-6脂肪酸含量方面的至少1.1倍或更高(包括例如至少1.5 倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍或更多)的增加。 [0079] 在一些实施方式中，当转基因动物中的第一外源和/或异源核酸分子表达时，具有δ12脂肪酸去饱和酶(例如，由fat-2基因编码的δ12脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体)的异源表达的转基因动物中的n-6脂肪酸与n-3脂肪酸的比值可以大于1:1或更高。例如，转基因动物中的n-6脂肪酸与n-3脂肪酸的比值可以大于1.5:1、大于2:1、大于5:1、大于10:1、大于15:1或大于20:1或更高。 [0080] 在一些实施方式中，非人转基因动物的基因组可以进一步包含第二外源和/或异源核酸分子。第二外源和/或异源核酸分子可以含有编码与饱和脂肪和/或碳水化合物的代谢相关的基因的核苷酸序列。与饱和脂肪和/或碳水化合物的代谢相关的基因的实例包括但不限于：n-3脂肪酸去饱和酶、脂肪酸合酶(FAS)和硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD-1)以及它们的两种或多种的组合。 [0081] 在一些实施方式中，第二外源和/或异源核酸分子可以含有编码将至少一种或多种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的酶的核苷酸序列。 [0082] 在一些实施方式中，转基因动物内的将至少一种或多种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的异源酶的转化效率可以是至少约30％或更多，包括例如至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多。在一些实施方式中，转基因动物内的异源酶将饱和脂肪、单不饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的转化效率可以是100％。因此，当转基因动物中的第一外源和/或异源核酸分子以及第二外源和/或异源核酸分子表达时，转基因动物可以由饱和脂肪和/或碳水化合物制造n-3脂肪酸和n-6脂肪酸(至少其部分或全部可以转化为n-3脂肪酸)。 [0083] 在一些实施方式中，与没有第二外源和/或异源核酸分子的同一物种的动物(例如，野生型动物或具有本文所述的第一外源核酸分子的异源表达的转基因动物)中的n-3脂肪酸的含量相比，当含有编码将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的酶的核苷酸序列的第二外源和/或异源核酸分子表达时，转基因动物中(例如，机体组织和/或细胞中)的n-3脂肪酸含量增加。在一些实施方式中，与没有第二外源和/或异源核酸分子的同一物种的动物(例如，野生型动物或具有本文所述的第一外源核酸分子的异源表达的转基因动物)中的n-3脂肪酸的含量相比，n-3脂肪酸含量的增加可以是至少约30％或更高，包括至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多。在一些实施方式中，与没有第二外源和/或异源核酸分子的同一物种的动物(例如，野生型动物或具有本文所述的第一外源核酸分子的异源表达的转基因动物)中的n-3脂肪酸 的含量相比，n-3脂肪酸含量的增加可以是至少约1.1倍或更高，包括至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多。 [0084] 因此，本文所述的另一方面提供了可以由饱和脂肪和/或碳水化合物制造n-3脂肪酸的非人转基因动物。在该方面，非人转基因动物可以具有包含如下的基因组：(i)第一外源和/或异源核酸分子，该核酸分子编码将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的酶(例如，由fat-2基因序列编码的酶或其生物活性变体)；以及(ii)第二外源和/或异源核酸分子，该核酸分子含有编码将n-6脂肪酸转化为n-3脂肪酸的酶的核苷酸序列。当转基因动物内的第一外源和/或异源核酸分子以及第二外源和/或异源核酸分子表达时，转基因动物可以由饱和脂肪和/或碳水化合物制造n-3脂肪酸和任选的n-6脂肪酸(n-6脂肪酸的至少一部分或全部可以被转化为n-3脂肪酸)。 [0085] 在一些实施方式中，将n-6脂肪酸转化为n-3脂肪酸的酶可以包括n-3脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体。当第二外源和/或异源核酸分子表达时，使转基因动物可以将n-6脂肪酸转化为n-3脂肪酸。国际专利申请号WO 2005/077022和美国专利号7,238,851描述了可以将n-6脂肪酸转化为n-3脂肪酸的转基因动物、组合物及其制造方法、以及它们的用途，可在本文中用于本文所述的各方面的目的，将其各自的内容以引用的方式并入本文中。 [0086] 在一些实施方式中，编码n-3脂肪酸去饱和酶的核苷酸序列可以衍生自能够在细胞或动物内由n-6脂肪酸从头或在体内合成n-3脂肪酸的任何物种。例如，n-3脂肪酸去饱和酶可以衍生自：无脊椎动物、昆虫、蠕虫、植物(例如花生、大豆、油菜籽和亚麻籽)、细菌、真菌、鱼、甲壳动物、软体动物、线虫、蓝藻和海藻。 [0087] 仅举例来说，在一个实施方式中，编码n-3脂肪酸去饱和酶的核苷酸序列可以衍生自蠕虫。在一个实施方式中，编码n-3脂肪酸去饱和酶的核苷酸序列可以衍生自秀丽隐杆线虫。 [0088] 在一些实施方式中，编码n-3脂肪酸去饱和酶的核苷酸序列可以对应于或衍生自野生型n-3脂肪酸去饱和酶的核苷酸序列。在一些实施方式中，野生型n-3脂肪酸去饱和酶可以由野生型fat-1基因序列编码。衍生自秀丽隐杆线虫的示例性的野生型fat-1基因序列以SEQ ID NO.8表示。 [0089] 在一些实施方式中，与相应的野生型n-3脂肪酸去饱和酶的核苷酸序列相比，编码n-3脂肪酸去饱和酶的核苷酸序列可以是经修饰的核苷酸序列。例如，经修饰的n-3脂肪酸去饱和酶是具有约1％或更多(包括约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％或更多)不同于编码野生型n-3脂肪酸去饱和酶的核苷酸序列的核苷酸的核苷酸序列并保留了野生型n-3脂肪酸去饱和酶的足够的生物活性。如上文所讨论的，为了使待进行转基因的宿主中的异源基因更高表达，核苷酸序列的密码子可以例如被优化用于宿主细胞。因此，编码n-3脂肪酸去饱和酶的序列可以包含至少一个或多个经优化的密码子。经优化的密码子的数目可以不同。在一些实施方式中，该数目足以改善表达的某些方面(例如，转录的拷贝数)或者足以提高序列的效用。在一些实施方式中，仅修饰一些密码子(例如，1-5个)可以改善序列。在另外的实施方式中，大量的密码子(例如，至少5个以及多达 150个)可以被优化。在一些实施方式中，并且不论编码n-3脂肪酸去饱和酶的序列的原始物种，第二外源和/或异源核酸分子可以包含5-10个、10-15个、15-20个、20-25个、25-30个、 30-35个、35-40个、40-45个、45-50个、50-55个、55-60个、60-65个、65-70个、70-75个、75-80个、80-85个、85-90个、90-95个、95-100个、100-105个、105-110个、110-115个、115-120个、 120-125个、125-130个、130-135个、135-140个、140-145个、145-150个、10-125个、25-100个、30-90个、40-80个、50-70个或约60个经优化的密码子。 [0090] 此外，经优化的密码子的位置可以不同。例如，对于秀丽隐杆线虫fat-1基因(例如，如以SEQ ID NO.8所示，其中，ATG是密码子1)，经优化的密码子可见于如下位置的一处或多处(例如，至少1处、至少2处、至少3处、至少4处、至少5处、至少6处、至少7处、至少8处、至少9处、至少10处、至少20处、至少30处、至少40处、至少50处、至少60处、至少70处、至少80处或更多，包括全部)：位置6、9、18、20、22、24、28-30、33-36、47、49、52、54、58、60、61、64、67、69-71、73、77、79、81、86、89、92、94-95、100、101、105、106、112、115、118、124、127、128、 131、146、151、154、161、163、164、169、178、187、188、195、197、200、202、206、210、214、217、 221、223、225、227、228、232、234、241、245、255、271、280-282、284、285、301、303、310、312、 327、362和370。当使用秀丽隐杆线虫fat-1基因以外的去饱和酶编码基因时，密码子可以在这些相同位置的一处或多处(例如，至少1处、至少2处、至少3处、至少4处、至少5处、至少6处、至少7处、至少8处、至少9处、至少10处、至少20处、至少30处、至少40处、至少50处、至少 60处、至少70处、至少80处或更多，包括全部)被优化。在同源基因(例如，植物或真菌的n-3去饱和酶基因)中，优化的位置可以对应于上述列出的位置的一处或多处(例如，至少1处、至少2处、至少3处、至少4处、至少5处、至少6处、至少7处、至少8处、至少9处、至少10处、至少 20处、至少30处、至少40处、至少50处、至少60处、至少70处、至少80处或更多，包括全部)的位置。 [0091] 在一些实施方式中，经优化的序列可以与野生型序列(例如，秀丽隐杆线虫fat-1基因)具有至少约70％或更多(包括例如至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多)的相似性。在一些实施方式中，经优化的序列可以与野生型序列(例如，秀丽隐杆fat-1基因)具有约80％或更多的相似性。在一些实施方式中，经优化的序列可以与野生型序列(例如，秀丽隐杆线虫fat-1基因)具有约90％或更多的一致性。在一些实施方式中，经优化的序列可以与野生型序列(例如，秀丽隐杆线虫fat-1基因)具有约91％或更多的相似性。 [0092] 在一些实施方式中，为了提高哺乳动物中的秀丽隐杆线虫fat-1基因的表达，秀丽隐杆线虫fat-1基因序列的密码子可以基于哺乳动物去饱和酶序列进行优化。在一个实施方式中，fat-1的经优化的核苷酸序列以SEQ ID NO.2表示，其相应的氨基酸序列以SEQ ID NO.4表示。 [0093] 第二外源和/或异源核酸分子可以含有编码n-3脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体的核苷酸序列。术语“生物活性变体”与上述的定义相同，旨在包括分子的片段、变体、类似物或化学衍生物，例如，在n-3脂肪酸去饱和酶的背景下的分子的片段、变体、类似物或化学衍生物。 [0094] 在一些实施方式中，n-3脂肪酸去饱和酶的生物活性变体可以是保留了本文所述的将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的野生型或经修饰的n-3脂肪酸去饱和酶(例如，由SEQ ID NO.2编码)的足够的生物活性的变体。在一些实施方式中，n-3脂肪酸去饱和酶的生物活性变体可以是保留了野生型或经修饰的n-3脂肪酸去饱和酶的足够的生物活性的变体，以在治疗上有效或在临床上有效(例如，在制造转基因动物、治疗患者、或者进行诊断或其它实验室测试或检测中，变体是有用的)。例如，n-3脂肪酸去饱和酶的生物活性变体可以包括保留了野生型或经修饰的n-3脂肪酸去饱和酶(例如，由SEQ ID NO.2编码)的将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的生物活性的至少约25％或更高(包括例如至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％以及高至100％)的酶的突变体或片段。例如，当n-3脂肪酸去饱和酶的片段能够将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸，并且该转化为野生型或经修饰的酶在相同条件下的效率的至少约25％或更高(包括例如至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％以及高至100％)时，n-3脂肪酸去饱和酶的片段是全长酶的生物活性变体。 [0095] n-3脂肪酸去饱和酶的生物活性变体还可以包含一个或多个氨基酸取代(例如，酶序列中的1％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多的氨基酸残基可以被另一氨基酸残基所取代)。这些取代可以构成本领域已知的保守的氨基酸取代。 [0096] 在一些实施方式中，n-3脂肪酸去饱和酶的生物活性变体可以与野生型或经修饰的n-3脂肪酸去饱和酶(例如，由SEQ ID NO.2编码)的核苷酸序列具有至少约50％或更高 (包括例如至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％)的一致性。在一些实施方式中，n-3脂肪酸去饱和酶的生物活性变体与野生型或经修饰的n-3脂肪酸去饱和酶(例如，由SEQ ID NO.2编码)的核苷酸序列具有至少约70％的一致性。在一些实施方式中，n-3脂肪酸去饱和酶的生物活性变体与野生型或经修饰的n-3脂肪酸去饱和酶(例如，由SEQ ID NO.2编码)的核苷酸序列具有至少约90％的一致性。在一些实施方式中，n-3脂肪酸去饱和酶的生物活性变体与野生型或经修饰的n-3脂肪酸去饱和酶(例如，由SEQ ID NO.2编码)的核苷酸序列具有至少约95％的一致性。在一些实施方式中，n-3脂肪酸去饱和酶的生物活性变体与野生型或经修饰的n-3脂肪酸去饱和酶(例如，由SEQ ID NO.2编码)的核苷酸序列具有至少约99％的一致性。 [0097] 类似于fat-2，n-3脂肪酸去饱和酶(例如，fat-1)的生物活性变体的生物活性可以通过在细胞或动物中的表达进行评估，例如，通过使用本领域已知或上文所述的任何方法进行的RNA表达和/或酶检测和/或细胞或动物的脂肪酸组成的脂质分析。 [0098] 因为功能性的n-3脂肪酸去饱和酶(例如，由fat-1基因编码的n-3脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体)可以将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸，所以当将转基因动物或由其衍生的细胞用含有碳水化合物和/或饱和脂肪的组合物饲喂时，携带异源δ12脂肪酸去饱和酶(例如，由fat-2基因编码)和异源n-3脂肪酸去饱和酶(例如，由fat-1基因编码的n-3脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体)的转基因动物或由其衍生的细胞的n-3脂肪酸含量普遍增加。例如，当转基因动物和对照均饲喂包含碳水化合物和/或饱和脂肪的相同组合物时，与没有n-3脂肪酸去饱和酶转基因的动物(对照)相比，具有n-3脂肪酸去饱和酶(例如，由fat-1基因编码的n-3脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体)和δ12脂肪酸去饱和酶(例如，由fat-2基因编码的δ12脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体)的异源表达的转基因动物可以显示出机体组织和/或细胞中的n-3脂肪酸含量增加至少30％或更多，包括例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更多。在一些实施方式中，当转基因动物和对照均饲喂包含碳水化合物和/或饱和脂肪的相同组合物时，与没有n-3脂肪酸去饱和酶转基因的动物(对照)相比，具有n-3脂肪酸去饱和酶(例如，由fat-1基因编码的n-3脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体)和δ12脂肪酸去饱和酶(例如，由fat-2基因编码的δ12脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体)的异源表达的转基因动物可以显示出机体组织和/或细胞中的n-3脂肪酸含量方面的至少1.1倍或更高(包括例如至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍或更多)的增加。 [0099] 在一些实施方式中，当转基因动物中的第一外源和/或异源核酸分子以及第二外源和/或异源核酸分子进行异源表达时，具有n-3脂肪酸去饱和酶(例如，由fat-1基因编码的n-3脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体)和δ12脂肪酸去饱和酶(例如，由fat-2基因编码的δ12脂肪酸去饱和酶或其生物活性变体)的异源表达的转基因动物中的n-6脂肪酸与n-3脂肪酸的比值可以低于2:1或更低。例如，转基因动物中的n-6脂肪酸与n-3脂肪酸的比值可以小于1:1或更低。在一些实施方式中，转基因动物中的n-6脂肪酸与n-3脂肪酸的比值可以小于0.9:1、小于0.8:1、小于0.7:1、小于0.6:1、小于0.5:1、小于0.4:1或更小。 [0100] 如本文所使用且贯穿于本说明书的，术语“转基因动物”是指在一些或所有的细胞中具有转基因的动物，通过人为干预例如下文所述的方法，转基因被导入转基因动物或转基因动物的祖先中。例如，在产前阶段例如胚胎阶段，可将转基因导入转基因动物的一个或多个细胞中。“转基因”是被整合入宿主细胞的基因组中的DNA序列，转基因动物发育自该宿主细胞。转基因一般包括“感兴趣的基因”。“感兴趣的基因”是期望在宿主细胞中整合和/或表达的编码蛋白质或其它分子(例如，酶)的核酸序列。例如，在本文所述的各方面的背景下，感兴趣的基因包括例如δ12脂肪酸去饱和酶、n-3脂肪酸去饱和酶和/或它们的生物活性变体。 [0101] 待进行转基因的“动物”是指在其机体内不能从头或在体内制造n-6脂肪酸和/或n-3脂肪酸的动物，或者是在其机体内不会从头制造足够量的n-6脂肪酸和/或n-3脂肪酸以产生期望或有益的效果(例如，营养值或治疗效果)的动物。在一些实施方式中，待进行转基因的转基因动物是除秀丽隐杆线虫以外的动物。例如，待进行转基因的动物可以包括但不限于下述任何动物：被作为牲畜或用作食物来源的动物(例如，鱼或其它水生动物(例如，鱿鱼、章鱼、甲壳动物(例如，龙虾、蟹、蜗牛和虾)、或其它可食用的水生动物(例如，鳗鱼)。如实施例中所示，当被递送至动物细胞时，秀丽隐杆线虫fat-2基因和/或fat-1基因可有效表达，根据本领域公知的方法，该基因、其变体以及其它的fat-1基因可以被用于制造转基因小鼠或更大的转基因动物(例如牛、猪、绵羊、鹿、山羊、兔或任何其它牲畜和家畜；任何可食用的鸟类(例如，鸡、火鸡、鹅、鸭或母野鸡)和鱼类(包括贝壳动物和甲壳动物)。在一些实施方式中，动物是非人动物。 [0102] 在本文所述的各方面的一些实施方式中，非人转基因动物可以是转基因鱼。例如，转基因可以包括fat-2基因或其生物活性变体(例如，秀丽隐杆线虫fat-2基因，其可以包含本文所述的至少一个经优化的密码子)、或者fat-2基因和fat-1基因或它们的生物活性变体(例如秀丽隐杆线虫fat-2基因，其可以包含本文所述的至少一个经优化的密码子；以及秀丽隐杆线虫fat-1基因，其也可以包含本文所述的至少一个经优化的密码子)。转基因鱼的实例包括但不限于：鳕鱼(或鳕形目鳕鱼科的任何鱼(例如，黑线鳕)；比目鱼(庸鲽属的鲽鱼的两个种中的任一个种的通用名)；鲱鱼(鲱形目的数种鱼的通用名，还包括凤尾鱼)；鲭鱼(鲭科中的进口食用鱼的多个种的通用名)；鲑鱼(或鲑科的任何鱼，包括鳟鱼)；鲈鱼(或鲈科的任何鱼)；鲥鱼(或鲱科的任何鱼)；鳐鱼(或鳐科的任何鱼)；胡瓜鱼(或胡瓜鱼科的任何鱼)；鳎鱼(或鳎科的任何鱼)；金枪鱼(或鲭科的任何鱼)和斑马鱼。 [0103] 在一些实施方式中，转基因鱼可以具有包含可操作地连接至启动子的第一外源和/或异源核酸分子的基因组，其中，第一外源和/或异源核酸分子含有(i)SEQ ID NO.1的核苷酸序列；或(ii)作为SEQ ID NO.1的生物活性变体且与SEQ ID NO.1具有至少约70％的一致性的核苷酸序列；其中，当转基因鱼中的第一外源和/或异源核酸分子表达时，转基因鱼由饱和脂肪和/或碳水化合物制造n-6脂肪酸。在一些实施方式中，转基因鱼的基因组可以进一步包含第二外源和/或异源的核酸分子，其中，第二外源和/或异源核酸分子含有编码将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的酶的核苷酸序列。当转基因鱼中的第一和第二外源和/或异源核酸分子表达时，转基因鱼由饱和脂肪和/或碳水化合物制造n- 3脂肪酸和可选的n-6脂肪酸。在一些实施方式中，编码将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的酶的核苷酸序列可以是(i)SEQ ID NO.2的核苷酸序列；或(ii)作为SEQ ID NO.2的生物活性变体且与SEQ ID NO.2具有至少约70％的一致性的核苷酸序列。 [0104] 在本文所述的各方面的一些实施方式中，非人转基因动物可以是脊椎动物。在一些实施方式中，非人转基因动物可以是哺乳动物。在一些实施方式中，哺乳动物是非人哺乳动物。在一些实施方式中，非人转基因动物可以选自于由奶牛、小鼠、大鼠、猪、绵羊、山羊、鹿、兔、水牛、鱼、家禽、牲畜或家畜所组成的组。 [0105] 本文所述的各方面的转基因动物、由其衍生的组织或细胞可以使人们能够在无需给它们饲喂可能转而向系统中引入额外变量的不同的脂肪来源时，研究由n-6脂肪酸和/或n-3脂肪酸介导的细胞机制或生物条件。因此，在一些实施方式中，本文所述的非人转基因动物的基因组可以进一步包含基因修饰。基因修饰可以包括感兴趣的基因的插入、缺失和/或突变。例如，感兴趣的基因可能与受脂肪代谢影响的细胞机制或生物条件相关。这种感兴趣的基因的实例包括但不限于：ob(肥胖)基因、瘦素受体基因、载脂蛋白(apo)E基因。 [0106] 在一些实施方式中，本文所述的非人转基因动物可以被进一步工程化以包含ob基因中的突变，从而创造瘦素缺乏的ob/ob或肥胖非人转基因动物模型(例如，ob/ob或肥胖转基因小鼠模型)。 [0107] 在一些实施方式中，本文所述的非人转基因动物可以被进一步工程化为瘦素受体基因中的点突变的纯合子，从而创造瘦素受体活性缺乏的db/db非人转基因动物模型(例如，db/db转基因小鼠)。 [0108] 在一些实施方式中，本文所述的非人转基因动物可以被进一步工程化以敲除apoE，从而创造动脉粥样硬化的apoE敲除的非人转基因动物模型(例如，apoE敲除的转基因小鼠模型)。 [0109] 在一些实施方式中，基因修饰可以包括宿主基因的修饰。在一些实施方式中，基因修饰可以包括异源基因的表达。异源基因可以是例如与脂肪代谢通路相关的基因、治疗基因(例如，小分子或化疗剂的受体)或包含编码改善检测中的分子效用的多肽的序列的核酸分子(例如，编码荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(GFP)或增强型绿色荧光蛋白(EGFP))、非荧光标记(例如β-半乳糖苷酶)或者本领域已知的任何其它可检测标记的标记基因或序列。异源基因可以(通过相同或单独的表达载体)与本文所述的第一外源和/或异源核酸分子和/或第二外源和/或异源核酸分子(例如，编码fat-2和/或fat-1的核酸分子)共表达。 [0110] 取决于所使用的构建体是否包含组成型激活的启动子或组织特异性启动子(例如，在如下中激活的启动子，例如：骨骼肌细胞、乳腺组织细胞、结肠组织细胞、神经元、视网膜细胞、胰细胞(例如，胰岛细胞)、其它内分泌细胞、内皮细胞、皮肤细胞、脂肪细胞、视网膜细胞等)，本文所述的第一和/或第二外源和/或异源核酸分子(例如，编码fat-2基因和/或fat-1基因的核酸分子)可以在动物机体内全面表达或以组织特异性的方式表达。 [0111] 本文所述的各方面的转基因动物的组织和细胞可以含有改变的PUFA含量。例如，携带第一外源和/或异源核酸分子以及第二外源和/或异源核酸分子(例如，编码fat-2基因和fat-1基因的核酸分子)的转基因动物的细胞和组织对消费来说可能更期望费，因为它们被工程化以具有高水平的n-3脂肪酸和低水平的n-6脂肪酸的细胞或组织含量(与没有这些转基因的转基因动物相比)。因此，当它们被工程化以表达将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的第一异源酶和将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的第二异源酶(例如，分别由fat-2基因和fat-1基因编码的去饱和酶)时，作为食物被消费(例如，被人类或哺乳动物消费)的转基因牲畜或任何动物可以是更出众的或者更健康的食物来源。 [0112] 本文所述的制作非人转基因动物的示例性方法 [0113] 制作转基因动物的方法是本领域已知的，包括例如但不限于：(1)将基因显微注射入受精卵细胞的原核；(2)通过逆转录病毒转移DNA；(3)将此前暴露至外源DNA的胚胎干细胞和/或胚胎生殖细胞注射入囊胚的腔中；(4)体外受精过程中由精子介导的外源和/或异源DNA转移；(5)脂质体介导的DNA向细胞和胚胎中的转移；(6)DNA电穿孔入精子、卵或胚胎；(7)生物导弹；以及(8)用体细胞或胚胎细胞进行的核移植，上述方法被描述于Wheeler等,“Transgenic technology and Applications in Swine,”Theriogenology 56:1345-1370(2001)；Wolf等,“Transgenic technology in farm animals–progress and perspectives”,Exp Physiol 85.6:615-625(2000)，以引用的方式将其整体并入本文中。 [0114] 例如，在一个实施方式中，fat-2转基因构建体被施用至小鼠(例如，通过显微注射)，以创造fat-2转基因小鼠。在转基因小鼠被评估以显示fat-2表型和基因型后，杂合的fat-2转基因小鼠可以与野生型小鼠(例如，C57BL6野生型(WT)小鼠)回交许多世代(例如，～5代)，然后与杂合的fat-1转基因小鼠杂交。所产生的后代由WT小鼠、fat-1小鼠、fat-2小鼠和ω小鼠组成。WT小鼠并不表达fat-1或fat-2转基因中的任一者。fat-2小鼠仅携带fat-2转基因，而ω小鼠表达fat-1转基因和fat-2转基因。更多细节见实施例。 [0115] 在一些实施式案中，如实施例所示，ω小鼠可以通过将包含fat-2转基因和fat-1转基因的构建体导入至野生型小鼠中来制造。 [0116] 在另一实施方式中，可用于制造转基因动物(例如但不限于，小鼠)的一种方法如下：雌性小鼠交配，并将由此产生的受精卵从其输卵管中解剖出来。将卵存储于适当的介质如M2培养基中(Hogan B.等Manipulating the Mouse Embryo,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1986)，以引用的方式将其内容并入本文)。通过本领域已知的方法从载体(例如，质粒pCEXV-α、质粒pCAGGS)中纯化DNA或cDNA编码基因、小基因(minigene)或重组底物。诱导型启动子可以与DNA的编码区融合，以提供实验手段来调节转基因的表达。可选或另外的是，组织特异性调控元件可以与编码区融合，以使得转基因能够进行组织特异性表达。将处于适当的缓冲溶液中的DNA放入显微注射针(可使用移液器由毛细管制造)，并将待注射的卵放入凹玻片。将针插入卵的原核，并注射DNA溶液。然后将经注射的卵转移至假孕小鼠(即，用适当的激素刺激以维持怀孕但实际上并没有怀孕的小鼠)的输卵管中，当卵进入子宫，植入并发育一段时间。这一原核DNA显微注射是基因转移的经典方法，并描述于Brem“,Transgenic animals.In Biotechnology,ed.Rehm,H.J.&Reed,G.,pp.745-832.VCH,Weinheim(1993)；以及Hammer等“,Production of transgenic rabbits,sheep and pigs by microinjection”,Nature 315,680-683(1985)，以引用的方式将其内容整体并入本文中。用于小鼠中的DNA显微注射的基本方法描述于Rulicke等,“Germline transformation of mammals by pronuclear microinjection,”Experimental Physiology 85:589-601(2000)，以引用的方式将其内容整体并入本文中。对于该方法而言，一些物种的特异性修饰是必要的，例如在胚胎回收、显微注射过程、以及用于经注射的胚胎向接受者的转移中(Brem“,Transgenic animals”.In Biotechnology,ed.Rehm,H.J.&Reed,G.,pp.745-832.VCH,Weinheim(1993)，以引用的方式将其内容整体并入本文中)。DNA显微注射不是将DNA插入卵细胞中的唯一方法，DNA显微注射用于本文仅为示范的目的。 [0117] 另外，重组逆转录病毒可以用于将本文所述的转基因递送至细胞，例如，卵母细胞、胚胎细胞或单细胞胚胎。因此，可将转基因和任何相关的遗传因子作为前病毒整合入宿主细胞的基因组中。然后可以使细胞能够发育成转基因动物。 [0118] 在一些实施方式中，用于递送转基因(例如，fat-2和/或fat-1)的重组逆转录病毒可以是经修饰的慢病毒，从而能感染分裂和未分裂两种细胞。重组逆转录病毒可以包含含有转基因(例如，fat-2和/或fat-1)的经修饰的慢病毒基因组。此外，经修饰的慢病毒基因组可以缺乏病毒复制所需的蛋白质的内源基因，从而防止在转基因动物中的复制。如本文所述，在重组逆转录病毒的制造过程中，在包装细胞系中以反式(in trans)提供所需的蛋白质。 [0119] 在一些实施方式中，转基因被并入包含完整的逆转录病毒5′LTR和自我失活3′LTR的病毒构建体中。病毒构建体优选被导入包装细胞系中，基于病毒构建体，将病毒基因组RNA包装入具有期望的宿主特异性的病毒颗粒中。病毒颗粒集合并使得能够感染宿主细胞。 [0120] 创造转基因动物尤其是如小鼠或大鼠的动物的方法，在本领域已成为常规，描述于例如：Ausubel等(eds)“Current Protocols in Molecular Biology”John Wiley&Sons,Inc.,in Hogan,B.,Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)；美国专利号5,614,396、5,487,992、5,464,764、5,387,742、5,347,075、5,298,422、5,288,846、5,221,778、5,175,384、5,175,383、4,873, 191、4,870,009、4,736,866；以及Burke和Olson,Methods in Enzymology,194:251-270, 1991；Capecchi,Science 244:1288-1292,1989；Davies等,Nucleic Acids Research,20(11)2693-2698,1992；Dickinson等,Human Molecular Genetics,2(8):1299-1302,1993； Duff和Lincoln“, Insertion of a pathogenic mutation into a yeast artificial chromosome containing the human APP gene and expression in ES cells”,Research Advances in Alzheimer's Disease and Related Disorders,1995；Huxley等,Genomics, 9:742-7501991；Jakobovits等,Nature,362:255-261 1993；Lamb等,Nature Genetics,5: 22-29,1993；Pearson和Choi,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90:10578-82；Rothstein,Methods in Enzymology,194:281-301,1991；Schedl等,Nature,362:258-261,1993； Strauss等,Science,259:1904-1907,1993；WO 94/23049,WO93/14200,WO 94/06908and WO 94/28123也提供了信息。 [0121] 本文所述的各方面并不限于特定的动物。在一些实施方式中，本文所述的各方面可以被施用至人和非人动物。例如，在一些实施方式中，啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)或灵长动物被提供作为动物模型，用于脂肪代谢的变化和化合物的筛选。 [0122] 本文所述的某些方面提供了商业上有用的过表达本文所述的第一外源和/或异源核酸分子和/或第二外源和/或异源核酸分子(例如，编码fat-2或fat-1相关的蛋白)的转基因动物(例如，牲畜，如猪、奶牛或绵羊)。来自这种转基因动物的肉可以具有期望的特性，例如较低的脂肪含量和较高的肌肉含量。可以利用任何适用于制造转基因牲畜的技术。在一些实施方式中，利用了逆转录病毒载体感染(参见例如美国专利号6,080,912和WO/ 0030437，以引用的方式将其各自的内容整体并入本文。 [0123] 类似的方法可以用于制造其它转基因动物。转基因创始动物可以被基于在其基因组中存在的转基因和/或在转基因动物的组织或细胞中的转基因mRNA的表达来确认。例如，携带fat-2或fat-1相关的转基因的转基因创始动物可以随后被用来培育携带转基因的另外的动物。此外，携带转基因的转基因动物可以进一步被培育成为携带其它基因的其它转基因动物。转基因动物还包括如下动物，整个动物或该转基因动物中的组织利用本文所述的同源重组宿主细胞制造。 [0124] 本领域已知的任何技术都可用于将转基因(如fat-2和/或fat-1基因)可表达地导入动物中以制造动物的哺乳动物系。这些技术包括但不限于：原核显微注射(美国专利号4, 873,191)；逆转录病毒介导的向生殖系基因转移[Van der Putten等,1985, Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 82,6148-6152]；在胚胎干细胞中的基因靶向，例如同源重组介导的基因靶向[Thompson等,1989,Cell 56,313-321；以及美国专利号5,614,396]；胚胎的电穿孔[Lo,1983,Mol.Cell.Biol.3,1803-1814]；以及精子介导的基因转移[Nakanishi和Iritani,Mol.Reprod.Dev.36:258-261(1993)；Maione,Mol.Reprod.Dev.59:406(1998)； Lavitrano等Transplant.Proc.29:3508-3509(1997)；Lavitrano等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:14230-5(2002)；Lavitrano等,Mol.Reprod.Dev.64-284-91(2003))。类似的技术还被描述于美国专利号6,376,743；美国专利公开号20010044937、 20020108132和20050229263。 [0125] 在一些实施方式中，转基因(例如，fat-2或fat-1基因)可以被整合入转基因动物的细胞的基因组中。细胞可以是体细胞或生殖系细胞。在一些实施方式中，转基因(例如，fat-2或fat-1基因)可以被整合入细胞的基因组中，转基因动物由该细胞发育成，并且该转基因仍然以转基因动物的一种或多种细胞类型或者一种或多种组织保留在成熟动物的基因组中。 [0126] 转基因(例如，fat-2或fat-1基因)可在非人动物如哺乳动物中过表达。哺乳动物可以是例如：啮齿动物如小鼠、仓鼠、豚鼠、兔或大鼠；灵长动物；猪；羊；牛；猫；犬等。在特定的实施方式中，转基因动物可以是绵羊、山羊、马、奶牛、公牛、猪、兔、豚鼠、仓鼠、大鼠、沙鼠、小鼠等。在其它实施方式中，转基因动物可以是鸟。在一些实施方式中，转基因动物是嵌合动物(即，由基因学上不同的细胞的混合物组成的动物)、镶嵌动物(即，由具有不同遗传来源或染色体组成的两个或多个细胞系组成的动物，细胞系均衍生自同一合子)、未成熟的动物、胎儿、囊胚等。 [0127] 含有fat-2或fat-1相关的转基因的转基因非人动物可以使用本领域已知的方法制备。一般来说，将fat-2或fat-1相关的转基因导入靶细胞中，然后用来制备转基因动物。 fat-2或fat-1相关的转基因可以被导入靶细胞中，举例来说，多能细胞或全能细胞，例如胚胎干(ES)细胞(例如，鼠胚胎干细胞)或其它干细胞(例如，成人干细胞)；生殖细胞(例如，原始生殖细胞、卵母细胞、卵细胞、精母细胞或精细胞)；受精卵；合子；卵裂球；(分化或未分化的)胎儿或成体细胞等。在一些实施方式中，fat-2或fat-1相关的转基因被导入动物(例如，啮齿动物)的胚胎干细胞或生殖细胞中，以制备过表达fat-2或fat-1相关的转基因的转基因动物。 [0128] 通过胚胎操作和显微注射制造转基因动物(特别是例如小鼠的动物)的方法描述于例如：Leder等的美国专利号4,736,866和4,870,009；Wagner等的美国专利号4,873,191； 以及Hogan,B.,Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。 [0129] 胚胎干细胞可以按照公开的程序(参见例如，Teratocarcinomas和Embryonic Stem Cells:A Practical Approach,Robertson(ed.),IRL Press,Washington,D.C. (1987)；Zjilstra等,Nature 342:435-38(1989)；Schwartzberg等,Science 246:799-803(1989)；美国专利号6,194,635、6,107,543和5,994,619；以引用的方式将其各自整体并入本文中)进行操作。分离原始生殖细胞的方法在本领域是公知的。例如，从有蹄动物分离原始生殖细胞的方法公开于美国专利号6,194,635(以引用的方式将该公开内容整体并入本 文)。 [0130] 转基因(例如，fat-2或fat-1基因)可以通过任何合适的方法导入靶细胞。例如，fat-2或fat-1相关的转基因可以通过如下导入细胞中：转染(例如，磷酸钙或DEAE-右旋糖酐介导的转染)、脂质转染、电穿孔、显微注射(例如，通过直接注射裸的DNA)、生物导弹、用含有fat-2或fat-1相关的转基因的病毒载体进行感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、核移植等。fat-2或fat-1相关的转基因可以通过电穿孔(参见例如，Wong和Neumann,Biochem.Biophys.Res.Commun.107:584-87(1982))和生物导弹(例如，基因枪；Johnston和Tang,Methods Cell Biol.43Pt A:353-65(1994)；Fynan等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11478-82(1993))导入细胞。 [0131] 在某些实施方式中，fat-2或fat-1相关的转基因可以通过转染或脂质转染导入靶细胞。转染或脂质转染的合适的药剂包括例如：磷酸钙、DEAE-右旋糖酐、脂质体、lipfectamine、DIMRIE C、Superfect和双甲苯喘定(Effectin；Qiagen)、unifectin、 maxifectin、DOTMA、DOGS(Transfectam；双十八烷基酰胺甘氨酰精胺)、DOPE(1,2-二油酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺)、DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷)、DDAB(二甲基双十八烷基溴化铵)、DHDEAB(N,N-双正十六烷基-N,N-二羟乙基溴化铵)、HDEAB(N-正十六烷基-N,N-二羟乙基溴化铵)、聚凝胺、聚乙烯亚胺(PEI)等(参见例如，Banerjee等,Med.Chem.42: 4292-99(1999)；Godbey等,Gene Ther.6:1380-88(1999)；Kichler等,Gene Ther.5:855-60(1998)；Birchaa等,J.Pharm.183:195-207(1999)；以引用的方式将其各自整体并入本文)。 [0132] 在一些实施方式中，fat-2或fat-1相关的转基因可以被显微注射入受精卵母细胞的原核或ES细胞的核中。典型的方法是受精卵母细胞的显微注射。通过标准的技术用编码fat-2或fat-1相关的转基因的核酸显微注射受精卵母细胞。一般将经显微注射的卵母细胞在体外培养直至得到“移植前胚胎”。这样的移植前胚胎可以包含约16个至150个细胞。对于小鼠、兔、猪、奶牛等，用于培养受精卵母细胞至移植前阶段的方法包括由如下描述的方法：Gordon等(Methods in Enzymology 101:414(1984))；Hogan等(in Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y. (1986))；Hammer等(Nature315:680(1986))；Gandolfi等(J.Reprod.Fert.81:23-28 (1987))；Rexroad等(J.Anim.Sci.66:947-53(1988))；Eyestone等(J.Reprod.Fert.85: 715-20(1989))；Camous等(J.Reprod.Fert.72:779-85(1989))；以及Heyman等 (Theriogenology 27:5968(1989))(以引用的方式将这些参考文献整体并入本文)。这样的移植前胚胎可以随后转移至适当的(例如，假孕)雌性。取决于发育阶段，当将fat-2或fat-1相关的转基因或者含有fat-2或fat-1相关的转基因的细胞导入胚胎时，可制造嵌合动物或镶嵌动物。通过选择育种方法，可以培育嵌合动物或镶嵌动物以形成真正的生殖系转基因动物。或者，可以将经显微注射或转染的胚胎干细胞注射入合适的囊胚中，然后将囊胚植入适当的培育雌性中(例如，假孕雌性)。 [0133] fat-2或fat-1相关的转基因也可通过感染细胞而被导入细胞中或用含有突变基因的传染性病毒而被导入合子细胞中。合适的病毒包括：逆转录病毒(一般参见Jaenisch,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73:1260-64(1976))；缺陷或减毒的逆转录病毒载体(参见例如，U.S.Pat.No.4,980,286；Miller等,Meth.Enzymol.217:581-99(1993)；Boesen等, Biotherapy 6:291-302(1994)；将这些参考文献整体并入本文)；慢病毒载体(参见例如，Naldini等,Science 272:263-67(1996)，以引用的方式整体并入本文)；腺病毒或腺相关病毒(AAV)(参见例如，Ali等,Gene Therapy 1:367-84(1994)；美国专利号4,797,368和5, 139,941；Walsh等,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300(1993)；Grimm等,Human Gene Therapy 10:2445-50(1999)；以引用的方式将其公开内容整体并入本文)。 [0134] 病毒载体可以被导入例如：胚胎干细胞、原始生殖细胞、卵母细胞、卵细胞、精母细胞、精细胞、受精卵、合子、卵裂球或任何其它合适的靶细胞。在示例性的实施方式中，可以使用转导分裂细胞的逆转录病毒载体(例如，衍生自鼠白血病病毒的载体；参见例如，Miller和Baltimore,Mol.Cell.Biol.6:2895(1986))。携带感兴趣的基因的重组逆转录病毒载体的制造通常以两个阶段实现。首先，fat-2或fat-1相关的转基因可以被插入包含如下的逆转录病毒载体中：fat-2或fat-1相关的转基因(包含可由病毒的长末端重复序列 (LTRs)提供或者由内部的启动子/增强子和相关剪接信号提供的启动子和/或增强子元件)的高效表达所必需的序列；用于将病毒RNA高效包装入传染性病毒颗粒中所需的序列(例 如，包装信号(Psi)、tRNA引物结合位点(-PBS)、逆转录所需的3′调控序列(+PBS)以及病毒LTRs)。LTRs包含病毒基因组RNA结合所需的序列；逆转录酶和整合酶的功能所需的序列；以及参与引导基因组RNA表达以包装成病毒颗粒的序列。 [0135] 随着重组载体的构建，载体DNA被导入包装细胞系中。包装细胞系以反式提供了用于将病毒基因组RNA包装成具有期望的寄主范围的病毒颗粒(例如，病毒编码的核心(gag)、聚合酶(pol)和包膜(env)蛋白)的所需的病毒蛋白。寄主范围部分地由病毒颗粒表面上表达的包膜基因产物的类型控制。包装细胞系可以表达嗜同性、双嗜性或嗜异性的包膜基因产物。或者，包装细胞系可以缺乏编码病毒包膜(env)蛋白的序列。在该情况下，包装细胞系可以将病毒基因组包装成缺乏膜相关蛋白(例如，env蛋白)的颗粒。为了制造含有使病毒能够进入细胞的膜相关蛋白的病毒颗粒，含有逆转录病毒序列的包装细胞系可以用编码膜相关蛋白(例如，疱疹性口腔炎病毒(VSV)的G蛋白)的序列转染。然后，经转染的包装细胞可以制造含有由经转染的包装细胞系表达的膜相关蛋白的病毒颗粒；这些含有衍生自被另一病毒的包膜蛋白的壳体包裹的一种病毒的病毒基因组RNA的病毒颗粒被称为假型病毒颗粒。 [0136] 未经历配子发生的最后阶段的卵母细胞通常会被逆转录病毒载体感染。然后，经注射的卵母细胞使得能够伴随减数分裂而完全成熟。减数分裂过程中的核包膜的破坏使得逆转录病毒载体的前病毒形式能够整合入卵母细胞的基因组中。当使用成熟前的卵母细胞时，经注射的卵母细胞随后在允许卵母细胞于体外受精前成熟的条件下在体外进行培养。卵母细胞可以在体内成熟，并且代替在体外成熟的卵母细胞使用。对于各种哺乳动物，超数排卵和收集体内成熟的卵母细胞(例如，处于中期2期的卵母细胞)的方法是已知的(例如，对于小鼠的超数排卵，参见Hogan等,in Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y. (1994),pp.130-133；以引用的方式将其公开内容整体并入本文)。 [0137] 在一些实施方式中，通过核转移制备转基因动物。术语“核转移”或“核移植”是指制备转基因动物的方法，其中，来自供体细胞的细胞核被移植入去核卵母细胞中。核转移技术或核移植技术是本领域已知的(参见例如，Campbell等,Theriogenology 43:181(1995)；Collas和Barnes,Mol.Reprod.Dev.38:264-67(1994)；Keefer等,Biol.Reprod.50:935-39(1994)；Sims等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6143-47(1993)；Prather等, Biol.Reprod.37:59-86(1988)；Roble等,J.Anim.Sci.64:642-64(1987)；国际专利公开WO 90/03432，WO 94/24274和WO 94/26884；美国专利号4,994,384和5,057,420；以引用的方式将其公开内容整体并入本文)。例如，转基因胚胎的核、多能细胞、全能细胞、胚胎干细胞、生殖细胞、胎儿细胞或成体细胞(即，含有fat-2或fat-1相关的转基因)可以被移植入去核卵母细胞中，此后将其各自培养至囊胚阶段(本文所使用的术语“去核”是指核被移除的细胞、以及是指核在功能上被导致无效的细胞)。含有fat-2或fat-1相关的转基因的核可以通过任何合适的方法被导入这些细胞中。然后，转基因细胞可以通常在体外培养，以形成预植入胚胎，预植入胚胎可以植入合适的雌性中(例如，假孕的雌性)。 [0138] 转基因胚胎任选地可以接受或再接受另一轮的核移植。当原始的转移核来自成体细胞(例如，成纤维细胞或其它高度分化细胞或终末分化细胞)以制造健康的转基因动物时，额外轮核移植克隆可能是有用的。 [0139] 制造表达fat-2或fat-1相关的转基因的转基因动物的其它方法包括使用雄性精细胞以将fat-2或fat-1相关的转基因携带至卵。在一个实例中，fat-2或fat-1相关的转基因可通过直接递送而被在体内给予至雄性动物的睾丸。fat-2或fat-1相关的转基因可以使用例如微量吸移管导入细精管、导入睾丸网、导入输出管或输入管。 [0140] 在一些实施方式中，fat-2或fat-1相关的转基因可以被离体导入雄性生殖细胞的基因组中。许多已知的基因递送方法可用于将核酸序列摄入细胞中。将fat-2或fat-1相关的转基因导入雄性生殖细胞中的合适的方法包括例如：脂质体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒增强基因递送系统、或它们的组合。 [0141] 将fat-2或fat-1相关的转基因转移入雄性生殖细胞中后，转基因合子可以通过雌性动物与雄性动物繁殖而形成。转基因合子可以通过例如通过自然交配(例如，由同一物种的雄性和雌性脊椎动物交配)形成、或通过体外或体内的人工手段形成。如本领技术人员所了解的，合适的人工手段包括但不限于：人工授精；体外受精(IVF)；和/或其它人工生殖技术，例如胞浆内精子注射(ICSI)、带下授精(SUZI)、部分带剖开(PZD)等(参见例如，国际专利公开WO 00/09674，以引用的方式将其公开内容整体并入本文)。 [0142] 可以使用各种各样的方法来检测靶细胞和/或转基因动物中的fat-2或fat-1相关的转基因的存在。由于转基因掺入的频率可能较低，所以虽然是可靠的，但是移植前胚胎中的转基因整合的检测可以是期望的。一方面，筛选胚胎以使得能够鉴别用于植入以形成转基因动物的含有fat-2或fat-1相关的转基因的胚胎。例如，从移植前胚胎中移除一个或多个细胞。当使用胚胎的均等分裂时，通常不将胚胎培育超过桑椹期(32个细胞)。移植前胚胎的分裂(参见例如，Williams等,Theriogenology 22:521-31(1986))使得产生两个“半胚胎”(半桑椹胚或半囊胚)，在植入适当的雌性中后，其中的一个可以随后发育，以在子宫内发育一段时间。虽然移植前胚胎的均等分裂是常见的，将理解的是，这样的胚胎可以有意或无意地非均等分裂成为两个半胚胎。从本质上讲，未进行分析的胚胎中的一个通常有足够的细胞数以在子宫内发育到足月。在一个具体的实施方式中，未进行分析的半胚胎如果显示为转基因的，可以被用来产生转基因动物的克隆种群，例如通过胚胎分裂。 [0143] 可对由移植前胚胎的分裂所形成的半胚胎之一进行分析以确定fat-2或fat-1相关的转基因是否已被整合入生物体的基因组中。另外的半胚胎各自可以被保存以用于随后植入受体雌性中，通常是同一物种的受体雌性。用于检测在胚胎发育中处于早期的fat-2或fat-1相关的转基因的典型方法利用了这些半胚胎连同等位基因特异性PCR，等位基因特异性PCR可以区分fat-2或fat-1相关的转基因与内源转基因(参见例如，McPherson等(eds) PCR2:A Practical Approach,Oxford University Press(1995)；Cha等,PCR Methods Appl.2:14-20(1992)；以引用的方式将其公开内容并入本文)。 [0144] 在半胚胎被鉴别为转基因半胚胎后，半胚胎任选地可以被克隆。这种胚胎克隆可以通过多种不同的方法进行。在一种克隆方法中，转基因半胚胎可以在与用于培养个体卵母细胞至移植前阶段的相同或类似的培养基中培养。这样形成的“转基因胚胎”(通常是转基因桑椹胚)随后可以被分裂为“转基因半胚胎”，转基因半胚胎可被植入受体雌性中以形成两个转基因非人动物的克隆种群。或者，所获得的两个转基因半胚胎可被再次培养至移植前阶段、分裂并再培养至转基因胚胎阶段。此过程可以被重复，直至获得期望数目的具有相同的基因型的克隆转基因胚胎。然后，这样的转基因胚胎可以被植入受体雌性中以产生转基因非人动物的克隆种群。 [0145] 除了用于检测fat-2或fat-1相关的转基因的存在的以上方法以外，还可采用其它方法。这样的方法包括例如组织的子宫内和产后分析。子宫内分析可以通过多种技术进行。在一个实例中，在听诊器指引(echoscopic guidance)下进行羊膜腔的经阴道穿刺(参见例如，Bowgso等,Bet.Res.96:124-27(1975)；Rumsey等,J.Anim.Sci.39:386-91(1974))。这涉及在妊娠期间恢复羊水。羊水中的大部分细胞是死亡的。然而，这样的细胞含有可以接受对作为成功的转基因的指示的fat-2或fat-1相关的转基因进行分析(例如，通过PCR)的基因组DNA。或者，胎儿细胞可以通过绒毛膜穿刺恢复。该方法还可以经阴道并在听诊器指引下进行。在该方法中，针可以用于穿刺受体动物的胎盘，尤其是倚靠着阴道壁固定的胎盘结构(placentonal structures)。如果有必要，绒毛膜细胞可以从母体组织分离，并接受对作为成功的转基因的指示的fat-2或fat-1相关的转基因进行的PCR分析。 [0146] fat-2或fat-1相关的转基因的存在还可以在出生后被检测到。在这种情况下，fat-2或fat-1相关的转基因的存在可以通过合适的组织活检进行检测，例如来自推定的转基因动物的耳朵或尾巴。fat-2或fat-1相关的转基因的存在还可以通过测定组织中的fat- 2或fat-1相关的转基因多肽的表达来进行检测。 [0147] 可以通过本领域技术人员已知的方法确定整合事件的位置和数目(参见例如，Ausubel等，同前；Sambrook等,同前)。例如，当期望关于病毒DNA向宿主基因组中整合的位点的信息时，可以利用从被感染的卵母细胞和/或由此制造的胚胎、后代和由其衍生的组织中提取的基因组DNA的PCR或DNA印迹分析。为了检查宿主基因组中存在的整合位点的数量，所提取的基因组DNA通常可以用限制性酶消化，该限制性酶在载体序列内切割至少一次。如果所选择的酶在载体序列内切割两次，除了可以使用适当的探针检测的具有新长度的两个片段以外，还形成具有已知(即，可预测的)大小的条带。 [0148] 本文所述的非人转基因动物的克隆还可以根据在如下中描述的方法制造：Wilmut等,Nature 385:810-813(1997)；以及PCT国际公开号WO97/07668和WO 97/07669。举例来说，来自转基因动物的细胞(例如，体细胞)可以被分离和诱导以退出生长周期并进入G0期。然后，静止细胞可以例如通过使用电脉冲被融合至来自分离出该静止细胞的同一物种动物的去核卵母细胞。然后培养重构建的卵母细胞，以使该卵母细胞发育为桑椹胚或囊胚，然后转移至假孕雌性饲养动物。该雌性饲养动物生育的后代是转基因动物的克隆，细胞(例如体细胞)由该克隆分离。 [0149] 制备转基因动物的另外的方法被公开于例如：美国专利号5,633,076或6,080,912；以及国际专利公开WO 97/47739、WO 99/37143、WO 00/75300、WO 00/56932和WO 00/ 08132，以引用的方式将其公开内容整体并入本文。 [0150] 在一个相关的方面，表达fat-2或fat-1相关的转基因的非人转基因动物可以是用于建立表达fat-2或fat-1相关的转基因的细胞系的细胞的来源。例如，细胞系可以来源自表达同源、异源fat-2或fat-1相关的转基因的小鼠。 [0151] 本文所述的转基因动物除了存在fat-2或fat-1相关的转基因以外，可以具有其它的基因改变。例如，宿主的基因组可以被改变以影响编码疾病相关基因或治疗基因(包括标记基因)的内源基因的功能或者与所期望的应用一致的其它的基因改变。例如，虽然不需要本文所述的各方面的可操作性，本文所述的转基因动物可具有除了fat-2和/或fat-1基因以外的内源基因(或者fat-2和/或fat-1基因)的改变，基因改变如上所述。 [0152] 本文所述的转基因动物的克隆还可以根据在如下中描述方法制造：Wilmut,I.等Nature 385:810-813(1997)和PCT国际公开号WO 97/07668和WO 97/07669。总之，来自转基因动物的细胞(例如，体细胞)可以被分离和诱导以退出生长周期并进入G0期。然后，静止细胞可以例如通过使用电脉冲被融合至来自分离出该静止细胞的同一物种动物的去核卵母 细胞。然后，培养重构建的卵母细胞，以使卵母细胞发育为桑椹胚和囊胚，然后转移至假孕雌性饲养动物。这种雌性饲养动物生育的后代是转基因动物的克隆，细胞(例如体细胞)由该克隆分离。 [0153] 另一方面提供了分离自本文所述的转基因动物的细胞群。例如，可将本文所述的转基因动物用作细胞培养的细胞的来源。 [0154] 用于制造本文所述的转基因动物的转基因构建体 [0155] 在一个方面，本文提供的是含有可操作地连接至启动子的第一外源和/或异源核酸分子的转基因构建体，其中，第一外源和/或异源核酸分子含有编码δ12脂肪酸去饱和酶(例如，fat-2)的核苷酸序列、或其生物活性变体的核苷酸序列，其中，该核苷酸序列并不对应于秀丽隐杆线虫的野生型fat-2基因，并且其中，当将转基因构建体导入细胞中时，启动子指导动物细胞中的第一外源和/或异源核酸分子的表达。例如，可以通过显微注射将转基因构建体导入细胞中。 [0156] 在一些实施方式中，第一外源和/或异源核酸分子可以包含：(i)SEQ ID NO.1的核苷酸序列；或(ii)作为SEQ ID NO.1的生物活性变体且与SEQ ID NO.1具有至少约70％或更多的一致性(包括例如，至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多)的核苷酸序列。 [0157] 在一些实施方式中，转基因构建体可以进一步包含第二外源和/或异源核酸分子，第二外源和/或异源核酸分子含有编码将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的酶的核苷酸序列。在一些实施方式中，编码将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的酶的核苷酸序列可以是编码n-3脂肪酸去饱和酶的核苷酸序列或其生物活性变体的核苷酸序列，其中，核苷酸序列并不对应于秀丽隐杆线虫的野生型fat-1基因。 [0158] 在一些实施方式中，第二外源和/或异源核酸分子可以包含：(i)SEQ ID NO.2的核苷酸序列；或(ii)作为SEQ ID NO.2的生物活性变体且与SEQ ID NO.2具有至少约70％或更多的一致性(包括例如，至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多)的核苷酸序列。 [0159] 在第二外源和/或异源核酸分子存在于本文所述的转基因构建体的一些实施方式中，第二外源和/或异源核酸分子能够可操作地连接至相同的启动子或不同的启动子，其中，当将转基因构建体导入细胞中时，所述的相同的启动子或不同的启动子指导转基因动物细胞中的第二外源和/或异源核酸的表达。动物细胞的实例包括但不限于衍生自本文所述的任何动物的细胞，所述动物例如但不限于：奶牛、小鼠、大鼠、猪、绵羊、山羊、兔、水牛、鱼、家禽、牲畜或家畜。 [0160] 在一些实施方式中，转基因构建体可以包含载体(例如，表达载体)。在一些实施方式中，载体可以是腺病毒载体。可以作为表达构建体使用的其它病毒载体包括衍生自如下病毒的载体，所述病毒例如：痘苗病毒(例如，痘病毒或修饰型痘苗病毒安卡拉株(MVA))、腺相关病毒(AAV)或疱疹病毒。这些病毒提供了与动物细胞(包括人细胞)关联使用的多个引人注目的特性。例如，单纯疱疹病毒(例如，HSV-1)可以被选择用于递送去饱和酶(例如，fat-1/fat-2或其同源物(或其生物活性变体，包括密码子经优化的变体))至感兴趣的细胞。 [0161] 逆转录病毒、脂质体和质粒载体也是本领域公知的，并且也可以用于递送编码fat-2和/或fat-1的序列至细胞(例如，当希望融合编码去饱和酶(例如，fat-1和/或fat-2)的序列至LacZ基因时，可以使用表达载体pUR278；LacZ编码可检测的标记物β-半乳糖苷酶(参见例如，Ruther等,EMBOJ.2:1791,1983))。 [0162] 注意到的是，编码去饱和酶的序列(例如fat-1和/或fat-2序列)或其生物活性变体(包括密码子经优化的序列)也可以被融合至其它类型的异源序列，例如编码另一治疗基因的序列，或者当表达时提高融合蛋白的数量或质量(例如，溶解度或循环半衰期)的序列。 例如，pGEX载体可以用来表达融合至谷胱甘肽S-转移酶(GST)的去饱和酶。一般来说，这种融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附至谷胱甘肽琼脂糖珠并随后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱而很容易地从裂解细胞纯化。pGEX载体(Pharmacia Biotech公司；Smith和Johnson,Gene 67:31-40,1988)被设计为包含凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点，以使经克隆的目标基因产物可从GST部分释放。其它的融合成员包括白蛋白和免疫球蛋白分子(例如，IgG、IgA、IgM或IgE)的区(例如，有或没有铰链区的Fc区)。其它有用的载体包括将麦芽糖E结合蛋白和蛋白A分别融合至n-3去饱和酶的pMAL(New England Biolabs,Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)。 [0163] 转基因的表达可以由附加体系统充分延长，以使得不需要重新给予具有其转基因的任何给定的表达载体。 [0164] 或者，载体可以被设计为优选在特定位点的位置促进整合入宿主基因组中，这将有助于确保转基因不会在细胞的生命期内丢失。无论以什么方式递送，由宿主细胞施加的转录调控将促进组织特异性和调节转基因表达。 [0165] 因此，本文所述的核酸分子可以包含促进去饱和酶编码序列整合入宿主基因组中。 [0166] 取决于例如待转化的宿主细胞的类型以及期望的蛋白质表达的水平，可对表达载体进行选择或设计。例如，当宿主细胞是哺乳动物细胞时，表达载体可以包含病毒调控元件，如衍生自如下的启动子：多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。这些调控元件也可用于非哺乳动物(例如，鸟或鱼)细胞。所插入的核酸(即，待表达的序列；此处指去饱和酶，例如fat-1和/或fat-2)也可以被修饰以编码在大肠杆菌中被优先使用的残基(Wada等,Nucleic Acids Res.20:2111-2118,1992)。类似地，如果必要或期望的话，可以在除大肠杆菌(E.coli.)以外的生物中优先修饰密码子。这样的修饰(例如，掺入各种调控元件和密码子优化)可以通过标准的重组技术实现。更普遍的是，表达载体可以被设计成在原核或真核细胞中表达蛋白质。例如，多肽可以在细菌细胞(例如，大肠杆菌)、真菌、酵母或昆虫细胞中表达(例如，使用杆状病毒表达载体)。例如，可将杆状病毒(例如生长在草地贪夜蛾细胞中的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV))用作载体以表达fat-1和/或fat-2基因。而本发明并不限于此，当表达的主要目的是制造和纯化n-3去饱和酶时，大肠杆菌、酵母和昆虫细胞可以作为宿主细胞。如本文所指出的，本发明还涵盖了在高等细胞中的n-3去饱和酶的表达，包括在广泛范围的不同类型的转基因动物中的n-3去饱和酶的表达。 [0167] 如上所述，当宿主细胞从多细胞动物获得，或者宿主细胞是多细胞动物内的细胞时，用于表达去饱和酶的表达载体和核酸(例如，fat-1和/或fat-2核酸序列)还可以包含组织特异性启动子。这样的启动子是本领域已知的，并且包括但不限于：肝特异性启动子(例如，白蛋白；Miyatake等,J.Virol.71:5124-5132,1997)、肌肉特异性启动子(例如，肌球蛋白轻链1(Shi等,Hum.Gene Ther.8:403-410,1997)或α-肌动蛋白)、胰腺特异启动子(例如，胰岛素或胰高血糖素启动子)、神经特异性启动子(例如，酪氨酸羟化酶启动子或神经元特异性烯醇化酶启动子)、内皮细胞特异性启动子(例如，von Willebrandt；Ozaki等,Hum Gene Ther.7:1483-1490,1996)和平滑肌细胞特异性启动子(例如，22a)。肿瘤特异性启动子也被用于开发癌症疗法，包括用于B16黑色素瘤的酪氨酸激酶特异性启动子(Diaz等,J.Virol.72:789-795,1998)、用于特定的乳腺癌的DF3/MUC1(Wen等,Cancer Res.53:641- 651,1993；对于乳腺癌，还可以使用人芳香酶细胞色素p450(p450arom)的脂肪特异性启动子区域(参见美国专利号5,446,143；Mahendroo等,J.Biol.Chem.268:19463-19470,1993； 以及Simpson等,Clin.Chem.39:317-324,1993)。甲胎蛋白启动子可用于引导肝癌中的表达(Chen等,Cancer Res.55:5283-5287,1995)。当组织特异性表达不需要或不期望时，去饱和酶(例如，fat-1和/或fat-2)编码序列可以被置于组成型激活的启动子(例如，β-肌动蛋白启动子)的控制之下(例如，操作性地连接至该启动子)。其它的组成型激活的启动子在本领域已知并使用。 [0168] 载体和其它核酸分子(例如，fat-1和/或fat-2cDNA本身)还可以包含限制转基因的时序表达的序列。例如，通过例如在启动子中包含cAMP应答元件(CRE)增强子并且用cAMP调节药物处理被转染或被感染的细胞(Suzuki等,Hum.Gene Ther.7:1883-1893,1996)，转基因可以通过可药物诱导的启动子控制。或者，阻遏子元件可以在药物存在的情况下阻止转录(Hu等,Cancer Res.57:3339-3343,1997)。表达的空间调控也已经利用与ergl基因启动子结合的电离辐射(放疗)实现。本文还提供了包含这样的调控序列的构建体。 [0169] 本文所述的包含核酸分子的宿主细胞(包含表达载体)也在本文所述的各方面的范围内。细胞可以是原核细胞或真核细胞。合适的原核细胞包括细菌细胞，而合适的真核细胞包括哺乳动物的细胞、鸟类的细胞和鱼类的细胞。细胞系(包括已建立并保藏在公共的保藏机构中的细胞系)也可用作宿主细胞。可以使用这些细胞中的任何一种，尤其是在优化核酸序列的过程中。细胞可以被认为是健康的或患病的(例如，细胞可以被炎症感染或可以是以不期望(例如，不期望地高)的速率转化和/或增殖)。 [0170] δ12脂肪酸去饱和酶和/或n-3脂肪酸去饱和酶转基因：“δ12脂肪酸去饱和酶转基因”是指编码将碳水化合物和/或饱和脂肪转化为n-6脂肪酸的酶的核酸或者其生物活性变体或片段。δ12脂肪酸去饱和酶转基因可以是例如编码功能酶或功能活性片段或酶的功能性衍生物的cDNA、mRNA、RNA、基因组DNA的一部分或其片段。示例性的δ12脂肪酸去饱和酶可以是全长fat-2转基因或其功能活性片段或其功能性衍生物。 [0171] 本文所使用的术语“n-3脂肪酸去饱和酶转基因”是指编码可以将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的酶的核酸、或如本文所定义的其生物活性变体。n-3脂肪酸去饱和酶转基因可以是例如编码功能酶或功能活性片段或酶的功能性衍生物的cDNA、mRNA、RNA、基因组DNA的一部分或片段。示例性的n-3脂肪酸去饱和酶可以是全长fat-1基因或其功能活性片段或其功能性衍生物。 [0172] 术语“功能性衍生物”是指具有与全长(野生型)多肽相关的一个或多个功能(例如，制造必需脂肪酸的酶活性)的片段、同系物、衍生物或类似物。在一些实施方式中，δ12脂肪酸去饱和酶的功能性衍生物是全长(野生型)酶的片段、同系物、衍生物或类似物，以使功能性衍生物可以将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸。在一些实施方式中，n-3脂肪酸去饱和酶的功能衍生物是全长(野生型)酶的片段、同系物、衍生物或类似物，以使功能性衍生物可以将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸。 [0173] 在一些实施方式中，δ12脂肪酸去饱和酶和/或n-3脂肪酸去饱和酶转基因可以是来自在不同物种的宿主中表达的一个物种的同种异源转基因。例如，同种异源fat-2或fat-1转基因是指来自另一物种的相应基因；因此，如果鼠类是待进行转基因的宿主，来自秀丽隐杆线虫的fat-1基因或fat-2基因是同种异源基因。在一些实施方式中，δ12脂肪酸去饱和酶和/或n-3脂肪酸去饱和酶转基因可以衍生自与转基因动物相同的物种(例如，在鱼中过表达的鱼fat-2或fat-1相关的转基因)。 [0174] 含有编码同种异源蛋白序列的各种基因片段的转基因可以例如通过杂交或DNA测序很容易地被鉴别为来自转基因动物以外的生物物种。在一些实施方式中，同种fat-2或fat-1相关的转基因与秀丽隐杆线虫fat-2或fat-1相关的转基因具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90或至少95％的一致性。本文在两个或多个核酸或多肽序列的语境下所使用的术语“一致性”或“一致性百分比”是指使用下述的序列比较算法中的一种或通过目视检查所测定的，当对最大对应进行比较和比对时的两个或多个序列或者子序列相同或具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基。在两个核酸或多肽的语境下所使用的短语“基本上一致”是指使用下述的序列比较算法中的一种或通过目视检查所测定的，当对最大对应进行比较和比对时，两个或多个序列或者子序列具有至少60％、通常80％、最常见90％- 95％的核苷酸或氨基酸残基一致性。两个多肽序列是“基本上一致”的指征是一个多肽与针对第二多肽产生的抗体在免疫学上反应。 [0175] 在一些实施方式中，fat-2或fat-1相关的酶与秀丽隐杆线虫fat-2或fat-1相关的酶具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的相似性。本文在两个或多个多肽序列的语境下所使用的术语“相似性”或“相似性百分比”是指使用下述的序列比较算法中的一种或通过目视检查所测定的，当对最大对应进行比较和比对时，两个或多个序列或者子序列相同或者具有指定百分比的相同的氨基酸残基或其保守取代。举例来说，当将对与第一序列所含数量相同数量的氨基酸进行比较或者当与已通过使用如下文所讨论的本领域已知的计算机相似性程序进行比对的多肽比对物进行比较时，当第一氨基酸序列与第二氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、75％、80％、90％或甚至95％一致性或相对于第二氨基酸序列保守取代至少50％、60％、70％、75％、80％、90％或甚至95％时，第一氨基酸序列可以被认为类似于第二氨基酸序列。 [0176] 在多肽序列的语境下，术语“基本相似”是指在大约10-20个氨基酸残基的比较窗口中，多肽含有与参比序列具有至少60％的序列一致性(或与参比序列具有70％或80％或85％的序列一致性、或最优选具有90％的一致性)的序列。在氨基酸序列的语境下，“基本一致”进一步包括氨基酸的保守取代。因此，例如在两个多肽因一个或多个保守取代而不同的情况下，多肽基本上类似于第二多肽。 [0177] 当描述多肽时，术语“保守取代”是指不会实质上改变多肽活性的多肽的氨基酸组成方面的变化。因此，特定氨基酸序列的“保守取代”是指对于多肽活性而言不重要的氨基酸的取代或用具有类似性质(例如，酸性、碱性、带正电或带负电、极性或非极性等)的其它氨基酸进行的氨基酸的取代，以使甚至关键氨基酸的取代也不会实质上改变活性。提供功能上类似的氨基酸的保守取代表是本领域公知的。例如，下述六组各自含有互为保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)(还参见Creighton,Proteins,W.H.Freeman and Company(1984))。此外，编码序列中的改变、插入或删除单一氨基酸或少量百分比的氨基酸的单个取代、缺失或插入也是“保守取代”。 [0178] 对于序列比较，通常使一个序列充当参比序列，测试序列针对该序列进行比较。当使用序列比对算法时，测试序列和参比序列被输入计算机中，如果有必要，子序列坐标被指定，并且序列算法程序参数被指定。然后基于指定的程序参数，序列比对算法计算出测试序列相对于参比序列的序列一致性百分比。 [0179] 用于比较的序列的最佳比对可以通过如下施行：例如，通过Smith和Waterman的局部同源性算法(local homology algorithm)(Adv.Appl.Math.2:482(1981)，以引用的方式并入本文)；通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.48:443-53(1970)，以引用的方式并入本文)；通过Pearson和Lipman的相似性搜索方法(search for similarity method)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-48(1988)，以引用的方式并入本文)；通过这些算法的计算机化实施(例如，Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)；或者通过目视检查(通常参见Ausubel等(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,4th ed.,John Wiley and Sons,New York(1999))。 [0180] 有用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP采用渐进的成对的比对由成组的相关序列创建多序列比对，以示出序列一致性百分比。PILEUP还绘制了显示出用于创建比对的聚类关系的树或树形图。PILEUP使用Feng和Doolittle(J.Mol.Evol.25:351-60(1987)，以引用的方式并入本文)的简化的渐进比对方法。所使用的方法类似于Higgins和Sharp(Comput.Appl.Biosci.5:151-53(1989)，以引用的方式并入本文)描述的方法。该程序可以比对多至300个序列，各序列具有最大长度为5,000个核苷酸或氨基酸。多重比对过程起始于两个最相似序列的成对比对，制造两个经比对的序列的聚类。然后，该聚类与下一个最相关的序列或经比对的序列的聚类进行比对。序列的两个聚类通过两个单独序列的成对比对的简单扩展进行比对。最终的比对通过一系列的渐进的成对比对来实现。该程序通过指定序列比较区域的特定序列以及它们的氨基酸或核苷酸的坐标以及通过指定程序参数来运 行。例如，可以将参比序列与其它的测试序列进行比较，以使用下列参数确定序列一致性百分比的关系：默认的空位权重(3.00)、默认的空位长度权重(0.10)和加权末端缺口。 [0181] 适用于确定序列一致性百分比和序列相似性百分比的算法的另一实例是BLAST算法，该算法描述于Altschul等(J.Mol.Biol.215:403-410(1990)，以引用的方式并入本文)(还参见Zhang等,Nucleic Acid Res.26:3986-90(1998)；Altschul等,Nucleic Acid Res.25:3389-402(1997)，以引用的方式并入本文)。用于执行BLAST分析的软件是通过美国国家生物技术信息中心的互联网网站公众可得的。该算法涉及通过识别查询序列中的长度W的短字串来首先识别高得分序列对(HSPs)，当与数据库序列中的相同长度的字串比对时，该高得分序列对匹配或满足一些正值的阈值得分T。T被称为邻域字串得分阈值 (neighborhood word score threshold)(Altschul等(1990)，同前)。这些初始邻域字串采样数(hits)作为种子用于起始搜索以发现含有它们的较长HSPs。然后字串采样数在两个方向上沿各序列延伸，直至累积比对得分可被增加。在下述情况下，字串采样数在各方向的延伸停止：累积比对得分由它达到的最大值下降数量X；由于一个或多个负得分余数比对 (negative-scoring residue alignments)的积累，累积得分变为零或零以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用下述缺省值：字串长(W)为11，BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-9(1992)，以引用的方式并入本文)比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4和双链比较。 [0182] 除了计算序列一致性百分比，BLAST算法还执行两个序列之间的相似性的统计分析(参见例如，Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-77(1993)，以引用的方式并入本文)。由BLAST算法提供的相似性的一个度量是最小概率和(P(N))，它提供了两个核苷酸序列或两个氨基酸序列之间的匹配随机发生的概率的指示。例如，如果测试核酸与参比核酸的比较中的最小和概率小于约0.1、更典型地小于约0.01、且最典型地小于约 0.001，则该核酸被认为类似于参比序列。 [0183] 在一些实施方式中，fat-2或fat-1相关的转基因由包含转录单位的表达构建体表达。“转录单位”是指如下多核苷酸序列，该多核苷酸序列包含：fat-2或fat-1相关的转基因(例如，结构基因(外显子))或其功能活性片段的、结构序列的有效转录所必需的顺式作用连接的启动子和其它顺式作用序列、结构序列的适当的组织特异性转录和发育的转录所必需的远端调控元件(视情况而定)以及用于有效的转录和翻译的额外的顺式序列(例如，多聚腺苷酸化位点、mRNA稳定性调控序列等)。表达载体中有用的调控序列或其它序列可以形成转基因序列的一部分。如果没有已经包含在内的话，这包含内含子序列和多聚腺苷酸化信号。启动子和其它顺式作用序列可操作地连接至结构基因。 [0184] 在一些实施方式中，启动子是组织特异性启动子，例如，肌肉特异性启动子、骨骼特异性的启动子或器官特异性启动子。示例性的肌肉特异性启动子例如但不限于：心肌特异性的α-肌球蛋白重链、在骨骼肌中激活的肌球蛋白轻链2基因调控区(Shani,Nature 314:283-86(1985))；以及在下丘脑激活的促性腺激素释放激素基因调控区(Mason等, Science234:1372-78(1986))。在示例性的实施方式中，启动子是在骨骼肌细胞中表达的MKC启动子。在另一实施方式中，肌肉启动子是平滑肌启动子，例如但不限于SM22a，它指导血管平滑肌细胞中的表达。 [0185] 在一些实施方式中，肌肉特异性启动子是诱导型肌肉特异性启动子。例如，δ12脂肪酸去饱和酶(例如，fat-2)和/或n-3脂肪酸去饱和酶(例如，fat-1)转基因能够可操作地连接至提供可操作性地连接的核酸的受调控表达或条件性表达(例如，组织特异性表达或诱导型表达)的一个或多个调控元件。本领域技术人员可以很容易地确定使期望组织中的转基因能够进行表达的适当的组织特异性启动子或增强子。还可将各种诱导型启动子或增强子的任一种包含于用于转基因的可调控表达的载体中。“诱导型”启动子是使基因表达能够可控和细致调节的系统。参见，Miller和Whelan,Human Gene Therapy,8:803-815(1997)。本文所使用的短语“诱导型启动子”或“诱导型系统”包括可以使用外部递送的试剂来调节启动子活性的系统。 [0186] 这些系统包括例如：使用来自大肠杆菌的lac阻遏子作为转录调节器以调节来自荷载lac操纵子的哺乳动物细胞启动子的转录的系统(Brown等Cell,49:603-612,1987)；使用四环素阻遏子(tetR)的系统(Gossen和Bujard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547- 5551,1992；Yao等,Human Gene Ther.9:1939-1950,1998；Shokelt等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:6522-6526,1995)。其它的这样的系统包括例如但不限于： FK506二聚体、使用castradiol的VP16或p65、RU486/米非司酮、二酚米乐甾酮或雷帕霉素(参见，Miller和Whelan，同上，图2)。另一实例是蜕皮激素诱导型系统(参见例如，Karns等,MBC Biotechnology 1:11,2001)。诱导型系统可以由例如Invitrogen、Clontech和Ariad提供。优选与操纵子一起使用阻遏子的系统。 [0187] 在没有适当的刺激的情况下，一些诱导型启动子引起几乎没有或检测不到的表达水平(或没有表达)。在没有刺激的情况下，其它的诱导型启动子引起可检测的组成型表达。无论在没有刺激的情况下的表达水平如何，在正确的刺激的存在下，来自任何诱导型启动子的表达增加。这样的诱导型系统包括例如：四环素诱导型系统(Gossen&Bizard, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992)；Gossen等,Science,268:1766-1769 (1995)；Clontech,Palo Alto,Calif.)；由重金属诱导的金属硫蛋白启动子；响应于蜕皮激素或相关激素如米乐甾酮的昆虫甾体激素(No等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996)；Yao等,Nature,366:476-479(1993)；Invitrogen,Carlsbad,Calif.)；由甾体例如糖皮质激素(glucocortocoid)和雌激素诱导的小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)(Lee等,Nature, 294:228-232(1981))；以及由温度变化诱导的热休克启动子。其它的实例系统包括可由经修饰的腺病毒载体中的抗孕激素例如米非司酮诱导的Gal4融合物(Burien等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:355-360(1999)。另一这样的诱导型系统利用药物雷帕霉素以诱导腺相关病毒载体中的含有FKBP12和FRAP的雷帕霉素结合结构域的转录激活因子的 重组(Ye等,Science,283:88-91(1999))。其它的诱导型系统是本领域技术人员已知的，并且可以用于本文所述的方法中。 [0188] 受调控的表达系统的另一实例是噬菌体P1的cre/loxP重组酶系统。对于cre/loxP重组酶系统的描述，参见例如，Lakso等PNAS 89:6232-6236(1992)。重组酶系统的另一实例是酿酒酵母(S.cerevisiae)的FLP重组酶系统(O'Gorman等Science 251:1351-1355(1991)。如果cre/loxP重组酶系统被用来调节转基因的表达，需要含有编码Cre重组酶和所选择的蛋白质的转基因的动物。这样的动物可以通过构建“双”转基因动物(例如通过交配两个转基因动物，一个含有编码所选择的蛋白质的转基因，另一个含有编码重组酶的转基因)来提供。 [0189] 人们可以改造这些“诱导”系统，以使组成型激活的同种型的脂肪酸去饱和酶(例如，fat-2或fat-1相关的酶)通过加入外部试剂进行调节，但仅在特定的组织中表达。在本文中，这样的启动子系统被称为“诱导型组织特异性启动子”。因此，在一些实施方式中，脂肪酸去饱和酶转基因(例如，fat-2和/或fat-1相关的转基因)操作性地连接至在组织中调节转基因表达的诱导型启动子。这样的系统可以被包含在可以被操作性地连接的一个或多个外源和/或异源DNA或转基因。 [0190] 在一个实施方式中，调控元件例如转录调控元件或增强子可以被包含于转基因中。在一个实施方式中，“转录调控元件(transcriptional regulatory element)”或“TRE”被引入用于感兴趣的基因的调控。如本文所使用的，TRE是多核苷酸序列，优选DNA序列，该序列调节(即，控制)通过RNA聚合酶的可操作地连接的多核苷酸序列的转录以形成RNA。如本文所使用的，在使TRE能够发挥功能的宿主细胞中，TRE增加了可操作地连接的多核苷酸序列的转录。TRE包含可能或可能并非衍生自相同基因的增强子元件和/或pox启动子元件。 TRE的启动子和增强子组件可以在感兴趣的编码序列的任何方向和/或距离处，并且包括上述的多聚体。如本文所讨论的，TRE可以或可以不缺少沉默子元件。 [0191] 在一些实施方式中，用于调节感兴趣的基因的“增强子”可以被包含于本文所述的转基因构建体中。增强子是本领域公知的术语，并且是衍生自增高可操作地连接至启动子的基因的转录至如下程度的基因的多核苷酸序列，当可操作地连接至该基因时，增高程度大于受启动子自身影响的转录激活，即，增高来自启动子的转录。具有“增强子活性”是本领域公知的术语，并且其含义已经陈述，即，当增强子可操作地连接至基因时，增强子增高可操作地连接至启动子的基因的转录至如下程度，该增高程度大于受启动子自身影响的转录增高，即，增强子增高来自启动子的转录。 [0192] 调控元件例如TRE或增强子的活性一般取决于转录调控因子的存在和/或转录调控抑制因子的缺失。转录激活可以通过本领域已知的一些方法(并在下文中更详细地描述)进行测量，但通常是通过检测和/或量化在调控元件控制(即、可操作地连接至调控元件)下的编码序列的mRNA或蛋白质产物来进行测量。正如本文所讨论的，调控元件可以具有不同的长度和不同的序列组成。通过转录激活，预期转录可以高于靶细胞中的基础水平而增加至少约2倍、优选至少约5倍、优选至少约10倍、更优选至少约20倍、更优选至少约50倍、更优选至少约100倍、甚至更优选至少约200倍、甚至更优选至少约400至约500倍、甚至更优选至少约1000倍。基础水平一般是非靶细胞(如果有活性的话)中的活性的水平，或者如在靶细胞类型中所测试的缺少感兴趣的TRE的报告子构建体的活性水平(如果有的话)。 [0193] 转基因还可以包含报告子基因，例如，报告子基因包括：β-半乳糖苷酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)，氯霉素乙酰转移酶(CAT)、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等。在一个实施方式中，报告子基因被融合至fat-2或fat-1相关的基因。 [0194] 在表达载体中有用的调控序列或其它序列可以形成转基因序列的一部分。这包括但不限于(如果没有已经包括的话)：内含子序列、转录终止信号和多聚腺苷酸化信号。条件型调控序列能够可操作地连接至转基因以指导转基因对特定细胞的表达。 [0195] 非人转基因动物或者由其衍生的细胞或组织的用途 [0196] 因此，本文所提供的另一方面涉及由本文所述的非人转基因动物的一个或多个实施方式获得、衍生或加工的食物或食物产品，其中，非人转基因动物携带将饱和脂肪和/或碳水化合物转化为n-6脂肪酸的第一异源基因以及将至少一种n-6脂肪酸转化为一种或多种n-3脂肪酸的第二异源基因。在一个实施方式中，第一异源基因可以含有fat-2基因。在一个实施方式中，第二异源基因可以含有fat-1基因。食物产品可以包括：肉、奶、蛋、组织、肌腱、油、乳制品(例如，奶酪)和它们的任何组合。在一些实施方式中，本文所述的食物产品中的n-6脂肪酸与ω-3脂肪酸的比值可以是约1:1或更低。 [0197] 本文还提供了包含这些非人转基因动物或者其组织或经加工部分的食物产品或膳食补充剂。食物产品可是非加工的(例如，在整个动物、或动物的整个部分(例如，关节、指节或器官)的情况下)或加工自经屠宰的动物或其部分(例如，由动物获得的骨骼、脂肪、皮或油)。膳食补充剂的制备方法(例如，鱼油胶囊)是本领域已知的，并可以被应用至本文所述的基因学上修饰的动物或转基因动物，以制造膳食补充剂。因此，本文还描述了由本文所述的动物(例如，转基因哺乳动物、鸟或鱼)制造食物产品或膳食补充剂的方法。这些方法能够以任何方式进行，包括任何目前已知的过程，并且来源是或包括如本文所述制造的非人转基因动物(或其部分)。 [0198] 正如所指出的，本文所述的核酸分子和/或转基因构建体(包括其中的密码子的使用已针对宿主进行了优化的核酸分子和/或转基因构建体)可以用于制造非人转基因动物。不希望受到限制，本文所述的核酸和/或转基因构建体可以被用于对被养殖或者认为是食物来源的动物进行基因学上的修饰。转基因动物可以使用本领域已知的技术制造。更具体地说，可以使用本文所述的方法来制造哺乳动物和鱼。 [0199] 在一些实施方式中，食物或食物产品(包括例如，膳食补充剂)可以衍生自转基因鱼或转基因鸟，转基因鱼或转基因鸟在基因学上修饰以表达编码δ12脂肪酸去饱和酶(例如，fat-2)和n-3脂肪酸去饱和酶(例如，fat-1)或它们的生物活性变体的异源核酸序列。转基因鱼可以包括但不限于：鳕鱼或鳕形目鳕鱼科的任何鱼；比目鱼；鲱鱼或鲱形目的任何鱼；鲭鱼或鲭科的任何鱼；鲑鱼或鲑科的任何鱼，包括鳟鱼；鲈鱼或鲈科的任何鱼；鲥鱼或鲱科的任何鱼；鳐鱼或鳐科的任何鱼；胡瓜鱼或胡瓜鱼科的任何鱼；鳎鱼或鳎科的任何鱼；金枪鱼或鲭科的任何鱼；以及上文所述和本领域技术人员已知的其它鱼，例如，斑马鱼。 [0200] 获得或衍生自本文所述的非人转基因动物(例如，本文所述的携带fat-2和fat-1基因的非人转基因动物)的食物或食物产品(包括例如，膳食补充剂)可以提供给健康个体或患有缺乏必须脂肪酸(例如，n-3脂肪酸)的个体。与缺乏n-3脂肪酸相关的疾病或失调是本领域已知的，包括例如：肥胖、糖尿病、癌症、心脏疾病、炎症性疾病、神经退行性疾病、神经精神疾病、骨关节炎、狼疮、非酒精性脂肪肝疾病、结肠炎和它们的任意组合。因此，本文还提供了治疗与缺乏n-3脂肪酸相关的病症(例如，疾病或失调)的方法。通过向被诊断为患有缺乏n-3脂肪酸相关的病症(例如，疾病或失调)或具有缺乏n-3脂肪酸相关的病症的风险的受试者给予获得或衍生自本文所述的非人转基因动物(例如，携带fat-2和fat-1基因的非人转基因动物)的食物或食物产品，与未给予本文所述的食物或食物产品的缺乏n-3脂肪酸的受试者相比，经治疗的受试者的n-3脂肪酸含量可以增加例如至少约30％或以上，包括例如至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约 95％或以上。在一些实施方式中，与未给予本文所述的食物或食物产品的缺乏n-3脂肪酸的受试者相比，经治疗的受试者中的n-3脂肪酸含量可以增加例如至少约1.1倍或以上，包括例如至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少10倍或以上。 [0201] 在一些实施方式中，与未给予本文所述的食物或食物产品的缺乏n-3脂肪酸的受试者相比，经治疗的受试者中的n-6脂肪酸与n-3脂肪酸的比值可以降低例如至少约10％或以上，包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约 70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或以上。 [0202] 受试者可以是明显健康的或者可以是已被诊断为患有下述疾病或失调、或具有下述疾病或失调的风险的受试者，例如患有癌症(例如，乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、脑癌、皮肤癌、胃癌、头颈癌、胰腺癌、血癌或卵巢癌)。因此，受试者可以是被诊断为患有神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病、帕金森病或亨丁顿舞蹈症)的受试者。其它可治疗或可预防的病症包括心律失常、心血管疾病、癌症、炎症性疾病、自身免疫疾病、视网膜和大脑先兆畸形或畸形、糖尿病、肥胖、皮肤失调、肾脏疾病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、慢性阻塞性肺病。受试者还可以是已经接受移植物或计划接受移植物的受试者，所述移植物包括生物器官、组织或细胞。该方法可以通过向受试者或移植物给予本文所述的核酸分子来实施。 [0203] 本文的另一方面提供了增高动物(例如，非人动物)或由动物衍生的食物产品中的n-3脂肪酸含量的方法。该方法包括用高碳水化合物和/或高饱和脂肪的组合物或饮食饲喂本文所述的将碳水化合物和/或饱和脂肪转化为n-6脂肪酸和n-3脂肪酸的非人转基因动物(例如，携带本文所述的fat-2和fat-1基因的转基因动物)。因此，转基因动物可以将至少一部分(例如，至少约30％或更多，包括例如，至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多、包括高达100％)来自饮食的碳水化合物和/或饱和脂肪转化为n-3脂肪酸。 [0204] 本文所使用的术语“高碳水化合物和/或高饱和脂肪的组合物或饮食”是指下述组合物或饮食，其中的至少约50％或更多(包括例如，至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多、包括高达100％)的总卡路里是由碳水化合物、饱和脂肪或两者的组合提供。在一些实施方式中，组合物或饮食可以进一步包含蛋白质、矿物质、维生素、纤维和它们的两种或多种的组合。在一些实施方式中，高碳水化合物和/或高饱和脂肪的组合物或饮食可以是无脂肪的组合物或饮食。在这些实施方式中，碳水化合物能够以提供总卡路里的约50％至约90％的量存在。在一些实施方式中，高碳水化合物和/或高饱和脂肪的组合物或饮食可以含有提供总卡路里的约40％-60％的量的碳水化合物，并且含有提供总卡路里的约20％-40％的量的饱和脂肪。 [0205] 在一些实施方式中，高碳水化合物和/或高饱和脂肪的组合物或饮食可以是低PUFA组合物或饮食。在这些实施方式中，组合物或饮食可以含有提供总卡路里的小于30％或更低的量的PUFA(例如，必需脂肪酸)。在一些实施方式中，PUFAs能够以一定量存在，所述PUFAs提供总卡路里的小于20％、小于10％、小于5％、小于1％或更低。在一些实施方式中，低PUFA组合物或饮食可以排除任何PUFA和必需脂肪酸。 [0206] 在一些实施方式中，当用高碳水化合物和/或高饱和脂肪的组合物或饮食饲喂转基因动物时，转基因动物或由其衍生的食物产品中的n-6脂肪酸与n-3脂肪酸的比值可以是约1:1或更少，包括例如，约0.75:1或约0.5:1。 [0207] 在一些实施方式中，n-6脂肪酸的至少一部分(例如，由饮食中的碳水化合物和/或饱和脂肪转化的n-6脂肪酸、或者直接来自饮食的n-6脂肪酸)并不会转化为n-3脂肪酸。在一些实施方式中，基本上所有的n-6脂肪酸(例如，由饮食中的碳水化合物和/或饱和脂肪转化的n-6脂肪酸、或者直接来自饮食的n-6脂肪酸)转化为n-3脂肪酸。 [0208] 本文还提供了在与脂肪代谢相关的病症(例如，疾病或失调)的条件下确定n-6脂肪酸和/或n-3脂肪酸的影响的方法。在一些实施方式中，该方法包括：(a)在本文所述的非人转基因动物或者本文所述的由其衍生的细胞或组织中诱导与脂肪代谢相关的病症(例 如，疾病或失调)的至少一个表型；(b)用高碳水化合物和/或高饱和脂肪的组合物饲喂非人转基因动物或者由其衍生的细胞或组织；(c)检测来自(b)的非人转基因动物、细胞或组织的响应；以及(d)将非人转基因动物、细胞或组织的检测到的响应与对照进行比较，其中，非人转基因动物、细胞或组织与对照之间的响应方面的不同决定了n-6和/或n-3脂肪酸对病症的影响。 [0209] 在一些实施方式中，与脂肪代谢相关的病症(例如，疾病或失调)的表型可以通过修饰非人转基因动物或者由其衍生的细胞或组织的基因组中的至少一个基因进行诱导，其中，该基因与病症相关。基因修饰可以包括例如感兴趣的基因的插入、缺失和/或突变。在一些实施方式中，与脂肪代谢相关的病症(例如，疾病或失调)的表型可以通过将转基因动物或者由其衍生的细胞或组织暴露至诱导病症的至少一个表型的试剂进行诱导。诱导病症的试剂可以是蛋白质、肽、核酸、药物、小分子、辐射或它们的任意组合。 [0210] 在用高碳水化合物和/或高饱和脂肪的组合物饲喂本文所述的转基因动物后，可以进行各种检测和/或分析以测定本文所述的非人转基因动物的响应。例如，非人转基因动物的响应可以包括与基因组学、代谢组学、脂质组学或蛋白质组学相关的分析物的表达水平。 [0211] 通过将非人转基因动物的检测到的响应与对照进行比较，可以确定n-6脂肪酸和/或n-3脂肪酸对所研究的病症(例如，疾病或失调)的影响。在一些实施方式中，对照可以是未用高碳水化合物和/或高饱和脂肪的组合物饲喂的本文所述的非人转基因动物或者由其衍生的细胞或组织。在一些实施方式中，对照可以是不能将碳水化合物和/或饱和脂肪转化为n-6脂肪酸或n-3脂肪酸的非人动物。在一些实施方式中，对照可以是野生型非人动物。 [0212] 在一些实施方式中，本文所述的转基因动物(例如，表达fat-2或fat-1相关的转基因的转基因动物)可以被培育成具有不同遗传背景的动物，包括具有下述感兴趣的表型的动物，例如：肥胖、糖尿病、血管生成缺陷、心血管缺陷。这种动物是本领域技术人员所已知的，并且例如可见于小鼠基因组数据库中(Blake JA,Richardson JE,Bult CJ,Kadin JA,Eppig JT,and the members of the Mouse Genome Database Group.2003.MGD:The Mouse Genome Database.Nucleic Acids Res 31:193-195；Eppig JT,.Blake,JA, Burkhart DL,Goldsmith CW,Lutz CM,Smith CL.2002.Corralling conditional mutations:a unified resource for mouse phenotypes.Genesis 32:63-65)或橡树岭美国国家实验室突变小鼠数据库中。 [0213] 在可选的实施方式中，本文所述的细胞和/或转基因动物(例如，表达fat-2或fat-1相关的转基因的细胞和/或转基因动物)可用于分析以识别影响脂肪代谢的靶标，该靶标可反过来影响肌肉生长、血管新生、肥胖、胰岛素敏感性和/或心血管功能。 [0214] 一些方面还提供了用于识别与脂肪代谢功能相关的由fat-2或fat-1相关的酶调节的基因和基因产物、蛋白质、蛋白质产物、脂质或代谢物的方法，包括识别mRNAs、功能性RNAs，例如在本文所述的转基因动物中差异化表达的微小RNAs和/或蛋白质。这种方法是本领域技术人员所已知的，并且可以包括下文所述的方法。 [0215] 通过本文所述的方法识别的基因和基因产物对进一步表征而言是有用的，以用于检测经识别的基因和基因产物对脂肪代谢的影响，脂肪代谢可能参与肌肉生长和生物学、以及血管新生、胰岛素敏感性和脂肪块减少/生长。 [0216] 可将通过本文所述的方法识别的基因用于构建转基因动物，例如基因敲除动物，例如具有外源和/或异源表达的动物，用于识别肌肉分泌因子或研究肌肉生长、血管新生、肥胖、胰岛素敏感性和心血管功能。进一步地，转基因动物(包括敲除的动物)可被培育成为本文所述的fat-2或fat-1转基因小鼠。 [0217] 可对通过本文所述的方法识别的基因的感兴趣的特性进行计算或实验分析。在一个实施方式中，将被识别为与脂肪代谢相关的基因在计算上筛选用于识别出作为分泌因子的基因的特征，即，拥有推定的信号序列并缺乏推定的跨膜结构域。感兴趣的任何其它结构域或序列特征(例如，核酸或氨基酸序列)可用于从通过本文所述的方法识别的基因和基因产物中选择基因和基因产物。 [0218] 还可以将本文所述的转基因动物模型和/或细胞(例如，表达fat-2或fat-1相关的转基因的转基因动物模型和/或细胞)用于检测测试化合物(例如，药物候选物)对测试动物或来自测试动物的样品或样本(例如，活检物)中的参与肌肉发育、肌肉生长、肥胖、胰岛素敏感性和心血管功能的脂肪代谢的功效。在某些情况下，有利的是可以测量从测试动物(无需宰杀转基因动物)获得的样品、血液中的肌肉生长、肥胖、胰岛素敏感性和心血管功能的标记物。 [0219] 本文所述的各方面的实施方式可以在以下编号的段落中的任一个加以定义： [0220] 1.一种非人转基因动物，所述非人转基因动物具有含有可操作地连接至启动子的第一外源和/或异源核酸分子的基因组，其中，所述第一外源和/或异源核酸分子包含：(i)SEQ ID NO.1的核苷酸序列；或(ii)作为SEQ ID NO.1的生物活性变体且与SEQ ID NO.1具有至少约70％的一致性的核苷酸序列，其中，当在所述转基因动物中表达所述第一外源和/或异源核酸分子时，所述转基因动物由饱和脂肪和/或碳水化合物制造n-6脂肪酸。 [0221] 2.如段落1所述的非人转基因动物，其中，所述基因组进一步含有第二外源和/或异源核酸分子，所述第二外源和/或异源核酸分子含有编码将n-6脂肪酸转化为n-3脂肪酸的酶的核苷酸序列，其中，当在所述转基因动物中表达所述第一外源和/或异源核酸分子以及第二外源和/或异源核酸分子时，所述转基因动物由饱和脂肪和/或碳水化合物制造n-3脂肪酸和任选的n-6脂肪酸。 [0222] 3.如段落2所述的非人转基因动物，其中，编码将n-6脂肪酸转化为n-3脂肪酸的酶的核苷酸序列的核苷酸序列是：(i)SEQ ID NO.2的核苷酸序列；或(ii)作为SEQ ID NO.2的生物活性变体且与SEQ ID NO.2具有至少约70％的一致性的核苷酸序列。 [0223] 4.如段落1-3中任一段所述的非人转基因动物，其中，所述转基因动物中的n-6脂肪酸与n-3脂肪酸的比值为约1:1或更低。 [0224] 5.如段落1-4中任一段所述的非人转基因动物，其中，所述非人转基因动物选自于由奶牛、小鼠、大鼠、猪、绵羊、山羊、鱼、水牛、兔、家禽和牲畜所组成的组。 [0225] 6.如段落1-5中任一段所述的非人转基因动物，其中，所述基因组进一步包含与受脂肪代谢影响的病症相关的基因修饰。 [0226] 7.如段落6所述的非人转基因动物，其中，所述基因修饰包括与受脂肪代谢影响的病症相关的基因的插入、缺失和/或突变。 [0227] 8.衍生自段落2-5中任一段所述的非人转基因动物的食物产品。 [0228] 9.如段落8所述的食物产品，其中，所述食物产品包括肉、奶、蛋、乳制品或它们的任意组合。 [0229] 10.如段落8或9所述的食物产品，其中，所述食物产品中的n-6脂肪酸与n-3脂肪酸的比值为约1或更少。 [0230] 11.增高动物或由其衍生的食物产品中的n-3脂肪酸含量的方法，所述方法包括：用高碳水化合物和/或高饱和脂肪的饮食饲喂段落2-7中任一段所述的非人转基因动物，从而使所述转基因动物将至少一部分碳水化合物和/或饱和脂肪转化为n-3脂肪酸。 [0231] 12.如段落11所述的方法，其中，所述高碳水化合物和/或高饱和脂肪的饮食将必需脂肪酸排除在外。 [0232] 13.如段落11或12所述的方法，其中，将至少一部分碳水化合物和/或饱和脂肪转化为n-6脂肪酸。 [0233] 14.如段落11-13中任一段所述的方法，其中，所述转基因动物或由其衍生的食物产品中的n-6脂肪酸与n-3脂肪酸的比值为约1或更少。 [0234] 15.转基因构建体，所述转基因构建体包含可操作地连接至启动子的第一外源和/或异源核酸分子，其中，所述第一外源和/或异源核酸分子包含：(i)SEQ ID NO.1的核苷酸序列；或(ii)作为SEQ ID NO.1的生物活性变体且与SEQ ID NO.1具有至少约70％的一致性的核苷酸序列，并且其中，所述启动子至少指导动物细胞中的所述第一外源和/或异源核酸分子的表达。 [0235] 16.如段落15所述的转基因构建体，所述转基因构建体进一步包含第二外源和/或异源核酸分子，所述第二外源和/或异源核酸分子含有编码将n-6脂肪酸转化为n-3脂肪酸的酶的核苷酸序列。 [0236] 17.如段落16所述的转基因构建体，其中，编码将n-6脂肪酸转化为n-3脂肪酸的酶的核苷酸序列是：(i)SEQ ID NO.2的核苷酸序列；或(ii)作为SEQ ID NO.2的生物活性变体且与SEQ ID NO.2具有至少约70％的一致性的核苷酸序列。 [0237] 18.如段落16或17所述的转基因构建体，其中，所述第二外源和/或异源核酸分子可操作地连接至相同的启动子或不同的启动子，其中，所述相同的启动子或不同的启动子指导转基因动物细胞中的所述第二外源和/或异源核酸的表达。 [0238] 19.如段落15-18中任一段所述的转基因构建体，其中，转基因动物细胞衍生自如下动物，所述动物选自于由奶牛、小鼠、大鼠、猪、绵羊、山羊、鱼、水牛、兔、家禽和牲畜所组成的组。 [0239] 20.一种治疗与缺乏n-3脂肪酸相关的病症的方法，所述方法包括向被诊断为患有与缺乏n-3脂肪酸相关的病症或具有与缺乏n-3脂肪酸相关的病症的风险的受试者给予段落8-10中任一段所述的食物产品，其中，所述食物产品的给予增高了受试者中的n-3脂肪酸的含量，从而治疗所述病症。 [0240] 21.如段落20所述的方法，其中，所述病症选自于由如下所组成的组：肥胖、糖尿病、癌症、心脏疾病、炎症性疾病、神经退行性疾病、神经精神疾病、骨关节炎、狼疮、非酒精性脂肪肝疾病、结肠炎和它们的任意组合。 [0241] 22.确定n-3脂肪酸对与脂肪代谢相关的病症的影响的方法，所述方法包括： [0242] a.在段落1-7中任一段所述的非人转基因动物中诱导与脂肪代谢相关的病症的至少一个表型； [0243] b.用高碳水化合物和/或高饱和脂肪的饮食饲喂所述非人转基因动物； [0244] c.检测来自(b)的所述非人转基因动物的响应；以及 [0245] d.将所述非人转基因动物的检测到的响应与对照进行比较， [0246] 其中，所述非人转基因动物与对照之间的响应方面的差异决定了n-3脂肪酸对所述病症的影响。 [0247] 23.如段落22所述的方法，其中，所述诱导包括对非人转基因动物的基因组中的至少一个基因进行修饰，其中，所述的至少一个基因与所述病症相关。 [0248] 24.如段落23所述的方法，其中，通过插入、缺失和/或突变对所述基因组中的至少一个基因进行修饰。 [0249] 25.如段落22-24中任一段所述的方法，其中，所述诱导包括向所述非人转基因动物给予诱导所述病症的试剂。 [0250] 26.如段落22-25中任一段所述的方法，其中，所述对照是用低碳水化合物和/或低饱和脂肪的饮食饲喂的同类的非人转基因动物。 [0251] 27.如段落22-25中任一段所述的方法，其中，所述对照是不能将碳水化合物和/或饱和脂肪转化为至少一种或多种n-3脂肪酸的非人动物。 [0252] 28.如段落22-25中任一段所述的方法，其中，所述对照是野生型非人动物。 [0253] 29.如段落22-28中任一段所述的方法，所述的非人转基因动物的响应包括与基因组学、代谢组学、脂质组学或蛋白质组学相关的分析物的表达水平。 [0254] 一些选择的定义 [0255] 除非本文进行了定义，本文所使用的术语具有它们的普通的含义，并可以在说明书的上下文中被进一步理解。 [0256] 本文所使用的术语“可操作地连接”是指两个以上的核酸(例如，DNA)片段之间的功能关系：例如，如果启动子或增强子刺激适当的宿主细胞或其它表达系统中的序列的转录，则启动子或增强子被可操作地连接至编码序列。一般来说，可操作地连接的序列是连续的。然而，增强子不需要位于极其接近其所增强转录的编码序列。进一步地，通过第二启动子转录的因子反式调控的启动子所转录的基因可以被称为可操作连接至第二启动子。在这种情况下，第一基因的转录被称为操作性地连接至第一启动子，并且也被称为可操作地连接至第二启动子。 [0257] 本文所使用的术语“转化效率”是指酶(例如，去饱和酶)可以将底物转化为产物的效率和/或量。转化效率是根据以下公式来测量：([产物量]/[原始底物量])*100。在一些实施方式中，产品可以包括直接产品和由其衍生的方法中的所有产品。 [0258] 本文所使用的术语“δ12脂肪酸去饱和酶”是指如本文所定义的可以将碳水化合物和/或饱和脂肪转化为n-6脂肪酸的酶或其生物活性变体。示例性的δ12脂肪酸去饱和酶是由fat-2基因或其生物活性变体编码的酶，例如衍生自秀丽隐杆线虫。 [0259] 本文所使用的术语“n-3脂肪酸去饱和酶”是指如本文所定义的可以将n-6脂肪酸转化为n-3脂肪酸的酶或其生物活性变体。示例性的n-3脂肪酸去饱和酶是由fat-1基因或其生物活性变体编码的酶，例如衍生自秀丽隐杆线虫。 [0260] 本文所使用的术语“表达”是指衍生自核酸分子(例如，本文所述的第一外源和/或异源核酸分子和/或第二外源和/或异源核酸分子)的正义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达还可以指mRNA翻译成为多肽。 [0261] 术语“核酸”在本领域中是公知的。本文所使用的“核酸”一般是指DNA、RNA的分子(例如，链)、或其衍生物或类似物，包括核酸碱基。核酸碱基包括例如发现于DNA中的天然存在的嘌呤或嘧啶碱基(例如，腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”或胞嘧啶“C”)或发现于RNA中的天然存在的嘌呤或嘧啶碱基(例如，A、G、尿嘧啶“U”或C)。术语“核酸”涵盖了作为术语“核酸”的亚属的术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”。术语“寡核苷酸”是指具有长度在约3个至约100个核酸碱基之间的分子。术语“多核苷酸”是指具有长度大于约100个核酸碱基的至少一个分子。术语“核酸”也指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)，以及在适当的情况下的核糖核酸(RNA)。该术语也应被理解为包括由核苷酸类似物制造的RNA或DNA的等价物、类似物，并且当可应用于本文所述的实施方式时，包括单链(正义或反义)和双链多核苷酸。术语“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”也在本文互换使用。 [0262] 本文所使用的术语“基因”是指含有编码多肽的开放阅读框的核酸，包含外显子和(任选的)内含子序列。“基因”是指基因产物的编码序列以及基因产物的非编码区，包含基因产物的5'UTR和3'UTR区、内含子和启动子。这些定义通常是指单链分子，但在具体的实施方式中还涵盖部分、基本上或完全互补于单链分子的另一条链。因此，核酸可以涵盖双链分子、或包含含有分子的特定序列的一条或多条互补链或“互补物”的双链分子。本文所使用的单链核酸可以通过前缀“ss”表示，双链核酸通过前缀“ds”表示，而三链核酸通过前缀“is”表示。术语“基因”是指参与制造多肽链的DNA片段，含有编码区之前和之后的区域以及单个编码片段(外显子)之间的中间序列(内含子)。“启动子”是核酸序列的区域，在该处控制转录的起始和转录速率。启动子可以包含调节蛋白和分子(例如，RNA聚合酶和其它的转录因子)可以结合的元件，以起始核酸序列的特异性转录。术语“增强子”是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调控序列。增强子可以在任一方向上发挥功能，并可为启动子的上游或下游。 [0263] 术语“实体”是指任何结构的分子或分子的组合。 [0264] 本文所使用的术语“受试者”是指人和非人动物。本文所使用的术语“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物，如非人的灵长动物(特别是高等灵长动物)、绵羊、狗、啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、奶牛；以及非哺乳动物，例如鸡、两栖动物、爬行动物等。在一些实施方式中，非人动物是非人哺乳动物。在一个实施方式中，受试者是人。在另一实施方式中，受试者是作为疾病模型的实验动物或动物替代物。该术语并不指明特定的年龄或性别。因此，旨在涵盖成年受试者和新生儿受试者以及胎儿，无论是雄性或雌性。受试者的实例包括人、狗、猫、奶牛、山羊和小鼠。术语受试者进一步旨在包括转基因物种。 [0265] 术语“组织”旨在包括：完整的细胞；血液；血液制品，例如血浆和血清；骨骼；关节；肌肉；平滑肌和器官。 [0266] 在本文中，术语“疾病”或“失调”可以互换使用，是指：机体状态方面的任何变化或某些器官中的任何变化；中断或干扰功能的表现；和/或对受折磨的人或者与患者接触的人引起如下症状，例如不适、功能紊乱、痛苦或甚至死亡。疾病或失调也可以与如下有关：瘟热、生病、微恙、痼疾(amlady)、失调、患病、染病、抱怨、不适(inderdisposion)、病变。 [0267] 本文所使用的术语“治疗”包括减少或减轻与不适当的增殖(例如癌症)有关的病症、疾病或失调的至少一种不利影响或症状。 [0268] 在本文中，本文所使用的术语“给予”和“引入/导入”可以互换使用，是指通过如下方法或途径将药剂放置入受试者中，所述方法或途经使得药剂至少部分定位于期望的位点。药剂可以通过引起受试者中的有效治疗任何适当的途径给予。 [0269] 在本文中，本文所使用的术语“启动子”或“启动子区域”或“启动子元件”可以互换使用，是指一段核酸序列，通常是但不限于控制其操作性地连接的核酸序列的转录的DNA或RNA或其类似物。启动子区域包含足够用于RNA聚合酶识别、结合和起始转录的特定序列。启动子区域的这一部分被称为启动子。此外，启动子区域包含调节RNA聚合酶的这一识别、结合和起始转录的活性的序列。这些序列可以顺式作用、或可以响应于反式作用因子。取决于调节的性质，启动子可以是组成型或调节型。 [0270] 在本文中，术语“调控序列”与“调控元件”互换使用，是指一段核酸的元件，通常是但不限于DNA或RNA或其类似物，调节其操作性地连接的核酸序列的转录，从而作为转录调节器起作用。调控序列调节其操作地连接的基因和/或核酸序列的表达。调控序列通常包含“调控元件”，调控元件是作为转录结合结构域的核酸序列，并且通过转录蛋白和/或转录因子、阻遏子或增强子等的核酸结合结构域识别。典型的调控序列包括但不限于：转录启动子、诱导型启动子和转录元件、控制转录的可选的操作序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和/或翻译的终止的序列。 [0271] 调控序列可以是单一调控序列或多重调控序列、或经修饰的调控序列或其片段。经修饰的调控序列是核酸序列已通过一些手段(例如但不限于突变、甲基化等)加以改变或修饰的调控序列。 [0272] 本文所使用的冠词“一”(“a”和“an”)是指一个或多于一个(即，至少一个)的语法宾语的冠词。 [0273] 为了方便起见，在整个申请(包括说明书、实施例和附加的权利要求书)中使用的某些术语被收集在此。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。 [0274] 应理解的是，本发明并不限于本文所述的特定的方法、方案和试剂等，并且可能会有所不同。本文所使用的术语仅用于描述特定的实施方式的目的，并不打算限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书所定义。 [0275] 除了在操作实施例中或另有指示以外，本文所使用的表示成分的量或反应条件的所有数字均应理解为在所有情况下均由术语“约”加以修饰。当用来描述本发明时，术语“约”在与百分比连接使用时意味着±5％。 [0276] 在一个方面，本发明涉及本文所述的组合物、方法及其各自的组件，对于本发明来说必要的是，对于包含未指定的必要或非必要的要素而言是开放性的(“包括”)。在一些实施方式中，待包含在组合物、方法或其各自的组件的描述中的其它要素被限定为不会实质上影响本发明的基础和新特征的要素(“基本上包含”)。这同样适用于所描述方法中的步骤以及组合物和其中的组件。在其它实施方式中，本文所述的发明、组合物、方法及其相应的组件旨在排除任何不被认为是组件、组合物或方法的必需要素的任何要素(“由…组成”)。 [0277] 出于描述和公开的目的，将被认定的所有专利、专利申请和出版物以引用方式并入本文，例如，在此类出版物中描述的可与本发明结合使用的方法学。这些出版物仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这方面没有任何内容应被理解为承认本发明人没有权利凭借先前的发明或因为任何其它原因而将此类公开提前。所有关于这些文件的内容的日期或表述是基于申请人可获得的信息，并不构成关于这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。 [0278] 实施例 [0279] 下面的实施例阐明了本文所述的本发明的一些实施方式和方面。对于相关领域的技术人员来说显而易见的是，在不改变本发明的精神或范围的情况下，可以进行各种修改、增加、替换等，并且这些修改和变化均涵盖在随后的权利要求书所限定的本发明的范围之内。以下的实施例不以任何方式限制本发明。 [0280] 实施例1可以由非必需营养素制造必需的n-6和n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)的转基因动物的制造 [0281] 为了消除脂肪酸补充剂的需要，制造了可以由非必需营养素制造必需的n-6和n-3PUFA的动物模型。在一些实施方式中，转基因动物模型是鼠类模型。制造这种转基因鼠类模型的示例性方法是：首先创建具有编码将单不饱和脂肪酸(MUFA)转化为n-6亚油酸(18: 2n-6，LA)的酶的秀丽隐杆线虫fat-2基因(或其变体)的fat-2转基因小鼠(17)，然后使fat- 2转基因小鼠与事先制造的具有编码将n-6转化为n-3PUFA的酶的秀丽隐杆线虫fat-1基因 (或其变体)的fat-1转基因小鼠杂交(18)。通过该方法，制造复合fat-1/fat-2转基因小鼠，以下简称“ω”小鼠。“ω”小鼠可以由仅含有饱和脂肪和/或碳水化合物的饮食制造n-6和n- 3PUFA(图1A)。 [0282] 为了使秀丽隐杆线虫fat-2基因在哺乳动物中更高地表达，首先基于哺乳动物去饱和酶序列来优化fat-2序列的密码子，并且启动子(例如鸡β-肌动蛋白启动子)被用来建立转基因构建体。在该实施例中使用的经优化的fat-2序列是SEQ ID NO.1。然后例如通过显微注射将转基因构建体施用至小鼠，以创造fat-2转基因小鼠。在对转基因小鼠进行示出fat-2表型和基因型的评估后，将杂合子fat-2转基因小鼠与野生型小鼠(例如，C57BL6野生型(WT)小鼠)回交多个世代(例如，～5代)，然后与杂合fat-1转基因小鼠杂交。由此制造的后代由WT小鼠、fat-1小鼠、fat-2小鼠和ω小鼠构成。先前已经对fat-1转基因小鼠进行了描述(12，19)。对WT、fat-2和ω同窝小鼠的基因型和表型进行评估。fat-1和fat-2转基因的表达通过PCR进行确定。WT小鼠不会表达fat-1或fat-2转基因的任一种。fat-2小鼠仅携带fat-2转基因，而ω小鼠表达fat-1转基因和fat-2转基因(图1B)。 [0283] 当WT、fat-2和ω同窝小鼠被饲喂同样的高饱和脂肪、高碳水化合物和低n-6PUFA的饮食，例如通过气相色谱法(GC)进行表型确定，显示了三种不同的组织脂肪酸图谱(图1C和图1D)。WT小鼠展现出高水平的饱和脂肪和非常低水平的必需脂肪酸，主要是n-6PUFA，n-6/n-3PUFA的比值为约3.5。fat-2转基因小鼠显示出总的组织PUFA含量的显著增加，肌肉组织中的n-6PUFA含量由约700μg/g倍增至1350μg/g，这归因于油酸转化为n-6亚油酸(LA)和花生四烯酸(AA)，而n-3PUFA的水平没有太大的变化，使得n-6/n-3PUFA的比值为约5。ω转基因小鼠也展现出显著增高的总PUFA含量，但是与它们的WT和fat-2同窝小鼠相比，n- 3PUFA的组织含量增加约五倍，这归因于几乎一半的n-6PUFA含量转化为n-3PUFA，n-6/n- 3PUFA的比值显著降低为0.75(图1D)。fat-2和ω小鼠中的MUFA水平相应减小，表明MUFA被转化为n-6PUFA。在三种表型之间，检测到饱和脂肪酸(SFA)水平无显著差异。下面的表1显示了三种基因型之间的各种组织中的脂肪酸分布的比较。 [0284] 表1.三种基因型之间的各种组织中的脂肪酸分布的比较。 [0285] [0286] WT：野生型；SFA：饱和脂肪酸；MUFA：单不饱和脂肪酸；PUFA：多不饱和脂肪酸；n-6：n-6；n-3：n-3；n.s.：不显著。每组N＝3；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。 [0287] 此外，当饲喂高碳水化合物、无脂肪饮食时，fat-2和ω小鼠仍然分别展现出n-6和n-3PUFA的显著的组织水平，表明在缺乏饮食脂肪且仅给予碳水化合物时，它们具有制造必需脂肪酸的能力(表2)。 [0288] 表2.在用无脂肪饮食饲喂的小鼠中的尾组织的脂肪酸分布。 [0289] [0290] WT：野生型；SFA：饱和脂肪酸；MUFA：单不饱和脂肪酸；PUFA：多不饱和脂肪酸；n-6：n-6；n-3：n-3；n.s.：不显著。每组N＝3；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。 [0291] 尽管饮食几乎不含这些脂肪酸，fat-2小鼠中的n-6PUFA的组织丰度和ω小鼠中的n-3和n-6PUFA的组织丰度表明转基因小鼠由非必需营养素(例如，MUFA、SFA以及甚至碳水化合物)制造必需脂肪酸的能力。这一技术使得能够使用单一饮食来创建必需脂肪酸的不同的组织水平，以使可以在没有饮食的干扰因素的情况下评估不同的脂肪对健康状况的特定影响。 [0292] 用于制造上述的转基因动物的示例性方法 [0293] 密码子优化：为了有效地在哺乳动物中在体内表达来自低等生命秀丽隐杆线虫的基因，秀丽隐杆线虫所使用的密码子被调整以匹配哺乳动物所使用的密码子。从基因库(GenBank登录号NM_070159)获得fat-2基因序列。哺乳动物去饱和酶以及先前优化的fat-1基因被用作参比以确定秀丽隐杆线虫和哺乳动物之间的去饱和酶的密码子使用方面的差 异。然后人工调整密码子，以实现超过80％的优化。经优化的Fat-2序列的实施例是SEQ ID NO.1的核苷酸序列。 [0294] 基因合成：在对基因序列进行修饰以优化密码子使用之后，例如通过GenScript(Piscataway，NJ)合成fat-2基因。基因被合成为在两侧具有限制性酶切位点(例如，EcoR I消化位点)，然后递送至质粒或载体(例如pUC57质粒)。扩增后，将fat-2序列插入含有启动子和调控元件的表达质粒中。在一个实施方式中，fat-2序列被插入含有鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒增强子的pCAGGS表达质粒中。连接后，确定方向并扩增质粒。最后，用适当的限制性内切酶(例如Ssp I和Sfi I)切除含有启动子、fat-2序列和多聚A序列的片段，以用于显微注射(图5)。 [0295] 显微注射：通过如下制造转基因动物系：将经纯化的经消化的片段(例如，由Ssp I和Sfi I消化)注射入感兴趣的动物的受精卵(例如，C57BL/6X C3H小鼠的受精卵)。将经注射DNA的卵移植至假孕动物(例如，B6C3F1小鼠)以制造转基因动物(例如，转基因小鼠)。初始的转基因小鼠接受基因分型和表型分型。 [0296] 基因分型和表型分型：通过移除转基因动物的组织(例如，小鼠尾尖)进行基因分型，以获得用于RT-PCR的DNA样本，该RT-PCR用下述引物进行：fat-2正向，GCGGCCA GACCCAGACCATC；以及fat-2反向，GGGCGAC GTGACCGTTGGTA。PCR产物在2％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。如此前在参考文献26中描述的，使用气相色谱(GC)通过脂肪酸组成分析进行表型分型。断奶后，fat-2小鼠保持低PUFA饮食(表3)。 [0297] 表3.低PUFA饮食和无脂肪饮食的组成(PUFA：多不饱和脂肪酸。) [0298] [0299] 在饮食20天后进行GC，以使得能够用于更清晰的表型分型。组织样本(例如，尾组织样本)在液氮下被磨成粉末并接受总的脂质提取，并且通过在～14％三氟化硼(BF3)-甲醇试剂(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和己烷(Sigma Aldrich)下在～100℃下加热～1h进行脂肪酸甲基化(26)。使用配备火焰离子化检测器的完全自动化6890N Network GC System(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)对脂肪酸甲酯进行GC分析。通过与脂肪酸标准品(Nu-chek Prep,Elysian,MN)比较来识别可分辨的脂肪酸的峰，并且所有的分离的峰的面积百分比使用GC ChemStation Software(Agilent)进行分析。 [0300] 在识别了基因型和表型之后，使fat-2小鼠与野生型(WT)动物(例如，C57BL6小鼠)交配以创建F1代。Fl代随后与野生型动物(例如，WT C57BL6小鼠)回交至少5次，以证实基因是可传递的并建立纯的背景，从而使fat-2系可以保持显著的表型。使各代接受通过RT-PCR进行的基因分型和通过GC进行的表型分型。 [0301] ω小鼠的制造：复合fat-1/fat-2转基因小鼠通过杂合的fat-2转基因小鼠与杂合的fat-1转基因小鼠杂交而建立，这此前在参考文献18和美国专利号7,238,851中描述，以引用的方式将其内容并入本文。断奶后，后代保持低PUFA饮食或无脂肪饮食(表3，如上所示)，然后通过RT-PCR实施基因分型，并通过GC实施表型分型。通过ω小鼠的RT-PCR用如下引物进行基因分型：fat-1正向，TGTTCATGCCTTCT TCTTTTTCC；fat-1反向，GCGACCATACC TCAAACTTGGA；fat-2正向，GCGGCCA GACCCAGACCATC；fat-2反向，GGGCGAC GTGACCG TTGGTA。如此前在参考文献26中描述的，使用GC通过脂肪酸组成分析进行表型分型。 [0302] 实施例2可以由非必需营养素制造必需的n-6和n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)的转基因动物的表征和实用性 [0303] 为了说明转基因动物用于研究病症(例如与脂肪代谢相关的病症)的实用性，使用通常与代谢性疾病的发育相联系的多个参数检测了实施例1中描述的转基因小鼠(即，WT小鼠、fat-2转基因小鼠和ω小鼠)。 [0304] 增加的肝脏脂肪合成是脂肪肝的病理基础，它与代谢性疾病包括肥胖、糖尿病和癌症有关(4)。为了评估不同的脂肪酸分布之间的肝脏脂肪合成方面的差异，分析了肝脏脂质含量。油红O染色显示出三种表型之间在脂质积累方面的显著差异；具体而言，与其WT同窝小鼠相比，具有增高的组织n-6PUFA的fat-2小鼠展现出显著更多的脂质积累，而在增高的组织n-3PUFA和平衡的n-6/n-3PUFA比值的ω小鼠中，脂质累积显著减少(图2A)。因此，肝脏甘油三酯(TG)含量的测量显示出类似的模式，fat-2小鼠中具有最大量甘油三酯，而ω小鼠中具有最低量甘油三酯(图2B)。关键的脂肪合成相关的基因的表达在fat-2小鼠中升高但在ω小鼠中降低，这些相关的基因的表达包括例如但不限于：硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD-1)、脂肪酸合酶(FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)(图2C)。这些结果表明n-6和n-3PUFA对肝脏脂肪合成的不同影响。 [0305] 肠道菌群被认为是与代谢疾病相关的许多生理和病理病症的关键决定因素(5)。肠杆菌科的增高的水平和双歧杆菌的下降的水平已连接至与内毒素血症引起的轻度炎症 (20，21)。因此，这两种肠道微生物物种被选择，以通过粪便培养和粪便细菌DNA的PCR测量来评估它们可能会如何受到组织脂肪酸分布的变化的影响。值得注意的是，虽然三组小鼠均饲喂相同的饮食，目前的发现表明，各组表现出与它们各自的脂肪酸分布相关的不同的肠道菌群的组成。如图3A所示，肠杆菌科种群数量在fat-2小鼠中增加，而在ω小鼠中显著降低。相比之下，图3B显示出双歧杆菌种群数量表现出相反的趋势，在fat-2小鼠中的存在大大减少，而在ω小鼠中升高。关于饮食对肠道菌群的影响的此前的报告在很大程度上归因于对肠空腔中的饮食成分与肠道菌群的直接相互作用的影响(22)；然而，三种不同的肠道菌群分布可以产生自单一饮食的当前发现首次显示了这些差异可以仅仅由组织脂肪酸 组成方面的变化诱导。因此，本文所提出的实验系统或转基因小鼠提供了独特的机会以探讨宿主组织含量与肠道微生物组学之间的相互作用。 [0306] 慢性低度炎症是许多疾病的共同机制，主要特点是炎性细胞因子的升高的血浆水平，炎性细胞因子包括例如但不限于TNF-α、IL-1β和IL-6(6，7，23)。使用多重检测，测定多个关键炎性细胞因子的血浆水平。发现在三组之间，TNF-α和IL-6水平显著不同，在fat-2小鼠中水平最高，而在ω小鼠中水平最低(图4A)。因为低度炎症往往可以通过肠道细菌衍生的血浆内毒素(例如脂多糖(LPS))诱导(24，25)，所以测定了LPS的血浆水平。如图4B所示，LPS水平在fat-2小鼠中最高，而在ω小鼠中最低，与如上所示的肠道菌群分布和炎症细胞因子水平一致。本文所提出的发现表明了潜在的新机制(组织n-6或n-3PUFA水平的改变通过调制肠道菌群和相关的内毒素血症来影响低度炎症)。总之，这些发现表明，低度炎症由更高的组织n-6PUFA水平促进，而通过增高组织n-3PUFA水平和平衡组织n-6/n-3PUFA比值来加以抑制。 [0307] 当今西方人的饮食与贯穿人类进化的大部的饮食从根本上是不同的。在过去的数十年里所发生的膳食营养素方面的许多变化中，一些关键变化包括饱和脂肪、碳水化合物的和n-6PUFA的摄入增加以及n-3PUFA的摄入减少(1，2)。作为其结果，现代人类具有偏爱n-6PUFA的高达20:1的n-6与n-3PUFA的比值；从进化上来看，这个比值已经接近1:1，并且相信该差异具有深刻的生理后果(1，2)。同时，慢性低度炎症已成为与慢性代谢性疾病(例如糖尿病、肥胖、心脏病和癌症)的患病率上升相关的常见的折磨(6，7)。然而，膳食构成方面的变化、尤其是n-6/n-3PUFA的比值是否与低度炎症的患病率以及当今的健康流行病之间真正存在联系，仍然值得商榷。 [0308] 使用本文所述的良好控制的实验体系得出的当前发现提供了这种联系的证据。在该实施例中，所有的小鼠均饲喂高饱和脂肪、高碳水化合物和低n-6PUFA的饮食。虽然WT小鼠和fat-2小鼠之间的唯一区别是fat-2小鼠具有升高的组织n-6PUFA水平，fat-2小鼠表现出肝脂质发生、肠道菌群和炎性细胞因子水平的最不利病症。这些结果表明，当在高饱和脂肪和低n-3PUFA的存在下组织n-6PUFA增加时，引起代谢性疾病的健康并发症的风险更大。这些结果还表明，鉴于n-6PUFA水平对其结果的显著影响，在解释使用高脂肪饮食的动物或人类的研究时需要考虑n-6PUFA含量。到目前为止，大多数现有的研究未考虑n-6PUFA含量。 此外，以往的研究未能够在使用油或补充剂时从其它成分(例如，抗氧化剂和植物甾醇)的潜在的有利影响中分离开n-6PUFA的影响。 [0309] 如在ω小鼠中所见的，当前的发现还表明如何解决由增高的组织n-6PUFA引起的健康并发症。fat-2和ω小鼠的不同仅在于ω小鼠具有降低的组织n-6PUFA水平和增高的n- 3PUFA水平。然而，在fat-2小鼠中观察到的不良健康结果在ω小鼠中极大地减少。这些发现强调了n-3PUFA和平衡的组织n-6/n-3PUFA比值在降低代谢性疾病的风险方面的重要性。 [0310] 本文所提出的发现对现代健康流行病有很大的影响。组织成分与消费现代西方饮食的动物高度相似的fat-2小鼠表明n-6PUFA的高组织水平似乎是当今的健康流行病的病因之一。ω小鼠显示出，增高组织n-3PUFA水平和降低n-6PUFA水平以平衡组织n-6/n-3PUFA的比值可以是抵消这些不良健康状况的有效方法。这些发现也表明用于最佳健康的平衡的n-6/n-3PUFA的比值的进化偏好(1，2)。 [0311] 此外，本文所提出的发现表明了在阐明改变组织脂肪组成对疾病病症的影响方面，这些转基因动物模型如何可以发挥巨大的效用。当将这些模型以其它感兴趣的饮食或不同疾病病症使用时，与分析技术例如基因组学和代谢组学相结合，潜在的应用是显而易见的。这种没有饮食的混杂因素的全面的数据可以使人们更好地了解营养素与基因的相互作用，并解决本领域的目前存在的不确定性，以及识别用于预防和治疗代谢性疾病的新的靶标或方法。 [0312] 此外，本文所提出的一个方面涉及可以通过仅用碳水化合物和/或饱和脂肪饲喂动物而在动物产品(例如，肉、奶、蛋等)中制造必需脂肪酸(尤其是有益的n-3PUFA)的新的转基因技术。鉴于n-3PUFA主要限于海洋资源(例如，鱼和海藻)，本文所述的转基因技术和转基因动物可以因此创造可持续且可获得的n-3PUFA的来源，尤其是在仅可用碳水化合物和/或饱和脂肪的场合。 [0313] 表征转基因动物的示例性方法 [0314] 油红O染色：为了确定肝脏脂质累积，将经冷冻的肝切片(例如，10μm)固定于4％磷酸缓冲的多聚甲醛中，用油红O(Sigma-Aldrich)染色，并用苏木精(Sigma-Aldrich)复染。切片通过光学显微镜检查，使用CCD相机(QImaging,Surrey,加拿大)获得图像。 [0315] 肝脏甘油三酯(TG)含量的测定：将肝组织用5％NP-40提取，并用dH2O稀释10倍，然后采用比色分析试剂盒(Sigma-Aldrich，TR0100)按照制造商的说明书进行TG测定。 [0316] 基因表达的PCR分析：切取肝脏组织，并在液氮中研磨。总RNA提取用TRIzol试剂(Invitrogen Life Technologies,Grand Island,NY)按照制造商的说明书实施。用iScript逆转录试剂盒(Bio-Rad,Hercules,CA)将来自各样品的3μg RNA逆转录成cDNA。使用Mastercycler Pro S热循环仪(Eppendorff,Hauppauge,NY)以下述程序进行PCR：95℃，5分钟→(95℃，30秒→58℃，30秒→72℃，30秒)×35→72℃，5分钟。将10μl PCR产物通过 1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析，在UV光下观察并拍照。各条带的密度使用Image J软件量化，且将各PCR产物的相对量作为相同样本中的管家基因GAPDH的带密度的比值加以计算。 [0317] 细菌培养：收集单独的粪便样品，例如，直接收集在微量离心管中的脑心浸液(BHI)培养基(200μl)中，并保持在冰上。以特定的重量:体积比(例如，10mg样品:100μl BHI)将BHI培养基添加至各管。将样品进行涡旋和连续稀释，然后涂布于琼脂平板上(例如，MacConkey琼脂(BD，USA)平板或Bifido琼脂(Anaerobe Systems,Morgan Hill,CA)平板)，以分别对肠杆菌科和双歧杆菌属的种进行计数。将MacConkey琼脂平板在周围空气中于37℃下孵育24小时，而将Bifido琼脂平板在厌氧袋(Fisher Scientific)中于37℃的孵化器中孵育48小时。 [0318] 细菌DNA的定量PCR(qPCR)测量：使用QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA)按照制造商的说明书从100g存储在-80℃下的粪便样品中提取细菌的基因组DNA。DNA浓度通过在260nm下的吸光度进行确定，并用Nanodrop分光光度计(Biotek, Winooski,VT)通过确定A260/A280比值来评估纯度。使用处于PRISM 9000Light Cycler (Applied Biosystems,USA)中的SyBR Green按照制造商的说明书进行qPCR。使用下述的组特异性16S rRNA基因引物(Invitrogen)：肠杆菌科正向，5′-GTG CCA GCA GCC GCG GTA A- 3′以及反向，5′-CCT CAA GGG CAC AAC CTC CAA G-3′；双歧杆菌属的种正向，5′-TCG CGT CCG GTG TGA AAG3′以及反向，5′-CCA CAT CCA GCA TCC AC-3′。数据分析采用MxPro QPCR软件(v4.10，Agilent)进行。各粪便样本的细菌浓度(微生物DNA拷贝数/克粪便)通过比较由标准曲线得到的Ct值进行计算，标准曲线利用来自相应的参比菌株(大肠杆菌MG1655和双歧杆菌菌株12147BFAA)的已知浓度的细菌基因组DNA(BEI Resources,Manassas,VA)的 系列的五倍稀释构建。细菌基因组的量使用阿伏伽德罗常数计算，并假设碱基对的平均分子量是660g/mol。将标准曲线归一化为各组细菌的16S rRNA基因的拷贝数。将各样本中的 16S rRNA基因拷贝数归一化为粪便的克数。 [0319] 血浆细胞因子水平的测定：例如，按照制造商的说明书，通过安排在磁珠上的Bio-Plex免疫测定(Bio-Rad)，分析血清样品的如下的水平：TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和IL-10。将Xponent软件(Luminex,Austin,TX)用于数据采集和分析。 [0320] 测量血浆LPS浓度：例如，按照制造商的说明书，用ToxinSensor显色鲎变形细胞裂解物(LAL)内毒素检测试剂盒(GenScript)测定血浆LPS浓度。例如，将样品使用无内毒素的水稀释10倍，调整到所建议的pH，并在70℃下加热10分钟以使污染蛋白的抑制或增强最小化。将LAL试剂添加至血清样品，在37℃下孵育45分钟，并在545nm读取吸光度。 [0321] 统计分析：将GraphPad Prism 5(GraphPad Software,San Diego,CA)用于所有的统计分析。通过F检验对数据集进行分析以验证正态分布。将单因素方差分析以及随后的Tukey检验用于确定统计学显著性，设定为*P<0.05，**P<0.01，以及***P<0.001。 [0322] 参考文献 [0323] 1 .Leaf ,A .&Weber ,P .C .A new era for science in nutrition.Am.J.Clin.Nutr.45,1048-1053(1987) [0324] 2.Cordain,L.et al.Origins and evolution of the Western 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TAAAACTTGGCCCCCGACGAAGATGACAATCGCCACAAAAGTGAACACAAATAAAAAAGACCTGGATACGATCAAGGTGCCGGAGCTGCCAAGCGTGGCAGCTGTCAAAGCCGCAATCCCTGAGCACTGCTTTGTGAAGGATCCCTTGACTAGCATTTCATATCTGATCAAGGATTACGTGCTTCTCGCCGGTCTCTACTTTGCAGTTCCCTACATAGAGCATTATCTCGGATGGATCGGGCTGCTTGGCTGGTATTGGGCCATGGGAATTGTTGGCTCCGCATTGTTCTGTGTGGGGCACGACTGCGGACACGGATCATTCTCCGATTATGAATGGCTCAATGATCTGTGTGGCCATTTAGCCCATGCTCCTATTCTGGCTCCGTTCTGGCCCTGGCAGAAATCTCACCGCCAGCATCACCAGTACACATCCCACGTGGAAAAGGATAAGGGACACCCCTGGGTTACTGAGGAAGACTACAATAATCGCACCGCCATTGAGAAATATTTCGCCGTGATTCCAATTAGCGGATGGCTGCGATGGAATCCCATCTACACCATCGTCGGTCTGCCCGATGGCTCTCACTTCTGGCCTTGGTCCCGGCTCTTCGAGACTACCGAGGATCGTGTCAAGTGTGCAGTTTCTGGCGTTGCATGCGCTATCTGCGCTTACATTGCCTTTGTGCTCTGCGACTATTCTGTCTACACATTTGTCAAGTACTACTACATTCCACTGCTCTTCCAGGGCCTGATCCTCGTCATTATCACGTATCTTCAACACCAGAATGAGGATATTGAGGTCTACGAAGCCGATGAGTGGGGCTTTGTACGCGGCCAGACCCAGACCATCGACAGGCACTGGGGCTTCGGACTAGACAACATCATGCACAACATTACCAACGGTCACGTCGCCCATCACTTCTTCTTCACCAAAATCCCCCACTATCATCTGTTGGAGGCAACTCCCGCCATCAAGAAAGCCCTGGAACCTCTGAAAGACACTCAGTACGGATACAAACGGGAAGTCAACTACAACTGGTTCTTCAAATATCTGCACTACAACGTGACCCTCGACTACTTGACCCACAAAGCAAAGGGTGTGCTGCAGTACCGCAGTGGCGTTGAGGCTGCAAAGGCTAAGAAGGCCCAGTGAACTACAAAATCTCCTGACACGTGTTCATTTTTTTGATTGCCATTTTATGTTATAACCAATTTTGAATTTGTTTTTGAAAATTAATTCTCACATATTTCAATGAAAATTTATGTGCTACTTTTG [0352] SEQ ID NO.2(经优化的秀丽隐杆线虫fat-1基因序列) [0353]caagtttgaggtatggtcgctcattccagcgaagggctgtccgccacggctccggtcaccggcggcgatgtgctggtggatgcccgtgcatctctggaggagaaggaggccccccgcgacgtgaatgcaaacactaaacaggccaccactgaggagccccgcatccagttacccactgtggatgccttccgccgcgcaattcccgcacactgcttcgagagggacctcgtgaaatcaatcaggtatctggtgcaggactttgcggcactgacaattctgtactttgcccttcccgcctttgagtactttggcctgtttggttacctggtgtggaacatttttatgggcgtttttggcttcgcgctgttcgtcgttggacacgactgtcttcacggctcattctccgataatcagaatctcaatgatttcattggacatatcgccttcagcccactcttctctccctacttcccctggcagaaaagtcacaagctgcaccacgccttcaccaaccacatcgacaaagatcatggacacgtgtggatacaggataaggattgggaagcaatgcccagctggaaaagatggttcaatcctattcctttctctggctggctgaaatggttccctgtgtacactctgttcggtttctgcgatggatcccacttctggccttactcctcactgtttgtgcgcaactctgaacgcgttcagtgtgtaatctctggaatctgctgctgtgtgtgcgcatatattgctctaacaattgctggaagctattccaattggttctggtactattgggttccactttctttcttcggcttgatgctcgtcattgttacctatctgcagcacgtcgacgacgtcgctgaggtgtacgaggctgatgaatggagcttcgtccggggacagacccagaccatcgatcgttactatggcctcggcttggacacaacgatgcaccatatcacagacggacacgttgcccaccacttcttcaacaaaatcccacattaccatctcatcgaagcaaccgaaggtgtcaaaaaggtcttggagccgttgtccgacacccaatacgggtacaaatctcaggtgaactacgatttctttgcccggttcctgtggttcaactacaagctcgactatctcgttcacaagaccgccggaatcatgcaattccgaacaactctcgaggagaaggcaaaggccaagtgaaagaatatcccgtgccgttctagagtacaacaacaacttctgcgttttcaccggttttgctctaattgcaatttttctttgttctatatatatttttttgctttttaattttattctctctaaaaaacttctacttttcagtgcgttgaatgcataaagccataactctt [0354] SEQ ID NO.3(SEQ ID NO.1的氨基酸序列) [0355]KTWPPTKMetTIATKVNTNKKDLDTIKVPELPSVAAVKAAIPEHCFVKDPLTSISYLIKDYVLLAGLYFAVPYIEHYLGWIGLLGWYWAMetGIVGSALFCVGHDCGHGSFSDYEWLNDLCGHLAHAPILAPFWPWQKSHRQHHQYTSHVEKDKGHPWVTEEDYNNRTAIEKYFAVIPISGWLRWNPIYTIVGLPDGSHFWPWSRLFETTEDRVKCAVSGVACAICAYIAFVLCDYSVYTFVKYYYIPLLFQGLILVIITYLQHQNEDIEVYEADEWGFVRGQTQTIDRHWGFGLDNIMetHNITNGHVAHHFFFTKIPHYHLLEATPAIKKALEPLKDTQYGYKREVNYNWFFKYLHYNVTLDYLTHKAKGVLQYRSGVEAAKAKKAQStopTTKSPDTCSFFStopLPFYVITNFEFVFENStopFSHISMetKIYVLLL [0356] SEQ ID NO.4(SEQ ID NO.2的氨基酸序列) [0357] [0358] SEQ ID NO.5(野生型秀丽隐杆线虫fat-2mRNA序列) [0359] [0360] SEQ ID NO.6(参比序列是野生型秀丽隐杆线虫fat-2基因序列。经优化的密码子可见于以下示出的以大写字母表示的位置) [0361] [0362] SEQ ID NO.7(δ12去饱和酶的菠菜FAD2mRNA) [0363] [0364] [0365] SEQ ID NO.8(野生型秀丽隐杆线虫fat-1mRNA序列) [0366] [0367] |
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