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△-5去饱和酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途
申请号 CN200780017916.6 申请日 2007-05-17 公开(公告)号 CN101448947A 公开(公告)日 2009-06-03
申请人 纳幕尔杜邦公司; 发明人 H·G·达穆德; Q·Q·朱;
摘要 本 发明 公开了编码Δ－5去饱和酶的分离的核酸 片段 、包含这种片段的重组构建体以及利用该Δ－5去饱和酶在 植物 和含油 酵母 中制备长链多不饱和 脂肪酸 (PUFA)的方法。
权利要求

1.一种分离的多核苷酸，包含：
(a)编码具有Δ-5去饱和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中在与 SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列进行比较时，基于CluStal W比对方 法，所述多肽具有至少80％的氨基酸同一性；
(b)编码具有Δ-5去饱和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中在与 SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中示出的核苷酸序列进行比较时，基于 BLASTN比对方法，所述核苷酸序列具有至少80％的序列同一性；
(c)编码具有Δ-5去饱和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核 苷酸序列在严格条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中示出的核苷酸 序列杂交；或
(d)(a)、(b)或(c)的所述核苷酸序列的互补序列，其中所述互 补序列和所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成且100％互补。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包含 SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列包含
(a)SEQ ID NO：2；或
(b)与(a)中所述氨基酸序列具有至少一个保守氨基酸置换的不 同的氨基酸序列。
4.一种重组DNA构建体，包含可操作地连接至至少一个调节序列 的根据权利要求1、2或3所述的多核苷酸。
5.一种细胞，其基因组中包含根据权利要求4所述的重组DNA构 建体。
6.根据权利要求5所述的细胞，其中所述细胞选自由植物和酵母 组成的组。
7.一种转化细胞的方法，包括用根据权利要求4所述的重组构建 体转化细胞并选择用根据权利要求4所述的重组构建体转化了的那些 细胞。
8.一种产生转化植物的方法，包括用根据权利要求1、2或3所述 的多核苷酸转化植物细胞并从所述转化植物细胞再生出植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述植物为大豆植物。
10.一种转基因种子，其基因组中包含根据权利要求4所述的重组 构建体。
11.一种转基因种子，所述转基因种子从用根据权利要求8或9所 述的方法制备的植物获得。
12.一种在植物细胞中产生长链多不饱和脂肪酸的方法，包括：
(a)用根据权利要求4所述的重组构建体转化细胞；
(b)选择那些产生长链多不饱和脂肪酸的转化细胞。
13.油或副产品，所述油或副产品从根据权利要求10所述的种子 获得。
14.油或副产品，所述油或副产品从根据权利要求11所述的种子 获得。
15.一种在油料种子植物细胞中产生至少一种多不饱和脂肪酸的 方法，包括：
(a)用第一重组DNA构建体和至少一种另外的重组DNA构建体 转化油料种子植物细胞，所述第一重组DNA构建体包含可操作地连接至 至少一个调节序列的、编码至少一种Δ-5去饱和酶多肽的分离的多核苷 酸；所述另外的重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一个调节序 列的、编码选自由以下酶组成的组的多肽的分离的多核苷酸：Δ-4去饱 和酶、Δ-5去饱和酶、Δ-6去饱和酶、Δ-8去饱和酶、Δ-12去饱和酶、 Δ-15去饱和酶、Δ-17去饱和酶、Δ-9去饱和酶、Δ-9延长酶、C14/16延 长酶、C16/18延长酶、C18/20延长酶和C20/22延长酶；
(b)从步骤(a)的所述转化细胞再生油料种子植物；以及
(c)选择从步骤(b)的所述植物获得的那些种子，与从非转化油 料种子植物获得的种子的多不饱和脂肪酸水平相比，所述种子具有改 变的多不饱和脂肪酸水平。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述油料种子植物选自由 大豆、芸苔属物种、向日葵、玉米、棉花、亚麻和红花组成的组。
17.一种油料种子植物，其基因组中包含根据权利要求4所述的重 组构建体。
18.一种油料种子植物，包含：
(a)第一重组DNA构建体，该构建体包含可操作地连接至至少一 个调节序列的、编码至少一种Δ-5去饱和酶多肽的分离的多核苷酸；和
(b)至少一种另外的重组DNA构建体，该构建体包含可操作地连 接至至少一个调节序列的、编码选自由下列酶组成的组的多肽的分离 的多核苷酸：Δ-4去饱和酶、Δ-5去饱和酶、Δ-6去饱和酶、Δ-8去饱 和酶、Δ-12去饱和酶、Δ-15去饱和酶、Δ-17去饱和酶、Δ-9去饱和酶、 Δ-9延长酶、C14/16延长酶、C16/18延长酶、C18/20延长酶和C20/22延长酶。
19.根据权利要求17或18所述的油料种子植物，其中所述油料种 子植物选自由大豆、芸苔属物种、向日葵、玉米、棉花、亚麻和红花组 成的组。
20.一种转基因种子，所述转基因种子从根据权利要求15所述的 油料种子植物获得。
21.一种转基因种子，所述转基因种子从根据权利要求16所述的 油料种子植物获得。
22.油或副产品，所述油或副产品从根据权利要求20所述的种子 获得。
23.油或副产品，所述油或副产品从根据权利要求21所述的种子 获得。
24.油，所述油用根据权利要求12或15所述的方法获得。
25.食物或饲料，所述食物或饲料掺入了根据权利要求22所述的 油。
26.食物或饲料，所述食物或饲料掺入了根据权利要求23所述的 油。
27.食物或饲料，所述食物或饲料掺入了根据权利要求24所述的 油。
28.食物或饲料，所述食物或饲料包含根据权利要求20所述的种 子。
29.食物或饲料，所述食物或饲料包含根据权利要求21所述的种 子。
30.食物或饲料，所述食物或饲料包含对根据权利要求20所述的 种子进行加工获得的成分。
31.食物或饲料，所述食物或饲料包含对根据权利要求21所述的 种子进行加工获得的成分。
32.根据权利要求22所述的油或副产品，其中所述副产品为卵磷 脂。
33.根据权利要求23所述的油或副产品，其中所述副产品为卵磷 脂。
34.后代植株，所述后代植株从根据权利要求8或9所述的方法制 备的植物获得。
35.后代植株，所述后代植株从根据权利要求20或30所述的油料 种子植物获得。
36.一种分离的核酸分子，该核酸分子编码SEQ ID NO：3中示出的 Δ-5去饱和酶，其中至少一个密码子经密码子最优化以用于在耶氏酵母 属物种中表达。
说明书全文

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地讲，本发明涉及编码Δ-5脂肪 酸去饱和酶的核酸片段的鉴定以及这种去饱和酶在制备长链多不饱和 脂肪酸(PUFA)中的用途。

背景技术

PUFA的重要性无可争议。例如，某些PUFA是健康细胞的重要生 物成分并被公认为是：在哺乳动物内不能从头合成、相反必须从膳食 获得或由亚油酸(LA；18:2ω-6)或α-亚麻酸(ALA；18:3ω-3)通过 进一步去饱和和延伸而衍生得到的“必需”脂肪酸；细胞质膜的组分， 在质膜中它们可以以诸如磷脂或三酰基甘油之类的形式存在；正确发育 (尤其是在发育中的婴儿脑中)和组织形成及修复的必需物质；以及哺 乳动物中几种重要的具有生物活性的类二十烷酸(如前列环素、类花 生酸、白细胞三烯和前列腺素)的前体。而且，摄入大量长链ω-3PUFA 产生心血管保护效果(Dyerberg，J.等人，Amer.J.Clin.Nutr.，28：958-966 (1975)；Dyerberg，J.等人，Lancet，2(8081)：117-119(1978年，7月 15日)；Shimokawa，H.，World Rev.Nutr.Diet，88：100-108(2001)； von Schacky，C.和Dyerberg，J.，World Rev.Nutr.Diet，88：90-99(2001))。 而且，大量的其它研究证明，针对多种症状和疾病(如哮喘、牛皮癣、 湿疹、糖尿病和癌)施用ω-3和/或ω-6PUFA赋予了广泛的健康益处。
目前正在研究包括植物、藻类、真菌和酵母在内的多种不同宿主 作为商业化PUFA生产的手段。基因工程已经证明，一些宿主(即便是 天然受限于LA和ALA脂肪酸生产的那些宿主)的天然能力可以得到大 幅改变，以导致高水平地产生多种长链ω-3/ω-6PUFA。无论这是天然 能力的结果还是重组技术的结果，花生四烯酸(ARA；20:4ω-6)、二 十碳五烯酸(EPA；20:5ω-3)和二十二碳六烯酸(DHA；22:6ω-3) 的产生可能都需要表达Δ-5去饱和酶。
大部分目前为止所鉴定的Δ-5去饱和酶都具有将二高-γ-亚麻酸 (DGLA；20:3ω-6)转化成ARA的主要能力，其次级活性是将二十碳 四烯酸(ETA；20:4ω-3)转化成EPA(其中EPA随后在与另外的C20/22 延长酶(elongase)和Δ-4去饱和酶反应后合成DHA)。Δ-5去饱和酶在 Δ-6去饱和酶/Δ-6延长酶途径(其主要存在于藻类、藓类、真菌、线虫 和人中并且其特征在于产生γ-亚麻酸(GLA；18:3ω-6)和/或十八碳 四烯酸(STA；18:4ω-3))和Δ-9延长酶/Δ-8去饱和酶途径(其在一些 生物如类眼虫物种中起作用并且其特征在于产生二十碳二烯酸(EDA； 20:2ω-6)和/或二十碳三烯酸(ETrA；20:3ω-3))中都起作用(图1)。
基于Δ-5去饱和酶在如ARA、EPA和DHA合成中的作用，已经付出 了相当大的努力来鉴定和表征来自多种来源的这些酶。同样，在公开 的文献(如GenBank登录号AF199596、AF226273、AF320509、 AB072976、AF489588、AJ510244、AF419297、AF07879、AF067654 和AB022097)和专利文献(如美国专利5,972,664和6,075,183)中均已 公开了很多种Δ-5去饱和酶。此外，临时申请号为60/801119(于2006 年5月17日提交)的共同拥有的、共同未决的申请公开了来自多甲藻属 物种(Peridium sp.)CCMP626的Δ-5去饱和酶的氨基酸和核酸序列， 而临时申请号为60/915733(BB1614)(于2007年5月3日提交)的共同 拥有的、共同未决的申请公开了来自Euglena anabaena的Δ-5去饱和酶 的氨基酸和核酸序列。
本发明涉及从小眼虫(Euglena gracilis)鉴定和分离另外的编码Δ -5去饱和酶的基因，该基因将适用于在多种宿主生物内异源表达用于生 产ω-3/ω-6脂肪酸。

发明内容

本发明涉及分离的多核苷酸，其包括：
(a)编码具有Δ-5去饱和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中在基 于Clustal W比对方法与SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列进 行比较时，该多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、 95％或100％的氨基酸同一性；
(b)编码具有Δ-5去饱和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中在基 于BLASTN比对方法与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中示出的 核苷酸序列进行比较时，该核苷酸序列具有至少70％、75％、 80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性；
(c)编码具有Δ-5去饱和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中该核 苷酸序列在严格条件下与在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中 示出的核苷酸序列杂交；或
(d)(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互补序列，其中该互补序 列与所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互 补。
在第二个实施方案中，本发明涉及重组DNA构建体，其包含任何 可操作地连接至至少一个调节序列的本发明的分离的多核苷酸。
在第三个实施方案中，本发明涉及在其基因组中包含本发明的重 组DNA构建体的细胞。这种细胞可以是植物细胞或酵母细胞。
在第四个实施方案中，本发明涉及用于转化细胞的方法，该方法 包括用本发明的重组构建体或本发明的分离的多核苷酸转化细胞并选 择用所述重组构建体或分离的多核苷酸转化了的那些细胞。
在第五个实施方案中，本发明涉及在其基因组中包含本发明重组 构建体的转基因种子或从通过本发明方法制备的植物获得的转基因种 子。所关注的还有从这种转基因种子获得的油或副产品。
在第六个实施方案中，本发明涉及用于在植物细胞中制备长链多 不饱和脂肪酸的方法，该方法包括：
(a)用本发明的重组构建体转化细胞；以及
(b)选择制备长链多不饱和脂肪酸的那些转化细胞。
在第七个实施方案中，本发明涉及用于在油料种子植物细胞中产生 至少一种多不饱和脂肪酸的方法，该方法包括：
(a)用第一重组DNA构建体和至少一种另外的重组DNA构建体 转化油料种子植物细胞，所述第一重组DNA构建体包含可操 作地连接至至少一个调节序列的编码至少一种Δ-5去饱和酶 多肽的分离的多核苷酸，所述另外的重组DNA构建体包含可 操作地连接至至少一个调节序列的编码选自由下列酶组成的 组的分离的多核苷酸：Δ-4去饱和酶、Δ-5去饱和酶、Δ-6 去饱和酶、Δ-8去饱和酶、Δ-12去饱和酶、Δ-15去饱和酶、 Δ-17去饱和酶、Δ-9去饱和酶、Δ-9延长酶、C14/16延长酶、 C16/18延长酶、C18/20延长酶和C20/22延长酶；
(b)从步骤(a)中的转化细胞再生油料种子植物；以及
(c)选择从步骤(b)的植物获得的、与从非转化油料种子植物获 得的种子中的多不饱和脂肪酸水平比较时该水平改变的那些 种子。
在第八个实施方案中，本发明涉及在其基因组中包含本发明的重 组构建体的油料种子植物。合适的油料种子植物包括但不限于大豆、芸 苔属(Brassica)物种、向日葵、玉米、棉花、亚麻和红花。
在第九个实施方案中，本发明涉及油料种子植物，其包含：
(a)第一重组DNA构建体，该构建体包含可操作地连接至至少一 个调节序列的编码至少一种Δ-5去饱和酶多肽的分离的多核 苷酸；以及
(b)至少一种另外的重组DNA构建体，该构建体包含可操作地连 接至至少一个调节序列的编码选自由下列酶组成的组的多肽 的分离的多核苷酸：Δ-4去饱和酶、Δ-5去饱和酶、Δ-6去饱 和酶、Δ-8去饱和酶、Δ-12去饱和酶、Δ-15去饱和酶、Δ-17 去饱和酶、Δ-9去饱和酶、Δ-9延长酶、C14/16延长酶、C16/18 延长酶、C18/20延长酶和C20/22延长酶。
所关注的还有从这种油料种子植物获得的转基因种子以及从这些 转基因种子获得的油和副产品。优选的副产品是卵磷脂。
在第十个实施方案中，本发明涉及掺入了本发明的油或种子的食 物或饲料，或包含源于对种子进行加工的成分的食物或饲料。
在第十一个实施方案中，本发明涉及从通过本发明方法制备的植 物或本发明的油料种子植物获得的后代植物。
附图说明和序列表
图1示出了ω-3/ω-6脂肪酸的生物合成途径。
图2示出了如实施例1中描述的小眼虫细胞提取物的脂质概况的色 谱图。
图3示出了采用Clustal W分析方法(DNASTAR软件中的MegAlignTM 程序)的Δ-5去饱和酶蛋白质和Δ-8去饱和酶蛋白质之间和之中的比对 的一部分。
图4用图示说明了SEQ ID No：1、2、4、5、6、8和10之间的关系， 其中每一个序列都与小眼虫Δ-5去饱和酶相关。
图5A示出了用于扩增小眼虫Δ-5去饱和酶基因(EgD5)的克隆策略。 图5B为pZUF17的质粒图谱，而图5C为pDMW367的质粒图谱。
图6提供了下列质粒的质粒图谱：(A)pKUNF12T6E；(B)pEgD5S； 和(C)pDMW369。
图7示出了小眼虫Δ-5去饱和酶基因的DNA序列(称为“EgD5”；SEQ ID NO：1)与经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中表达的合成基因的DNA序列(称为“EgD5S”；SEQ ID NO：3) 的比较。
图8A和8B示出了路氏巴夫藻(Pavlova lutheri)Δ-8去饱和酶(SEQ ID NO：18)、盐生巴夫藻(Pavlova salina)Δ-8去饱和酶(SEQ ID.NO：64)、小眼虫Δ-8去饱和酶(SEQ ID NO：16)以及两种不同的葡 枝根霉(Rhizopus stolonifer)Δ-6脂肪酸去饱和酶(SEQ ID NO：51和63) 之间的Clustal V比对(使用默认参数)。
图9提供了pY98的质粒图谱。
图10A提供了表达pY98(SEQ ID NO：76；包含称作“MaD5”的高 山被孢霉(Mortiere llaalpina)Δ-5去饱和酶基因)或pDMW367(SEQ ID NO：23；包含称作“EgD5”的小眼虫Δ-5去饱和酶基因)并供给多种 底物的解脂耶氏酵母的脂肪酸概况。图10B提供了MaD5与EgD5之间的 ω-3和ω-6底物特异性的比较。
图11提供了下列质粒的质粒图谱：(A)pKR916；(B)pKR1037； 和(C)pKR328。
图12A提供了当高山被孢霉酶(MaD5)转化进大豆胚时具有最高 Δ-5去饱和酶活性的10次事件的平均脂肪酸概况。图12B提供了当小眼 虫酶(EgD5)转化进大豆胚时具有最高Δ-5去饱和酶活性的10次事件 的平均脂肪酸概况。脂肪酸被鉴定为16:0(棕榈酸)、18:0(硬脂酸)、 18:1(油酸)、LA、ALA、EDA、SCI、DGLA、ARA、ERA、JUP、ETA 和EPA。列为“其它”的脂肪酸包括：18:2(5，9)、GLA、STA、20:0、 20:1(11)、20:2(7，11)或20:2(8，11)和DPA。这些“其它”脂肪酸 中的每一种都以小于总脂肪酸的3.0％的相对丰度存在。个别胚的脂肪 酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(重量％)，而平均脂肪酸组成是 每一事件中6个个别胚的平均值。图12B显示，EgD5在大豆胚中的活性非 常高，最高的10次事件的平均转化(正确％Δ-5去饱和)为77％至99％。
图13提供了对于MaD5(参见图12A)和EgD5(参见图12B)，Δ-5 去饱和酶对“正确”底物的活性(“正确％Δ-5去饱和”)绘制在x-轴上， 而Δ-5去饱和酶对“错误”底物的活性(“错误％Δ-5去饱和”)绘制在 y-轴上。与MaD5比较时，EgD5的底物特异性对“正确”底物比对“错误” 底物具有偏好。
根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明， 下面的详细描述和附带的序列描述形成了本申请的一部分。
下面的序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825(“对含有核苷酸序列和/或氨 基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”(“Requirements for Patent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知识产权组 织(World Intellectual Property Organization，WIPO)ST.25标准(1998) 以及EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政指令 (Administrative Instructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸 序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中列出的规则。
SEQ ID No：1-26、48、49、51-54、61-64、67-72和75-76是编码基 因或蛋白质(或其部分)的ORF或质粒，如表1中所示。
表1
核酸和蛋白质SEQ ID号汇总
  描述和缩写 核酸 SEQ ID No. 蛋白质 SEQ ID NO. 小眼虫Δ-5去饱和酶(“EgD5”) 1 (1350bp) 2 (449AA) 来源于小眼虫的、经密码子最优化以用于在解脂耶氏 酵母中表达的合成的Δ-5去饱和酶(“EgD5S”) 3 (1350bp) 2 (449AA) 小眼虫EgD5—pT-F10-1片段 4 (590bp) 5 (196AA) 小眼虫EgD5—pT-EgD5-5’C2片段 6 (797bp) -- 小眼虫EgD5—与SEQ ID NO：4相关的5′序列 7 (559bp) -- 小眼虫EgD5--pT-EgD5-5’2nd片段 8 (273bp) -- 小眼虫EgD5--与SEQ ID NO：6相关的5′序列 9 (20bp) -- 小眼虫EgD5--pT-EgD5-3’片段 10 (728bp) -- 小眼虫EgD5--与SEQ ID NO：4相关的3′序列 11 (464bp) -- 畸雌腐霉(Pythium irregulare)Δ-5去饱和酶(GenBank 登录号AAL13311) -- 12 (456AA) 大雄疫霉(Phytophthora megasperma).Δ-5去饱和酶 (GenBank登录号CAD53323) -- 13 (477AA) 三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum).Δ-5去饱和 酶(GenBank登录号AAL92562) -- 14 (469AA) 盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum).Δ-5去饱和酶 (GenBank登录号XP_640331) -- 15 (467AA)
  小眼虫Δ-8去饱和酶(PCT公开No.WO 2006/012325和 No.WO 2006/012326) -- 16 (421AA) 路氏巴夫藻(CCMP459)Δ-8去饱和酶 17 (1269bp) 18 (423AA) 保守区1 -- 19 (7AA) 保守区2 -- 20 (7AA) 假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana) Δ-8鞘脂去饱和酶(GenBank登录号AAX14502) -- 21 (476AA) 质粒pZUF17 22 (8165bp) -- 质粒pDMW367 23 (8438bp) -- 质粒pKUNF12T6E 24 (12,649bp) -- 来源于金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum) (美国专利6,677,145)的、经密码子最优化以用于在 解脂耶氏酵母中表达的合成的C18/20延长酶基因 (“EL2S”) 25 (819bp) 26 (272AA) 质粒pEgD5S 48 (4070bp) -- 质粒pDMW369 49 (8438bp) -- 葡枝根霉Δ-6脂肪酸去饱和酶(NCBI登录号 AAX22052) -- 51 (459AA) 路氏巴夫藻Δ-8去饱和酶--来自克隆epslc.pk002.f22的 cDNA插入片段的部分 (cDNA插入片段的5′端) 52 (695bp) -- 路氏巴夫藻Δ-8去饱和酶--完整测序的EST epslc.pk002.f22:fis(完整插入序列) 53 (1106bp) --
  路氏巴夫藻Δ-8去饱和酶—完全测序的EST epslc.pk002.f22:fis(完整插入序列；SEQ ID NO：53) 的核苷酸1-864的翻译 -- 54 (287AA) 路氏巴夫藻Δ-8去饱和酶--通过基因组步移得来的完 整的5′端序列 61 (1294bp) -- 路氏巴夫藻Δ-8去饱和酶—组装的序列 62 (1927bp) -- 葡枝根霉Δ-6脂肪酸去饱和酶(NCBI登录号 ABB96724) -- 63 (459AA) 盐生巴夫藻Δ-8去饱和酶 -- 64 (427AA) 高山被孢霉Δ-5去饱和酶 67 (1338bp) 68 (446AA) 质粒pY5-22 69 (6473bp) -- 质粒pY5-22GPD 70 (6970bp) -- 解脂耶氏酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(GPD) 71 (968bp) -- 质粒pYZDE2-S 72 (8630bp) -- 质粒pKR136 75 (6339bp) -- 质粒pY98 76 (8319bp) -- 小眼虫Δ-9延长酶(“EgD9e”) 77 (774bp) -- 小眼虫Δ-8去饱和酶(“EgD8”) 78 (1263bp) -- 质粒pKR906 81 (4311bp) --
  质粒pKR72 82 (7085bp) -- 质粒pKS102 83 (2540bp) -- 质粒pKR197 84 (4359bp) -- 质粒pKR911 85 (5147bp) -- 质粒pKR680 86 (6559bp) -- 质粒pKR913 87 (9014bp) -- 质粒pKR767 88 (5561bp) -- 质粒pKR916 89 (11,889 bp) -- 质粒pKR974 90 (5661bp) -- 质粒pKR1032 91 (5578bp) -- 质粒pKR1037 92 (11,907bp) -- 质粒pKR328 93 (8671bp) -- 异丝水霉(Saprolegnia diclina) Δ-5去饱和酶(“SdD5”) 94 (1413bp) --
SEQ ID NO：27-30分别对应编码保守区1的简并寡核苷酸引物 5-1A、5-1B、5-1C和5-1D。
SEQ ID NO：31-34分别对应编码保守区2的简并寡核苷酸引物 5-5AR、5-5BR、5-5CR和5-5DR。
SEQ ID NO：35-40分别对应引物ODMW480、CDSIII 5′引物、 ODMW479、DNR CDS 5′、YL791和YL792，用于5′RACE。
SEQ ID NO：41-43分别对应引物ODMW469、AUAP和ODMW470， 用于3′RACE。
SEQ ID NO：44-47分别对应引物YL794、YL797、YL796和YL795， 用于扩增EgD5的全长cDNA。
SEQ ID NO：50对应引物T7，用于对路氏巴夫藻(CCMP459)cDNA 文库进行测序。
SEQ ID NO：55和56分别对应引物SeqE和SeqW，用于对路氏巴夫藻 (CCMP459)克隆进行测序。
SEQ ID NO：57和58分别对应通用引物AP1和引物GSP PvDES，用于 扩增路氏巴夫藻(CCMP459)基因组DNA。
SEQ ID NO：59和60分别对应引物M13-28Rev和PavDES seq，用于 对路氏巴夫藻(CCMP459)基因组插入片段进行测序。
SEQ ID NO：65和66分别对应AP引物和Smart IV寡核苷酸引物，用 于小眼虫cDNA的合成。
SEQ ID NO：73和74分别对应引物GPDsense和GPDantisense，用于 扩增GPD启动子。
SEQ ID NO：79和80分别对应引物oEugEL 1-1和oEugEL 1-2，用于扩 增小眼虫Δ-9延长酶(EgD9e)。

具体实施方式

本文所引用的所有专利、专利申请和出版物均以引用的方式将其全 文并入本文。这具体包括如下申请人的受让人共同未决的申请：美国 专利7,125,672、美国专利7,189,559、美国专利7,192,762、美国专利 7,198,937、美国专利7,202,356、美国专利申请No.10/840579和 No.10/840325(提交于2004年5月6日)、美国专利申请No.10/869630(提 交于2004年6月16日)、美国专利申请No.10/882760(提交于2004年7月1 日)、美国专利申请No.10/985254和No.10/985691(提交于2004年11月 10日)、美国专利申请No.11/024544(提交于2004年12月29日)、美国专 利申请No.11/166993(提交于2005年6月24日)、美国专利申请 No.11/183664(提交于2005年7月18日)、美国专利申请No.11/185301(提 交于2005年7月20日)、美国专利申请No.11/190750(提交于2005年7月 27日)、美国专利申请No.11/198975(提交于2005年8月8日)、美国专利 申请No.11/225354(提交于2005年9月13日)、美国专利申请 No.11/253882(提交于2005年10月19日)、美国专利申请No.11/264784 和11/264737(提交于2005年11月1日)、美国专利申请No.11/265761(提 交于2005年11月2日)、美国专利申请No.11/737,772(提交于2007年4月 20日)、美国专利申请No.11/787,772(提交于2007年4月17日)、美国专 利申请No.11/740,298(提交于2007年4月26日)、美国专利申请 No.60/801172和No.60/801119(提交于2006年5月17日)、美国专利申请 No.60/853563(提交于2006年10月23日)、美国专利申请No.60/855177 (提交于2006年10月30日)、美国专利申请No.11/601563和11/601564 (提交于2006年11月16日)、美国专利申请No.11/635258(提交于2006 年12月7日)、美国专利申请No.11/613420(提交于2006年12月20日)、 美国专利申请No.60/909790(提交于2007年4月3日)、美国专利申请 No.60/911925(提交于2007年4月16日)、美国专利申请No.60/910831(提 交于2007年4月10日)和美国专利申请No.60/915733(BB1614)(提交 于2007年5月3日)。还另外包括如下申请人的受让人共同未决的申请： 涉及在植物中产生PUFA的美国专利公开No.2005/0136519；以及涉及膜 联蛋白启动子及它们在植物中的转基因表达中的用途的美国专利No. 7,129,089。
如本文使用的和在附带权利要求书中使用的，单数形式“一个”、 “一种”和“该”包括复数指代，除非上下文另外清楚地指明。因此， 例如，提及“一种植物”时是包括多种这样的植物，提及“一个细胞” 时是包括一个或多个细胞及其为本领域技术人员已知的等价物等等。
根据本发明，申请人鉴定了新的小眼虫Δ-5去饱和酶和编码该酶的 基因，该酶和编码该酶的基因可用于操纵产生有益于健康的PUFA的生 化途径。因此，本发明有许多应用。
通过本文所公开的方法学制备的PUFA或其衍生物可用作膳食替 代品或补充剂，尤其是婴儿代乳品(formula)，可用于接受静脉内营养 法的病人或用来预防或治疗营养不良。备选地，可以将纯化的PUFA(或 其衍生物)掺入食用油、脂肪或调配的人造黄油中，以便食用者在正 常使用中将获得所需量的膳食补充。PUFA还可以掺入婴儿代乳品、营 养补充剂或其它食品中，并且可用作抗炎或降胆固醇试剂。任选地， 该组合物可以用于药用(人药或兽药)。
给人或动物补充以重组手段产生的PUFA可导致加入的PUFA以及 它们的代谢物的水平升高。例如，用EPA处理不但可以导致EPA的水平 升高，而且还可以导致EPA的下游产物如类二十烷酸(即前列腺素、白 细胞三烯和血栓素)的水平升高。复杂的调节机制使得期望组合多种 PUFA或者添加不同的PUFA缀合物，以预防、控制或克服这种机制来在 个体中实现所需水平的特定PUFA。
定义
在本公开中，使用了大量术语和缩写。给出了如下定义。
“可读框”缩写为ORF。
“聚合酶链反应”缩写为PCR。
“美国典型培养物保藏中心”缩写为ATCC。
“多不饱和脂肪酸”缩写为PUFA。
“三酰基甘油”缩写为TAG。
如本文所用的，术语“发明”或“本发明”无意于局限于本发明 的任一具体实施方案，而是在一般情况下适用于如权利要求和说明书 中所描述的本发明的任何实施方案和所有实施方案。
术语“脂肪酸”指各种链长的长链脂族酸(链烷酸)，链长大约为 C12至C22(尽管更长和更短链长的酸两者都是已知的)。主要的链长在 C16和C22之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X:Y”来表示，其中 X表示具体脂肪酸中碳(C)原子的总数，且Y表示双键的数目。另外 的关于“饱和脂肪酸”与“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”与“多 不饱和脂肪酸”(或“PUFA”)以及“ω-6脂肪酸”(ω-6或n-6)与“ω -3脂肪酸”(ω-3或n-3)之间的区别的详细信息在美国专利公开 No.2005/0136519中有提供。
脂肪酸在本文中用简单的记号系统“X:Y”表示，其中X表示具体脂 肪酸中碳(C)原子的数目，且Y表示双键的数目。脂肪酸名称后面的 数字表示从脂肪酸羧基端计数的双键的位置，其中词缀“c”表示双键的 顺式-构型(如棕榈酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1，9c)、岩芹 酸(18:1，6c)、LA(18:2，9c，12c)、GLA(18:3，6c，9c，12c)和ALA(18:3， 9c，12c，15c))。除非另外说明，否则18:1、18:2和18:3分别指油酸、LA 和ALA脂肪酸。如果没有另外明确地写明，则双键被认为是顺式构型 的。例如，18:2(9，12)中的双键将被认为是顺式构型。
在本公开内容中用于描述PUFA的命名在下面的表2中示出。在标题 为“简化符号”一栏中，ω-指代系统用于表明碳数目、双键的数目和 最接近ω碳的双键位置，双键位置的计数从ω碳开始(为此ω碳的编 号为1)。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸及其前体的俗名、将 在整个说明书中使用的缩写以及每种化合物的化学名称。
表2
多不饱和脂肪酸及其前体的命名法
  俗名 缩写 化学名称 简化符号 肉豆蔻酸 -- 十四酸 14:0 棕榈酸 Palmitate 十六酸 16:0 棕榈油酸 -- 9-十六碳烯酸 16:1 硬脂酸 -- 十八酸 18:0 油酸 -- 顺式-9-十八碳烯酸 18:1 亚油酸 LA 顺式-9，12-十八碳 二烯酸 18:2ω-6 γ-亚油酸 GLA 顺式-6，9，12-十八 碳三烯酸 18:3ω-6 附子脂酸 EDA 顺式-11，14-二十碳 二烯酸 20:2ω-6 二高-γ-亚油酸 DGLA 顺式-8，11，14-二十 碳三烯酸 20:3ω-6 花生四烯酸 ARA 顺式-5，8，11，14-二 十碳四烯酸 20:4ω-6 α-亚麻酸 ALA 顺式-9，12，15-十八 碳三烯酸 18:3ω-3 十八碳四烯酸 STA 顺式-6，9，12，15-十 八碳四烯酸 18:4ω-3 二十碳三烯酸 ETrA或ERA 顺式-11，14，17-二 十碳三烯酸 20:3ω-3
  Sciadonic SCI 顺式-5，11，14-二十 碳三烯酸 20:3bω-6 Juniperonic JUP 顺式-5，11，14，17-二 十碳四烯酸 20:4bω-3 二十碳四烯酸 ETA 顺式-8，11，14，17- 二十碳四烯酸 20:4ω-3 二十碳五烯酸 EPA 顺式-5，8，11，14， 17-二十碳五烯酸 20:5ω-3 二十二碳五烯酸 DPA 顺式-7，10，13，16， 19-二十二碳五烯酸 22:5ω-3 二十二碳六烯酸 DHA 顺式-4，7，10，13，16， 19-二十二碳六烯酸 22:6ω-3
术语“三酰基甘油”、“油”和“TAG”指由与甘油分子酯化的三个 脂肪酰残基组成的中性脂质(并且这些术语在本公开内容中将可以互 换使用)。这些油可含有长链PUFA以及较短的饱和的和不饱和的脂肪 酸以及较长链的饱和脂肪酸。因而，“油的生物合成”一般指细胞中 TAG的合成。
“总脂质和油级分中的PUFA百分比(％)”指PUFA相对于在那些级 分中的总脂肪酸的百分比。术语“总脂质级分”或“脂质级分”两者 均指含油生物内所有脂质(即中性和极性脂质)的总和，因此包括位 于磷脂酰胆碱(PC)级分、磷脂酰乙醇胺(PE)级分和三酰基甘油(TAG 或油)级分中的那些脂质。然而，术语“脂质”和“油”将可在整个 说明书中互换使用。
代谢途径或生物合成途径在生物化学意义上可以认为是发生于细 胞内由酶催化的一系列化学反应，用以实现细胞待使用的或待贮存的 代谢产物的形成，或启动另一代谢途径(因而称作流量产生步骤)。很 多此类途径都很精细，并涉及对起始物质的逐步修饰以使之形成具有 期望的精确化学结构的产物。
术语“PUFA生物合成途径”指将油酸转化成LA、EDA、GLA、 DGLA、ARA、ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA的代谢过 程。该过程在文献中已有很好的描述(如参见PCT公开No.WO 2006/052870)。简而言之，该过程涉及通过添加碳原子来延长碳链和通 过加入双键来使分子去饱和，这通过存在于内质网膜内的一系列特异 性去饱和酶和延长酶(即“PUFA生物合成途径酶”)进行。更具体地 讲，“PUFA生物合成途径酶”指如下与PUFA生物合成相关的任何酶 (以及编码该酶的基因)，包括：Δ-4去饱和酶、Δ-5去饱和酶、Δ-6 去饱和酶、Δ-12去饱和酶、Δ-15去饱和酶、Δ-17去饱和酶、Δ-9去饱 和酶、Δ-8去饱和酶、Δ-9延长酶、C14/16延长酶、C16/18延长酶、C18/20 延长酶和/或C20/22延长酶。
术语“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”指在合适条件下表达时编码 催化ω-3和ω-6脂肪酸二者之一或两者产生的酶的一组基因。通常，参 与ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因编码PUFA生物合成途径酶。图1 示出了一条代表性途径，提供了从肉豆蔻酸经过多种中间产物向DHA 的转化，演示了ω-3和ω-6脂肪酸两者是如何可以从共同来源产生。自 然，该途径分成两部分，其中一部分将产生ω-3脂肪酸而另一部分只产 生ω-6脂肪酸。只产生ω-3脂肪酸的部分在本文中将称作ω-3脂肪酸生 物合成途径，而只产生ω-6脂肪酸的部分在本文中将称作ω-6脂肪酸生 物合成途径。
如本文中关于ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径所用的，术语“功能性 的”指该途径中的一些(或全部)基因表达活性酶，导致体内催化或 底物转化。应该了解，“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”或“功能性ω -3/ω-6脂肪酸生物合成途径”并不意味着上面段落中列出的所有基因都 是必需的，因为许多脂肪酸产物将仅需要表达该途径中的一亚组基因。
术语“Δ-6去饱和酶/Δ-6延长酶途径”将指最低程度包括至少一种 Δ-6去饱和酶和至少一种C18/20延长酶的PUFA生物合成途径，从而使得 能分别从LA和ALA开始，以GLA和/或STA作为脂肪酸中间产物生物合 成DGLA和/或ETA。通过其它去饱和酶和延长酶的表达，还可以合成 ARA、EPA、DPA和DHA。
术语“Δ-9延长酶/Δ-8去饱和酶途径”将指最低程度包括至少一种 Δ-9延长酶和至少一种Δ-8去饱和酶的PUFA生物合成途径，从而使得 能分别从LA和ALA开始，以EDA和/或ETrA作为脂肪酸中间产物生物合 成DGLA和/或ETA。通过其它去饱和酶和延长酶的表达，还可以合成 ARA、EPA、DPA和DHA。
术语“脂肪酸中间产物”指在脂肪酸代谢途径中产生的任何脂肪 酸，其可以通过其它代谢途径酶的作用进一步转化成本途径的目的脂 肪酸产物。例如，当利用Δ-9延长酶/Δ-8去饱和酶途径产生EPA时，可 以产生EDA、ETrA、DGLA、ETA和ARA并被认为是“脂肪酸中间产 物”，因为这些脂肪酸可通过其它代谢途径酶的作用进一步转化成EPA。
术语“脂肪酸副产物”指在脂肪酸代谢途径中产生的既非该途径 的目的脂肪酸产物又非该途径的“脂肪酸中间产物”的任何脂肪酸。 例如，当利用Δ-9延长酶/Δ-8去饱和酶途径产生EPA时，sciadonic acid (SCI)和juniperonic acid(JUP)也可通过Δ-5去饱和酶分别作用于EDA 或ETrA而产生。它们被认为是“脂肪酸副产物”，因为两者均不能通过 其它代谢途径酶的作用进一步转化成EPA。
术语“去饱和酶”指可以在一种或多种脂肪酸中去饱和(即引入 双键)而产生所关注的脂肪酸或前体的多肽。尽管在整个说明书中使 用ω-指代系统来指代特定的脂肪酸，但使用Δ-系统从底物的羧基端计 数来表示去饱和酶的活性更方便。本文特别关注的是催化DGLA转化成 ARA和/或催化ETA转化成EPA的Δ-5去饱和酶。其它去饱和酶包括：1.) 使脂肪酸在从该分子的羧基末端计数的第17和第18个碳原子之间去饱 和并且(例如)催化ARA转化成EPA和/或催化DGLA转化成ETA的Δ-17 去饱和酶；2.)催化LA转化成GLA和/或催化ALA转化成STA的Δ-6去 饱和酶；3.)催化油酸转化成LA的Δ-12去饱和酶；4.)催化LA转化成 ALA和/或催化GLA转化成STA的Δ-15去饱和酶；5.)催化DPA转化成 DHA的Δ-4去饱和酶；6.)催化EDA转化成DGLA和/或催化ETrA转化 成ETA的Δ-8去饱和酶；和7.)催化棕榈酸转化成棕榈油酸(16:1)和/ 或催化硬脂酸转化成油酸的Δ-9去饱和酶。在本领域中，基于Δ-15和 Δ-17去饱和酶将ω-6脂肪酸转化成它们的ω-3对应物的能力(如分别 将LA转化成ALA和将ARA转化成EPA)，偶尔也将它们称作“ω-3去饱 和酶”、“w-3去饱和酶”和/或“ω-3去饱和酶”。在一些实施方案中， 最理想的是，通过用脂肪酸去饱和酶的基因转化合适的宿主并测定它 对该宿主脂肪酸概况的作用来经验性地测定特定脂肪酸去饱和酶的特 异性。
术语“Δ-5去饱和酶”指使脂肪酸在从该分子羧基末端计数的第五 个和第六个碳原子之间去饱和的酶。优选地，Δ-5去饱和酶将二高-γ- 亚麻酸[20:3，DGLA]转化成花生四烯酸[20:4，ARA]或将二十碳四烯酸 [20:4，ETA]转化成二十碳五烯酸[20:5，EPA]。
就本文的目的而言，术语“EgD5”指由本文中的SEQ ID NO：1编码 的分离自小眼虫的Δ-5去饱和酶(SEQ ID NO：2)。类似地，术语”EgD5S” 指来源于小眼虫的经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的合 成的Δ-5去饱和酶(即SEQ ID NO：3和2)。
术语“转换效率”和“底物转换百分比”指特定酶(如去饱和酶) 能够将底物转化成产物的效率。转换效率根据下面的公式测量：([产 物]/[底物+产物])×100，其中“产物”包括中间产物和该途径中来 源于它的所有产物。
术语“延长酶”指能延长脂肪酸碳链从而产生比该延长酶作用在 其上的脂肪酸底物长2个碳原子的酸的多肽。该延长过程在与脂肪酸合 酶相关的多步骤机制中发生，如在美国专利公开No.2005/0132442中所 描述的。由延长酶体系催化的反应的实例是将GLA转化成DGLA、将 STA转化成ETA和将EPA转换成DPA。通常，延长酶的底物选择性有些 广泛，但由链长度和不饱和的程度及类型两者来区分。例如，C14/16延 长酶将会利用C14底物(如肉豆蔻酸)，C16/18延长酶将会利用C16底物 (如棕榈酸)，C18/20延长酶(又称为Δ-6延长酶，两个术语可以互换使 用)将利用C18底物(如GLA和STA)，而C20/22延长酶将利用C20底物(如 EPA)。以类似方式，Δ-9延长酶能够催化LA和ALA分别转化成EDA和 ETrA。重要的是，须注意一些延长酶具有广泛的特异性并因而单个延 长酶可能能催化几种延长酶反应(如，从而既可作为C16/18延长酶，又 可作为C18/20延长酶)。
术语“含油的”指那些趋于以脂质形式贮存它们的能源的生物 (Weete，Fungal Lipid Biochemistry，第二版，Plenum，1980)。术语“含 油酵母”指那些能够产油并被归类为酵母的微生物。通常，含油微生 物的细胞油或TAG含量符合S形曲线，其中脂质浓度增加直至在晚对数 生长期或早稳定生长期时它达到最高浓度，随后在晚稳定生长期和死亡 期期间逐渐下降(Yongmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.， 57：419-25(1991))。含油微生物积累油超过它们的干细胞重量的约25％ 的情形并不鲜见。含油酵母的实例包括但不限于如下属：耶氏酵母属 (Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬 孢属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属 (Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。
术语“裸藻纲(Euglenophyceae)”指生活在淡水环境、海洋环境、 土壤环境和寄生环境中的一群单细胞的无色或光合鞭毛虫(“类眼虫”)。 该纲的特征为孤立的单细胞，其中大多数是自由游动的并且具有从称为储 存器的前内陷长出的两条鞭毛(其中一条可能不露出)。光合类眼虫含有 一个至多个叶绿体，叶绿体从微小的盘状至延伸的板状或带状而不同。无 色类眼虫依赖于渗透营养或吞噬营养来进行营养同化作用。已经描述了约 1000种物种并将它们分为约40个属和6个目。裸藻纲的实例包括(但不限 于)如下属：裸藻属(Euglena)、Eutreptiella和Tetruetreptia。
术语“保守氨基酸置换”指将给定蛋白质中的氨基酸残基用另一 种氨基酸置换，而不改变该蛋白质的化学或功能性质。例如，在本领 域中熟知，导致在给定位点产生化学等价的氨基酸(但不影响所编码、 折叠蛋白质的结构和功能特性)的基因改变是常见的。为了本发明目 的，将“保守氨基酸置换”定义为如下五组中的一组内的互换：
1.小的脂族非极性或有轻微极性的残基：Ala[A]、Ser[S]、Thr[T] (Pro[P]、Gly[G])；
2.极性带负电荷残基和它们的酰胺：Asp[D]、Asn[N]、Glu[E]、 Gln[Q]；
3.极性带正电荷残基：His[H]、Arg[R]、Lys[K]；
4.大的脂族非极性残基：Met[M]、Leu[L]、Ile[I]、Val[V](Cys[C])； 和
5.大的芳族残基：Phe[F]、Tyr[Y]和Trp[W]。
保守氨基酸置换通常保持：1)置换区内多肽主链的结构；2)分子 在靶位点处的电荷或疏水性；或3)侧链体积。此外，在许多情形中， 改变蛋白质分子的N-末端和C-末端部分也将预计不会改变蛋白质的活 性。
如本文所用的，“核酸”意指多核苷酸并包括单链或双链的脱氧核 糖核苷酸或核糖核苷酸碱基聚合物。核酸也可以包括片段和经修饰的 核苷酸。因此，术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核 酸片段”可互换使用，并且是作为单链或双链的RNA或DNA聚合物， 任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常以它 们的5′单磷酸形式存在)可以用如下它们的单个字母名称指代÷：“A”表 示腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别针对RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱 氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示 脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示 G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，“N”表示任何核苷酸。
术语“在功能上等价的亚片段”和“功能等价的亚片段”在本文 中可互换使用。这些术语指分离的核酸片段的一部分或子序列，其中 无论所述片段或亚片段是否编码活性酶，其都保留有改变基因表达或 产生某些表型的能力。例如，所述片段或亚片段可用于设计嵌合基因 以在转化的植物中产生理想的表型。通过将核酸片段或其亚片段(无 论它是否编码活性酶)以相对于植物启动子序列的有义或反义的方向 连接，可以设计嵌合基因用于抑制作用。
术语“保守结构域”或“基序”意指进化上相关的蛋白质的比对 序列上在特定位置处保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其它 位置的氨基酸可以发生变化，但在特定位置高度保守的氨基酸表示对 蛋白质的结构、稳定性或活性来说是必需的氨基酸。因为它们通过它 们在蛋白质同源物家族的比对序列中的高度保守来鉴定，所以它们可用 作识别标记或“签名”来确定具有新测定序列的蛋白质是否属于以前 鉴定的蛋白质家族。
术语“同源”、“同源的”、“基本相似的”和“基本对应的”在本 文中可互换使用。它们指这样的核酸片段，即其中一个或多个核苷酸 碱基改变并不会影响该核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能 力。这些术语也指本发明的核酸片段的修饰(例如缺失或插入一个或 多个核苷酸)，相对于初始的未经修饰的核酸片段，所述修饰基本上不 会改变所得核酸片段的功能特性。因此正如本领域技术人员应该理解 的，本发明涵盖的不仅仅是具体的示例性序列。
此外，技术人员认识到，本发明所涵盖的基本相似的核酸序列也 通过它们(在中等严格条件如0.5×SSC，0.1％ SDS，60℃下，)与本文 所示例的序列杂交的能力，或杂交至本文所公开的核苷酸序列的任何 部分和与本文所公开的任何核酸序列功能等价的序列的能力所限定。 可以调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同 源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基 因)。杂交后的洗涤可确定严格条件。
术语“选择性杂交”包括指在严格杂交条件下，核酸序列与特定 核酸靶序列以比其与非靶核酸序列的杂交更高的可检测程度(如，至 少两倍于背景)杂交，并指基本排除了非靶核酸序列。选择性杂交的 序列通常彼此具有约至少80％的序列同一性，或90％的序列同一性，最 多并包括100％的序列同一性(即完全互补)。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针将选择性杂交 至其靶序列的条件。严格条件是序列依赖性的，并将因不同的环境而 异。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的 靶序列(同源探测)。作为另一种选择，可调节严格条件以允许序列中 的一些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针 的长度少于约1000个核苷酸，任选长度少于500个核苷酸。
一般地，严格条件将是如下那些条件：在pH7.0-8.3下盐浓度低于 约1.5M钠离子，通常约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且对于短 探针(如10-50个核苷酸)温度为至少约30℃而对于长的探针(如多于 50个核苷酸)温度为至少约60℃。严格条件也可以通过加入诸如甲酰 胺之类的去稳定剂来实现。示例性的低严格条件包括在37℃下于含 30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液中杂 交，以及在50-55℃下用1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸 三钠)洗涤。示例性的中等严格条件包括在37℃下于40-45％甲酰胺、 1M NaCl、1％ SDS中杂交，以及在55-60℃下用0.5×至1×SSC洗涤。示 例性的高严格条件包括在37℃下于50％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS中 杂交，以及在60-65℃下用0.1×SSC洗涤。
特异性通常取决于杂交后洗涤，最后的洗涤溶液的离子强度和温 度是关键因素。对于DNA-DNA杂交体，Tm可以用Meinkoth等人，Anal. Biochem.138：267-284(1984)中的等式估算：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子 的体积摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％ form 是杂交溶液中甲酰胺的百分比，而L是以碱基对表示的杂交体的长度。 Tm指(在确定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探 针杂交时的温度。每出现1％的错配，Tm降低约1℃；因此，可调节Tm、 杂交和/或洗涤条件以与具有期望同一性的序列杂交。例如，如果要寻 求具有≥90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，在确定的离 子强度和pH下，严格条件选择为比特定序列及其互补序列的热解链温 度(Tm)低约5℃。然而，极严格条件可采用在比热解链温度(Tm)低 1、2、3或4℃下杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在比热解链温度 (Tm)低6、7、8、9或10℃下杂交和/或洗涤；低严格条件可采用在比 热解链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20℃下杂交和/或洗涤。利 用所述等式、杂交和洗涤组合物以及理想的Tm，一般技术人员将会理 解，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化已经在本质上得以描述。如果 所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)， 则优选增加SSC的浓度以便能使用更高的温度。对核酸杂交的详尽指导 可在以下文献中找到：Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分， 第2章“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”，Elsevier，New York(1993)；以及Current Protocols in Molecular Biology，第2章，Ausubel等人编辑，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。杂交和/或洗涤条件可进行至少 10、30、60、90、120或240分钟。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”指这样的部分，该部分包含 的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定而鉴定所述多 肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来 完成，或者可以利用诸如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool； Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))之类的算法通过 计算机自动化序列比较和鉴定来完成。通常，为了推测鉴定多肽或核 酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有10个或更多邻接氨基 酸或者30个或更多核苷酸的序列。此外，就核苷酸序列而言，包含20-30 个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可以用于序列依赖性的基因 鉴定(如DNA杂交)和基因分离(如细菌菌落或噬菌体斑的原位杂交) 方法。此外，12-15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物以获 得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”包 含的序列足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明 书教导了编码特定类眼虫蛋白质的完整的氨基酸和核苷酸序列。利用本 文所报道的序列，技术人员现在可以使用所公开的序列的全部或基本 部分用于本领域技术人员已知的目的。因此，本发明包含在所附序列 表中报道的完整序列，以及如上面定义的那些序列的基本部分。
术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。 例如，就DNA而言，腺苷与胸腺嘧啶互补而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因 此，本发明也包含与所附序列表中报道的完整序列互补的分离的核酸 片段，以及那些基本相似的核酸序列。
术语“同源”和“同源的”在本文中可以互换使用。它们指其中 一个或多个核苷酸碱基的变化不影响核酸片段介导基因表达或产生某 种表型的能力的核酸片段。这些术语也指本发明的核酸片段的修饰(例 如缺失或插入一个或多个核苷酸)，相对于初始的未经修饰的核酸片 段，所述修饰基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。因此正如本 领域技术人员应该理解的，本发明涵盖的序列不仅仅是具体的示例性 序列。
而且，技术人员将认识到，本发明所涵盖的同源核酸序列也通过 它们在中等严格条件(例如0.5×SSC，0.1％ SDS，60℃)下与本文所例 示的序列杂交的能力，或杂交至本文所公开的核苷酸序列的任何部分 和与本文所公开的任何核酸序列功能等价的序列的能力所限定。
“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基 酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。因此，本发明涉及编码 氨基酸序列的全部或基本部分的任何核酸片段，所述氨基酸序列编码 在SEQ ID NO：2中示出的本发明的类眼虫多肽。技术人员非常了解具体 宿主细胞在使用核苷酸密码子以指定给定氨基酸时所表现出的“密码 子偏倚”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望设 计基因以使得其密码子使用频率与该宿主细胞优选的密码子使用频率 接近。
与DNA序列有关的“化学合成”指在体外对组分核苷酸进行装配。 可以采用完善建立的方法来完成DNA的手工化学合成，或者可使用许 多种可商业获得的机器的其中一种来完成自动化学合成。“合成的基 因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸构件装 配而成。将这些构件进行连接并退火以形成基因节段，该基因节段随后 在酶促作用下装配而构建成完整的基因。因此，基于最优化核苷酸序 列以反映宿主细胞的密码子偏倚，可以定制基因用以最优化基因表达。 如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员理解成功 的基因表达的可能性。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞 的基因(其中序列信息可获得)的检测。
“基因”指表达特定蛋白质的核酸片段，并且该核酸片段可以指单 独的编码区或可以包含位于编码序列之前的调节序列(5′非编码区)和 之后的调节序列(3′非编码区)。“天然基因”指天然存在的具有其自身 调节序列的基因。“嵌合基因”指任何不是天然基因的基因，其包含在 天然情况下不会一起存在的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因可 以包含源于不同来源的调节序列和编码序列，或者包含源于同一来源， 但以不同于天然存在的方式排列的调节序列和编码序列。“内源基因” 指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。“外来”基因指通过 基因转移导入到宿主生物内的基因。外来基因可包括插入到非天然生 物内的天然基因、导入到天然宿主内的新位置的天然基因，或嵌合基 因。“转基因”指已经通过转化方法导入到基因组内的基因。“经密码 子最优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选 的密码子使用频率的基因。
“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调节序 列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、之内或下游(3′非编码序 列)的核苷酸序列，并且其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或 稳定性或翻译。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、 多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
术语“等位基因”指占据染色体上给定基因座的基因的几种备选 形式中的一种。当存在于染色体上给定基因座上的所有等位基因都相 同时，则该植物在此基因座处是纯合的。如果存在于染色体给定基因 座上的等位基因不同，则该植物在此基因座处是杂合的。
“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。通 常，编码序列位于启动子序列的3′。启动子可以全部来源于天然基因， 或由源于天然存在的不同启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成 的DNA节段。本领域的技术人员理解，不同的启动子可以引导基因在 不同的组织或细胞类型中、或在不同的发育阶段、或响应不同的环境 或生理条件而表达。导致基因在大部分时间内在大多数细胞类型中表 达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在 大多数情况下调节序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的 DNA片段可能具有相同的启动子活性。
启动子序列可以由邻近的和更远处的上游元件组成，后一类元件 常称为增强子。因此，“增强子”是能刺激启动子活性的DNA序列，并 且可以是启动子的固有的元件或插入的异源元件，用以增强启动子的 水平或组织特异性。正不断发现可用于植物细胞的多种类型的新启动 子；大量的实例可以在Okamuro，J.K.和Goldberg，R.B.，Biochemistry of Plants，15：1-82(1989)的汇编中找到。
“翻译前导序列”指位于基因的启动子序列和编码序列之间的多核 苷酸序列。翻译前导序列存在于完全加工的mRNA的翻译起始序列的上 游。翻译前导序列可以影响mRNA初级转录物的加工、mRNA的稳定性 或翻译效率。翻译前导序列的实例已有描述(Turner，R.和Foster，G.D.， Mol.Biotechnol.，3：225-236(1995))。
术语“3′非编码序列”和“转录终止子”指位于编码序列下游的DNA 序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达 的调节信号的其它序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片 添加到mRNA前体的3′末端。3′区可影响相关编码序列的转录、RNA加 工或稳定性或翻译。
“RNA转录物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列的转录所产生的产 物。当RNA转录物是DNA序列的完全互补的拷贝时，它被称为初级转 录物，或者它可以是源自初级转录物的转录后加工的RNA序列并被称 作成熟RNA。“信使RNA”或“mRNA”指无内含子并且可以由细胞翻译 成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA互补并源于mRNA的双链DNA。 “有义”RNA指包含mRNA并因而能由细胞翻译成蛋白质的RNA转录 物。“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补并且可 阻断靶基因的表达的RNA转录物(美国专利5,107,065；PCT公开 No.WO99/28508)。反义RNA可以与特定基因转录物的任何部分，即5′ 非编码序列、3′非编码序列或编码序列互补。“功能性RNA”指反义 RNA、核酶RNA或其它不能翻译可是对细胞过程有作用的RNA。
术语“可操作地连接”指单个核酸片段上核酸序列的关联，使得其 中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子 能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制) 时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反 义的方向可操作地连接至调节序列。
如本文所用的，术语“表达”指源于本发明的核酸片段的有义RNA (mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指mRNA翻译成多 肽。
“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽，即已经去除了存在于初始 翻译产物中的任何前肽或肽原的多肽。“前体”蛋白质指mRNA的初级 翻译产物，即前肽和肽原仍然存在。前肽和肽原可以是(但不限于) 细胞内定位信号。
“转化”指将核酸分子转移至宿主生物中，导致在遗传上稳定遗传。 例如，核酸分子可以是自主复制的质粒，或者它可以整合进宿主生物 的基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物称作“转基因”或“重组” 或“转化”生物。
术语“质粒”、“载体”和“盒”指通常携带有不属于细胞中心代 谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形 式。这种元件可以是源于任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、 噬菌体或者单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线状或环状)，其中 许多核苷酸序列已经连接或重组为一种独特构建体，该构建体能够将 所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同合适的3′非翻译序列一起 导入细胞中。“表达盒”指包含外来基因并且除该外来基因以外还具有 使得该基因在外来宿主中的表达增强的元件的特定载体。
如本领域已知的，术语“百分比同一性”是两条或更多条多肽序列 之间或者两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，其通过比较序列测 定。在本领域中，“同一性”也表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联 的程度，根据具体情况而定，其由这些序列串之间的匹配确定。“同一 性”和“相似性”可以通过已知方法很容易计算出来，所述方法包括 但不限于下列文献中所述的那些方法：1.)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)Oxford University：NY(1988)；2.) Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑) Academic：NY(1993)；3.)Computer Analysis of Sequence Data，Part I (Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humania：NJ(1994)；4.)Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.编辑)Academic(1987)； 和5.)Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑) Stockton：NY(1991)。
设计用于测定同一性的优选方法来获得检测序列之间的最佳匹 配。用于测定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编 成了代码。序列比对和百分比同一性计算可以用LASERGENE生物信息 学计算软件包(LASERGENE bioinformatics computing suite) (DNASTAR Inc.，Madison，WI)中的MegAlignTM程序进行。序列的多 重比对采用包括几种改变形式的算法在内“Clustal比对方法”进行，包 括“Clustal V比对方法”，该算法相当于称为Clustal V(在Higgins和 Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl. Biosci.，8：189-191(1992)中有所描述)并且可以在LASERGENE生物 信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)中的MegAlignTM程序中找到的比 对方法。对于多重比对，默认值对应于缺口罚分(GAP PENALTY)＝10 和缺口长度罚分(GAP LENGTH PENALTY)＝10。用Clustal V方法进 行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为 KTUPLE＝1、缺口罚分＝3、窗口(WINDOW)＝5和DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2、缺口罚分＝5、窗口＝4 和DIAGONALS SAVED＝4。在用Clustal V程序进行序列比对后，通过 观察相同程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”成为可能。 此外，也可以使用“Clustal W比对方法”，该方法相当于称为Clustal W (在Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins，D.G.，等人， Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992)中有所描述)并且可以在 LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)中的MegAlignTM v6.1程序中找到的比对方法。用于多重比对的默认参数对应于缺口罚分 ＝10、缺口长度罚分＝0.2、延迟发散序列(Delay Divergen Seqs)(％) ＝30、DNA转换权重(DNA Transition Weight)＝0.5、蛋白质权重矩阵 (Protein Weight Matrix)＝Gonnet系列和DNA权重矩阵(DNA Weight Matrix)＝IUB。在用Clustal W程序进行序列比对后，通过观察相同程 序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”成为可能。
“BLASTN比对方法”是由国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)提供的用以采用默认参数比较核 苷酸序列的算法。
本领域的技术人员将充分理解，许多水平的序列同一性可用于从其 它物种鉴定多肽，其中该多肽具有相同或相似的功能或活性。合适的 核酸片段(本发明的分离的多核苷酸)编码与本文所报道的氨基酸序 列具有至少约70％同一性，优选至少约75％同一性，并且更优选至少约 80％同一性的多肽。优选的核酸片段编码与本文所报道的氨基酸序列具 有至少约85％同一性的氨基酸序列。更优选的核酸片段编码与本文所报 道的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。最优选的核酸片 段编码与本文所报道的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序 列。虽然优选的范围如上所述，但从39％至100％的任何整数氨基酸同 一性都可用于描述本发明，例如40％、41％、42％、43％、44％、45％、 46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、 58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、 69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
合适的核酸片段不仅具有以上同源性，而且通常还编码具有至少 50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，还 更优选至少200个氨基酸，并且最优选至少250个氨基酸的多肽。
术语“保守结构域”或“基序”指进化上相关的蛋白质的比对序 列中在特定位置保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其它位置 的氨基酸可以发生变化，但在特定位置高度保守的氨基酸表示对蛋白 质的结构、稳定性或活性来说是必需的氨基酸。因为它们可通过它们 在蛋白质同源物家族比对序列中的高度保守来鉴定，所以它们可用作识 别标记或“签名”来确定具有新的测定序列的蛋白质是否属于以前鉴 定的蛋白质家族。
术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何 计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可以商业获得或者独立开 发。一般的序列分析软件将包括但不限于：1.)GCG程序包(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)； 2.)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.， 215：403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR Inc.，Madison， WI)；4.)Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)；和5.) 整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput. Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992， 111-20。编辑：Suhai，Sandor.Plenum：New York，NY)。在本申请的上下 文中应该理解，除非另外说明，否则在使用序列分析软件进行分析时， 分析的结果将基于所参考的程序的“默认值”。如本文所用的，“默认值” 将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。就本文使 用的BLASTP算法而言，默认参数将包括Robinson和Robinson氨基酸频 率(Robinson A.B.，Robinson LR.，Proc.Natl Acad.Sci.，U.S.A.， 88：8880-8884(1991))、BLOSUM62打分矩阵和缺口成本(gap cost) Δ(g)＝11+g。
术语“植物部分”包括分化和未分化的组织，包括但不限于下列 部分：根、茎、苗、叶、花粉、种子、肿瘤组织和多种形式的细胞和 培养物(如单个细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可存在于 植株或植物器官、组织或细胞培养物中。
术语“植物器官”指构成植株的形态和功能迥异的部分的植物组 织或组织群。
术语“基因组”指：(1)存在于生物的每一个细胞或者病毒或细 胞器中的全套遗传物质(基因和非编码序列)；(2)作为(单倍体)单 位从一个亲本遗传的全套染色体。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已 经在如下文献中有所描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis， T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文称“Maniatis”)；Silhavy， T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions， Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及 Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ(1987)。
术语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体” 和“重组DNA构建体”在本文中可互换使用。重组构建体包含核酸片 段(如在天然条件下不会一起存在的调节序列和编码序列)的人工组 合。例如，嵌合构建体可包含源自不同来源的调节序列和编码序列， 或源自相同来源但以不同于天然存在的方式排列的调节序列和编码序 列。这种构建体可以单独使用或与载体联合使用。如果使用载体，则 载体的选择取决于本领域技术人员熟知的将要用于转化宿主细胞的方 法。例如，可以使用质粒载体。技术人员十分了解必须存在于载体上 以成功地转化、选择和繁殖含本发明任何分离的核酸片段的宿主细胞 的遗传元件。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将导致不同 水平和模式的表达(Jones等人，EMBO J.4：2411-2418(1985)；De Almeida等人，Mol.Gen.Genetics 218：78-86(1989))，因此，必须筛选 多次事件以获得显示期望表达水平和模式的品系。这种筛选可以通过 DNA的DNA印迹分析、mRNA表达的RNA印迹分析、蛋白质表达的免 疫印迹分析或表型分析等完成。
如本文所用的，术语“表达”指功能性终产物(如mRNA或蛋白质 [前体或成熟形式])的产生。
术语“导入”指将核酸(如表达构建体)或蛋白质提供至细胞中。 导入包括指将核酸整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸可以整 合进细胞的基因组内，以及包括指将核酸或蛋白质暂时提供给细胞。 导入包括指稳定的或瞬时的转化方法以及有性杂交。因此，将核酸片 段(如重组DNA构建体/表达构建体)插入细胞内的情况下的“导入” 意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真 核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可以整合进细胞的基因组(如 染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内、转变成自主的复制子，或瞬 时表达(如转染的mRNA)。
“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽(即，已经除去了存在于初 级翻译产物中的任何前肽或肽原的多肽)。“前体”蛋白质指mRNA的初 级翻译产物(即前肽和肽原仍然存在)。前肽和肽原可以是但不限于细 胞内定位信号。
“稳定转化”指将核酸片段转移至宿主生物的基因组(包括核基因 组和细胞器基因组)内，导致在遗传上稳定遗传。相比之下，“瞬时转 化”指将核酸片段转移至宿主生物的核内或含有DNA的细胞器内，导 致基因表达而不整合或不稳定遗传。含有转化的核酸片段的宿主生物 称作“转基因”生物。
如本文所用的，“转基因”指其基因组内含有异源多核苷酸的植物 或细胞。优选地，将异源多核苷酸稳定整合进基因组内以便该多核苷 酸连续传代。异源多核苷酸可以单独地或作为表达构建体的部分整合 进基因组中。本文所用的转基因包括因异源核酸存在而已经改变了基 因型的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括 初始进行此类改变的转基因以及从初始的转基因通过有性杂交或无性 繁殖产生的那些转基因。如本文所用的，术语“转基因”不包括通过 常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组 细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组 改变。
“反义抑制”指能抑制靶蛋白质表达的反义RNA转录物的产生。 “共抑制”指能抑制相同或基本相似的外来或内源基因表达的有义 RNA转录物的产生(美国专利No.5,231,020)。以前已经设计了植物中 的共抑制构建体，这通过集中于在有义方向上与内源mRNA同源的核酸 序列的超表达来进行，其导致与超表达序列同源的所有RNA减少 (Vaucheret等人，Plant J.16：651-659(1998)；Gura，Nature 404：804-808 (2000))。该现象的整体效率低，并且RNA减少的程度的变化范围很 大。更近期的工作已经描述了以互补方向整合了全部或部分mRNA编码 序列的“发夹”结构的利用，其导致表达的RNA出现可能的“茎-环” 结构(PCT公开No.WO 99/53050，于1999年10月21日公开；PCT公开 No.WO02/00904，于2002年1月3日公开)。这增加了回收的转基因植物 中的共抑制频率。另一变化形式描述了利用植物病毒序列来引导近侧 mRNA编码序列的抑制或“沉默”(PCT公开No.WO 98/36083，于1998 年8月20日公开)。尽管遗传学证据已经开始解开这种复杂的情形 (Elmayan等人，Plant Cell 10：1747-1757(1998))，但这两种共抑制现 象都还没有从机理上得到阐明。 综述：脂肪酸和三酰基甘油的微生物生物合成
通常，含油微生物的脂质蓄积响应存在于生长培养基中的总的碳 氮比率而触发。该过程(导致含油微生物中游离棕榈酸(16:0)的从头 合成)在PCT公开No.WO 2004/101757中有详细描述。棕榈酸是长链饱 和的和不饱和的脂肪酸衍生物的前体，这些脂肪酸衍生物通过延长酶 和去饱和酶的作用形成(图1)。
TAG(脂肪酸的主要贮存单位)通过包括如下反应在内的一系列 反应形成：1.)一分子的酰基辅酶A和甘油-3-磷酸通过酰基转移酶酯化 而生成溶血磷脂酸；2.)第二分子的酰基辅酶A通过酰基转移酶酯化而 生成1，2-二酰基甘油磷酸(通常称为磷脂酸)；3.)通过磷脂酸磷酸酶除 去磷酸而生成1，2-二酰基甘油(DAG)；和4.)在酰基转移酶作用下加入 第三个脂肪酸以形成TAG。广谱的脂肪酸可被整合进TAG中，包括饱和 的和不饱和的脂肪酸以及短链和长链的脂肪酸。
ω-脂肪酸的生物合成
其中油酸转化成ω-3/ω-6脂肪酸的代谢过程包括通过添加碳原子 使碳链延长和通过加入双键使分子去饱和。这需要存在于内质网膜内 的一系列特殊去饱和酶和延长酶。然而，如在图1中看到的和如下所述 的，通常存在多个用于产生特定ω-3/ω-6脂肪酸的替代途径。
具体地讲，所有途径都需要最初通过Δ-12去饱和酶将油酸转化成 LA(第一个ω-6脂肪酸)。然后，利用“Δ-6去饱和酶/Δ-6延长酶途径”， 如下形成ω-6脂肪酸：(1)通过Δ-6去饱和酶将LA转化成GLA；(2)通 过C18/20延长酶将GLA转化成DGLA；和(3)通过Δ-5去饱和酶将DGLA 转化成ARA。作为另一种选择，“Δ-6去饱和酶/Δ-6延长酶途径”可用 于如下形成ω-3脂肪酸：(1)通过Δ-15去饱和酶将LA转化成ALA(第 一个ω-3脂肪酸)；(2)通过Δ-6去饱和酶将ALA转化成STA；(3)通过 C18/20延长酶将STA转化成ETA；(4)通过Δ-5去饱和酶将ETA转化成 EPA；(5)通过C20/22延长酶将EPA转化成DPA；和(6)通过Δ-4去饱和 酶将DPA转化成DHA。任选地，ω-6脂肪酸可转化成ω-3脂肪酸；例如， ETA和EPA通过Δ-17去饱和酶活性分别从DGLA和ARA生成。
用于生物合成ω-3/ω-6脂肪酸的替代途径使用了Δ-9延长酶和Δ-8 去饱和酶。更具体地讲，LA和ALA可通过Δ-9延长酶分别转化成EDA 和ETrA；然后，Δ-8去饱和酶将EDA转化成DGLA和/或将ETrA转化成 ETA。
预期需要在特定宿主生物中表达用以产生ω-3/ω-6脂肪酸的特定 功能将取决于宿主细胞(及其天然的PFUA概况和/或去饱和酶/延长酶 概况)、底物的可利用性和所需的终产物。本领域技术人员将能够鉴定 多种编码ω-3/ω-6脂肪酸生物合成所需的每种酶的候选基因。可用的去 饱和酶和延长酶序列可源自任何来源，例如，分离自天然来源(来自 细菌、藻类、真菌、植物、动物等)、经由半合成途径产生或从头合成。 尽管导入宿主的去饱和酶和延长酶基因的具体来源不是关键的，但选 择具有去饱和酶或延长酶活性的特定多肽的考虑事项包括：1.)多肽的 底物特异性；2.)多肽或其组分是否为限速酶；3.)去饱和酶或延长酶 是否是合成期望的PUFA所必需的；和/或4.)多肽所需的辅因子。表达 的多肽优选具有与它在宿主细胞中的位置的生化环境相容的参数(其 它详细信息参见PCT公开No.WO 2004/101757)。
在另外的实施方案中，考虑每种具体的去饱和酶和/或延长酶的转 换效率也将是有用的。更具体地讲，由于每种酶极少能以100％的效率 将底物转化成产物，宿主细胞所产生的未纯化的油的最终脂质概况将 通常是由期望的ω-3/ω-6脂肪酸及多种上游PUFA中间产物组成的多种 PUFA混合物。因此，当最优化所需的脂肪酸的生物合成时，每种酶的 转换效率也是一个要考虑的变量。
考虑到上述各个考虑事项，具有合适去饱和酶和延长酶活性(如 Δ-6去饱和酶、C18/20延长酶、Δ-5去饱和酶、Δ-17去饱和酶、Δ-15去 饱和酶、Δ-9去饱和酶、Δ-12去饱和酶、C14/16延长酶、C16/18延长酶、 Δ-9延长酶、Δ-8去饱和酶、Δ-4去饱和酶和C20/22延长酶)的候选基因 可根据可公开获得的文献(如GenBank)、专利文献和对具有产生PUFA 能力的生物的实验分析来鉴定。这些基因将适用于导入到特定的宿主 生物中，以使生物能合成PUFA或增强生物合成PUFA。
新小眼虫Δ-5去饱和酶的序列鉴定
在本发明中，已经从小眼虫中分离出一种编码Δ-5去饱和酶(SEQ ID NO：2)(在本文中称为“EgD5”)的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。
EgD5的核苷酸碱基和推导的氨基酸序列与公共数据库的比较揭 示，用Clustal W比对方法，最相似的已知序列与本文所报道的EgD5氨 基酸序列在449个氨基酸的长度上具有约39％的同一性。更优选的氨基酸 片段与本文中的序列具有至少约70％-80％的同一性，其中具有至少约 80％-90％同一性的那些序列尤其适合，而具有至少约90％-95％同一性 的那些序列是最优选的。类似地，优选的对应本发明ORF的编码EgD5 的核酸序列是编码活性蛋白质的那些并且其与本文所报道的EgD5的核 酸序列具有至少约70％-80％同一性，其中具有至少约80％-90％同一性 的那些序列尤其适合，而具有至少约90％-95％同一性的那些序列是最 优选的。
在备选的实施方案中，本发明的EgD5去饱和酶序列可经密码子最 优化以便在特定的宿主生物中表达。如本领域所熟知的，这可以是进 一步最优化该酶在替代宿主中表达的有用手段，因为使用宿主优选的 密码子能够大幅增强编码该多肽的外来基因的表达。通常，宿主优选 的密码子可在所关注的具体宿主物种中通过检查蛋白质(优选那些最 大量表达的蛋白质)中的密码子使用以及确定哪些密码子的使用频率 最高来测定。然后，可利用宿主物种优选的密码子整个或部分地合成 具有例如去饱和酶活性的所关注的多肽的编码序列。
在本发明的一个优选实施方案中，EgD5经密码子最优化以便在解 脂耶氏酵母中表达。这可能通过这样来实现：首先测定解脂耶氏酵母 的密码子使用概况(参见PCT公开No.WO 04/101757和美国专利 7,125,672)并鉴定那些优选的密码子。然后，为了进一步最优化在解 脂耶氏酵母中的基因表达，对‘ATG’起始密码子周围的共有序列进行 测定。这种最优化导致修饰了1350bp的编码区中的196bp(14.5％)以及 最优化了总共449个密码子中的189个密码子(42％)。经密码子最优化 的基因(“EgD5S”；SEQ ID NO：3)中的所有修饰都不改变所编码蛋白 质的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。如实施例11中所描述的，当在解脂 耶氏酵母中表达时，经密码子最优化的基因对DGLA去饱和形成ARA 的效率比野生型基因高36％。
基于野生型EgD5序列，本领域技术人员将能够利用本文的教导产 生适用于在替代宿主(即解脂耶氏酵母以外的宿主)中最优化表达的 多种其它经密码子最优化的Δ-5去饱和酶。因此，本发明涉及任何来源 于野生型EgD5(即由SEQ ID NO：2编码的)的经密码子最优化的Δ-5 去饱和酶蛋白。这包括但不限于在SEQ ID NO：3中示出的核苷酸序列， 该核苷酸序列编码经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的合 成的Δ-5去饱和酶蛋白(即EgD5S)。
同源物的鉴定和分离
任何本发明的去饱和酶序列(即EgD5、EgD5S)或其部分都可用 于利用序列分析软件来搜索相同或其它细菌、藻类、真菌、类眼虫或植 物物种中的Δ-5去饱和酶同源物。通常，这种计算机软件通过将同源的 程度分配给多种置换、缺失和其它修饰来匹配相似的序列。
备选地，任何本发明的去饱和酶序列或其部分也可以用作杂交试 剂用以鉴定Δ-5同源物。核酸杂交试验的基本组分包括探针、怀疑含有 所关注的基因或基因片段的样品及特定的杂交方法。本发明的探针通 常是与待检测核酸序列互补的单链核酸序列。探针与待检测的核酸序 列是“可杂交的”。尽管探针的长度可在5个碱基到成好几万个碱基之 间变化，但通常约15个碱基到约30个碱基的探针长度是合适的。只 需要探针分子的部分与待检测核酸序列互补。另外，探针和靶序列之 间不需要完全互补。杂交确实可以在并不完全互补的分子之间发生， 结果是杂交区内的某些碱基级分没有与正确的互补碱基配对。
杂交方法是非常确实的。通常探针和样品必须在允许核酸杂交的条 件下混合。这涉及在正确浓度和温度条件下在存在无机或有机盐时使探 针和样品接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，使探针和样 品核酸之间的任何可能的杂交都可发生。混合物中的探针或靶的浓度 将决定杂交发生所需的时间。探针或靶的浓度越高，所需的杂交孵育 时间就越短。任选地，可以加入离液剂(如氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸 钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾和三氟乙酸铯)。如 果需要，人们可以加入甲酰胺至杂交混合物中，通常为30-50％(v/v)。
可以采用多种杂交溶液。通常，这些杂交溶液包含约20％至60％体 积，优选30％体积的极性有机溶剂。普通的杂交溶液采用约30-50％v/v 甲酰胺、约0.15至1M氯化钠、约0.05至0.1M缓冲液(如柠檬酸钠、 Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6-9))、约0.05至0.2％去污剂(如 十二烷基硫酸钠)或0.5-20mM的EDTA、FICOLL(Pharmacia Inc.)(约 300-500千道尔顿(kdal))、聚乙烯吡咯烷酮(约250-500千道尔顿) 和血清白蛋白。一般的杂交溶液还将包含约0.1至5mg/mL未经标记的载 体核酸、片段化的核酸DNA(如小牛胸腺或鲑精DNA或酵母RNA)，以 及任选约0.5％至2％重量/体积的甘氨酸。还可以包含其它添加剂，例如 包括多种极性水溶性或可膨胀试剂(如聚乙二醇)、阴离子聚合物(如 聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和阴离子糖类聚合物(如硫酸葡聚糖) 在内的体积排阻剂。
核酸杂交可适用于多种测定形式。最合适的形式之一是夹心测定形 式。夹心测定尤其适用于在非变性条件下杂交。夹心型测定最主要的 成分是固体支持体。固体支持体具有吸附或共价连接至其上的固定核酸 探针，该探针未经标记并且与序列的一部分互补。
在另外的实施方案中，本文描述的任何Δ-5去饱和酶核酸片段(或 其鉴定的任何同源物)都可用于从相同的或其它细菌、藻类、真菌、类 眼虫或植物物种中分离编码同源蛋白质的基因。使用序列依赖性规程分 离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性规程的实例包括但不限于 1.)核酸杂交方法；2.)DNA和RNA扩增方法，这可通过核酸扩增技术 的多种用法例证[如聚合酶链反应(PCR)，Mullis等人，美国专利 4,683,202；连接酶链反应(LCR)，Tabor，S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.， U.S.A.，82：1074(1985)；或链置换扩增(SDA)，Walker等人，Proc.Natl. Acad.Sci.，U.S.A.，89：392(1992)]；和3.)文库构建和互补筛选方法。
例如，编码与本文描述的Δ-5去饱和酶相似的蛋白质或多肽的基因 可以用本领域技术人员熟知的方法，通过将本发明的核酸片段的全部 或部分用作DNA杂交探针来筛选来自例如任何期望的酵母或真菌(其 中那些产生ARA[或其衍生物]的生物将是优选的)的文库而得以直接 分离。基于本发明的核酸序列的特异性寡核苷酸探针可通过本领域已 知的方法(Maniatis，同上)设计和合成。而且，整个序列可直接用于 通过熟练技术人员已知的方法(如随机引物DNA标记、切口平移或末 端标记技术)合成DNA探针，或使用可获得的体外转录体系合成RNA 探针。另外，可设计特异性引物并将其用于扩增部分(或全长)的本 发明序列。所得的扩增产物可在扩增反应过程中直接标记或在扩增反 应后标记，并用作探针来在合适的严格条件下分离全长的DNA片段。
通常，在PCR类型的扩增技术中，引物具有不同的序列而且彼此之 间不互补。取决于所需的检测条件，应该设计引物序列以提供既有效 又可靠的靶核酸的复制。PCR引物设计方法是本领域常见且熟知的 (Thein和Wallace，“The use of oligonucleotides as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders”，Human Genetic Diseases：A Practical Approach，K.E.Davis编辑，(1986)pp33-50，IRL：Herndon， VA；以及Rychlik，W.，Methods in Molecular Biology，White，B.A.编辑， (1993)Vol.15，pp31-39，PCR Protocols：Current Methods and Applications.Humania：Totowa，NJ)。
通常，可以将本发明序列的两个短片段在PCR规程中用于从DNA 或RNA扩增编码同源基因的更长的核酸片段。PCR也可以用克隆的核 酸片段的文库进行，其中一个引物的序列源自本发明的核酸片段，而 另一个引物的序列利用编码真核基因的mRNA前体的3′端的多腺苷酸 片的存在。
备选地，第二个引物序列可以基于来源于克隆载体的序列。例如， 技术人员可以按照RACE规程(Frohman等人，Proc.Natl Acad.Sci.， U.S.A.，85：8998(1988))，通过用PCR扩增在转录物内单个位点与3′或 5′端之间的区域的拷贝来产生cDNA。以3′和5′方向取向的引物可用本 发明的序列设计。使用可商业获得的3′RACE或5′RACE体系(Gibco/BRL， Gaithersburg，MD)，可以分离特异性的3′或5′cDNA片段(Ohara等人， Proc.Natl Acad.Sci.，U.S.A.，86：5673(1989)；Loh等人，Science， 243：217(1989))。
在其它实施方案中，本文所述的任何Δ-5去饱和酶核酸片段(或其 鉴定的任何同源物)都可用于产生新的和改良的脂肪酸去饱和酶。如 本领域所熟知的，体外诱变和选择、化学诱变、“基因改组(gene shuffling)”法或其它手段可用于获得天然存在的去饱和酶基因的突变。 备选地，改良的脂肪酸可以通过结构域交换合成，其中将本文所述的 任何Δ-5去饱和酶核酸片段的功能结构域与备选的去饱和酶基因的功 能结构域交换，从而产生新的蛋白质。
用于产生多种ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法
期望在合适的启动子控制下编码本文所描述的Δ-5去饱和酶(即 EgD5、EgD5S或其它突变酶、经密码子最优化的酶或它们的同源物) 的嵌合基因的导入将导致ARA和/或EPA分别在转化的宿主生物内的产 生增加。同样，本发明涵盖了用于直接产生PUFA的方法，其包括将脂 肪酸底物(即DGLA或ETA)暴露给本文所描述的去饱和酶(例如EgD5、 EgD5S)，以便该底物转化成期望的脂肪酸产物(即分别为ARA或EPA)。
更具体地来说，本发明的目的是提供用于在宿主细胞(如含油酵 母、大豆)中产生ARA的方法，其中宿主细胞包含：
(i)编码Δ-5去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，
基于BLASTP算法或Clustal W比对方法，该多肽在与具有 SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列的多肽比较时具有至少 39％的同一性；和
(ii)二高-γ-亚油酸的来源；
其中将宿主细胞在使Δ-5去饱和酶表达并且将DGLA转化成ARA的条 件下培育，而且其中可任选地回收ARA。
本领域技术人员将认识到，Δ-5去饱和酶的广的底物范围可以另外 允许利用该酶将ETA转化成EPA。因此本发明提供了用于产生EPA的方 法，其中宿主细胞包含：
(i)编码Δ-5去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，
基于BLASTP算法或Clustal W比对方法，该多肽在与具有 SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列的多肽比较时具有至少 39％的同一性；和
(ii)二十碳四烯酸的来源；
其中将宿主细胞在使Δ-5去饱和酶表达并将ETA转化成EPA的条件下 培育，而且其中可任选地回收EPA。
作为另一种选择，本文描述的每种Δ-5去饱和酶基因及其相应的酶 产物可间接用于产生ω-3脂肪酸(参见美国专利公开 No.2005/0136519)。发生了间接产生ω-3/ω-6PUFA，其中脂肪酸底物经 由中间步骤或途径中间产物间接转化成期望的脂肪酸产物。因此，预 期可以将本文描述的Δ-5去饱和酶(如EgD5、EgD5S或其它突变酶、经 密码子最优化的酶或它们的同源物)与另外的编码PUFA生物合成途径 的酶(如Δ-6去饱和酶、C18/20延长酶、Δ-17去饱和酶、Δ-15去饱和酶、 Δ-9去饱和酶、Δ-12去饱和酶、C14/16延长酶、C16/18延长酶、Δ-9延长 酶、Δ-8去饱和酶、Δ-4去饱和酶、C20/22延长酶)的基因结合表达以导 致更高水平地产生长链ω-3脂肪酸(如EPA、DPA和DHA)。包含于具 体表达盒中的具体基因将取决于宿主细胞(和它的PFUA概况和/或去饱 和酶/延长酶概况)、底物的可利用性和期望的终产物。
在备选的实施方案中，基于本文描述的完整序列、那些完整序列 的互补序列、那些序列的基本部分、源于那些序列的经密码子最优化 的去饱和酶以及那些与其基本同源的序列，破坏宿主生物内的天然Δ-5 去饱和酶可能是有用的。
植物表达系统、盒和载体以及转化
在一个实施方案中，本发明涉及重组构建体，其包含可操作地连接 至至少一种适用于在植物中表达的调节序列的本发明的任何一种Δ-5 去饱和酶多核苷酸。启动子是引导植物的细胞机器从启动子下游(3′) 的邻接编码序列产生RNA的DNA序列。启动子区影响速率、发育阶段 和其中产生基因的RNA转录物的细胞类型。RNA转录物被加工而产生 mRNA，其作为RNA序列翻译成所编码多肽的氨基酸序列的模板。5′ 非翻译前导序列是位于蛋白质编码区上游的可在mRNA的起始和翻译 中起作用的mRNA区。3′转录终止/多腺苷酸化信号是蛋白质编码区下游 的非翻译区，其在植物细胞中起作用以导致RNA转录终止以及在RNA 的3′端添加多腺苷酸核苷酸。
选择用于驱动Δ-5去饱和酶编码序列表达的启动子的来源不重要， 只要它具有足够的转录活性来实现本发明，这通过使期望核酸片段的 可翻译mRNA在期望的宿主组织中在正确的时间表达来实现。异源性或 非异源性(即内源性)启动子可用于实践本发明。例如，合适的启动 子包括但不限于：β-伴大豆球蛋白α’亚基启动子、Kunitz胰蛋白酶 抑制剂3启动子、膜联蛋白启动子、大豆球蛋白Gy1启动子、β-伴大豆 球蛋白β-亚基启动子、P34/Gly Bd m 30K启动子、白蛋白启动子、Leg A1启动子和Leg A2启动子。
膜联蛋白或P34启动子在PCT公开No.WO 2004/071178(于2004年8 月26日公开)中有描述。膜联蛋白启动子的活性水平与许多已知的强 启动子的活性水平相当，例如：(1)CaMV 35S启动子(Atanassova等 人，Plant Mol.Biol.37：275-285(1998)；Battraw和Hall，Plant Mol.Biol. 15：527-538(1990)；Holtorf等人，Plant Mol.Biol.29：637-646(1995)； Jefferson等人，EMBO J.6：3901-3907(1987)；Wilmink等人，Plant Mol. Biol.28：949-955(1995))；(2)鼠耳芥属(Arabidopsis)油质蛋白启动 子(Plant等人，Plant Mol.Biol.25：193-205(1994)；Li，Texas A&M University Ph.D.dissertation，pp.107-128(1997))；(3)鼠耳芥属泛蛋白 延伸蛋白启动子(Callis等人，J Biol.Chem.265(21)：12486-93(1990))； (4)西红柿泛蛋白基因启动子(Rollfinke等人，Gene.211(2)：267-76 (1998))；(5)大豆热休克蛋白启动子(Schoffl等人，Mol Gen Genet. 217(2-3)：246-53(1989))；和(6)玉米H3组蛋白基因启动子(Atanassova 等人，Plant Mol Biol.37(2)：275-85(1989))。
膜联蛋白启动子的另一个有用的特征是其在发育中的种子中的表 达概况。膜联蛋白启动子在发育中的种子的早期阶段(授粉后10天之 前)最活跃，而在后期阶段很大程度上静止。膜联蛋白启动子的表达概 况不同于许多种子特异性启动子，例如种子贮藏蛋白启动子，其通常 在发育的后期阶段提供最高的活性(Chen等人，Dev.Genet.10：112-122 (1989)；Ellerstrom等人，Plant Mol.Biol.32：1019-1027(1996)；Keddie 等人，Plant Mol.Biol.24：327-340(1994)；Plant等人，(同上)；Li，(同 上))。尽管膜联蛋白启动子具有更常规的表达概况但仍与其它已知的种 子特异性启动子不同。因此，当需要在胚的早期发育阶段超表达或抑制 基因时，膜联蛋白启动子将是非常有吸引力的候选者。例如，超表达 调节胚早期发育的基因或参与种子成熟前代谢的基因可能是所需的。
在鉴定出适用于表达特异性Δ-5去饱和酶编码序列的合适启动子 之后，随后用本领域技术人员熟知的常规手段将启动子以有义方向可操 作地连接。
本文使用的标准重组DNA技术和分子克隆技术是本领域熟知的并 且在如下文献中得到了更充分的描述：Sambrook，J.等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；第二版；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，New York，1989(下文称为“Sambrook等人， 1989”)或Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.， Seidman，J.G.，Smith，J.A.和Struhl，K.(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology；John Wiley and Sons：New York，1990(下文称为 “Ausubel等人，1990”)。
一旦已经制备了重组构建体，就可随后通过本领域技术人员熟知 的方法(例如，转染、转化和电穿孔)将它导入至所选择的植物细胞 中。油料种子植物细胞是优选的植物细胞。然后将转化的植物细胞在 允许长链PUFA表达的合适条件下培养和再生，随后任选回收和纯化表 达的长链PUFA。
可以将本发明的重组构建体导入一种植物细胞中；或者，作为另 一种选择，可以将每种构建体导入独立的植物细胞中。
在植物细胞中的表达可以如上所述的瞬时或稳定的方式完成。
期望的长链PUFA可以在种子中表达。从这些转化植物获得的种子 或植物部分也包括在本发明的范围内。
植物部分包括分化和未分化的组织，包括但不限于下列部分÷：根、 茎、苗、叶、花粉、种子、肿瘤组织和多种形式的细胞和培养物(如 单个细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可存在于植株或植物 器官、组织或细胞培养物中。
术语“植物器官”指构成植物的形态和功能迥异的部分的植物组 织或组织群。术语“基因组”指：(1)存在于生物的每个细胞、或病 毒或细胞器中的全套遗传物质(基因和非编码序列)；和/或(2)作为 (单倍体)单位从一个亲本遗传的全套染色体。
因此，本发明也涉及用于转化细胞的方法，其包括用本发明的重 组构建体转化细胞并选择用本发明的重组构建体转化了的细胞。
所关注的还有用于产生转化植物的方法，其包括用本发明的Δ-5 去饱和酶多核苷酸转化植物细胞并从转化的植物细胞再生出植株。
已经公布了用于转化双子叶植物(主要使用根癌土壤杆菌 (Agrobacterium tumefaciens))以及获得转基因植物的方法，其中涉及 的植物有：棉花(美国专利No.5,004,863；美国专利No.5,159,135)；大 豆(美国专利No.5,569,834；美国专利No.5,416,011)；芸苔属(美国专 利No.5,463,174)；花生(Cheng等人，Plant Cell Rep.15：653-657(1996)； McKently等人，Plant Cell Rep.14：699-703(1995))；番木瓜(Ling，K. 等人，Bio/technology 9：752-758(1991))；和豌豆(Grant等人，Plant Cell Rep.15：254-258(1995))。其它常用的植物转化方法的综述参见Newell， C.A.(Mol.Biotechnol.16：53-65(2000))。这些转化方法中的一种使 用了发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)(Tepfler，M.和 Casse-Delbart，F.Microbiol.Sci.，4：24-28(1987))。已经公布了使用PEG 融合(PCT公开No.WO92/17598)、电穿孔(Chowrira，G.M.等人，Mol. Biotechnol.3：17-23(1995)；Christou，P等人，Proc.Natl.Acad.Sci.， U.S.A.84：3962-3966(1987))、显微注射和粒子轰击(McCabe，D.E.等 人，Bio/Technology 6：923(1988)；Christou等人，Plant Physiol. 87：671-674(1988))，利用直接递送DNA来转化大豆。
存在多种用于从植物组织再生出植物的方法。具体的再生方法将 取决于初始的植物组织和待再生的具体植物物种。从单个植物原生质 体转化体或从多种转化的外殖体的植物的再生、发育和培养是本领域 熟知的(Weissbach和Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，(编 辑)，Academic：San Diego，CA(1988))。这种再生和生长方法通常包 括如下步骤：选择转化的细胞以及培养那些个体化的细胞通过胚发育 的通常阶段、通过生根的小植株阶段。转基因胚和种子以相似的方式 再生。此后，将所得的转基因的生根的苗种植在合适的植物生长培养 基例如土壤中。优选地，让再生的植物自花授粉以提供纯合的转基因 植物。另外，将从再生植物获得的花粉与农艺学上重要的品系的种子- 繁育的植物杂交。相反，将来自这些重要品系的植物的花粉用于给再 生的植物授粉。用本领域技术人员熟知的方法培养含有所需多肽的本 发明转基因植物。
除了上面讨论的方法，从业人员还熟悉描述下列操作的具体条件 和方法的标准资源资料：大分子(如DNA分子、质粒等)的构建、操 作和分离；重组DNA片段和重组表达构建体的产生；和克隆的筛选和 分离。参见，例如：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor：NY(1989)；Maliga等人，Methods in Plant Molecular Biology，Cold Spring Harbor：NY(1995)；Birren等人，Genome Analysis：Detecting Genes，第1卷，Cold Spring Harbor：NY(1998)； Birren等人，Genome Analysis：Analyzing DNA，第2卷，Cold Spring Harbor：NY(1998)；Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual(编 辑)Clark，Springer：NY(1997)。
油料种子植物的实例包括但不限于：大豆、芸苔属物种、向日葵、 玉米、棉花、亚麻和红花。
具有至少20个碳原子以及四个或更多个碳-碳双健的PUFA的实例 包括但不限于ω-3脂肪酸如EPA、DPA和DHA以及ω-6脂肪酸ARA。从 这些植物获得的种子以及从这些种子获得的油也在本发明的范围内。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及油料种子植物，其包含：
(a)第一重组DNA构建体，
其包含可操作地连接至至少一个调节序列的编码Δ-5去饱和 酶多肽的分离的多核苷酸；和，
(b)至少一种另外的重组DNA构建体，其包含可操作地连接至至 少一个调节序列的编码选自由如下酶组成的组的多肽的分离 的多核苷酸：Δ-4去饱和酶、Δ-5去饱和酶、Δ-6去饱和酶、 Δ-8去饱和酶、Δ-9去饱和酶、Δ-9延长酶、Δ-12去饱和酶、 Δ-15去饱和酶、Δ-17去饱和酶、C14/16延长酶、C16/18延长酶、 C18/20延长酶和C20/22延长酶。
另外的去饱和酶在例如美国专利No.6,075,183、5,968,809、 6,136,574、5,972,664、6,051,754、6,410,288和PCT公开No.WO98/46763、 WO98/46764、WO00/12720和WO00/40705中有所讨论。
所用盒的组合的选择部分取决于待转化的油料种子植物的PUFA概 况和/或去饱和酶/延长酶概况以及将要表达的长链PUFA。
在另一个方面，本发明涉及用于在植物细胞中产生长链PUFA的方 法，其包括：
(a)用本发明的重组构建体转化细胞；以及，
(b)选择产生长链PUFA的那些转化细胞。
在又一个方面，本发明涉及用于在大豆细胞中产生至少一种PUFA 的方法，其包括：
(a)用第一重组DNA构建体转化大豆细胞，该重组构建体包含：
(i)可操作地连接至至少一个调节序列的编码Δ-5去饱和酶 多肽的分离的多核苷酸；
和，
(ii)至少一种另外的重组DNA构建体，该构建体包含 可操作地连接至至少一个调节序列的编码选自由如下酶 组成的组的多肽的分离的多核苷酸：Δ-4去饱和酶、Δ -5去饱和酶、Δ-6去饱和酶、Δ-8去饱和酶、Δ-9去饱和 酶、Δ-9延长酶、Δ-12去饱和酶、Δ-15去饱和酶、Δ-17 去饱和酶、C14/16延长酶、C16/18延长酶、C18/20延长酶和 C20/22延长酶；
(b)从步骤(a)的转化细胞再生大豆植株；
以及，
(c)选择从步骤(b)的植株获得的、与获自非转化大豆植株的种 子的PUFA水平比较时具有改变的PUFA水平的那些种子。
在其它优选的实施方案中，所述的至少一种另外的重组DNA构建 体编码具有Δ-9延长酶活性的多肽，例如分离自或源于绿光等鞭金藻 (Isochrysis galbana)的Δ-9延长酶(GenBank登录号AF390174；IgD9e) 或者分离自或源于小眼虫的Δ-9延长酶。
在其它优选的实施方案中，所述的至少一种另外的重组DNA构建 体编码具有Δ-8去饱和酶活性的多肽。例如，PCT公开No.WO 2005/103253(于2005年4月22日公开)公开了来自盐生巴夫藻的Δ-8去 饱和酶的氨基酸和核酸序列(也参见美国公开No.2005/0273885)。 Sayanova等人，(FEBS Lett.580：1946-1952(2006))描述了来自自由生 活的土壤变形虫卡氏棘变形虫(Acanthamoeba castellanii)的cDNA的 分离和表征，当在鼠耳芥属中表达时，该cDNA编码C20Δ-8去饱和酶。 此外，于2006年4月28日提交的临时申请号为60/795,810的申请人的受 让人共同未决的申请(代理人档案号BB-1566)公开了来自路氏巴夫藻 (CCMP459)的Δ-8去饱和酶的氨基酸和核酸序列。美国临时申请 No.60/853,563(于2006年10月23日提交；代理人档案号BB-1574)公开 了来自Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491、Eutreptiella sp.CCMP389 和Eutreptiella cf_gymnastica CCMP1594的Δ-8去饱和酶的氨基酸和核 酸序列。
微生物表达系统、盒和载体以及转化
本文描述的Δ-5去饱和酶基因和基因产物(即EgD5，或其它突变 酶、经密码子最优化的酶或它们的同源物)也可以在异源微生物宿主 细胞，尤其是含油酵母(如解脂耶氏酵母)的细胞中产生。
含有引导外来蛋白质高水平表达的调节序列的微生物表达系统和 表达载体是本领域技术人员熟知的。这些微生物表达系统和表达载体 的任一种均可用于构建用于产生本发明序列的任何基因产物的嵌合基 因。然后可以将这些嵌合基因通过转化导入进合适的微生物中以提供 所编码的酶的高水平表达。
可用于转化合适的微生物宿主细胞的载体或DNA盒是本领域熟知 的。存在于构建体中的序列的具体选择取决于期望的表达产物(同上)、 宿主细胞的性质以及建议的相对于未转化细胞分离转化细胞的手段。 然而，通常载体或盒含有引导相关基因、选择标记和允许自主复制或 染色体整合的序列的转录和翻译的序列。合适的载体包含控制转录起 始的基因5′区(如启动子)和控制转录终止的DNA片段3′区(如终止子)。 最优选的是，这两个控制区都来源于来自转化的微生物宿主细胞的基 因，尽管应该了解这种控制区不必源自选作生产宿主的特定物种的天然 基因。
可用于驱动本发明Δ-5去饱和酶ORF在期望微生物宿主细胞中表 达的起始控制区或启动子有许多并且是本领域技术人员所熟悉的。实 际上任何能引导这些基因在所选择的宿主细胞中表达的启动子都适用 于本发明。在微生物宿主细胞中的表达可以瞬时或稳定的方式完成。 瞬时表达可通过诱导可操作地连接至所关注的基因的可调节启动子的 活性完成。稳定表达可通过利用可操作地连接至所关注的基因的组成型 启动子实现。举例来说，当宿主细胞为酵母时，提供在酵母细胞中起 作用的转录和翻译区，尤其是来自宿主物种的转录和翻译区(例如， 对于在解脂耶氏酵母中使用的优选的转录起始调节区，参见PCT公开 No.WO 2004/101757和WO 2006/052870)。可以使用许多调节序列的任 意一种，这取决于是期望组成型转录还是诱导型转录、启动子在表达 所关注的ORF中的效率、构建容易性等。
已经发现转录起始密码子‘ATG’周围的核苷酸序列可影响酵母细 胞中的表达。如果期望的多肽在酵母中表达差，则可以将外源基因的 核苷酸序列进行修饰以包含有效的酵母翻译起始序列来获得最优化的 基因表达。对于在酵母中表达，这可以通过将低效率表达的基因与内 源性酵母基因(优选高度表达的基因)框内融合来对其进行定点诱变 而完成。作为另一种选择，人们可以测定宿主中的共有翻译起始序列并 将该序列工程改造到异源性基因中以最优化它们在所关注的宿主中的 表达。
终止区可源于起始区从其获得的基因的3′区或来自不同的基因。大 量的终止区是已知的并且(在用于与它们源自的属和物种相同和不同 的属和物种两者时)在多种宿主中发挥的功能令人满意。终止区的选 择通常更多是为了方便而不是因为任何特殊的性质。优选地，当微生 物宿主为酵母细胞时，终止区来源于酵母基因(尤其是糖酵母属 (Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、假丝酵母属、 耶氏酵母属或克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces))。编码γ-干扰素和α -2干扰素的哺乳动物基因的3′区也已知在酵母中发挥功能。终止控制区 也可以来源于优选宿主的多种天然基因。任选地，终止位点可以是非 必需的；然而，如果包括则是最优选的。尽管无意于限制，但可用于 本公开内容的终止区包括：解脂耶氏酵母细胞外蛋白酶(XPR；GenBank 登录号M17741)的约100bp的3′区；酰基辅酶A氧化酶(Aco3:GenBank 登录号AJ001301和No.CAA04661；Pox3:GenBank登录号XP_503244) 终止子；Pex20(GenBank登录号AF054613)终止子；Pex16(GenBank 登录号U75433)终止子；Lip1(GenBank登录号Z50020)终止子；Lip2 (GenBank登录号AJ012632)终止子；和3-氧代酰基-辅酶A硫解酶 (OCT；GenBank登录号X69988)终止子。
如本领域技术人员所意识到的，仅仅将基因插入到克隆载体中不 能保证它将被成功地以所需要的水平表达。响应于对高表达率的需要， 通过操作许多控制转录、翻译、蛋白质稳定性、氧限制和从微生物宿 主细胞分泌方面的不同遗传元件，已经建立了许多专用的表达载体。 更具体地讲，已经进行操作来控制基因表达的一些分子特征包括：(1) 相关转录启动子和终止子序列的性质；(2)所克隆基因的拷贝数目以 及该基因是质粒携带的还是整合到了宿主细胞的基因组中；(3)所合成 的外来蛋白质的最终细胞定位；(4)蛋白质在宿主生物内的翻译和正确 折叠的效率；(5)所克隆基因的mRNA和蛋白质在宿主细胞内的固有稳 定性；和(6)所克隆基因中的密码子使用，以使得其频率与宿主细胞 的优选密码子使用频率接近。这些类型的修饰的每一种都包含于本发 明中，作为进一步最优化本文所描述的Δ-5去饱和酶的表达的手段。
一旦已经获得适于在合适的微生物宿主细胞(如含油酵母)中表 达的编码多肽的DNA(如包含启动子、ORF和终止子的嵌合基因)，则 将其置于能在宿主细胞中自主复制的质粒载体中，或将其直接整合到 宿主细胞的基因组中。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地发生 或者可以通过使用这样的构建体来靶向，该构建体含有足以靶向宿主 基因座中的重组的与宿主基因组同源的区。如果构建体靶向内源性基因 座，则全部或一些转录和翻译调节区可以由内源性基因座提供。
在本发明中，在解脂耶氏酵母中表达基因的优选方法是将线性 DNA整合到宿主的基因组中；而且，当期望基因高水平表达时，整合 到基因组中的多个位置可以是尤其有用的[如在Ura3基因座(GenBank 登录号AJ306421)、Leu2基因座(GenBank登录号AF260230)、Lys5基 因(GenBank登录号M34929)、Aco2基因座(GenBank登录号AJ001300)、 Pox3基因座(Pox3:GenBank登录号XP_503244；或Aco3：GenBank登录 号AJ001301)、Δ-12去饱和酶基因座(PCT公开No.WO2004/104167)、 Lip1基因座(GenBank登录号Z50020)和/或Lip2基因座(GenBank登录 号AJ012632)]。
有利的是，Ura3基因可反复地与5-氟乳清酸(5-氟尿嘧啶-6-羧酸 一水合物；“5-FOA”)选择(下文)联合使用，以容易地允许基因修饰 以简易的方式整合到耶氏酵母基因组中。
如果两个或更多个基因从独立的复制载体表达，则希望每个载体 具有不同的选择手段并且应该缺乏与其它构建体的同源性以维持稳定 表达和防止元件在构建体之间重配(reassortment)。可用实验方法确定 调节区、选择手段和导入的构建体的增殖方法的明智选择，以便所有导 入的基因都以需要的水平表达从而提供所需产品的合成。
包含目的基因的构建体可以通过任何标准技术导入到微生物宿主 细胞中。这些技术包括转化(如醋酸锂转化[Methods in Enzymology， 194：186-187(1991)])、原生质体融合、基因枪轰击(bolistic impact)、 电穿孔、显微注射或任何将所关注的基因导入宿主细胞中的其它方法。 适用于含油酵母(即解脂耶氏酵母)的更具体的教导包括U.S.4,880,741 和U.S.5,071,764以及Chen，D.C.等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.，48 (2)：232-235(1997))。
为方便起见，已经通过任何方法操纵而来摄取DNA序列(如表达 盒)的宿主细胞在本文中将称为“转化的”或“重组的”。因此，术语 “转化的”和“重组的”在本文中可互换使用。转化的宿主将具有至 少一个拷贝的表达构建体，而且可以具有两个或更多个拷贝，这取决 于该基因是整合到基因组内、被扩增还是存在于具有多拷贝数的染色 体外元件上。
转化的宿主细胞可通过多种选择技术鉴定，如在PCT公开No.WO 2004/101757和WO 2006/052870中描述的。本文使用的优选选择方法是 对卡那霉素、潮霉素和氨基糖苷G418的抗性以及在缺乏尿嘧啶、亮氨 酸、赖氨酸、色氨酸或组氨酸的培养基上生长的能力。在备选的实施 方案中，将5-FOA用于选择酵母Ura-突变体。该化合物对具有编码乳清 苷5′-单磷酸脱羧酶(OMP脱羧酶)的功能性URA3基因的酵母细胞有毒 性；因此，基于这种毒性，5-FOA特别可用于选择和鉴定Ura-突变酵母 菌株(Bartel，P.L.和Fields，S.，Yeast 2-Hybrid System，Oxford University： New York，第7卷，第109-147页，1997)。更具体地讲，人们可以首先 将天然的Ura3基因敲除从而产生具有Ura-表型的菌株，其中基于5-FOA 抗性进行选择。然后，可以将一簇多个嵌合基因和新的Ura3基因整合 至耶氏酵母基因组中的不同基因座，由此产生具有Ura+表型的新菌株。 当将导入的Ura3基因敲除时，后面的整合产生了新的Ura3-菌株(仍利 用5-FOA选择鉴定)。因此，Ura3基因(与5-FOA选择结合)可在多轮 转化中用作选择标记。
转化后，适合于本发明Δ-5去饱和酶(以及任选在宿主细胞中共表 达的其它PUFA酶)的底物可以由宿主自然产生或转基因产生，或者它 们可以从外源提供。
用于表达本发明基因和核酸片段的微生物宿主细胞可以包括在多 种原料(包括简单或复杂的碳水化合物、脂肪酸、有机酸、油和醇类 和/或碳氢化合物)上于广泛的温度和pH值范围内生长的宿主。基于申 请人的受让人的需要，本发明描述的基因将在含油酵母(并且尤其是 解脂耶氏酵母)中表达；但是预期，由于转录、翻译和蛋白质生物合 成装置是高度保守的，任何细菌、酵母、藻类和/或真菌都将是用于表 达本发明的核酸片段的合适的微生物宿主。
然而，优选的微生物宿主是含油酵母。这些生物天然能够合成并 积聚油，其中油可构成超过约25％的细胞干重，更优选超过约30％的细 胞干重，而最优选超过约40％的细胞干重。通常鉴定为含油酵母的属包 括但不限于：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢属、隐球 酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。更具体地讲，示例性的油合成酵 母包括÷：类酵母红冬孢(Rhodosporidium toruloides)、斯达氏油脂酵母 (Lipomyces starkeyii)、产油油脂酵母(L.lipoferus)、拉可夫氏假丝酵 母(Candida revkaufi)、铁红假丝酵母(C.pulcherrima)、热带假丝酵 母(C.tropicalis)、产朊假丝酵母(C.utilis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullans)、皮状丝孢酵母(T.cutaneum)、胶粘红酵母(Rhodotorula glutinus)、禾木科红酵母(R.graminis)和解脂耶氏酵母(以前归类为 解脂假丝酵母(Candida lipolytica))。
最优选的是含油酵母解脂耶氏酵母；而且，在其它实施方案中， 最优选的是命名为ATCC #20362、ATCC #8862、ATCC #18944、ATCC #76982和/或LGAM S(7)1的解脂耶氏酵母菌株(Papanikolaou S.和 Aggelis G.，Bioresour.Technol.82(1)：43-9(2002))。
在历史上，多种解脂耶氏酵母菌株已经被用于生产和制备如下物 质：异柠檬酸裂解酶、脂肪酶、聚羟基链烷酸酯、柠檬酸、赤藓醇、2- 酮戊二酸、γ-癸内酯、γ-十二内酯和丙酮酸。适用于工程化ARA、EPA 和DHA在解脂耶氏酵母中的产生的具体教导分别在美国专利申请 No.11/264784(WO 2006/055322)、美国专利申请No.11/265761(WO 2006/052870)和美国专利申请No.11/264737(WO 2006/052871)中有 提供。
其它优选的微生物宿主包括含油细菌、藻类和其它真菌；而且， 在该广的微生物宿主的组中，特别关注的是合成ω-3/ω-6脂肪酸的微生 物(或那些能被基因工程化而达到该目的的微生物[如其它酵母例如啤 酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)])。因此，例如，用处于诱导型或 调节的启动子控制下的任何本发明的Δ-5去饱和酶基因转化高山被孢 霉(在商业上用于生产ARA)可以产生能合成增加量的DGLA的转化生 物。Mackenzie等人(Appl.Environ.Microbiol.，66：4655(2000))描述 了转化高山被孢霉的方法。类似地，美国7,001,772公开了转化破囊壶 菌目(Thraustochytriales)微生物的方法。
基于上述教导，在一个实施方案中，本发明涉及分别产生ARA或 EPA的方法，该方法包括：
(a)提供含油酵母，其包含：
(i)第一重组DNA构建体，该构建体包含可操作地连接至至 少一个调节序列的编码Δ-5去饱和酶多肽的分离的多核 苷酸；和，
(ii)分别由DGLA或ETA组成的去饱和酶底物的来源；以及，
(b)在存在合适的可发酵碳源的情况下培育步骤(a)的酵母，其 中该编码Δ-5去饱和酶多肽的基因得以表达，并将DGLA转化 成ARA或将ETA转化成EPA；以及，
(c)任选地分别回收步骤(b)的ARA或EPA。
可能需要供给底物。
当然，由于含油酵母中天然产生的PUFA局限于18:2脂肪酸(即LA) 和较不常见的18:3脂肪酸(即ALA)，在本发明的更优选的实施方案中， 将对含油酵母进行基因工程改造以除了本文所述的Δ-5去饱和酶之外 还表达长链PUFA生物合成所必需的多种酶(由此使得能产生如ARA、 EPA、DPA和DHA)。
具体地讲，在一个实施方案中，本发明涉及含油酵母，其包含：
(a)第一重组DNA构建体，该构建体包含可操作地连接至至少一个 调节序列的编码Δ-5去饱和酶多肽的分离的多核苷酸；和，
(b)至少一种另外的重组DNA构建体，其包含
可操作地连接至至少一个调节序列的编码选自由下列酶组成的组 的多肽的分离的多核苷酸：Δ-4去饱和酶、Δ-5去饱和酶、Δ-6去饱和 酶、Δ-9去饱和酶、Δ-12去饱和酶、Δ-15去饱和酶、Δ-17去饱和酶、 Δ-9延长酶、C14/16延长酶、C16/18延长酶、C18/20延长酶和C20/22延长酶。
在特别优选的实施方案中，所述至少一种另外的重组DNA构建体 编码具有Δ-9延长酶活性的多肽，如分离自或源于绿光等鞭金藻的Δ-9 延长酶(GenBank登录号AF390174；IgD9e或IgD9eS)或分离自或源于 小眼虫的Δ-9延长酶。
微生物中ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成的代谢工程改造
操纵生化途径的方法是本领域技术人员所熟知的；而且，预计很 多操纵将可能使含油酵母并且尤其是解脂耶氏酵母中的ω-3和/或ω-6 脂肪酸的生物合成达到最大程度。这种操纵可能需要直接在PUFA生物 合成途径中进行代谢工程改造或需要额外的协同操纵多种其它代谢途 径。
对于在PUFA生物途径内的操纵，期望增加LA的产生以使得能增加 ω-6和/或ω-3脂肪酸的产生。引入和/或扩增编码Δ-9和/或Δ-12去饱和 酶的基因可能会实现该期望。为了最大水平的产生ω-6不饱和脂肪酸， 本领域的技术人员熟知，在基本不含有ALA的宿主微生物中所述产生 是有利的；因此，优选地，通过移除或抑制允许LA转化成ALA的Δ-15 或ω-3型去饱和酶活性来选择或获得宿主。作为另一种选择，可能期望 最大程度的产生ω-3脂肪酸(而最小程度地合成ω-6脂肪酸)。在该实 例中，人们可使用其中允许油酸转化成LA的Δ-12去饱和酶活性被移除 或抑制的宿主微生物；随后，将合适的表达盒连同用于转化成ALA的 ω-3脂肪酸衍生物(如STA、ETrA、ETA、EPA、DPA、DHA)的合适 底物(如ALA)一起导入宿主中。
在备选的实施方案中，与ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径竞争 能量或碳的生化途径或干扰特定PUFA终产物产生的天然PUFA生物合 成途径中的酶可以通过基因破坏来去除或通过其它手段(如反义 mRNA)来下调。
在PUFA生物合成途径中作为增加ARA、EPA或DHA的手段的操纵 (及其相关技术)的详细讨论分别在PCT公开No.WO 2006/055322、WO 2006/052870和WO 2006/052871中给出，在TAG生物合成途径和TAG降 解途径中的所需的操纵(及其相关技术)也在其中给出。
在本发明的内容中，通过上述策略中的任意一种来调节脂肪酸生 物合成途径的表达都可能是有用的。例如，本发明提供了方法，通过 该方法，编码Δ-9延长酶/Δ-8去饱和酶生物合成途径中的关键酶的基因 被导入含油酵母中用以产生ω-3和/或ω-6脂肪酸。利用对宿主生物进 行代谢工程改造的多种手段，使该Δ-5去饱和酶基因在天然不具有ω-3 和/或ω-6脂肪酸生物合成途径的含油酵母中表达并协调这些基因的表 达，以最大程度地产生优选的PUFA产物将是特别有用的。
PUFA产生的微生物发酵工艺
将转化的宿主细胞在最优化去饱和酶嵌合基因的表达并且产生最 大且最经济产量的期望PUFA的条件下生长。通常，可以被最优化的培 养基条件包括碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物 离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物量生产期的时长、油积聚期 的时长以及细胞收获的时间和方法。解脂耶氏酵母通常生长在复合培 养基(如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖液体培养基(YPD))或缺乏生长 所必需的成分并由此强迫选择所需表达盒的确定成分的极限培养基中 (如Yeast Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI))。
本发明的发酵培养基必须含有合适的碳源。PCT公开No.WO 2004/101757中教导了合适的碳源。尽管预期本发明中利用的碳源可以 涵盖许多种含碳源，但优选的碳源是糖类、甘油和/或脂肪酸。最优选 的碳源是葡萄糖和/或含有10-22个碳的脂肪酸。
氮可以由无机来源(如(NH4)2SO4)或有机来源(如尿素或谷氨 酸)提供。除了合适的碳源和氮源，发酵培养基还必须含有合适的矿 物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素和本领域技术人员已知的适合含油 宿主生长并促进PUFA产生所必需的酶促途径的其它组分。要特别注意 促进脂质和PUFA合成的几种金属离子(如Mn+2、Co+2、Zn+2、Mg+2) (Nakahara，T.等人，Ind.Appl.Single Cell Oils，D.J.Kyle和R.Colin(编 辑).pp61-97(1992))。
本发明中优选的生长培养基是普通的商业制备的培养基，例如 Yeast Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)。也可以使用其 它确定成分的生长培养基或合成的生长培养基，且适于转化宿主细胞生 长的培养基对微生物学或发酵科学领域的技术人员来说将是已知的。 适于发酵的pH范围通常在约pH4.0至pH8.0之间，其中优选pH5.5至 pH7.5作为初始生长条件的范围。发酵可以在有氧或厌氧条件下进行， 其中优选为微好氧条件。
通常，在含油酵母细胞中积聚高水平的PUFA需要两个阶段的过程， 因为代谢状态必须在生长和脂肪的合成/贮存之间达到“平衡”。因此， 最优选的是，两个阶段的发酵过程是在含油酵母(如解脂耶氏酵母) 中产生PUFA所必需的。这种方法在PCT公开No.WO 2004/101757中有所 描述，其也描述了多种合适的发酵工艺设计(即分批式、补料分批式和 连续式)和生长过程中的注意事项。
PUFA油的纯化和加工
PUFA可以以游离脂肪酸或以酯化的形式(例如酰基甘油、磷脂、 硫脂或糖脂)存在于宿主微生物和植物中，而且可以通过本领域熟知 的多种手段从宿主细胞提取。关于酵母脂质的提取技术、质量分析和 可接受标准的一篇综述是Z.Jacobs(Critical Reviews in Biotechnology， 12(5/6)：463-491(1992))的综述。有关下游加工的简述也可由A.Singh 和O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.，45：271-312(1997))提供。
通常，用于纯化PUFA的手段可以包括用有机溶剂提取、超声处理、 超临界流体萃取(如使用二氧化碳)、皂化和物理手段例如挤压，或它 们的组合。另外的详细信息可参考PCT公开WO 2004/101757的教导。 分离种子油的方法是本领域熟知的：(Young等人，Processing of Fats and Oils，The Lipid Handbook，Gunstone等人编辑，第5章第253-257页； Chapman & Hall：London(1994))。例如，大豆油是利用涉及从含油种 子提取并纯化食用油产品在内的一系列步骤产生的。大豆油和大豆副 产品是利用表3中所示出的一般步骤产生的。
表3
大豆油和副产品产生的一般步骤
  加工 步骤 工艺 去除的杂质和/或 获得的副产品 #1 大豆种子 #2 油提取 粗粉 #3 脱胶 卵磷脂 #4 碱或物理精炼 胶、游离脂肪酸、色素 #5 水洗 皂 #6 漂白 颜色、皂、金属 #7 (氢化) #8 (冬化) 硬脂酸甘油酯 #9 脱臭 游离脂肪酸、生育酚、固醇、挥 发物 #10 油产品
更具体地讲，将大豆种子清洗、调和、去皮和切成薄片，从而增加 油提取的效率。油提取通常通过溶剂(如己烷)萃取来完成，但也可 通过物理加压和/或溶剂萃取的组合来实现。将所得油称为粗油。粗油 可以通过使磷脂和其它促进它们与非水合的甘油三酯级分(大豆油) 分离的极性和中性脂质复合物水合来进行脱胶。可以将所得卵磷脂胶 进一步加工以制成在多种食物和工业产品中用作乳化和隔离(即抗粘) 剂的具有重要商业价值的卵磷脂产品。可以进一步精炼脱胶的油脂以 除去杂质(主要为游离脂肪酸、色素和残留的胶)。精炼可以通过加入 与游离脂肪酸反应形成皂以及使粗油中的磷脂和蛋白质水合的苛性试 剂完成。用水冲洗掉在精炼过程中形成的痕量皂。皂料副产品可以直 接用于动物饲料或经酸化以回收游离脂肪酸。可以通过用除去大部分 叶绿素和类胡萝卜素化合物的漂白土吸附去除颜色。可以将精炼的油 氢化，从而得到具有多种熔化性和质构的脂肪。可将冬化(分级分离) 用于除去氢化油中的硬脂酸甘油酯，这通过在小心控制的冷却条件下的 结晶进行。脱臭(主要通过在真空下蒸汽蒸馏进行)是最后的步骤并 设计用以除去赋予油气味或风味的化合物。其它有价值的副产品如生 育酚和固醇也可以在脱臭过程中移出。含有这些副产物的脱臭馏出液 可以出售，用于生产天然维生素E和其它高价值的药物产品。经精炼、 漂白、(氢化、分级分离)和脱臭的油和脂肪可以进行包装并直接出售 或者可以进一步加工成更特化的产品。大豆种子加工、大豆油生产和 副产品利用的更详细参考可在Erickson，Practical Handbook of Soybean Processing and Utilization，The American Oil Chemists′Society and United Soybean Board(1995)中找到。大豆油在室温下呈液态，因为 与诸如椰子、棕榈、棕榈仁和可可油之类的油相比，它的饱和脂肪酸 含量相对较低。
可以将经精炼和/或纯化的含PUFA的植物和微生物油氢化，从而产 生具有多种熔化性和质构的脂肪。许多加工的脂肪(包括涂抹料、糖 果用脂肪、硬质脂肪、人造黄油和烘烤用起酥油等)要求在室温下有不 同的固化程度并且只能通过改变源油的物理性质产生。这最普遍通过 催化氢化来实现。
氢化是其中在催化剂(例如镍)的帮助下将氢添加到不饱和脂肪 酸双键上的化学反应。例如，高油酸大豆油含有不饱和油酸、LA和亚 麻酸脂肪酸，而这些脂肪酸的任何一种都可被氢化。氢化具有两个主 要作用。第一，油的氧化稳定性由于不饱和脂肪酸含量减少而增加。 第二，油的物理性质改变，因为脂肪酸修饰增加了熔点，导致在室温 下为半液体或固体的脂肪。
存在许多影响氢化反应的变量，这些变量继而改变终产物的组成。 包括压力、温度、催化剂类型和浓度、搅拌和反应器设计在内的操作 条件是可控制的较重要参数中的一些。选择性氢化条件可用于氢化更 不饱和的脂肪酸(优先于较少不饱和的脂肪酸)。非常轻微地或部分氢 化通常用于增加液体油的稳定性。进一步的氢化使液体油转化成物理 形态为固体的脂肪。氢化的程度取决于为具体终产物设计的期望的性 能和熔化特性。液体起酥油(用于制备烘烤产品、固体脂肪和用于商 业油炸和烘烤操作的起酥油)和用于人造黄油生产的基本原料是通过 氢化获得的很多可能的油和脂肪产品中的一些。氢化和氢化产品的更 详细的描述可在如下文献中找到：Patterson，H.B.W.，Hydrogenation of Fats and Oils：Theory and Practice.The American Oil Chemists’Society (1994)。
由于存在由氢化处理产生的反式-脂肪酸异构体，氢化油已经变得 多少有些令人争议。摄入大量的反式异构体已经与有害的健康影响相 联系，包括血浆中低密度和高密度脂蛋白比率增加和冠心病的风险增 加。
含PUFA油在食品中的用途
市场目前支持许多种掺入了ω-3和/或ω-6脂肪酸(尤其是ARA、 EPA和DHA)的食物和饲料产品。预期含有PUFA的本发明的植物/种子 油、改变的种子和微生物油将在食物和饲料产品中起作用以赋予当前 制剂的健康益处。与其它植物油相比，从物理学观点看，据信本发明 的油与食物应用中的其它油的作用相似(例如，部分氢化的油例如大 豆油可广泛用作软涂抹料、人造黄油和烘烤和油炸用起酥油的成分)。
本文所述的含有ω-3和/或ω-6脂肪酸的植物/种子油、改变的种子 和微生物油将适用于许多种食物和饲料产品，包括但不限于：食物模拟 物、肉产品、谷类产品、烘烤食物、小吃和乳制品。此外，本发明的植 物/种子油、改变的种子和微生物油可用于制剂中以在医疗食物(包括 医疗营养品、膳食补充剂、婴儿代乳品以及药物产品)中赋予健康益 处。食物加工和食物配制领域的技术人员将了解植物和微生物油的量 和组成是如何加入至食物或饲料产品中的。该量在本文中将称为“有 效”量并将取决于食物或饲料产品、期望补充该产品的膳食或医疗食 物或医疗营养品打算纠正或治疗的医学状况。
食物模拟物可用本领域技术人员熟知的工艺制备。可提及的是肉 模拟物、干酪模拟物、乳模拟物等。用大豆制备的肉模拟物含有大豆 蛋白或豆腐以及其它混合在一起用以模拟多种肉类的成分。这些肉替 代物作为冷冻、罐装或干燥食物出售。通常，它们可以与它们所代替 的食物相同的方式使用。用大豆制备的肉替代物是蛋白质、铁和B族维 生素的极好来源。肉模拟物的实例包括但不限于：火腿模拟物、香肠 模拟物、熏肉模拟物等。
食物模拟物可根据它们的功能和组成性质分为仿制品或替代品。 例如，仿制干酪只需要与其设计代替的干酪相似。然而，产品只有在 它与其所替代的干酪在营养上等价并满足该干酪最低组成要求时，通 常才可称为替代干酪。因此，替代干酪通常将具有比仿制干酪更高的蛋 白质水平并且富含维生素和矿物质。
乳模拟物或非乳制品食品包括但不限于仿制乳和非乳制品冷冻甜 食(如那些用大豆和/或大豆蛋白产品制得的产品)。
肉产品涵盖了很多种产品。在美国，“肉”包括产自牛、猪和羊的 “红肉”。除了红肉，还有禽类肉，其包括鸡肉、火鸡肉、鹅肉、珍珠 鸡肉、鸭肉和鱼肉及贝类。存在许多种类的风干的肉产品和加工的肉 产品：新鲜、熏制和油炸的肉产品以及熏制和煮熟的肉产品。香肠和 热狗是加工的肉产品的实例。因此，如本文使用的术语“肉产品”包 括但不限于加工的肉产品。
谷类食品是来源于粮谷加工的食品。粮谷包括来自产生可食用谷 粒(种子)的禾本科的任何植物。最普及的谷物是大麦、玉米、稷、 燕麦、奎奴亚藜、稻、黑麦、高粱、黑小麦、小麦和野生稻。谷类食品 的实例包括但不限于：整个谷物、粉碎的谷物、粗磨粉、面粉、糠、 胚芽、早餐谷类食物、挤出的食物、意大利面食等。
烘烤食品包括上述的任何谷类食品并且已经经过烘烤或与烘烤相 当的方式(即通过接受热处理来干燥或硬化)加工。烘烤食品的实例 包括但不限于：面包、蛋糕、炸面圈、脆条(bars)、意大利面食、面 包屑、烘烤小吃、迷你饼干、迷你脆饼干、迷你曲奇饼和迷你椒盐卷饼。 如上面所提及的，本发明的油可用作配料。
小吃食品包括上文或下文中所描述的任何食品。
油炸食品包括经油炸过的上文或下文中所描述的任何食品。
保健食品是任何能赋予健康益处的食品。许多源于油料种子的食品 可以认为是保健食物。
饮料可以是液体或干粉的形式。
例如，可提及非充碳酸气的饮料如新鲜的、冷冻的、罐装的或浓缩 的果汁；调味的或普通的乳饮料等。成年人和婴儿营养代乳品是本领域 熟知且可商业获得的(例如来自Ross Products Division，Abbott Laboratories的和)。
婴儿代乳品是喂养婴儿和幼儿的液体或复配粉末。“婴儿代乳品” 在本文中定义为可替代人母乳喂养婴儿的肠内营养产品，并且通常由 与水溶液中的理想百分比的碳水化合物及蛋白质混合的理想百分比的 脂肪组成(例如，参见美国专利No.4,670,285)。基于世界范围的组成研 究以及专家组确定的水平，普通人母乳通常含有约0.20％至0.40％的总 脂肪酸(承担了来自脂肪的约50％的卡路里)；而一般来说DHA和ARA 的比率的范围应该是约1:1至1:2(参见，例如Enfamil LIPILTM(Mead Johnson & Company)和Similac AdvanceTM(Ross Products Division， Abbott Laboratories的配方))。婴儿代乳品在婴儿的膳食中具有特殊的 作用，因为它们常常是婴儿的唯一营养来源；而且，虽然母乳喂养仍 然是婴儿的最佳营养品，但婴儿代乳品是非常接近的不仅使婴儿存活而 且使婴儿健壮的第二大营养品。
乳制品是来源于乳的产品。乳模拟物或非乳制品产品来源于乳以外 的来源，如上面讨论的豆奶。这些产品包括但不限于：全脂乳、脱脂乳、 发酵乳制品如酸乳酪或酸乳、奶油、黄油、甜炼乳、脱水乳、调咖啡白 油、咖啡乳脂、冰淇淋和干酪等。
其中可包含本发明的含PUFA油的另外的食品是例如口香糖、糖果 和糖衣、明胶和布丁、硬糖和软糖、果酱和果冻、白砂糖、糖替代物、 甜沙司、浇头和糖浆以及干掺合型粉末混合物。
含PUFA的油在保健食品和药物中的用途
保健食品是赋予健康益处的任何食品，并包括功能性食物、医疗 食物、医疗营养品和膳食补充剂。此外，本发明的植物/种子油、改变 的种子和微生物油可以用于标准药物组合物中(如含有长链PUFA的油 能容易地掺入到任何上述的食品中，由此产生功能性食物或医疗食 物)。包含PUFA的更浓缩的制剂包括可用作人或非人动物的膳食补充 剂的胶囊、粉末、片剂、软凝胶、软胶囊剂(gelcaps)、液体浓缩剂和 乳剂。
含PUFA的油在动物饲料中的用途
动物饲料在本文一般定义为旨在用作非人动物的饲料或混合在饲 料中的产品。本发明的植物/种子油、改变的种子和微生物油可用作多 种动物饲料中的配料。
更具体地讲，尽管不限于此，预期本发明的油可用于宠物食品、 反刍动物食品和家禽食品以及水产动物食品中。宠物食品是那些旨在 饲喂宠物(如狗、猫、鸟、爬行动物和啮齿动物)的产品。这些产品 可以包括上面的谷物和保健食品以及肉和肉副产品、大豆蛋白产品、 草和干草产品(如苜蓿、梯牧草、燕麦或雀麦草、蔬菜)。反刍动物食 品和家禽食品是那些其中产品旨在饲喂动物(如火鸡、鸡、牛、猪) 的产品。与上面的宠物食物一样，这些产品可以包括谷物和保健食品、 大豆蛋白产品、肉类和肉类副产品以及如上面所列的草和干草产品。 水产动物食品(或“水产饲料(aquafeeds)”)是旨在用于水产养殖场(即 涉及在淡水或海水中繁殖、培养或饲养水生生物和/或动物的场所)的 那些产品。
实施例
本发明在下列实施例中进一步说明。应该理解，这些实施例尽管 说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上 面的论述和这些实施例，本领域的技术人员能确定本发明的基本特征， 并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对本发明做出多种改 变和修饰，以使其适用于多种用法和条件。
一般方法
实施例中使用的标准的重组DNA技术和分子克隆技术是本领域所 熟知的并且在如下文献中有所描述：1.)Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和 Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(Maniatis)；2.) T.J.Silhavy、M.L.Bennan和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)； 以及3.)Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology， Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ (1987)。
适用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是本领域熟知 的。适用于下面实施例的技术可在Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow， Eugene W.Nester，Willis A.Wood、Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips编 辑)，American Society for Microbiology：Washington，D.C.(1994))；或 ThomasD.Brock in Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第2版，Sinauer Associates：Sunderland，MA(1989)的描 述中找到。除非另外说明，否则用于微生物细胞的生长和维持的所有试 剂、限制性内切酶和材料均获自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、 DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD) 或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。大肠杆菌(E.coli) (XL1-Blue)感受态细胞购自Stratagene Company(San Diego，CA)。 大肠杆菌菌株通常于37℃在Luria Bertani(LB)平板上培养。
一般的分子克隆根据标准方法(Sambrook等人，同上)来完成。 DNA序列是在ABI自动测序仪上采用染料终止剂技术(美国专利 5,366,860；EP 272,007)使用载体和插入片段特异性引物的组合来产生 的。序列编辑在Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI) 中完成。所有的序列代表在两个方向均至少覆盖两次。基因序列的比 较使用DNASTAR软件(DNASTAR Inc.，Madison，WI)完成。
缩写的含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”表示小时， “d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示 微摩尔浓度，“mM”表示毫摩尔浓度，“M”表示摩尔浓度，“mmol”表 示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表 示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对而“kB”表示千碱基对。
解脂耶氏酵母的转化和培养
解脂耶氏酵母菌株ATCC #20362购自美国典型培养物保藏中心 (Rockville，MD)。解脂耶氏酵母菌株通常在28℃下于YPD琼脂(1％酵 母提取物、2％细菌用蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)上培育。
除非另外说明，否则解脂耶氏酵母的转化根据Chen，D.C.等人 (Appl.Microbiol Biotechnol.，48(2)：232-235(1997))的方法完成。 简而言之，将耶氏酵母划线到YPD平板上，并在30℃下培育大约18小 时。从平板上刮掉几大环量的细胞并将其重悬浮于含有下面成分的1mL 转化缓冲液中：2.25mL 50％ PEG，平均分子量为3350；0.125mL 2M醋 酸锂，pH6.0；0.125mL 2M DTT；以及50μg已剪切的鲑精DNA。然后， 将大约500ng线性化的质粒DNA在100μl重悬浮的细胞中孵育，并将其 在39℃下维持1小时，每间隔15分钟进行涡旋混合。将细胞铺平板在选 择培养基平板上并在30℃下维持2至3天。
为了选择转化体，一般使用极限培养基(“MM”)；MM的组成如下： 不含硫酸铵或氨基酸的0.17％酵母氮基质(DIFCO Laboratories，Detroit， MI)、2％葡萄糖、0.1％脯氨酸，pH6.1。视需要加入尿嘧啶补充剂至终 浓度0.01％(由此产生用20g/L琼脂制备的“MMU”选择培养基)。
备选地，将转化体在5-氟乳清酸(“FOA”；也称为5-氟尿嘧啶-6- 羧酸一水合物)选择培养基上进行选择，该培养基包含：不含硫酸铵 或氨基酸的0.17％酵母氮基质(DIFCO Laboratories)、2％葡萄糖、0.1％ 脯氨酸、75mg/L尿嘧啶、75mg/L尿苷、900mg/L FOA(Zymo Research Corp.，Orange，CA)和20g/L琼脂。
解脂耶氏酵母的脂肪酸分析
为了进行脂肪酸分析，将细胞通过离心收集并如Bligh，E.G.& Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.，37：911-917(1959))中所描述的 提取脂质。脂肪酸甲酯通过将脂质提取物与甲醇钠进行酯交换作用而 制备(Roughan，G.和Nishida I.，Arch Biochem Biophys.，276(1)：38-46 (1990))并随后将其用配有30-m×0.25mm(i.d.)HP-INNOWAX (Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard 6890气相色谱仪(GC)分析。 烘箱温度以3.5℃/min从170℃(保持25min)升到185℃。
为了进行直接的碱催化酯交换反应，收获耶氏酵母培养物(3mL)， 在蒸馏水中洗涤一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5-10分钟。将甲 醇钠(100μl，1％)加入至样品中，然后将样品涡旋并摇动20分钟。加 入3滴1M NaCl和400μl己烷后，将样品涡旋并离心。移出上层并如上描 述的用GC进行分析。
实施例1
小眼虫的生长条件、脂质概况和mRNA分离
小眼虫从密歇根州立大学(East Lansing，MI)的Richard Triemer博士 的实验室获得。从10mL活性生长的培养物，将1mL等分试样转移至500mL 玻璃瓶中的250mL小眼虫(Eg)培养基。Eg培养基通过在970mL水中合并 1g醋酸钠、1g牛肉膏(产品目录号U126-01，Difco Laboratories，Detroit， MI)、2g 胰蛋白胨(产品目录号0123-17-3，Difco Laboratories)和 2g 酵母提取物(产品目录号0127-17-9，Difco Laboratories)而制备。 在过滤灭菌后，在无菌条件下加入30mL土壤-水上清液(产品目录号 15-3790，Carolina Biological Supply Co.，Burlington，NC)而得到最终的 Eg培养基。采用16小时光照8小时黑暗周期，将小眼虫培养物在23℃培养 两周，不进行搅动。
2周后，移出10mL培养物用于脂质分析并在1,800×g下离心5分钟。将 沉淀用水洗涤一次并再次离心。将所得的沉淀在真空下干燥5分钟，重悬 浮于100μL氢氧化三甲基锍(TMSH)中并在室温下摇晃孵育15分钟。 随后，加入0.5mL己烷并将小瓶在室温下摇晃孵育15分钟。使用配有 Omegawax320熔融石英毛细管柱(产品编号#24152，Supelco Inc.，Bellefonte，PA)的Hewlett-Packard 6890气相色谱仪对脂肪酸甲酯 (从己烷层取5μL注射上样)进行分离和定量。用程序控制烘箱温度 在220℃下保持2.7分钟，以20℃/min上升到240℃并随后另外保持2.3分 钟。载气由Whatman氢发生器提供。将保留时间与那些市售的甲酯标准 品(目录号#U-99-A，Nu-Chek Prep Inc.，Elysian，MN)的保留时间比较， 且所得色谱图在图2中示出。
将剩余的培养了2周的培养物(240mL)通过在1,800×g下离心10分钟 得到沉淀，用水洗涤一次并再次离心。利用RNA STAT-60TM试剂 (TEL-TEST，Inc.，Friendswood，TX)并根据生产商提供的方法(使用 5mL试剂，将RNA溶解于0.5mL水中)从得到的沉淀提取总RNA。以这种 方式，从沉淀获得了1mg的总RNA(2mg/mL)。利用mRNA纯化试剂盒 (mRNA Purification Kit)(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)根据 生产商提供的方法从1mg总RNA分离mRNA。以这种方式，获得了85μg mRNA。
实施例2
小眼虫cDNA合成
用如下方法直接从小眼虫的mRNA合成cDNA。具体地讲，将总RNA 用来自Invitrogen 3′-RACE试剂盒(Carlsbad，CA)中的接头引物AP(SEQ ID NO：65)在存在BD-Clontech CreatorTM SmartTM cDNA文库试剂盒 (Mississauga，ON，加拿大))中的Smart IV寡核苷酸(SEQ ID NO：66) 时引发。利用3′-RACE试剂盒中的Superscript II逆转录酶根据CreatorTM SmartTM cDNA文库试剂盒的方法进行逆转录。
将第一链cDNA合成混合物用作用于PCR扩增的模板，将AP用作3′ 引物而CDSIII 5′引物(SEQ ID NO：36)用作5′引物(与BD-Clontech CreatorTM SmartTM cDNA文库试剂盒一起提供)。利用Clontech Advantage cDNA聚合酶混合物在如下条件下进行扩增：94℃30秒，然后是20个 循环的94℃10秒和68℃6分钟。在68℃下进行7分钟最后的延伸反应。
实施例3
小眼虫Δ-5去饱和酶基因的一部分编码区的分离
本实施例描述了通过利用源于其它已知的Δ-5和Δ-8去饱和酶序 列的保守区的引物，鉴定编码Δ-5去饱和酶(本文称为“EgD5”(SEQ ID NO：1和2)的一部分小眼虫的基因。
在评价哪种去饱和酶可以使得能设计适合于分离小眼虫Δ-5去饱和 酶的简并引物时，做了多种考虑。具体地讲，申请人知道只有Δ-5、Δ -6和Δ-8去饱和酶序列在它们的N末端包含保守的‘HPGG’基序(其中 ‘HPGG’结构域是熟知的细胞色素B5结构域的部分)；比较而言，Δ-9 去饱和酶在它们的C-末端具有细胞色素B5结构域的‘HPGG’基序，而 Δ-17和Δ-12去饱和酶二者均缺乏细胞色素B5结构域。据推断，Δ-9延 长酶/Δ-8去饱和酶途径在小眼虫中起作用；因此，在共有N末端保守的 ′HPGG′基序的去饱和酶中，预期只有Δ-5和Δ-8去饱和酶存在于该生物 中。最后，尽管只有少数Δ-8去饱和酶序列是已知的，但许多Δ-5去饱 和酶是可公开获得的。本申请人选择了那些与“传统的”Δ-5去饱和酶 基因具有较低同源性但彼此之间也共有高度同源性的Δ-5去饱和酶序 列。
基于上述内容，采用DNASTAR软件的MegAlignTM程序中的Clustal W方法(慢的，精确的，Gonnet选项；Thompson等人，Nucleic Acids Res.，22：4673-4680(1994))对下面表3中示出的四种Δ-5去饱和酶和两 种Δ-8去饱和酶进行了比对。
表3
进行比对来鉴定氨基酸保守区的Δ-5和Δ-8去饱和酶
  去饱和 酶 生物 参考 SEQ ID NO： Δ-5 畸雌腐霉 GenBank登录号AAL13311 12 Δ-5 大雄疫霉 GenBank登录号CAD53323 13 Δ-5 三角褐指藻 GenBank登录号AAL92562 14 Δ-5 盘基网柄菌 GenBank登录号XP_640331 15 Δ-8 小眼虫 PCT公开No.WO 2006/012325 和No.WO 2006/012326 16 Δ-8 路氏巴夫藻 实施例12(下文) 18
图3示出了一部分所得的比对结果，该部分含有几段在6种不同生 物之间保守的氨基酸序列。基于该比对，设计了两组简并寡核苷酸来 扩增来自小眼虫的Δ-5去饱和酶基因的一部分编码区，其对应于图3中 标记为“保守区1”和“保守区2”的区域。具体地讲，设计了对应保守区 1的保守氨基酸序列GHH(I/V)YTN(SEQ ID NO：19)，同时设计了对 应保守区2的保守氨基酸序列N(Y/F)Q(V/I)EHH(SEQ ID NO：20)。 为了减少寡核苷酸的简并性，设计了4组编码保守区1的寡核苷酸(即 5-1A、5-1B、5-1C和5-1D)；并设计了4组编码保守区2的反义链的寡核 苷酸(即5-5AR、5-5BR、5-5CR和5-5DR)。
表4
用于扩增来自小眼虫的Δ-5去饱和酶基因的简并寡核苷酸
  寡核苷酸名称 序列 SEQ ID NO 5-1A GGHCAYCAYRTBTAYACAAA SEQ ID NO：27 5-1B GGHCAYCAYRTBTAYACCAA SEQ ID NO：28 5-1C GGHCAYCAYRTBTAYACGAA SEQ ID NO：29 5-1D GGHCAYCAYRTBTAYACTAA SEQ ID NO：30 5-5AR TGRTGVACAAYYTGRWARTT SEQ ID NO：31 5-5BR TGRTGVACTAYYTGRWARTT SEQ ID NO：32 5-5CR TGRTGVACCAYYTGRWARTT SEQ ID NO：33 5-5DR TGRTGVACGAYYTGRWARTT SEQ ID NO：34
[注意：用于SEQ ID NO：27至SEQ ID NO：34的 核酸简并代码如下：R＝A/G；Y＝C/T；W＝A/T；B＝G/T/C；V＝G/A/C 而H＝A/C/T。]
基于表3中Δ-5序列的全长序列，推断上述扩增的小眼虫Δ-5基因片 段的长度将为约600bp(其N末端缺少约210个氨基酸，而其C-末端缺少 70个氨基酸)。
总共进行了16次不同的PCR扩增，因为检测了所有的引物组合(即 引物5-1A分别与5-5AR、5-5BR、5-5CR和5-5DR中的每一个单独联用； 类似地，引物5-1B分别与5-5AR、5-5BR、5-5CR和5-5DR中的每一个联 用；等)。PCR扩增在包含如下成分的50μl总体积中进行：PCR缓冲液 (含有10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH8.75)、2mM MgSO4、0.1％ Triton X-100)、100μg/mL BSA(终浓度)、200μM的每种 脱氧核糖核苷酸三磷酸、10pmole的每种引物、10ng小眼虫的cDNA以及 1μl的Taq DNA聚合酶(Epicentre Technologies，Madison，WI)。热循环 仪的条件设定为：95℃ 1分钟，56℃ 30秒和72℃ 1分钟，35个循环， 随后在72℃进行10分钟的最后延伸。
使用Qiagen PCR纯化试剂盒(Valencia，CA)纯化PCR产物。在1％ (w/v)琼脂糖中进行凝胶电泳后，将接近预期大小的一个片段进一步 纯化并随后克隆到pGEM-T-easy载体(Promega，Madison，WI)中。将 连接的DNA用于转化大肠杆菌DH10B的细胞，并且在含有氨苄青霉素 (100μg/mL)的LB(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％细菌用酵母提取物和1％ NaCl)琼脂上选择转化体。对得自一组12个转化体的质粒DNA进行的 分析证实存在预期大小的插入片段(质粒称为“pT-F10-1”、“pT-F10-2”、 “pT-F10-3”等直至“pT-F10-12”)。
序列分析显示pT-F10-1含有590bp的片段(SEQ ID NO：4)，其编码 196个氨基酸(SEQ ID NO：5)(包括对应于保守区1和2的氨基酸)。小 眼虫序列的特性通过进行BLAST(基本的局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)；Altschul，S.F等人，J.Mol.Biol.，215：403-410 (1993))搜索来寻找与BLAST“nr”数据库(包含所有非丰余GenBank CDS的翻译序列，来源于三维结构Brookhaven Protein Data Bank、 SWISS-PROT蛋白质序列数据库、EMBL和DDBJ数据库的序列)中含 有的序列的相似性来确定。采用由国家生物技术信息中心(NCBI)提 供的BLASTN算法，分析该序列与包含在“nr”数据库中的所有可公开 获得的DNA序列的相似性。采用由NCBI提供的BLASTX算法(Gish，W. 和States，D.J.，Nature Genetics，3：266-272(1993))，比较SEQ ID NO：4 与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的蛋白质序列的相似性。
根据百分比同一性、百分比相似性和期望值，报告了BLASTX比较 的结果，该结果总结了与SEQ ID NO：4具有最大相似性的序列。“百分 比同一性”定义为两种蛋白质之间相同的氨基酸的百分比。“百分比相 似性”定义为两种蛋白质之间相同的或保守的氨基酸的百分比。“期望 值”用给定分值估计限定匹配数的匹配的统计显著性，该匹配数是在完 全偶然地搜索数据库中这种大小片段时所预期的。因此，SEQ ID NO：4 的翻译的氨酸酸序列(即SEQ ID NO：5)与假微型海链藻的Δ-8鞘脂去 饱和酶的氨酸酸序列(GenBank登录号AAX14502；SEQ ID NO：21)具 有38％的同一性和53％的相似性，期望值为5E-28；此外，SEQ ID NO：4 的部分片段与三角褐指藻的Δ-5脂肪酸去饱和酶(GenBank登录号 AAL92562；SEQ ID NO：14)具有37％的同一性和52％的相似性，期望 值为7E-28。
实施例4
小眼虫Δ-5去饱和酶基因的5′编码区的分离
为了分离在实施例3中鉴定的推定的Δ-5去饱和酶的N末端部分， 使用了基于来自两个不同公司(即Invitrogen和BD-Clontech)的RACE 方法的改良的5′RACE技术。
简而言之，将小眼虫的双链cDNA(实施例2)在5′RACE实验中用 作模板，该实验包含两轮独立的PCR扩增。在第一轮PCR扩增中，寡核 苷酸引物由基因特异性的寡核苷酸(即ODMW480；SEQ ID NO：35)和 来自BD-Clontech CreatorTM SmartTMcDNA文库试剂盒的通用寡核苷酸 CDSIII5′引物(SEQ ID NO：36)组成。PCR扩增在包含如下成分的50μl 总体积中进行：25μl的LA TaqTMpre-mix(TaKaRa Bio Inc.，Otsu，Shiga， 520-2193，日本)、10pmole的每种引物和1μl的Taq DNA聚合酶(Epicentre Technologies，Madison，WI)。热循环仪的条件设定为：95℃1分钟，56 ℃30秒和72℃ 1分钟，35个循环，随后在72℃进行10分钟的最后延伸。
第二轮PCR扩增使用1μl的来自第一轮PCR反应的产物作为模板。 引物由基因特异性的寡核苷酸(即ODMW479；SEQ ID NO：37)和 BD-Clontech’s CreatorTM SmartTM cDNA文库试剂盒提供的通用寡核苷酸 DNR CDS 5′(SEQ ID NO：38)组成。扩增如上所述的进行。
将第二轮PCR反应的产物在1％(重量/体积)琼脂糖上进行电泳。 然后从胶上纯化400bp和800bp之间的产物并将其克隆到pGEM-T-easy 载体(Promega，Madison，WI)中。将连接的DNA用于转化大肠杆菌 DH10B，并在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB琼脂上选择转化体。
对来自包含推定的Δ-5去饱和酶基因的5′区的一个转化体的质粒 DNA进行分析证实，存在预期的称作pT-EgD5-5′C2的质粒。序列分析 表明pT-EgD5-5′C2含有797bp的片段(SEQ ID NO：6)，该片段与590bp 的pT-F10-1片段(实施例3；SEQ ID NO：4)的5′端具有238bp的重叠， 并且另外提供559bp的5′上游序列(SEQ ID NO：7)(图4)。pT-EgD5-5′C2 的序列也校正了对应于保守区1的序列，该对应于保守区1的序列是通 过将简并寡核苷酸用于初始PCR扩增pT-F10-1中的590bp片段(实施例 3)而获得的。然而，在延长的797bp的SEQ ID NO：6片段中没有翻译起 始密码子。
第二轮改良的5′RACE如上描述的进行，不同的是将寡核苷酸 YL791(SEQ ID NO：39)和YL792(SEQ ID NO：40)用作基因特异性引 物。然后从凝胶上纯化200bp和400bp之间的产物并克隆到pGEM-T-easy 载体(Promega，Madison，WI)中。将连接的DNA转化大肠杆菌DH10B， 并且在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB琼脂上选择转化体。
对来自包含推定的Δ-5去饱和酶基因的5′区的一个转化体的质粒 DNA进行分析证实，存在预期的称作pT-EgD5-5’2nd的质粒。序列分析 表明pT-EgD5-5’2nd含有273bp的片段(SEQ ID NO：8)，该片段与上述 pT-EgD5-C2中的DNA片段的5′端具有253bp的重叠，并另外提供20bp 的5′上游序列(SEQ ID NO：9)。这20bp中的十七(17)bp编码推定的Δ -5去饱和酶基因的N末端部分，包括翻译起始密码子，因此提供了该基 因完整的5′序列。
实施例5
小眼虫Δ-5去饱和酶基因的3′编码区的分离
为了分离实施例3中鉴定的推定的Δ-5去饱和酶的C-末端部分，利 用了3′RACE技术。方法在上面的实施例4中描述；然而，在第一轮和第 二轮的PCR扩增两者中使用的引物在下面的表5中示出。
表5
用于3′RACE的寡核苷酸引物
  PCR扩增 基因特异性的寡核苷酸 通用的寡核苷酸 第一轮 ODMW469(SEQ ID NO：41) AUAP(SEQ ID NO：42) 第二轮 YL470(SEQ ID NO：43) AUAP(SEQ ID NO：42)
*引物AUAP在Invitrogen公司的3′-RACE试剂盒(Carlsbad，CA)中提 供。
在分离和纯化产物(即400-800bp)之后，如实施例4中那样将片段 克隆到pGEM-T-easy载体(Promega)中并转化至大肠杆菌DH10B中。
对来自包含Δ-5去饱和酶基因的3′区的一个转化体的质粒DNA进 行分析证实，存在预期的称作pT-EgD5-3′的质粒。序列分析表明 pT-EgD5-3′含有728bp的片段(SEQ ID NO：10)，该片段与590bp的 pT-F10-1片段(实施例3；SEQ ID NO：4)的3′端的264bp重叠，并提供 464bp的另外的3′下游序列(SEQ ID NO：11)。包含于pT-EgD5-3′中的 464bp的延长片段的起始184bp编码推定的Δ-5去饱和酶基因的C末端编 码区(包含翻译终止密码子)。pT-EgD5-3′的序列也校正了对应于保守 区2的序列，该对应于保守区2的序列是通过将简并寡核苷酸用于初始 PCR扩增pT-F10-1中的590bp片段(实施例3)而获得的。
在两轮5′RACE和一轮3′RACE之后，确定了整个推断的小眼虫Δ-5 去饱和酶(EgD5)编码区的DNA序列。如在图4中示出的，基于SEQ ID NO：4、6、8和10的比对，EgD5CDS的长度为1350bp(SEQ ID NO：1)， 并编码具有449个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：2)。用全长EgD5基因作为 查询序列的BLASTP搜索的结果表明它与三角褐指藻的Δ-5脂肪酸去 饱和酶(GenBank登录号AAL92562；SEQ ID NO：14)具有39％的同一 性和56％的相似性，期望值为1E-80。此外，全长EgD5基因与假微型海 链藻的Δ-8鞘脂去饱和酶(GenBank登录号AAX14502；SEQ ID NO：21) 具有37％的同一性和55％的相似性，期望值为3E-75。
实施例6
包含EgD5的构建体pDMW367的产生
本实施例描述了包含FBAIN::EgD5::Pex20-3’嵌合基因的 pDMW367(图5C)的产生。该构建体经设计用于将嵌合基因整合进解 脂耶氏酵母的基因组中并然后研究小眼虫Δ-5去饱和酶在解脂耶氏酵母 中的功能。
基于EgD5(SEQ ID NO：1)的全长cDNA，将寡核苷酸YL794和 YL797(分别为SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45)用作引物以扩增EgD5 的第一部分(图5A)。引物YL794含有一个NcoI位点，而引物YL797含 有一个HindIII位点。然后，将引物YL796和YL795(分别为SEQ ID NO：46 和SEQ ID NO：47)用作引物来扩增EgD5的第二部分。引物YL796含有 一个HindIII位点，而引物YL797含有一个NotI位点。利用引物对 YL794/YL797或YL796/YL795，将小眼虫cDNA(实施例2)作为模板， 在含有如下成分的50μl总体积中进行各PCR反应：PCR缓冲液(含有 10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH8.75)、2mM MgSO4、 0.1％ Triton X-100)、100μg/mL BSA(终浓度)、200μM的每种脱氧核 糖核苷酸三磷酸、10pmole的每种引物以及1μl的PfuDNA聚合酶 (Stratagene，San Diego，CA)。热循环仪的条件设定为：95℃ 1分钟， 56℃ 30秒和72℃ 1分钟，35个循环；随后在72℃进行10分钟的最后延 伸。
使用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化各PCR产物。用NcoI和HindIII消化 来自用引物YL794/YL797扩增的反应的PCR产物，而用HindIII和NotI消 化来自用引物YL796/YL795扩增的反应的PCR产物。将经NcoI/HindIII 和HindIII/NotI消化的DNA片段在1％(w/v)琼脂糖上凝胶电泳后纯化， 然后与NcoI/NotI-消化的pZUF17(图5B；SEQ ID NO：22；包含源自异 丝水霉的合成的Δ-17去饱和酶基因[“D17st”](美国专利公开 No.2003/0196217 A1)，该基因经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母 表达(PCT公开No.WO 2004/101757))定向连接。该连接的产物为 pDMW367(图5C；SEQ ID NO：23)，因此其包含下列组分：
表6
质粒pDMW367(SEQ ID NO：23)的组分
  SEQ ID NO：23 中的RE位点和 核苷酸 片段和嵌合基因组分的描述 EcoR I/BsiW I (7416-1671) FBAIN::EgD5::Pex20，包含： ·FBAIN：解脂耶氏酵母FBAIN启动子(PCT公开 No.WO 2005/049805；美国专利7,202,356) ·EgD5：小眼虫Δ-5去饱和酶(本文描述的SEQ ID NO：1；在图中标为“眼虫D5DS”) ·Pex20：耶氏酵母Pex20基因(GenBank登录号 AF054613)的Pex20终止子序列 2707-1827 ColE1质粒复制起点 3637-2777 用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因 (AmpR) 4536-5840 耶氏酵母自主复制序列(ARS18；GenBank登录号 A17608) 7373-5886 耶氏酵母Ura3基因(GenBank登录号AJ306421)
术语“FBAIN启动子”或“FBAIN启动子区”指在fba1基因编码的 解脂耶氏酵母果糖二磷酸醛缩酶(E.C.4.1.2.13)的‘ATG’翻译起始密 码子之前而且是表达所必需的5′上游非翻译区，加上具有fba1基因的内 含子的一部分5′编码区。
实施例7
产生解脂耶氏酵母菌株M4以产生占总脂质约8％的DGLA
本实施例描述了来源于解脂耶氏酵母ATCC #20362的菌株M4的构 建，该菌株M4能产生相对总脂质而言8％的DGLA。通过引入 pKUNF12T6E构建体(图6A；SEQ ID NO：24)，该菌株经工程改造而表 达Δ-6去饱和酶/Δ-6延长酶途径。产生该构建体用以将四个嵌合基因 (包含Δ-12去饱和酶、Δ-6去饱和酶和两种C18/20延长酶)整合至野生 型耶氏酵母菌株ATCC #20362的Ura3基因座，由此使得能产生DGLA。 因而，pKUNF12T6E含有下列组分：
表7
质粒pKUNF12T6E(SEQ ID NO：24)的描述
  SEQ ID NO：24 中的RE位点和 核苷酸 片段和嵌合基因组分的描述 AscI/BsiWI (9420-8629) 784bp的耶氏酵母Ura3基因的5′部分(GenBank登录号 AJ306421) SphI/PacI (12128-1) 516bp的耶氏酵母Ura3基因的3′部分(GenBank登录号 AJ306421) SwaI/BsiWI (6380-8629) FBAIN::EL1S::Pex20，包含： ·FBAIN：解脂耶氏酵母FBAIN启动子(PCT公开No. WO2005/049805；美国专利7,202,356，在图中标 为“Fba1+内含子”) ·EL1S：来源于高山被孢霉(GenBank登录号 AX464731)的经密码子最优化的延长酶1基因 (PCT公开No.WO 2004/101753) ·Pex20：来自耶氏酵母Pex20基因(GenBank登录号 AF054613)的Pex20终止子序列 BglII/SwaI (4221-6380) TEF::Δ-6S::Lip1，包含： ·TEF：解脂耶氏酵母TEF启动子(GenBank登录号 AF054508) ·Δ-6S：来源于高山被孢霉(GenBank登录号 AF465281)的经密码子最优化的Δ-6去饱和酶基因 (PCT公开WO 2004/101753) ·Lip1：来自耶氏酵母Lip1基因(GenBank登录号 Z50020)的Lip1终止子序列 PmeI/ClaI (4207-1459) FBA::F.Δ-12::Lip2，包含 ·FBA：解脂耶氏酵母FBA启动子(PCT公开No.WO 2005/049805；美国专利7,202,356；在图中标为 “FBA1”)
  ·F.Δ-12：串珠镰孢(Fusarium moniliforme)Δ-12去 饱和酶基因(PCT公开No.WO 2005/047485) ·Lip2：来自耶氏酵母Lip2基因(GenBank登录号 AJ012632)的Lip2终止子序列 ClaI/PacI (1459-1) TEF::EL2Syn::XPR2，包含： ·TEF：解脂耶氏酵母TEF启动子(GenBank登录号 AF054508) ·EL2Syn：来源于金黄色破囊壶菌的经密码子最优化 的延长酶基因(SEQ ID NO：25)(美国专利 6,677,145) ·XPR2：耶氏酵母Xpr基因(GenBank登录号M17741) 的约100bp的3′区
将质粒pKUNF12T6E用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”用于 转化野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362。将转化细胞铺平板在FOA选择 培养基平板上并在30℃下维持2至3天。挑取FOA抗性菌落并划线到MM 和MMU选择平板上。将在MMU平板上生长但不在MM平板上生长的菌 落选作Ura-菌株。然后将Ura-菌株的单菌落接种到液体MMU中，在30 ℃下以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换作 用制备脂肪酸甲酯，并随后用Hewlett-Packard 6890 GC分析。
GC分析显示，DGLA出现在含有pKUNF12T6E的四个嵌合基因的 转化体中，但没有出现在野生型耶氏酵母对照株中。所选的32个Ura- 菌株中大部分产生占总脂质约6％的DGLA。有两个菌株(即菌株M4和 13-8)产生了占总脂质约8％的DGLA。
实施例8
解脂耶氏酵母M4菌株中EgD5基因的功能分析
如“一般方法”中所描述的，将质粒pDMW367(实施例6；包含 FBAIN::EgD5::Pex20嵌合基因)转化进M4菌株(实施例7)中。在MM 平板上选择转化体。在30℃下生长2天后，挑取在MM平板上生长的3 个转化体并重新划线到新鲜的MM平板上。一旦有生长，就将这些菌株 在30℃下单独接种到3mL的液体MM中，并以250rpm/min摇动2天。离 心收集细胞，提取脂质，通过酯交换作用制备脂肪酸甲酯，并随后用 Hewlett-Packard 6890 GC分析。
GC分析显示，所有这3个转化体中所产生的总脂质都含有约5.6％ 的DGLA和2.8％的ARA，其中在这三个菌株中DGLA转化成ARA的转换 效率经测定为约33％(平均值)。转换效率根据下面的公式测量：([产 物]/[底物+产物])×100，其中‘产物’包括中间产物和该途径中源自其 的所有产物。因此，该实验数据表明，本文中描述为SEQ ID NO：1和2 的克隆的小眼虫Δ-5去饱和酶有效地将DGLA去饱和而形成ARA。
实施例9
用于在解脂耶氏酵母中表达的经密码子最优化的Δ-5去饱和酶基因 (“EgD5S”)的合成
将小眼虫的Δ-5去饱和酶基因(SEQ ID NO：1和2；EgD5)的密码 子使用以与PCT公开No.WO 2004/101753和美国专利7,125,672中描述 相似的方式最优化，以便在解脂耶氏酵母表达。具体地讲，基于Δ-5去 饱和酶基因EgD5的编码序列，根据耶氏酵母密码子使用模式(PCT公 开No.WO 2004/101753)、‘ATG′翻译起始密码子周围的共有序列以及 RNA稳定性的一般规则(Guhaniyogi，G.和J.Brewer，Gene，265 (1-2)：11-23(2001))，设计经密码子最优化的Δ-5去饱和酶基因(称 作“EgD5S”，SEQ ID NO：3)。除了修饰翻译起始位点，还对1350bp编 码区中的196bp进行了修饰(14.5％；图7)并最优化了189个密码子 (42％)。GC含量从野生型基因(即EgD5)中的55.5％减少到合成基因 (即EgD5S)中的54.4％。分别将NcoI位点和NotI位点整合到EgD5S的 翻译起始密码子的周围和终止密码子之后。在经密码子最优化的基因 中所有修饰均不改变所编码蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。设 计的EgD5S基因(SEQ ID NO：3)由GenScript Corporation(Piscataway， NJ)合成并克隆进pUC57(GenBank登录号Y14837)中以产生pEgD5S (图6B；SEQ ID NO：48)。
实施例10
包含EgD5S的构建体pDMW369的产生
本实施例描述了包含FBAIN::EgD5S::Pex20嵌合基因的质粒 pDMW369的构建。通过将pZUF17(图5B；SEQ ID NO：22)的NcoI/NotI 片段用来自pEgD5S(图6B；SEQ ID NO：48)的NcoI/NotI EgD5S片段替 换来构建质粒pDMW369(图6C；SEQ ID NO：49)。该连接的产物为 pDMW369，因此其含有如下组分：
表8
质粒pDMW369(SEQ ID NO：49)的组分
  SEQ ID NO：49 中的RE位点和 核苷酸 片段和嵌合基因组分的描述 EcoR I/BsiW I (6063-318) FBAIN::EgD5S::Pex20，包含 ·FBAIN：解脂耶氏酵母FBAIN启动子(PCT公 开No.WO 2005/049805；美国专利7,202,356， 在图中标为“Fba1+内含子”) ·EgD5S：源于小眼虫的经密码子最优化的Δ-5去 饱和酶(SEQ ID NO：3，本文描述为EgD5S) ·Pex20：耶氏酵母Pex20基因(GenBank登录号 AF054613)的Pex20终止子序列 1354-474 ColE1质粒复制起点 2284-1424 用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因 (AmpR) 3183-4476 耶氏酵母自主复制序列(ARS18；GenBank登录号 A17608) 6020-4533 耶氏酵母Ura 3基因(GenBank登录号AJ306421)
实施例11
经密码子最优化的Δ-5去饱和酶(“EgD5S”)在解脂耶氏酵母菌株M4中 的表达
如“一般方法”中所描述的，将质粒pDMW369(实施例10；包含 FBAIN::EgD5S::Pex20嵌合基因)转化进菌株M4(实施例7)中。在MM 平板上选择转化体。在30℃下生长2天后，挑选在MM平板上生长的3 个转化体并重新划线到新鲜的MM平板上。一旦有生长，就将这些菌株 在30℃下单独接种到3mL的液体MM中，并以250rpm/min摇动2天。离 心收集细胞，提取脂质，通过酯交换作用制备脂肪酸甲酯，并随后用 Hewlett-Packard 6890 GC分析。
GC分析显示，所有这3个转化体中所产生的总脂质都含有约3.3％ 的DGLA和2.7％的ARA，其中在这三个菌株中DGLA转化成ARA的转换 效率经测定为约45％(平均值；如实施例8中所述)。因此，该实验数据 表明，经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的合成的小眼虫 Δ-5去饱和酶(EgD5S，在SEQ ID NO：3中示出)将DGLA去饱和为ARA 的效率比野生型EgD5基因(SEQ ID NO：1)高约36％。
实施例12
路氏巴夫藻(CCMP459)Δ-8去饱和酶的分离
本实施例描述了对实施例3和图3中所使用的路氏巴夫藻 (CCMP459)Δ-8去饱和酶的分离(在提交于2007年4月20日的美国专 利申请No.11/737,772中也有所描述)。这需要：合成路氏巴夫藻 (CCMP459)的cDNA；构建文库并测序；鉴定Δ-8去饱和酶同源物； 以及从基因组DNA克隆全长的Δ-8去饱和酶。
路氏巴夫藻(CCMP459)cDNA合成、文库构建和测序
如PCT公开No.WO 2004/071467(于2004年8月26日公开)所述合成 路氏巴夫藻(CCMP459)cDNA文库。简而言之，Pav459的冷冻沉淀获 自Provasoli-Guillard国立海生浮游植物培养中心(Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton)(CCMP，West Boothbay Harbor，ME)。将这些沉淀在液氮中碾碎并根据生厂商的使用 说明用Qiagen Maxi试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从Pav459 中提取总RNA。使用寡脱氧胸苷(oligo dT)纤维素树脂从该总RNA中 分离mRNA，然后利用pSport1载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)用该 mRNA构建cDNA文库。将由此产生的cDNA定向克隆到(5′SalI/3′NotI) pSport1载体中。Pav459文库每毫升含有大约6.1×105个克隆，每个克隆 含有平均大小约为1200bp的插入片段。将该路氏巴夫藻文库命名为 epslc。
为了测序，首先从生长/冷冻在384孔冷冻培养基平板中的保藏甘油 培养物回收克隆，然后用自动菌落挑取仪(Genetix)接种到含 有LB+100mg/mL氨苄青霉素的96孔深孔板中。在37℃下生长20小时后， 离心沉淀细胞然后将其保存于-20℃。然后在Eppendorf 5Prime robot上 用改良的96孔型碱裂解小量制备方法(Eppendorf )分离质 粒。简而言之，将过滤器和多头抽真空装置用于促进在醋酸盐沉淀后 移除细胞碎片。质粒DNA随后直接从滤液中结合到第二个滤板上，将 其进行洗涤、干燥并洗脱。
使用载体-引发的T7引物(SEQ ID NO：50)和ABI BigDye第3版 Prism测序试剂盒在384孔板中对质粒进行末端测序。对于测序反应，使 用100-200ng的模板和6.4pmoL的引物，然后重复下面的反应条件25次： 96℃ 10秒、50℃ 5秒和60℃ 4分钟。在基于乙醇的纯化后，将循环测 序反应的产物在Perkin-Elmer ABI 3700自动测序仪上分离并检测。
从路氏巴夫藻cDNA文库epslc鉴定Δ-8去饱和酶的同源物
通过进行BLAST搜索寻找与BLAST“nr”数据库中所包含的序列的 相似性(如实施例3中所描述)，鉴定编码路氏巴夫藻Δ-8去饱和酶同源 物的cDNA克隆(据此称为Δ-8去饱和酶)。由BLAST计算的、观察到 cDNA序列与所搜索数据库中包含的序列仅偶然匹配的P-值(概率)在 本文中报道为“pLog”值，该值代表了所报道的P-值的负对数。因此， pLog值越大，cDNA序列和BLAST“命中”代表同源蛋白质的可能性越 大。
用来自克隆epslc.pk002.f22的核苷酸序列进行的BLASTX搜索揭 示，该cDNA编码的蛋白质与葡枝根霉的Δ-6去饱和酶(SEQ ID NO：51) (NCBI登录号AAX22052(GI 60499699)，基因座AAX22052，CDS AY795076；Lu等人，未公布)的相似性。来自克隆epslc.pk002.f22的 一部分cDNA插入片段的序列在SEQ ID NO：52(cDNA插入片段的5′端) 中示出。随后，获得了完整的插入片段序列(epslc.pk002.f22：fis)，并 在SEQ ID NO：53中示出。关于推断的氨基酸序列的序列(从SEQ ID NO：53的核苷酸1至位于SEQ ID NO：53的核苷酸864处的第一个终止密 码子)在SEQ ID NO：54中示出。完整插入片段的测序用改良的转座方 法进行。将鉴定的用于完整插入片段测序的克隆作为单菌落从保藏的 甘油母液回收，然后通过碱裂解分离质粒DNA。用Template Generation System(TGS II)转座试剂盒(Finnzymes Oy，Espoo，芬兰)根据厂商 的方法使质粒模板发生转座。将转座的DNA经电穿孔转化进EH10B电 感受态细胞(Edge BioSystems，Gaithersburg，MD)中。从每个转座反应 中随机选择多个转化体，制备质粒DNA，并利用独特的引物SeqE(SEQ ID NO：55)和SeqW(SEQ ID NO：56)如上从转座事件位点向外对模板 测序(ABI BigDye v3.1)。
收集序列数据(ABI Prism Collections软件)，然后用Phrap序列装 配程序(P.Green，University of Washington，Seattle)进行装配。用Consed 序列编辑器(D.Gordon，University of Washington，Seattle)观察装配序 列进行最终的编辑。
通过BLASTP评估在SEQ ID NO：54中示出的氨基酸序列，得到相对 于来自高山被孢霉的Δ-6去饱和酶(NCBI登录号BAC82361(GI 34221934)，基因座BAC82361，CDS AB070557；Sakuradani和Shimizu， Biosci.Biotechnol.Biochem.，67：704-711(2003))的pLog值为19.52(E 值为3e-20)。基于来自与高山被孢霉和其它脂肪酸去饱和酶BLASP比较 的结果，路氏巴夫藻Δ-8去饱和酶不是全长的，且缺少5′端序列。
从路氏巴夫藻基因组DNA克隆全长的Δ-8去饱和酶
使用Qiagen  Plant Maxi Prep试剂盒根据厂商的方法从路 氏巴夫藻(CCMP459)中分离基因组DNA。每1gm的冷冻细胞沉淀使 用1个maxi柱，从4gm的路氏巴夫藻培养物中总共分离122μg的基因组 DNA。基因组DNA的终浓度为22.8ng/μL。使用Universal GenomeWalker TM试剂盒(BD Biosciences Clonetech，Palo Alto，CA)根据厂商的方法 (Prot# PT3042-1，版本为PRO3300)合成GenomeWalker文库。简而言 之，按照所述方法设立四个限制酶切消化反应，每个反应使用300ng的 基因组DNA。在苯酚纯化后，将沉淀溶解在4μL的水中，然后按照所述 方法连接衔接头。
对于起始PCR，根据厂商的方法(Prot # PT3090-1，版本为 PR1X433)使用-GC Genomic PCR试剂盒(BD Biosciences Clonetech)。对于每个限制酶切消化，将1μL的文库与22.8μL的PCR级 水、10μL的5×GC基因组PCR反应缓冲液、2.2μL的25mM Mg(CH3CO2) 2、10μL的GC-Melt(5M)、1μL的50×dNTP混合物(每种10mM)、1μL 的Advantage-GC Genomic Pol.Mix(50×)、1μL的通用Genome WalkerTM 引物AP1(10μM，SEQ ID NO：57)和1μL的GSP PvDES(10μM，SEQ ID NO：58)合并在一起。在95℃下变性后，重复下面的反应条件35次：94 ℃30秒，68℃6分钟。在这些反应条件之后，在68℃进行6分钟的另 外的延伸，随后冷却到15℃直至移出。
通过琼脂糖凝胶电泳分析每个文库的起始PCR反应，然后观察分子 量大约为6kB、3.5kB、2.5kB和1.2kB的DNA条带。将每个文库的DNA 条带用ZymocleanTM凝胶DNA回收试剂盒(Zymo Research，Orange，CA) 根据厂商的方法纯化。将得到的DNA按照厂商的方法克隆到 Easy载体(Promega)中，然后如上所述用T7(SEQ ID NO：50)和 M13-28Rev(SEQ ID NO：59)引物对插入片段进行测序。然后用来源 于新获得序列数据的基因特异性测序引物PavDES seq(SEQ ID NO：60) 获得另外的序列。通过基因步移获得的完整5′端序列在SEQ ID NO：61 中示出。利用SequencherTM(版本4.2，Gene Codes Corporation，Ann Arbor， MI)使用大缺口装配算法(Large Gap assembly algorithm)对该基因组 序列(SEQ ID NO：61)的重叠区的序列和完整测序的EST epslc.pk002.f22:fis(SEQ ID NO：53)进行比对。有趣的是，该比较显 示，与该基因组序列(SEQ ID NO：61)相比，初始测序的EST(SEQ ID NO：53)缺少459bp。在EST中缺少的这个序列似乎是缺失而非内含子， 因为在该基因5′端的基因组DNA中没有鉴定出明确的内含子剪接位点。 将5′端的基因组序列(SEQ ID NO：61)与3′端的EST序列(SEQ ID NO：53) 结合从而产生SEQ ID NO：62。使用EditSeqTM 6.1序列分析软件 (DNASTAR Inc.，Madison，WI)，鉴定出ORF(SEQ ID NO：17)。由SEQ ID NO：17编码的氨基酸序列在SEQ ID NO：18中示出。
将SEQ ID NO：18中示出的氨基酸序列用BLASTP评估，得到相对于 来自葡枝根霉的Δ-6去饱和酶(SEQ ID NO：63)(NCBI Accession No.ABB96724(GI 83027409)，基因座ABB96724，CDS DQ291156； Zhang等人，未公布)的pLog值为35.10(E值为8e-36)。而且，利用Jotun Hein方法，路氏巴夫藻Δ-8去饱和酶与在PCT公开No.WO 2005/103253 (于2005年4月22日公开)中公开的盐生巴夫藻Δ-8去饱和酶序列(SEQ ID NO：64)具有78.0％的同一性。用Jotun Hein方法(Hein，J.J.，Meth. Enz.，183：626-645(1990))进行的序列百分比同一性计算是使用 LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)中 的MegAlignTMv6.1程序以用于成对比对的默认参数(KTUPLE＝2)来进 行。利用Clustal V方法，路氏巴夫藻Δ-8去饱和酶与盐生巴夫藻Δ-8去 饱和酶序列具有76.4％的同一性。用Clustal V方法(Higgins，D.G.和Sharp， P.M.，Comput.Appl.Biosci.，5：151-153(1989)；Higgins等人，Comput. Appl.Biosci.，8：189-191(1992))进行的序列百分比同一性计算是使用 LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)中的MegAlignTM v6.1程序以用于成对比对的默认参数(KTUPLE＝1、缺口罚分＝3、窗口 ＝5、DIAGONALS SAVED＝5和缺口长度罚分＝10)来进行。BLAST分 值和概率表明SEQ ID NO：17的片段编码整个路氏巴夫藻Δ-8去饱和 酶。
图8A和8B示出了SEQ ID NO：18(路氏巴夫藻Δ-8去饱和酶的氨基 酸序列)、SEQ ID NO：64(盐生巴夫藻Δ-8去饱和酶序列的氨基酸序列， 同上)、SEQ ID NO：16(于2006年2月2日公开的PCT公开No.WO 2006/012325中公开为SEQ ID NO：2的小眼虫Δ-8去饱和酶序列的氨基 酸序列)、SEQ ID NO：63(葡枝根霉Δ-6脂肪酸去饱和酶(NCBI登录号 ABB96724，同上)的氨基酸序列)和SEQ ID NO：51(葡枝根霉Δ-6脂 肪酸去饱和酶(NCBI登录号AAX22052，同上)的氨基酸序列)的Clustal V比对(用默认的参数)。Clustal V比对的结果显示SEQ ID NO：18与SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：51分别具有 76.4％、22.6％、22.2％和22.2％的同一性。
实施例13
大豆体细胞胚培养物的转化
培养条件：
将大豆胚发生悬浮培养物(cv.Jack)在26℃下在旋转振荡器上以 150rpm维持在35mL液体培养基SB196(见下文)中，使用光强度为 60-85μE/m2/s、白天/黑夜光周期为16:8小时的冷白荧光。通过将大约 35mg组织接种到35mL新鲜的SB196液体中，培养物每7天进行继代培养 至两周(优选的继代培养间隔为每7天)。
对于所有的转化，使用DuPont Biolistic PDS 1000/HE仪器(helium retrofit)以基因枪轰击(Klein等人，Nature，327：70(1987))将大豆表 达质粒转化到大豆胚发生悬浮培养物中。
大豆胚发生悬浮培养物的开始(Initiation)：
大豆培养物每个月开始两次，每次开始间隔5-7天。在种植后45-55 天，从可得到的大豆植株采摘含有不成熟种子的豆荚，去除它们的外 壳然后置于灭菌的magenta盒中。通过将大豆种子在含一滴象牙皂的5％ Clorox溶液(即，95mL的高压灭菌蒸馏水加5mL Clorox和一滴皂，充 分混合)中摇晃15分钟来使它们灭菌。用两个1升瓶子中的无菌蒸馏水 冲洗种子，然后将那些小于4mm的种子置于单独的显微镜载玻片上。 切除种子的小的一端，从种皮中挤出子叶。将子叶转移至含有SB1培养 基的平板(每个平板25-30个子叶)。将平板用纤维带包裹并保存8周。 之后，切除次生胚并将其置于SB196液体培养基中7天。
用于轰击的DNA的制备：
将含有所关注的Δ-5去饱和酶基因和选择标记基因的完整质粒或 DNA质粒片段用于轰击。通过对消化的质粒进行凝胶分离获得来自包 含本发明的Δ-5去饱和酶的大豆表达质粒的片段。将所得的DNA片段 通过在1％ SeaPlaque GTG琼脂糖(Bio Whitaker Molecular Applications) 上进行凝胶电泳而分离，并从琼脂糖凝胶上切取含有基因盒的DNA片 段。使用GELase消化酶根据厂商的方法从琼脂糖中纯化DNA。
将含有3mg金颗粒的无菌蒸馏水的50μL等分试样加入到5μL的 1μg/μL DNA溶液(完整的质粒或如上所述制备的DNA片段)、50μL的 2.5M CaCl2和20μL的0.1M亚精胺中。将混合物在涡旋振荡器上以3档振 荡3分钟并在台式微量离心机上离心10秒钟。用400μL的100％乙醇洗涤 后，通过超声处理将沉淀悬浮于40μL的100％乙醇中。将DNA悬浮液 (5μL)分配到Biolistic PDS1000/HE仪圆盘的每个飞行圆盘中。每次轰 击(即每个圆盘)的每个5μL等分试样含有大约0.375mg金颗粒。
组织制备和用DNA轰击：
将大约150-200mg的7天大的胚悬浮培养物置于无菌的60×15mm空 培养皿中，并用塑料网覆盖该培养皿。对每个平板的组织轰击1或2枪， 膜破裂压力设定为1100PSI，并将小室抽真空到27-28英寸汞柱。将组 织放置在距阻滞/阻止筛大约3.5英寸的地方。
转化的胚的选择：
用潮霉素作为选择标记来选择转化的胚。具体地讲，在轰击后， 将组织置于新鲜的SB196培养基中并如上所述地进行培养。轰击后6天， 用含有30mg/L潮霉素的新鲜SB196交换该SB196。每周更新选择培养 基。选择后4至6周，观察到绿色的转化组织从未转化的、坏死的胚发 生丛中长出。将分离的绿色组织移出并接种到多孔板以产生新的、无 性繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。
胚的成熟：
将胚在光强度为90-120μE/m2s、光周期为16:8小时的冷白荧光 (Phillips cool white Econowatt F40/CW/RS/EW)和Agro(Phillips F40 Agro)的灯泡(40瓦特)下，于26℃下的SB196中培养4-6周。之后， 将胚丛移至SB166固体琼脂培养基上1-2周。然后将所述丛在SB103培养 基中继代培养3周。在此期间，将单独的胚从所述丛中移出并根据如上 文所述的它们的脂肪酸组成的改变进行筛选。
培养基配方：
SB 196-FN Lite液体增殖培养基(每升)
MS FeEDTA-100×储液1         10mL
MS硫酸盐-100×储液2          10mL
FN Lite卤化物-100×储液3     10mL
FN LiteP，B，Mo-100×储液4   10mL
B5维生素(1mL/L)              1.0mL
2，4-D(10mg/L终浓度)         1.0mL
KNO3                         2.83gm
(NH4)2SO4                    0.463gm
天冬酰胺                     1.0gm
蔗糖(1％)                    10gm
pH5.8
                 FN Lite储液
贮存号                      1000mL       500mL
1        MS Fe EDTA 100×储液
         Na2EDTA*           3.724g       1.862g
        FeSO4-7H2O           2.784g       1.392g
*先加入，在深色瓶中搅拌溶解
2        MS硫酸盐100×储液
         MgSO4-7H2O          37.0g        18.5g
         MnSO4-H2O           1.69g        0.845g
         ZnSO4-7H2O          0.86g        0.43g
         CuSO4-5H2O          0.0025g      0.00125g
3    FN Lite卤化物-100×储液
CaCl2-2H2O          30.0g       15.0g
KI                 0.083g      0.0715g
CoCl2-6H2O          0.0025g     0.00125g
4     FN Lite P，B，Mo 100×储液
KH2PO4              18.5g       9.25g
H3BO3               0.62g       0.31g
Na2MoO4-2H2O        0.025g      0.0125g
SB1固体培养基(每升)
1个包装的MS盐(Gibco/BRL-产品目录号为11117-066)
1mL B5维生素1000×储液
31.5g蔗糖
2mL 2，4-D(终浓度为20mg/L)
pH5.7
8g TC琼脂
SB 166固体培养基(每升)
1个包装的MS盐(Gibco/BRL-产品目录号为11117-066)
1mL B5维生素1000×储液
60g麦芽糖
750mg MgCl2六水合物
5g活性炭
pH5.7
2g脱乙酰吉兰糖胶(gelrite)
SB 103固体培养基(每升)
1个包装的MS盐(Gibco/BRL-产品目录号为11117-066)
1mL B5维生素1000×储液
60g麦芽糖
750mg MgCl2六水合物
pH5.7
2g脱乙酰吉兰糖胶(gelrite)
SB71-4固体培养基(每升)
一瓶含蔗糖的Gamborg′s B5盐(Gibco/BRL-产品目录号为
21153-036)
pH5.7
5g TC琼脂
2，4-D储液
从Phytotech获得预制品，产品目录号为D295-浓度为1mg/mL
B5维生素储液(每100mL)
将等份样品在-20℃下保存
10g肌醇
100mg烟酸
100mg盐酸吡哆醇
1g硫胺素
如果溶液不能足够快地溶解，则用搅拌加热板轻微加热。
实施例14
大豆体细胞胚中Δ-5去饱和酶(SEQ ID NO：1和2)的功能分析
成熟的大豆体细胞胚是合子胚的良好模型。当在液体培养中呈球 形胚状态时，大豆体细胞胚含有非常少量的成熟大豆合子胚典型的三酰 基甘油(TAG)或贮藏蛋白。在该发育阶段，总的三酰基甘油与总的 极性脂质(磷脂和糖脂)的比率是约1:4，这是该发育阶段(体细胞胚 培养物从该阶段起始)的大豆合子胚典型的比率。同样在球形期，显 著的种子蛋白，β-伴大豆球蛋白α’-亚基、kunitz胰蛋白酶抑制剂3和 种子凝集素的mRNA基本上不存在。在转移至不含激素的培养基中以允 许分化至成熟的体细胞胚状态后，TAG成为最丰富的脂类。同样，β- 伴大豆球蛋白α’-亚基、kunitz胰蛋白酶抑制剂3和种子凝集素的mRNA 也成为总mRNA群中非常丰富的信使。基于此，该大豆体细胞胚体系与 体内成熟的大豆合子胚表现非常相似，因此是用于分析改变脂肪酸生 物合成途径中的基因表达的表型影响的良好且快速的模型体系(参看 PCT公开No.WO 2002/00904，实施例3)。最重要的是，该模型体系也 可预测起源于转基因胚的植株的种子的脂肪酸组成。
将含有本发明的Δ-5去饱和酶的转基因大豆体细胞胚以如下方式 进行分析。通过酯交换作用从单个成熟的大豆体细胞胚制备脂肪酸甲 酯。将个别胚置于含有50μL氢氧化三甲基锍(TMSH)和0.5mL己烷的 小瓶中并在室温下摇晃孵育30分钟。用配有Omegawax 320熔融石英毛 细管柱(Catalog #24152，Supelco Inc.)的Hewlett-Packard 6890气相色谱 仪分离和定量脂肪酸甲酯(从己烷层取5μL注射上样)。用程序控制烘 箱温度保持在220℃ 2.6分钟，以20℃/min上升到240℃，然后另外保持 2.4分钟。载气由Whatman氢发生器提供。将保留时间与那些市售的甲 酯标准品(Nu-Chek Prep Inc.)的保留时间比较。通常，使用上述方法， 通过GC每个事件分析5-10个胚。
实施例15
在大豆体细胞胚中共表达其它启动子/基因/终止子盒的组合
除了本文所描述的基因、启动子、终止子和基因盒，本领域的技 术人员能够理解，其它启动子/基因/终止子盒的组合能够以类似于但不 限于本文所描述的方式合成。例如，PCT公开No.WO 2004/071467和 No.WO 2004/071178描述了用于在大豆中胚特异表达的多种启动子和 转录终止子序列的分离。此外，PCT公开No.WO 2004/071467、No.WO 2005/047479和No.WO 2006/012325还描述了通过以独特组合将单独的 启动子、基因和转录终止子连接在一起来合成多种启动子/基因/终止子 盒组合。通常，将旁侧为合适的启动子(例如，那些列于但不限于表9 中的启动子)和转录终止子(例如，那些列于但不限于表10中的终止 子)的NotI位点用于克隆所需的基因。通过采用经设计用于将NotI位点 引入基因的5′端和3′端的寡核苷酸进行PCR扩增，可将NotI位点添加至 所关注的基因，例如那些列于但不限于表11中的基因。然后用NotI 消化所得的PCR产物并将其克隆到合适的启动子/NotI/终止子盒中。
此外，PCT公开No.WO2004/071467、No.WO 2005/047479和No.WO 2006/012325还描述了将单独的基因盒以独特组合，以及合适的选择标 记盒连接在一起，以获得所需的表型表达。尽管这主要是使用不同的 限制性内切酶位点来进行，但本领域的技术人员能够理解，很多技术 都可用于实现所需的启动子/基因/转录终止子组合。这样一来，任何组 合的胚特异性启动子/基因/转录终止子盒都可实现。本领域的技术人员 也能理解，这些盒可位于单独的DNA片段上或位于多个片段上，其中 多个DNA片段的共转化导致基因的共表达。
表9
种子特异性启动子
  启动子 生物 启动子的参考文献 β-伴大豆球蛋白α’-亚基 大豆 Beachy等人，EMBO J.，4：3047-3053(1985) kunitz胰蛋白酶抑制剂 大豆 Jofuku等人，Plant Cell，1：1079-1093(1989) 膜联蛋白 大豆 PCT公开No.WO2004/071467 大豆球蛋白Gy1 大豆 PCT公开No.WO2004/071467 白蛋白2S 大豆 美国专利6,177,613 豆球蛋白A1 豌豆 Rerie等人，Mol.Gen.Genet.，225：148-157 (1991) β-伴大豆球蛋白β-亚基 大豆 PCT公开No.WO 2004/071467 BD30(也称为P34) 大豆 PCT公开No.WO 2004/071467 豆球蛋白A2 豌豆 Rerie等人，Mol.Gen.Genet.，225：148-157 (1991)
表10
转录终止子

表11
PUFA生物合成途径的基因
  基因 生物 参考文献 Δ-6去饱和酶 异丝水霉 PCT公开No.WO 2002/081668 Δ-6去饱和酶 高山被孢霉 美国专利5,968,809 延长酶 高山被孢霉 PCT公开No.WO 2000/12720；美国专 利6,403,349 Δ-5去饱和酶 高山被孢霉 美国专利6,075,183 Δ-5去饱和酶 异丝水霉 PCT公开No.WO 2002/081668 Δ-15去饱和酶 串珠镰孢 PCT公开No.WO 2005/047479 Δ-17去饱和酶 异丝水霉 PCT公开No.WO 2002/081668 延长酶 金黄色破囊壶菌 PCT公开No.WO 2002/08401；美国专 利6,677,145 延长酶 巴夫藻属物种 Pereira等人，Biochem.J.，384：357-366 (2004) Δ-4去饱和酶 Schizochytrium aggregatum PCT公开No.WO 2002/090493 Δ-9延长酶 绿光等鞭金藻 PCT公开No.WO 2002/077213
  Δ-9延长酶 小眼虫 美国专利申请No.11/601563 Δ-8去饱和酶 小眼虫 PCT公开No.WO 2000/34439；美国专利 6,825,017；PCT公开No.WO 2004/057001；PCT公开No.WO 2006/012325 Δ-8去饱和酶 卡氏棘变形虫 Sayanova等人，FEBS Lett.， 580：1946-1952(2006) Δ-8去饱和酶 盐生巴夫藻 PCT公开No.WO 2005/103253 Δ-8去饱和酶 路氏巴夫藻 美国专利申请No.11/737,772
实施例16
绿黄隆选择(ALS)和植物再生
绿黄隆(ALS)选择：
轰击后，将植物组织分配到2个装有新鲜SB196培养基的瓶中并如 实施例13中所述的进行培养。轰击后6至7天，用含有100ng/mL绿黄隆 选择剂的新鲜SB196交换所述SB196。每周更新选择培养基。选择后4 至6周，观察到绿色的转化的组织从未转化的、坏死的胚发生丛中长出。 将分离的绿色组织移出并接种到含有SB196的多孔板中以产生新的、无 性繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。
大豆体细胞胚再生为植株：
为了从胚发生悬浮培养物获得完整植株，必须进行组织再生。如实 施例13中所述使胚成熟。在SB103培养基中继代培养3周后，将单独的 胚从所述丛中移出并如实施例14所述针对它们脂肪酸组成的改变进行 筛选。应该注意的是，由所关注基因的表达导致的任何可检测表型都 可在该阶段进行筛选。这将包括但不限于：脂肪酸概况、蛋白质概况和 蛋白质含量、碳水化合物含量、生长率、生存力或正常发育成大豆植 物的能力的改变。
通过将成熟的单独的胚置于空的小培养皿(35×10mm)中干燥大 约4至7天。用纤维带密封平板(产生小的潮湿小室)。将干燥的胚种植 到SB71-4培养基中，并在上述的相同培养条件下让它们在那里发芽。 从萌发培养基中移出发芽的小植株并用水充分冲洗，然后种植到覆盖 有透明塑料圆顶的24孔托盘(24-cell pack tray)中的Redi-Earth中。两 周后，移除该圆顶并使植物在接下来一周受冷而变得耐寒。如果小植 株看起来耐寒，则将它们移植到Redi-Earth的10”罐中，每个罐至多3株 小植株。10至16周后，收获成熟的种子，将其切碎并如在实施例14中 所述分析脂肪酸。
培养基配方可在实施例13中找到，绿黄隆储液为在0.01N氢氧化铵 中含有1mg/mL绿黄隆。
实施例17
比较高山被孢霉Δ-5去饱和酶(MaD5)与小眼虫Δ-5去饱和酶(EgD5) 在解脂耶氏酵母中的底物特异性
本实施例描述了美国专利6,075,183和PCT公开No.WO 2004/071467和No.WO 2005/047479中描述的高山被孢霉Δ-5去饱和酶 (MaD5；SEQ ID NO：67和68)与EgD5(SEQ ID NO：2)在解脂耶氏酵 母中的底物特异性的比较。
这项工作包括如下步骤：(1)构建包含MaD5的耶氏酵母表达载体 pY98；(2)将pY98和pDMW367转化至耶氏酵母菌株Y2224中；和3.) 在提供脂肪酸底物后比较包含pY98或包含pDMW367的转化生物内的 脂质概况。
包含MaD5的耶氏酵母表达载体pY98的构建
质粒pY5-22(SEQ ID NO：69)是既能在大肠杆菌中复制又能在解 脂耶氏酵母中复制的穿梭质粒，其含有如下元件：耶氏酵母自主复制 序列(ARS18；GenBank登录号M91600)；ColE1质粒复制起点；用于 在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)；用于在耶氏酵母 中选择的耶氏酵母URA3基因(GenBank登录号No.AJ306421)；和嵌合 的TEF::NcoI/NotI::XPR盒，其中“XPR”是耶氏酵母Xpr基因(GenBank 登录号M17741)的3′区的约100bp。尽管质粒pY5-22的构建在本文中没 有详细描述，但它来源于pY5(以前在PCT公开No.WO2004/101757中 描述过)。
通过用本领域技术人员所熟知的技术，用解脂耶氏酵母GPD启动 子(SEQ ID NO：71)置换TEF启动子而从pY5-22(SEQ ID NO：69)产 生质粒pY5-22GPD(SEQ ID NO：70)。耶氏酵母“GPD启动子”指位于 由解脂耶氏酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因编码的蛋白质的翻 译起始密码子‘ATG’之前的5′上游非翻译区并且是表达所必需的(PCT 公开No.WO 2005/003310)。更具体地讲，解脂耶氏酵母GPD启动子是 使用寡核苷酸GPDsense(SEQ ID NO：73)和GPDantisense(SEQ ID NO：74)从质粒pYZDE2-S(SEQ ID NO：72；其以前在美国专利申请 No.11/737,772(藉此将其内容以引用方式并入本文)中描述过)扩增 而来。用SalI/NotI消化所得的DNA片段并克隆进pY5-22(SEQ ID NO：69)的SalI/NotI片段中，因而用GPD启动子和独特的NotI位点替换 了TEF启动子和NcoI/NotI位点，并由此产生pY5-22GPD(SEQ ID NO：70)。
通过用NotI消化而从pKR136(SEQ ID NO：75；以前在PCT公开 No.WO2004/071467(藉此将其内容以引用方式并入本文)中描述过) 释放高山被孢霉Δ-5去饱和酶基因(SEQ ID NO：67)，并将其克隆到 pY5-22GPD的NotI位点中以产生pY98(SEQ ID NO：76；图9)。
pY98(包含MaD5)和pDMW367(包含EgD5)转化到耶氏酵母菌株Y2224 中以及脂质概况的比较
酵母株Y2224用如下方式分离：将来自YPD琼脂平板(1％酵母提 取物、2％细菌用蛋白胨、2％葡萄糖和2％琼脂)的解脂耶氏酵母ATCC #20362细胞划线到含有250mg/L5-FOA(Zymo Research)的MM平板(尿 嘧啶和尿苷各75mg/L、6.7g/L含有硫酸铵但不含氨基酸的YNB以及 20g/L葡萄糖)上。在28℃下孵育平板，将所得菌落中的4个单独接种 (patched)到含有200mg/mL5-FOA的MM平板和不含尿嘧啶和尿苷的 MM平板上以确认尿嘧啶Ura3营养缺陷。
如“一般方法”中所述，用pY98(SEQ ID NO：76，图9)和pDMW367 (SEQ ID NO：23；图5C；实施例6)转化Y2224株。
将含有pY98(SEQ ID NO：76)或pDMW367(SEQ ID NO：23)的 转化的解脂耶氏酵母的单个菌落于30℃下在不含尿嘧啶但补充有0.2％ 表面活性剂的3mL MM中培育1天。此后，将0.1mL转移到3mL补充有 EDA、ETrA、DGLA、ETA或不补充脂肪酸的相同培养基中。将这些培 养基在30℃下以250rpm孵育16小时，然后通过离心获得沉淀。将细胞 用水洗涤一次、通过离心沉淀并风干。用500μL的1％甲醇钠使沉淀在 50℃下进行酯交换反应30分钟(Roughan，G.和Nishida，I.，Arch.Biochem. Biophys.，276(1)：38-46(1990))，随后加入500μL的1M NaCl和100μL 的庚烷。充分混合和离心后，用GC分析脂肪酸甲酯(FAME)。
使用配有Omegawax 320熔融石英毛细管柱(Catalog No.24152， Supelco Inc.)的Hewlett-Packard 6890气相色谱仪分离和定量FAME(从 己烷层取5μL样品注射上样)。用程序控制烘箱温度在220℃保持2.6分 钟，以20℃/min上升到240℃并随后另外保持2.4分钟。载气由Whatman 氢发生器提供。将保留时间与那些市售的甲酯标准品(Nu-Chek Prep， Inc.)的保留时间比较。
表达pY98(SEQ ID NO：76)或pDMW367(SEQ ID NO：23)的解 脂耶氏酵母的脂肪酸概况和所提供的多种底物在图10A中示出。在图 10A中，阴影区表示提供的底物和产生的产物；脂肪酸鉴定为16:0(棕 榈酸)、16:1、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、LA、GLA、ALA、STA、 EDA、SCI(sciadonic acid或顺式-5，11，14-二十碳三烯酸；20:3 ω-6)、 DGLA、ARA、ETrA、JUP(juniperonic acid或顺式-5，11，14，17-二十碳 三烯酸；20:4 ω-3)、ETA和EPA。脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量 百分比(重量％)。
EgD5和MaD5对每种底物的Δ-5去饱和百分比(“Δ-5去饱和％”) 在图10B中示出，且取决于提供哪种底物，该去饱和百分比以产物(SCI、 JUP、ARA或EPA)的重量％除以底物和产物(分别为EDA和SCI、ETrA 和JUP、DGLA和ARA或ETA和EPA)的重量％之和然后乘以100表示为 ％来计算。
EgD5和MaD5的活性用图10B中的Δ-5去饱和百分比的比率 (“Eg/Ma的去饱和比率”)来比较，且以EgD5对具体底物的Δ-5去饱和 百分比除以MaD5对相同底物的Δ-5去饱和百分比来计算。
EgD5和MaD5对正确的ω-6脂肪酸底物(即DGLA)相对于对副产 物脂肪酸(即SCI)或对正确的ω-3脂肪酸底物(即ETA)相对于对副 产物脂肪酸(即JUP)的底物特异性也在图10B中示出。具体地讲，对 ω-6底物的底物特异性(“产物/副产物比”)以对DGLA的Δ-5去饱和百 分比(Δ-5去饱和％)除以对EDA的Δ-5去饱和百分比(Δ-5去饱和％) 来计算并在与DGLA的结果的相同行中示出。对ω-3底物的底物特异性 (“产物/副产物比”)以对ETA的Δ-5去饱和百分比(Δ-5去饱和％) 除以对ETrA的Δ-5去饱和百分比(Δ-5去饱和％)来计算并在与ETA的 结果的相同行中示出。此外，对ω-6底物的底物特异性的比(“Eg/Ma 的产物/副产物比”)以EgD5对ω-6底物(即DGLA/EDA)的底物特异 性除以MaD5对ω-6底物的特异性来测定。对ω-3底物的底物特异性的 比(“Eg/Ma的产物/副产物比”)以EgD5对ω-3底物(即ETA/ETrA)的 底物特异性除以MaD5对ω-3底物的特异性来计算。
EgD5和MaD5对ω-6或ω-3底物的偏好用图10B中的Δ-5去饱和百 分比的比率(“n-6/n-3的比率”)来比较，且以EgD5和MaD5对特定ω-6 底物(DGLA或EDA)的Δ-5去饱和百分比除以对相应ω-3底物(分 别为ETA或ETrA)的Δ-5去饱和百分比来计算。
从图10B中的结果看出，显然，当DGLA、EDA和ETA用作为底物 时，EgD5在耶氏酵母中的活性是MaD5活性的大约2.6至2.9倍。例外的 是对ETrA的活性，对这两种酶来说该活性大约相同。EgD5和MaD5对 正确的ω-6底物(即DGLA对EDA)的底物特异性在耶氏酵母中是相同 的，但是EgD5比MaD5对ETA(相对于ETrA)的偏好高2.5倍。EgD5对 ETA较于对ETrA的高的活性和优选的底物特异性在生产长链PUFA中 是有用的。较于对ω-3底物(即ETrA和ETA)，EgD5也分别对ω-6底物(即 EDA和DGLA)具有偏好。
实施例18
用于共表达高山被孢霉Δ-5去饱和酶(MaD5)与来源于小眼虫的Δ-9 延长酶(EgD9e)和来源于小眼虫的Δ-8去饱和酶(EgD8)的大豆表达 载体pKR916的构建
本实施例描述了用于共表达MaD5(SEQ ID NO：67，实施例17)与 EgD9e(SEQ ID NO：77；在美国申请No.11/601,563(提交于2006年11 月16日；代理人档案号BB-1562)中有所描述)和EgD8(SEQ ID NO：78； 在PCT公开No.WO 2006/012325中描述为Eg5)的大豆载体的构建。 小眼虫Δ-9延长酶(EgD9e)：
将含有小眼虫Δ-9延长酶(EgD9e；SEQ ID NO：77)的来源于眼虫 cDNA文库(eeglc)被称为eeglc.pk001.n5f的克隆用作模板，根据厂商 的方法用寡核苷酸引物oEugEL1-1(SEQ ID NO：79)和oEugEL1-2(SEQ ID NO：80)以及DNA聚合酶(产品目录号M0254S，New England Biolabs Inc.，Beverly，MA)扩增EgD9e。用Zero PCR克隆试剂盒 (Invitrogen Corporation)根据厂商的方法，将得到的DNA片段克隆到 克隆载体中，以产生pKR906(SEQ ID NO：81)。
起始质粒pKR72(ATCC登录号PTA-6019；SEQ ID NO：82，7085bp 序列)是以前在PCT公开No.WO 02/008269(藉此将其内容以引用的方 式并入本文)中描述的pKS123的衍生物，其含有旁侧为T7启动子和转 录终止子的潮霉素B磷酸转移酶基因(HPT)(即T7prom/HPT/T7term盒) (Gritz，L和Davies，J.，Gene，25：179-188(1983))和用于在细菌(如大 肠杆菌)选择和复制的细菌复制起点(ori)。此外，pKR72也含有旁侧 为35S启动子(Odell等人，Nature，313：810-812(1985))和NOS3′转录 终止子(Depicker等人，J.Mol.Appl.Genet.，1：561-570(1982))的用于 在植物如大豆中选择的HPT(即35S/HPT/NOS3′盒)。pKR72还含有旁 侧为β-伴大豆球蛋白α’亚基的启动子(Beachy等人，EMBO J.， 4：3047-3053(1985))和菜豆蛋白基因的3′转录终止区(Doyle等人，J.Biol. Chem.，261：9228-9238(1986))的NotI限制性位点，因而允许克隆到 NotI位点的基因在大豆种子中以很强的组织特异性表达。
将来自以前在PCT公开No.WO 02/00905(藉此将其内容以引用的 方式并入本文)中描述的质粒pKS102(SEQ ID NO：83)的、含有 T7prom/hpt/T7term盒和细菌ori的AscI片段与质粒pKR72(SEQ ID NO：82)的、含有βcon/NotI/Phas盒的AscI片段组合以产生以前在PCT 公开No.WO 04/071467(藉此将其内容以引用方式并入本文)中描述的 pKR197(SEQ ID NO：84)。
通过用NotI消化以从pKR906(SEQ ID NO：81)释放小眼虫的Δ-9 延长酶基因，并将其克隆进pKR197(SEQ ID NO：84)的NotI位点中以 产生中间克隆载体pKR911(SEQ ID NO：85)。
小眼虫Δ-8去饱和酶(EgD8)：
以前在PCT公开No.WO 2006/012325(藉此将其内容以引用方式并 入本文)中描述的质粒pKR680(SEQ ID NO：86)含有旁侧为Kunitz大 豆胰蛋白酶抑制剂(KTi)启动子(Jofuku等人，Plant Cell，1：1079-1093 (1989))和KTi 3’终止区(其分离方法在美国专利6,372,965中描述) 的小眼虫Δ-8去饱和酶(EgD8；SEQ ID NO：78；在WO 2006/012325中 描述为Eg5)以及其后的以前在PCT公开No.WO 2004/071467中描述的 大豆白蛋白转录终止子(即Kti/NotI/Kti3’Salb3’盒)。
用BsiWI消化质粒pKR680(SEQ ID NO：86)，并将含有EgD8的片段 克隆进pKR911(SEQ ID NO：85)的BsiWI位点中以产生pKR913(SEQ ID NO：87)。
高山被孢霉Δ-5去饱和酶(MaD5)：
以前在PCT公开No.WO 2006/012325(藉此将其内容以引用方式并 入本文)中描述的pKR767(SEQ ID NO：88)质粒含有旁侧为大豆球蛋 白Gy1基因启动子和豌豆豆球蛋白A2 3’转录终止区的高山被孢霉Δ-5 去饱和酶(MaD5；SEQ ID NO：67)(即Gy1/MaD5/legA2盒；其构建在 WO 2006/012325中有所描述)。
通过用SbfI消化而从pKR767(SEQ ID NO：88)释放Gy1/Mad5/legA2 盒，并将所得的片段克隆至pKR913(SEQ ID NO：87)的SbfI位点中以 产生pKR916(SEQ ID NO：89)。pKR916的示意图在图11A中示出。以 该方式，小眼虫Δ-9延长酶(在图11A中标记为“eug el1”)就与小眼虫 Δ-8去饱和酶(在图11A中标记为“eug d8-sq5”)和高山被孢霉Δ-5去 饱和酶(在图11A中标记为“高山被孢霉Δ-5去饱和酶”)在强的种子 特异性启动子后面共同表达。
实施例19
用于共表达小眼虫Δ-5去饱和酶(EgD5)与来源于小眼虫的Δ-9延长酶 (EgD9e)和来源于小眼虫的Δ-8去饱和酶(EgD8)的大豆表达载体 pKR1037的构建
本实施例描述了用于共表达EgD5(SEQ ID NO：1，实施例5)与 EgD9e(SEQ ID NO：77，实施例18)和EgD8(SEQ ID NO：78，实施 例18)的大豆载体的构建。
除了将含有MaD5的NotI片段替换为含有异丝水霉Δ-5去饱和酶 (SdD5；SEQ ID NO：94，其在PCT公开No.WO 2004/071467中有所描述) 的NotI片段外，起始质粒pKR974(SEQ ID NO：90)与pKR767(SEQ ID NO：88，实施例18)相同。此外，通过用MfeI消化、填补MfeI位点和重 新连接(即CAATTG被转变成CAATTAATTG)去除了pKR767(SEQ ID NO：88)的legA2终止子中的MfeI位点，因此，相较于pKR767(SEQ ID NO：88)的766bp，pKR974(SEQ ID NO：90)的legA2终止子为770bp。
为了将EgD5克隆进大豆表达载体中，需要在基因的5′端引入NotI 限制位点。本领域技术人员将认识到有许多种方式可将限制位点引入 到基因中，例如但不限制于PCR或通过亚克隆至含有合适位点的载体 中。在这种情况下，为了将NotI位点引入EgD5(SEQ ID NO：1)的5′端， 用MfeI消化pDMW367(SEQ ID NO：23)，然后用NcoI部分消化。将含 有全长EgD5(SEQ ID NO：1)的NcoI/MfeI片段克隆进在NcoI位点(即 GCGGCCGCAAACCATGG)正上游具有NotI位点的中间克隆载体的 NcoI/MfeI位点中。用NotI消化所得的质粒，然后将含有EgD5(SEQ ID NO：1)的片段克隆至pKR974(SEQ ID NO：90)的NotI位点中以产生 pKR1032(SEQ ID NO：91)。
通过用SbfI消化而从pKR1032(SEQ ID NO：91)释放 Gy1/EgD5/legA2盒，并将所得的片段克隆进pKR913(SEQ ID NO：87) 的SbfI位点以产生pKR1037(SEQ ID NO：92)。pKR1037(SEQ ID NO：92) 的示意图在图11B中示出。以该方式，小眼虫Δ-9延长酶(在图11B中 标记为“eug el1”)就能够与小眼虫Δ-8去饱和酶(在图1lB中标记为“eug d8-sq5”)和小眼虫Δ-5去饱和酶(在图11B中标记为“eug-d5 DS”)在强 的种子特异性启动子后面共同表达。
实施例20
小眼虫Δ-9延长酶、小眼虫Δ-8去饱和酶和异丝水霉Δ-17去饱和酶或 者与高山被孢霉Δ-5去饱和酶(pKR916和pKR328)或者与小眼虫Δ-5 去饱和酶(pKR1037和pKR328)在大豆体细胞胚中的共表达
本实施例描述了pKR916(SEQ ID NO：89，实施例18；含有EgD9e、 EgD8和MaD5)与含有异丝水霉Δ-17去饱和酶(SdD17)和用于潮霉 素选择的潮霉素磷酸转移酶基因的pKR328(SEQ ID NO：93，图11C， 以前在PCT公开No.WO 04/071467中有所描述)，在大豆体细胞胚中的 转化和表达。本实施例进一步描述了pKR1037(SEQ ID NO：92，实施例 19；含有EgD9e、EgD8和EgD5)与pKR328(SEQ ID NO：93，图11C) 在大豆体细胞胚中的转化和表达。
如实施例13中所述，用含有pKR916的表达盒(SEQ ID NO：89)的 AscI片段和完整的质粒pKR328(SEQ ID NO：93)或者含有pK1037的表 达盒(SEQ ID NO：92)的AscI片段和完整的质粒pKR328(SEQ ID NO：93) 转化豆胚发生悬浮培养物(cv.Jack)。
用改良的方法在大豆组织分化和成熟液体培养基(SHaM液体培养 基；Schmidt等人，Cell Biology and Morphogenesis，24：393(2005))中使 胚成熟。简而言之，在如实施例13所述在SB196中选择4周后，将胚丛 移至250mL锥形瓶中的35mL SB228(SHaM液体培养基)中。使用光强 度为60-85μE/m2/s、白天/黑夜光周期为16:8小时的冷白荧光于26℃在旋 转振荡器上以130rpm使组织维持在SHaM液体培养基中两周直至胚成 熟。在SHaM液体培养基中生长2周的胚在大小和脂肪酸含量方面与在 实施例13中所描述的在SB166/SB103上培养5-8周的胚等价。
培养基配方：
SB228-大豆组织分化和成熟(SHaM)(每升)
DDI H2O                             600mL
SHaM用FN-Lite Macro盐10×           100mL
MS Micro盐1000×                    1mL
MS FeEDTA 100×                     10mL
CaCl 100×                          6.82mL
B5维生素1000×                      1mL
L-甲硫氨酸                          0.149g
蔗糖                                30g
山梨糖醇                            30g
调节体积至900mL
pH5.8
高压灭菌
加入到冷却的培养基(≤30℃)：
*谷氨酰胺(终浓度30mM)4％          110mL
*注意：加入谷氨酰胺后最终体积将为1010mL。
由于谷氨酰胺降解相对较快，在使用培养基前立即加入可能是优 选的。加入谷氨酰胺后有效期为两周；不含谷氨酰胺的基础培养基可 保存更长时间。
SHAM 10×用FN-lite Macro-储液#1(每升)
(NH4)2SO4(硫酸铵)                  4.63g
KNO3(硝酸钾)                       28.3g
MgSO4*7H2O(七水硫酸镁)              3.7g
KH2PO4(磷酸二氢钾)                  1.85g
定容
高压灭菌
MS Micro 1000×-储液#2(每1升)
H3BO3(硼酸)                      6.2g
MnSO4*H2O(一水硫酸锰)             16.9g
ZnSO4*7H2O(七水硫酸锌)            8.6g
Na2MoO4*2H2O(二水钼酸钠)          0.25g
CuSO4*5H2O(五水硫酸铜)            0.025g
CoCl2*6H2O(六水氯化钴)            0.025g
KI(碘化钾)                       0.8300g
定容
高压灭菌
FeEDTA 100×-储液#3(每升)
Na2EDTA*(EDTA钠)                3.73g
FeSO4*7H2O(七水硫酸铁)           2.78g
*在加入铁之前EDTA必须完全溶解。
定容
溶液是光敏的。瓶子应该用箔包裹以避光。
高压灭菌
Ca 100×-储液#4(每升)
CaCl2*2H2O(二水氯化钙)             44g
定容
高压灭菌
B5维生素1000×-储液#5(每升)
盐酸硫胺素                        10g
烟酸                              1g
盐酸吡哆醇                        1g
肌醇                              100g
定容
冷冻保存
4％谷氨酰胺-储液#6(每升)
加热至30℃的DDI水                  900mL
L-谷氨酰胺                         40g
边搅拌边逐渐加入，并轻微加热。
不要超过35℃
定容
过滤灭菌
冷冻保存*
*注意：在31℃温浴中热融化储液以便完全溶解晶体。
在ShaM液体培养基中成熟后，从丛中移出个别胚，干燥并如上文 所述针对脂肪酸组成的改变进行筛选。
收获用pKR916(SEQ ID NO：89)和pKR328(SEQ ID NO：93)或 pKR1037(SEQ ID NO：92)和pKR328(SEQ ID NO：93)转化的一亚组 大豆胚(即，每个事件6个胚)并挑取放入玻璃GC小瓶中，然后通过酯 交换作用制备脂肪酸甲酯。为了进行酯交换，将50μL的氢氧化三甲基 锍(TMSH)和0.5mL的己烷加入到玻璃小瓶中的胚中，然后在室温下 摇晃孵育30分钟。使用配有Omegawax 320熔融石英毛细管柱(产品号 24152，Supelco Inc.)的Hewlett-Packard 6890气相色谱仪分离和定量脂 肪酸甲酯(从己烷层取5μL注射上样)。用程序控制烘箱温度在220℃保 持2.6分钟，以20℃/min上升到240℃并随后另外保持2.4分钟。载气由 Whatman氢发生器提供。将保留时间与那些市售的甲酯标准品 (Nu-Chek Prep，Inc.)的保留时间比较。
以这种方式，分析了60个用pKR916(SEQ ID NO：89)和pKR328 (SEQ ID NO：93)转化的事件以及45个用pKR1037(SEQ ID NO：92) 和pKR328(SEQ ID NO：93)转化的事件。每种转化(pKR916和pKR328、 pKR1037和pKR328)的具有最高Δ-5去饱和酶活性的10次事件的平均 脂肪酸谱概况别在图12A和图12B中示出。
在图12A和12B中，脂肪酸被鉴定为16:0(棕榈酸)、18:0(硬脂酸)、 18:1(油酸)、LA、ALA、EDA、SCI、DGLA、ARA、ERA、JUP、ETA 和EPA。列为“其它”的脂肪酸包括：18:2(5，9)、GLA、STA、20:0、 20:1(11)、20:2(7，11)或20:2(8，11)和DPA。这些“其它”脂肪酸 中的每一种在总脂肪酸中的相对丰度都小于3.0％。个别胚的脂肪酸组成 表示为总脂肪酸的重量百分比(重量％)，而平均脂肪酸组成则为每一 事件中6个胚的平均值。
Δ-5去饱和酶对“正确”底物(即DGLA和ETA)的活性表示为根 据下面公式计算的Δ-5去饱和百分比(“正确％Δ-5去饱和”)：([产 物]/[底物+产物])×100。更具体地讲，对“正确”底物的百分比Δ-5 去饱和可测定为：([ARA+EPA]/[DGLA+ETA+ARA+EPA])×100。
Δ-5去饱和酶对“错误”底物(即EDA和ERA)的活性也表示为Δ -5去饱和百分比(“错误％Δ-5去饱和”)，如下计算÷：([SCI+JUP]/[EDA +ERA+SCI+JUP])*100。
比较了MaD5和EgD5对“正确”底物(即DGLA和ETA)相对于“错 误”底物(即EDA和ERA)的底物特异性，并将该比较在图13中示出。 在图13中，MaD5(来自图12A的数据)和EgD5(来自图12B的数据) 对“正确”底物的Δ-5去饱和酶的活性(“正确％Δ-5去饱和”)绘制在 x-轴，而对“错误”底物的Δ-5去饱和酶活性(“错误％Δ-5去饱和”) 绘制在y-轴。
图12B显示，EgD5在大豆胚中的活性非常高，最高的10次事件的平均 转化(正确％Δ-5去饱和)为77％至99％。与MaD5比较，EgD5(图13) 的底物特异性对“正确”底物比对“错误”底物具有偏好。由于高的活性 和底物特异性，EgD5可用于在宿主细胞中生产PUFA，例如但不限于，EPA 和DHA。
本申请要求于2006年5月17日提交的美国临时专利申请60/801,172 的利益，在此将该申请的全部内容以引用方式并入本文。
序列表
<110>E.I.du Pont de Nemours & Company
<120>Delta-5 desaturase and it use for making
     polyunsaturated fatty acids
<130>BB1629
<150>US 60/801,172
<151>2006-05-17
<160>94
<170>PatentIn version 3.4
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<211>1350
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<213>Euglena gracilis
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<222>(1)..(1350)
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<220>
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     MUTASE PROMOTERS FOR GENE EXPRESSION IN OLEAGINOUS YEAST
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<221>misc_feature
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Plasmid pKR974
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<213>Artificial Sequence
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<223>Plasmid pKR1037
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<221>misc_feature
<222>(7810)..(7810)
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Plasmid pKR328
<400>93








<210>94
<211>1413
<212>DNA
<213>Saprolegnia diclina
<400>94
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