[0001] 本发明涉及抗病植物，特别是抗真菌界及卵菌(Oomycota)门生物体——卵菌的植物。本发明还涉及能赋予疾病抗性的植物基因和获得这种抗病植物的方法，用于提供针对卵菌病原体的保护。

[0002] 已广泛地研究过植物对真菌及卵菌病原体的抗性，包括病原体特异性的和广谱的抗性两个方面。在很多情况下是通过抗性显性基因表明了抗性。这些品种-特异性或基因-对-基因的抗性基因已被鉴定了许多，其通过直接或间接地与无毒性基因产物或来自病原体的其它分子相互作用来介导病原体识别。这种识别导致许多植物防御反应的活化，这些反应会阻滞病原体生长。

[0003] 在植物育种中经常想要鉴定主要为单基因显性抗性基因的新来源。在新引入了单抗性基因的栽培品种中，抗病保护通常会迅速地被破坏，因为病原体进化和适应的频率极快，能恢复成功感染寄主植物的能力。因此，非常需要获得新的疾病抗性来源。

[0004] 其它抗性机理例如通过调节植物中的防御反应起作用，如通过隐性mlo基因在大麦中介导的针对白粉菌病原体禾布氏白粉菌大麦专化型(Blumeria graminis f.sp.hordei)的抗性。带有野生型MLO基因突变等位基因的植物显示出几乎完全抗性，与真菌试图穿透单个受攻击的表皮细胞的细胞壁受挫相符。因此野生型MLO基因作为病原体应答的一种负向调节子发挥作用。这在WO9804586中有说明。

[0005] 其它实例是隐性白粉菌抗性基因，是在筛选对二孢白粉菌(Erysiphecichoracearum)的易感性丧失的过程中被发现的。至今已经克隆了三个基因，称为的PMR6编码一种果胶酸裂合酶-样蛋白质，PMR4编码胼胝质合酶，和PMR5编码未知功能的蛋白质。
mlo和pmr两个基因似乎能够特异性地引发对白粉菌的抗性，而非对卵菌如霜霉。

[0006] 已经通过两个主要方式获得广谱的病原体抗性，或系统形式的抗性如SAR。第一个是通过植物防御和细胞死亡的负调节子的突变，例如在拟南芥属(Arabidopsis)的cpr，lsd和acd突变体中。第二个是通过植物防御的诱导物或调节子的转基因过表达，例如在NPR1过表达植物中。

[0007] 这些已知的抗性机理的缺点是：除病原体抗性之外，这些植物通常显示可检测的附加和不良表型，例如生长受碍或自发形成的细胞死亡。

[0008] 本发明的一个目的是提供一种广谱的，持久的而且不伴随不良表型的抗性形式。

[0009] 在促成本发明的研究中，筛选对霜霉病病原体——寄生霜霉(Hyaloperonospora parasitica)的敏感度降低的拟南芥(Arabidopsis thaliana)突变体。在高度易感的拟南芥品系Lereds1-2中产生了EMS-突变体。详细分析了八种霜霉抗性(dmr)突变体，对应于6个不同的基因座。显微镜分析显示，在所有的突变体中，寄生霜霉的生长被严重降低。dmr3、dmr4和dmr5的抗性与植物防御的组成型活化有关。此外，dmr3和dmr4(但非dmr5)还能够抗丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和Golovinomyces orontii。

[0010] 相比之下，在dmr1、dmr2和dmr6突变体内没有观察到植物防御的活化增加。该研究结果已经在Van Damme等人(2005)MolecularPlant-Microbe Interactions
18(6)583-592中被描述。但是该文章没有公开DMR基因的鉴定和表征。

[0011] dmr6突变体是在拟南芥Ler eds1-2背景下筛选易感性丧失时鉴定出的。DMR6基因现在已经克隆并定性了。这样，发现了DMR6就是基因At5g24530，该基因编码了一种氧化还原酶(DNA及氨基酸序列在图2中描述)。氧化还原酶是催化电子从一个分子(氧化剂)转移到另一个分子(还原剂)上的一类酶。根据本发明，发现缺少功能性DMR6蛋白质会导致霜霉病抗性的产生。

[0012] 因此本发明提供了一种植物，其对病毒、细菌、真菌或卵菌来源的病原体有抗性，特征为这种植物与不具对所述病原体有抗性的植物相比，具有降低水平的、降低活性的或者完全缺乏DMR6蛋白。

[0013] 这种抗性形式对下述的病原体特别有效：卵菌门，比如白锈菌属(Albugo)，丝囊霉属(Aphanomyces)，圆梗霉属(Basidiophora)，盘梗霉属(Bremia)，Hyaloperonospora，Pachymetra，类霜霉属(Paraperonospora)，Perofascia，霜疫霉属(Peronophythora)，霜霉属(Peronospora)，霜指霉属(Peronosclerospora)，Phytium，疫霉属(Phytophthora)，单轴霉属(Plasmopara)，Protobremia，假霜霉属(Pseudoperonospora)，指梗霉属(Sclerospora)，Viennotia物种，以及属于真菌的病原体。

[0014] 根据本发明的抗性基于植物中DMR6蛋白质的改变，具体而言是其水平降低、活性降低或完全缺失。“DMR6蛋白质”这一术语在这一点上涉及DMR6基因产物，如由拟南芥属中At5g24530基因编码的蛋白质。这种改变可以通过多种方式实现。

[0015] 在本发明的一个实施方式中，DMR6蛋白质的水平降低是内源DMR6基因表达减少的结果。减少内源DMR6基因表达可以通过直接方法如基因沉默，或间接方法，通过修饰其调控序列或激活该基因的抑制来实现。

[0016] 可以在不同的水平实现调节DMR6基因以降低其活性或表达。首先，该内源的基因可以被直接突变。这可以通过诱变处理获得。备选地，可以通过转基因技术或通过渐渗杂交(introgression)将修饰的DMR6基因引入植物，或者可以在调控的水平上降低DMR6的表达，例如通过修饰调控序列或通过基因沉默。

[0017] 在本发明的另一个实施方式中，DMR6蛋白质水平降低是DMR6基因中的突变造成的，该突变导致DMR6的表达相对于无此突变存在的野生型DMR6基因降低，或导致mRNA或蛋白质稳定性降低。在一个具体的实施方式中，这是通过在DMR6的编码序列中产生突变导致产生无功能DMR6蛋白质(即没有酶活性或酶活性降低)而实现的。

[0018] 在本发明的另一个实施方式中，表达降低可以通过转录水平或翻译水平上DMR6基因表达下调而实现，如，通过基因沉默或通过影响DMR6基因表达的突变。

[0019] 本发明基于在拟南芥属中对寄生霜霉的抗性的研究，但这是可以更广泛地应用于植物的总构思，具体而言是对病原体例如卵菌门和真菌感染敏感的农作物。

[0020] 本发明适于由卵菌所引起的许多植物疾病，例如但不限于：莴苣的莴苣盘梗霉(Bremia lactucae)，菠菜的粉霜霉(Peronosporafarinosa)，葫芦科成员例如黄瓜和甜瓜的古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，洋葱的毁坏霜霉(Peronosporadestructor)，十字花科成员例如卷心菜的寄生霜霉，葡萄的葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，番茄和马铃薯的致病疫霉(Phytophthora infestans)，和大豆的大豆疫霉(Phytophthorasojae)。

[0021] 当通过遗传修饰DMR6基因或通过鉴定DMR6基因的突变来改变植物中的DMR6基因表达，而该基因仍未知时，必须首先对其进行鉴定。为通过遗传修饰DMR6基因或通过鉴定DMR6基因中的突变而产生病原体-抗性植物，特别是农作物，必须从这些植物物种中分离出直向同源的DMR6基因。

[0022] 各式各样的方法可用于鉴定其它植物中的直向同源序列。

[0023] 鉴定植物物种中的DMR6直向同源序列的方法，举例来说可以包含，在数据库中鉴定该植物物种的DMR6 EST；设计扩增完整DMR6转录物或cDNA的引物；用该引物进行扩增实验，获得相应的完整转录物或cDNA；和测定该转录物或cDNA的核苷酸序列。在仅部分编码序列已知的情况下扩增完整的转录物或cDNA的适用方法，是高级PCR技术5’RACE，3’RACE，TAIL-PCR，RLM-RACE和小载体PCR(vectorettePCR)。

[0024] 备选地，如果得不到该目的植物物种的核苷酸序列，就以与该目的植物密切相关的植物物种的DMR6基因来设计引物，基于通过多重核苷酸序列比对确定的保守结构域，用于PCR扩增直向同源序列。这类引物是适当简并的引物。

[0025] 评价指定序列是否为DMR6直向同源物的另一个可靠的方法是鉴定交互最佳命中(reciprocal best hit)。当使用Blast程序，用拟南芥属或别的植物物种的DMR6蛋白质或DNA序列检索时，一个指定植物物种的候选直向同源DMR6序列被鉴定为来自DNA数据库的最佳命中。使用BlastX检索法，检索该指定植物物种的所获的候选直向同源核苷酸序列与该DNA数据库(例如在NCBI或TAIR)之中存在的所有拟南芥属蛋白质的同源性。如果最佳命中和得分是与拟南芥属DMR6蛋白质，则该指定DNA序列可以被描述为是直向同源物或直向同源序列。

[0026] DMR6在拟南芥属中由单个基因编码，如从对这些植物物种公众可获得的完整基因组序列推导而来。已经在稻3直向同源物基因组及白杨2直向同源物的基因组中鉴定出该基因。在至今试验过的大部分其它植物物种中，DMR6似乎是由单个基因编码，如通过分析来自公共DNA数据库的mRNA序列和EST数据而确定的。用公共数据库之中存在的信息，通过核苷酸和氨基酸比较，鉴定这些植物中的直向同源基因和蛋白质。

[0027] 备选地，如果得不到所需植物物种的DNA序列，可通过异源杂交分离直向同源序列，其中使用拟南芥属或其他植物的DMR6基因的DNA探针，或者通过PCR方法，利用在DMR6编码序列中的保守结构域来限定引物。对于许多作物物种，可得到能够用于设计引物的部分DMR6mRNA序列，用于随后PCR扩增完整mRNA或基因组序列，以进行DNA序列分析。

[0028] 在一个具体的实施方案中，直向同源物是基因，其编码的蛋白质与拟南芥属DMR6蛋白质(At5g24530)或其它植物DMR6蛋白质具有至少50％同一性。在一个更具体的实施方案中，同一性是至少55％，更具体地60％，更具体地65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％。

[0029] 图1显示在公众可用的数据库中鉴定的以及通过对cDNA进行PCR扩增且随后测序而获得的直向同源DMR6序列(表1中进行描述)。鉴定直向同源DMR6序列后，通过标准的分子生物学技术鉴定了该基因的调控以及编码序列的完整核苷酸序列。对此，通过用来源于已知的DMR6基因的探针或引物进行DNA杂交或PCR，筛选该植物物种的基因组文库，用于鉴定含有DMR6基因的基因组克隆。备选地，高级的PCR方法，例如RNA连接酶介导的RACE(RLM-RACE)，可用于直接从基因组DNA或反转录的mRNA扩增基因以及cDNA序列。DNA测序随后即可表征该完整的基因或编码序列。

[0030] 一旦已知该基因的DNA序列，将该信息用于制备以调节DMR6基因表达的手段。

[0031] 为获得降低的DMR6蛋白活性，可以通过氨基酸替换下调DMR6基因的表达，或降低该DMR6蛋白质的酶活性，所述替换来自DMR6编码序列中核苷酸的改变。

[0032] 在本发明的一个具体实施方式中，DMR6基因表达的下调是使用RNAi通过基因-沉默获得。为此，产生表达DMR6反义构建体、最优化的微-RNA构建体、反向重复构建体或联合的有义-反义构建体的转基因植物，以便产生能导致基因沉默的相应于DMR6的dsRNA。

[0033] 在备选的实施方案中，通过RNAi下调了DMR6基因的一种或多种调节子(在转录激活子的情况下)。

[0034] 在另一实施方案中，调节子通过转基因过表达被上调(在阻遏蛋白的情况下)。在一个具体的实施方案中，通过从强启动子表达DMR6基因的阻遏蛋白获得过表达，强启动子例如通常用于植物生物技术的35S启动子。

[0035] 还可以通过在启动子，终止子区域或可能的内含子中调控元件的诱变获得DMR6基因的下调。在很多情况下，DMR6编码序列中的突变导致氨基酸替换或成熟前终止密码子，其负向影响所编码的DMR6蛋白质的表达或活性。

[0036] 通过使用诱变化学物质例如乙基甲磺酸酯(EMS)，用γ射线或快中子照射植物材料，或用其它方式，在植物中诱导这些突变。产生的核苷酸改变是随机的，但是在经诱变处理植物的一个大集合中，DMR6基因中的突变可以使用TILLING(基因组中的靶向诱导的局部损害)方法(McCallum等人(2000)Targeted screening for inducedmutations.Nat.Biotechnol.18，455-457，以及Henikoff等人(2004)TILLING.Traditional mutagenesis meets functionalgenomics.Plant Physiol.135，630-636)容易地鉴定。该方法的原理是基于从M2代经诱变植物的大集合的基因组DNA中PCR扩增目的基因。通过DNA测序或通过使用单链特异性核酸酶例如CEL-I核酸酶寻找点突变(Till等人(2004)Mismatch cleavage by single-strandspecific nucleases.Nucleic Acids Res.32，2632-2641)，鉴定了在目的基因中具有突变的个体植物。

[0037] 通过筛选许多植物，获得了突变等位基因的大集合，每个对基因表达或酶活性产生不同影响。例如基因表达或蛋白质水平可以如下测试：通过分析DMR6转录物的水平(例如通过RT-PCR)，或者用抗体定量DMR6蛋白质水平。

[0038] 然后对具有所需降低了的DMR6水平或DMR6表达的植物进行回交或者与其他种系杂交，以便只将所需的新等位基因转移到所需作物的背景中。

[0039] 本发明进一步涉及突变的DMR6基因。

[0040] 在特定实施方式中，本发明涉及具有成熟前终止密码子的dmr6等位基因，如dmr6-1等位基因。

[0041] 在另一实施方案中，本发明涉及莴苣、黄瓜以及菠菜的DMR6基因的突变型，如图3-5所示。

[0042] 本发明证实不具有或者具有降低水平的功能性DMR6基因产物的植物显示出对病原体，特别是卵菌和真菌来源病原体的抗性。利用这些知识，本领域技术人员可以鉴定给定植物物种的至今未知的天然变体，其具有导致功能性DMR6蛋白质的水平降低或缺失的DMR6基因变体、或DMR6蛋白质的突变形式，以及根据本发明使用这些天然变体。

[0043] 本发明进一步涉及使用DMR6启动子为植物提供疾病抗性，即，为植物提供对病毒、细菌、真菌或卵菌来源的病原体的抗性。根据本发明，已经证实DMR6响应病原体感染应答而转录上调。转录物分析及启动子DMR6-报告子品系二者都支持了该发现(见实施例1，下文)。因此，根据本发明的可被病原体诱导的DMR6启动子对控制导致植物的疾病抗性的可诱导系统的表达尤其有用。

[0044] 这种可诱导系统的一个实例导致在植物中产生了疾病抗性，且其中根据本发明的DMR6启动子是有效的，例如在WO 99/45125中有所描述，其中，对于一个与C-5卟啉代谢途径调控相关基因的反义核苷酸序列可操作地连接到一个可被病原体诱导的启动子上，并用于转化植物细胞。该反义核苷酸序列在对病原体应答时产生表达，从而有效地破坏了被转化植物细胞的卟啉代谢，而且破坏了包含病原体扩散的局部损害的产生。WO 96/36697还公开了导致植物中疾病抗性的可诱导系统，其中可诱导启动子控制了一种蛋白质的表达，该蛋白质能够激发植物中的超敏应答。EP 0474857进一步公开了在植物中诱导产生病原体抗性的方法，包括用编码病原体-衍生-无毒-基因/植物-衍生-抗性-基因这一对的多聚核苷酸序列转化植物，其中一种或两种诱导子肽的表达及抗性基因的表达都由可被病原体诱导的启动子调控。导致植物中产生病原体抗性的可诱导系统进一步的实例在例如WO98/32325中有所描述。

[0045] 在一个具体优选的实施方式中，本发明涉及为植物提供疾病抗性的方法，包括用含有至少一种可表达核酸的DNA构建体转化植物细胞，其中可表达核酸被可操作地连接到可被病原体诱导的启动子上，该启动子在植物细胞中可以操作，并且从所述的植物细胞中再生出转化的植物，其中可被病原体诱导的启动子为DMR6启动子，且其中可表达核酸的表达赋予该转基因植物疾病抗性。

[0046] 本发明还涉及通过所述方法获得的疾病抗性植物，及植物组织和由所述植物获得的种子。

[0047] 本发明具体而言涉及对病毒、细菌、真菌或卵菌来源的病原体有抗性的植物，其中的植物在其基因组内含有DNA构建体，该构建体含有至少一种可表达核酸，该核酸可操作地连接到可被病原体诱导的启动子上，其中所述可被病原体诱导的启动子为DMR6启动子。

[0048] 本发明还涉及DNA构建体本身，其含有至少一种可表达核酸，该核酸可操作地连接到可被病原体诱导的启动子上，其中所述可被病原体诱导的启动子为DMR6启动子。本发明的构建体可用来转化能再生为转化植物的植物细胞。而且，可以得到转化的植物组织和种子。将本发明构建体引入植物细胞的合适的方法为技术人员所知。

[0049] 根据本发明，通过“可操作性连接”指启动子和可表达核酸，如将基因通过能使可表达核酸(例如基因)由启动子起始转录的方式连接。

[0050] 通过“可表达核酸”所指的是可在细胞中表达的核酸(如，基因或基因的部分)，即能转录为mRNA并最终可被翻译成蛋白质的核酸。这种可表达核酸可以是基因组DNA、cDNA或化学合成DNA或其任何组合形式。

[0051] 根据本发明，DNA构建体包括所有使特定核酸在细胞中表达(即转录)的必需核酸元件。该构建体典型地含有可表达核酸(即要转录的核酸)和启动子。该构建体能适当地整合到如质粒或载体中。

[0052] 可表达核酸优选的为参与植物防御应答的基因，如，与植物的超敏应答(hypersensitivity response)相联系的基因。在植物的超敏应答(HR)中，植物在病原体侵入的位点通过一种自杀机制的诱导表达产生局部细胞死亡，该自杀机制应答病原体而触发所述的局部细胞死亡。通过这种方式，仅仅牺牲了少量植物细胞，病原体扩散就被有效地阻滞。参与植物防御反应的所述基因的实例有：调控蛋白质NPR1/NIM1(Friedrich et al.，Mol.Plant Microbe Interact.14(9)：1114-1124，2001)和转录因子MYB30(Vailleau et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(15)：10179-10184，2002)。

[0053] 在一个具体的实施方式中，可表达核酸编码了一种自体或异源的多肽，其能赋予植物疾病抗性。通过“自体多肽”所指的是转化的植物细胞中由转化植物细胞天然产生的基因表达出的任何多肽。通过“异源多肽”所指的是转化的植物细胞中由相对于转化植物细胞部分或完全外源(即不是由该转化植物细胞天然产生)的基因表达出的任何多肽。这种多肽的实例有哺乳动物Bax蛋白质，其编码一种促凋亡蛋白质并导致植物中细胞死亡(Lacomme和Santa Cruz，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(14)：7956-61，1999)，及真菌几丁质酶(de lasMercedes Dana et al.，Plant 25 Physiol.142(2)：722-730，2006)。

[0054] 优选地，DMR6启动子为拟南芥属DMR6启动子。DMR6启动子包括拟南芥DMR6编码区域(ATG起始密码子)上游的3000bp的区域并包括5’UTR区域。优选地，DMR6启动子包括如图11中所定义的核酸序列，和/或任何其功能性片段，即仍能起始与其可操作性相连的可表达核酸转录的所述序列的任何片段(或部分)，和/或其天然变体，即该启动子的天然变体，其可能含有小的多态性，但一般至少具有90％的同一性。

[0055] 在另一个优选的实施方式中，DMR6启动子为直向同源DMR6启动子，即直向同源DMR6基因的启动子。鉴定DMR6直向同源物的方法在下文实例2中有描述。一旦鉴定了DMR6直向同源物，则本领域技术人员能够使用标准分子生物学技术分离所述直向同源物各自的启动子。

[0056] 根据本发明，证明DMR6启动子能被病原体强烈地诱导，且DMR6启动子在其他非感染组织中没有高表达。因此，这是非常适合的启动子，可用于为植物提供对病毒、细菌、真菌或卵菌来源的病原体抗性的可诱导系统。使用本发明的DMR6启动子的可诱导系统能适用的具体病原体和植物的实例在上文中给出。

[0057] 在下面实施例中举例说明了本发明，但并非旨在以任何方式限制本发明。在实施例中参考下列附图。

[0058] 表1显示拟南芥属DMR6 mRNA及来自其他植物物种直向同源物序列的Genbank登录号及GenInfo标识符。

[0059] 表2显示用于基于图谱的DMR6克隆的标记物的PCR引物。

[0060] 表3显示在合适的植物表达载体中克隆dmr6直向同源物的引物对。

[0061] 图1显示拟南芥的DMR6蛋白质和来自耧斗菜物种(Aquilegiaspecies)、甜橙(Citrus sinensis)、中果咖啡(Coffea canephora)、黄瓜(Cucumis sativus)、陆地棉(Gossypium hirsitum)、莴苣(Lactuca sativa)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、稻(Oryzasativa)(3)、毛果杨(Populus trichocarpa)(2)、番茄(Solanumlycopersicum)(2)、高梁(Sorghum bicolor)、菠菜(Spinaciaoleracea)、葡萄(Vitis vinifera)、玉米(Zea mays)及姜(Zingiberofficinale)的直向同源物的氨基酸序列的比对，使用CLUSTAL W(1.83)多重序列比对程序(EBI)。在序列下方保守氨基酸以点标明，相同的氨基酸用星号标明。

[0062] 图2分别显示拟南芥DMR6基因(At5g24530，gi 42568064，Genbank NM_122361)和蛋白质(gi 15238567，Genbank NP_197841)的核酸及氨基酸序列序列。

[0063] 图3分别显示莴苣的DMR6直向同源物的核酸和衍生氨基酸序列。

[0064] 图4分别显示菠菜的DMR6直向同源物的核酸和衍生氨基酸序列。

[0065] 图5显示了黄瓜和甜瓜的DMR6直向同源物的核酸和衍生氨基酸序列。

[0066] 图6显示拟南芥属dmr6突变体的霜霉病抗性。(a)定量接种后7天，dmr6-1突变体(BC2，E37品系)相对其亲本品系Ler eds1-2上寄生霜霉分离株Waco9形成的分生孢子梗的定量；及dmr6-2突变体(FLAG_445D09 T-DNA品系)相对其亲本品系Ws-4上寄生霜霉分离株Waco9形成的分生孢子梗的定量。(b)在dmr6-1突变体中通过与At5g24530互补重建易感性。定量Ler eds1-2，dmr6-1及5号互补品系((#121、122、211、231和241)上每毫克苗重的寄生霜霉孢子。

[0067] 图7显示拟南芥属DMR6基因及dmr6-1和dmr6-2突变的结构。DMR6基因含有4个外显子，编码序列为1026个碱基。指出了两个等位基因；dmr6-1在2号外显子上有一个碱基改变，dmr6-2的2号内含子中插入了一个T-DNA。

[0068] 图8显示在空白处理的Ler植物中或接种了兼容或非兼容寄生霜霉分离株的Ler植物中，DMR6的相对转录物水平。接种后不同日期确定转录物水平。周期阈值(ΔCT)的差异反映了达到相对于ACTIN2任意阈值产物浓度所需的附加的PCR扩增循环数。较低的ΔCT值表明了较高的转录物水平。

[0069] 图9显示DMR6启动子-报告子(pDMR6::GUS)构建体在转基因拟南芥属品系中的表达，通过仅以X-gluc(图d和e)或品红-Xgluc(图a-c)作底物和寄生霜霉生长的台盼蓝染色来观察。(a)Ler eds1-2(pDMR6::GUS)以寄生霜霉，Cala2分离株接种后3天，(b)Co1-0(pDMR6::GUS)以寄生霜霉，Waco9分离株接种后3天，(c)Ler eds1-2(pDMR6::GUS)以寄生霜霉，Emoy2分离株接种后3天，(d)Co1-0(pDMR6::GUS)创伤后3天，(e)Co1-0(pDMR6::GUS)BTH使用后3天。

[0070] 图10显示这些基因的转录物水平的Q-PCR分析；选择At4g14365、At1g14880、ACD6、PR-1、PR-2和PR-5，因为它们在dmr6-1微阵列分析中显示上调。(a)这六个基因在dmr6-1中相对于Ler eds1-2的转录水平以及另外的DMR6转录物。(b)dmr6-2相对于Ws-4，六个防御相关基因的基因转录物增加。ΔCT反映了达到ACTIN2转录物水平所需的附加的PCR循环数。较低的ΔCT值表明了较高的转录物水平。

[0071] 图11显示DMR6基因起始密码子上游的3kb区域的核苷酸序列。拟南芥的(at5g24530)，包括启动子和5’-UTR(下划线部分)。

[0072] 图12分别显示了番茄的DMR6直向同源物的核酸和衍生氨基酸序列。

[0073] 图13分别显示了本生烟(Nicotiana benthamiana)的DMR6直向同源物的核酸和衍生氨基酸序列。

[0074] 图14显示了拟南芥属dmr6-1与来自甜瓜(Cs)、菠菜(So)、莴苣(Ls)和番茄(S1)的DMR6的互补。

[0075] 实施例1

[0076] 拟南芥属DMR6(At5g24530)基因为霜霉病易感性所需要

[0077] 实验步骤

[0078] 寄生霜霉生长和感染

[0079] 寄生霜分离株Wco9由M.Aarts博士(WUR，Wageningen，NL)提供，Cala2分离株由E.Holub博士(Warwick HRI，Wellsbourne，UK)提供，分别在拟南芥属Ws-0和Ler上维持生长。每周将培养液(400000孢子/ml)用喷枪转移至10天大小的健康幼苗(Holub，E.B.等人，Mol.Plant Microbe Interact.7：223-239，1994)。幼苗在空气中干燥大约45分钟并在生长室里置于封口盖下于相对湿度100％、16℃下培养，每天给予9小时光照(100mE/m2/s)。在接种之后(dpi)7天定量孢子形成水平，可以通过计数每个幼苗产生的分生孢子梗，每个试验品系至少需要40个幼苗(图6a)，或者可以通过在5dpi在水中分离孢子并确定孢子浓度，得出每mg叶组织的孢子数(图6b)。

[0080] 产生回交的dmr6品系

[0081] dmr6突变体与亲本品系Ler eds1-2及Ler回交两次(BC2)。通过PCR分析就野生型EDS1基因选择用Ler产生的BC2品系。

[0082] 克隆DMR6

[0083] 通过使用Cereon数据库设计的PCR标记物完成dmr6基因的精确作图，鉴定出Co1-0和Ler之间插入和缺失(IND)的差异。标记物：At5G24210基因中IND_MOP9；At5G24420基因中IND_K16H17；At5G24820基因中IND_T4C12；At5G24950_60基因中IND_T11H3及At5G25270基因中IND_F21J6，这些用来作图(表2)。对新重组体的附加筛选起始于300个F2植物，得到两个IND的标记物IND_MOP9与IND_T4C12之间的8个F2重组植物，这两个标记物在61个基因的两侧。7个附加的标记物(M450-M590；表2)将区域减少到At5g24420与At5g24590之间的dmr6基因座的18个候选基因。At5g24530的序列分析表明有一个点突变导致了dmr6-1突变体中2号外显子内的一个终止密码子。

[0084] dmr6的T-DNA插入品系的鉴定

[0085] 鉴定了第二个dmr6等位基因，445D09，在Ws-4隐性背景中由INRAVersailles产生的FLAG T-DNA插入品系。用在At5g24530基因中设计的引物——LP引物(5’-caggtttatggcatatctcacgtc-3’)，结合T-DNA右边界引物Tag3’(5’-ctgataccagacgttgcccgcataa-3’)或RB4(5’-tcacgggttggggtttctacaggac-3’)进行PCR证实了此T-DNA插入。At5g24530第二个内含子中精确的T-DNA插入是通过测序由来自左右边界T-DNA引物结合基因特异性引物LP或RP(5’-atgtccaagtccaatagccacaag-3’)扩增出的扩增子而得到的。

[0086] cDNA合成

[0087] RNA(来自10天幼苗的大约100mg叶组织)用RNaesy试剂盒(Qiagen，Venlo，The Netherlands)提取并用无RNase的DNase试剂盒(Qiagen)处理。总RNA用UVmini-1240分光光度计(Shimadzu，Kyoto，Japan)定量。cDNA用Superscript III逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)及oligo(dT)15(Promega，Madison，WI，USA)按照制造商说明书合成。

[0088] dmr6-1突变体的互补

[0089] 通过使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的浸花法(floral dip method，Clough and Bent，1998)转化dmr6植物而产生互补品系，该根癌农杆菌含有在35S启动子后的、来自Co1-0的At5g24530基因。该构建体通过PCR扩增来自Co1-0 cDNA的全长At5g24530而产生，所用引物含有定向克隆所用的限制性位点。正向引物(5’-ttctgggatccaATGGCGGCAAAGCTGATATC-3’)含有一个靠近起始密码子(ATG)的BamHI限制性位点，扩增DMR6的5’-末端且用反向引物(5’-gatatatgaattcttagttgtttagaaaattctcgaggc-3’)在终止密码子之后的3’-末端产生了一个EcoRI位点。将35S-DMR6-Tn克隆到pGreenII0229(Hellens，R.P.，Edwards，E.A.，Leyland，N.R.，Bean，S.，and Mullineaux，P.M.(2000))中。pGreen是一个多用途且灵活的二元Ti载体，用于土壤杆菌属介导的植物转化(Plant Mol.Biol.42，819-832)。分离对300μM的DL-草胺膦(BASTA)抗性的幼苗，分析其寄生霜霉易感性及通过RT-PCR分析其DMR6表达水平。

[0090] 通过RNAi建立DMR6的敲减(Knock down)品系

[0091] 在Ler eds1-2和Co1-0的背景中产生RNAi品系。产生了Co1-0At5g24530基因的782bp长的cDNA扩增子。用Phusion DNA聚合酶(2U/μL)并使用两套不同的引物组合完成该PCR反应。来自第一套DMR6基因特异性引物组合(RNAiDMR6F：5’-aaaaagcaggctGACCGTCCACGTCTCTCTGAA-3’和RNAiDMR6R：5’-AGAAAGCTGGGTGAAACGATGCGACCGATAGTC-3’)的扩增子用作第二轮PCR扩增的模板，这轮扩增用的是允许重组进GateWay克隆系统的pDONR7载体的通用引物。第二轮PCR中，使用了10μl第一轮PCR(98℃变性30sec；接着为10个循环：98℃ 10sec；58℃ 30sec；72℃ 30sec)产物作为模板，在总体积20μl中。第二轮PCR以attB1(5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’)及attB2(5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggt-3’)为引物在50μl反应体系中进行(变性30sec；接着是5个循环：98℃ 10sec；
45℃ 30sec；72℃30sec及20个循环：98℃ 10sec；55℃ 30sec；72℃ 30sec；最后是72℃下进行最后一步10min的延伸)。PCR产物经过凝胶纯化后，使用克隆酶BP酶将50ng片段重组入150ng的pDONR7载体中。将载体转化入电感受态(electrocompotent)DH5α大肠杆菌细胞，并且分离含有正确插入片段的质粒，将具有DMR6扩增子的100ng pDONR7用于LR反应从而将插入片段以两个相反方向重组入150ng的pHellsgate8载体中。在转化入大肠杆菌之后，选取spectomycin抗性克隆，分离的质粒通过经NotI消化得到正确的片段大小及通过对At5G24530的一个单内部引物(DfragmentF：5’-gagaagtgggatttaaaatagaggaa-3’进行菌落PCR来验证，如果插入片段以相反的方向插入2次，则能够检测稻1420bp的扩增子。将具有相反方向的双插入片段的正确pHellsgate8质粒转化入电感受态土壤杆菌属菌株C58C1。从土壤杆菌分离质粒，并再次转化入大肠杆菌中以通过NotI消化验证质粒和插入片段的正确大小。经过再次验证的土壤杆菌属菌株用于浸花法转化Co1-0和Ler eds1-2植物。在1/2xGM平板上就卡那霉素抗性筛选得出的种子，移出T1幼苗，下一代种子T2用于分析DMR6表达及寄生霜霉易感性。

[0092] dmr6突变体的基因表达谱

[0093] 按上文所述的方法分离总RNA。通过MessageAmp aRNA试剂盒(Ambion)扩增mRNA。CATMA阵列(Crowe et al.，2003)片 上含有大约 25000个基因特 异性标签，将其按de Jong等人描述的标准化条件(deJong M.，van Breukelen B.，Wittink，F.R.，Menke，F.L.，Weisbeek，P.J.， 及 Van den Ackerveken G.(2006)。
Membrane-associated transcripts in Arabidopsis；theirisolation and
characterization by DNA microarray analysis andbioinformatics.Plant J.46，
708-721)进行杂交。cDNA模板按前述方法产生，用于定量PCR。用ABIPRISM 7700序 列 检 测 系 统 (AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA)，使 用SYBR Green I(AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA)作为报告子染料重复三次测定每个转录物的循环阈值。转录物的引物对为：DMR6(QDMR6F：5’-TGTCATCAACATAGGTGACCAG-3’和 QDMR6R：5’-CGATAGTCACGGATTTTCTGTG-3’)，At1g14880(QAt1g14880F：
5’-CTCAAGGAGAATGGTCCACA-3’ 和 QAt1g14880R：5’-CGACTTGGCCAAATGTGATA-3’)，At4g14365(QAt4g14365F：5’-TGGTTTTCTGAGGCATGTAAA-3’ 和 QAt4g14365R：
5’-AGTGCAGGAACATTGGTTGT-3’)，ACD6(QACD6F：5’-TGGACAGTTCTGGAGCAGAT-3’和QACD6R：
5’-CAACTCCTCCGCTGTGAG-3’)，PR-5(QPR-5F：5’-GGCAAATATCTCCAGTATTCACA-3’和QPR-5R：
5’-GGTAGGGCAATTGTTCCTTAGA-3’)，PR-2(QPR-2F：5’-AAGGAGCTTAGCCTCACCAC-3’ 和QPR-2R：5’-GAGGGAAGCAAGAATGGAAC-3’)，PR-1(QPR-1F：5’-GAACACGTGCAATGGAGTTT-3’和QPR-1R：5’-GGTTCCACCATTGTTACACCT-3’)和ACT-2(QACT2 F：5’-AATCACAGCACTTGCACCA-3’和QACT2R：5’-GAGGGAAGCAAGAATGGAAC-3’)，产生100个碱基对的片段。

[0094] 结果

[0095] dmr6突变体中负责病原体抗性的基因的特征

[0096] Van Damme等人2005，如上文所述公布了一种对寄生霜霉有抗性的dmr6突变体。抗性水平可以通过计数接种寄生霜霉(分离株Waco9或Cala2，得自G.Van den Ackerveken博士，Plant-MicrobeInteractions Group，Utrecht大学，Utrecht，NL)后七天每个幼苗的分生孢子梗的数目而检验。亲本品系Ler eds1-2(Parker等人，1996，Plant Cell 8：
2033-2046)是高度易感的，其被用作阳性对照(定为100％)。

[0097] 图6a显示，相对于亲本品系的幼苗，感染的dmr6突变体上分生孢子梗的形成减少了，其中显示了与亲本品系Ler eds1-2回交两次的霜霉病抗性dmr6-1突变体及突变体dmr6-2(FLAG_445D09 T-DNA品系)上寄生霜霉Waco9的孢子形成(分生孢子梗/幼苗)相对于对照品系的定量结果。

[0098] 根据本发明，van Damme等人，2005，如上文，其中描述的dmr6突变体中负责对寄生霜霉抗性的基因通过作图和测序候选基因的组合而被克隆。之前，将隐性dmr6突变作图在5号染色体上的nga139标记物附近，在包含74个基因的区域内。精确的作图将dmr6基因座关联到位于相应基因上的、标记物At5g24420和At5g24590之间含有BACs T13K7和K18P6的一个作图区间。这使得dmr6区间被限定在一个含18个候选基因的区域。对dmr6及亲本品系Ler eds1-2中的18个基因的比较序列分析揭示了At5g24530基因第二个外显子上有一个点突变。这个G变成了A的单碱基突变对于EMS突变是典型的，它将编码序列的核苷酸691号位TGG(trp密码子)变成了TGA(成熟前终止密码子)(图7)。这个提前的终止密码子将342个aa的预期氧化还原酶在保守催化结构域之前的141号位置截短了，说明dmr6是个无功能等位基因。预期At5g24530编码序列(图2)编码分子量为39.4kDa的蛋白质。目前还没有描述At5g24530的生物学功能。

[0099] At5g24530就是DMR6

[0100] 在来自INRA，Versailles的突变体集合的T-DNA插入品系(FLAG_445D09)中鉴定出第二个等位基因，dmr6-2。T-DNA插入片段在At5g24530的第二个内含子当中的存在以及位置(图7)通过PCR和序列分析而确定(数据未显示)。对T-DNA插入片段为纯合的FLAG_445D09品系子代对寄生霜霉分离株Waco9有抗性，而亲本品系(Ws-4)对其易感(图6a)。At5g24530转录物可以使用在Ws-4中2、3号外显子中的引物通过RT-PCR来扩增，但不能用纯合的dmr6-2品系中的引物(数据未显示)，表明可认为dmr6-2是第二个无功能等位基因。

[0101] 为确证At5g24530是对寄生霜霉易感性所必需的这一想法，dmr6-1突变体用来自At5g24530的、被克隆受35S启动子控制的cDNA进行转化。在五个独立dmr6-1 T2幼苗中，通过RT-PCR所证实At5g24530的强烈过表达(数据未显示)。所有对转基因纯合的T3品系都显示重建了对寄生霜霉分离株Cala2的易感性(图6b)，这证实了At5g24530就是DMR6。该互补与两个相互独立的dmr6突变体的鉴定一起清楚表明了对寄生霜霉的易感性需要功能性DMR6基因。

[0102] DMR6在寄生霜霉感染期间被转录激活

[0103] 为研究寄生霜霉感染期间的DMR6表达，从接种后第0天(2小时)到接种后(dpi)第5天的6个不同时间点，通过定量PCR测量相对转录物水平(图8)。从10天的Ler幼苗分离RNA，这些幼苗分别用水(空白)、兼容或非兼容的寄生霜霉分离株而喷洒接种。接种后2小时(0dpi)不同处理中的DMR6转录物水平相等。从1dpi起，兼容或非兼容相互作用中的幼苗与空白处理幼苗相比，DMR6转录物水平显著增加。1dpi时非兼容相互作用(ΔCT为3.5，大约有11倍的诱导)中DMR6转录物水平略微提高但比兼容相互作用(ΔCT为3.0，大约有8倍的诱导)中的显著更高。表达水平随时间进一步提高，在4-5dpi时达到稳定的高水平。在这些时间点上，DMR6转录物水平在兼容相互作用中比在非兼容相互作用中更高。在兼容和非兼容寄生霜霉相互作用期间升高的DMR6转录物水平提示DMR6在植物防御中起作用。在我们的三种防御增强突变体dmr3、dmr4和dmr5(Van den Ackerveken等人，未发表)中都证实了DMR6的防御相关表达。而且，在Genevestigator Mutant Surveyor中进行的DMR6水平计算机模拟分析(Zimmermann，P.，Hennig，L.，和Gruissem，W.(2005).Geneexpression analysis and network discovery usingGenevestigator.Trends Plant Sci.10，407-409)表明该基因组病原体抗性突变体mpk4和cpr5中强烈被诱导。在cpr5/npr1双突变体中，DMR6转录物维持高水平表明DMR6表达的诱导大部分是不依赖于NPR1的。水杨酸似乎是衰老时DMR6表达诱导时一个重要信号，因为nahG转基因植物(表达细菌水杨酸水解酶基因)只有低水平的DMR6转录物。

[0104] 为更详细研究DMR6的表达是如何在生物和非生物压力下激活的，产生DMR6报告品系。在转基因Co1-0和Ler eds1-2植物中研究了DMR6表达的定位，所述植物含有连接于uidA(beta-葡萄糖苷酸酶GUS)报告基因(pDMR6::GUS)的DMR6启动子。为观察寄生霜霉菌丝生长，使用台盼蓝染色，为观察GUS活性，使用品红-Xgluc作为β-葡萄糖苷酸酶底物产生品红沉淀。在未感染的植物中，不同植物器官——根、分裂组织、花、花粉和种子中都没有检测到GUS表达。DMR6的表达在兼容相互作用中被诱导——感染了Cala2的Ler eds1-2(图9a)及感染了分离株Waco9的Co1-0(图9b)。GUS表达还在非兼容相互作用——用分离株Emoy2接种的Ler eds1-2——中被诱导(图9c)。如图9a和9b所显示的，DMR6表达限定在其中寄生霜霉已经形成吸器的细胞当中。含有最新形成的吸器的植物细胞没有显示出可检测的GUS活性水平(图9a，用星号表示)。在非兼容相互作用中(图9c)，DMR6启动子的活性只能在与初始侵入菌丝接触的细胞中检测到。在由超敏应答(HR，通过台盼蓝染色所显示，图9c中用星号标明)导致死亡的细胞中未能检测到GUS活性，可能是由于这些细胞中的蛋白质降解。为测试含吸器细胞中DMR6的表达是否由类创伤应答引起，用剪刀切割损伤幼苗，并在3天后就GUS活性染色。没有观察到可检测的启动子DMR6的GUS表达，表明DMR6的表达不是由创伤诱导的(图9d)。而且，测试DMR6表达的局部诱导对苯丙噻二唑(BTH，一种水杨酸(SA)的功能类似物)的应答。在BTH处理后3天，GUS活性主要局限于新形成的叶子，而非成熟叶子中(图9e)。对pDMR6::GUS品系的分析证实了上述表达数据且突出了DMR6对寄生霜霉感染应答时严格局限的诱导。

[0105] dmr6-1突变体组成型地表达防御相关转录物

[0106] 为阐明缺乏DMR6如何导致寄生霜霉抗性，将dmr6-1突变体与Lereds1-2亲本品系的转录组比较进行分析。来自dmr6-1和Ler eds1-2的14天幼苗地上部分的mRNA的探针在全基因组CATMA微阵列上进行杂交。总共发现58个基因在dmr6-1中有显著的差别表达，其中51个基因转录物水平提高，7个基因转录物水平降低。这51个诱导的转录物中有一组明显鉴定为植物防御反应激活相关的基因，例如：ACD6、PR-5、PR-4/HEL和PAD4。这些数据表明DMR6丢失导致一组特异性防御相关转录物的激活。发现DMR6是被dmr6-1诱导的基因之一确证了DMR6是防御相关的。为测试防御相关基因的诱导表达是否由DMR6丢失造成，而不是由于留存于回交的dmr6-1突变体中附加的甲基磺酸乙酯(ethane methyl sulfonate，EMS)突变造成的，选择一组基因(At4g14365、At1g14880、ACD6、PR-1、PR-2和PR-5)通过在dmr6-1和dmr6-2两种突变体中进行定量PCR证实其转录物水平(图10)。我们只测试dmr6-1突变体中DMR6转录物水平(图10a)，因为dmr6-2突变体(图10b)当中的T_DNA插入片段破坏了DMR6转录物。与Lereds1-2相比，在dmr6-1中通过Q-PCR证实了在微阵列分析中观察到的、对DMR6的诱导(图10a)。图10a和b显示所有六个所选基因相比于亲本品系，在两种dmr6突变体中都提高。所选防御相关基因在dmr6突变体中观察到的表达提高表明DMR6的缺失激活了植物防御应答。这组防御相关转录物的激活可能是dmr6突变体中对寄生霜霉抗性的主要原因。

[0107] 实施例2

[0108] 在作物中鉴定DMR6直向同源物

[0109] 1.根据序列同源性筛选文库

[0110] 图2显示了拟南芥的DMR6编码序列和蛋白质的核苷酸及氨基酸序列。将公共文库的核苷酸及氨基酸序列与图2的序列相比较。该比较结果鉴定了耧斗菜属物种、甜橙、中果咖啡、黄瓜、陆地棉、莴苣、蒺藜苜蓿、稻(3)、毛果杨(2)、番茄(2)、高梁、菠菜、葡萄、玉米及姜中的完整DMR6编码序列及预测的氨基酸序列。如此鉴定的直向同源蛋白质的序列信息列于表1，且在图1中以多重比对显示。至于许多其它植物物种，直向同源DNA片段可以以与拟南芥属或其它植物DMR6蛋白质序列的交互最佳命中通过BlastX鉴定。

[0111] 2.通过异源杂交鉴定直向同源物

[0112] 使用标准的分子生物学方法，通过与任何植物物种的DNA杂交，用如图2所示的拟南芥DMR6 DNA序列作为探针查找同源序列。使用该方法，通过对限制酶消化的DNA进行southern杂交或通过与基因组或cDNA文库杂交，检测直向同源基因。这些技术为本领域技术人员公知。作为替代探针，任何其它更密切相关的植物物种的DMR6 DNA序列可用作探针。

[0113] 3.通过PCR的方法鉴定直向同源物

[0114] 对于许多作物物种，可获得用于设计引物的部分DMR6 mRNA或基因序列用于随后PCR扩增完整的cDNA或基因组序列。当可得到5’及3’序列时，通过DMR6特异性5’正向引物及3’反向引物PCR扩增缺失的内部序列。如果只有5’、内部或3’序列可用时，设计正向和反向两种引物。与可得到的质粒多接头引物联合，从目的植物物种的基因组及cDNA文库中扩增插入片段。以类似的方式，通过高级PCR技术：5’RACE、3’RACE、TAIL-PCR、RLM-RACE或小载体PCR，扩增缺失的5’或3’序列。

[0115] 例如，提供了莴苣DMR6 cDNA的测序。使用tblastn工具，从拟南芥属DMR6氨基酸序列开始，从NCBI的Genbank EST数据库中鉴定了几个莴苣属DMR6EST。EST的聚类及比对得到了一个5’DMR6片段的共有序列。为获得完整的莴苣DMR6 cDNA，对莴苣苗的mRNA使用RLM-RACE试剂盒(Ambion)。使用在来源于EST的5’DMR6共有序列中设计的2个引物(Lsat_dmr6_fw1：CGATCAAGGTCAACACATGG，及Lsat_dmr6_fw2：TCAACCATTACCCAGTGTGC)及来自该试剂盒的3’RACE引物获得3’mRNA序列。根据该装配顺序，设计新引物以扩增来自cDNA的完整DMR6编码序列，从而提供如图3所示的核苷酸序列及衍生的蛋白序列。

[0116] 已从基因组及EST数据库中鉴定了来自多于10个不同的植物物种的完整DMR6编码序列。从DNA序列的比对中，选择了编码序列中的保守区域用于设计简并寡核苷酸引物(对于简并核苷酸，缩写是根据作为所有合成寡核苷酸的公司所用的标准代码的IUB核苷酸符号：G＝鸟嘌呤，A＝腺嘌呤，T＝胸腺嘧啶，C＝胞嘧啶，R＝A或G，Y＝C或T，M＝A或C，K＝G或T，S＝C或G，W＝A或T，B＝C或G或T，D＝G或A或T，H＝A或C或T，V＝A或C或G，N＝A或C或G或T)。

[0117] 用于获得指定植物物种的内部DMR6 cDNA序列的方法如下：

[0118] 1.使用标准方法分离mRNA，

[0119] 2.使用寡dT引物及标准方法合成cDNA，

[0120] 3.使用简并正向和反向寡核苷酸进行PCR反应，

[0121] 4.通过标准的琼脂糖凝胶电泳分离PCR片段，从该凝胶分离预期大小的片段，[0122] 5.使用标准方法将分离的PCR片段克隆到质粒载体中，

[0123] 6.通过PCR确定具有正确插入片段大小的质粒，再通过DNA测序分析，

[0124] 7.使用blastX进行的序列分析显示哪些片段含有正确的内部DMR6序列，[0125] 8.然后所述内部DNA序列可用于设计基因-及物种-特异性的引物进行5’及3’RACE，从而通过RLM-RACE获得完整的DMR6编码序列(如上所述)。

[0126] 例如，提供了黄瓜DMR 6cDNA的测序。对于黄瓜而言，以下引物的几种引物组合成功地从cDNA扩增内部编码序列的节段：正向引物：dmr6_deg_
fw1B(TTCCAGGTDATTAAYCAYGG)，dmr6_deg_fw2B(CATAAYTGGAGRGAYTAYCT)，dmr6_deg_fw3B(GARCAAGGRCARCAYATGGC)和 dmr6_deg_fw4(AATCCTCCTTCHTTCAAGGA)以 及 反 向 引物 dmr6_deg_rv3B(AGTGCATTKGGGTCHGTRTG)，dmr6_deg_rv4(AATGTTRATGACAAARGCAT)，和dmr6_deg_rv5(GCCATRTGYTGYCCTTGYTC)。克隆及测序扩增的片段后，设计黄瓜DMR6-特异 性 引 物 用 于 5’RACE((Cuc_dmr6_rv1：TCCGGACATTGAAACTTGTG 和 Cuc_dmr6_rv2：
TCAAAGAACTGCTTGCCAAC)及3’RACE(Cuc_dmr6_fw1：CGCACTCACCATTCTCCTTC和Cuc_dmr6_fw2：GGCCTCCAAGTCCTCAAAG)。最终扩增并测序了完整的黄瓜DMR6 cDNA序列(图5)。类似方法被用于菠菜(图4)、番茄(图12)和本生烟(图13)。

[0127] 如该实施例所述鉴定的直向同源物可以使用众所周知的技术修饰，以诱导降低DMR6表达或活性的突变，而获得对真菌及卵菌具有抗性的非遗传改造的植物。备选地，该直向同源物的遗传信息可用于设计载体进行基因沉默。然后转化相应的农作物以获得抗卵菌的植物。

[0128] 实施例3

[0129] 种子的突变

[0130] 用诱变剂处理目的植物物种的种子以便在基因组中引入随机点突变。突变的植物生长结籽，就DMR6转录物水平或活性的减少或缺失筛选下一代。这可通过监测DMR6基因表达的水平，或用TILLING方法通过搜索核苷酸改变(突变)，通过DNA测序，或通过任何其它用于鉴定核苷酸变化的方法而实现。选择的植物为纯合的，或通过自交或杂交而成为纯合的。就对目的病原体的抗性增强，测试具有DMR6转录物活性缺失或降低的所选纯合植物，以证实疾病抗性的增强。

[0131] 实施例4

[0132] 将突变的等位基因转移到所需作物的背景中

[0133] 通过杂交和基因型筛选突变的等位基因而获得所需突变等位基因向作物中的渐渗杂交。这是目前作物的标记辅助育种的标准方法。

[0134] 实施例5

[0135] DMR6启动子用于可被病原体诱导的基因表达及产生疾病抗性植物的用途[0136] 精确控制转基因的表达是工程改造植物提高疾病抗性的关键。过去，转基因的组成型过表达常常导致质量低劣的植物。因此建议使用可被病原体诱导的启动子，通过该启动子转基因仅在需要其的时间和地点(在感染位点)表达。

[0137] 工程基因的局部及可诱导表达，例如控制开关基因、诱导子或Avr基因、抗微生物基因或毒素基因，导致了防御或细胞死亡的活化，而这些会产生病原体抗性，如Gurr和 Rushton(Trends inBiotechnology 23：275-282，2005) 所 述。De wit(Annu.Rev.Phytopathol.30：391-418，1992)提供了一个好的实例，他提出使用Avr9-Cf9组合来实现诱导的细胞死亡以产生疾病抗性。表达的组织特异性及可诱导性对这些方法是至关重要的，如Gurr和Rushton(Trends in Biotechnology 23：283-290，2005)所描述的。

[0138] 根据本发明，基于启动子-GUS分析，证实DMR6启动子显示出强烈的、可诱导的、局部的表达。因此DMR6启动子非常适合在转基因植物中工程改造疾病抗性。DMR6启动子由拟南芥属DMR6编码序列(ATG起始密码子)上游的2.5kb区域组成，还包括5’UTR(如图11中所描述的)。随后使用本领域技术人员已知的标准技术，将该可被病原体诱导启动子用于工程改造合适的转基因构建体。

[0139] 使用来自给定植物物种的直向同源DNA序列为PCR设计引物。然后这些用于筛选目的植物物种基因组库，以鉴定含有DMR6直向同源物及其启动子和调控序列的基因组克隆。备选地，通过筛选有对应于DMR6直向同源基因的、标记的PCR片段的文库来分离基因组克隆。测序揭示了启动子的核苷酸序列。然后通过PCR扩增DMR6直向同源编码序列(ATG起始密码子)上游的2-5kb区域(因此包括5’UTR)以工程改造构建体以进行植物转化。

[0140] 实施例6

[0141] 这个实例证明拟南芥dmr6-1突变体可由来自4种不同作物物种的DMR6直向同源物来互补。为此，将黄瓜(Cs)、菠菜(So)、莴苣(Ls)及番茄(S1)的DMR6直向同源物克隆进受35S启动子控制的植物表达载体，接着将这个载体转化进拟南芥一个突变体dmr6-1。

[0142] 简言之，通过标准方法分离mRNA，使用oligo dT引物及标准方法合成cDNA。接着，使用下面表3描述的各作物的引物对来产生PCR片段。使用Invitrogen公司pENTR/D-TOPO克隆试剂盒，将产生的PCR产物克隆进pENTR/D-TOPO载体，得到的具有正确插入片段大小(通过PCR确认)的质粒通过DNA测序进行分析。用来自Invitrogen公司的LR克隆酶II完成向pB7WG2,0载体的重组，所得的质粒用PCR和限制性酶消化进行分析。将合适的质粒转化入根癌农杆菌C58C1PGV2260，且来自土壤杆菌属的质粒用PCR和限制性酶消化进行分析。

[0143] 用上述构建体，通过浸入土壤杆菌属溶液转化拟南芥dmr6-1植物，并使用农作物DMR6克隆引物通过RT-PCR确认拟南芥T1植物中作物DMR6的过表达(表3)。最后用寄生霜霉Cala2感染拟南芥T2和T3植物以验证互补。结果显示于图14中。

[0144] 如图14中所示，所有测试的DMR6直向同源物都能与拟南芥突变体dmr6-1互补，这表明鉴定的DMR6直向同源物编码与拟南芥DMR6具有类似功能的DMR6蛋白质。

[0145] 表

[0146] 表1列出了拟南芥属DMR6 mRNA的表达序列标签(EST)和mRNA或蛋白质序列及来自其它植物物种的直向同源序列的GI编号(GenInfo标识符)和Genbank登录号。GI编号(GenInfo标识符，有时小写为“gi”)是一个识别特定序列的独特整数。GI编号是一系列数字，连续地分配给由NCBI处理的每个序列记录。因而每当序列变化时，GI编号也随之变化。NCBI会给进入Entrez处理的所有序列分配GI编号，包括来自DDBJ/EMBL/GenBank的核苷酸序列，来自SWISS-PROT、PIR和许多其它的蛋白质序列。因而GI编号提供独特的序列标识符，其与详细说明确切序列的数据库来源无关。如果GenBank中的一个序列被修改，甚至仅修改单个碱基对，也会给该更新的序列分配一个新的GI编号。登录号保持相同。GI编号始终稳定并且可检索。因此，参考该表中的GI编号可以清楚并明确地鉴定相应序列。

[0147] 表1

[0148]

[0149]

[0150]

[0151] 表2

[0152] 对DMR6基因作图及克隆时所用插入/删除标记物(大小差异标于括号内)的引物序列

[0153]引物名称 基因 INDEL/酶 -正向引物 反向引物
IND_MOP9 At5G24210 tttgggaacagaaaaagt catattcaaaagggaaaa
tggaggt tcccaga
IND_K16H17 At5g24420 tggggttgtggtttattc tggccaatagtagttgat
tgttgac acgcaaga
IND_T4C12 At5g24820 tctcgggtaagacacaag tattccaacttgcgacgt
tcgagat agagcat
IND_T11H3 At5g24950- ccaattgggttatttact cggcttttaacaacatat
60 tcgatt tttcca
IND_F21J6 At5g25270 aacacatcaccaagatga cctctgccccaagaaata
atccaga ttgagat
M450 At5G24450 18 agctttgtatggtagtgc gcggtatacgggggttaa
caatga aatcta
M490 At5g24490 TaqI atggccaaccactctttg acaagcaagaagaacagc
ttac gaag
M525 At5g24520- TaqI gaaatttggttgttggca tcaagatcttcatattct
30 tttatc cattcca
M545 At5G24540/ 41 cagctgaagtatgtttca cttgcaattgtt gggact
50 tcccttt aggtaa
M555 At5G24550/ 14 tcactaaccagtgaaaaa tatacagcgaatagcaaa
60 ggttgc gccaag
M470 At5g24470 HphI ccgcgagtgt aatatatc cagtttaacgcatgaagt
tctcct gctagt
M590 At5g24590 pdmI gcatcatttgtaccgtac tagtggatactctgtccc
tgagtc tgaggt

[0154] 表3

[0155] 用于在合适植物表达载体中克隆dmr6直向同源物的引物对

[0156]