Novel Bacillus licheniformis gene product and improved biotechnological production method based on it to produce an odor substance

本発明は、５つの異なる代謝経路での臭気物質の生成に関与する、以前に報告されていない２５種のバシラス・リケニホルミス遺伝子およびそれから得られる遺伝子産物、ならびにこれらの遺伝子の同定を基礎としてこのような臭気物質の生成を低減することができるように改良された生物工学的な生産法に関する。

本発明は、生物工学の分野、特に目的の価値ある産物を生成することのできる微生物の発酵による、価値ある産物の調製にある。 これには、例えば低分子量の化合物、例えば栄養補助食品もしくは医薬関連化合物などの調製、またはその多様性のためにそれに向けた産業的な用途の領域が広いタンパク質の調製が含まれる。 第１の場合では、価値ある産物を調製するために関連する微生物の代謝特性を利用および／または変更させる、第２の場合では、目的とするタンパク質の遺伝子を発現させる細胞を使用する。 どちらの場合でも、遺伝子改変生物（ＧＭＯ）を主に利用する。

微生物発酵に関する従来技術は、特に工業的規模で広範囲にわたっており、発酵槽の技術的な設計による生成速度および栄養利用性に関する該当菌株の最適化から、関連する細胞それ自体および／または発酵培地からの価値ある産物の単離にまで広がる。 遺伝子および微生物に関する手法、プロセス工学に関する手法、ならびに生化学的手法がこれらに適用される。 本発明の目的は、実際の発酵工程、特に使用する菌株の遺伝子特性のレベルで差し障る使用した微生物の一般的性質に関してこの方法を改良することである。

生物工学的な工業上の生産では、関連する微生物は、その代謝特性に相応しく設計された発酵槽で培養される。 培養中、微生物は、与えられた基質を代謝し、通常は、実際の産物のほかに、普通は利益がなくかつ／または不必要な副作用をもたらすことのある数多くの他の物質を生成する。

これらには、臭気物質および／または有毒物質が含まれるが、かかる物質は、厄介でおよび／または有害な物であり、発酵の間でさえ流出空気を介して放出され、そして／または価値ある産物のその後の後処理の際にも完全には除去されないため製品の質を損なう。 したがって、同時発生する臭気物質および／または有毒物質は、第１に、関わる従業員およびプラント周辺環境という意味で、生産工程にとって有害である。 第２に、製品が所望の品質（規格）に到達しないと、意図した使用領域（例えば食品製造）に利用できなくなる場合もあり、これはかなりの経済的不利益を意味する。 逆に、臭気物質および／または有毒物質の生成を低減すれば、職業上および環境上の安全性を増大させ、製品販売に向けてさらなる使用領域および市場を開拓することができるはずである。

微生物発酵の際に頻繁に認められる臭気は、揮発性の分枝および非分枝の脂肪酸、アルコール、ならびにジアミンの類に由来する有機小分子によって引き起こされる。 これらには、分枝脂肪酸類からのイソ吉草酸、２−メチル酪酸、イソ酪酸；酪酸、プロピル酸（非分枝の脂肪酸）、ブタノール（アルコール）、カダベリンおよびプトレシン（ジアミン）が含まれる。

その上、これらの揮発性物質の一部、例えばプトマインとしても知られているカダベリンやプトレシンは、ヒトおよび動物にとって毒性がある。 したがって、これらを濃度および関連生物への曝露時間によっては、臭気物質としてだけでなく有毒物質としても規定することができる。

このような化合物を、発酵産物からその後に除去するための努力は、現在もなされている。 この目的のために、生成した価値ある産物の通常の後処理は、細胞分解産物および高分子量化合物を除去するための工程のほかに、脱臭と呼ばれる追加の処理工程も含む。 通常は、これに濾過、沈殿工程、および／またはクロマトグラフィー工程を加えるが、これらの各工程も、ある程度は脱臭に寄与する。 しかし、除去のために、これらすべての工程を実施しても、上述の基準からすると純度は不十分でしかならない。

発酵槽からの流出空気も同様に、生産工程の間の汚染を最小限に抑えるために調べられる。

とはいえ、可能であれば臭気原因に対抗する、すなわち関連物質が産生されないようにすることが望ましいはずである。 例えば、第１に、後続の精製および後処理工程の数を少なく保つことが可能であれば、それらの工程が、それぞれの場合において所望の生成物に対して物理化学的なストレスとなり、収量を減少させるので有利であると思われる。 したがって、全体としてより良好な製品品質が得られるはずである。 第２に、生産条件それ自体が改善され、発酵槽流出空気をフィルター処理するシステムは、よりシンプルにしておくことができるはずである。 このような臭気原因の抑制は、微生物自身の性質を変えることができれば、その微生物に対するさらなる操作への耐用性をも増大させるはずである。

したがって、本発明の目的は、微生物、特にバシラス種のグラム陽性細菌の発酵の際に生じ、そのものが原因であると考えられる不快臭および／または有毒化合物の生成を低減することである。 本発明は、好ましくは、臭気物質および／または有毒物質を著しく低下させる微生物を得るために、遺伝子レベルで実施することが意図されている。 部分的な課題においては、本発明は、それに関連する代謝経路を同定すること、その経路に存在する反応を触媒し、可能性のある出発点として課題を解決するのに適切なタンパク質および／または酵素をコードする遺伝子を発見すること、ならびに関連するヌクレオチド配列の同定によって、所望の遺伝子改変のためのツールを獲得し、対応する用途を提供することを目的とする。

この課題を解決すべく、以下の５つの代謝経路が同定された。
（１）イソ吉草酸を合成するための（ロイシン異化の一部としての）代謝経路、
（２）２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸を合成するための（バリンおよび／またはイソロイシン異化の一部としての）代謝経路、
（３）ブタノールおよび／または酪酸を合成するための（酪酸代謝の一部としての）代謝経路、
（４）プロピル酸を合成するための（プロピオン酸代謝の一部としての）代謝経路、および（５）カダベリンおよび／またはプトレシンを合成するための（リジンおよび／またはアルギニン異化の一部としての）代謝経路。

これらの経路に存在する反応を触媒し、出発点として本発明の生物工学的な生産工程に適するタンパク質および／または酵素をコードする以下の遺伝子が見いだされた。 幾つかの場合に関して非連続的な番号付けは、各場合において、それぞれの代謝経路についての以下の完全な記述に基づく。 さらに、それらのいくつかは、そうした経路のうちの複数の経路に関与する：
−イソ吉草酸を合成するための、またロイシン異化の一部としての代謝経路については、
（１）Ｌ−ロイシン脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．４．１．９）、
（２）３−メチル−２−オキソブタン酸脱水素酵素または２−オキソグルタル酸脱水素酵素Ｅ１（Ｅ．Ｃ．１．２．４．２）、
（３）イソバレリルＣｏＡをイソ吉草酸とコエンザイムＡに加水分解する酵素、
（４）アシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
（５）メチルクロトニルカルボキシラーゼ、
（６）３−メチルグルタコニルＣｏＡヒドラターゼ、および（７）エノイルＣｏＡヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）、
−２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸を合成するための、そしてバリンおよび／またはイソロイシン異化の一部としての代謝経路については、
（１）分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．４２）、
（２）３−メチル−２−オキソブタン酸脱水素酵素または２−オキソグルタル酸脱水素酵素Ｅ１（Ｅ．Ｃ．１．２．４．２）、
（３）２−メチルブチリルＣｏＡを２−メチル酪酸とコエンザイムＡに、またはイソブチリルＣｏＡをイソ酪酸とコエンザイムＡに加水分解するための酵素、
（４）アシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
（５）エノイルＣｏＡヒドラターゼ（タンパク質）（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）、
（６）３−ヒドロキシ−アシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３５）、
（７）アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、
（８）エノイル−（３−ヒドロキシイソブチリル）ＣｏＡヒドロラーゼタンパク質、および（９）３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３１）または酸化還元酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．−．−）、
−ブタノールおよび／または酪酸を合成するための、そして酪酸代謝の一部としての代謝経路については、
（１）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１５７）、
（２）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（Ｅ．Ｃ．４．２．１．５５）、
（３）ブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．２５）、
（４）リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１９）、
（５）酪酸キナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．２．７）、
（６）ブチルアルデヒド脱水素酵素、および（８）ＮＡＤＨ依存性ブタノール脱水素酵素Ａ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．−）、
−プロピル酸を合成するための、そしてプロピオン酸代謝の一部としての代謝経路については、
（１）コハク酸−プロピオン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、
（２）酢酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼまたはプロピオン酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼ（Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）および（３）酢酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼまたはプロピオン酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼ（Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）、および−リジンおよび／またはアルギニン異化の一部としての、カダベリンおよび／またはプトレシンを合成するための代謝経路については、
（１）リジン脱炭酸酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１８）および／またはアルギニン脱炭酸酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１９）、
（２）アグマチナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．１１）、および（３）オルニチン脱炭酸酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１７）。

最後に、バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３中の関連遺伝子の配列決定を行って、これらのタンパク質／酵素をコードするヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を完全に決定した、すなわち目的とする微生物の所望の改変に利用できるようにした。 それらの配列は、本出願用の配列表に収集してある。 それらは、以下の核酸（奇数）、ならびにそれから派生する、酵素、または複数のサブユニットからなるそれら酵素の一部分としてのタンパク質のアミノ酸配列（偶数、各場合の後方）を含むものである。 すなわち、
−配列番号１および２によって規定される、推定上の分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．４２）、
−配列番号３および４によって規定される、推定上の分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．４２）、
−配列番号５（ｓｐｅＡ遺伝子）および６によって規定される、リジンおよび／またはアルギニン脱炭酸酵素（タンパク質ＳｐｅＡ；Ｅ．Ｃ．４．１．１．１８またはＥ．Ｃ．４．１．１．１９）、
−配列番号７（ｙｕｇＪ遺伝子）および８によって規定されるＮＡＤＨ依存性ブタノール脱水素酵素Ａ（タンパク質ＹｕｇＪ；ＥＣ．１．１．１．−）、
−配列番号９および１０によって規定される、ブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．２５）またはアシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
−配列番号１１および１２によって規定される、ブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．２５）またはアシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
−配列番号１３および１４によって規定される３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１５７）、
−配列番号１５および１６によって規定される、推定上のエノイルＣｏＡヒドラターゼタンパク質（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）、
−配列番号１７および１８によって規定される、ほぼ確定したエノイル−（３−ヒドロキシイソブチリル）ＣｏＡヒドロラーゼタンパク質、
−配列番号１９（ｅｃｈＡ８遺伝子）および２０によって規定される、ほぼ確定したエノイルＣｏＡヒドラターゼ（タンパク質ＥｃｈＡ８；Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）、
−配列番号２１および２２によって規定される、アシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
−配列番号２３（ａｃｓＡ遺伝子）および２４によって規定される酢酸-ＣｏＡリガーゼまたはプロピオン酸-ＣｏＡリガーゼ（またはシンテターゼ、タンパク質ＡｃｓＡ；Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）、
−配列番号２５（ｙｎｇＦ遺伝子）および２６によって規定される３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（タンパク質ＹｎｇＦ；ＥＣ．４．２．１．５５）、
−配列番号２７（ｙｕｓＪ遺伝子）および２８によって規定される、ブチリルＣｏＡ脱水素酵素（タンパク質ＹｕｓＪ；Ｅ．Ｃ．１．３．９９．２５）またはアシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
−配列番号２９（ｙｋｗＣ遺伝子）および３０によって規定される３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素（タンパク質ＹｋｗＣ；ＥＣ．１．１．１．３１）または酸化還元酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．−．−）、
−配列番号３１および３２によって規定される、ほぼ確定したリン酸ブチリルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１９）、
−配列番号３３および３４によって規定される、ほぼ確定した酪酸キナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．２．７）、
−配列番号３５（ａｃｓＡ遺伝子）および３６によって規定される酢酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼまたはプロピオン酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼ（タンパク質ＡｃｓＡ；Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）、
−配列番号３７（ｙｔｃｌ遺伝子）および３８によって規定される酢酸-ＣｏＡリガーゼまたはプロピオン酸-ＣｏＡリガーゼ（タンパク質Ｙｔｃｌ；ＥＣ．６．２．１．１）、
−配列番号３９（ｓｐｅＡ遺伝子）および４０によって規定される、リジンおよび／またはアルギニン脱炭酸酵素（タンパク質ｓｐｅＡ；Ｅ．Ｃ．４．１．１．１８またはＥ．Ｃ．４．１．１．１９）、
−配列番号４１（ｙｓｉＢ遺伝子）および４２によって規定される、ほぼ確定したエノイルＣｏＡヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）、
−配列番号４３および４４によって規定される３−ヒドロキシ−アシルＣｏＡ脱水素酵素の類似物（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３５）、
−配列番号４５および４６によって規定される３−メチル−２−オキソブタン酸脱水素酵素または２−オキソグルタル酸脱水素酵素Ｅ１（Ｅ．Ｃ．１．２．４．２）、
−配列番号４７（ｙｈｆＬ遺伝子）および４８によって規定される、ほぼ確定した酢酸-ＣｏＡリガーゼまたはプロピオン酸-ＣｏＡリガーゼ（タンパク質ＹｈｆＬ；Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）または酸ＣｏＡリガーゼ（Ｅ．Ｃ．６．２．１．−）、あるいは−配列番号４９（ｙｗｈＧ遺伝子）および５０によって規定されるアグマチナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．１１）。

これらはすべて、本出願によって入手可能となった。

すなわち、言明した課題は、それぞれの場合において、以下で規定し、従来技術に記載されている配列とは一線を画する対応する相同性領域を含む、配列表に示され、バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３から得ることができる配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、および４９の全２５種の核酸によって、原則として同じように解決される。 同様に、この課題は、ここでも以下で規定する対応する相同性領域を含めて、それから得られる配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０の遺伝子産物によって解決される。 従来技術に記載されているそれぞれの最も類似した核酸およびアミノ酸配列は、関連データベースの登録項目に即して、実施例２（表１）にまとめてある。 請求項に記載の相同性領域は、各場合においてこの情報を基礎として規定した。 言明した課題の本発明による解決策は、各場合において、実際に微生物から生じる核酸およびタンパク質であることが好ましい。

それらの遺伝子のうちのどれが好ましいかは、個々の場合において、培養しようとする個々の菌株（ともすると異なる遺伝子活性）およびそれぞれの代謝状況（例えば、ある特定のＣまたはＮ供給源の（過剰）供給）を考慮に入れて、実験によって解明しなければならない。 このため、原則として同じように産生される、種々の関連遺伝子の一連のいくつかの突然変異体を、他の点では同一の条件下で並行して生成し、培養することが必要である。

別の解決策は、（１）イソ吉草酸（ロイシン異化の一部としての）、（２）２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸（バリンおよび／またはイソロイシン異化の一部としての）、（３）ブタノールおよび／または酪酸（酪酸代謝の一部としての）、（４）プロピル酸（プロピオン酸代謝の一部としての）、および／または（５）カダベリンおよび／もしくはプトレシン（リジンおよび／またはアルギニン異化の一部としての）、を合成するための代謝経路の１つまたは複数が、好ましくはそれらの経路で活性のある上述の酵素／タンパク質によって、特に好ましくは本発明によって提供されるヌクレオチド配列によって機能的に不活性化される発酵方法によって示される。 後者は、例えば、ノックアウト構築体を作製し、それをベクターを介して宿主細胞に導入して遺伝子破壊が起こるようにするため、それ自体既知かつ従来技術で確立されている方法で使用することができる。

別の解決策は、特に工業的生産に関連する適切に改変された微生物により示され、それを使用するすべての発酵方法、およびその中でも特に価値ある産物の製造に使用されるものによって示される。

さらに、これらの遺伝子産物は、本発明を基礎として、そのそれぞれの生化学的特性に従って反応混合物または反応方法に利用できるが、このことは、特に、（１）イソ吉草酸、（２）２−メチル酪酸および／もしくはイソ酪酸、（３）ブタノールおよび／もしくは酪酸、（４）プロピル酸、および／または（５）カダベリンおよび／もしくはプトレシンの合成を意味する。

本発明は、少なくともこれらの重要な代謝経路が関係している限り、臭気原因を抑制できる。 これは、関与するタンパク質をコードする核酸の助けを借りて、これらのタンパク質を介し、同定された代謝経路を遮断することによって、関連物質が全く産生されない様に実質的に防止することができるためである。 したがって、これは、第１に、後続の精製および後処理工程の数を少なく保つことが可能であるが、これらの工程は各場合において所望の生成物に対して物理化学的なストレスとなり、収量を減少させるので有利である。 すなわち、全体として製品品質は向上する。 第２に、生産条件それ自体が改善され、発酵槽流出空気をフィルター処理するためのシステムをよりシンプルにすることができる。 この臭気原因の抑制は、遺伝子レベルで機能するので、それぞれの微生物それ自体の性質に作用し、したがってその微生物に対するさらなる操作への耐用性を増大させる。

特に、工業的な発酵は、こうして改良され、発酵産物の費用節減にもなるはずである。

加えて、同定された遺伝子および遺伝子産物は、したがって多様な用途、例えば関連化合物の化学合成および／または少なくとも一部の生体触媒合成に利用できる。

本出願の実施例に記載するように、これは、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，３８１２４ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ）から入手可能な基準参照株であるバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３のゲノムＤＮＡの配列決定を行うことによって、この種に対する前記の新規な２５の遺伝子を同定することが可能となった。 これらの遺伝子は、本明細書に記載の臭気物質を合成する反応に関与する酵素または酵素サブユニットをコードするものである。

この点について従来技術で知られている最も類似している遺伝子および関連するタンパク質は、各場合において、本出願の実施例２（表１）に示す配列相同性を示す。 本出願が扱う保護範囲は、各場合においてそれによって規定される。 したがって、以下のすべての核酸およびタンパク質は、原則として本発明の等価な実施態様である：
−２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸の合成に関与する遺伝子産物（推定上の分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ；Ｅ．Ｃ．２．６．１．４２）をコードし、配列番号１で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも６７％の同一性、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸、
−２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸の合成に関与し、配列番号２で示すアミノ酸配列に対して少なくとも７３％の同一性、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物（推定上の分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ；Ｅ．Ｃ．２．６．１．４２）、
−２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸の合成に関与する遺伝子産物（推定上の分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ；Ｅ．Ｃ．２．６．１．４２）をコードし、配列番号３で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも７８％の同一性、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸、
−２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸の合成に関与し、配列番号４で示すアミノ酸配列に対して少なくとも８３％の同一性、少なくとも８５％、８７．５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物（推定上の分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ；Ｅ．Ｃ．２．６．１．４２）、
−カダベリンおよび／またはプトレシンの合成に関与する遺伝子産物（リジンおよび／またはアルギニン脱炭酸酵素；Ｅ．Ｃ．４．１．１．１８または４．１．１．１９）をコードし、配列番号５で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも７８％の同一性、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸ｓｐｅＡ、
−カダベリンおよび／またはプトレシンの合成に関与し、配列番号６で示すアミノ酸配列に対して少なくとも８９％の同一性、少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物ＳｐｅＡ（リジンおよび／またはアルギニン脱炭酸酵素；Ｅ．Ｃ．４．１．１．１８またはＥ．Ｃ．４．１．１．１９）、
−ブタノールおよび／または酪酸の合成に関与する遺伝子産物（ＮＡＤＨ依存性ブタノール脱水素酵素Ａ；Ｅ．Ｃ．１．１．１．−）をコードし、配列番号７で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも８１％の同一性、少なくとも８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸ｙｕｇＪ、
−ブタノールおよび／または酪酸の合成に関与し、配列番号８で示すアミノ酸配列に対して少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物ＹｕｇＪ（ＮＡＤＨ依存性ブタノール脱水素酵素Ａ；Ｅ．Ｃ．１．１．１．−）、
−イソ吉草酸、２−メチル酪酸、イソ酪酸、ブタノールおよび／または酪酸の合成に関与する遺伝子産物（アシルＣｏＡ脱水素酵素；Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）をコードし、配列番号９で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも７９％の同一性、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸、
−イソ吉草酸、２−メチル酪酸、イソ酪酸、ブタノールおよび／または酪酸の合成に関与し、配列番号１０で示すアミノ酸配列に対して少なくとも８６％の同一性、少なくとも８７．５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物（アシルＣｏＡ脱水素酵素；Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
−イソ吉草酸、２−メチル酪酸、イソ酪酸、ブタノールおよび／または酪酸の合成に関与する遺伝子産物（アシルＣｏＡ脱水素酵素；Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）をコードし、配列番号１１で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも６４％の同一性、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸、
−イソ吉草酸、２−メチル酪酸、イソ酪酸、ブタノールおよび／または酪酸の合成に関与し、配列番号１２で示すアミノ酸配列に対して少なくとも６７％の同一性、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物（アシルＣｏＡ脱水素酵素；Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
−ブタノールおよび／または酪酸の合成に関与する遺伝子産物（３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素；Ｅ．Ｃ．１．１．１．１５７）をコードし、配列番号１３で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも６７％の同一性、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸、
−ブタノールおよび／または酪酸の合成に関与し、配列番号１４で示すアミノ酸配列に対して少なくとも６９％の同一性、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物（３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素；Ｅ．Ｃ．１．１．１．１５７）、
−イソ吉草酸、２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸の合成に関与する遺伝子産物（推定上のエノイルＣｏＡヒドラターゼタンパク質；Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）をコードし、配列番号１５で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸、
−イソ吉草酸、２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸の合成に関与し、配列番号１６で示すアミノ酸配列に対して少なくとも６２％の同一性、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物（推定上のエノイルＣｏＡヒドラターゼタンパク質；Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）、
−イソ吉草酸、２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸の合成に関与する遺伝子産物（ほぼ確定したエノイル−（３−ヒドロキシイソブチリル）−コエンザイムＡヒドロラーゼタンパク質）をコードし、配列番号１７で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも６６％の同一性、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸、
−イソ吉草酸、２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸の合成に関与し、配列番号１８で示すアミノ酸配列に対して少なくとも６６％の同一性、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物（ほぼ確定したエノイル−（３−ヒドロキシイソブチリル）−コエンザイムＡヒドロラーゼタンパク質）、
−イソ吉草酸、２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸の合成に関与する遺伝子産物（ほぼ確定したエノイルＣｏＡヒドラターゼ；Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）をコードし、配列番号１９で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも４８％の同一性、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸ｅｃｈＡ８、
−イソ吉草酸、２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸の合成に関与し、配列番号２０で示すアミノ酸配列に対して少なくとも５２％の同一性、少なくとも５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物ＥｃｈＡ８（ほぼ確定したエノイルＣｏＡヒドラターゼ；Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）、
−イソ吉草酸、２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸の合成に関与する遺伝子産物（アシルＣｏＡ脱水素酵素；Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）をコードし、配列番号２１で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも５４％の同一性、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸、
−イソ吉草酸、２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸の合成に関与し、配列番号２２で示すアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物（アシルＣｏＡ脱水素酵素）、
−プロピル酸の合成に関与する遺伝子産物（アセチルコエンザイムＡシンテターゼ；Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）をコードし、配列番号２３で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも６７％の同一性、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸ａｃｓＡ、
−プロピル酸の合成に関与し、配列番号２４で示すアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物ＡｓｃＡ（アセチルコエンザイムＡシンテターゼ；Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）、
−ブタノールおよび／または酪酸の合成に関与する遺伝子産物（３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素；Ｅ．Ｃ．４．２．１．５５）をコードし、配列番号２５で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも６８％の同一性、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸ｙｎｇＦ、
−ブタノールおよび／または酪酸の合成に関与し、配列番号２６で示すアミノ酸配列に対して少なくとも６９％の同一性、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物ＹｎｇＦ（３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素；Ｅ．Ｃ．４．２．１．５５）、
−イソ吉草酸、２−メチル酪酸、イソ酪酸、ブタノールおよび／または酪酸の合成に関与する遺伝子産物（アシルＣｏＡ脱水素酵素；Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）をコードし、配列番号２７で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも７７％の同一性、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸ｙｕｓＪ、
−イソ吉草酸、２−メチル酪酸、イソ酪酸、ブタノールおよび／または酪酸の合成に関与し、配列番号２８で示すアミノ酸配列に対して少なくとも８６％の同一性、少なくとも８７．５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物ＹｕｓＪ（アシルＣｏＡ脱水素酵素；Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
−２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸の合成に関与する遺伝子産物（仮定上の酸化還元酵素；Ｅ．Ｃ．１．１．−．−）をコードし、配列番号２９で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも７７％の同一性、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、および特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸ｙｋｗＣ、
−２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸の合成に関与し、配列番号３０で示すアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも８７．５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物ＹｋｗＣ（仮定上の酸化還元酵素；Ｅ．Ｃ．１．１．−．−）、
−ブタノールおよび／または酪酸の合成に関与する遺伝子産物（ほぼ確定したリン酸ブチリルトランスフェラーゼ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．１９）をコードし、配列番号３１で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも５１％の同一性、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸、
−ブタノールおよび／または酪酸の合成に関与し、配列番号３２で示すアミノ酸配列に対して少なくとも６９％の同一性、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物（ほぼ確定したリン酸ブチリルトランスフェラーゼ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．１９）、
−ブタノールおよび／または酪酸の合成に関与する遺伝子産物（ほぼ確定した酪酸キナーゼ；Ｅ．Ｃ．２．７．２．７）をコードし、配列番号３３で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも７７％の同一性、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸、
−ブタノールおよび／または酪酸の合成に関与し、配列番号３４で示すアミノ酸配列に対して少なくとも８４％の同一性、少なくとも８５％、８７．５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物（ほぼ確定した酪酸キナーゼ；Ｅ．Ｃ．２．７．２．７）、
−プロピル酸の合成に関与する遺伝子産物（アセチルコエンザイムＡシンテターゼ；Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）をコードし、配列番号３５に示すヌクレオチド配列に対して少なくとも７９％の同一性、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸ａｃｓＡ、
−プロピル酸の合成に関与し、配列番号３６で示すアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも８７．５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物ＡｃｓＡ（アセチルコエンザイムＡシンテターゼ；Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）、
−プロピル酸の合成に関与する遺伝子産物（酢酸-ＣｏＡリガーゼ、Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）をコードし、配列番号３７で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも７４％の同一性、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸ｙｔｃｌ、
−プロピル酸の合成に関与し、配列番号３８で示すアミノ酸配列に対して少なくとも７７％の同一性、少なくとも８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物Ｙｔｃｌ（酢酸-ＣｏＡリガーゼ、Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）、
−カダベリンおよび／またはプトレシンの合成に関与する遺伝子産物（リジンおよび／またはアルギニン脱炭酸酵素；Ｅ．Ｃ．４．１．１．１８またはＥ．Ｃ．４．１．１．１９）をコードし、配列番号３９で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも６８％の同一性、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸ｓｐｅＡ、
−カダベリンおよび／またはプトレシンの合成に関与し、配列番号４０で示すアミノ酸配列に対して少なくとも６６％の同一性、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物ＳｐｅＡ（リジンおよび／またはアルギニン脱炭酸酵素；Ｅ．Ｃ．４．１．１．１８またはＥ．Ｃ．４．１．１．１９）、
−イソ吉草酸、２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸の合成に関与する遺伝子産物（ほぼ確定したエノイルＣｏＡヒドラターゼ；Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）をコードし、配列番号４１で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸ｙｓｉＢ、
−イソ吉草酸、２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸の合成に関与し、配列番号４２で示すアミノ酸配列に対して少なくとも７７％の同一性、少なくとも８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物ＹｓｉＢ（ほぼ確定したエノイルＣｏＡヒドラターゼ；Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）、
−２−メチル酪酸の合成に関与する遺伝子産物（３−ヒドロキシアシルＣｏＡ脱水素酵素の類似物；Ｅ．Ｃ．１．１．１．３５）をコードし、配列番号４３で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも７６％の同一性、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸、
−２−メチル酪酸の合成に関与し、配列番号４４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％、８７．５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物（３−ヒドロキシアシルＣｏＡ脱水素酵素の類似物）、
−イソ吉草酸、２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸の合成に関与する遺伝子産物（２−オキソグルタル酸脱水素酵素Ｅ１構成要素；Ｅ．Ｃ．１．２．４．２）をコードし、配列番号４５に示すヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸、
−イソ吉草酸、２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸の合成に関与し、配列番号４６で示すアミノ酸配列に対して少なくとも８２％の同一性、少なくとも８５％、８７．５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物（２−オキソグルタル酸脱水素酵素Ｅ１構成要素；Ｅ．Ｃ．１．２．４．２）、
−プロピル酸の合成に関与する遺伝子産物（ほぼ確定した酸−ＣｏＡリガーゼ、Ｅ．Ｃ． ６．２．１．−）をコードし、配列番号４７で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも６７％の同一性、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸ｙｈｆＬ、
−プロピル酸の合成に関与し、配列番号４８で示すアミノ酸配列に対して少なくとも７６％の同一性、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物ＹｈｆＬ（ほぼ確定した酸−ＣｏＡリガーゼ、Ｅ．Ｃ．６．２．１．−）、
−カダベリンおよび／またはプトレシンの合成に関与する遺伝子産物（アグマチナーゼ；Ｅ．Ｃ．３．５．１．１１）をコードし、配列番号４９で示すヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に好ましく、特に好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を有する核酸ｙｗｈＧ、
−カダベリンおよび／またはプトレシンの合成に関与し、配列番号５０で示すアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性、少なくとも９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％の順に好ましく、特に好ましくは１００％同一性を示すアミノ酸配列を有する遺伝子産物ＹｗｈＧ（アグマチナーゼ；Ｅ．Ｃ．３．５．１．１１）。

本出願に関して、「少なくともＸ％」という形式の表現は、「極値のＸおよび１００と、ならびにその間にある全ての整数および非整数のパーセンテージを含めたＸ％〜１００％」を意味する。

それぞれの酵素の命名は、例えば図１〜７（以下に続く図および関連する代謝経路の詳細な説明）に示すように、それらを触媒とする特定の反応によって決定される。 したがって、単一の酵素が、化学的には実質的に同一であるが、それぞれの基質を基礎として異なる経路に割り当てられている２つの反応を触媒し得ることも考えられる。 これは、ＩＵＢＭＢに従う別の酵素分類（Ｅ．Ｃ．番号）とも関連付けられる。 本発明によれば、酵素の命名は、それぞれの特定の反応に即して決定される。 これは、本発明の過程で実行され、または適切な場合に消される特定の機能もそれと関連付けられるためである。

例示のために、このような逸脱が本発明により規定される同じ代謝経路上で実際にある、配列番号１８で示される酵素を例として参照することができる。 関連する配列番号１７の記述から、これは「ほぼ確定したエノイル−（３−ヒドロキシイソブチリル）−コエンザイムＡヒドロラーゼタンパク質」である。 出願の時点で、ＩＵＢＭＢはまだこの反応にＥ． Ｃ． 番号を割り当てておらず、そのため、関連する酵素活性の規定について参照できるのは図３の反応（６．）のみである。 ２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸を合成するための（バリンおよび／またはイソロイシン異化の一部としての）同じ代謝経路には、エノイルＣｏＡヒドラターゼを触媒とする反応、すなわち図３の反応（３．）もあり、図１の反応（７．）についても状況は同様である。 Ｅ． Ｃ． クラス４．２．１．１７の複数の酵素、例えば配列番号１６、２０、および４２で示されるものが各場合においてこれに適するが（以下を参照されたい）、配列番号１８の酵素もこれに適する。 したがって、この特定の反応の過程において、配列番号１８の酵素は、エノイルＣｏＡヒドラターゼであるとみなされ、Ｅ． Ｃ． クラス４．２．１．１７に割り当てられる。

現在、これらの遺伝子および遺伝子産物は、それ自体が知られている方法によって、実施例１に記載されている配列決定の再現を必要とせずに、これらの配列を基礎として的を絞ったやり方で人工的に合成することができる。

それに代わる別の方法として、バシラス系統、特にＤＳＭＺから得られるバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３系統からＰＣＲによって関連遺伝子を得ることが可能であり、関連遺伝子は、プライマーの合成には配列表に示したそれぞれの境界配列を使用することが可能である。 他の系統の使用については、各場合においてそれに対して相同的な遺伝子を得るためであり、ＰＣＲの成功は、プライマー結合領域内での配列の一致が増すことが相同性と関連付けられるはずであるので、選択された系統とＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＤＳＭ１３との関係が近いほど容易になるはずである。

それに代わるものとして、他の種からのゲノムＤＮＡを調製する際、それぞれの相同遺伝子を検出するために、配列表に示した核酸をＤＮＡプローブとして使用することもできる。 このための手順は、それ自体が知られており、この方法で得られた遺伝子の単離、そのクローニング、その発現、および関連するタンパク質の取得も同様である。 これに関して、特に実施例１でバシラス・リケニホルミスそれ自体について記載するような操作ステップについても考慮される。

目的とする菌株中の関連タンパク質の存在は、第１に、関連する臭気物質が生成するかどうかを化学的に検出することによって検出する。 次いで、それによって想定される酵素活性を適切な検出反応の中で確かめることが可能である。 これは例えば、目的とする反応に関係のある出発化合物を細胞抽出物と共にインキュベートすることによって実施される。 関連する酵素活性が存在するとき、関連する代謝経路の次にくる産物が蓄積し、後続のすべての酵素が存在するならば、臭気物質がもたらされるはずである。

分子生物学レベルでの検出としては、本発明の配列表に示すアミノ酸配列を基礎としてタンパク質を合成すること、ならびにそれに対する抗体を生成することが可能である。 次いで、これらを例えばウェスタンブロットで使用して、目的とする宿主細胞の細胞抽出物中にある相同性タンパク質を検出することができる。

イソ吉草酸、２−メチル酪酸、イソ酪酸、ブタノール、酪酸、プロピル酸、カダベリンおよび／またはプトレシンの合成に関与する本発明の遺伝子産物をコードし、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７また４９を基準として上記のとおりに規定される、本明細書で言及する核酸の中でも、各場合において、微生物、好ましくは細菌、特に好ましくはグラム陽性菌、その中でも好ましくはバシラス属の菌、その中でも特に好ましくはバシラス・リケニホルミス種の菌、その中でもとりわけ好ましくはバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３中に本来存在するものが好ましい。

したがって、新合成法に関して比較的簡単に述べたように、関連する核酸を天然の種、特に微生物から得ることが可能である。 その中でも、言明した問題を考慮して、発酵させることができ、実際に工業的な発酵で使用することのできるものであるほど好ましい。 これらには、特に代表的なものとして、ブドウ球菌属、コリネバクテリウム属、およびバシラス属が含まれる。 その中でも、例えば、Ｓ． ｃａｒｎｏｓｕｓ、Ｃ． ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、ならびにバチルス・サブチリス、バシラス・リケニホルミス、バチルス・アミロリクエファシエンス、Ｂ． ａｇａｒａｄｈｅｒｅｎｓ、Ｂ． ｌｅｎｔｕｓ、バチルス・グロビジイ、およびＢ． ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓを列挙する。 配列表に載せた配列をそれから正確に得ることが可能であったので、バシラス・リケニホルミスＤＳＭ１３が最も好ましい。

これらの説明は、関連するタンパク質にも同じように当てはまる。

したがって、イソ吉草酸、２−メチル酪酸、イソ酪酸、ブタノール、酪酸、プロピル酸、カダベリンおよび／またはプトレシンの合成に関与し、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、または５０を基準として規定される、本明細書で言及する遺伝子産物の中でも、各場合において、微生物、好ましくは細菌、特に好ましくはグラム陽性菌、その中でも好ましくはバシラス属の菌、その中でも特に好ましくはＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｓ種の菌、その中でもとりわけ好ましくはＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｓ ＤＳＭ１３によって天然に生成されるものが好ましい。

バシラス属のグラム陽性細菌で利用され、ロイシン異化の一部としてイソ吉草酸を合成するための代謝経路を図１に示す。 最終的に、この経路は、ロイシン合成に関してクエン酸回路および／もしくは脂肪酸代謝とピルビン酸代謝との間の接点となる。

上述のように、図１に示す反応に関与する酵素は、以下のものであり、関連する番号は、図中に示されるそれぞれの反応ステップを表す。
（１．）Ｌ−ロイシン脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．４．１．９）、
（２．）３−メチル−２−オキソブタン酸脱水素酵素または２−オキソグルタル酸脱水素酵素Ｅ１（Ｅ．Ｃ．１．２．４．２）、
（３．）イソバレリルＣｏＡをイソ吉草酸とコエンザイムＡに加水分解するための酵素（非酵素的な加水分解も可能である）、
（４．）アシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
（５．）メチルクロトニルカルボキシラーゼ、
（６．）３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ、および（７．）エノイルＣｏＡヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）。

したがって、言明した本発明の課題の解決策、すなわち独立した実施態様は、イソ吉草酸を合成するための（ロイシン異化の一部としての）代謝経路上の遺伝子の少なくとも１種が機能的に不活性化される全ての微生物発酵法である。

前記した説明した利点は、この解決策と関連がある。

この点について、微生物が、その時点で同じ条件下で天然に生成される量の５０％だけ、好ましくはその時点で１０％だけしかイソ吉草酸を生成しない、特に好ましくは全く生成しない、この種類の任意の方法が好ましい。

これらのパーセンテージ（および後続の別の代謝経路についてのすべての対応するデータ）は、配列相同性について上で述べたのと同様に、相応じて好ましい漸次移行においてすべての中間の整数または小数のパーセンテージをここでも意味する。 これらの値を決定するために、未処理の菌株および処理した菌株の細胞を他の点では同一の条件下で発酵させ、発酵の間、望ましくない臭気物質の生成速度を、それ自体が知られているやり方で適切に確認する。 菌株は他の点では同一であるので、この物質の生成の差は、異なる遺伝子活性に起因すると考え得る。 この点について、本発明によれば、臭気物質の生成においていかなる減少も望ましい。 パーセンテージなる用語に相当する値は、両方の発酵のサンプル（したがって流出空気から）を採取し、それ自体が知られている分析法によってそれぞれの物質の含有量を決定して得られる。 この値は、増殖の定常期に移行する時点で決定することが好ましい。 この時期は、通常明確に確認することができ、同時に通常は最高の代謝率と関連付けられるためである。

そのために、微生物がその代謝に関して一般に柔軟性が高いことを考慮に入れる。 すなわち、ある遺伝子の不活性化が、ともするとインビボで有効とまではいえない別の遺伝子および／またはタンパク質の活性が強化されて部分的に相殺されることが考えられる。 しかし、前記経路は可能な限り広範に不活性化されるほど好ましい。 個々の場合において種々の遺伝子の不活性化をそれらの本発明による有効性について試験して、最強の効果を有するものを選択することが可能である。 さらに、複数の不活性化を共に組み合わせることも可能である。

以下の酵素の少なくとも１種を機能的に不活性化する本発明による方法が好ましい：
（１．）Ｌ−ロイシン脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．４．１．９）、
（２．）３−メチル−２−オキソブタン酸脱水素酵素または２−オキソグルタル酸脱水素酵素Ｅ１（Ｅ．Ｃ．１．２．４．２）、
（３．）イソバレリルＣｏＡをイソ吉草酸とコエンザイムＡに加水分解する酵素（４．）アシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
（５．）メチルクロトニルカルボキシラーゼ、
（６．）３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ、および（７．）エノイルＣｏＡヒドラターゼ（タンパク質）（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）。

これは、図１で示されるように、これらの活性は、ここで考える代謝経路と関係付けられるためである。

既に上記し、本出願の実施例に記載するように、バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３のゲノムＤＮＡの配列決定を行って、この経路上にある酵素またはそのサブユニットをコードする遺伝子のいくつかを同定することは可能であった。 関与する遺伝子は、以下のものである（先行する番号は、各場合において関連酵素が関与する反応を表す）：
（２．）配列番号４５によって規定される３−メチル−２−オキソブタン酸脱水素酵素または２−オキソグルタル酸脱水素酵素Ｅ１（Ｅ．Ｃ．１．２．４．２）、
（４．）配列番号９、１１、２１または２７（ｙｕｓＪ遺伝子）によって規定されるアシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）のサブユニット、および（７．）配列番号１５、１７、１９（ｅｃｈＡ８遺伝子）、または４１（ｙｓｉＢ遺伝子）によって規定されるエノイルＣｏＡヒドラターゼ（タンパク質）（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）。
これらから得られるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４６、１０、１２、２２、２８、１６、１８、２０および４２で表示される。 すなわち、本発明の過程で、イソ吉草酸を合成するための（ロイシン異化の一部としての）この代謝経路に関与するこれらの特定の遺伝子産物を同定することが可能であった。

したがって、好ましい本発明の方法は、機能的に不活性化される酵素が、関連する微生物中で天然に活性のある、以下のバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来タンパク質のうちの１種に対する相同体であるものである：
（２．）配列番号４６によって規定される３−メチル−２−オキソブタン酸脱水素酵素または２−オキソグルタル酸脱水素酵素Ｅ１（Ｅ．Ｃ．１．２．４．２）、
（４．）配列番号１０、１２、２２または２８によって規定されるアシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）のサブユニット、および（７．）配列番号１６、１８、２０または４２によって規定されるエノイルＣｏＡヒドラターゼ（タンパク質）（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）。

本発明の好ましい方法は、好ましくは以下のバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来タンパク質のうちの１種をコードする核酸に対応する遺伝子の不活性化によって、酵素を遺伝子レベルで機能的に不活性化するものである：
（２．）配列番号４５によって規定される３−メチル−２−オキソブタン酸脱水素酵素または２−オキソグルタル酸脱水素酵素Ｅ１（Ｅ．Ｃ．１．２．４．２）、
（４．）配列番号９、１１、２１または２７（ｙｕｓＪ遺伝子）によって規定されるアシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）のサブユニット、および（７．）配列番号１５、１７、１９（ｅｃｈＡ８遺伝子）または４１（ｙｓｉＢ遺伝子）によって規定されるエノイルＣｏＡヒドラターゼ（タンパク質）（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）。

これは、言明した課題によれば、分子生物学のレベルで適用するという意味で、原因からの解決策を見つけようとすることが好ましかったためである。 これは、言明したヌクレオチド配列を用いて利用できる。 実施例３では、対応する欠失をどのように為し得るかを説明し、後記には、原則として記載するすべての代謝経路に当てはまるので、これに関するさらなる記述を記す。

従って、本発明の好ましい方法は、遺伝子レベルでの不活性化のために、
（２．）配列番号４５、
（４．）９、１１、２１または２７、および（７．）１５、１７、１９または４１
に対して相同的な上記した領域内で、本発明の核酸のうちの１種が使用されており、各場合においてこれらの配列の１つの好ましくは一部分、特に好ましくはその二部分が、各場合において少なくとも７０の連続する位置を含むものである。

これは、例えば、突然変異誘発によって改変された遺伝子領域の分子生物学的な調査（例えば制限、配列決定など）によって検出することができる。

本発明の別の実施態様は、微生物中でイソ吉草酸合成のための（ロイシン異化の一部としての）代謝経路を遺伝子レベルで機能的に不活性化するための、以下のバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３タンパク質のうちの１種をコードする核酸に対応する遺伝子の使用である：
２． ）配列番号４５によって規定される３−メチル−２−オキソブタン酸脱水素酵素または２−オキソグルタル酸脱水素酵素Ｅ１（Ｅ．Ｃ．１．２．４．２）、
（４．）配列番号９、１１、２１または２７（ｙｕｓＪ遺伝子）によって規定されるアシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）のサブユニット、および（７．）配列番号１５、１７、１９（ｅｃｈＡ８遺伝子）または４１（ｙｓｉＢ遺伝子）によって規定されるエノイルＣｏＡヒドラターゼ（タンパク質）（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）。

対応する方法について前記したのと同じ記述が、原則としてこのような使用にも当てはまる。

したがって、本発明の核酸の本発明による好ましい使用は、機能的な不活性化のための、
（２．）配列番号４５、
（４．）９、１１、２１または２７、および（７．）１５、１７、１９または４１
に対する上記した相同性領域内にあり、各場合において好ましくはこれの配列の１つの一部分、特に好ましくは二部分の使用であり、これらの部分は、各場合において少なくとも７０の連続する位置を含む。

これらの発酵処理および使用に基づく別の実施態様は、原則として、本発明の範囲内で記載されるすべての代謝経路に適用することができるので、以下で詳述する。

バシラス属のグラム陽性細菌で利用される、イソロイシン異化の一部として２−メチル酪酸を合成するための代謝経路を図２に示す。 図３からは、バリン異化の一部としてイソ酪酸を合成するための、原則として同じ酵素によって進行する対応する経路が明らかである。 本出願に関して単一の経路であるとみなされる、細菌代謝のこの態様は、以前に検討した経路のように、最終的に、２種のアミノ酸イソロイシンおよびバリンの合成までのクエン酸回路および／もしくは脂肪酸代謝とピルビン酸代謝の間の接点となる。

既に記載したように、以下の酵素は、図２および３に示す反応に関与し、各場合において、図中に示される反応ステップの関連する番号を表示する：
（１．）分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．４２、図２および３の反応１）、
（２．）３−メチル−２−オキソブタン酸脱水素酵素または２−オキソグルタル酸脱水素酵素Ｅ１（Ｅ．Ｃ．１．２．４．２、図２および３の反応２）、
（３．）２−メチルブチリルＣｏＡを２−メチル酪酸に（図２の反応３）、またはイソブチリルＣｏＡをイソ酪酸とコエンザイムＡに（図３の反応３、どちらの場合においても非酵素的な加水分解も可能である）加水分解するための酵素、
（４．）アシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−、図２および３の反応４）、
（５．）エノイルＣｏＡヒドラターゼ（タンパク質）（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７、図２および３の反応５）、
（６．）３−ヒドロキシ−アシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３５）（図２の反応６）、
（７．）アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ（図２の反応ステップ７）、
（８．）エノイル−（３−ヒドロキシイソブチリル）ＣｏＡヒドロラーゼタンパク質（図３のステップ６）および（９．）３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３１）または酸化還元酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．−．−、図３のステップ７）。

したがって、言明した課題の解決策、およびすなわち本発明の独立した実施態様は、２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸を合成するための（バリンおよび／もしくはイソロイシン異化の一部としての）代謝経路上の遺伝子の少なくとも１種を機能的に不活性化するすべての微生物発酵の方法である。

既に説明した利点は、この解決策と関連がある。

この点について、微生物が、その時点で同じ条件下で天然に生成される量の５０％だけ、好ましくはその時点で１０％だけしか２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸を生成しない、特に好ましくは全く生成しない、この種類の任意の方法が好ましい。

そのため、記載した最初の代謝経路について上で説明したように、微生物がその代謝に関して一般に柔軟性が高いことを考慮に入れる。

本発明の好ましい方法は、以下の酵素の少なくとも１種を機能的に不活性化するものである：
（１．）分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．４２）、
（２．）３−メチル−２−オキソブタン酸脱水素酵素または２−オキソグルタル酸脱水素酵素Ｅ１（Ｅ．Ｃ．１．２．４．２）、
（３．）２−メチルブチリルＣｏＡを２−メチル酪酸に、またはイソブチリル−ＣｏＡをイソ酪酸とコエンザイムＡに加水分解するための酵素、
（４．）アシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
（５．）エノイルＣｏＡヒドラターゼ（タンパク質）（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）、
（６．）３−ヒドロキシ−アシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３５）、
（７．）アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、
（８．）エノイル−（３−ヒドロキシイソブチリル）ＣｏＡヒドロラーゼタンパク質、および（９．）３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ． １．１．１．３１）または酸化還元酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．−．−）。

これは、図２および３で示すように、これらの活性が、考慮下の代謝経路と関連付けられるためである。

前記し、本出願の実施例に記載するように、それは、バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３のゲノムＤＮＡの配列決定を行って、この経路上にある酵素またはそのサブユニットをコードする遺伝子のいくつかを同定することが可能であった。 これらには、以下の遺伝子が関与する（先行する番号は、各場合において、関連する酵素が関与する反応を表す）：
（１．）配列番号１または３によって規定される分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．４２）、
（２．）配列番号４５によって規定される３−メチル−２−オキソブタン酸脱水素酵素または２−オキソグルタル酸脱水素酵素Ｅ１（Ｅ．Ｃ．１．２．４．２）、
（４．）配列番号９、１１、２１または２７（ｙｕｓＪ遺伝子）によって規定されるアシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
（５．）配列番号１５、１７、１９（ｅｃｈＡ８遺伝子）または４１（ｙｓｉＢ遺伝子）によって規定されるエノイルＣｏＡヒドラターゼ（タンパク質）（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）、
（６．）配列番号４３によって規定される３−ヒドロキシ−アシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３５）、
（８．）配列番号１７によって規定されるエノイル−（３−ヒドロキシイソブチリル）ＣｏＡヒドロラーゼタンパク質、および（９．）配列番号２９（ｙｋｗＣ遺伝子）によって規定される３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３１）または酸化還元酵素（Ｅ．Ｃ． １．１．−．−）。

これらから得られるアミノ酸配列は、配列番号２、４、４６、１０、１２、２２、２８、１６、１８、２０、４２、４４、１８および３０で表示される。 このように、本発明の過程で、２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸を合成するための（バリンおよび／またはイソロイシン異化の一部としての）この代謝経路に関与する特定の遺伝子産物を同定することが可能であった。

したがって、本発明の好ましい方法は、機能的に不活性化される酵素が、関連する微生物中で天然に活性であって、以下のバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来タンパク質のうちの１種に対する相同体であるようなものである：
（１．）配列番号２または４によって規定される分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．４２）、
（２．）配列番号４６によって規定される３−メチル−２−オキソブタン酸脱水素酵素または２−オキソグルタル酸脱水素酵素Ｅ１（Ｅ．Ｃ．１．２．４．２）、
（４．）配列番号１０、１２、２２または２８によって規定されるアシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
（５．）配列番号１６、１８、２０または４２によって規定されるエノイルＣｏＡヒドラターゼ（タンパク質）（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）、
（６．）配列番号４４によって規定される３−ヒドロキシ−アシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３５）、
（８．）配列番号１８によって規定されるエノイル−（３−ヒドロキシイソブチリル）ＣｏＡヒドロラーゼタンパク質、および（９．）配列番号３０によって規定される３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３１）または酸化還元酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．−．−）。

本発明の好ましい方法は、好ましくは、以下のＢ． ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＤＳＭ１３タンパク質のうちの１種をコードする核酸に対応する遺伝子の不活性化によって、酵素を遺伝子レベルで機能的に不活性化するものである：
（１．）配列番号１または３によって規定される分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．４２）、
（２．）配列番号４５によって規定される３−メチル−２−オキソブタン酸脱水素酵素または２−オキソグルタル酸脱水素酵素Ｅ１（Ｅ．Ｃ．１．２．４．２）、
（４．）配列番号９、１１、２１または２７（ｙｕｓＪ遺伝子）によって規定されるアシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
（５．）配列番号１５、１７、１９（ｅｃｈＡ８遺伝子）、または４１（ｙｓｉＢ遺伝子）によって規定されるエノイルＣｏＡヒドラターゼ（タンパク質）（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）、
（６．）配列番号４３によって規定される３−ヒドロキシ−アシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３５）、
（８．）配列番号１７によって規定されるエノイル−（３−ヒドロキシイソブチリル）ＣｏＡヒドロラーゼタンパク質、および（９．）配列番号２９（ｙｋｗＣ遺伝子）によって規定される３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３１）または酸化還元酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．−．−）。

これは、言明した課題によれば、分子生物学のレベルで適応するものという意味で、原因からの解決策を見つけようとすることが好ましかったためである。 実施例３では、対応する欠失をどのように為し得るかを説明し、後記には、これに関するさらなる記述を記す。

従って、本発明の好ましい方法は、遺伝子レベルでの不活性化のために、本発明の核酸のうちの１種が、上記し、
（１．）配列番号１または３、
（２．）４５、
（４．）９、１１、２１または２７、
（５．）１５、１７、１９または４１、
（６．）４３、
（８．）１７、および（９．）２９
に対して相同的な領域内で、各場合において少なくとも７０の連続する位置を含み、これらの配列の１つの各場合において、好ましくは一部分、特に好ましくは二部分で使用されているものである。

本発明の別の実施態様は、微生物中でイソ吉草酸合成のための（ロイシン異化の一部としての）代謝経路を遺伝子レベルで機能的に不活性化するための、以下のバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３タンパク質のうちの１種をコードする核酸に対応する遺伝子の使用である：
（１．）配列番号１または３によって規定される分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．４２）、
（２．）配列番号４５によって規定される３−メチル−２−オキソブタン酸脱水素酵素または２−オキソグルタル酸脱水素酵素Ｅ１（Ｅ．Ｃ．１．２．４．２）、
（４．）配列番号９、１１、２１または２７（ｙｕｓＪ遺伝子）によって規定されるアシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
（５．）配列番号１５、１７、１９（ｅｃｈＡ８遺伝子）または４１（ｙｓｉＢ遺伝子）によって規定されるエノイルＣｏＡヒドラターゼ（タンパク質）（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）、
（６．）配列番号４３によって規定される３−ヒドロキシ−アシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３５）、
（８．）配列番号１７によって規定されるエノイル−（３−ヒドロキシイソブチリル）ＣｏＡヒドロラーゼタンパク質、および（９．）配列番号２９（ｙｋｗＣ遺伝子）によって規定される３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３１）または酸化還元酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．−．−）。

対応する方法に関して予め述べたのと同じことが、原則としてこのような使用にも当てはまる。

したがって、本発明による好ましい使用は、機能的な不活性化のための、上記した、
（１．）配列番号１または３、
（２．）４５、
（４．）９、１１、２１または２７、
（５．）１５、１７、１９または４１、
（６．）４３、
（８．）１７、および（９．）２９
に対して相同的な領域内での、本発明の核酸の各場合において好ましくはこれら配列の１つの一部分、特に好ましくは二部分の使用であり、これらの部分は各場合において少なくとも７０の連続する位置を含む。

これらの発酵処理および使用に基づく別の実施態様を以下に詳述する。

バシラス属のグラム陽性細菌で利用される、酪酸代謝の一部としてブタノールおよび／または酪酸を合成するための代謝経路を図４に示す。 この代謝経路は、最終的に脂肪酸代謝から導かれる。

前記したように、以下の酵素は、図４に示す反応に関与し、関連する番号は、図中に示されるそれぞれの反応ステップを表す：
（１．）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１５７）、
（２．）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．４．２．１．５５）、
（３．）ブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．２５）、
（４．）リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１９）、
（５．）酪酸キナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．２．７）、
（６．）ブチルアルデヒド脱水素酵素、および（８．）ＮＡＤＨ依存性ブタノール脱水素酵素Ａ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．−）。

反応（７．）は、通常は大気中の酸素による非酵素的な酸化によって起こる。

したがって、言明した課題の解決策、およびすなわち本発明の独立した実施態様は、ブタノールおよび／または酪酸を合成するための（酪酸代謝の一部としての）代謝経路上の遺伝子の少なくとも１種を機能的に不活性化するすべての微生物発酵法である。

既に説明した利点は、この解決策と関連がある。

この点について、微生物が、その時点で同じ条件下で天然に生成される量の５０％だけ、好ましくはその時点で１０％だけしかブタノールまたは酪酸を生成しない、特に好ましくは全く生成しない、この種類の任意の方法が好ましい。

このため、記載した最初の代謝経路について上で説明したように、微生物がその代謝に関して一般に柔軟性が高いことを考慮に入れる。

本発明の好ましい方法は、以下の酵素の少なくとも１種を機能的に不活性化するものである：
（１．）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１５７）、
（２．）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（Ｅ．Ｃ．４．２．１．５５）、
（３．）ブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．２５）、
（４．）リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１９）、
（５．）酪酸キナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．２．７）、
（６．）ブチルアルデヒド脱水素酵素、および（８．）ＮＡＤＨ依存性ブタノール脱水素酵素Ａ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．−）。

これは、図４で示すように、これらの活性が、ここで考える代謝経路と関連付けられるためである。

上述のように、また本出願の実施例に記載するとおり、それは、バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３のゲノムＤＮＡの配列決定を行って、この経路上にある酵素またはそのサブユニットをコードする遺伝子のいくつかを同定することが可能であった。 それらは、以下の遺伝子である（先行する番号は、各場合において、関連する酵素が関与する反応を表す）：
（１．）配列番号１３によって規定される３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１５７）、
（２．）配列番号２５（ｙｎｇＦ遺伝子）によって規定される３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（Ｅ．Ｃ．４．２．１．５５）、
（３．）配列番号９、１１または２７（ｙｕｓＪ遺伝子）によって規定されるブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．２５）、
（４．）配列番号３１によって規定されるリン酸ブチリルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１９）、
（５．）配列番号３３によって規定される酪酸キナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．２．７）、および（８．）配列番号７（ｙｕｇＪ遺伝子）によって規定されるＮＡＤＨ依存性ブタノール脱水素酵素Ａ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．−）。
これらから派生するアミノ酸配列は、配列番号１４、２６、１０、１２、２８、３２、３４および８で表示される。 すなわち、本発明の過程で、ブタノールおよび／または酪酸を合成するための（酪酸代謝の一部としての）この代謝経路に関与するこれらの特定の遺伝子産物を同定することが可能であった。

したがって、本発明の好ましい方法は、機能的に不活性化される酵素が、関連する微生物中で天然に活性のある、以下のバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来タンパク質のうちの１種に対する相同体であるものである：
（１．）配列番号１４によって規定される３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１５７）、
（２．）配列番号２６によって規定される３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（Ｅ．Ｃ．４．２．１．５５）、
（３．）配列番号１０、１２、または２８によって規定される、ブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．２５）、
（４．）配列番号３２によって規定されるリン酸ブチリルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１９）、
（５．）配列番号３４によって規定される酪酸キナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．２．７）、および（８．）配列番号８によって規定されるＮＡＤＨ依存性ブタノール脱水素酵素Ａ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．−）。

本発明による好ましい方法は、好ましくは以下のバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３タンパク質のうちの１種をコードする核酸に対応する遺伝子の不活性化によって、酵素を遺伝子レベルで機能的に不活性化するものである：
（１．）配列番号１３によって規定される３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１５７）、
（２．）配列番号２５（ｙｎｇＦ遺伝子）によって規定される３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（Ｅ．Ｃ．４．２．１．５５）、
（３．）配列番号９、１１または２７（ｙｕｓＪ遺伝子）によって規定されるブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．２５）、
（４．）配列番号３１によって規定されるリン酸ブチリルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１９）、
（５．）配列番号３３によって規定される酪酸キナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．２．７）、および（８．）配列番号７（ｙｕｇＪ遺伝子）によって規定されるＮＡＤＨ依存性ブタノール脱水素酵素Ａ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．−）。

これは、言明した課題によれば、分子生物学のレベルで適応するものという意味で、原因からの解決策を見つけることが好ましかったためである。 実施例３では、対応する欠失をどのように為し得るかを説明し、後記では、これに関するさらなる記述を記す。

すなわち、本発明の好ましい方法は、遺伝子レベルでの不活性化のために、本発明の核酸のうちの１種が、上記した、
（１．）配列番号１３、
（２．）２５、
（３．）９、１１または２７、
（４．）３１、
（５．）３３、および（６．）７
に対して相同的な領域内で、各場合において少なくとも７０の連続する位置を含み、これらの配列の１つの各場合において、好ましくは一部分、特に好ましくは二部分で使用されているものである。

本発明の別の実施態様は、微生物中でブタノールおよび／または酪酸合成のための（酪酸代謝の一部としての）代謝経路を遺伝子レベルで機能的に不活性化するための、以下のバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３タンパク質のうちの１種をコードする核酸に対応する遺伝子の使用である：
（１．）配列番号１３によって規定される３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１５７）、
（２．）配列番号２５（ｙｎｇＦ遺伝子）によって規定される３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（Ｅ．Ｃ．４．２．１．５５）、
（３．）配列番号９、１１または２７（ｙｕｓＪ遺伝子）によって規定される、ブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．２５）、
（４．）配列番号３１によって規定される、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１９）、
（５．）配列番号３３によって規定される、酪酸キナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．２．７）、および（８．）配列番号７（ｙｕｇＪ遺伝子）によって規定されるＮＡＤＨ依存性ブタノール脱水素酵素Ａ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．−）。

対応する方法に関して、前記したのと同じことが、原則としてこのような使用にも当てはまる。

したがって、本発明による好ましい使用は、機能的な不活性化のための、上記した、
（１．）配列番号１３、
（２．）２５、
（３．）９、１１または２７、
（４．）３１、
（５．）３３、および（８．）７
に対して相同的な領域内での本発明の核酸の、各場合において好ましくはこれらの配列の１つの一部分、特に好ましくは二部分の使用であり、これらの部分は各場合において少なくとも７０の連続する位置を含む。

これらの発酵処理および使用に基づく別の実施態様を以下で詳述する。

バシラス属のグラム陽性細菌で利用される、プロピル酸を合成するための（プロピオン酸代謝の一部として）代謝経路を図５に示す。 この代謝経路は、最終的にクエン酸回路と脂肪酸代謝の間の接点となる。

既に述べたように、以下の酵素は、図５に示す反応に関与し、関連する番号は、図中に示されるそれぞれの反応ステップを表す：
（１．）コハク酸−プロピオン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、
（２．）酢酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼまたはプロピオン酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼ（Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）、および（３．）酢酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼまたはプロピオン酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼ（Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）。

したがって、言明した課題の解決策、およびすなわち本発明の独立した実施態様は、（プロピオン酸代謝の一部としての）プロピル酸を合成するための代謝経路上の遺伝子の少なくとも１種を機能的に不活性化するすべての微生物発酵の方法である。

前記した説明した利点は、この解決策と関連がある。

この点について、微生物が、その時点で同じ条件下で天然に生成される量の５０％だけ、好ましくはその時点で１０％だけしかプロピル酸を生成しない、特に好ましくは全く生成しない、この種類の任意の方法が好ましい。

上述のように、記載した最初の代謝経路について微生物はその代謝に関して一般に柔軟性が高いことを考慮に入れる。

本発明の好ましい方法は、以下の酵素の少なくとも１種を機能的に不活性化するものである：
（１．）コハク酸−プロピオン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、
（２．）酢酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼまたはプロピオン酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼ（Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）、および（３．）酢酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼまたはプロピオン酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼ（Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）。

これは、図５で示すように、これらの活性が、ここで考える代謝経路と関係付けられるためである。

既に上記し、本出願の実施例に記載するように、バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３のゲノムＤＮＡの配列決定を行うことによって、この経路上にある酵素またはそのサブユニットをコードする遺伝子のいくつかを同定することが可能であった。 それらは以下の遺伝子である（先行する番号は、各場合において、関連する酵素が関与する反応を表す）：
配列番号３５（ａｃｓＡ遺伝子）、３７（ｙｔｃｌ遺伝子）、４７（ｙｈｆＬ遺伝子）または２３（ａｃｓＡ遺伝子）によって規定される酢酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼまたはプロピオン酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼ（Ｅ．Ｃ． ６．２．１．１）。
これらから派生するアミノ酸配列は、配列番号３６、３８、４８および２４で表示される。 すなわち、本発明の過程で、プロピル酸を合成するための（プロピオン酸代謝の一部としての）この代謝経路に関与する特定の遺伝子産物を同定することが可能であった。

したがって、本発明の好ましい方法は、機能的に不活性化される酵素が、関連する微生物中で天然に活性のある、次のバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来タンパク質のうちの１種に対する相同体であるものである：配列番号３６、３８、４８または２４によって規定される酢酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼまたはプロピオン酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼ（Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）。

本発明の好ましい方法は、好ましくは、次のバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３タンパク質のうちの１種をコードする核酸に対応する遺伝子の不活性化によって、酵素を遺伝子レベルで機能的に不活性化するものである：配列番号３５（ａｃｓＡ遺伝子）、３７（ｙｔｃｌ遺伝子）、４７（ｙｈｆＬ遺伝子）、または２３（ａｃｓＡ遺伝子）によって規定される酢酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼまたはプロピオン酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼ（Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）。

これは、言明した課題によれば、分子生物学のレベルで適応されるものという意味で、原因からの解決策を見つけようとすることが好ましかったためである。 実施例３では、対応する欠失をどのように為し得るかを説明し、後記では、これに関するさらなる記述を記す。

すなわち、本発明の好ましい方法は、遺伝子レベルでの不活性化のために、上記した、配列番号３５、３７、４７または２３に対して相同的な領域内で、本発明の核酸のうちの１種が、各場合において少なくとも７０の連続する位置を含み、これらの配列の１つの各場合において、好ましくは一部分、特に好ましくは二部分で使用されているものである。

本発明の別の実施態様は、微生物中でプロピル酸合成のための（プロピオン酸代謝の一部としての）代謝経路を遺伝子レベルで機能的に不活性化するための、次のバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３タンパク質のうちの１種をコードする核酸に対応する遺伝子の使用である：配列番号３５（ａｃｓＡ遺伝子）、３７（ｙｔｃｌ遺伝子）、４７（ｙｈｆＬ遺伝子）、または２３（ａｃｓＡ遺伝子）によって規定される酢酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼまたはプロピオン酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼ（Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）。

対応する方法に関して前記したのと同じことが、原則としてこの種類の使用にも当てはまる。

したがって、本発明によれば、機能的な不活性化のための、上記し、配列番号３５、３７、４７または２３に対して相同的な領域内での、本発明の核酸の、各場合において好ましくはこれら配列の１つの一部分、特に好ましくは二部分の使用が好ましく、これらの部分は、各場合において少なくとも７０の連続する位置を含む。

これらの発酵処理および使用に基づく別の実施態様を以下で詳述する。

バシラス属のグラム陽性細菌で利用される、カダベリンおよび／またはプトレシンを合成するための（リジンおよび／またはアルギニン異化の一部として）代謝経路を、図６（リジンおよびそれから得られるカダベリンについて）および図７（アルギニンおよびそれから派生するプトレシンについて）に示す。 本出願では単一の経路として示す細菌代謝のこの態様は、最終的にアミノ酸代謝から副経路として、二次的な場合ではさらに尿素回路から派生する。

既に記載したように、以下の酵素が、図６および７に示す反応に関与し、関連する番号は、図中に示されるそれぞれの反応ステップを表す：
（１．）リジン脱炭酸酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１８）および／またはアルギニン脱炭酸酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１９）（図６では示される唯一の反応、図７のステップ１、同じ酵素が両方の反応を触媒できる事例もここで当てはまる）、
（２．）アグマチナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．１１）、図７のステップ２）、および（３．）オルニチン脱炭酸酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１７、図７のステップ３）。

したがって、言明した課題の解決策、およびすなわち本発明の独立した実施態様は、（リジンおよび／またはアルギニン異化の一部としての）カダベリンおよび／またはプトレシンを合成するための代謝経路上の遺伝子の少なくとも１種を機能的に不活性化するすべての微生物発酵の方法である。

前記した説明した利点は、この解決策と関連がある。

この点について、微生物が、その時点で同じ条件下で天然に生成される量の５０％だけ、好ましくはその時点で１０％だけしかカダベリンおよび／またはプトレシンを生成しない、特に好ましくは全く生成しない、この種類の任意の方法が好ましい。

上で説明したように、記載した最初の代謝経路について、微生物はその代謝に関して一般に柔軟性が高いことを考慮に入れる。

本発明の好ましい方法は、以下の酵素の少なくとも１種を機能的に不活性化するものである：
（１．）リジン脱炭酸酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１８）および／またはアルギニン脱炭酸酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１９）、
（２．）アグマチナーゼ（Ｅ．Ｃ． ３．５．１．１１）、および（３．）オルニチン脱炭酸酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１７）。

これは、図６および７で示されるように、これらの活性がここで考える代謝経路と関連付けられるためである。

上で述べ、本出願の実施例に記載するように、それは、バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３のゲノムＤＮＡの配列決定を行って、この経路上にある酵素またはそのサブユニットをコードする遺伝子のいくつかを同定することによって可能であった。 それらは、以下の遺伝子である（先行する番号は、各場合において、関連する酵素が関与する反応を表す）：
（１．）配列番号５（ｓｐｅＡ遺伝子）または３９（ｓｐｅＡ遺伝子）によって規定されるリジンおよび／またはアルギニン脱炭酸酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１８またはＥ．Ｃ．４．１．１．１９）、および（２．）配列番号４９（ｙｗｈＧ遺伝子）によって規定されるアグマチナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．１１）。
これらから派生するアミノ酸配列は、配列番号６、４０、および５０で表示される。 すなわち、本発明の過程で、カダベリンおよび／またはプトレシンを合成するための（リジンおよび／またはアルギニン異化の一部としての）この代謝経路に関与する特定の遺伝子産物を同定することが可能であった。

したがって、本発明の好ましい方法は、機能的に不活性化される酵素が、関連する微生物中で天然に活性のある、以下のｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＤＳＭ１３由来タンパク質のうちの１種に対する相同体であるものである：
（１．）配列番号６または４０によって規定される、リジンおよび／またはアルギニン脱炭酸酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１８またはＥ．Ｃ．４．１．１．１９）、および（２．）配列番号５０によって規定されるアグマチナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．１１）。

本発明の好ましい方法は、好ましくは、以下のバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３タンパク質のうちの１種をコードする核酸に対応する遺伝子の不活性化によって、酵素を遺伝子レベルで機能的に不活性化するものである：
（１．）配列番号５（ｓｐｅＡ遺伝子）または３９（ｓｐｅＡ遺伝子）によって規定される、リジンおよび／またはアルギニン脱炭酸酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１８またはＥ．Ｃ．４．１．１．１９）、および（２．）配列番号４９（ｙｗｈＧ遺伝子）によって規定されるアグマチナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．１１）。

これは、言明した課題によれば、分子生物学のレベルで適応されるものという意味で、原因からの解決策を見つけようとすることが好ましかったためである。 実施例３では、対応する欠失をどのように為し得るかを説明し、後記では、これに関するさらなる記述を記す。

すなわち、遺伝子レベルでの不活性化のために、上記した、
（１．）配列番号５または３９、および（２．）４９
に対して相同的な領域内で、本発明の核酸のうちの１種が、各場合において少なくとも７０の連続する位置を含み、これらの配列の１つの各場合において、好ましくは一部分、特に好ましくは二部分で使用されている本発明の方法が好ましい。

本発明の別の実施態様は、微生物中でカダベリンおよび／またはプトレシン合成のための（リジンおよび／またはアルギニン異化の一部としての）代謝経路を遺伝子レベルで機能的に不活性化するための、以下のバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３タンパク質のうちの１種をコードする核酸に対応する遺伝子の使用である：
（１．）配列番号５（ｓｐｅＡ遺伝子）または３９（ｓｐｅＡ遺伝子）によって規定される、リジンおよび／またはアルギニン脱炭酸酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１８またはＥ．Ｃ．４．１．１．１９）、および（２．）配列番号４９（ｙｗｈＧ遺伝子）によって規定されるアグマチナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．１１）。

対応する方法に関して予め述べた同じことが、原則としてこのような使用にも当てはまる。

したがって、本発明によれば、機能的な不活性化のための、上記した、
（１．）配列番号５または３９、および（２．）４９
に対して相同的な領域内での、本発明の核酸の、各場合においてこれら配列の１つの好ましくは一部分、特に好ましくは二部分の使用が好ましく、これらの部分は各場合において少なくとも７０の連続する位置を含む。

これらの発酵処理および使用に基づく別の実施態様を以下に詳述する。

記載した５通りの代謝経路それぞれの遺伝子および／または核酸の、本発明による上述の使用の各場合において好ましい実施態様は、微生物を発酵させる間に機能的な不活性化が起こるものである。

これは、言明した課題に従って、遺伝子レベルでの発酵の改良を企図しているためである。 これらの遺伝子および／または核酸を介してしかるべく改変された微生物の発酵では、臭気物質および／または有毒物質の量が改変されていない菌株より少ないことが予想される。 発酵の間に現れるこの利点は、本発明によれば、発酵処理を意味する生産工程、および後続の後処理の両方に有利な影響を及ぼすので好ましい。

その中でも、（（１．）イソ吉草酸合成、（２．）２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸合成、（３．）ブタノールおよび／または酪酸合成、（４）プロピル酸合成、および／または（５．）カダベリンおよび／またはプトレシン合成のための）各代謝経路について言及した遺伝子のうちの（存在するならば）多い程好ましくいが２、３、または４種を不活性化する、この種類の任意の使用が好ましい。

これは、既に説明したように、微生物は、個々の場合において、副経路または少なくとも匹敵する反応の酵素を活性化することにより、不活性化を免れ、こうして関連のある臭気物質および／または有毒な物質を生成し続ける場合がある。 この問題は、特に、単一の反応を複数遮断することによって解決することができる。

さらに、（１．）イソ吉草酸合成のため、（２．）２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸合成のため、（３．）ブタノールおよび／または酪酸合成のため、（４．）プロピル酸合成のため、および／または（５．）カダベリンおよび／またはプトレシン合成のための代謝経路のうちの（関連する微生物中に存在するならば）、多い程好ましいが２、３、４、または５種が少なくとも部分的に遮断される、この種類の任意の使用が好ましい。

というのは、第１に、たった１種の反応の不活性化が複数の前記経路を遮断し得るためである。 例えば、このことは、言及した最初の３種の代謝経路に存在する配列番号９、１１または２７（ｙｕｓＪ遺伝子）によって規定される、ブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．２５）、あるいは最初に言及した２種の経路に同等に関与する次の３種の酵素または酵素群に当てはまる：配列番号４６によって規定される３−メチル−２−オキソブタン酸脱水素酵素または２−オキソグルタル酸脱水素酵素Ｅ１（Ｅ．Ｃ．１．２．４．２）、配列番号１０、１２、２２または２８によって規定される、アシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）のサブユニット、および配列番号１６、１８、２０または４２によって規定される、エノイルＣｏＡヒドラターゼ（タンパク質）（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）。 これらの場合でも、酵素活性は、上で述べ、図中に示される反応に即して規定される。

第２に、一般に知られている分子生物学の方法によって、原則としてこれらすべての経路を切断することができるように、すなわち相応じて有利な発酵処理を実現できるように、複数の遺伝子を並行して不活性化することが可能である。

１つの選択肢では、遺伝子および／または記載される本発明の核酸のこれらすべての使用は、各場合において、不活性なタンパク質をコードし、点突然変異を有する核酸を用いるものである。

この種類の核酸は、それ自体が知られている点突然変異誘発の方法によって生成することができる。 このような方法は、例えば、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＭａｎｉａｔｉｓの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米ニューヨーク、１９８９年などの関連する手引書に記載されている。 加えて、現在そのための数多くの市販の作成キットが入手可能であり、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国Ｌａ ＪｏｌｌａからＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）キットが入手可能である。 その原理は、１箇所が交換されているオリゴヌクレオチド（ミスマッチプライマー）を合成し、一本鎖形態の遺伝子とハイブリダイズさせるものであり、次いで後続のＤＮＡ重合によって対応する点変異体がもたらされる。 この目的のために、これらの遺伝子のそれぞれの種特異的な配列を使用することが可能である。 高い相同性のために、配列表に示すヌクレオチド配列を基準としてこの反応を実施することは可能であり、本発明に関して特に有利である。 これらの配列は、近縁種用の適切なミスマッチプライマーを設計するのにも役立ち得る。

１つの選択肢では、遺伝子および／または記載される本発明の核酸のこれらすべての使用は、各場合において、欠失変異または挿入変異を有する核酸を用いるものであり、前記核酸は、好ましくは各場合において少なくとも７０〜１５０の核酸位置からなる、タンパク質をコードする領域の境界配列を含む。

これらの方法も、それ自体は当業者によく知られている。 すなわち、適切な形質転換ベクター上の関連遺伝子の一部分を制限エンドヌクレアーゼによって切り出し、その後ベクターを目的とする宿主に入れて形質転換させ、そこで活性のある遺伝子が、その時点まで依然として起こり得る相同性組換えによって不活性なコピーに交換されることによって、宿主細胞による記載の１種または複数の遺伝子産物の生成を防ぐことが可能である。 挿入変異の実施態様では、単にインタクトな遺伝子を割り込むように導入し、またはある遺伝子部分の代わりに別の遺伝子、例えば選択マーカーを導入することが可能である。 それによって、それ自体が知られているやり方で変異事象の表現型を調べることが可能である。

各場合において必要な、細胞に導入された欠損遺伝子と、例えば染色体上に内因的に存在するインタクトな遺伝子コピー間の組換え事象を可能にするために、現状の知識に従えば、各場合において非一致部分に対して２箇所の境界配列中で、各場合において少なくとも７０〜１５０の連続する核酸位置が一致することが必要であり、間にある部分は重要でない。 したがって、好ましい実施態様は、大きさがこれらのうちの少なくとも１つである２箇所のフランキング領域しか含まないものである。

この使用の代替実施態様では、各場合において、少なくとも７０〜１５０の核酸位置を含み、即ちタンパク質をコードする領域と少なくとも部分的に、好ましくは完全に隣接する、合計２箇所の核酸セグメントを有する核酸を使用する。 この点について、フランキング領域は、既知の配列を出発材料として、それ自体が知られている方法によって、例えば外向き定方向のＰＣＲプライマーおよびテンプレートとしてのゲノムＤＮＡの調製（アンカＰＣＲ）によって確認することができる。 というのは、相同組換えによる２個の遺伝子コピーの交換を可能にするために、そのセグメントがタンパク質をコードすることは必須でないためである。 本発明によれば、配列表に示すヌクレオチド配列を基礎として、これに必要な、グラム陽性菌の他の種、その中でも特にバシラス属の菌用のプライマーを設計することも可能である。 この実験的な手法に代わる選択肢として、例えば、バチルス・サブチリスデータベース入力項目、例えばＩｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａｓｔｅｕｒ、仏パリのＳｕｂｔｉＬｉｓｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｇｉ）または実施例２で指定のデータベースからの多様な近縁種由来の遺伝子について、少なくとも一部が非翻訳領域を選ぶことが可能である。

本発明は、特に、生物工学的生産のための遺伝子的に改良された微生物を提供することを目的とする。 したがって、以下のバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３タンパク質のうちの１種をコードする核酸に対応する遺伝子の少なくとも１種が機能的に不活性化されているあらゆる微生物が、本発明の実施態様となる：
−配列番号１によって規定される推定上の分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．４２）、
−配列番号３によって規定される推定上の分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．４２）、
−配列番号５（ｓｐｅＡ遺伝子）によって規定されるリジンおよび／またはアルギニン脱炭酸酵素（タンパク質ＳｐｅＡ；Ｅ．Ｃ．４．１．１．１８またはＥ．Ｃ．４．１．１．１９）、
−配列番号７（ｙｕｇＪ遺伝子）によって規定されるＮＡＤＨ依存性ブタノール脱水素酵素Ａ（タンパク質ＹｕｇＪ；ＥＣ．１．１．１．−）、
−配列番号９によって規定される、ブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．２５）またはアシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
−配列番号１１によって規定される、ブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．２５）またはアシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
−配列番号１３によって規定される３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１５７）、
−配列番号１５によって規定される、推定上のエノイルＣｏＡヒドラターゼタンパク質（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）、
−配列番号１７によって規定される、ほぼ確定したエノイル−（３−ヒドロキシイソブチリル）ＣｏＡヒドロラーゼタンパク質、
−配列番号１９（ｅｃｈＡ８遺伝子）によって規定される、ほぼ確定したエノイルＣｏＡヒドラターゼ（タンパク質ＥｃｈＡ８；Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）、
−配列番号２１によって規定される、アシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
−配列番号２３（ａｃｓＡ遺伝子）によって規定される酢酸-ＣｏＡリガーゼまたはプロピオン酸-ＣｏＡリガーゼ（またはシンテターゼ、タンパク質ＡｃｓＡ；Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）、
−配列番号２５（ｙｎｇＦ遺伝子）によって規定される３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（タンパク質ＹｎｇＦ；ＥＣ．４．２．１．５５）、
−配列番号２７（ｙｕｓＪ遺伝子）によって規定される、ブチリルＣｏＡ脱水素酵素（タンパク質ＹｕｓＪ；Ｅ．Ｃ．１．３．９９．２５）またはアシルＣｏＡ脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．３．９９．−）、
−配列番号２９（ｙｋｗＣ遺伝子）によって規定される３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素（タンパク質ＹｋｗＣ；ＥＣ．１．１．１．３１）または酸化還元酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．−．−）、
−配列番号３１によって規定される、ほぼ確定したリン酸ブチリルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１９）、
−配列番号３３によって規定される、ほぼ確定した酪酸キナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．２．７）、
−配列番号３５（ａｃｓＡ遺伝子）によって規定される酢酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼまたはプロピオン酸-ＣｏＡリガーゼもしくはシンテターゼ（タンパク質ＡｃｓＡ；Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）、
−配列番号３７（ｙｔｃｌ遺伝子）によって規定される酢酸-ＣｏＡリガーゼまたはプロピオン酸-ＣｏＡリガーゼ（タンパク質Ｙｔｃｌ；ＥＣ．６．２．１．１）、
−配列番号３９（ｓｐｅＡ遺伝子）によって規定される、リジンおよび／またはアルギニン脱炭酸酵素（タンパク質ｓｐｅＡ；Ｅ．Ｃ．４．１．１．１８またはＥ．Ｃ．４．１．１．１９）、
−配列番号４１（ｙｓｉＢ遺伝子）によって規定される、ほぼ確定したエノイルＣｏＡヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１７）、
−配列番号４３によって規定される３−ヒドロキシアシルＣｏＡ脱水素酵素の類似物（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３５）、
−配列番号４５によって規定される３−メチル−２−オキソブタン酸脱水素酵素または２−オキソグルタル酸脱水素酵素Ｅ１（Ｅ．Ｃ．１．２．４．２）、
−配列番号４７（ｙｈｆＬ遺伝子）によって規定される、ほぼ確定した酢酸-ＣｏＡリガーゼまたはプロピオン酸-ＣｏＡリガーゼ（タンパク質ＹｈｆＬ；Ｅ．Ｃ．６．２．１．１）または酸−ＣｏＡリガーゼ（Ｅ．Ｃ．６．２．１．−）、または−配列番号４９（ｙｗｈＧ遺伝子）によって規定されるアグマチナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．１１）。

この点について、「対応する」とは、各場合においてそれぞれの代謝経路に関して上で規定したのと同じ生化学活性を有する遺伝子産物をコードする、考慮中の生物の遺伝子を意味する。 一般に、これは同時に、インビボで翻訳され、述べたバシラス・リケニホルミス由来遺伝子に対して各場合において最も高い相同性（通常は、実施例２で実施するような２個の配列の並置によってわかる４０％より高い同一性）を示す、この生物のすべての遺伝子である。

その中でも、上記によれば、各場合において、（１．）イソ吉草酸合成、（２．）２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸合成、（３．）ブタノールおよび／または酪酸合成、（４．）プロピル酸合成、および／または（５．）カダベリンおよび／またはプトレシン合成のための、各代謝経路について言及した遺伝子のうちの、２、３、または４種が不活性化されている微生物ほど好ましい。

加えて、上記によれば、各場合において、（１．）イソ吉草酸合成のため、（２．）２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸合成のため、（３．）ブタノールおよび／または酪酸合成のため、（４．）プロピル酸合成のため、および／または（５．）カダベリンおよび／またはプトレシン合成のための代謝経路のうちの、２、３、４、または５種が少なくとも部分的に遮断されている微生物ほど好ましい。

さらに、その中でも、各場合において微生物が細菌であるのが好ましい。

これは、そうした微生物は、遺伝子に対する生物工学的な操作について特に重要であるためである。 一方では、バシラス属の微生物について関連する経路を記載した。

その中でも好ましい微生物は、各場合において、グラム陰性菌、特に大腸菌、クレブシエラ、シュードモナスまたはザントモナス属、特に大腸菌Ｋ１２、大腸菌Ｂ、あるいはクレブシエラ・プランチコラ系統の１種、とりわけ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、大腸菌ＲＶ３０８、大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＸＬ−１、またはクレブシエラ・プランチコラ（Ｒｆ）系統の派生株である。

これは、上記系統が、遺伝子の分子生物学的な操作、例えばクローニング（実施例を参照されたい）のために重要な系統であり、さらに重要な産生株系統でもあるためである。

それに代わる選択肢として、各場合において、グラム陽性菌である微生物、特にバシラス、ブドウ球菌またはコリネバクテリウム属、とりわけバチルス・レンタス、バシラス・リケニホルミス、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・サブチリス、バチルス・グロビジイ、バチルス・アルカロフィラス、ストレプトコッカス・カルノサス、またはコリネバクテリウム・グルタミカム種のうちの１種、その中でもとりわけ好ましくはバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３が好ましい。

これは、これらの微生物は、周囲媒質に価値ある産物およびタンパク質を天然に分泌し得るので、価値ある産物およびタンパク質の生物工学的な生産にとって特に重要であるためである。 一方では、この用途のために使用されるバシラス・リケニホルミスとの関係が近付くほど、各場合において、開示される配列から得られる記載した作業工程は、バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３との関係性の程度が増すにつれてより首尾よく進行するはずである。 したがって、例えば、配列表に示す遺伝子は、点突然変異の後、近縁種で、この目的のためにその系統それ自体から相同遺伝子を単離する必要なく、直接的に欠失変異に使用できると考えられる。

本発明は特に、発酵処理を改良することを目的とする。 したがって、上述の本発明の微生物を発酵させるあらゆる方法が本発明の実施態様となる。

これらの方法、ならびに各場合において、記載した５種の代謝経路のうちの１種に対する影響に関して上述した方法は、特に価値ある産物、特に低分子量の化合物またはタンパク質が産生される方法である。

というのは、これらが、微生物発酵による生物工学的生産の本質的な使用領域であるためである。

その中でも、各場合において、低分子量の化合物が、天然物、栄養補助食品または医薬関連化合物である方法が好ましい。

というのは、これらが、微生物発酵による生物工学的な生産にとって重要な産物群であるためである。

微生物発酵によってタンパク質を生産するためのこのような生物工学的な方法の中でも、各場合において、タンパク質が、酵素、特にαアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、酸化還元酵素、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ、およびヘミセルラーゼからなる群からの酵素である方法が好ましい。

というのは、これらが、例えば洗浄剤または清浄用組成物に混ぜるために、工業的規模で生産される重要な酵素であるためである。

さらに、本発明によって提供される遺伝子産物は、別の用途にも利用できる。 すなわち、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０に示す上述に規定される、その生化学的性質に相応しい反応混合物または方法において、本発明のどの遺伝子産物をどのように使用しても実施される。

その中でも、好ましくは、（１．）イソ吉草酸合成のため、（２．）２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸合成のため、（３．）ブタノールおよび／または酪酸合成のため、（４．）プロピル酸合成のため、および／または（５．）カダベリンおよび／またはプトレシンの合成のための、適切な場合には、別の酵素と適切に組み合わせての使用が含まれる。

したがって、記載の代謝経路の産物は、単純な有機化合物であり、例えばそれらを出発材料としてより複雑な合成に使用することが、化学では確実に求められている。 その調製は、立体化学的な反応が利用されているとき、特に適切な酵素の使用により、ほとんどの場合には特異的に１種の鏡像異性体が生成されるので、かなり単純化することができる。 生体触媒による少なくとも１つの反応ステップにおいてそのような合成経路が為される場合に使用する用語は、バイオトランスフォーメーションである。 本発明のすべての遺伝子産物は、原則としてそれに適する。

以下の実施例は、本発明をさらに例示するものである。

分子生物学的な作業工程はすべて、例えばＦｒｉｔｓｃｈ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＭａｎｉａｔｉｓによる手引書「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米ニューヨーク、１９８９年に示されるような標準の方法、または類似の関連作業に従う。 酵素および作成キットは、それぞれの製造者の指示書に従って使用する。

（実施例１）
バシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３由来の、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、および４９で示す核酸の同定 ゲノムＤＮＡは、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，３８１２４ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ）から誰にでも入手可能なバシラス・リケニホルミス ＤＳＭ１３系統を機械的に細分し、０．８％アガロースゲル中での電気泳動によって分別して、標準の方法によって調製した。 より小さい断片のショットガンクローニングについては、大きさが２〜２．５ｋｂの断片をアガロースゲルから溶出し、脱リン酸化し、ベクターｐＴＺ１９Ｒ−ＣｍのＳｍａＩ制限切断部位に平滑末端化断片として連結した。 これは、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｓｔ．Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔ）から入手可能なプラスミドｐＴＺ１９Ｒの、クロラムフェニコール耐性を付与する派生物である。 それによって、より小さい断片の遺伝子ライブラリを得た。 二次的なショットガンクローニングとして、酵素ＳａｕＩＩＩａＩでの部分的な制限によって得たゲノム断片を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米Ｌａ ＪｏｌｌａのＳｕｐｅｒＣｏｓ１ベクター系（「Ｃｏｓｍｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ」）に連結し、その結果として主により大きい断片の遺伝子ライブラリを得た。

関連する組換えプラスミドを関連する遺伝子ライブラリでの形質転換によって入手可能な細菌である大腸菌ＤＨ５αから単離し、配列を決定した（Ｄ．Ｈａｎｎａｈａｎ（１９８３年）：「Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第１６６巻、５５７〜５８０ページ）。 この場合ではダイターミネーター法（ダイターミネーター化学）を使用し、自動シークエンサーＭｅｇａＢＡＣＥ１０００／４０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）およびＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）によって実施した。

この方法では、特に、本出願の配列表に示す配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、および４９の配列が得られた。 これらから得られるアミノ酸配列は、関連するアミノ酸配列が各場合においてより多い数字、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、および５０で表示される。

（実施例２）
配列相同性 実施例１のようにＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を確認した後、各場合において、ＧｅｎＢａｎｋ（国立バイオテクノロジー情報センターＮＣＢＩ、国立衛生研究所、米メリーランド州ベセズダ）、英ケンブリッジのＥＭＢＬ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ）、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ［Ｇｅｎｅｖａ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＧｅｎｅＢｉｏ）Ｓ． Ａ． 、スイス国ジュネーヴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ． ｇｅｎｅｂｉｏ． ｃｏｍ／ｓｐｒｏｔ． ｈｔｍｌ］、およびＰＩＲ［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、米ワシントンＤＣ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ． ｐｉｒ． ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ． ｅｄｕ］のデータベースを調べることによって、現時点までに開示されている最も類似した相同体を確認した。 この点について、ｎｒ（重複しない）オプションを選択した。

相同性の度合いを決定するために、突き止められたＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を並置して互いに比較したが、このために使用したコンピュータプログラムは、Ｉｎｆｏｒｍａｘ Ｉｎｃ． 、米ベセズダから入手可能なＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ７であった。 この場合では、ＤＮＡ配列の比較のために、このプログラムの標準のパラメータを使用した。 すなわち、Ｋ−タプルサイズ：２、最良ダイアゴナル数：４、ウィンドウサイズ：４、ギャップペナルティ：５、ギャップ開始ペナルティ：１５、およびギャップ伸長ペナルティ：６．６６。 以下の標準のパラメータをアミノ酸配列の比較に適用した。 Ｋ−タプルサイズ：１、最良ダイアゴナル数：５、ウィンドウサイズ：５、ギャップペナルティ：３、ギャップ開始ペナルティ：１０、およびギャップ伸長ペナルティ：０．１。 これらの配列比較の結果は、機能を意味するそれぞれの酵素名、Ｅ． Ｃ． 番号、および関連する代謝経路の表示と一緒に以下の表１にまとめてある。 従来技術で知られている酵素の番号付けは、上述のデータベースの一貫した呼称である。

表１：実施例１でそれぞれ確認した遺伝子およびタンパク質に最も類似した遺伝子およびタンパク質表中での意味は、以下のとおりである：
ＩＤ 本出願の配列表に示す配列番号、
Ｅ． Ｃ． 番号 国際酵素分類（ＩＵＢＭＢの酵素命名法）に従う番号。

発見された遺伝子およびそれから得られる遺伝子産物は、それぞれ、現時点までに開示されている従来技術とは明らかにかけはなれた新規な遺伝子およびタンパク質であることは明白である。

（実施例３）
バシラス・リケニホルミスの配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７および４９で示される遺伝子のうちの１種または複数の機能的な不活性化 欠失ベクター調製の原理 これらの遺伝子は、例えば、いわゆる欠失ベクターによって機能的に不活性化することができる。 この手順は、それ自体が、例えば、Ｊ． Ｖｅｈｍａａｎｐｅｒａら（１９９１年）による刊行物「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ」、Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． 、第１９巻、２２１〜２４０ページに記載されている。

これに適するベクターは、Ｔ． Ｊ． Ｇｒｙｃｚａｎら（１９８２年）による刊行物「Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥ１９４ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ」、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 、第１５２巻、７２２〜７３５ページで特徴付けられているｐＥ１９４である。 この欠失ベクターの利点は、これが温度依存性の複製起点を有することである。 ｐＥ１９４は、３３℃の形質転換細胞中で複製し得るので、形質転換を成功させるための最初の選択は、この温度で実施される。 その後、ベクターを含む細胞を４２℃でインキュベートする。 欠失ベクターは、この温度ではもはや複製せず、予め選択した相同領域によるプラスミドの染色体への組込みに対して選択圧が発揮される。 次いで、第２の相同領域による第２の相同組換えによって、染色体からベクターならびにインタクトな遺伝子コピーが切除され、こうして生体内の染色体にある遺伝子の欠失がもたらされる。 第２の組換えとしての別の可能性は、ベクターの染色体外への組換えを意味する、組込みとは逆の反応となるはずであるので、染色体の遺伝子は無傷のままになるはずである。 したがって、遺伝子欠失は、それ自体が知られている方法によって、例えば、染色体ＤＮＡを適切な酵素で制限した後にサザンブロットで、または増幅された領域のサイズを基としたＰＣＲ技術によって検出しなければならない。

したがって、除去すべき遺伝子の２箇所の相同領域を選択することが必要であり、そのそれぞれは、各場合において少なくとも７０の塩基対、例えば選択された遺伝子の５'領域および３'領域を含むべきである。 これらの領域は、それらが不活性なタンパク質をコードする部分と隣接するか、または間の領域が削除されるようにして、立て続けにベクター中にクローニングされる。 それによって、欠失ベクターが得られる。

本明細書で考察した遺伝子の欠失 本発明の欠失ベクターは、各場合において、これら目的とする遺伝子の１種の５'領域および３'領域のＰＣＲ増幅によって構築する。 配列表に示す配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、および４９の配列は、適切なプライマーの設計に利用でき、バシラス・リケニホルミスから生じるものであるが、相同性が予想されるので、他の種、特にバシラス属の種にも適するはずである。

増幅された２箇所の領域は、例えば大腸菌でのクローニング工程に適するベクターｐＵＣ１８での操作に有用なベクター上で、立て続けに適切に中間クローニングを為される。

次の工程は、欠失用に選択されたベクターｐＥ１９４へのサブクローニング、およびバチルス・サブチリスＤＢ１０４へのその形質転換、例えば、ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎ（１９７９年、「Ｈｉｇｈ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｂｙ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ」、Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９７９年）、第１６８巻，１１１〜１１５ページ）に従うプロトプラスト形質転換の方法による。 すべての作業工程は、確実にベクターを複製するために、３３℃で実施しなければならない。

次の工程では、中間クローニングを経たベクターを、望ましい宿主系統、この場合ではバシラス・リケニホルミスへのプロトプラスト形質転換法によって同様に形質転換する。 この方法で得られ、従来の方法（プラスミドの耐性マーカーによる選択、プラスミド調製による確認および挿入断片に対するＰＣＲ）によって陽性であると確認された形質転換体を、その後、エリスロマイシンを添加してプラスミドの存在について選択圧をかけながら４２℃で培養する。 欠失ベクターは、この温度で複製できず、唯一生存する細胞のみが、ベクターが染色体中に組み込まれた細胞であって、この組込みのほとんどは相同領域または同一領域で起こっている細胞である。 次いで、欠失ベクターの切除は、その後エリスロマイシン選択圧なしに３３℃で培養することによって誘発することができ、染色体にコードされている遺伝子が、染色体から完全に除去される。 その後、適切なもので染色体ＤＮＡを制限した後、サザンブロッティングによって欠失の成功を確認する。

関連遺伝子が除去されているかかる形質転換体は、通常は、関連する代謝経路の結果として生じる臭気物質または有毒物質の生成を制限することによってさらに区別される。 細胞が関連化合物の合成のための代わりの経路をもたない場合では、関連する代謝経路は完全に遮断されるので、その化合物はもはや生成されず、この方法で改変された系統は、該当する臭気構成要素をもたない。

イソ吉草酸生成のための代謝経路を示す図である。 説明：本文を参照されたい。

２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸生成のための代謝経路（２−メチル酪酸生成の態様）を示す図である。 説明：本文を参照されたい。 説明：本文を参照されたい。

２−メチル酪酸および／またはイソ酪酸生成のための代謝経路（イソ酪酸生成の態様）を示す図である。 説明：本文を参照されたい。 説明：本文を参照されたい。

ブタノールおよび／または酪酸生成のための代謝経路を示す図である。 説明：本文を参照されたい。

プロピル酸生成のための代謝経路を示す図である。 説明：本文を参照されたい。

カダベリンおよび／またはプトレシン生成のための代謝経路（カダベリン生成の態様）を示す図である。 説明：本文を参照されたい。

カダベリンおよび／またはプトレシン生成のための代謝経路（プトレシン生成の態様）を示す図である。 説明：本文を参照されたい。