用于生物合成异丁烯酸盐的方法 |
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| 申请号 | CN201480053694.3 | 申请日 | 2014-08-28 | 公开(公告)号 | CN105705650A | 公开(公告)日 | 2016-06-22 |
| 申请人 | 英威达技术有限责任公司; | 发明人 | A.L.博特斯; A.V.E.康拉迪; | ||||
| 摘要 | 本文件描述了使用酶(诸如一种或多种硫酯酶、转移酶或脱氢酶)以及表达一种或多种此类酶的重组宿主经由异丁 醛 和异丁酰基-CoA从前体(诸如丙 酮 酸 )生成异丁烯酸盐的 生物 化学途径。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种生成异丁烯酸盐的方法，所述方法包括使用硫酯酶或CoA-转移酶将异丁烯酰基-CoA酶促转化为异丁烯酸盐。 |
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| 说明书全文 | 用于生物合成异丁烯酸盐的方法发明领域 [0001] 本发明涉及用于生物合成异丁烯酸盐的方法，且更具体而言涉及使用一种或多种分离的酶(诸如一种或多种硫酯酶、脱氢酶或转移酶)或使用表达一种或多种此类酶的重组宿主细胞合成异丁烯酸盐。 [0002] 发明背景 [0003] 异丁烯酸盐(methacrylate)(2-甲基丙烯酸)是一种广泛用于异丁烯酸酯，诸如异丁烯酸甲酯或聚(异丁烯酸甲酯)(其用于生产透明的聚异丁烯酸甲酯丙烯酸塑料)的中间体。异丁烯酸盐可以通过各种路径合成，包括通过使用硫酸将丙酮合氰化氢(acetone cyanohydrin)转化为硫酸甲基丙烯酰胺以及水解成异丁烯酸，通过将异丁烯氧化为异丁烯醛(其被氧化为异丁烯酸)，或者通过异丁酸的脱氢。参见例如Bauer,“Methacrylic Acid and Derivatives”in Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry 2002,Wiley-VCH,Weinheim。因而，需要用于生成异丁烯酸盐的生物合成方法以避免使用危险的化学品。 [0004] 发明概述 [0005] 本公开内容至少部分基于用于生物合成异丁烯酸盐的酶促系统和重组宿主的开发，所述异丁烯酸盐是一种可用于生产异丁烯酸酯或聚(异丁烯酸甲酯)酯类，诸如异丁烯酸甲酯或聚(异丁烯酸甲酯)的中间体。特别地，如本文中描述的，可以自可再生给料生物合成生成异丁烯酸盐。异丁烯酸盐的生成经由异丁酰基CoA进行。术语“异丁烯酸盐”和“异丁烯酸”在本文中可互换使用，指任何其中性或离子化形式的相同化合物，包括其任何盐形式。本领域技术人员理解具体的形式会取决于pH。 [0006] 在一个方面，本文件特征在于生成异丁烯酸盐的方法。该方法包括从丙酮酸酶促合成异丁烯酰基-CoA，并且使用硫酯酶或CoA-转移酶将异丁烯酰基-CoA酶促转化为异丁烯酸盐。硫酯酶可以在EC 3.1.2.-下分类，并且可以是tesB或YciA的基因产物。CoA-转移酶可以在EC 2.8.3.-下分类，并且可以具有Genbank登录号CAB77207.1(SEQ ID NO:4)。 [0007] 本文件的特征还在于生成异丁烯酸盐的方法。该方法包括自丙酮酸酶促合成异丁醛，并且将异丁醛酶促转化为异丁烯酸盐。可以使用苯乙醛脱氢酶、异丁醛脱氢酶或乳醛脱氢酶将异丁醛转化为异丁酸，可以使用CoA转移酶或连接酶将异丁酸转化为异丁酰基-CoA，可以使用脱氢酶将异丁酰基-CoA转化为异丁烯酰基-CoA，并且可以使用硫酯酶或CoA转移酶将异丁烯酰基-CoA转化为异丁烯酸盐。苯乙醛脱氢酶可以在EC 1.2.1.39下分类。例如，苯乙醛脱氢酶可以与SEQ ID NO:8中所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。乳醛脱氢酶可以在EC 1.2.1.22下分类。异丁醛脱氢酶可以与SEQ ID NO:6中所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。CoA转移酶可以是EC 2.8.3.1下分类的丙酸CoA转移酶。例如，丙酸CoA-转移酶可以与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5.的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。连接酶可以是EC 6.2.1.13下分类的丙酸CoA连接酶。 [0008] 在一个方面，本文件特征在于生成异丁烯酸盐的方法。该方法包括使用硫酯酶或CoA-转移酶将异丁烯酰基-CoA酶促转化为异丁烯酸盐。硫酯酶可以在EC 3.1.2.-下分类。例如，硫酯酶可以是tesB或YciA的基因产物。硫酯酶可以与SEQ ID NO:1、2或3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。CoA-转移酶可以在EC 2.8.3.-下分类。例如，CoA-转移酶可以与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5.的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。可以从丙酮酸酶促合成异丁烯酰基-CoA。例如，可以使用例如一种或多种下述酶，自丙酮酸经由异丁醛酶促合成异丁烯酰基-CoA：乙酰乳酸合酶；二羟基异戊酸脱氢酶；2,3-二羟基异戊酸脱水酶；2-氧代戊酸脱酸酶；苯乙醛脱氢酶，异丁醛脱氢酶或乳醛脱氢酶；或CoA转移酶或连接酶；或酰基-CoA脱氢酶。也可以使用例如一种或多种下述酶，经由2-氧代-异戊酸至异丁酰基-CoA的转化自丙酮酸酶促合成异丁烯酰基-CoA：乙酰乳酸合酶；二羟基异戊酸脱氢酶；2,3-二羟基异戊酸脱水酶；支链脱氢酶；或酰基-CoA脱氢酶。连接酶可以是EC 6.2.1.13下分类的丙酸CoA连接酶。酰基-CoA脱氢酶可以是异丁酰基-CoA脱氢酶，例如，与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9中所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的异丁酰基-CoA脱氢酶。 [0009] 本文中描述的任何方法可以在重组宿主(例如原核生物或真核生物)中进行。宿主可以经受厌氧、需氧或微需氧培养条件下的培养策略。可以经由氮、磷酸盐或氧限制在营养物限制的条件下培养所述宿主。可以使用陶瓷中空纤维膜保留所述重组宿主细胞以在发酵期间维持高细胞密度。补料到发酵的主要碳源可以源自生物或非生物给料。生物给料可以是或可以源自单糖，二糖，木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素诸如乙酰丙酸和糠醛、木质素、甘油三酯例如甘油和脂肪酸、农业废物或城市废物。非生物给料可以是或可以源自天然气、合成气、CO2/H2，甲醇，乙醇，非挥发性残留物(NVR)或来自环己烷氧化过程的碱洗液(caustic wash)。 [0010] 在本文中描述的任何方法中，可以经由在选择性环境中的连续培养改善所述宿主对高浓度的异丁烯酸的耐受性。 [0011] 在本文中描述的任何方法中，可以在所述宿主中减弱导致并且包含异丁烯酸的中心代谢物和中心前体的内源降解途径。 [0012] 在本文中描述的任何方法中，可以通过遗传工程化改造对细胞膜的结构修饰或者提高异丁烯酸的任何关联转运蛋白活性增强或放大异丁烯酸穿过细胞膜到胞外介质的流出。 [0013] 本文件的特征还在于重组宿主，其包含至少一种编码苯乙醛脱氢酶的外源核酸，其中所述重组宿主生成异丁烯酸。苯乙醛脱氢酶可以在EC 1.2.1.39下分类。宿主可以进一步包含编码丙酸CoA转移酶的外源核酸。宿主可以进一步包含编码丙酸CoA连接酶的外源核酸。宿主可以进一步包含编码YciA或tesB的基因产物的外源核酸。 [0014] 本文件的特征还在于重组宿主，其包含至少一种编码苯乙醛脱氢酶的外源核酸，其中重组宿主生成异丁烯酸。苯乙醛脱氢酶可以在EC 1.2.1.39下分类。例如，苯乙醛脱氢酶可以与SEQ ID NO:8中所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。宿主可以进一步包含下述外源酶中的一种或多种(例如1、2、3、或4)：丙酸CoA转移酶、丙酸CoA连接酶、硫酯酶和异丁酰基-CoA脱氢酶。丙酸CoA转移酶可以与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。硫酯酶可以是YciA或tesB的基因产物。硫酯酶可以与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。异丁酰基-CoA脱氢酶可以与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9中所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。 [0015] 任何重组宿主或任何方法中使用的任何重组宿主可以是原核生物。原核生物可以来自埃希氏菌属(Escherichia)如大肠杆菌(Escherichia coli)；来自梭菌属(Clostridia)如杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)或者克鲁佛梭菌(Clostridium kluyveri)；来自棒状杆菌属 (Corynebacteria)如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)；来自贪铜菌属(Cupriavidus)如钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)或者耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)；来自假单胞菌属(Pseudomonas)如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或者食油假单胞菌(Pseudomonas oleavorans)；来自代尔夫特菌属(Delftia)，食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)；来自芽孢杆菌属(Bacillus)如枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillis)；来自乳杆菌属 (Lactobacillus)如德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)；或者来自乳球菌属 (Lactococcus)如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)或来自红球菌属(Rhodococcus)如马红球菌(Rhodococcus equi)。 [0016] 任何重组宿主或任何方法中使用的任何重组宿主可以是真核生物。所述真核生物可以来自曲霉属(Aspergillus)如黑曲霉(Aspergillus niger)；来自酵母属(Saccharomyces)如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；来自毕赤氏酵属(Pichia)如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；来自耶罗维亚酵母属(Yarrowia)如解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)；来自伊萨酵母属(Issatchenkia)如东方伊萨酵母 (Issathenkia orientalis)；来自德巴利酵母属(Debaryomyces)如汉逊德巴利酵母 (Debaryomyces hansenii)；来自Arxula属如Arxula adenoinivorans；或者来自克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)如乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis)。 [0017] 可以在一种或多种细胞(例如宿主细胞)株中实施本文中描述的途径的反应，所述细胞株(a)天然表达一种或多种相关酶，(b)经过遗传工程化改造以表达一种或多种相关酶，或(c)天然表达一种或多种相关酶，并且经过遗传工程化改造以表达一种或多种相关酶。或者，相关酶可以自任何上述类型的宿主细胞提取，并且可以以纯化或半纯化形式使用。任选地，提取的酶可以固定化到固体基片，诸如合适的反应容器的底和/或壁。此外，此类提取物包括可以用作相关酶的来源的裂解物(例如细胞裂解物)或部分纯化的裂解物。在由本文件提供的方法中，可以在宿主(宿主细胞)中进行所有步骤，可以使用提取的酶进行所有步骤，或者可以在细胞中进行一些步骤，并且可以使用提取的酶进行其他步骤。在任何方法中，反应可以是单步骤转化，其中将一种化合物直接转化为感兴趣的不同化合物(例如异丁烯酰基-CoA至异丁烯酸盐)，或者转化可以包括两个或更多个步骤来将一种化合物转化为感兴趣的不同化合物。 [0018] 除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然可以使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料来实施本发明，但是下文描述了合适的方法和材料。通过提及完整并入本文中提及的所有出版物、专利申请、专利、和其它出版物。在冲突的情况中，应以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和例子仅是例示性的，而不意图为限制性的。 [0019] 本发明的一个或者多个实施方案的细节在附图和下面的描述中阐明。根据说明书和附图，并根据权利要求书，本发明的其它特征、目的和优点将是明显的。根据专利法的标准实践，词语“包含”在权利要求书中可被“基本上由…组成”或者“由…组成”替代。 [0020] 附图简述 [0021] 图1是导致异丁烯酸生成的生物合成途径的示意性概述。 [0022] 图2含有大肠杆菌硫酯酶(GenBank登录号AAA24665.1,SEQ ID NO:1)、大肠杆菌硫酯酶(GenBank登录号ACX40038,SEQ ID NO:2)，流感嗜血菌(Haemophilus influenza)酰基-CoA硫酯酶(GenBank登录号ADO96882,SEQ ID NO:3)，丙酸梭菌(Clostridium propionicum)丙酸CoA-转移酶(GenBank登录号CAB77207.1,SEQ ID NO:4)，埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)DSM20460丙酸CoA-转移酶(Genbank登录号CCC72964.1,SEQ ID NO:5)，假单胞菌物种(Pseudomonas sp.)VLB120异丁醛脱氢酶(Genbank登录号 AGZ35351.1,SEQ ID NO:6)，Shewanella oneidensis MR-1异丁酰基-CoA脱氢酶(SEQ ID NO:7)、大肠杆菌苯乙醛脱氢酶(GenBank登录号CAA67780.1,SEQ ID NO:8)和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)异丁酰基-CoA脱氢酶(GenBank登录号AAD44196.1,SEQ ID NO:9)的氨基酸序列。 [0023] 发明详述 [0024] 特别地，本文件提供了酶、非天然途径、培养策略、给料、宿主微生物和对宿主生物化学网络的减弱，其可以用于从中心前体或中心代谢物合成异丁烯酸(2-甲基丙烯酸)。例如，可以从丙酮酸生成异丁烯酸，合成经由2-氧代-异戊酸，接着是异丁醛、异丁酸和异丁酰基CoA进行。或者，合成可以直接从2-氧代-异戊酸进行到异丁酰基CoA，而没有首先形成异丁醛，然后形成异丁酸。如本文中使用的，术语“中心前体”用于表示导致异丁烯酸合成的本文中公开的途径中的任何代谢物。术语“中心代谢物”在本文中用于表示在所有微生物中产生以支持生长的代谢物。 [0025] 因此，本文中描述的宿主微生物可以包含内源途径，该内源途径可以经操作，使得可以生成异丁烯酸。在内源途径中，宿主微生物天然表达催化途径内的反应的所有酶。含有工程化途径的宿主微生物不天然表达催化途径内的反应的所有酶，但是已经经过工程化改造，使得在宿主中表达途径内的所有酶。例如，宿主可以包含合成丙酮酸的内源酶。在工程化途径内，酶可以来自单一来源，即来自一种物种，或者可以来自多种来源，即不同物种。编码本文中描述的酶的核酸已经从各种生物体中鉴定，并且在公众可用的数据库诸如GenBank或EMBL中容易得到。 [0026] 可以用于异丁烯酸生成的本文中描述的任何酶可以与相应的野生型酶的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。例如，本文中描述的硫酯酶可以与大肠杆菌硫酯酶诸如testB的基因产物(GenBank登录号AAA24665.1,SEQ ID NO:1)、GenBank登录号ACX40038的大肠杆菌硫酯酶(SEQ ID NO:2)、或来自流感嗜血菌的酰基-CoA硫酯酶，诸如yciA的基因产物(GenBank登录号ADO96882,SEQ ID NO:3)具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、 85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。 [0027] 例如，本文中描述的丙酸CoA-转移酶与来自丙酸梭菌(GenBank登录号CAB77207.1,SEQ ID NO:4)或埃氏巨球形菌DSM 20460(Genbank登录号CCC72964.1,SEQ ID NO:5)的丙酸CoA-转移酶的氨基酸序列可以具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少 75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。参见Prabhu et al.,2012,Appl.Environ.Microbiol.,78(24),8564–8570，其指示了来自埃氏巨球形菌的丙酸CoA-转移酶接受异丁烯酰基-CoA作为底物。 [0028] 例如，本文中描述的异丁醛脱氢酶可以与EC 1.2.1.-下分类的来自假单胞菌物种VLB120的异丁醛脱氢酶(Genbank登录号AGZ35351.1,SEQ ID NO:6)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或 100％)。参见Lang et al.,2014,Microbial Cell Factories,13(2),1–14，其指示异丁醛脱氢酶接受异丁醛作为底物。 [0029] 例如，本文中描述的异丁酰基-CoA脱氢酶可以与例如EC 1.3.99.12下分类的来自Shewanella oneidensis MR-1(SEQ ID NO:7)或来自阿维链霉菌(Genbank登录号AAD44196.1,SEQ ID NO:9)的异丁酰基-CoA脱氢酶的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。参见Kazakov et al.,2009,J.Bacteriol.,191(1),52–64,及Zhang et al.,1999,Microbiology,145, 2323–2334，其指示异丁酰基-CoA脱氢酶接受异丁酰基-CoA(isobytyryl-CoA)作为底物。 [0030] 例如，本文中描述的苯乙醛脱氢酶可以与来自大肠杆菌的苯乙醛脱氢酶的氨基酸序列(Genbank登录号CAA67780.1,SEQ ID NO:8)具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)。参见Xiong et al.,2012,Sci.Rep.,2,1–13，其指示苯乙醛脱氢酶接受异丁醛作为底物。 [0031] 可以如下测定两种氨基酸序列间的百分比同一性(同源性)。首先，使用来自含有BLASTP第2.0.14版的单机版BLASTZ的BLAST 2 Sequences(Bl2seq)程序比对氨基酸序列。此单机版BLASTZ可以获自Fish&Richardson的网站(例如www.fr.com/blast/)或美国政府国立生物技术信息中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)。解释如何使用Bl2seq程序的用法说明可以参见伴随BLASTZ的自述文件。Bl2seq使用BLASTP算法实施两种氨基酸序列之间的比较。为了比较两种氨基酸序列，如下设置Bl2seq的选项：-i设置为含有要比较的第一氨基酸序列的文件(例如C:\seq1.txt)；-j设置为含有要比较的第二氨基酸序列的文件(例如C:\seq2.txt)；-p设置为blastp；-o设置为任何期望的文件名称(例如C:\output.txt)；并且所有其它选项保持为其缺省设置。例如，可以使用以下命令来产生含有两种氨基酸序列间的比较的输出文件：C:\Bl2seq–i c:\seq1.txt–j c:\seq2.txt–p blastp–o c:\ output.txt。如果两种比较序列共享同源性(同一性)，那么指定的输出文件会呈现那些同源性区作为比对序列。如果两种比较序列不共享同源性(同一性)，那么指定的输出文件不会呈现比对序列。可以对核酸序列遵循相似的规程，只是使用blastn。 [0032] 一旦比对，通过计算相同氨基酸残基在这两种序列中呈现的位置的数目确定匹配数目。通过用匹配数目除以全长多肽氨基酸序列的长度，接着将所得的数值乘以100来确定百分比同一性(同源性)。注意到百分比同一性(同源性)值被四舍五入到最近的十分位。例如，78.11、78.12、78.13、和78.14被向下四舍五入到78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18、和78.19被向上四舍五入到78.2。还注意到长度值会总是整数。 [0033] 应当领会，许多核酸可以编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码的简并性是本领域中公知的；即对于许多氨基酸，存在有超过一种充当氨基酸密码子的核苷酸三联体。例如，可以修饰给定酶的编码序列中的密码子，从而获得特定物种(例如细菌或真菌)中的最佳表达，这使用适合于所述物种的密码子偏爱表进行。 [0034] 也可以在本文件的方法中使用本文中描述的任何酶的功能性片段。如本文中使用的，术语“功能性片段”指与相应的成熟、全长、野生型蛋白质的活性具有至少25％(例如至少30％；40％；50％；60％；70％；75％；80％；85％；90％；95％；98％；99％；100％；或甚至大于100％)的蛋白质的肽片段。功能性片段一般但不总是可以由蛋白质的连续区构成，其中该区具有功能性活性。 [0035] 此文件还提供了(i)本文件的方法中使用的酶的功能性变体和(ii)上文描述的功能性片段的功能性变体。相对于相应的野生型序列，酶和功能性片段的功能性变体可以含有添加、缺失、或取代。具有取代的酶一般会具有不超过50(例如不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、或50)处氨基酸取代(例如保守取代)。这适用于本文中描述的任何酶和功能性片段。保守取代是用一种氨基酸取代具有相似特征的另一种。保守取代包括下列组内的取代：缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、缬氨酸、和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、半胱氨酸、和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。非极性疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。用上文提及的极性、碱性或酸性组的一种成员被相同组的另一种成员的任何取代可以视为保守取代。比较而言，非保守取代是用一种氨基酸取代具有不同特征的另一种。 [0036] 缺失变体可以缺乏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个氨基酸的区段(具有两种或更多种氨基酸)或非连续的单一氨基酸。添加(添加变体)包括融合蛋白，其含有：(a)本文中描述的任何酶或其片段；和(b)内部或末端(C或N)无关或异源氨基酸序列。在此类融合蛋白的背景中，术语“异源氨基酸序列”指与(a)不同的氨基酸序列。异源序列可以是例如用于纯化重组蛋白的序列(例如FLAG、多组氨酸(例如六组氨酸)、凝集素(HA)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、或麦芽糖结合蛋白(MBP))。异源序列也可以是可用作可检测标志物的蛋白质，例如萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、或氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。在一些实施方案中，融合蛋白含有来自另一种蛋白质的信号序列。在某些宿主细胞(例如酵母宿主细胞)中，可以经由使用异源信号序列提高靶蛋白的表达和/或分泌。在一些实施方案中，融合蛋白可以含有可用于例如引发免疫应答以生成抗体的载体(例如KLH)或ER或高尔基体保留信号。异源序列可以是不同长度的，并且在一些情况中可以是比与异源序列附接的全长靶蛋白质更长的序列。 [0037] 工程化宿主可以天然表达本文中描述的途径的酶中的无一或一些(例如一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、或六种或更多种)。还可以破坏工程化宿主的内源基因以阻止不想要的代谢物的形成或阻止经由对中间体起作用的其它酶的途径中的此类中间体的损失。工程化宿主可以称为重组宿主或重组宿主细胞。如此，如本文中描述的，重组宿主可以包含编码下列一项或多项的核酸：乙酰乳酸合酶、脱氢酶，诸如二羟基异戊酸脱氢酶、2-甲基酰基-CoA脱氢酶、苯乙醛脱氢酶、异丁醛脱氢酶、短链或中等链酰基-CoA脱氢酶，诸如异丁酰基-CoA(isobuytryl-CoA)脱氢酶、2,3-二羟基异戊酸脱水酶、转移酶，诸如丙酸CoA转移酶、连接酶，诸如乙酸CoA连接酶或酰基-CoA水解酶或硫酯酶，如下文更为详细描述的。 [0038] 另外，可以使用本文中描述的分离的酶，使用来自宿主微生物的裂解物(例如细胞裂解物)作为酶来源，或者使用来自不同宿主微生物的多种裂解物作为酶来源在体外实施异丁烯酸盐的生成。 [0039] 如本文中描述的，可以通过脱氢酶，诸如例如在EC 1.3.8.1、EC 1.3.8.7、EC 1.3.99.12下分类的酶，或类EC 1.3.99.-中的其它酶酶促形成异丁烯酸盐的碳-碳双键，如本文中描述的。 [0040] 在一些实施方案中，丙酮酸是异丁烯酸合成的前体。如图1中描绘，可以通过例如EC 2.2.1.6下分类的乙酰乳酸合酶将丙酮酸转化为乙酰乳酸。通过例如EC 1.1.1.86下分类的二羟基异戊酸脱氢酶将2-乙酰乳酸转化为2,3-二羟基异戊酸；接着通过例如在EC 4.2.1.9下分类的2,3-二羟基异戊酸脱水酶将2,3-二羟基异戊酸转化为2-氧代-异戊酸；接着通过例如EC 4.1.1.72下分类的2-氧代戊酸脱酸酶将2-氧代-异戊酸转化为异丁醛；接着通过例如EC 1.2.1.39下分类的苯乙醛脱氢酶，异丁醛脱氢酶，或例如EC 1.2.1.22下分类的乳醛脱氢酶将异丁醛转化为异丁酸；接着通过例如EC 2.8.3.-下类型的CoA转移酶，诸如例如EC 2.8.3.1下分类的丙酸CoA转移酶或者通过例如EC 6.2.1.下分类的连接酶，诸如例如EC 6.2.1.7下分类的丙酸CoA连接酶将异丁酸转化为异丁酰基-CoA；接着通过例如EC 1.3.8.-下分类的酰基-CoA脱氢酶诸如EC 1.3.8.1下分类的短链酰基-CoA脱氢酶，或EC 1.3.8.7下分类的中等链酰基-CoA脱氢酶，或者通过例如EC 1.3.99.12下分类的2-甲基酰基-CoA脱氢酶将异丁酰基-CoA转化为异丁烯酰基CoA；接着通过例如酰基-CoA水解酶或例如EC3.1.2.-下分类的硫酯酶，诸如yciA或tesB的基因产物或例如EC 2.8.3.-下分类的CoA-转移酶，诸如例如EC 2.8.3.1下分类的丙酸CoA转移酶将异丁烯酰基CoA转化为异丁烯酸。 [0041] 在一些实施方案中，丙酮酸再次是异丁烯酸合成的前体，但是使用部分不同的途径。如图1中描绘，可以通过例如EC 2.2.1.6下分类的乙酰乳酸合酶将丙酮酸转化为2-乙酰乳酸。可以通过例如EC 1.1.1.86下分类的二羟基异戊酸脱氢酶将2-乙酰乳酸转化为2,3-二羟基异戊酸；接着通过例如EC 4.2.1.9下分类的2,3-二羟基异戊酸脱水酶将2,3-二羟基异戊酸转化为2-氧代-异戊酸；接着通过以其亚基分类的支链脱氢酶复合物(例如在EC 1.2.4.4、EC 1.8.1.4和EC 2.3.1.168下)将2-氧代-异戊酸转化为异丁酰基-CoA；接着通过例如EC 1.3.8.-下分类的酰基-CoA脱氢酶，诸如EC 1.3.8.1下分类的短链酰基-CoA脱氢酶，或EC 1.3.8.7下分类的中等链酰基-CoA脱氢酶，或者通过例如EC 1.3.99.12下分类的 2-甲基酰基-CoA脱氢酶将异丁酰基-CoA转化为异丁烯酰基CoA；接着通过例如酰基-CoA水解酶或例如EC 3.1.2.-下分类的硫酯酶，诸如yciA或tesB的基因产物或例如EC 2.8.3.-下分类的CoA-转移酶，诸如例如EC 2.8.3.1下分类的丙酸CoA转移酶(参见例如，GenBank登录号CAB77207.1下的转移酶，SEQ ID NO:4)将异丁烯酰基-CoA转化为异丁烯酸。 [0042] 培养策略 [0043] 在一些实施方案中，可以使用发酵策略在重组宿主中生物合成异丁烯酸盐，所述发酵策略可以包括重组宿主的厌氧、微需氧或需氧培养。 [0044] 异丁烯酸盐合成中的途径需要维持低溶解氧浓度，同时维持足够氧转移以防止底物氧化受控条件的微需氧策略，所述途径掺入需要分子氧的酶和体外表征为氧敏感性的酶(Chayabatra&Lu-Kwang,Appl.Environ.Microbiol.,2000,66(2),493 0 498)。 [0045] 在一些实施方案中，可以采用使用例如陶瓷中空纤维膜的细胞保留策略来实现并维持异丁烯酸盐合成中的补料分批或连续发酵期间的高细胞密度。 [0046] 在一些实施方案中，在异丁烯酸合成中对发酵补料的主要碳源可以源自生物或非生物给料。 [0047] 在一些实施方案中，生物给料可以是，可以包括或者可以源自单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素诸如乙酰丙酸和糠醛、木质素、甘油三酯，诸如甘油和脂肪酸、农业废物、或城市废物。 [0048] 已经在几种微生物(诸如大肠杆菌、钩虫贪铜菌、食油假单胞菌、恶臭假单胞菌和解脂耶罗维亚酵母)中证明了源自生物柴油生产的粗制甘油的有效分解代谢(Lee等,Appl.Biochem.Biotechnol.,2012,166:1801–1813；Yang等,Biotechnology for Biofuels,2012,5:13；Meijnen等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011,90:885-893)。 [0049] 已经在几种生物体(诸如钩虫贪铜菌和恶臭假单胞菌)中在经由前体丙酰基-CoA合成3-羟基戊酸中证明了木质纤维素衍生的乙酰丙酸的有效分解代谢(Jaremko and Yu,Journal of Biotechnology,2011,155,2011,293–298；Martin and Prather,Journal of Biotechnology,2009,139,61–67)。 [0050] 已经在几种微生物(诸如恶臭假单胞菌、钩虫贪铜菌)中证明了木质素衍生的芳香族化合物诸如苯甲酸类似物的有效分解代谢(Bugg等,Current Opinion in Biotechnology,2011,22,394–400；Pérez-Pantoja等,FEMSMicrobiol.Rev.,2008,32,736– 794)。 [0051] 已经在几种微生物(包括解脂耶罗维亚酵母)中证明了农业废物(诸如橄榄磨坊废水)的有效利用(Papanikolaou等,Bioresour.Technol.,2008,99(7):2419-2428)。 [0052] 已经对几种微生物(诸如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌和德氏乳杆菌和乳酸乳球菌)证明了可发酵糖类(诸如源自纤维素、半纤维素、甘蔗和甜菜糖蜜、木薯、玉米和其它农业来源的单糖和二糖)的有效利用(参见例如Hermann et al,Journal of Biotechnology,2003,104,155–172；Wee et al.,Food Technol.Biotechnol.,2006,44(2),163–172； Ohashi et al.,Journal of Bioscience and Bioengineering,1999,87(5),647-654)。 [0053] 已经对钩虫贪铜菌证明了源自多种农业木质纤维素来源的糠醛的有效利用(Li等,Biodegradation,2011,22:1215–1225)。 [0054] 在一些实施方案中，非生物给料可以是或者可以源自天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物(NVR)或碱洗废物流。 [0055] 已经对甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母证明了甲醇的有效分解代谢。 [0056] 已 经对克鲁佛梭菌证明了乙醇的有效分解代谢( Seedorf等 ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2008,105(6)2128-2133)。 [0057] 已经对钩虫贪铜菌证明了CO2和H2(其可以源自天然气和其它化学和石油化学来源)的有效分解代谢(Prybylski等,Energy,Sustainability and Society,2012,2:11)。 [0058] 已经对多种微生物(诸如杨氏梭菌和自产乙醇梭菌)证明了合成气的有效分解代谢( 等,Applied and Environmental Microbiology,2011,77(15):5467–5475)。 [0059] 已经对多种微生物(诸如食酸代尔夫特菌和钩虫贪铜菌证明了来自环己烷过程的非挥发性残留物废物流的有效分解代谢(Ramsay等,Applied and Environmental Microbiology,1986,52(1):152–156)。 [0060] 在一些实施方案中，宿主微生物可以是原核生物。例如，原核生物可以是来自以下的细菌：埃希氏菌属如大肠杆菌；梭菌属如杨氏梭菌、自产乙醇梭菌或者克鲁佛梭菌；棒状杆菌属如谷氨酸棒状杆菌；贪铜菌属如钩虫贪铜菌或者耐金属贪铜菌；假单胞菌属如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌或者食油假单胞菌；代尔夫特菌属如食酸代尔夫特菌；芽孢杆菌属如枯草芽胞杆菌；乳杆菌属如德氏乳杆菌；或者乳球菌属如乳酸乳球菌。此类原核生物也可以是构建能够生成异丁烯酸的本文中描述的重组宿主细胞的基因来源。 [0061] 在一些实施方案中，宿主微生物可以是真核生物。例如，真核生物可以是来自曲霉属如黑曲霉的丝状真菌。另外，真核生物可以是来自酵母属如酿酒酵母；来自毕赤氏酵属如巴斯德毕赤酵母；来自耶罗维亚酵母属如解脂耶罗维亚酵母；来自伊萨酵母属如东方伊萨酵母；来自德巴利酵母属如汉逊德巴利酵母；来自Arxula属如Arxula adenoinivorans；或者来自克鲁维酵母菌属如乳酸克鲁维酵母菌的酵母。此类真核生物也可以是构建能够生成异丁烯酸的本文中描述的重组宿主细胞的基因来源。 [0062] 可以在细胞中表达的外源酶可以包括下列一项或多项：例如EC 2.2.1.6下分类的乙酰乳酸合酶；例如，EC 1.1.1.86，EC 1.2.1.39，EC 1.3.8.1，EC1.3.8.7，或EC 1.3.99.12下分类的脱氢酶，或由EC 1.2.4.4，EC 1.8.1.4和EC 2.3.1.168构成的支链脱氢酶复合物；例如EC 4.2.1.9下分类的脱水酶；例如EC 4.1.1.72下分类的脱酸酶；例如EC 2.8.3.-，诸如EC 2.8.3.1下分类的CoA转移酶；例如EC 6.2.1.7下分类的连接酶；或酰基-CoA水解酶或例如EC 3.1.2.-下分类的硫酯酶。 [0063] 例如，重组宿主可以包含至少一种编码苯乙醛脱氢酶或异丁醛脱氢酶的外源核酸，并且生成异丁烯酸。苯乙醛脱氢酶可以在EC 1.2.1.39下分类，例如与SEQ ID NO:8中所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的苯乙醛脱氢酶。异丁醛脱氢酶可以与SEQ ID NO:6中所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。宿主还可以包含一种或多种(例如2、3、4、5、6、7、8、9或更多)可以用于将丙酮酸转化为异丁烯酸的外源酶。例如，重组宿主可以包含外源丙酸CoA转移酶(例如与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70％序列同一性丙酸CoA转移酶)、外源丙酸CoA连接酶、外源硫酯酶(例如YciA或tesB的基因产物或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的硫酯酶)、外源异丁酰基-CoA脱氢酶(例如与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9中所列的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的异丁酰基-CoA脱氢酶)、外源乙酰乳酸合酶、外源二羟基异戊酸脱氢酶、2,3-二羟基异戊酸脱水酶、2-氧代戊酸脱酸酶、支链脱氢酶复合物。 [0064] 在一些实施方案中，提供重组宿主的基本上纯的培养物。如本文中使用的，重组细胞的“基本上纯的培养物”是下述细胞的培养物，其中在培养物中活细胞的总数中少于约40％(即，小于约：35％；30％；25％；20％；15％；10％；5％；2％；1％；0.5％；0.25％；0.1％； 0.01％；0.001％；0.0001％；或甚至更少)是不同于重组细胞的活细胞，例如，细菌、真菌(包括酵母)、支原体或原生动物细胞。在此上下文中的术语“约”意指相关百分比可以是高于或低于规定百分比的15％规定百分比。因此，例如，约20％可以是17％至23％。重组细胞的此类培养物包括细胞和生长培养基，贮存培养基或转运培养基。培养基可以是液体、半固体(例如，凝胶状培养基)或冷冻的。培养物包括在液体培养基中或在半固体培养基中/上生长或正在贮存或转运培养基(包括冷冻贮存或转运培养基)中贮存或转运的细胞。培养物是在培养容器或贮存容器或基质(例如，培养皿、烧瓶、或管或贮存管形瓶或管)中。 [0065] 代谢工程 [0066] 本文件提供方法，所述方法牵涉少于对上述途径描述的所有的步骤。这种方法可牵涉例如此类步骤中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多个。在这种方法包含少于所有步骤的情况下，第一个步骤可为所列步骤中的任何步骤。 [0067] 此外，本文中描述的重组宿主可以包括上述酶中的任何组合，使得所述步骤中的一个或者多个，例如此类步骤中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多个可以在重组宿主内实施。 [0068] 另外，本文件认识到，在酶已经被描述为接受CoA活化的底物的情况下，存在与[acp]结合底物相关的相似的酶活性，其不一定为相同的酶种类。 [0069] 此外，本文件认识到，在酶已经被描述为接受底物的(R)-对映异构体的情况下，存在与底物的(S)-对映异构体相关的相似的酶活性，其不一定为相同的酶种类。 [0070] 本文件还认识到，在已经显示酶接受特定辅因子如NADPH或者共底物如乙酰基-CoA的情况下，许多酶在催化特定酶活性中在接受大量不同辅因子或者共底物方面是泛宿主性的(promiscuous)。此外，本文件认识到，在酶对例如特定辅助因子如NADH具有高特异性的情况下，对辅助因子NADPH具有高特异性的具有相似或者相同活性的酶可为不同的酶种类。 [0071] 在一些实施方案中，上文概述的途径中的酶是经由非直接或者合理酶设计方法的酶工程的结果，目的在于改善活性、改善特异性、降低反馈抑制、降低阻抑、改善酶溶解度、改变立体特异性，或者改变辅助因子特异性。 [0072] 在一些实施方案中，将上文概述的途径中的酶经由附加型或者染色体整合方法基因投入(gene dose)(即，过表达)至所得的遗传修饰的生物体中。 [0073] 在一些实施方案中，利用基因组级别(genome-scale)系统生物学技术如通量平衡分析来设计用于将碳流量引导至异丁烯酸盐的基因组级别的弱化或者敲除策略。 [0074] 弱化策略包括但不限于使用转座子、同源重组(双交叉方法)、诱变、酶抑制剂和RNAi干扰。 [0075] 在一些实施方案中，利用通量组(fluxomic)、代谢物组(metabolomic)和转录物组(transcriptomal)数据来告知或者支持基因组级别的系统生物学技术，由此在将碳流量导向异丁烯酸盐中设计基因组级别的弱化或者敲除策略。 [0076] 在使用天然积累聚羟基链烷酸酯(polyhydroxyalkanoates)的宿主的一些实施方案中，可以在宿主菌株中弱化酶聚合物核酶。 [0077] 在需要丙酮酸的胞内利用度的一些实施方案中，可以通过生物素限制策略弱化丙酮酸羧化酶的活性。 [0078] 在需要2-乙酰乳酸的胞内利用度的一些实施方案中，可以在宿主生物体中过表达反馈抑制抗性乙酰乳酸合酶酶突变体。 [0079] 在一些实施方案中，可以在宿主中弱化导致中心代谢物和中心前体的前体和异丁烯酸盐的内源降解途径。 [0080] 在一些实施方案中，通过遗传工程化改造对细胞膜的结构修饰或者提高异丁烯酸盐的任何关联转运蛋白活性增强或放大异丁烯酸盐穿过细胞膜到胞外介质的流出。 [0081] 其它实施方案 [0082] 应理解的是，尽管本发明结合其详细描述进行了描述，但是前面的描述意图例示并且不限制发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点和修饰也在所附权利要求书的范围内。 |
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