产生1,3‑丁二烯的方法 |
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| 申请号 | CN201280040122.2 | 申请日 | 2012-06-15 | 公开(公告)号 | CN103842513B | 公开(公告)日 | 2017-05-17 |
| 申请人 | 英威达技术有限责任公司; | 发明人 | P.S.珀尔曼; 陈昌林; A.L.波特斯; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了用于从一种或多种的数种不同原料中产生丁二烯的方法，所述原料包括 生物 来源的原料、可 再生原料 、石油化学品原料和 天然气 。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种生物合成丁二烯的方法，所述方法包括： |
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| 说明书全文 | 产生1,3-丁二烯的方法[0001] 相关申请 [0002] 本申请要求2011年6月17日提交的美国临时申请No.61/498,408的优先权。发明领域 [0004] 发明背景 [0005] 1,3-丁二烯(下文为丁二烯)是合成橡胶包括苯乙烯-丁二烯橡胶(SBR)，塑料包括聚丁二烯(PB)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、丙烯腈丁二烯(NBR)和作为用于尼龙-6,6其他化学品的己二腈的原材料的一种重要单体。丁二烯通常产生为蒸汽裂化工艺(steam cracking process)中的副产物，且经由萃取从裂化设备蒸汽(cracker stream)中分离。已通过对n-丁烷的脱氢、n-丁烷的脱氢、对正丁醇或丁二醇的脱水等方法来有意地制备丁二烯。在工业上，已使用基于石油化学品的原料合成丁二烯。目前用于有意地生产丁二烯的商业实践具有几个缺点，包括生产的高成本和低产率工艺。目前，用于有意地生产丁二烯的方法依赖于石油化学品原料和能量密集性催化步骤。就此而言，生物技术提供了生物催化形式的一种备选的办法。生物催化是使用天然催化剂如酶来进行有机化合物上的化学转化。已完全或部分纯化的酶，和存在于全细胞中的酶均为生物催化中的可用催化剂。 [0006] 因此，在此背景下，显然需要用于生产中间物特别是丁二烯的可持续方法，其中所述方法是基于生物催化的。生物来源的原料和石油化学品原料均为可行的生物催化工艺的起始材料。 [0007] 发明概述 [0009] 发明人的发现尤为令人惊讶，因为由本发明的酶催化的反应与自然界中观察到的典型反应方向完全相反。即，反应是以与在自然界中观察到的逆方向。在自然界中，分子中例如不饱和脂肪酸中碳原子之间的双键倾向于变成饱和的，例如通过在双键中碳原子之一上的酶催化的亲核攻击。即，部分受胞内环境的普遍条件驱动。 [0010] 如此，本发明提供将丁烯醇转化成丁二烯的酶。该转化可由本发明的单一的酶进行，或者可由本发明的两种或更多种酶连续作用进行(亦即，例如第一酶作用于四碳分子以产生第一丁烯醇，然后该第一丁烯醇受到本发明的第二酶作用以产生丁二烯)。本发明还提供从不饱和羟基化四碳分子产生丁二烯的方法，包括至少一个生物催化步骤。由本发明的酶实施的反应包括脱水(即从分子除去H2O)。 [0011] 在一些实施方案中，丁烯醇选自下组：1-丁烯-3-醇、1-丁烯-4-醇、2-丁烯-1-醇、2-丁烯-3-醇或2-丁烯-4-醇。 [0013] 在一些实施方案中，通过酶作用从选自以下的四碳分子产生丁烯醇：丁二醇(1,4-丁二醇、1,3-丁二醇、或2,3-丁二醇)或丁醇(1-丁醇或2-丁醇)或丁烯(1-丁烯或2-丁烯)。 [0014] 在一些实施方案中，丁烯醇从丁烯如1-丁烯或2-丁烯产生。 [0015] 由本发明的酶进行的反应将是脱水(即从分子除去H2O)、氧化还原酶(即羟基基团替换氢)、或脱氢(即从分子除去氢)。在由本发明的酶催化的反应中，脱氢导致分子碳主链的去饱和。对于脱水步骤，酶可以是与用于将丁烯醇脱水成丁二烯的酶类别相同的酶类别，或者可以是另一种酶类别。 [0016] 在一个分开的发明中，本发明提供来自酶类别4.2.1.-的酶-此类别中的酶将丁二醇转化成丁烯醇。 [0017] 在一些实施方案中，丁烯醇或丁二醇可源自基于生物或非生物原料的微生物发酵工艺。例如，丁烯醇或丁二醇可源自基于生物原料(如甘油、来自生物质的合成气体(Synthesis Gas)、来自食料的糖如蔗糖或葡萄糖、或来自非食料的糖如纤维素或半纤维素来源的糖)的酶促工艺或生物工艺。或者，丁烯醇或丁二醇可源自基于非生物原料(如来自煤的合成气体、天然气、燃烧废气和城市废料、或石油化学品来源的原料如烃类)的生物工艺。另外，丁烯醇或丁二醇可源自基于石油化学品原料的非酶促工艺。 [0018] 由本发明的酶实施的反应将是脱水(即从分子除去H2O)。 [0019] 在一个分开的发明中，本发明提供将丁烯转化成丁烯醇的酶。 [0020] 丁烯醇可自选自下组的四碳分子产生：丁烯如1-丁烯或2-丁烯。另外，丁烯醇可选自下组：1-丁烯-3-醇、1-丁烯-4-醇、2-丁烯-1-醇、2-丁烯-3-醇或2-丁烯-4-醇。 [0021] 由本发明的酶实施的反应将是氧化还原酶(即用羟基基团替换氢)。 [0022] 在另一个实施方案中，本发明提供将丁醇转化成丁烯醇的酶或酶组。丁烯醇从选自下组的四碳分子产生：丁醇如1-丁醇或2-丁醇。另外，丁烯醇可选自下组：1-丁烯-3-醇、1-丁烯-4-醇、2-丁烯-1-醇、2-丁烯-3-醇或2-丁烯-4-醇。 [0023] 在一些实施方案中，丁烯醇可直接从丁醇产生，其通过细胞色素P450型酶或其他去饱和酶如酶类别1.14.99.-或1.3.1.-的作用，或通过脱水酶的作用直接从丁二醇产生。 [0024] 在一些实施方案中，丁醇经由多个酶步骤从氧化的中间物如1-丁醛、丁酸、或丁酸CoA形成，之后与去饱和酶反应导致碳分子的去饱和。如此，不饱和的氧化中间物被还原成丁烯醇。 [0025] 在一些实施方案中，丁醇和丁二醇可源自基于生物或非生物原料的酶促工艺。例如，丁醇和丁二醇可源自基于生物原料(如甘油、来自生物质的合成气体、来自食料的糖如蔗糖或葡萄糖、或来自非食料的糖如纤维素或半纤维素来源的糖)的酶促工艺。或者，丁醇和丁二醇可源自基于非生物原料(如来自煤的合成气体、天然气、燃烧废气和城市废料、或石油化学品来源的原料如烃类)的酶促工艺。另外，丁醇和丁二醇可源自基于石油化学品原料的非酶促工艺。 [0026] 由本发明的酶实施的反应将是对丁醇的脱氢(即从分子除去H2)或通过脱水酶对丁二醇的脱水。在由本发明的酶催化的反应中，脱氢导致分子碳主链的去饱和，而脱水导致水分子的除去。 [0027] 在另一个实施方案中，本发明提供酶或酶组以从选自下组的非羟基化的四碳分子产生丁二烯：n-丁烷、1-丁烯或2-丁烯。 [0028] 由本发明的酶实施的反应将是通过CytP450酶的羟基化。 [0029] 本发明的方法可与任何来源的不饱和羟基化四碳分子或其前体一起使用，且因此适用于整合到用于合成可随后转化成丁二烯的不饱和羟基化四碳分子的任何已知方法中。例如，羟基化四碳分子可通过化学合成产生，或者其可生物催化产生。合成羟基化四碳分子的方法是本领域中已知的。如此，本发明提供一种从包括以下的底物合成丁二烯的方法：合成气(syngas)、甘油、CO2/H2O、CO2/H2、城市固体废物(MSW)、谷物/玉米、木浆(wood pulp)、木质纤维素、半纤维素、大型藻类(macroalgae)糖或糖、丁烷、1-丁烯、2-丁烯、正丁醇、异丁醇、丁酸、3-丁二醇、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、或丁烯醛或2-酮丁烯，所述方法包括至少一个酶催化的步骤，其中一个酶催化的步骤是将丁烯醇转化成丁二烯。 [0030] 用于生产丁二烯的生物催化方法的发现是尤为有利的，因为它使得能将四碳分子转化成丁二烯而没有化学催化该反应所需的极端反应条件，所述极端反应条件是高度能量密集性的。 [0031] 在一个实施方案中，本发明涉及用于生产丁二烯的方法，其通过发酵可发酵原料。所述方法包括在存在一种生物体的情况下发酵可发酵原料以产生包含C4前体的发酵液的步骤，所述前体包括丁醇、丁二醇或两者。在存在所述生物体的情况下发酵C4前体以将发酵液中的至少一部分C4前体通过包含以下的途径转化以产生丁烯醇：(a)将丁二醇转化成丁烯醇，或(b)将丁醇转化成丁烯醇。在存在所述生物体的情况下发酵丁烯醇以在发酵液中产生1,3-丁二烯。然后从发酵液中分离1,3-丁二烯。 [0032] 在另一个实施方案中，本发明涉及用于从原料生物催化性产生丁二烯的方法。在存在生物催化剂的情况下将原料转化成至少一部分的C4前体，所述C4前体是丁醇、丁二醇或两者。然后，使C4前体与生物催化剂反应以将C4前体的至少一部分通过包含以下的途径转化以产生丁烯醇：(a)将丁二醇转化成丁烯醇，或(b)将丁醇转化成丁烯醇。用第二生物催化剂将丁烯醇转化成1,3-丁二烯，然后分离。 [0033] 在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于从石油化学品原料的发酵产生丁二烯的方法。该工艺包括从石油化学品原料获得丁烷或丁烯。然后，在存在一种生物体的情况下发酵丁烷或丁烯以在发酵液中产生1,3-丁二烯，然后将其分离。 [0034] 在另一个实施方案中，本发明涉及一种从石油化学品原料生物催化性产生丁二烯的方法。丁烷从石油化学品原料获得。使丁烷与第一生物催化剂接触以产生丁烯。使丁烯与第二生物催化剂接触以产生1,3-丁二烯。 [0036] 图1显示用于依照本发明的酶促丁二烯产生的途径的图。 [0037] 图2显示用于依照本发明从脂肪酸、甘油和糖产生丁二烯的详细酶途径的图。 [0038] 图3显示用于依照本发明的丁二烯产生的详细酶促途径的图。 [0039] 发明详述 [0040] 本发明的方法施用一种或多种用于特定化学反应的酶：催化丁烯醇到丁二烯的转化、催化丁二醇到丁烯醇的转化、催化丁烯到丁烯醇的转化、丁醇到丁烯醇转化的催化剂、不饱和丁酸到丁二烯转化的催化剂、或非羟基化四碳分子到丁二烯转化的催化。通过酶来催化是高度特异性的，如此常见的是单酶仅会催化单个反应，而且经常会仅以低量的底物来催化该反应。图1例示了针对依照本发明的丁二烯酶促产生的数个催化途径。 [0041] 针对从脂肪酸、甘油和糖产生丁二烯的催化途径例示于图2。具体地，脂肪酸、甘油和糖可进行糖酵解和/或脂肪酸代谢以产生乙酰-CoA。乙酰-CoA可经由E.C.2.3.1.9转化成乙酰乙酰-CoA。然后，乙酰乙酰-CoA可通过E.C.1.1.1.157转化成(S)-3-羟基丁酰-CoA。或者/另外地，1,2-丁二醇可经由EC1.1.3.41转化成3-羟基丁醛，然后经由EC6.2.1.-转化成(S)-3-羟基丁酰-CoA。(S)-3-羟基丁酰-CoA到巴豆酰(crotonyl)-CoA的转化可经由EC4.3.1.17进行。巴豆酰-CoA可经由EC5.3.3.3转化成乙烯乙酰-CoA，且乙烯乙酰-CoA经由EC4.2.1.120转化成4-羟基丁酰-CoA。此外，4-羟基丁酰-CoA可经由EC3.2.1-abtT转化成4-羟基丁醛。 [0042] 或者/另外地，脂肪酸、甘油和/或糖可经由如图2中显示的三羧酸循环(TCA循环)转化成琥珀酸和/或2-酮戊二酸。琥珀酸可经由EC6.2.1.5且2-酮戊二酸可经由EC1.2.1.52转化成琥珀酰-CoA。琥珀酰-CoA可经由EC1.2.1.76转化成琥珀酸半醛，其可经由EC1.1.1.-转化成4-羟基丁酸(酯)且任选地转化成4-羟基丁醛。或者/另外地，4-羟基丁酸酯可经由EC6.2.1.-转化成4-羟基丁酰-CoA，然后经由EC3.2.1-abtT转化成4-羟基丁醛。 [0043] 如进一步在图2中显示的，4-羟基丁醛可经由EC1.1.1.202转化成1,4-丁二醇。然后，1,4-丁二醇可经由EC4.2.1.-，adh转化成1,3-丁二烯。然后，可从反应介质分离1,4-丁二醇。可修饰图2中显示的反应以包含图1中显示的途径。例如，1,4-丁二醇可经由脱水酶转化成丁烯醇，或者/另外地如图2中显示的指导向1,4-丁二醇的转化。此外，显示的反应链中任何中间步骤对于起始点根据可获原料可用于1,4-丁二烯的商业性相关生产。 [0044] 图3例示用于将各种起始材料转化成丁二烯的另外途径。这些起始材料包括异丁醇、丁烷、2-酮戊二酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丁酰基磷酸盐(酯)和/或t-丁烯。这些途径包括转化来自石油化学品的源材料和/或天然气原料如丁烷。与图2相同，图3中显示的途径可与本文中描述的其他途径整合。例如，正丁醇可经由如图1中例示的去饱和酶作用转化成丁烯醇，或者可经由图3中例示的途径进行，其导致1,4-丁二醇的形成，然后1,4,-丁二醇被转化成1,4-丁二烯。 [0045] 用于鉴定、分离和重组操作酶的合适技术是本领域中已知的。 [0046] 1.1酶催化的转化 [0047] 本发明的酶催化将羟基化四碳分子转化成丁二烯的反应。 [0048] 由本发明的酶催化的反应包括丁烯醇如1-丁烯-3-醇、1-丁烯-4-醇、2-丁烯-1-醇、2-丁烯-3-醇或2-丁烯-4-醇脱水成丁二烯。 [0049] 在一个备选的反应中，由本发明的酶催化的反应包括丁二醇如1,4-丁二醇、1,3-丁二醇和2,3-丁二醇到丁烯醇如1-丁烯-3-醇、1-丁烯-4-醇、2-丁烯-1-醇、2-丁烯-3-醇或2-丁烯-4-醇的脱水。这些酶可以是能够将丁烯醇转化成丁二烯的相同酶，或者是不同的酶或酶类。 [0050] 如此，通过组合这两个酶反应步骤，可以将1,4-丁二醇、1,3-丁二醇和2,3-丁二醇转化成丁二烯。在此情况中，脱水酶可首先作用于丁二醇以产生丁烯醇，然后丁烯醇受到相同或不同脱水酶的作用以产生丁二烯。 [0051] 在一个备选的反应中，可使用水解酶将羟基基团引入非羟基化四碳分子中。该反应的底物通常将是1-丁烯或2-丁烯。这里，在氧化还原酶作用时，在末端碳或烯丙基碳上引入羟基基团以产生丁烯醇。如此，在用该酶反应后，1-丁烯被转化成1-丁烯-4-醇或1-丁烯-3-醇，而2-丁烯被转化成2-丁烯-1-醇(也称为巴豆醇(crotonic alcohol))。相应地，由丁烷去饱和产生的1-丁烯将再受到酶作用以产生1,3-丁二烯。使用如上文详述的酶，可将1-丁烯-3-醇和1-丁烯-4-醇脱水以产生1,3-丁二烯。 [0052] 如此，通过将此氧化还原酶与丁烯醇酶的脱水步骤组合，可以将1-丁烯和2-丁烯转化成丁二烯。在此情况下，水解酶可首先作用于丁烯以产生丁烯醇，然后丁烯醇由脱水酶作用以产生丁二烯。 [0053] 在一个备选的反应中，可使用去饱和酶将C=C键引入饱和的四碳分子中。此反应的底物通常将是丁烷-1-醇、丁烷-2-醇、丁烷或1-丁烯。这里，在去饱和酶作用时，在末端碳和倒数第二个碳之间引入C=C键(在丁烷-1-醇、丁烷-2-醇或1-丁烯的情况中在分子上存在的官能团远端)。如此，在用该酶反应后，丁烷-1-醇、丁烷-2-醇、丁烷或1-丁烯分别被转化成1-丁烯-4-醇、1-丁烯-3-醇、1-丁烯或1,3-丁二烯。由丁烷去饱和产生的1-丁烯将相应地受到该酶再次作用以产生1,3-丁二烯。使用上文详述的酶，可将1-丁烯-3-醇和1-丁烯-4-醇脱水以产生1,3-丁二烯。 [0054] 如此，通过将这两类酶组合，可以将丁烷-1-醇和丁烷-2-醇转化成丁二烯。在此情况中，脱水酶首先作用于丁醇以产生1-丁烯，然后，1-丁烯受去饱和酶作用以产生丁二烯。或者，去饱和酶可首先作用以产生1-丁烯-3-醇或1-丁烯-4-醇，其然后由脱水酶反应以产生丁二烯。 [0055] 在一个备选的反应中，可使用去饱和酶将双键引入饱和的四碳羧酸或醛中。此反应的底物通常将是丁酸或丁醛。这里，在去饱和酶作用时，在末端碳和倒数第二个碳之间引入C=C键(在丁酸或丁醛的情况中在分子上存在的官能团远端)。如此，在用该酶反应后，将丁酸或丁醛分别转化成3-丁烯-羧酸、2-丁烯-羧酸、4-氧-1-丁烯或4-氧-2-丁烯。所得不饱和丁酸或丁醛将相应地受到酶或酶组再次作用以产生相应的丁烯醇。使用如上文详述的脱水酶，可将2-丁烯-4-醇或1-丁烯-4-醇脱水以产生1,3-丁二烯。丁酸和丁醛可通过氧化酶作用从1-丁醇酶促产生。如此，通过组合这些反应系列，1-丁醇可转化成丁二烯。 [0056] 适用于本发明方法的酶 [0057] 1.1.1脱水酶 [0058] EC4.2.1.-中的脱水酶可用于催化许多反应步骤，其将丁烯醇转化成丁二烯和/或丁二醇转化成丁烯醇。见图2-3。 [0059] 依照本发明的脱水酶包含具有以下能力的酶： [0060] a)将1-丁烯-3-醇脱水以产生丁二烯 [0061] b)将1-丁烯-4-醇脱水以产生丁二烯 [0062] c)将2-丁烯-1-醇脱水以产生丁二烯 [0063] d)将2-丁烯-3-醇脱水以产生丁二烯 [0064] e)将2-丁烯-4-醇脱水以产生丁二烯 [0065] f)将1,4-丁二醇脱水以产生1-丁烯-4-醇 [0066] g)将1,3-丁二醇脱水以产生1-丁烯-3-醇、1-丁烯-4-醇或2-丁烯-4-醇；或[0067] h)将2,3-丁二醇脱水以产生1-丁烯-3-醇或2-丁烯-3-醇 [0068] 1.1.2.去饱和酶 [0069] 本发明的去饱和酶在饱和末端碳处将双键引入正丁醇或异丁醇中。现有技术中已显示去饱和酶在脂肪酸中的特定位置处引入双键。此外，可以修饰这些酶的底物特异性和区域特异性。参见Wang等,“Alteration of Product Specificity of Rhodobacter sphaeroides Phytoene Desaturase by Direct Evolution,”J.Biolog.Chem.,Vol.27,No.44,Issue of November2,pp.41161-41164(2001)。 [0070] 具体地，已发现类别EC1.14.19.-中的酶可用于实施本发明的方法。其他能够将双键引入四碳分子中的酶包括EC1.14.99.-的成员如1.14.99.19/30/31/32/33。类EC1.3.1.35中的酶也能够引入双键。因此，在本发明的一些实施方案中，所述酶在类EC1.14.19.-,1.14.99.-，例如1.14.99.19,1.14.99.30,1.14.99.31,1.14.99.32,1.14.99.33、或1.3.1.35中。 [0071] 1.1.3细胞色素P450酶 [0072] 脂肪族去饱和还可由细胞色素P450酶催化。因此，在本发明的一些实施方案中，所述酶是细胞色素P450。已报告CYP4同工酶催化丙戊酸的末端去饱和以形成相比于CYP2具有高活性的4-烯酸(ene acid)。参见Rettie等,“CYP4Isozyme Specificity and the Relationship betweenω-Hydroxylation and Terminal Desaturation of Valproic Acid,”Biochemistry,34,7889-7895(1995)。 [0073] 1.1.4Clavaminate合酶2 [0074] 类似于P450酶，根据底物clavaminate合酶2能在羟基化和去饱和之间转换。如此，clavaminate超家族的2-酮戊二酸依赖性非血红素铁(non-heme iron)酶能够在烷烃、烯烃、烯醇和烯酸中引入末端双键。具体地，类EC1.14.11.22的clavaminate合酶能够将羟基化四碳分子转化成丁二烯。因此，在本发明的一些实施方案中，所述酶在类EC1.14.11.22中。 [0075] 1.1.5非天然存在的酶 [0076] 在一些实施方案中，用于实施本发明方法中的转化的酶是非天然存在的。换言之，编码它们的DNA已从野生型序列经过突变以改进一种或多种酶特性。用于蛋白质诱变的方法是本领域中公知的。或者/另外地，随机和/或组合诱变办法包括办法如DNA改组、STEP和易错PCR、分子进化和致突变菌株(mutator strain)可用于创建突变库。诱变变化的非限制性列表包括缺失、插入、取代、重排、点突变和抑制突变(suppressor mutations)。然后，对诱变方法的产物筛选期望的活性。如此，在一些实施方案中，本发明的酶源自如部分中描述的酶。“源自”意指该酶相比于野生型酶的序列含有一个或多个氨基酸变化，其中一个或多个变化包括缺失、插入、取代、重排、点突变。技术人员会理解关于所述酶论述的EC分类系统是高度特异性的，且依赖于由酶催化的特定底物。因此，本发明的源自如所述酶之一的酶可归类在与野生型酶不同的EC分类中。 [0077] 1.2生物催化剂形式化 [0078] 可将表达本发明一种或多种酶的全细胞用作生物催化剂。使用的全细胞通常具有许多特性：它们可容易地进行遗传修饰、耐受本发明方法中使用的条件、及生长至工业可用的细胞密度。 [0079] 在一个备选中，所述全细胞是原核生物的。在另一个备选中，其为真核生物的。通常使用单细胞微生物。 [0080] 术语原核细胞包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。可与本发明方法一起使用的革兰氏阴性细菌的例子包括：大肠杆菌(Escherichia coli)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、鞘脂单胞菌(sphingomonads)、假单胞菌(pseudomonads)、和属于以下属的其他细菌：沙门氏菌属(Salmonella)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、莫拉氏菌属(Moraxella)、产碱杆菌属(Acaligenes)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、栖热袍菌属(Thermotoga)、Acinetobacteria、红细菌属(Rhodobacter)、固氮弓菌属(Azoarcus)和红螺菌属(Rhodospirillum)。可与本发明方法一起使用的革兰氏阳性细菌的例子包括：链球菌属(streptococci)、乳杆菌属(lactobacilli)，和属于以下属的其他细菌：诺卡氏菌属(Nocardia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、梭菌属(Clostridium)、链霉菌属(Streptomyces)和节杆菌属(Arthobacter)。 [0081] 真核宿主细胞包括那些来自酵母和其他真菌的。可与本发明方法一起使用的真核宿主细胞的例子包括：解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)、假丝酵母属如热带假丝酵母(Candida tropicalis)、C.albicans、C.cloacae、C.guillermondii、C.intermedia、C.maltosa、C.parapsilosis、C.zeylenoides、属于红酵母属(Rhodotorula)、根霉属(Rhizopus)、丝孢酵母菌(Trichosporon)和油脂酵母菌(Lipomyces)的酵母，和属于以下属的其他真菌：曲霉属(Aspergillus)、外瓶霉属(Exophiala)、毛霉属(Mucor)、木霉属(Trichoderma)、枝孢属(Cladosporium)、平革菌属(Phanerochaete)、Cladophialophora、拟青霉属(Paecilomyces)、Scedosporium和Ophiostoma。 [0082] 1.3全细胞生物催化剂的修饰 [0083] 本发明方法中使用的生物催化剂可以是其中天然存在该酶的物种的未经修饰的全细胞。然而，一般需要对宿主细胞进行遗传修饰。在一个备选中，所述遗传修饰是将核酸引入细胞基因组中。引入细胞的核酸可包含来自另一物种或生物的核酸序列，例如不存在于该全细胞野生型基因组中的DNA序列。在其他情况下，引入的DNA序列可以是全细胞基因组中DNA序列的另外拷贝。在一些备选中，所述遗传修饰是来自全细胞基因组的DNA序列的缺失。在另一备选中，所述遗传修饰是细胞基因组的修饰。 [0084] 1.4在工程化为产生羟基化四碳分子的全细胞中使用本发明的酶 [0085] 可将编码本发明酶的核酸置于能够产生羟基化四碳分子的已知宿主细胞中，作为产物或作为其他化合物产生中的中间物。通过生物合成途径的扩张或转向，这些先前已知的宿主生物工程化为从可再生原料如碳水化合物和脂肪酸以及从甘油、合成气或光合作用产生羟基化四碳分子。将这些途径扩张或转向以进一步将羟基化四碳分子或其前体转化成丁二烯。 [0086] 1.5全细胞的代谢工程 [0087] 代谢工程是优化全细胞中参数以增加细胞产生一种化合物能力的过程。任选地，本发明方法中使用的全细胞已经过工程化以优化丁二烯的输出。 [0088] 1.6生长全细胞生物催化剂 [0089] 在本发明的一些实施方案中，使用这样的全细胞生物催化剂，其在全细胞进行本发明方法中的转化时生长(即分裂)。在这些实施方案中，在优化期望的产物(即丁二烯)或前体(丁醇(butonol)或丁二醇(buitanediol))产生的条件下培养细胞。如本文中使用的，术语培养等同于用发酵罐或生物反应器。 [0090] 1.7工艺的原料 [0091] 在一些实施方案中，丁二烯可源自基于生物或非生物原料的酶促工艺。 [0092] 在一些实施方案中，丁二烯可源自基于生物原料(如甘油、来自生物质的合成气体、来自食料的糖如蔗糖或葡萄糖、或来自非食料的糖如纤维素或半纤维素来源的糖)的酶促工艺。 [0093] 在一些实施方案中，丁二烯可源自基于非生物原料(如来自煤的合成气体、天然气、燃烧废气、和城市废料、或石油化学品来源的原料如烃类)的酶促工艺。 [0094] 在一些实施方案中，丁二烯可源自基于石油化学品原料的非酶促工艺。 [0095] 1.8本发明的组合物 [0096] 本发明还提供包含本发明的酶和四碳分子的组合物。本发明还提供包含本发明的酶和1,3-丁二烯的组合物。 |
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