脱泛素酶抑制剂及其应用方法 |
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| 申请号 | CN201180046099.3 | 申请日 | 2011-09-23 | 公开(公告)号 | CN103261169A | 公开(公告)日 | 2013-08-21 |
| 申请人 | 密歇根大学董事会; | 发明人 | 尼可拉斯·J·多纳托; 克里斯蒂安·沃巴斯; H·D·霍利斯·朔瓦尔特; 莫舍·塔尔帕兹; 杰弗里·威廉·佩里; 罗德里克·约瑟夫·索兰松; 玛丽·叙安·迪兹姆·欧里奥尔丹; 靳亚非; | ||||
| 摘要 | 本文公开了抑制脱泛素酶（DUB）的方法、 治疗 病原体感染（例如病毒、细菌和/或寄生虫感染）的方法、抑制 细胞增殖 的方法、治疗神经变性 疾病 的方法、治疗神经变性疾病或遗传障碍的一种或多种症状的方法、以及化合物。 | ||||||
| 权利要求 | 1.化合物或其盐，所述化合物由式（II）、（IIa）或（III）所示： |
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| 说明书全文 | 脱泛素酶抑制剂及其应用方法[0001] 与相关申请的交叉引用 [0002] 本申请要求2010年9月24日提交的美国临时申请系列号61/386,057的权益，所述临时申请的公开内容以其全文引为参考。 背景技术[0004] 蛋白质泛素化是动态的双向过程，该过程可以被脱泛素化酶（脱泛素酶，DUB）逆转或调控。人类基因组编码近100种具有推测的DUB活性的蛋白，它们可以被宽泛地分成两个主要亚组：泛素C-末端水解酶（UCH）和泛素特异性蛋白酶（USP）。USP构成人类中最大的DUB亚类，而仅有4种已知的UCH DUB已被描述。DUB主要起到平衡泛素-蛋白质偶联的作用，并且也促进泛素从其前体和未锚定的多泛素链上切割下来。因此，DUB调控并维持细胞中游离泛素池的稳态。据报道，数种DUB调控组蛋白的脱泛素化、DNA损伤修复、细胞增殖（USP2）和细胞因子信号转导（DUB-A）。已显示，DUB例如USP14、Uch37和RPN11结合蛋白酶体（19S）的调控亚基，并编辑蛋白酶体底物上的多泛素链。发明内容 [0005] 本文公开了抑制DUB的方法。另外或可选地，所述方法的目的在于抑制UCH催化结构域。本文还公开了治疗病原体感染的方法和治疗由病原体感染造成的病症的方法。本文还公开了抑制细胞增殖或降低细胞存活的方法。本文还公开了治疗神经变性障碍或神经变性障碍的症状的方法。本文还公开了治疗遗传障碍的症状的方法。 [0006] 可以在本文公开的方法中使用的化合物包括具有下式的化合物或其盐： [0007]3 4 [0008] 其中虚线指示任选的双键；R 是氨基亚烷基芳基或取代的氨基亚烷基芳基；R 选自CN、氨基、取代的氨基、酰胺基、取代的酰胺基、亚烷基硫醚、取代的亚烷基硫醚、烷基、取5 代的烷基、叠氮基、亚烷基叠氮基或取代的亚烷基叠氮基；R 选自氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、烷氧基、取代的烷氧基、亚烷基芳基、取代的亚烷基芳 6 基、硫醚、取代的硫醚、氨基、取代的氨基、卤化物、羟基、硝基和SH；并且R 选自芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环烯基、取代的杂环烯基、杂环烷基、取代的杂环烷基、亚烷基芳基、取代的亚烷基芳基、亚烷基杂芳基、取代的亚烷基杂芳基、亚烷基杂环烯基、取代的亚烷基杂环烯基、亚烷基杂环烷基和取代的亚烷基杂环烷基。 [0009] 在各种不同情形中，可以在本文公开的方法中使用的化合物包括由式（II）、（IIa）或（III）所示的化合物或其盐： [0010] 或 [0011] [0012] 其中每个R1选自H、酰胺基、取代的酰胺基、卤化物、-(CH2)mR9、-NH(CH2)9 9 9 9 mR、-NHC(O)(CH2)mR、-C(O)NH(CH2)mR 和-O(CH2)mR，并且对于式（II）的化合物来说，不能 1 2 每个R 都是氢；X是氟或氯；R 是烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳 9 基、杂芳基或取代的杂芳基；Het是除2-吡啶基以外的杂芳基或取代的杂芳基；R 是氨基、取代的氨基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、环杂烷基或取代的环杂烷基；并且m是2、3或4。 下面描述的任何具体化合物可以被用在一种或多种所描述的方法中。 [0013] 本文还公开了由式（II）、（IIa）或（III）所示的化合物或其盐： [0014] 或 [0015] [0016] 其中每个R1选自H、酰胺基、取代的酰胺基、卤化物、-(CH2)mR9、-NH(CH2)9 9 9 9 mR、-NHC(O)(CH2)mR、-C(O)NH(CH2)mR 和-O(CH2)mR，并且对于式（II）的化合物来说，不能 1 2 每个R 都是氢；X是氟或氯；R 是烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳 9 基、杂芳基或取代的杂芳基；Het是除2-吡啶基以外的杂芳基或取代的杂芳基；R 是氨基、取代的氨基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、环杂烷基或取代的环杂烷基；并且m是2、3或4。 [0017] 详细描述 [0018] 蛋白质泛素化是需要数种酶参与的受到精确控制的过程，所述酶用泛素（Ub）的单体或聚合链修饰靶蛋白上的赖氨酸残基。泛素途径的酶是真核生物细胞周期时间安排、蛋白质破坏和信号转导的介导物。最近的研究表明，在原核生物和病毒的生活周期的各个阶段以及在真核生物宿主细胞内，Ub调控也是关键的。因此，破坏或抑制特定的Ub调控酶可能具有抗微生物活性。 [0019] 由于DUB在调控参与转化、细胞周期调控、凋亡保护和耐药性的蛋白质中的多样化作用，DUB似乎代表了适合的治疗靶点。最近显示，USP2和USP9x的下调分别通过促进周期蛋白D1和MCL-1的降解来抑制肿瘤细胞生长，这表明，肿瘤细胞中特定DUB的沉默在带有癌基因的细胞或耐药性细胞中可能是安全有效的疗法。其他研究牢固确定了DUB在包括癌症、病毒和细菌致病以及神经变性障碍的广范围疾病中的作用。尽管已描述的具有DUB调节活性的化合物很少，但所报道的化合物大多数都具有与DUB抑制相关的抗肿瘤、抗增殖或抗病毒活性（例如UCH-L1和USP7、SARS蛋白酶）。 [0020] 因此，本文描述了抑制DUB的方法、抑制UCH催化结构域的方法、抑制或防止病原体感染的方法、抑制细胞存活或增殖的方法、治疗神经变性障碍的方法、治疗神经变性障碍的一种或多种症状的方法、治疗遗传障碍的一种或多种症状的方法，以及能够抑制DUB的化合物。在提供的方法中，使DUB与例如式（I）的化合物或其盐相接触： [0021] [0022] 其中 [0023] 虚线指示任选的双键； [0024] R3是氨基亚烷基芳基或取代的氨基亚烷基芳基； [0025] R4选自CN、氨基、取代的氨基、酰胺基、取代的酰胺基、亚烷基硫醚、取代的亚烷基硫醚、烷基、取代的烷基、叠氮基、亚烷基叠氮基或取代的亚烷基叠氮基； [0026] R5选自氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、烷氧基、取代的烷氧基、亚烷基芳基、取代的亚烷基芳基、硫醚、取代的硫醚、氨基、取代的氨基、卤化物、羟基、硝基和SH；并且 [0027] R6选自芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环烯基、取代的杂环烯基、杂环烷基、取代的杂环烷基、亚烷基芳基、取代的亚烷基芳基、亚烷基杂芳基、取代的亚烷基杂芳基、亚烷基杂环烯基、取代的亚烷基杂环烯基、亚烷基杂环烷基和取代的亚烷基杂环烷基。 [0028] 脱泛素酶（DUB） [0029] 脱泛素化酶（即脱泛素酶或DUB）典型地是半胱氨酸蛋白酶，并且可以被分类成泛素特异性蛋白酶（USP）和泛素C-末端水解酶（UCH）亚组。DUB的实例包括例如USP5、USP6、USP4、USP8、USP13、USP2、USP11、USP14、USP7、USP9X、USP10、USP1、USP12、USP16、USP15、USP17、USP19、USP20、USP3、USP9Y、USP18、USP21、USP22、USP33、USP29、USP25、USP36、USP32、USP26、USP24、USP42、USP46、USP37、USP28、USP47、USP38、USP44、USP50、USP35、USP30、Mername-AA088肽酶、Mername-AA091肽酶、USP45、USP51、USP34、USP48、USP40、USP31、Mername-AA129肽酶、USP49、USP17样肽酶、USP54、USP53、USP39、UCH-L1、UCH-L3、UCH-BAP1、UCH37、Cezanne脱泛素化肽酶、Cezanne2、肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3、TRABID蛋白、VCP(p97)/p47相互作用蛋白、otubain1、otubain2、CylD蛋白、SENP1肽酶、SENP3肽酶、SENP6肽酶、SENP2肽酶、SENP5肽酶、SENP7肽酶、SENP8肽酶、SENP4肽酶、Poh1肽酶、Jab1/MPN结构域金属酶、Mername-AA165肽酶、Mername-AA166肽酶、Mername-AA167肽酶、Mername-AA168蛋白、COP9信号小体亚基6、26S蛋白酶体非ATPase调控的亚基7、真核翻译起始因子3亚基5、IFP38肽酶同源物。 [0030] 所考虑的其他DUB包括自噬蛋白酶（ATG）、卵巢肿瘤（OUT）结构域蛋白、Josephin结构域（JD）或Machado-Joseph病（MJD）蛋白、泛素样蛋白特异性蛋白酶（ULP）和JAMM（Jab1/MPN结构域结合的金属异肽酶）结构域蛋白。 [0031] 特异性DUB抑制剂 [0032] 在本文公开的方法中使用的化合物包括式（I）的化合物或其盐： [0033] [0034] 其中 [0035] 虚线指示任选的双键；3 [0036] R 是氨基亚烷基芳基或取代的氨基亚烷基芳基；4 [0037] R 选自CN、氨基、取代的氨基、酰胺基、取代的酰胺基、亚烷基硫醚、取代的亚烷基硫醚、烷基、取代的烷基、叠氮基、亚烷基叠氮基或取代的亚烷基叠氮基；5 [0038] R 选自氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、烷氧基、取代的烷氧基、亚烷基芳基、取代的亚烷基芳基、硫醚、取代的硫醚、氨基、取代的氨基、卤化物、羟基、硝基和SH；并且6 [0039] R 选自芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环烯基、取代的杂环烯基、杂环烷基、取代的杂环烷基、亚烷基芳基、取代的亚烷基芳基、亚烷基杂芳基、取代的亚烷基杂芳基、亚烷基杂环烯基、取代的亚烷基杂环烯基、亚烷基杂环烷基和取代的亚烷基杂环烷基。3 3 [0040] 在某些情形中，虚线指示双键。在各种不同情形中，所设想的具体R 部分包括R 选自 和 或其任选取代的部分；7 R 选自2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、单糖、单糖衍生物、芳基和亚烷基芳基，或其任选取 8 代的部分；每个R 独立地选自氢、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基和取代的 1 芳基；Ar是芳基或取代的芳基；Z是亚烷基、取代的亚烷基、氨基或取代的氨基；Z 是亚烷基 6 或取代的亚烷基；并且n是1、2、3或4。在某些情形中，所设想的具体R 部分包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、苯基、1-哌啶基、2-(2H)-吡喃基和2-(2H)-硫代吡喃基，或其取 6 代的部分。在某些具体情形中，R 是2-吡啶基或取代的2-吡啶基。在各种不同的具体情 4 形中，R 是CN。 [0041] 在某些情形中，R3是 在某些具体情形中，Ar是苯基或取代的苯基。 [0042] 所设想的某些具体化合物包括下列结构或其盐 [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] 和 [0048] 其他设想的抑制剂包括以下化合物或其盐： [0049] [0050] [0051] [0052] 进 一 步 设 想 到 的 是 具 有 [0053] 或 结构的抑制剂或其盐。 [0054] 在某些实施方案中，式（I）的化合物或其盐是式（II）、（IIa）或（III）的化合物或其盐： [0055] 或 [0056] [0057] 其中每个R1选自H、酰胺基、取代的酰胺基、卤化物、-(CH2)mR9、-NH(CH2)9 9 9 9 mR、-NHC(O)(CH2)mR、-C(O)NH(CH2)mR 和-O(CH2)mR，并且对于式（II）的化合物来说，不 1 2 能每个R 都是氢；X是氟或氯；R 是烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；Het是除2-吡啶基以外的杂芳基或取代的杂芳基； 9 R 是氨基、取代的氨基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、环杂烷基或取代的环杂烷基；并 1 9 9 且m是2、3或4。在各种不同情形中，R 选自H、-(CH2)mR、-NH(CH2)mR、-NHC(O)(CH2) 9 9 9 1 mR、-C(O)NH(CH2)mR 和-O(CH2)mR。在各种不同情形中，R 选自-O(CH2)mNEt2、-O(CH2)mNMe2、-O(CH2)mNHEt、-O(CH2)mNHMe2、-O(CH2)m吗啉基、-O(CH2)m取代的吗啉基、-O(CH2)m亚砜基吗啉基、-O(CH2)m取代的亚砜基吗啉基、-O(CH2)m吡咯烷基、-O(CH2)m取代的吡咯烷基、-O(CH2)m哌嗪基、-O(CH2)m取代的哌嗪基、-O(CH2)m哌啶基、-O(CH2)m取代的哌啶基、-O(CH2)mN(Me)(CH2)2NMe2、-O(CH2)mN(Me)(CH2)2NHMe、-O(CH2)mN(Me)(CH2)2NEt2、-O(CH2)mN(Me)(CH2)2NHEt、-O(CH2)mO(CH2)2NMe2、-O(CH2)mO(CH2)2NHMe、-O(CH2)mO(CH2)2NEt2、-O(CH2)mO(CH2)2NHEt、-O(CH2)mO(CH2)2杂环烷基和-O(CH2)mO(CH2)2取代的杂环烷基。在各种不同情 1 形中，R 是-O(CH2)mNH(CO)亚烷基-生物素。在各种不同情形中，所述化合物是式（II）或（III）的化合物。 [0058] 在某些情形中，R2是C1-6烷基或C3-6环烷基，并且任选被羟基、氨基、取代的氨基、烷1 氧基和取代的烷氧基中的一个或多个取代。在某些情形中，式（II）或（IIa）的化合物的R 9 9 9 9 9 选自选自H、-(CH2)mR、-NH(CH2)mR、-NHC(O)(CH2)mR、-C(O)NH(CH2)mR 和-O(CH2)mR。在各种 1 9 不同情形中，R 选自H、酰胺基、取代的酰胺基和卤化物。在某些实施方案中，R 选自OH、NH2、NHMe、N(Me)2、N(Et)2、O(CH2)2NH2、NH(CH2)2OH、N(Me)(CH2)2N(Me2)、 和 [0059] 在某些情形中，式（II）或（III）的化合物具体来说不包括具有下列结构的化合物： 或 [0060] 当在本文中使用时，术语“烷基”是指具有1至40个碳原子的饱和或不饱和直链或支链烃基，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基等。还考虑到了具有1至6个碳原子的烷基。术语“烷基”包括“桥接的烷基”，即双环或多环的烃基，例如降冰片基、金刚烷基、双环[2.2.2]辛基、双环[2.2.1]庚基、双环[3.2.1]辛基或十氢萘基。烷基可以任选被例如羟基（OH）、卤化物、硫醇（SH）、芳基、杂芳基、环烷基、杂环烷基和氨基取代。具体设想了，在本文描述的化合物中，烷基由1-40个碳原子、优选1-25个碳原子、优选1-15个碳原子、优选1-12个碳原子、优选1-10个碳原子、优选1-8个碳原子、优选1-6个碳原子构成。“杂烷基”的定义与烷基类似，区别在于杂烷基含有至少一个独立地选自氧、氮和硫的杂原子。 [0061] 当在本文中使用时，术语“环烷基”是指环状烃基，例如环丙基、环丁基、环己基和环戊基。“杂环烷基”的定义与环烷基类似，区别在于环含有1至3个独立地选自氧、氮和硫的杂原子。杂环烷基的非限制性实例包括哌啶、四氢呋喃、四氢吡喃、二氢呋喃、吗啉、噻吩等。环烷基和杂环烷基可以是饱和或部分不饱和的环系统，并任选被例如1至3个独立地选自烷基、亚烷基OH、C(O)NH2、NH2、氧代（=O）、芳基、卤代烷基、卤素和OH的基团取代。杂环烷基可以任选进一步被烷基、羟基烷基、亚烷基芳基或亚烷基杂芳基进行N-取代。 [0062] 当在本文中使用时，术语“烯基”是指含有至少一个碳双键的2至10个碳原子的直链或支链烃基，包括但不限于1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基等。术语“环烯基”是指具有一个或多个双键的环烷基。“杂环烯基”是指具有一个或多个杂原子（例如N、S、O或其组合）的环烯基。 [0063] 当在本文中使用时，术语“炔基”是指含有至少一个碳叁键的2至10个碳原子的直链或支链烃基，包括但不限于1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基等。 [0064] 当在本文中使用时，“卤化物”是指氟、氯、溴或碘。 [0065] 当在本文中使用时，术语“亚烷基”是指具有取代基的烷基。例如，术语“亚烷基芳基”是指被芳基取代的烷基。亚烷基任选被一个或多个前面作为任选的烷基取代基列出的取代基取代。例如，亚烷基可以是-CH2CH2-或-CH2-。 [0066] 当在本文中使用时，术语“芳基”是指单环或多环的芳香族基团，优选为单环或双环的芳香族基团，例如苯基或萘基。除非另有指明，否则芳基可以是未取代的，或者可以被一个或多个、特别是1至4个基团取代，所述基团独立地选自例如卤素、烷基、烯基、OCF3、NO2、CN、NC、OH、烷氧基、氨基、CO2H、CO2烷基、芳基和杂芳基。示例性芳基包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、氯苯基、甲基苯基、甲氧基苯基、三氟甲基苯基、硝基苯基、2,4-甲氧基氯苯基等。 [0067] 当在本文中使用时，术语“杂芳基”是指含有一个或两个芳香环并在芳香环中含有至少一个氮、氧或硫原子的单环或双环的环系统。除非另有指明，否则杂芳基可以是未取代的，或者可以被一个或多个、特别是1至4个取代基取代，所述取代基选自例如卤素、烷基、烯基、OCF3、NO2、CN、NC、OH、烷氧基、氨基、CO2H、CO2烷基、芳基和杂芳基。在某些情形中，杂芳基被烷基和烷氧基中的一个或多个取代。杂芳基的实例包括但不限于噻吩基、呋喃基、吡啶基、噁唑基、喹啉基、硫苯基、异喹啉基、吲哚基、三嗪基、三唑基、异噻唑基、异噁唑基、咪唑基、苯并噻唑基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基和噻二唑基。当在本文中使用时，杂芳基可以与术语“Het”互换使用。在某 些 情 形 中，“Het” 选 自和 或其取代的部分。在某些情形中， Het不包括2-吡啶基、3-吡啶基和/或4-吡啶基。在某些情形中，Het被烷基、烷氧基、羟基、氨基和取代的氨基中的一个或多个取代。 [0068] 当在本文中使用时，术语“烷氧基”是指通过--O--连接键共价连接到母体分子的直链或支链烷基。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等。 [0069] 当在本文中使用时，术语“硫代烷基”是指连接于烷基的一个或多个硫基。 [0070] 当在本文中使用时，术语“硫醚”是指通过--S--连接键共价连接到母体分子的直链或支链烷基或环烷基。硫醚基团的实例包括但不限于-SCH3、-SCH2CH3、-SCH2CH2CH3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH2CH3、-SCH2CH(CH3)2、-SC(CH3)3等。 [0071] 当在本文中使用时，术语“羟基烷基”是指连接于烷基的一个或多个羟基。 [0072] 术语“叠氮基”是指-N3基团。术语“硝基”是指-NO2基团。 [0073] 当在本文中使用时，术语“氨基”是指-NR2，其中R独立地是氢、任选取代的烷基、任选取代的杂烷基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。氨基的非限制性实例包括NH2、NH(CH3)和N(CH3)2。在某些情形中，R独立地是氢或烷基。 [0074] 当在本文中使用时，术语“酰胺基”是指-C(O)NH2、-C(O)NR2、-NRC(O)R或-NHC(O)H，其中每个R独立地是氢、任选取代的烷基、任选取代的杂烷基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。在某些情形中，酰胺基是-NHC(O)烷基或-NHC(O)H。在各种不同情形中，酰胺基是-C(O)NH(烷基)或-C(O)NH(取代的烷基)。酰胺基的非限制性实例是-NHC(O)CH3。 [0075] 当在本文中使用时，取代的基团源自于未取代的母体结构，其中存在一个或多个氢原子与另一种原子或基团的交换。当在本文中使用时，“取代基”是指选自下列部分的基团： [0076] （A）-OH，-NH2，-SH，-CN，-CF3，-NO2，氧代，卤素，未取代的烷基，未取代的杂烷基，未取代的环烷基，未取代的杂环烷基，未取代的芳基，未取代的杂芳基，未取代的烷氧基，未取代的芳氧基，三卤代甲磺酰基，三氟甲基，以及 [0078] （i）-OH，-NH2，-SH，-CN，-CF3，-NO2，氧代，卤素，未取代的烷基，未取代的杂烷基，未取代的环烷基，未取代的杂环烷基，未取代的芳基，未取代的杂芳基，未取代的烷氧基，未取代的芳氧基，三卤代甲磺酰基，三氟甲基，以及 [0079] （ii）被至少一个取代基取代的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、氨基、酰胺基、羰基、硫代羰基、烷氧基羰基、甲硅烷基、磺酰基、亚砜基、烷氧基、芳氧基和杂芳基，所述取代基选自： [0080] （a）-OH，-NH2，-SH，-CN，-CF3，-NO2，氧代，卤素，未取代的烷基，未取代的杂烷基，未取代的环烷基，未取代的杂环烷基，未取代的芳基，未取代的杂芳基，未取代的烷氧基，未取代的芳氧基，三卤代甲磺酰基，三氟甲基，以及 [0081] （b）被至少一个取代基取代的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、氨基、酰胺基、羰基、硫代羰基、烷氧基羰基、甲硅烷基、磺酰基、亚砜基、烷氧基、芳氧基和杂芳基，所述取代基选自-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、氧代、卤素、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基、未取代的烷氧基、未取代的芳氧基、三卤代甲磺酰基、三氟甲基。 [0082] 当在本文中使用时，术语“羧基”是指—COOH或其去质子化的形式-COO-。C1-10羧基是指具有羧基部分的任选取代的烷基或烯基。其实例包括但不限于-CH2COOH、-CH2CH(COOH)CH3和-CH2CH2CH2COOH。 [0083] 术语“烷氧基羰基”是指—(CO)—O-烷基，其中烷基可以任选被取代。烷氧基羰基的实例包括但不限于甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基等。 [0084] 术语“烷基羰基”是指—(CO)-烷基，其中烷基可以任选被取代。烷基羰基的实例包括但不限于甲基羰基、乙基羰基、丙基羰基等。 [0085] 术语“磺酰胺基”是指-SO2NR2，其中R独立地是氢、任选取代的杂烷基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。在某些情形中，磺酰胺基是-SO2NR2，其中R独立地是氢或任选取代的烷基。磺酰胺基的实例包括但不限于-SO2N(CH3)2和-SO2NH2。 [0086] 术语“磺酰基”是指-SO2R，其中R独立地是氢或任选取代的烷基、任选取代的杂烷基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。在某些情形中，磺酰基是-SO2烷基，其中烷基可以任选被取代。磺酰基的一个实例是甲磺酰基（例如-SO2CH3）。 [0087] 术语“亚砜基”是指-SOR，其中每个R独立地是氢或任选取代的烷基、任选取代的杂烷基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。磺酰基的一个实例是甲磺酰基（例如-SOCH3）。 [0088] 在某些情形中，取代基是各自独立地选自烷基、环烷基、芳基、杂环基、杂芳基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷基硫代、芳基硫代、氰基、卤素、羰基、硫代羰基、烷氧基羰基、硝基、甲硅烷基、三卤代甲磺酰基、三氟甲基和氨基及其被保护的衍生物的一个或多个基团，所述氨基包括单取代和二取代的氨基。 [0089] 可以形成上述取代基的保护衍生物的保护基团对于本领域技术人员来说是已知的，并且可以在参考文献例如Greene和Wuts的《有机合成中的保护基团》（Protective Groups in Organic Synthesis），第三版，John Wiley and Sons:New York，2006中找到。当取代基被描述成“任选被取代”时，取代基可以被上面描述的取代基取代。 [0090] 可以存在不对称碳原子。所有这样的异构体，包括非对映异构体和对映异构体及其混合物，都意在被包含在本文公开的范围内。在某些情形中，化合物可以以互变异构形式存在。所有互变异构形式都意在被包含在本文公开的范围内。类似地，当化合物含有烯基或亚烯基时，存在着化合物的顺式和反式异构形式的可能性。顺式和反式异构体以及顺式和反式异构体的混合物都被考虑在内。 [0091] 所公开的治疗剂的盐例如药学可接受的盐可以通过将适合的碱或酸与化学计量当量的治疗剂进行反应来制备。 [0092] 常用于形成药学可接受的盐的酸包括无机酸例如二硫化氢、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸和磷酸，以及有机酸例如对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、双酒石酸（bitartaric acid）、抗坏血酸、马来酸、苯磺酸、延胡索酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、甲酸、谷氨酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、乳酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸和乙酸，以及相关的无机和有机酸。因此，这样的药学可接受的盐包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、癸酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯代苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、O-羟基丁酸盐、羟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐等。在一个实施方案中，药学可接受的酸加成盐包括与无机酸例如盐酸和氢溴酸形成的盐，以及特别是与有机酸例如马来酸形成的盐。 [0093] 可以用金属或胺例如碱金属和碱土金属或有机胺来形成药学可接受的碱加成盐。也可以用药学可接受的阳离子来制备化合物的药学可接受的盐。适合的药学可接受的阳离子对于本领域技术人员来说是公知的，并包括碱金属阳离子、碱土金属阳离子、铵和季铵阳离子。碳酸盐或碳酸氢盐也是可能的。用作阳离子的金属的实例是钠、钾、镁、铵、钙或铁等。 适合的胺的实例包括异丙胺、三甲胺、组氨酸、Ν,Ν'-二苯甲基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己胺、乙二胺、N-甲基葡萄糖胺和普鲁卡因。 [0094] 类似地，治疗剂的药学可接受的衍生物（例如酯）、代谢物、水合物、溶剂化物和前体药物可以通过本领域技术人员公知的方法来制备。因此，另一个实施方案提供了作为活性化合物的前体药物的化合物。一般来说，前体药物是在体内被代谢（例如通过代谢转化例如脱氨基化、脱烷基化、脱酯化等）以提供活性化合物的化合物。“药学可接受的前体药物”是指在合理的医学判断范围内适合于在患者中药用而没有不适当的毒性、刺激性、过敏反应等并对目的用途而言有效的化合物，包括治疗剂的药学可接受的酯以及在可能的情况下可以是治疗剂的两性离子形式。当在本文中使用时，术语“药学可接受的酯”是指在体内水解的酯，并包括容易在人体内分解以留下母体化合物或其盐的酯。适合的酯基团包括例如源自于药学可接受的脂族羧酸特别是烷酸、烯酸、环烷酸和烷二酸的酯基团，其中每个烷基或烯基部分在有利情况下具有不超过6个的碳原子。具体酯的代表性实例包括但不限于甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯和乙基琥珀酸酯。药学可接受的前体药物类型的实例被描述在Higuchi和Stella，“作为新递送系统的前体药物”（Pro-drugs as Novel Delivery Systems），A.C.S.专题丛书第14卷以及Roche主编的《药物设计中的生物可逆载体》（Bioreversible Carriers in Drug Design），American Pharmaceutical Association and Pergamon Press，1987中，二者在此引为参考。 [0095] 本文描述的化合物和组合物也可以包括代谢物。当在本文中使用时，术语“代谢物”是指实施方案的化合物或其药学可接受的盐、类似物或衍生物的代谢产物，其在体外或体内表现出与所公开的治疗剂相似的活性。本文描述的化合物和组合物还可以包括水合物和溶剂化物。当在本文中使用时，术语“溶剂化物”是指由溶质（在本文中是治疗剂）与溶剂形成的复合物。供实施方案的目的用的这样的溶剂优选不应不利地干扰溶质的生物活性。溶剂可以是例如水、乙醇或乙酸。 [0096] 治疗方法 [0097] 本文公开的方法包括治疗障碍例如与DUB活性相关的障碍或受DUB活性调节影响的障碍的方法，或在制备用于治疗与DUB活性相关和/或受DUB活性调节影响的障碍的药物中使用本文公开的化合物的方法。此外还设想了对UCH催化结构域进行抑制的治疗方法。所设想的具体障碍包括病原体感染、癌症、发育和神经变性障碍、Riddle综合征、帕金森氏病、阿尔兹海默氏病和需要DUB或受DUB调节的遗传障碍例如范可尼贫血。 [0098] 在某些情形中，本文提供的方法进一步包括鉴定患有受DUB活性调节影响的障碍的对象，以及向所述对象施用本文公开的化合物。 [0099] 在各种不同情形中，本文提供的方法是预防性方法，并且本文公开的化合物或组合物在障碍发作之前被施用。在某些情形中，所述方法还包括鉴定具有患上与DUB活性相关和/或受DUB调节影响的障碍的风险（例如本文公开的病毒、细菌和/或寄生虫）的对象，以及施用有效量的本文公开的化合物。 [0100] 在某些情形中，本文提供了在细胞中抑制病原体感染的方法，所述方法包括以抑制所述病原体感染的量施用本文公开的化合物。在各种不同情形中，将所述细胞与所述化合物相接触。在某些实施方案中，所述细胞是动物细胞，或者更具体来说是哺乳动物细胞或禽类细胞，或者甚至更具体来说是人类细胞。在各种不同情形中，所述方法包括治疗由病原体感染造成的病症。所设想的病原体感染如本文别处所描述的。在各种实施方案中，所述方法还包括鉴定患有病原体感染和/或由病原体感染造成的病症的人，以及施用有效量的本文公开的化合物以抑制所述病原体感染。 [0101] 在某些情形中，本文提供了抑制细胞增殖的方法，所述方法包括将细胞与有效量的本文公开的化合物相接触，以抑制增殖。在某些情形中，所述细胞是癌细胞。所设想的癌细胞被描述在本文别处。在各种不同情形中，所述化合物抑制细胞的内源性DUB并抑制增殖。 [0102] 在各种不同情形中，本文提供了治疗神经变性疾病的方法，所述方法包括向需要的对象施用有效量的本文公开的化合物。所设想的神经变性疾病被描述在本文别处。在某些情形中，所述方法治疗神经变性疾病的一种或多种症状。 [0103] 本文还公开了治疗遗传障碍的一种或多种症状的方法，所述方法包括向需要的对象施用有效量的本文公开的化合物。在各种不同情形中，所述化合物抑制DUB，从而缓解所述遗传障碍的一种或多种症状。所设想的遗传障碍被描述在本文别处。 [0104] 在某些情形中，本文公开的方法还包括施用第二治疗剂。所述第二治疗剂可以与本文公开的化合物同时施用，或者在不同的时间施用（例如相隔约1小时至约12小时的时间段）。在同时施用药剂的情形中，药剂可以被共同配制在一起，或被配制在独立的制剂中但在同时或彼此相隔约30分钟内施用。所设想的第二药剂包括例如抗病毒剂、抗寄生虫剂、抗细菌剂、抗癌剂、治疗遗传障碍的一种或多种症状的药剂和/或治疗神经变性障碍的药剂。 [0105] 病原体感染 [0106] 本文公开的方法和化合物可用于治疗病原体感染，例如防止、抑制和/或缓解病原体感染或病原体感染的症状。在某些情形中，本文公开的方法和化合物可用于治疗由病原体感染造成的病症。 [0107] 食品和水源的故意污染是对全体美国人群的健康和健康相关服务以及对美国在全世界各地服务的武装力量的主要威胁。许多借助水和食物传播的B类病原体具有诸如低感染剂量、高稳定性的特定性质，使得它们成为这类生物恐怖主义的有吸引力的候选者。为了挫败这种潜在威胁，迫切需要针对这些确定的病原体提供保护或预防的方法或药剂。理想情况下，对广范围的威胁提供保护的药剂是合乎需要的。本文公开的化合物具有针对多种病原体的广泛活性。例如，WP1130是多种A类和B类病原体和相关家族成员特别是鼠诺罗病毒、单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）和刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）感染以及诺沃克病毒复制的强效抑制剂。此外，它还表现出针对脑心肌炎病毒、辛德毕斯病毒和拉克罗斯病毒的抗病毒活性。在某些细胞中，WP1130抑制脱泛素酶，并且这种作用引起泛素化蛋白质积累在细胞的细胞质和聚集体区室中。这可以在靶细胞中建立起对于病原体感染或复制来说不适宜的环境。因此，WP1130被用作能够有效抑制多种病原体的抗微生物抑制剂。该化合物以及式（I）、（II）、（IIa）和/或（III）的其他化合物阻断A类和/或B类病原体和/或相关家族成员的感染性。 [0108] 所设想的病原体在其感染机制中利用DUB。在某些情形中，病原体利用被感染细胞的内源性DUB。在各种不同情形中，病原体利用病原体的内源性DUB。 [0109] 所设想的由病原体感染造成的疾病或障碍包括肠胃炎、脑炎、呼吸道感染（例如SARS、流感）、病毒诱导的癌、狂犬病、出血热（例如克里米亚-刚果出血热、登革热）、里夫特裂谷热、李斯特菌病或弓形虫病。还考虑到的由病原体感染造成的疾病或障碍包括脑膜炎、心肌炎、肝炎、菌血症和皮肤感染。 [0110] 所设想的病原体包括病毒、细菌、真菌和寄生虫病原体。所设想的病原性病毒包括杯状病毒（例如诺罗病毒、沙波病毒）、小核糖核酸病毒、披膜病毒、布尼亚病毒、弹状病毒、疱疹病毒、腺病毒、动脉炎病毒、冠状病毒、黄病毒、副粘病毒、乳头瘤病毒、编码卵巢肿瘤（OTU）样蛋白酶的病毒、杆状病毒或内罗病毒。所设想的其他病原性病毒包括多瘤病毒和反转录病毒。 [0111] 所设想的具体病毒包括脑心肌炎病毒（EMCV）、辛德毕斯病毒（SiNV）、拉克罗斯病毒（LaCV）、诺沃克病毒、Epstein-Barr病毒（EBV）、疱疹病毒、登革热病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、乳头瘤病毒和流感病毒。所设想的其他具体病毒包括巨细胞病毒、BK病毒、丙型肝炎病毒和HIV。 [0112] 所设想的细菌包括衣原体属（Chlamydia）、埃希氏菌属（Escherichia）、沙门氏菌属（Salmonella）、耶尔森氏菌属（Yersinia）、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、李斯特菌属（Listeria）和分枝杆菌属（Mycobacterium）。所设想的其他细菌包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），或者更具体来说是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（Staph aureus）（MRSA）。 [0113] 所设想的寄生虫或真菌包括恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）、刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）、溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）、兰伯氏贾第虫（Giardia lamblia）、布氏锥虫（Trypanosoma brucei）、克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）、绦虫纲（Cestoda）、支睾吸虫属（Clonorchis）、后睾吸虫属（Opisthorchis）、类圆线虫属（Strongylocides）、假丝酵母属（Candida）、曲霉菌属（Aspergillus）和隐球菌属（Cryptococcus）。 [0114] 癌症 [0115] 本文公开的方法和化合物可用于治疗癌症，例如防止、抑制和/或缓解癌症或癌症的症状。在某些情形中，治疗癌症的方法包括抑制DUB，例如参与癌症存活或增殖的DUB。在各种不同情形中，用于治疗癌症的化合物是WP1130： 其中Pr 表示正丙基。 [0116] 所设想的具体癌症包括但不限于慢性髓细胞性白血病（CML）、黑色素瘤、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞病、骨髓增生性障碍、胶质母细胞瘤、卡波济氏肉瘤和鼻咽癌（EBV）。所设想的其他癌症包括肺癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和实体肿瘤。 [0117] 剂量和药物制剂 [0118] 当在本文中使用时，术语“治疗有效量”和“预防有效量”是指足以治疗、缓解或防止指定疾病或病症或者表现出可检测到的治疗、预防或抑制效应的化合物的量。所述效应可以通过例如临床病症的改善、症状的减轻或通过本文描述的任何测定法或临床诊断测试来检测。对于对象来说，精确的有效量取决于对象的体重、大小和健康，病症的性质和程度，以及所选的用于施用的治疗剂或治疗剂组合。对于给定的情形来说，治疗和预防有效量可以通过在临床医生的技术和判断范围之内的常规实验来确定。 [0119] 治疗剂的剂量可以可选地作为以mg/kg度量的剂量进行施用。所公开的治疗剂的被设想的mg/kg剂量包括约0.001mg/kg至约1000mg/kg。以mg/kg计的具体剂量范围包括约0.1mg/kg至约500mg/kg、约0.5mg/kg至约200mg/kg、约1mg/kg至约100mg/kg、约2mg/kg至约50mg/kg和约5mg/kg至约30mg/kg。 [0120] 在本文中，本文描述的化合物可以与药学可接受的赋形剂、载体或稀释剂一起被配制成药物组合物。化合物或包含所述化合物的组合物通过允许治疗所述疾病或病症的任何途径进行施用。一种施用途径是经口施用。此外，可以使用任何标准的施用途径将化合物或包含所述化合物的组合物递送至患者，所述施用途径包括肠胃外例如静脉内、腹膜内、肺内、皮下或肌内、鞘内、局部、透皮、直肠、经口、经鼻或通过吸入施用。也可以从本文描述的药剂制备缓释制剂，以便实现与胃肠道中的体液相接触的活性剂的受控释放，并在血浆中提供基本上恒定且有效的活性剂水平。为此目的，可以将晶体形式包埋在可生物降解的聚合物、水溶性聚合物或二者的混合物与任选的适合的表面活性剂的聚合物基质中。在这种情形中，包埋可以是指将微粒掺入到聚合物基质中。也可以通过使用已知的分散体或乳液包衣技术将分散的微粒或乳化的微滴囊封来获得受控释放制剂。 [0121] 施用可以采取单剂量施用的形式，或者可以在一段时间内以分开的剂量或以连续释放的制剂或施用方法（例如泵）来施用本文公开的化合物。不论采取何种方式将实施方案的化合物施用于对象，所施用的化合物的量和所选的施用途径应该被选择成允许有效治疗疾病病症。 [0122] 在实施方案中，取决于具体的施用方式和剂型，使用一种或多种药学可接受的赋形剂例如载体、溶剂、稳定剂、佐剂、稀释剂等来配制药物组合物。一般来说，药物组合物应该被配制成获得生理相容的pH，并且取决于制剂和施用途径，可以在约pH3至约pH11、优选约pH3至约pH7的范围内。在可选实施方案中，pH被调整到在约pH5.0至约pH8的范围内。更具体来说，药物组合物可以包含治疗或预防有效量的至少一种本文所述化合物以及一种或多种药学可接受的赋形剂。任选地，药物组合物可以包含本文所述化合物的组合，或者可以包含可用于治疗或防止细菌感染的第二活性成分（例如抗细菌剂或抗微生物剂）。 [0123] 在最典型的情况下，制剂例如用于肠胃外或经口施用的制剂是固体、液体溶液、乳液或悬液，而用于肺施用的可吸入制剂一般是液体或粉剂。药物组合物也可以被配制成冷冻干燥的固体，在施用前用生理相容的溶剂将所述固体重构。可选的药物组合物可以被配制成糖浆、霜剂、软膏、片剂等。 [0124] 术语“药学可接受的赋形剂”是指用于施用药剂例如本文描述的化合物的赋形剂。该术语是指任何可以施用而没有不适当的毒性的药物赋形剂。 [0125] 药学可接受的赋形剂部分由待施用的具体组合物所决定，并且也由用于施用所述组合物的具体方法所决定。因此，存在大量各种不同的适合的药物组合物制剂（参见例如《雷氏药学大全》（Remington's Pharmaceutical Sciences））。 [0126] 适合的赋形剂可以是包含大的、代谢缓慢的大分子例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物和失活的病毒粒子的载体分子。其他示例性赋形剂包括抗氧化剂（例如抗坏血酸）、螯合剂（例如EDTA）、糖类（例如糊精、羟基烷基纤维素和/或羟基烷基甲基纤维素）、硬脂酸、液体（例如油、水、盐水、甘油和/或乙醇）润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。脂质体也被包含在药学可接受的赋形剂的定义内。 [0127] 本文描述的药物组合物被配制成适合于预期的施用方法的任何形式。例如，当预期经口使用时，可以制备片剂、含片、锭剂、水性或油性悬液、非水性溶液、可分散的粉剂或颗粒剂（包括微粉化粒子或纳米粒子）、乳液、硬质或软质胶囊、糖浆或酏剂。预期经口使用的组合物可以按照本领域任何已知的用于制造药物组合物的方法来制备，并且这样的组合物可以含有一种或多种试剂，包括甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以便提供适口的制剂。 [0128] 特别适合与片剂结合使用的药学可接受的赋形剂包括例如惰性稀释剂，例如纤维素、碳酸钙或碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；崩解剂，例如交联聚维酮、玉米淀粉或藻酸；粘合剂，例如聚维酮、淀粉、明胶或阿拉伯树胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。 [0129] 片剂可以是未包衣的，或者可以通过包括微囊封的已知技术进行包衣，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并由此在较长时间段内提供持续作用。例如，时间延迟材料例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯可以被单独或与蜡一起使用。 [0130] 用于经口使用的制剂也可以被提供为硬质或软质明胶胶囊，在所述硬质明胶胶囊中，活性成分与惰性固体稀释剂例如纤维素、乳糖、磷酸钙或高岭土混合，而在所述软质明胶胶囊中，活性成分与非水性或油性介质例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、花生油、液体石蜡或橄榄油混合。 [0131] 在另一个实施方案中，药物组合物可以被配制成悬液，所述悬液包含实施方案的化合物与至少一种适合于制造悬液的药学可接受的赋形剂的混合物。 [0132] 在另一个实施方案中，药物组合物可以被配制成适合于通过添加适合的赋形剂来制备悬液的可分散的粉剂和颗粒剂。 [0133] 适合于与悬液联合使用的赋形剂包括悬浮剂（例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶、阿拉伯树胶），分散剂或润湿剂（例如天然存在的磷脂（例如卵磷脂），氧化烯烃与脂肪酸的缩合产物（例如聚氧乙烯硬脂酸酯），氧化乙烯与长链脂族醇的缩合产物（例如十七亚乙基氧化鲸蜡醇），氧化乙烯与源自于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物（例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯）），和增稠剂（例如卡波姆、蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇）。悬液还可以含有一种或多种防腐剂（例如乙酸、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸正丙酯）、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂例如蔗糖或糖精。 [0134] 药物组合物也可以是水包油乳液的形式。油相可以是植物油例如橄榄油或花生油，矿物油例如液体石蜡，或它们的混合物。适合的乳化剂包括天然存在的树胶例如阿拉伯树胶和黄蓍树胶，天然存在的磷脂例如大豆卵磷脂，源自于脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯例如山梨糖醇酐单油酸酯；以及这些偏酯与氧化乙烯的缩合产物例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。乳液还可以含有甜味剂和调味剂。可以用甜味剂例如甘油、山梨糖醇或蔗糖来配制糖浆和酏剂。这样的制剂还可以含有镇痛剂、防腐剂、调味剂或着色剂。 [0135] 此外，药物组合物可以是无菌可注射制剂例如无菌可注射水性乳液或油性悬液的形式。这种乳液或悬液可以由本领域普通技术人员使用适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂、包括上面所提到的那些来配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒性、肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬液，例如在1,2-丙二醇中的溶液。 [0136] 无菌可注射制剂也可以被制备成冷冻干燥的粉剂。可以使用的可接受的介质和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发油可以被用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸（例如油酸）同样也可以被用于制备可注射制剂。 [0137] 为了获得药物组合物的稳定的水溶性剂型，可以将本文描述的化合物的药学可接受的盐溶解在有机或无机酸的水性溶液例如琥珀酸或更优选为柠檬酸的0.3M溶液中。如果不能获得可溶性盐形式，可以将化合物溶解在适合的共溶剂或共溶剂的组合中。适合的共溶剂的实例包括醇、丙二醇、聚乙二醇300、聚山梨醇酯80、甘油等，其浓度在总体积的约0至约60%的范围内。在一个实施方案中，将活性化合物溶解在DMSO中并用水稀释。 [0138] 药物组合物也可以是活性成分的盐形式在适合的水性介质中的溶液的形式，所述适合的水性介质例如为水或等渗盐水或右旋糖溶液。此外还设想了例如通过酯化、糖基化、PEG化等将化学或生物化学部分取代或添加这样的部分来对化合物进行修饰以使其更适合于递送（例如提高溶解性、生物活性、适口性，减少副反应等）。 [0139] 在某些实施方案中，本文描述的化合物可以被配制在适合于低溶解性化合物的基于脂的制剂中用于经口施用。基于脂的制剂通常能够提高这样的化合物的口服生物利用度。 [0140] 因此，药物组合物包含治疗或预防有效量的本文描述的化合物以及至少一种药学可接受的赋形剂，所述赋形剂选自中链脂肪酸及其丙二醇酯（例如可食用脂肪酸如辛酸和癸酸的丙二醇酯）和药学可接受的表面活性剂例如聚氧乙烯40氢化蓖麻油（polyoxyl40hydrogenated castor oil）。 [0141] 在某些实施方案中，可以添加环糊精作为水溶性增强剂。示例性环糊精包括α-、β-和γ-环糊精的羟丙基、羟乙基、葡萄糖基、麦芽糖基和麦芽三糖基衍生物。具体的环糊精溶解性增强剂是羟丙基-o-环糊精（BPBC），其可以被添加到上述组合物的任一种中，以进一步改善实施方案的化合物的水溶性特性。在一个实施方案中，组合物包含约0.1%至约20%的羟丙基-o-环糊精、更优选为约1%至约15%的羟丙基-o-环糊精、甚至更优选为约2.5%至约10%的羟丙基-o-环糊精。所使用的溶解性增强剂的量取决于组合物中本发明化合物的量。 [0142] 组合疗法 [0143] 实施方案的方法还包括将本文所述的化合物与一种或多种用于治疗疾病病症的其他治疗剂一起使用。因此，例如，活性成分的组合可以：（1）被共同配制在一起并以组合制剂同时施用或递送；（2）作为独立的制剂交替或并行递送；或（3）通过本领域中已知的任何其他组合治疗方案。当以交替疗法施用时，本文描述的方法可以包括例如以独立的溶液、乳液、悬液、片剂、丸剂或胶囊，或者通过在独立的注射器中的不同注射剂来顺序施用或递送活性成分。一般来说，在交替疗法期间，每种活性成分的有效剂量被顺序即依次施用，而在同时疗法中，两种或更多种活性成分的有效剂量被一起施用。也可以使用各种顺序的间歇式组合疗法。 [0144] 在某些情形中，本文公开的化合物与第二治疗剂例如抗病毒剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂和/或化疗剂（例如抗癌剂）一起施用和/或配制在一起。 [0145] 设想使用的抗病毒剂包括但不限于阿昔洛韦、二十二烷醇、利巴韦林（ribarivin）、干扰素等、乙酸纤维素、卡波普和卡拉胶、普来可那立、金刚烷胺、金刚乙胺、福米韦生、齐多夫定、拉米夫定、扎那米韦、奥司他韦、溴夫定、阿巴卡韦、阿德福韦、安普那韦、阿比朵尔、阿扎那韦、atripla、西多福韦、双汰芝、依度尿苷、依法韦仑、恩曲他滨、恩夫韦肽、恩替卡韦、泛昔洛韦、夫沙那韦、膦甲酸、膦乙酸、更昔洛韦、加德西（gardasil）、伊巴他滨、异丙肌苷、碘苷、咪喹莫特、茚地那韦、肌苷、整合酶抑制剂、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦胺、mk-0518、马拉维若、吗啉胍、奈非那韦、奈韦拉平、多吉美（nexavir）、核苷酸和/或核苷类似物、奥司他韦、喷昔洛韦、帕拉米韦、鬼臼毒素、金刚乙胺、利托那韦、沙奎那韦、司他夫定、泰诺福韦、延胡索酸泰诺福韦酯、替拉那韦、三氟尿苷、三协唯、曲金刚胺、特鲁瓦达、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、vicriviroc、阿糖腺苷、viramidine、扎西他滨、吗啉代寡核苷酸、核酶、蛋白酶抑制剂、装配抑制剂（例如利福平）和齐多夫定。 [0146] 设想使用的抗细菌剂包括但不限于β-内酰胺类抗生素例如天然的青霉素类、半合成的青霉素类、天然的头孢菌素类、半合成的头孢菌素类、头霉素类、1-氧头孢烯类、克拉维酸类、青霉烯类、碳青霉烯类、诺卡杀菌素类、单环内酰胺类；四环素类、脱水四环素类、蒽环霉素类；氨基糖苷类；核苷类例如N-核苷类、C-核苷类、碳环核苷类、杀稻瘟菌素S；大环内酯类例如12元环大环内酯类、14元环大环内酯类、16元环大环内酯类；安沙霉素类；肽类例如博来霉素类、短杆菌肽类、多粘菌素类、杆菌肽类、含内酯键的大环肽类抗生素、放线菌素类、安福霉素、卷曲霉素、偏端霉素、持久杀菌素类、米卡霉素，新制癌菌素、涂链霉素、紫霉素、维吉霉素；环己酰亚胺；环丝氨酸；宛氏霉素；肉瘤霉素A；新生霉素；灰黄霉素；氯霉素；丝裂霉素类；烟曲霉素；莫能菌素类；硝吡咯菌素；磷霉素；夫西地酸；D-(对羟基苯基)甘氨酸；D-苯甘氨酸；烯二炔类；苄基青霉素（钾盐，普鲁卡因，苄星青霉素）、苯氧基甲基青霉素（钾盐）、苯氧乙基青霉素钾、丙匹西林、羧苄西林（二钠盐，苯基钠盐，茚满基钠盐）、磺苄西林、替卡西林二钠、甲氧西林钠、苯唑西林钠、氯唑西林钠、双氯西林、氟氯西林、氨苄西林、美洛西林、哌拉西林钠、阿莫西林、环己西林，海他西林、舒巴坦钠、盐酸酞氨西林、盐酸巴氨西林、匹美西林、头孢氨苄、头孢克洛、头孢来星、头孢羟氨芐、头孢拉定、头孢沙定、头孢匹林钠、头孢噻吩钠、头孢乙腈钠、头孢磺啶钠、头孢噻啶、头孢曲嗪、头孢哌酮钠，头孢孟多、盐酸头孢替安（vefotiam hydrochloride）、头孢唑啉钠、头孢唑肟钠、头孢噻肟钠、盐酸头孢甲肟、头孢呋辛、头孢曲松钠、头孢他啶、头孢西丁、头孢美唑、头孢替坦、拉氧头孢、克拉维酸、亚胺培南、氨曲南、四环素、盐酸金霉素、去甲基金霉素、土霉素、甲烯土霉素、多西环素、罗利环素、米诺环素、盐酸柔红霉素、多柔比星、阿柔比星、硫酸卡那霉素、卡那霉素B、妥布霉素、硫酸庆大霉素、地贝卡星、阿米卡星、小诺霉素、核糖霉素、硫酸新霉素、硫酸巴龙霉素、硫酸链霉素、双氢链霉素、越霉素A、潮霉素B、安普霉素、西索米星、硫酸奈替米星、盐酸壮观霉素、硫酸阿司米星、有效霉素、春雷霉素、多氧菌素、杀稻瘟菌素S、红霉素、依托红霉素、磷酸竹桃霉素、醋竹桃霉素、吉他霉素、交沙霉素、螺旋霉素、泰乐菌素、伊维菌素、麦迪霉素、硫酸博来霉素、硫酸培洛霉素、短杆菌肽S、多粘菌素B、杆菌肽、硫酸多粘菌素E、多粘菌素E甲磺酸钠、恩拉霉素、米卡霉素、维吉霉素、硫酸卷曲霉素、紫霉素、恩维霉素、万古霉素、放线菌素D、新制癌菌素、苯丁抑制素、胃酶抑素、莫能菌素、拉沙里菌素、盐霉素、两性霉素B、制霉菌素、纳他霉素、曲古霉素、光辉霉素、林可霉素、克林霉素、盐酸克林霉素棕榈酸酯、黄霉素、环丝氨酸、培西洛星、灰黄霉素、氯霉素、氯霉素棕榈酸酯、丝裂霉素C、硝吡咯菌素、磷霉素、夫西地酸、二环霉素、泰妙菌素或西卡宁。在某些情形中，抗病毒剂阻断毒力产物。在这样的情形中，阻止了细菌分泌其毒力因子（毒素等），并且免疫系统能够清除细菌。参见例如Lin等，Arch Biochem Biophys.2010Sep15;501(2):214-20.Epub 2010 Jun 15；Darby 等，J Antimicrob Chemother.2010Jul;65(7):1424-7.Epub 2010 Apr 30；Bryk 等，Biochemistry.2010 Mar 2;49(8):1616-27；Lin 等，Nature.2009 Oct 1;461(7264):621-6.Epub 2009 Sep 16；de Carvalho 等，J Med Chem.2009Oct8;52(19):5789-92；Nathan 等，Tuberculosis(Edinb).2008Aug;88Suppl LS25-33；Bryk,等，Cell Host Microbe.2008Mar13;3(3):137-45；Casenghi,等，PLoS Med.2007Nov6;4(11):e293；Hu等，Mol Microbiol.2006Mar;59(5):1417-28；以及Kline等，J Med Chem.2008 Nov 27;51(22):7065-74。 [0147] 设想使用的抗寄生虫剂包括但不限于2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇（BNPD）、β-硝基苯乙烯（BNS）、十二烷基胍盐酸盐、2,2-二溴-3-氰基丙酰胺（DBNPA）、戊二醛、异噻唑啉、亚甲基双(硫氰酸酯)、三嗪类、正烷基二甲基苯甲基氯化铵、基于磷酸三钠的抗微生物剂、三丁基氧化锡、噁唑啉类、四(羟甲基)鏻硫酸盐（THPS）、酚类、铬化砷酸铜、吡啶硫酮锌或吡啶硫酮铜、氨基甲酸酯类、次氯酸钠或次氯酸钙、溴化钠、卤代乙内酰脲类（Br、Cl）、乙胺嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺多辛、克林霉素和螺旋霉素或其混合物。 [0148] 设想使用的化疗剂包括但不限于烷化剂，包括：氮芥类，例如二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥；亚硝基脲类，例如卡莫司汀（BCNU）、洛莫司汀（CCNU）和司莫司丁（甲基-CCNU）；乙烯亚胺类/甲基三聚氰胺，例如三亚乙基三聚氰胺（TEM）、三乙烯、硫代磷酰胺（噻替派）、六甲基三聚氰胺（HMM、六甲蜜胺）；烷基磺酸盐类，例如白消安；三嗪类，例如达卡巴嗪（DTIC）；抗代谢药，包括叶酸类似物例如氨甲喋呤和三甲曲沙，嘧啶类似物例如5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、吉西他滨、胞嘧啶阿糖核苷（AraC、阿糖胞苷）、5-氮杂胞苷、2,2’-二氟脱氧胞苷，嘌呤类似物例如6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、硫唑嘌呤、2’-脱氧柯福霉素（喷司他丁）、赤型羟基壬基腺嘌呤（EHNA）、磷酸氟达拉滨和2-氯脱氧腺苷（克拉屈滨、2-CdA）；天然产物，包括抗有丝分裂药物例如紫杉醇，长春花生物碱类，包括长春花碱（VLB）、长春新碱和长春瑞滨，泰索帝，雌莫司汀和雌莫司汀磷酸盐；表鬼臼毒素类，例如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素类，例如放线菌素D、柔红霉素（红比霉素）、多柔比星、米托蒽醌、伊达比星、博莱霉素、普卡霉素（光辉霉素）、丝裂霉素C和放线菌素； 酶类，例如L-天冬酰胺酶；生物应答调节剂，例如α-干扰素、IL-2、G-CSF和GM-CSF；混杂的药剂，包括铂配位络合物例如顺铂和卡铂，蒽二酮类例如米托蒽醌类，取代的脲例如羟基脲，甲基肼衍生物、包括N-甲基肼（MIH）和丙卡巴肼，肾上腺皮质素抑制剂如米托坦（ο,p’-DDD）和氨鲁米特；激素类和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂例如强的松和等效物，地塞米松和氨鲁米特；孕激素，例如己酸羟孕酮、乙酸甲羟孕酮和乙酸甲地孕酮； 雌激素，例如己烯雌酚和炔雌醇等效物；抗雌激素药，例如他莫昔芬；雄激素类，包括丙酸睾酮和氟甲睾酮/等效物；抗雄激素药，例如氟他胺、促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林；非甾类抗雄激素药，例如氟他胺；激酶抑制剂，组蛋白脱乙酰酶抑制剂、甲基化抑制剂、蛋白酶体抑制剂、单克隆抗体、氧化剂、抗氧化剂、端粒酶抑制剂、BH3模拟物、泛素连接酶抑制剂、stat抑制剂和纳米粒子。 [0149] 通过参考下面的实施例将更充分地理解本发明，所述实施例详细描述了本发明的示例性实施方案。然而，它们不应被解释为限制本发明的范围。本公开中的所有引文在此明确引为参考。实施例 [0150] DUB抑制剂的抗癌评估 [0151] 慢性髓细胞性白血病（CML）与造血干细胞中的染色体异常相关，所述染色体异常引起具有不受调控的酪氨酸激酶活性的Bcr-Ab1表达。这些观察结果支持了第一种Bcr-Ab1激酶抑制剂伊马替尼的开发和临床测试，伊马替尼在CML患者中显示出显著的临床功效。伊马替尼是CML和其他表达Bcr-Ab1的白血病的一线疗法，大多数用伊马替尼治疗的慢性期患者获得了完全的细胞遗传学响应。然而，对伊马替尼治疗缓解的患者的分子研究证实，在大多数病例中Bcr-Ab1表达仍可被检测到，并且伊马替尼疗法的中断常常引起疾病复发。伊马替尼响应的有限持续时间在晚期CML患者中也是常见的，并且在疾病的任何阶段都能出现伊马替尼耐药性。获得性伊马替尼耐药性和疾病的进展通常以影响伊马替尼结合和激酶抑制的Bcr-Ab1突变和翻译后修饰为特征。伊马替尼耐药性疾病中的一些分子变化可以通过第二代酪氨酸激酶抑制剂来克服，所述第二代酪氨酸激酶以更高的亲和性结合Bcr-Ab1或抑制与耐药性相关的伊马替尼不敏感性激酶。然而，这些抑制剂的活性也可能受到突变和其他机制的限制。一些证据表明，Bcr-Ab1可以作为蛋白质支架起到组织信号转导复合物的作用，所述信号转导复合物不完全依赖于激酶活性。这些观察结果表明，在某些情况下，调节Bcr-Ab1蛋白水平的化合物可能更有效并且更适合用于CML疗法。 [0152] WP1130是一种具有DUB抑制活性的小分子，其快速诱导Bcr-Ab1的泛素化，引起Bcr-Ab1从细胞质重新定位到被称为聚集体（aggresome）的紧密的细胞内蛋白质复合物中。这种修饰引起下游Bcr-Ab1致癌信号转导的丧失。WP1130直接抑制Usp9x这种据最近报道能够调控Mc1-1稳定性的脱泛素酶，所述Mc1-1是在许多肿瘤、包括血液恶性肿瘤中表达的抗凋亡蛋白。Mc1-1与血液恶性肿瘤中的耐药性和存活相关。WP1130介导的Usp9x抑制伴有Mc1-1水平降低以及Bcr-Ab1激酶信号转导阻断，引起凋亡的快速发生。这些结果表明，靶向特定的泛素循环调控物可以成为抑制癌蛋白信号转导并降低升高的凋亡阈值的新型治疗方法。 [0153] 对WP1130作为抗癌治疗的作用机制进行了研究。通过对CML细胞中表达并激活的多种激酶进行筛查，只检测到Bcr-Ab1在CML细胞中下调。全面的检查显示，WP1130的作用是在细胞的细胞质级分中被启动的，这可以部分解释其对主要在细胞质中的Bcr-Ab1蛋白的选择性。其他激酶例如Jak2、Lyn和PI3-K据报道在膜级分中被检测到或与跨膜受体结合。数种肿瘤类型的分析支持所观察到的WP1130对特定细胞质激酶的选择性，而跨膜激酶例如HER家族、c-kit和Flt-3对WP1130不敏感。然而，在不表达Bcr-Ab1的血液肿瘤中，Jak2对WP1130作出响应，经历快速泛素化和聚集体运输。这可能解释了所报道的WP1130和活性较低的衍生物例如WP1066和WP1034的Jak/Stat抑制活性。根据此处报道的活性和以前的观察结果，WP1130引发一系列导致蛋白质例如Bcr-Ab1泛素化的事件。这种修饰转导信号使蛋白质运输或转移到细胞器，并且在Bcr-Ab1的情况下，聚集体似乎是转移的主要位点。聚集体通常是对蛋白质错误折叠或过载作出响应而形成的，并且据推测，其通过降低过量的蛋白质干扰细胞代谢的潜力而具有细胞保护性。然而，在Bcr-Ab1的情况下，信号转导的丧失，即使是短时间的丧失，也与CML细胞凋亡的发生相关。就此而言，WP1130引发的Bcr-Ab1的区室化使细胞保护过程转变成细胞破坏过程。根据观察到的WP1130对DUB活性的抑制，似乎DUB靶可能与观察到的WP1130活性相关。 [0154] 一小组DUB酶可能构成了某些蛋白质泛素化和WP1130的凋亡活性的基础。尽管在WP1130接触后在CML细胞中没有检测到总DUB活性的大的变化，但检测到了特定DUB例如Usp9x的抑制。在来自于完整细胞、细胞裂解物和酶制备物的测定体系中，在诱导Bcr-Ab1运输和凋亡所需的浓度下，Usp9x活性对WP1130敏感。最近的报道表明，Usp9x通过防止Mc1-1免于经由脱泛素化的蛋白酶体破坏，提高了Mc1-1的稳定性并延长其半衰期（参见例如Schwickart等，Nature，463:103-107(2010)）。WP1130处理的细胞中Mc1-1水平的降低与Usp9x活性的抑制并行。为了确定Usp9x抑制是否也与Bcr-Ab1运输相关，在CML细胞中Usp9x被沉默，并表现出Mc1-1下调，但对Bcr-Ab1泛素化或其细胞定位没有影响。尽管在多种肿瘤中Usp9x的表达和活性与Mc1-1控制高度相关，但它对CML干细胞这种对Bcr-Ab1激酶抑制仅仅具有中度反应性的细胞的持续存活性可能也是非常重要的。多项研究显示，由于包括Bcr-Ab1在内的大量上游级联的激活以及细胞因子介导的Stat激活，早期的致白血病祖细胞过表达Mc1-1。 [0155] 直到不久以前，Usp9x在转化的细胞中作为Mc1-1活性调节物的作用还是未知的，但Usp9x的抑制剂在大量情形中具有治疗重要性。就此而言，WP1130非常适合基于CML的疗法，因为它通过将激酶扣留在聚集体中而对Bcr-Ab1信号转导具有间接影响，并且直接抑制对于稳定CML干细胞存活来说可能是必需的Usp9x活性。由于Usp9x在Mc1-1水平的控制中的重要性，因此化合物如WP1130可用于克服与Usp9x活性和Mc1-1保护相关的凋亡抗性。 [0156] 所有化合物被制成20mM的储备液（在DMSO中），冷冻储存在-20℃下，并在即将使用前稀释在水性介质中。本研究中使用的其他试剂从下列来源获得：硼替佐米（Millennium Pharmaceuticals；Cambridge，MA）；Mini-Complete和PhosSTOP抑制性混合物（Roche Applied Science，Indianapolis，IN）；Ub-AMC、带血凝素标签的泛素乙烯基甲基砜（HA-UbV）、Suc-LLVY-AMC、Boc-LRR-AMC、MG-132、乳胞素和20S人类蛋白酶体（BostonBiochem，Cambridge，MA）。Rap80-琼脂糖和Ataxin-琼脂糖珠的亲和基质以及纯化的多泛素链（连接K-48/K-63）也从Boston Biochem获得。17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素（17-AAG）购自LC Laboratories（Woburn，MA）。 [0157] 细胞系和患者样品-K562、K562R、BV-173、BV-173R和WDT-2细胞系按照以前的描述进行生长和维持。将BaF3细胞维持在增补有1ng/ml IL-3（PeproTech,Rocky Hill,NJ）的相同培养基中。此外，还用如以前所描述的未突变或突变的Bcr-Ab1转化BaF3细胞，或用在框内被插入到Bcr-Ab1表达载体中的上游eGFP编码序列转化BaF3细胞。所有细胞在加湿气氛中在37℃下进行培养和维持。 [0158] 患者样本来自于CML患者，所述患者源自于当伊马替尼疗法不能继续控制他们的疾病时的患者。通过密度离心（Ficoll-Hypaque）从血液样品分离单核细胞，将其用PBS洗涤，重新悬浮在细胞培养基（RPMI-1640，10%胎牛血清）中，并在5%CO2培养箱中在37℃温育过夜，然后用抑制剂处理。 [0159] 质 粒 和 电 穿 孔 - 使 用 具 有 EcoRI 限 制 酶 位 点 的 5’ 引 物GAATTCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCG（SEQ ID NO：1）和具有EcoRV限制酶位点的3’引物GATATCGACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTG（SEQ ID NO：2），通过PCR从pLEGFPc克隆eGFP编码区。将含有p210Bcr/Ab1cDNA（源自于pSG5）的pBSsk+载体用ClaI和EcoRI消化，并将EcoRI位点平端化。将eGFP片段用ClaI和EcoRV消化并连接到pBSsk+/p210Bcr/Ab1中，产生5’端带有标签的eGFPp210Bcr/Ab1。通过使用EcoRI和NotI将eGFPp210Bcr/Ab1连接到缺失了IRES eGFP的pMXpuro载体中，构建了pMX/eGFPp210Bcr/Ab1。用pMX/eGFPp210Bcr/Ab1或pMX/eGFPpl20Bcr/Ab1-T315I（通过使用KpnI/BsrGI位点从pSG5-Bcr/Ab1/T315I亚克隆化而构建的）电转化BaF3细胞。所有突变和载体插入片段通过测序来证实。选择嘌呤霉素抗性（2μg/ml；2周）细胞，并通过eGFP阳性细胞的荧光活化细胞分选（FACSCANTO-II，Becton Dickenson）来富集表达Bcr-Ab1的细胞。通过免疫印迹和由不撤除IL-3的伊马替尼温育诱导的凋亡来证实Bcr-Ab1表达和细胞因子不依赖性。 [0160] 裂解物制备、抗体和蛋白质印迹-通过将细胞沉淀物在1xLaemmli还原性样品缓冲液中煮沸并超声来制备全细胞裂解物。为了制备去污剂可溶性和不溶性级分，将细胞在冷的等渗裂解缓冲液[10mM Tris-HCl(pH7.5)，0.5%Triton X-100，150mM NaCl以及Mini-Complete和PhosSTOP]中在冰上裂解15分钟，并以20,000RCF离心10分钟。澄清的上清液被用作去污剂可溶性细胞级分。将残留的沉淀物在Laemmli还原性样品缓冲液中洗涤和提取，并短暂超声以得到去污剂不溶性级分。将相等体积的细胞裂解物或相等的蛋白量在SDS-PAGE凝胶上电泳，并转移到硝酸纤维素膜（Whatmann，Dassel，德国）上。通过免疫印迹来检测蛋白质。 [0161] 本研究中使用的抗体购自下列来源：抗pY-Stat5抗体、pY-CrkL、抗PARP抗体、抗Mc1-1抗体（Cell Signaling Technology，Danvers，MA），抗肌动蛋白抗体（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）；多克隆抗ABL抗体（K12）、单克隆抗ABL抗体（SH2结构域；8E9）、抗泛素抗体克隆P4D1、抗HSP90抗体、抗HSP70抗体、抗Jak2抗体、抗CrkL抗体、抗α-微管蛋白抗体、辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔/小鼠/大鼠IgG抗体（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）；抗HA抗体克隆3F10（Roche Applied Science Indianapolis，IN）和抗Usp9x抗体（Bethyl Laboratories，Montgomery，TX）。 [0162] 蛋白酶体活性测定-使用产荧光的底物Suc-LLVY-AMC来测定20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性。为了在体内测定蛋白酶体抑制，将细胞用WP1130（5μM）或MG132（5μΜ）处理2小时，并在冰冷的裂解缓冲液（50mM HEPES，pH7.5，5mM EDTA，150mM NaCl，1%Triton X-100）中裂解。通过以20,000RCF离心10min使裂解物澄清，并将来自于每个样品的等量蛋白与100μΜ产荧光的底物在37℃下温育。为了在体外测定20S蛋白酶体的直接抑制，将纯化的20S人类蛋白酶体（200ng）与WP1130（5μΜ）、MG132（5μΜ）或乳胞素（5μΜ）在37℃温育30min，然后添加底物。使用分光光度计在360nm激发波长和460nm发射波长下测定荧光强度。进行三份平行样的测定，并使用配对Student’s t检验确定统计学显著性。 [0163] 活性氧物质的测定（ROS）-将白血病细胞（1x106）用DMSO、WP1130（5μΜ）或ROS内含物的阳性效应物[H2O2（0.5mM）]或阴性效应物[DTT（1mM）]在37℃下处理2小时。将细胞洗涤并重新悬浮在含有10μΜDCFDA的PBS中，并在暗处继续温育另外15min。在PBS中洗涤之后，将细胞转移至96孔板的各个孔中，使用分光光度计在492nm激发波长和 520nm发射波长下测定荧光强度。进行三份平行样的测定，并使用配对Student’s t检验确定统计学显著性。 [0164] 共聚焦显微术-将对照和处理过的eGFP-Bcr/Ab1转化的BaF3细胞在PBS中洗涤两次，然后使用4%甲醛固定15min。使用Cytopro离心机（Wescor，Logan，UT）将细胞离心在涂有聚赖氨酸的载片上，并在0.5%Triton X-100中通透化处理5min。然后将载片在封闭溶液（5%山羊血清）中在室温下温育1h。与第一抗体（1：100）的温育在室温下执行4h或在4℃下执行过夜，并将载片用0.2%Triton X-100/PBS缓冲液洗涤3次。使用Alexa-Fluor抗小鼠和Alexa-Fluor抗兔免疫球蛋白抗体作为第二抗体。将载片洗涤三次，并用Hoechst33342对核进行染色。使用Olympus共聚焦显微镜FV-500（Tokyo，日本）获取图像。 [0165] 体外脱泛素化测定-Ub-AMC蛋白酶测定。将细胞在冰冷的含有50mM pH7.5的Tris-HCl、0.5%NP-40、5mM MgCl2、150mM NaCl和1mM苯甲基磺酰氟的DUB缓冲液中裂解。简单来说，将来自于未处理或处理的细胞的5μg澄清的裂解物与500nM Ub-AMC在100μL反应体积中在37℃下温育，并使用荧光光度计在ex/em380/480下记录AMC荧光的释放。将USP9x从500μg细胞裂解物中免疫沉淀出来，并在含有NEM、WP1130或DMSO的DUB缓冲液中在100μL反应体积中温育30min。通过添加500nM Ub-AMC来起始反应，并记录AMC荧光的释放。 [0166] Ub链解体。按照以前的描述来进行纯化的多泛素链（连接K-48/K-63）的体外解体。将来自于未处理或WP1130处理的细胞的5μg裂解物制备在DUB缓冲液中，并与K48-或K-63连接的链（1μg）在37℃下温育10min。链解体的程度通过泛素免疫印迹来评估。 [0167] 脱泛素酶标记的测定为了测定细胞脱泛素酶活性的变化，将白血病细胞在DUB缓冲液（50mM Tris pH7.4，5mM MgCl2，150mM NaCl）中在4℃下裂解10min。将裂解物以20,000RCF离心10min，并将上清液用于DUB标记。将等量裂解物与500ng HA-UbV在室温下温育1小时，然后在还原性样品缓冲液中煮沸，并通过SDS-PAGE分离。使用HA免疫印迹来检测DUB标记。 [0168] 为了确定对Bcr-Ab1的选择性，评估了在CML细胞中表达的数种激酶的WP1130介导的下调（在5μΜ WP1130下2小时），所述激酶包括Bcr-Ab1、c-Ab1、BCR、肌动蛋白、Jak2、gp130、Lyn、Akt、Pt-3K、Jnk、Erk1/2。只有Bcr-Ab1蛋白水平在WP1130处理后降低，表明对该嵌合蛋白的特异性。将eGFP-Bcr-Ab1转化的BaF3细胞留置不处理或用5μΜ伊马替尼或WP1130处理2小时，然后分析等量蛋白的细胞裂解物中的Bcr-Ab1和肌动蛋白。带有eGFP标签的Bcr-Ab1（WT）在BaF3细胞中表达，并且检测到异常表达的Bcr-Ab1在WP1130处理后快速下调。建立了表达Bcr-Ab1的WT和T315I变体的稳定的BaF3细胞系，并且它们在两种情况下都表现出对WP1130介导的凋亡的高敏感性。将用不含（W/T）或含有T315I Bcr-Ab1突变的eGFP-Bcr-Ab1转化的BaF3细胞用指定浓度的伊马替尼或WP1130处理72小时，然后通过MTT染色来评估细胞的生长和存活。通过荧光显微术研究WP1130对eGFP-Bcr-Ab1的影响。在WP1130温育后，观察到eGFP-Bcr-Ab1快速积累到紧密的高密度Bcr-Ab1簇中。 [0169] 已报道，用格尔德霉素和类似物抑制Hsp90能够影响Bcr-Ab1的稳定性和细胞分布。将Hsp90抑制剂（17-AAG）与WP1130的抗增殖效应进行比较。WP1130和17-AAG两者在表达WT Bcr-Ab1（BV-173）或T315I突变体Bcr-Ab1（BV-173R）的CML细胞系中都表现出抗增殖效应，但是观察到凋亡起始的差异。在17-AAG处理的细胞中观察到Hsp90与Bcr-Ab1的结合降低，这能够通过泛素化导致Bcr-Ab1下调。然而，用WP1130处理导致Bcr-Ab1与Hsp90之间的结合增加，表明Bcr-Ab1下调具有不同的机制。评估了WP1130和17-AAG对细胞的泛素化的蛋白水平和Hsp70蛋白水平的影响，因为Hsp90抑制导致对Hsp70的诱导。17-AAG对泛素化的蛋白水平没有影响，但是引起对Hsp70的诱导。WP1130诱导去污剂可溶性细胞级分中泛素化的蛋白快速增加，并且这种增加在较晚的时间点基本上集中在去污剂不溶性级分中。在WP1130处理的细胞中Hsp70水平也增加，但是与Hsp90抑制无关。 [0170] 将BV-173细胞用5μΜ WP1130处理0、1或2小时，然后评估总细胞裂解物、去污剂可溶性和不溶性级分中的Bcr-Ab1、pY-Stat5和Jak2蛋白水平。将BV-173和BV-173R细胞用5μΜ WP1130处理2小时，然后对去污剂可溶性和不溶性细胞裂解物中的Bcr-Ab1进行印迹（K12抗体）。将K562R细胞用5μΜ WP1130处理2小时，然后探测源自于全细胞级分、去污剂可溶性和不溶性级分的蛋白中的Bcr-Ab1、Jak2、pY-Lyn和Lyn。将用具有T315I突变的eGFP-Bcr-Ab1转化的BaF3细胞用5μΜ WP1130处理0、0.5、1、2、4或6小时，然后对去污剂可溶性细胞裂解物中的Bcr-Ab1、pY-Stat5、Stat5和PARP进行免疫印迹。将来自于正进行伊马替尼治疗的两位CML患者的单核细胞用5μΜ WP1130处理4小时，然后探测等体积的代表去污剂可溶性和不溶性细胞级分的细胞裂解物中的Bcr-Ab1。还对去污剂可溶性细胞级分中的Bcr-Ab1底物磷蛋白（pY-Stat5、pY-CrkL）和它们的总蛋白水平进行免疫印迹。由于泛素化能够介导蛋白降解和细胞内运输，因此检查了WP1130处理的细胞中的Bcr-Ab1含量。WP1130处理导致Bcr-Ab1从去污剂可溶性细胞级分向不溶性细胞积分快速并接近完全的运输。Bcr-Ab1区室化到不溶性级分中与Stat5磷酸化的丧失相关，但不影响Jak2。然而，在全细胞提取液中没有观察到Bcr-Ab1蛋白质含量的显著变化。在伊马替尼耐药性CML细胞例如表达T315I-Bcr-Ab1的BV-173R细胞和过表达Lyn激酶的K562R细胞中，也观察到去污剂不溶性细胞级分中Bcr-Ab1蛋白含量的增加。在这些细胞中，Jak2或Lyn的去污剂溶解性都不受WP1130影响。在表达Bcr-Ab1的BaF3转化体中，Bcr-Ab1从去污剂可溶性级分中丧失与降低的底物磷酸化（pY-Stat5）和凋亡的发生（PARP切割）相关。在来自于伊马替尼耐药性患者的原代CML细胞中，也观察到Bcr-Ab1在WP1130温育后易位到去污剂不溶性级分中，并且与Bcr-Ab1底物（pY-Stat5、pY-CrkL）磷酸化的丧失相关。去污剂不溶性级分高度富集细胞骨架蛋白和被称为聚集体的细胞结构组分。这些结果表明，WP1130通过Bcr-Ab1的区室化阻断Bcr-Ab1底物磷酸化。 [0171] 将K562细胞与5μΜ WP1130温育30min，然后对去污剂可溶性细胞提取物进行Hsp90免疫沉淀，然后对Bcr-Ab1、泛素或Hsp90进行免疫印迹。将K562细胞与WP1130（5μΜ）、H2O2（500mM）或DTT（1mM）在37℃下温育2小时。然后将细胞洗涤并重新铺板在含有DCFDA的培养基中，在37℃下温育20min。读取DCFDA荧光，并将其用作处理过的样品中ROS生产的度量。在两种其他CML细胞系（WDT-2、BV-173）中获得类似结果。将K562细胞留置不处理，或者用5μΜ WP1130或MG-132在37℃处理2h。将蛋白裂解物与蛋白酶体底物温育，并通过产荧光的底物的切割来确定活性。将纯化的20S蛋白酶体与5μΜ MG-132、乳胞素或WP1130温育，然后测定蛋白酶体活性。使用两种其他CML细胞系获得类似结果。将K562细胞用50nM硼替佐米或5μΜ WP1130处理，然后对来自于去污剂可溶性级分、去污剂不溶性级分和全细胞裂解物的等体积裂解物的Bcr-Ab1或泛素进行免疫印迹。Bz和WP两者增加泛素的含量，但是只有WP影响Bcr-Ab1和去污剂不溶性泛素化蛋白的水平。泛素化蛋白的含量增加可能是蛋白酶体抑制、蛋白伴侣活性丧失或细胞氧化增加引起蛋白质错误折叠的结果。然而，没有检测到Hsp90与Bcr-Ab1的结合丧失，并且在WP1130处理的细胞中没有观察到活性氧物质的升高。此外，在完整的CML细胞或纯化的20S蛋白酶体亚基制备物中，WP1130不抑制20S蛋白酶体的活性，这消除了WP1130起到蛋白酶体抑制剂的作用的可能性。将WP1130与强效20S蛋白酶体抑制剂硼替佐米进行比较，以确定它们是否共同具有对蛋白质泛素化和Bcr-Ab1区室化的影响。两种化合物都增加泛素化蛋白的含量，但是只有WP1130诱导去污剂不溶性泛素化蛋白的积累。WP1130处理引起去污剂可溶性级分中的Bcr-Ab1减少以及Bcr-Ab1在去污剂不溶性级分中出现，但是没有观察到总Bcr-Ab1含量的变化。硼替佐米提高泛素化蛋白的水平，但是对Bcr-Ab1的去污剂溶解性或蛋白水平没有影响。 [0172] 为了确定在WP1130处理的细胞中Bcr-Ab1是否被泛素化，将CML细胞用WP1130短时间（30min）处理，以允许从去污剂可溶性级分中回收Bcr-Ab1（用于直接免疫沉淀）。在CML细胞中，WP1130刺激Bcr-Ab1的泛素化和运输。将WDT-2细胞用单独的介质（对照）或5μΜ WP1130在37℃下处理30min，然后将等体积的细胞裂解物分离成总级分、去污剂可溶性级分或去污剂不溶性级分，并对Bcr-Ab1或泛素进行探测。将来自于WP处理的细胞或对照细胞的等量蛋白（400μg）的去污剂可溶性细胞裂解物用1%SDS在60℃下处理，稀释至 0.1%SDS，并用抗Ab1抗体（K12）进行免疫沉淀。将IP洗涤，在凝胶上分离并对Ab1或泛素进行免疫印迹。将K562或BV-173细胞用WP或对照进行处理，并对等量蛋白的去污剂可溶性细胞裂解物进行Ab1免疫沉淀，并对Ab1和泛素进行免疫印迹。将来自于对照细胞和处理过的细胞的相同裂解物的等分试样（200μg）也进行亲和富集，以富集K48-连接（Ataxin）或K63连接（Rap80）的泛素聚合物。将结合的蛋白洗脱并进行Ab1免疫印迹。将eGFP-Bcr-Ab1转化的BaF3细胞用单独的介质或5μΜ WP1130处理4小时，然后将细胞固定，将细胞离心在载片上并进行通透化处理。在封闭反应性位点后，将载片与抗泛素抗体（1：100）温育，洗涤，并且使用Alexa-Fluor抗体检测抗原。将载片再次洗涤，并用Hoechst33342染色进行核检测。从WP1130处理的细胞免疫沉淀后进行的Bcr-Ab1免疫印迹证实了，从去污剂可溶性提取液回收的Bcr-Ab1适度减少，但是其泛素化明显增加。印迹证实了在来自于WP1130处理的细胞的不溶性级分中，Bcr-Ab1和泛素化蛋白显著增加。为了确定WP1130对Bcr-Ab1的修饰是否由特定泛素聚合物向激酶的转移造成，用偶联有对K48连接（Ataxin）或K63连接（Rap80）的泛素聚合物具有高亲和性的蛋白的琼脂糖珠对可溶性细胞裂解物进行免疫沉淀，并对蛋白洗脱液的Bcr-Ab1进行免疫印迹。在WP1130处理的细胞中，Bcr-Ab1/K63连接的泛素聚合物的回收更加显著，表明Bcr-Ab1上增加的K63连接的泛素聚合物为其易位到去污剂不溶性复合物中提供了信号。 [0173] 为了进一步评估Bcr-Ab1泛素化和细胞分布，通过共聚焦显微术对eGFP-Bcr-Ab1BaF3转化体进行检查。用WP1130处理引起Bcr-Ab1和泛素簇集到类似聚集体的靠近核的复合物中。生物化学研究支持在WP1130处理的细胞中包含与Bcr-Ab1复合形成聚集体的其他蛋白。这些结果表明，WP1130刺激Bcr-Ab1泛素化的增加（主要采用了K63连接的聚合物）以引发它向聚集体转移。 [0174] 具有两个在空间上可接近的亲电子的β-碳的交叉共轭α,β-不饱和二烯酮是异肽酶或脱泛素酶（DUB）抑制剂活性的分子决定因素。在WP1130中存在这些决定因素促使对其潜在的DUB抑制活性进行研究。将源自于未处理或WP1130处理的细胞的裂解物与纯化的泛素聚合物（Ub1-Ub5）温育，并通过免疫印迹评估聚合物的相对回收。源自于WP1130处理的CML细胞的裂解物显示出部分保护K48和K63连接的泛素聚合物两者免于解体，这支持DUB受WP1130抑制的可能性。为了更密切检查DUB抑制，将来自于未处理、WP1130处理（1-8小时）或N-乙基马来酰亚胺[NEM]处理的CML细胞的裂解物与荧光DUB底物（Ub-AMC）温育，并随时间推移监测活性。源自于用非特异性DUB抑制剂NEM处理的细胞的裂解物完全阻断底物水解，而来自于WP1130处理的CML细胞的裂解物显示出对Ub-AMC水解活性的有限影响。这些结果表明，WP1130介导的泛素变化可能通过单个或有限的一小组DUB的抑制来介导。为了检查对特定DUB活性的影响，将CML细胞用WP1130处理，并按照以前所述将裂解物与带有HA标签的不可逆DUB底物HA-UbVS温育。该构建物对DUB的共价修饰允许通过HA免疫印迹分析DUB活性。WP1130对DUB活性的抑制可以通过WP1130敏感性DUB的HA标记的减少来检测。来自于WP1130处理的细胞的裂解物显示出对被鉴定为Usp9x的一种显著的高分子量的DUB的标记能力降低。Usp9x主要表达在细胞质去污剂可溶性级分中，并且WP1130处理不影响Usp9x的回收或蛋白质含量。为了确定WP1130是否直接影响Usp9x活性，将CML细胞裂解物与WP1130温育1h，然后与HA-UbV DUB底物温育并通过HA印迹进行分析。在WP1130存在下Usp9x标记被完全阻断，表明Usp9x的直接抑制。用箭头表示的其他DUB也受WP1130的影响，表明WP1130以目前未知的特异性或选择性靶向其他DUB。为了证实DUB的直接抑制，将Usp9x免疫沉淀，彻底洗涤，并与WP1130温育，然后使用荧光DUB底物Ub-AMC评估DUB活性。测定底物水解速率并在DMSO和WP1130温育的测定体系中进行比较，以估算DUB被WP1130抑制的百分率。正常的IgG免疫沉淀物和用NEM处理的Usp9x免疫沉淀物不引起底物水解。当与对照反应相比时，WP1130使Usp9x活性降低超过80%，这证实了WP1130起到一小组特定DUB的抑制剂的作用，具有针对Usp9x的活性。 [0175] 最近的报道证实了Usp9x控制Mc1-1脱泛素化和降解。为了确定在CML细胞中WP1130对Usp9x的抑制是否影响Mc1-1水平，对总细胞提取液的Mc1-1进行免疫印迹。WP1130以与Usp9x抑制并行的时间方式降低Mc1-1水平，并且在伊马替尼敏感和伊马替尼耐药性CML细胞两者中都有活性。为了确定Bcr-Ab1或Jak2抑制是否也能降低Usp9x活性，将CML细胞用WP1130、Bcr-Ab1选择性（伊马替尼）、Jak2选择性（TG101209）或多种激酶的抑制剂（达沙替尼）处理4小时，然后对细胞裂解物进行HA-UbV标记并进行直接Usp9x免疫印迹。此外，还包括了用WP1130（5μΜ，30min）体外处理细胞裂解物以证实Usp9x的直接抑制。WP1130有效地降低Usp9x活性，而所检查的激酶抑制剂都没有显著的Usp9x抑制活性。 [0176] 白血病和骨髓瘤中的DUB抑制 [0177] 泛素化和泛素样蛋白修饰在引导大多数细胞蛋白的命运和功能方面发挥重要作用。这些途径中的数种关键酶在患病细胞中得到扩增或修饰，为抑制或调节它们的活性的小分子的开发提供了理论基础。在这些途径中的特定酶的选择性靶向中已取得重要进展，其中某些具有临床效果。由于DUB在泛素循环中的特殊作用及其在控制多种信号转导途径和癌蛋白中新出现的作用，DUB抑制剂是有用的抗癌剂。由于WP1130诱导多泛素化蛋白积累和促进肿瘤细胞凋亡的能力，因此WP1130被鉴定为有用的抗癌剂。 [0178] DUB的基于肽的强效不可逆抑制剂例如泛素醛和泛素乙烯基砜（UbVS）是已知的。然而，由于它们的高分子量和受限的细胞生物利用度，它们的治疗潜力受到限制。其他小分子化合物例如D12-前列腺素J2，最初显示出在细胞中抑制泛素异肽酶活性（IC50为约 30μΜ），并引起泛素化蛋白的细胞积累和细胞死亡。在这种化合物中注意到了DUB抑制活性所需的关键分子决定因素，即具有空间上可接近的β-碳的α,β-不饱和酮，并导致鉴定了具有相似活性的其他抑制剂例如二苯亚甲基丙酮（DBA，IC50为约20-40μΜ）、姜黄素（IC50为约80-100μΜ）和shikoccin（NSC-302979；IC50为约15μΜ）。然而，受这些化合物影响的具体DUB的情况尚未被描述。 [0179] 使用多种体内和体外测定法，在本文中提供了WP1130起到DUB部分选择性抑制剂作用的机械学证据。本文的数据显示，WP1130抑制大多数细胞脱泛素酶例如USP5、UCH-L1、USP9x、USP14和UCH37的活性。多种DUB的抑制可能诱导多种可预测的细胞变化，例如：（i）增加多泛素化蛋白/未锚定的多泛素链的积累；（ii）减少单体泛素池；（iii）减慢聚泛素解体的速率；（iv）总体降低各个DUB的活性；以及（v）影响DUB调控的癌蛋白例如p53和Mc1-1的细胞水平/活性。已知USP5和UCH37使K48连接和K63连接的多泛素化蛋白两者脱泛素化。 [0180] 由蛋白酶体抑制或细胞DUB活性丧失所引起的细胞泛素化蛋白的显著增加能够触发聚集体形成。在胁迫条件下聚集体的形成引起暂时的细胞保护性事件，将大量积累的泛素化蛋白重新定位到聚集体不溶性级分。数据表明，WP1130处理引起多泛素化Jak2和Bcr-Ab1积累到去污剂不溶性聚集体中，从而抑制肿瘤细胞增殖。 [0181] 因此，将在增殖、存活和生长因子信号转导中发挥关键作用的癌蛋白运输到它们不能起作用的聚集体中，据预测对肿瘤细胞有害。然而，在这些致癌激酶的调控中发挥关键作用的DUB目前还是未知的。通过CML和黑色素瘤的异体移植小鼠模型，WP1130处理有效地抑制体内肿瘤生长。这些观察结果合在一起表明WP1130通过它对DUB活性的影响而起到治疗剂的作用。 [0182] 值得注意的是，WP1130所靶向的数种DUB，包括Mc1-1和p53，最近已被显示是特定癌基因的稳定性和更新的关键调控物和凋亡调控物。并且还提出其他DUB在转化和控制泛素化蛋白进入蛋白酶体中发挥直接作用。此外，最近还显示可能被WP1130靶向的其他DUB在不受调控的细胞生长和肿瘤细胞的癌基因依赖中发挥作用。 [0183] 细胞培养、化学试剂和酶–将人类多发性骨髓瘤MM1.S和套细胞淋巴瘤Z138细胞生长在增补有10%胎牛血清（FBS）（Invitrogen，Carlsbad，CA）的RPMI-1640中。将贴壁的细胞系例如人类胚胎肾293T（HEK293T）细胞培养在含有10%FBS的Dulbecco改良基本培养基（DMEM）中。所有细胞在加湿气氛中在37℃下进行培养和维持。RPMI-1640和DMEM购自HyClone（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）。 [0184] 质粒和siRNA转染–在转染前24小时，将HEK293T细胞（105个细胞/孔）接种在6孔板中。使用Fugene HD（Roche）按照制造商的流程用500ng带有HA标签的泛素（WT/63O/48O）转染每个孔。在转染后温育过夜后，将细胞分到两个孔中并继续温育24小时，然后用单独的介质（DMSO）或WP1130处理。 [0185] 使 用 Lipofectamine2000，将 用 于 USP9x 和USP5 的 ON-TARGETplus siRNA（Thermo-scientific-Dharmacon）（各30nM）用来抑制HEK293T细胞中的USP9x和USP5。在转染72小时后，通过蛋白质印迹来估算蛋白水平。 [0186] 蛋白质印迹-通过将细胞沉淀物在1x Laemmli还原性样品缓冲液中煮沸并超声来制备全细胞裂解物。为了制备去污剂可溶性和不溶性级分，将细胞在冷的等渗裂解缓冲液[10mM Tris-HCl(pH7.5)，0.5%Triton X-100，150mM NaCl以及Mini-Complete和PhosSTOP]中在冰上裂解15分钟，并以20,000RCF离心10分钟。澄清的上清液被用作去污剂可溶性细胞级分的来源。通过将残留的沉淀物在等体积煮沸的1x Laemmli还原性样品缓冲液中超声，来提取去污剂不溶性级分。将相等体积的细胞裂解物或相等的蛋白量在SDS-PAGE凝胶上电泳。 [0187] 在本研究中使用的抗体购自下列来源：抗肌动蛋白抗体（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）；抗泛素抗体克隆P4D1、抗HDAC6抗体、抗HSP90抗体、抗HSP70抗体、抗20S蛋白酶体抗体、抗HDAC6抗体、辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔/小鼠/大鼠IgG抗体（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）；抗脂筏特征蛋白1抗体、抗MCL1抗体（BD Biosciences，San Jose，CA）；抗p53抗体（Millipore，Billerica，MA）；抗USP9x抗体、抗USP5抗体（Bethyl laboratories，Montgomery，TX）；抗PARP抗体（Cell signaling Technology，Danvers，MA）；抗HA抗体克隆3F10（Roche Applied Science Indianapolis，IN）。 [0188] 亚细胞分级–将Z138细胞用5μΜ WP1130或DMSO处理2小时，然后对它们进行裂解和处理以分离细胞浆、膜、核和细胞骨架级分。使用ProteoExtract亚细胞蛋白质组提取试剂盒（Calbiochem，San Diego，CA）按照制造商的说明书提取每种级分。包含用于每种级分的标志物以评估每种级分的纯度。 [0189] 共聚焦显微术-将用WP1130或DMSO处理4小时的HEK293T细胞在PBS中洗涤两次，然后使用4%甲醛固定15min。将细胞在0.5%Triton X-100中通透化处理5min。然后将载片在封闭溶液（5%山羊血清）中在室温下温育1h。与第一抗体（1：100）的温育在4℃下执行过夜，并将载片用0.2%Triton X-100/PBS缓冲液洗涤3次。使用Alexa-Fluor抗小鼠和Alexa-Fluor抗兔免疫球蛋白抗体作为第二抗体。将载片洗涤三次，并用Hoechst33342TM染色以进行核检测。使用Olympus FluoView 500（Tokyo，日本）获取图像。图像代表来自每种样品的分组的Z-堆叠物（Z=0.5μm）。 [0190] 通过MTT进行的细胞增殖评估和凋亡分析–将细胞以每个孔5,000个细胞的量接种在存在浓度增加的WP1130的96孔板中，在CO2培养箱中在37℃下温育3天。向每个孔添加20μL5g/L的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物（MTT）溶液，在37℃下温育2h。然后将细胞在10%SDS-缓冲液中裂解，并使用酶标仪测定相对于630nm参比波长的在570nm处得吸光度。计算引起细胞生长的50%抑制的浓度（IC50值）。 [0191] 使用膜联蛋白V（Annexin V）和碘化丙啶（PI）染色来测定WP1130处理的细胞中5 的凋亡。简单来说，从组织培养板收获10/mL细胞，并在室温下以2500rpm离心5min。去除培养基上清液，并将细胞在PBS中洗涤一次。然后将细胞重新悬浮在0.4ml冷的膜联蛋白V结合缓冲液中，并加入膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶。将样品在暗处在室温下温育10min，通过尼龙筛过滤，并使用FacScan分析仪（Becton-Dickinson，San Jose，CA）通过流式细胞术进行分析。 [0192] 将最适浓度（USP5：20nM，UCH-L1：20nM，UCH-L3：5nM，USP9x：从500μg Z138细胞裂解物免疫沉淀）的纯化的DUB在含有WP1130、单独的介质（DMSO）或1mM NEM（DUB抑制的阳性对照）的DUB缓冲液中在100μL反应体积中温育30min。通过添加500nM Ub-AMC起始反应，并使用荧光光度计在ex/em380/480下记录AMC荧光的释放。 [0193] 脱泛素酶标记的测定–为了测定细胞脱泛素酶的活性变化，将Z138和HEK293细胞在DUB缓冲液（50mM Tris pH7.4，5mM MgCl2，150mM NaCl）中在4℃下裂解10min。将裂解物以20,000RFC离心10min，并将上清液用于DUB标记。将等量裂解物与500ng HA-UbV在室温下温育1小时，然后在还原性样品缓冲液中煮沸并通过SDS-PAGE分离。在将蛋白转移至硝酸纤维素膜之后，使用HA免疫印迹来检测DUB标记。 [0194] 套细胞淋巴瘤Z138细胞表现出对WP1130的高凋亡敏感性（IC50为约1μΜ），其证据为在处理2-4小时后出现切割的PARP。WP1130与在套细胞肿瘤中有临床活性的AG490或硼替佐米的直接比较，表明每种化合物在凋亡起始和活性上有区别。与硼替佐米类似，WP1130对骨髓和淋巴来源的多种其他肿瘤细胞系以及HEK293细胞表现出强抗增殖性质。 [0195] 来自于WP1130处理的Z138细胞的全细胞提取物（WCE）的分析显示出泛素化蛋白的显著和浓度依赖性积累。在WP1130处理的其他细胞，包括K562、MM.1S、HeLa和HEK293中，观察到类似的蛋白质泛素化的增加。与WP1130和蛋白酶体抑制剂硼替佐米相反，用AG490处理的Z138细胞即使在较长的温育时间后也不诱导细胞蛋白质泛素化的改变，这表明WP1130与其母体化合物AG490具有不同的作用机制。 [0196] 在WP1130温育后，观察到泛素化蛋白时间依赖性积累到Z138细胞的去污剂可溶性和不溶性两种级分中。硼替佐米不诱导不溶性泛素化蛋白的显著积累，即使在处理8小时后在去污剂不溶性级分中也仅有极小的泛素含量变化。这些结果表明，在WP1130和硼替佐米处理的细胞中具有不同的蛋白质泛素化机制和下游效应物。由于在蛋白酶体抑制后可以发生泛素化蛋白的积累，因此评估了WP1130对20S蛋白酶体活性的影响。WP1130温育（5μΜ，2小时）在体内（p值>0.07）和体外（p值>0.78）不引起蛋白酶体胰凝乳蛋白酶样活性的显著降低，而MG-132（已知的蛋白酶体抑制剂）在任一种测定体系中都显著抑制蛋白酶体活性。这些结果表明，与MG-132或硼替佐米不同，WP1130不直接阻断20S蛋白酶体的活性。氧化胁迫也已被暗示与泛素化蛋白的积累有关。然而，在WP1130处理的细胞中没有观察到活性氧物质产生的增加。 [0197] 为了进一步确定对WP1130作出响应而积累的泛素连接物，用表达带有HA标签的泛素变体（WT/仅K48/仅K63）的质粒转染HEK293T细胞。用WP1130处理HEK293T转染体，显示出含有K48和K63连接的多泛素链两者的泛素化蛋白的积累增加。蛋白酶体抑制引起含有K48连接的泛素链的蛋白的积累，而对K63连接的泛素链的影响有限。 [0198] 聚集体形成-泛素化的不溶性蛋白聚集物通常与被称为聚集体的核周结构相结合。蛋白酶体抑制、未折叠的蛋白响应、热休克响应或氧化胁迫可以引起聚集体形成。聚集体富含与多泛素化蛋白结合的HSP90/70、20S蛋白酶体和HDAC6内含物。由于在WP1130处理的细胞的去污剂不溶性级分中观察到泛素化蛋白的快速积累，因此进行了亚细胞分级以鉴定在处理后富集泛素化蛋白的亚细胞区室。尽管所有细胞级分都显示出泛素化蛋白含量的一些变化，但WP1130处理的细胞的细胞骨架区室显示出泛素化蛋白偶联物的显著积累。亚细胞分级研究显示，聚集体标志物蛋白存在于在WP1130处理后富集泛素化蛋白的细胞骨架级分中。为了证实WP1130处理诱导真正的聚集体形成，用关键的聚集体标志物例如泛素、DAC6和20S蛋白酶体对HEK293细胞进行染色。在WP1130处理的细胞中，观察到与聚集体标志物共定位的多泛素化蛋白的靠近核的沉积。 [0199] WP1130起到脱泛素酶抑制剂的作用–细胞脱泛素酶的抑制可以在不存在蛋白酶体抑制的情况下引起高分子量泛素化蛋白的增加。在用5μΜ WP1130处理2小时的Z138细胞中，观察到单体泛素的快速贫化，并且随后未锚定/游离多泛素链（Ub4-5）的水平在用WP1130处理的细胞中增加。相反，硼替佐米处理不显著影响游离泛素或未锚定泛素链的水平。这一观察结果表明，WP1130可能降低泛素的再循环，并通过抑制脱泛素酶活性来积聚泛素化蛋白。为了在处理过的细胞中直接评估WP1130对DUB活性的影响，将来自于对照细胞和处理过的细胞的细胞裂解物与泛素-AMC温育，并测定作为底物切割的结果而产生的荧光作为DUB活性的指示。将Z138细胞用5μΜ WP1130、50nM硼替佐米、1mM NEM处理1、2或4小时或不处理，然后将提取物（5μg）与产荧光的底物温育。到4小时止，用WP1130进行的处理使Z-138细胞中的DUB活性显著降低近50%（p值0.0095）。有趣的是，在硼替佐米处理的细胞中没有观察到DUB活性的变化，而NEM（已知的DUB抑制剂）在1小时内将细胞DUB活性抑制80%。 [0200] 评估了WP1130处理对纯化的K48连接或K63连接的多泛素链的体外脱泛素化/解体的影响。将来自于WP1130处理的（2hr）或未处理的细胞的裂解物与1μg未锚定的多泛素链在37℃下温育5、10和15min。与使用来自于WP1130处理的细胞的裂解物所观察到的有限的解体相反，来自于未处理的细胞的裂解物表现出多泛素链的几乎完全的解体。在WP1130处理的细胞的裂解物中K48和K63连接的多泛素链两者的链解体的缺乏，与前面观察到的在WP1130处理后两种类型的泛素连接物的积累增加相一致。这些结果表明，WP1130处理抑制了K48和K63特异性泛素连接物两者的分解所需的细胞DUC酶。 [0201] WP1130在体外抑制脱泛素酶-带血凝素标签的泛素乙烯基甲基砜（HA-UbV）起到DUB自杀底物的作用，与活性DUB酶形成共价加成物。正如前面在各种细胞类型中所示，通过抗HA抗体印迹可以鉴定特定的细胞DUB。特定DUB活性的改变可以通过监测来自于对照和处理细胞的裂解物中的HA标记来测定。将Z138细胞用1、5或10μΜ的WP1130或250μΜ的AG490处理1小时并裂解。将20μg澄清的上清液与200nM HA-UbVS在37℃下温育1小时。在用WP1130处理的细胞中，观察到了代表USP9x、USP5、USP14和UCH37的DUB标记的剂量依赖性和时间依赖性降低。相反，在用AG490处理的细胞中没有观察到DUB标记的变化，这证实了母体酪氨酸磷酸化抑制剂和WP1130在活性和作用机制方面有区别。 使用细胞裂解物进行体外分析，以调查WP1130对DUB的直接抑制。简单来说，将未处理的Z138细胞裂解物与5μΜ WP1130或单独的介质在37℃温育1小时，然后用HA-UbV进行标记。细胞裂解物与WP1130的温育显示出与在完整细胞中观察到的相同的DUB的HA标记的减少，这表明WP1130引起DUB的直接抑制。 [0202] 为了确定WP1130是否直接抑制DUB活性，将纯化的DUB例如USP5、UCH-L1和UCH-L3与单独的介质或WP1130在37℃下在DUB缓冲液中温育30min。将USP9x从Z138细胞裂解物中免疫沉淀出来，制备在DUB缓冲液中，并将珠子与单独的介质或WP1130温育30min。向每个反应添加Ub-AMC（500nM），并且每分钟监测荧光直至30分钟。将在对照和WP1130处理的DUB中在底物切割的线性阶段结束时观察到的最大荧光用作计量标准来估算DUB活性和抑制百分率。用5μΜ WP1130处理使USP9x、USP5和UCH-L1的活性降低 80%或更高。没有观察到对UCH-L3活性的抑制，这表明WP1130可能是部分选择性的。使用HA-UbV标记证实了USP5活性的丧失，所述标记研究证实了在与WP1130温育后HA标记减少约80%。 [0203] DUB调节促凋亡和抗凋亡蛋白的水平-已知USP5在维持未锚定多泛素链的水平中发挥重要作用。已报道，由于与泛素化p53竞争的游离多泛素链的积累，USP5的丧失使p53稳定。在淋巴瘤和其他肿瘤中，MCL-1和USP9x的增加的水平之间存在正相关性。siRNA介导的USP9x抑制引起MCL-1的快速降解以及肿瘤细胞对凋亡刺激物的敏感化。 [0204] 在WP1130处理后，观察到p53蛋白水平的增加。用环己酰亚胺（50μg/mL）和WP1130共处理Z138细胞，证实了p53蛋白的稳定化而不是诱导。此外，在WP1130处理后观察到MCL-1水平的快速降低。为了再次证实USP9x和USP5分别在MCL-1和p53水平的调控中发挥的作用，在HEK293T细胞中执行了基于siRNA的USP9x和USP5抑制。USP9x的丧失导致MCL-1水平降低约50%，而USP5的丧失显示出p53水平增加约2倍。这些结果合在一起证实了WP1130抑制选择性细胞DUB活性，调控抗凋亡和促凋亡蛋白的稳定性。 [0205] WP1130对DUB的抑制诱导凋亡-WP1130含有α,β-不饱和羰基，据推测所述α,β-不饱和羰基可以通过迈克尔加成反应与在DUB活性位点中存在的半胱氨酸的巯基相互作用（参见例如Straus等，Medicinal Research Reviews,21:185-210(2001)）。然而，类似的羰基存在于AG490中，但是这种分子在细胞中不具有明显的DUB抑制活性。在存在或不存在1mM DTT的情况下，将Z138细胞与0.3-5μΜ WP1130温育。有趣的是，在DTT存在下观察到WP1130诱导的凋亡及其相关的抗增殖效应的完全丧失。这一观察结果与在DTT存在下由WP1130诱导的泛素化和DUB抑制的丧失相关联。在DTT存在下WP1130诱导的凋亡和DUB抑制活性的丧失表明，WP1130对活性DUB的抑制直接造成了WP1130的凋亡效应。 [0206] WP1051和WP1052是WP1130的两个早期的化学类似物。尽管WP1051有效抑制肿瘤细胞增殖（但是在比WP1130更高的剂量下），但WP1052不能显示出任何抗肿瘤性质。这是意料之外的，因为WP1051和WP1052是化学上一致但结构不同的异构体。由于WP1130的凋亡/抗增殖性质与其抑制细胞DUB和诱导泛素化蛋白积累的能力相关，因此调查了WP1051和1052是否能够影响蛋白质泛素化和DUB活性。用指定浓度的WP1051和1052处理Z138细胞，显示出尽管WP1051能够以剂量依赖性方式诱导泛素化蛋白的积累，但WP1052没有显示出对泛素化蛋白的任何影响。调查了在来自于用WP1051或WP1052处理的细胞的裂解物中DUB标记的情况，并观察到尽管WP1051能够抑制对应于USP9x的DUB活性，但WP1052不显示DUB抑制。这些结果证实这类化合物对DUB的抑制表现出精确的化学结构-活性关系。 [0207] DUB抑制剂的抗病毒活性 [0208] MNV容易在原代或培养的鼠类巨噬细胞和树突状细胞中复制。在鉴定MNV进入抑制剂的尝试中，正在进行的对所参与的特定激酶的调查发现了Jak2激酶运输的一种诱导物WP1130，以及化学上相关的化合物WP1051和WP1052。 [0209] [0210] 用WP1130或WP1051但不是结构相关的WP1052化合物预处理MNV-1感染的RAW264.7细胞，在感染后8和12小时（hpi：感染后的小时数）降低了病毒滴度而不影响细胞存活性。将RAW264.7细胞铺板并允许其贴壁过夜。第二天，吸出培养基并用含有抑制剂（5μΜ WP1130、20μΜ WP1052或20μΜ WP1051）或DMSO介质对照（未处理）的培养基替换。在37℃下预温育30分钟后，将细胞在冰上用MNV-1（MOI5）感染。去除病毒，重新施加化合物8或12小时。通过噬菌斑测定法确定病毒滴度。正如通过WST-1（Roche）所测定的，细胞存活率保持在80%以上。对MNV-1感染的该抑制水平（约2log）与在用高剂量IFNα（1000U/ml）预处理的RAW264.7细胞中所观察到的抑制相似，所述IFNα是一种已知的高效抗病毒分子。MNV-1的生命周期据估计在9和12小时之间。 [0211] WP1130在复制子系统中降低诺沃克病毒（NV）的复制 [0212] 没有稳健的细胞培养系统可用于研究人类诺罗病毒的感染，所述诺罗病毒包括诺沃克病毒。因此，为了研究NV在细胞中的复制并鉴定对抗难以培养的人类诺罗病毒的抗病毒剂，开发了带有NV复制子的细胞。简单来说，含有NV的RNA基因组的克隆的cDNA共有序列的质粒NV101被工程化改造成在主要的衣壳蛋白ORF2内编码新霉素抗性基因。得到的质粒被命名为pNV-Neo。将来自于pNV-Neo的RNA转录本转染到Huh-7中。在G418存在下选择存活的细胞集落，并命名为HG23细胞。全长基因组和亚基因组NV RNA物质（正义和反义）以及非结构蛋白的表达分别通过RNA印迹分析和免疫荧光测定法和蛋白质印迹分析来证实。使用带有复制子的细胞来检查WP1130的抗NV效应。将HG23细胞用5μΜ WP1130处理以检查它对NV复制的影响。在这项研究中，使用强效的抗病毒分子α-干扰素（IFN）作为阳性对照。在处理后48小时，使用qRT-PCR分析NV基因组。制备总RNA用于定量实时PCR，以检测NV基因组和β-肌动蛋白。与模拟物（mock）处理进行比较来计算由抑制剂引起的NV基因组的降低，随后将每个基因组水平用β-肌动蛋白的水平进行归一化。使用细胞毒性测定试剂盒（AnaSpec，San Jose，CA）监测WP1130对HG23细胞的非特异性细胞毒性效应。在5μΜ下，WP1130在HG23细胞中显示出显著的抗NV效应，与IFNα所观察到的水平相似。然而，在HG23细胞中，只有在高于10μΜ的浓度下才观察到化合物相关的细胞毒性。因此，WP1130具有针对鼠类和人类诺罗病毒的抗病毒活性，所述病毒是一类目前尚无抗病毒药物可用的病毒。 [0213] WP1130具有广泛的抗病毒活性 [0214] 基于WP1130阻断诺罗病毒复制的数据，调查了它是否还表现出更广泛的抗病毒活性。使用一系列具有RNA基因组的病毒表明，WP1130还阻断脑心肌炎病毒（EMCV）、辛德毕斯病毒（SiNV）、拉克罗斯病毒（LaCV）的感染，但是不阻断水泡性口炎病毒（VSV）的感染。EMCV是小核糖核酸病毒科中的(+)-正义RNA病毒，所述小核糖核酸病毒科是与杯状病毒（包括诺罗病毒）最密切相关的病毒科。辛德毕斯病毒是披膜病毒科（与美洲发现的东部/西部/委内瑞拉马脑炎病毒相关）中的(+)-正义RNA病毒。B类拉克罗斯病毒和水泡性口炎病毒是具有(-)正义基因组的RNA病毒，它们分别是布尼亚病毒科（例如汉坦病毒、里夫特裂谷热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒）和弹状病毒科（例如狂犬病病毒）的成员。尽管病毒基因组的极性似乎不决定WP1130的有效性，但该数据证实了WP1130具有广泛的抗病毒潜力。更重要的是，WP1130对含有A类（汉坦病毒、里夫特裂谷热病毒）、B类（东部/西部/委内瑞拉马脑炎病毒）和C类（狂犬病、克里米亚-刚果出血热病毒）因子的病毒科的成员具有活性。 [0215] WP1130的抗细菌活性 [0216] 单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）是革兰氏阳性杆状细菌，其在消耗污染过的食物后引起可能致命的李斯特菌病。它是兼性细胞内病原体，感染非吞噬细胞和吞噬细胞，包括鼠类巨噬细胞系RAW264.7。在细菌从吞噬体逃脱后，发生细胞内复制。由于其在细胞内的生活方式，测试了WP1130对抗这种食物传播的病原体的有效性。在用WP1130预处理后，将鼠类巨噬细胞用单核细胞增多性李斯特菌感染，或者在感染后用这种化合物处理以作为对照。将RAW264.7细胞铺板并允许其贴壁过夜。第二天，吸出培养基并用含有5μΜ WP1130或DMSO介质对照的培养基替换。在37℃下预温育30分钟后，将细胞在37℃下用单核细胞增多性李斯特菌菌株10403S（MOI1）感染30分钟。将细胞在PBS中洗涤三次，并向细胞加回含有10μg/ml庆大霉素和WP1130的培养基。对于后处理来说，在感染后1小时施加WP1130。在感染后8小时，将RAW264.7细胞裂解在无菌水中，并将细菌铺板在生长培养板上。在37℃温育24小时后测定菌落形成单位（CFU），并用介质对照进行归一化。正如通过WST-1（Roche）所测定的，细胞存活率保持在80%以上。当用WP1130预处理细胞时，与介质对照或后处理相比，能够生长的细菌显著减少。有趣的是，感染后1小时的WP1130处理不引起菌落形成单位的降低，这表明化合物影响李斯特菌生活周期中的早期时间点。这些数据证实，除了抗病毒活性之外，WP1130还具有抗细菌性质，使其成为广谱抗微生物剂的良好候选物。 [0217] WP1130的抗寄生虫活性 [0218] 刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种寄生性原生动物，并且是弓形虫病的病原体。目前防止和治疗弓形虫病的药物表现出有限的功效和潜在严重的副作用。刚地弓形虫是专性细胞内病原体，其事实上感染任何有核细胞。所述寄生虫具有两种形式，即速殖子和裂殖子。单倍体速殖子快速分裂并可逆地转化成潜伏的裂殖子以产生细胞内组织囊肿这种慢性感染的标志。在感染期间，弓形虫产生被称为寄生泡的亚细胞区室，寄生泡起到用于调节宿主细胞功能的平台的作用。因此，对WP1130的抗寄生虫功能进行了测试。 [0219] 在WP1130或介质对照存在下，将原代人类包皮成纤维细胞（HFF）用速殖子感染24小时。将HFF细胞铺板并允许其贴壁过夜。第二天，吸出培养基并用含有5μΜ WP1130或DMSO介质对照的培养基替换。在WP1130或DMSO介质对照存在下，向室玻片的每个孔添加5 1.25x10 个速殖子（RH株）（MOI=1）。在感染后24小时，将细胞在4%聚甲醛中固定15分钟。然后将细胞用PBS洗涤，并通过免疫荧光显微术进行分析。将寄生虫用抗SAG1抗体（刚地弓形虫的免疫显性表面抗原）、然后用Alexa594标记的第二抗体和DAPI染色。对于定量分析来说，对寄生虫/寄生泡的数量进行计数。感染的细胞的免疫荧光分析显示，WP1130显著降低每个寄生泡的寄生虫数量，这证实了WP1130阻断寄生虫复制。这些数据合在一起证实了WP1130在包括原代细胞的多种不同细胞类型中并针对各种不同的病原体表现出抗微生物活性。 [0220] WP1130衍生物的抗病毒活性 [0221] 将RAW264.7细胞或来自于Swiss Webster小鼠的骨髓来源的原代巨噬细胞铺板并允许其贴壁过夜。第二天，吸出培养基并用含有抑制剂（5μΜ WP1130或5μΜ WPDTT）或DMSO（介质对照）的培养基替换。将细胞用IFN-β处理，作为抗病毒阳性对照。在37℃下预温育30分钟后，将细胞在冰上用MNV-1（MOI5）感染。去除病毒并重新施加化合物8或12小时。与WP1130相比，使用WPDTT观察到类似的病毒滴度降低。 [0222] WP1130的没有宿主细胞毒性的抗病毒活性 [0223] 将RAW264.7细胞用浓度增加的WP1130预处理，然后进行MNV-1感染。在感染后12小时，对每种浓度的病毒滴度和细胞存活率（WST-1存活率测定，Roche）进行比较。据估算，抗病毒EC50活性为1.9μΜ，而存活率的IC50据估算为约7.6μΜ。使用这些数值计算到治疗指数为约4.0。 [0224] WP1130增加蛋白质泛素化并降低Usp9x DUB活性 [0225] 将RAW264.7细胞用5μΜ WP1130处理2小时，然后通过对SDS-PAGE分离的等蛋白量细胞裂解物（20μg）进行免疫印迹并用抗泛素抗体探测来评估泛素化蛋白的水平。将RAW264.7细胞与5μΜ WP1130或单独的介质（对照）温育2小时，然后制备细胞裂解物并将其与HA-UbVS（200ng）继续温育1小时。使用HA印迹来检测DUB活性。随后对细胞膜的Usp9x进行印迹分析。结果证实，在RAW264.7细胞中，WP1130温育引起Usp9x抑制。还对HEK293裂解物的Usp9x进行了免疫印迹分析。 [0226] WP1130抑制MNV-1感染诱导的DUB活性 [0227] 将RAW264.7细胞留置不处理或用指定浓度的WP1130处理2小时，然后将细胞用模拟物感染或用MNV-1感染（MOI=5）。将细胞在37℃下继续温育2小时，然后制备细胞裂解物并将其与HA-UbVS（200ng）继续温育1小时。使用HA印迹分析来检测DUB活性。MNV-1感染增加了数种DUB的活性。结果还证实，抗病毒有效的WP1130浓度阻断由MNV-1感染诱导的DUB活性。较低浓度的WP1130（1.25μΜ）不能有效阻断MNV-1或与MNV-1感染相关的DUB活化。这些结果表明，WP1130的抗病毒活性与阻断由MNV-1感染诱导的DUB活化相关。 [0228] 化学合成路线 [0229] 本文公开的化合物可以通过化学领域的普通技术人员容易获得的任何手段来制备。下文中，在下面的反应路线中示出了一些化合物的建议路线，并且普通技术人员可以容易地修改这些合成反应路线以获得本文所描述的化合物。 [0230] [0231] [0232] [0233] 1-(4-(甲氧基甲氧基)-苯基)-1-丁酮（2）。在氮气和室温下，向二甲氧基甲烷（41.7g，548mmol）和4-羟基苯丁酮（1；5.0g，30.5mmol）在二氯甲烷（180mL）中的搅拌后的溶液加入五氧化二磷（21.6g，152mmol）。在48小时后，将混合物倒入～500mL冰冷的2M碳酸钠水溶液中并充分搅拌。将水层重新导入反应烧瓶以与深色残留的淤浆反应（发泡），然后与后处理混合物重新合并。在充分混合后，允许层分离。抽出有机层，并将水层用少量二氯甲烷提取。将合并的提取液用水、然后用饱和盐水洗涤，并在硫酸镁上干燥。在真空中去除溶剂，得到5.7g透明的琥珀色油状物。将产物在硅胶柱（35x75mm）上快速层析，用8：1：1的Hxa/EtOAc/丙酮洗脱，得到通过TLC鉴定为均质的、Rf=0.40的4.1g（65%）稀薄的透明无色油状物，以及1g纯度略低的透明黄色油状物。 [0234] 1-(4-(甲氧基甲氧基)苯基)-1-丁酮肟（3）。向1-(4-(甲氧基甲氧基)-苯基)-1-丁酮（4.1g，19.7mmol）和吡啶（94.67g，59.1mmol）在乙醇（30mL）中的搅拌后的溶液加入盐酸羟胺（2.7g，39.4mmol），将混合物加热至回流1.5小时，然后允许其冷却。通过在减压下浓缩去除大部分乙醇，并将残留物在水与二氯甲烷之间分配。使层分离，并用二氯甲烷提取水相2次。将合并的提取液用水洗涤两次，然后用饱和盐水洗涤，并在硫酸镁上干燥。在真空中去除溶剂，留下5.1g略微云雾状的无色浆料，将其在硅胶柱（50x70mm）上快速层析，用8：1：1的Hxa/EtOAc/丙酮洗脱，得到3.4g（77%）雪白的结晶固体；mp74-76℃。 [0235] 1-(4-(甲氧基甲氧基)苯基)-1-丁胺（4）。在室温和氮气下，向氢化锂铝（1.83g，45.7mmol）在四氢呋喃（100mL）中的搅拌后的悬液逐滴加入1-(4-(甲氧基甲氧基)苯基)-1-丁酮肟（3.4g，15.2mmol）在四氢呋喃（50mL）中的溶液。在初始的发泡消退后，将混合物逐渐加热至回流。在回流7小时后，允许混合物冷却，并向混合物加入另外1.0g氢化锂铝，将其重新加热回流4小时，然后再次允许其冷却。加入另外0.2g氢化锂铝，并将混合物重新加热回流1小时，然后使其冷却。逐滴加入3mL水，然后是3mL15%氢氧化钠水溶液，然后是9mL水。在搅拌直至沉淀物良好成粒后，将混合物过滤，并将残留物用四氢呋喃洗涤两次。将滤液/洗涤液在真空中浓缩，将残留物溶解在二氯甲烷中并在硫酸镁上干燥。 在真空中去除溶剂，留下2.9g略带紫色的浆料残留物，将其在硅胶柱（50x90mm）上快速层析，用8：1：1的Hxa/EtOAc/丙酮洗脱，得到0.4g作为透明金色油状物的纯产物，以及1.4g（合计57%）纯度略低的材料。 [0236] 2-氰基-N-(1-(4-(甲氧基甲氧基)苯基)丁基)乙酰胺（5）。在冰浴温度和氮气下，向已添加1-2滴DMF的氰基乙酸（0.67g，7.9mmol）在四氢呋喃（15mL）中的搅拌后的溶液逐滴加入草酰氯（1.03g，8.15mmol）。将混合物搅拌1小时，然后在冰浴温度和氮气下，作为一个部分缓慢添加到1-(4-(甲氧基甲氧基)苯基)-1-丁胺（1.1g，5.3mmol）在THF（15mL）中的搅拌后的溶液。使混合物逐渐加温至室温，并在20小时后在50mL饱和碳酸氢钠水溶液中搅拌，并用二氯甲烷提取3次。将合并的提取液用饱和盐水洗涤，在硫酸镁上干燥并在真空中浓缩，留下1.5g深紫色浆料。将产物在硅胶（43-60μm）柱（50x70mm）上快速层析，用1：1的Hxa/EtOAc洗脱，得到1.0g（69%）透明深色油状物，通过TLC检测为均质的。 [0237] (E)-3-(6-溴吡啶-2-基)-2-氰基-N-(1-(4-(甲氧基甲氧基)苯基)丁基)丙烯酰胺（6）。在室温下，向2-氰基-N-(1-(4-(甲氧基甲氧基)苯基)丁基)乙酰胺（276mg，1.0mmol）在乙醇/水（28mL/17mL）中的搅拌后的溶液相继加入β-丙氨酸（1.42g，16mmol）和6-溴吡啶-2-甲醛（744mg，4mmol）。72小时后，TLC（在25%EtOAc/己烷中）显示出单一产物和一些起始原料。将混合物在碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯之间分配。将分离的有机层用饱和盐水洗涤，使用硫酸钠干燥并浓缩，得到作为粗产物的浅琥珀色油状物（830mg）。 将粗品材料通过快速层析进行纯化，得到作为黄色油状物的标题化合物（253mg），得率为 1 57%。H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.59(dd,J=7.9,7.5Hz,1H),7.52(d,J=8.0Hz,1H),7.27(d,J=8.6Hz,2H),7.22(d,J=7.4Hz,1H),6.96(d,J=8.6Hz,2H),6.82(s,1H),5.19(s,2H),3.85(t,J=7.6Hz,1H),3.49(s,3H),1.67(m,2H),1.39(m,2H),0.94(t,J=7.3Hz,3H)；质谱ES+；m/+ z=444.0(m+1)和466.0(m+Na)。 [0238] (E)-(6-溴吡啶-2-基)-2-氰基-N-(1-(4-羟基苯基)丁基)丙烯酰胺（7）。将3-(6-溴吡啶-2-基)-2-氰基-N-(1-(4-(甲氧基甲氧基)苯基)丁基)丙烯酰胺（14mg， 0.031mmol）溶解在HCl/MeOH（1.25M，2mL）中。将该溶液在室温下搅拌18小时。TLC（在 50%EtOAc/己烷中）显示单一产物。将混合物在碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯之间分配。将分离的有机层用饱和盐水洗涤，使用硫酸钠干燥并浓缩，得到作为粗产物的浅琥珀色油状物（20mg）。将粗品材料通过制备型TLC进行纯化，得到作为浅黄色固体的标题化合物（12mg）， 1 得率为95%。H NMR(500MHz,CDCl3/CD3OD)δ7.55(dd,J=7.8,7.5Hz,1H),7.48(d,J=8.0Hz,1H),7.18(d,J=7.4Hz,1H),7.07(d,J=7.4Hz,2H),6.78(s,1H),6.68(d,J=8.3Hz,1H),3.78 1 (t,J=7.6Hz,1H),1.62(m,2H),1.34(m,2H),0.88(t,J=7.3Hz,3H)。H NMR(500MHz,CDCl3/CD3OD)δ161.9,157.2,151.4,142.0,140.8,139.0,131.9,129.4,128.9,124.5,116.5,115+ .8,115.2,49.5,29.2,20.09,13.7；质谱ES+；m/z=422(m+Ma)；mp（195℃分解开始）。元素分析：C=56.73%，H=4.51%，N=10.33%（计算值为：C=57.01%，H=4.53%，N=10.50%）。 [0239] 3-(6-溴吡啶-2-基)-2-氰基-N-(1-(4-甲氧基苯基)丁基)丙烯酰胺（8和9）：向3-(6-溴吡啶-2-基)-2-氰基-N-(1-(4-羟基苯基)丁基)丙烯酰胺（21mg，0.05mmol）在丙酮中的溶液加入MeI（32.6μL，0.52mmol）和碳酸钾粉末（7.25mg，0.05mmol）。将得到的混合物在室温下搅拌4小时，然后加入乙酸乙酯。然后将有机溶液用水（1x）、饱和盐水（1x）洗涤，在硫酸钠上干燥并浓缩，得到作为粗产物的黄色油状物。将粗品材料用制备型TLC板进行纯化，得到作为浅黄色固体的(E)-3-(6-溴吡啶-2-基)-2-氰基-N-(1-(4-甲氧基苯基)丁基)丙烯酰胺（8）（9.2mg，得率42%）和作为白色固体的(Z)-3-(6-溴吡啶-2-基)-2-氰基-N-(1-(4-甲氧基苯基)丁基)丙烯酰胺（9）（4.4mg，得率20%）。质+ 1 谱ES+，m/z=414.0(m+H)。E-异构体（8)：H NMR(500MHz,CDCl3/CD3OD)δ7.59(t,J=7.7,1H),7.52(d,J=8.0,1H),7.27(d,J=8.7,2H),7.22(d,J=7.4,1H),6.83(d,J=8.9,2H),6.81(s,1H),3.89-3.83(m,2H),3.81(s,3H),1.65(dd,J=15.4,7.9,2H),1.39(dd,J=15.1,7.5,2H) 1 ,0.94(t,J=7.4,3H)。Z-异构体（9）：H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.83(s,1H),7.79(d,J=7.6,1H),7.61(t,J=7.8,1H),7.52(d,J=7.9,1H),7.15(d,J=8.8,2H),6.93(d,J=8.8,2H),3.84(s,3H),3.84-3.79(m,2H),1.57(dd,J=14.8,7.1,5H),1.37(dq,J=15.0,7.5,2H),0.94(t,J=7.4,3H)。 [0240] (E)-2-氰基-3-(1H-咪唑-2-基)-N-(1-(4-(甲氧基甲氧基)苯基)丁基)丙烯酰胺（10）：在室温下，向2-氰基-N-(1-(4-(甲氧基甲氧基)苯基)丁基)乙酰胺（5；27.6mg，0.1mmol）在乙醇/水（2.0mL/0.8mL）中的搅拌后的溶液相继加入β-丙氨酸（71.3mg， 0.8mmol）和1H-咪唑-2-甲醛（19.2mg，0.2mmol）。72小时后，TLC（在50%EtOAc/己烷中）显示出形成单一产物。将混合物在碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯之间分配。将分离的有机层用饱和盐水洗涤，使用硫酸钠干燥并浓缩，得到作为粗产物的浅琥珀色油状物（55mg）。将 1 粗品材料通过柱层析进行纯化，得到作为黄色油状物的标题化合物（23mg），得率为65%。H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.59(s,1H),8.14(s,1H),7.42(s,1H),7.23(s,1H),7.17-7.13(m,2H),7.12-7.07(m,2H),5.22(s,2H),3.86-3.75(m,2H),3.51(s,3H),1.64-1.53(m,2H),1.36+ (m,2H),0.93(t,J=7.3,3H)。质谱ES+,m/z=355.1(m+H)。 [0241] (E)-2-氰基-N-(1-(4-羟基苯基)丁基)-3-(1H-咪唑-2-基)丙烯酰胺（11）：将(E)-2-氰基-3-(1H-咪唑-2-基)-N-(1-(4-(甲氧基甲氧基)苯基)丁基)丙烯酰 胺（14.8mg，0.041mmol）溶解在HCl/MeOH（1.25M，2mL）中。将该溶液在室温下搅拌18小时。TLC显示单一产物。将混合物在碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯之间分配。将分离的有机层用饱和盐水洗涤，使用硫酸钠干燥并浓缩，得到作为粗产物的浅琥珀色固体（9mg）。将粗品材料从乙酸乙酯/己烷重结晶，得到作为浅黄色固体的标题化合物（6mg），得率为46%。 1 H NMR(500MHz,CDCl3/CD3OD)δ7.84(m,1H),7.28(m,1H),7.18(s,1H),6.99(d,J=6.8,2H), 6.82(d,J=7.8,2H),3.73(m,2H),1.53(m,2H),1.30(m,2H),0.88(t,J=7.1,3H)。质谱ES+,m/+ z=311.1(m+H)。 [0242] 1-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)-1-丙酮（13）：在氮气和室温下，向4-羟基苯丙酮（12；2.5g，16.7mmol）在二甲基甲酰胺（25mL）中的搅拌后的溶液加入碳酸铯(5.7g，17.5mmol），然后加入溴甲基甲醚（1.43g，17.5mmol）。20小时后，将混合物在200mL水中搅拌，然后用二氯甲烷提取三次。将合并的提取液用水、然后用饱和盐水洗涤，并在硫酸镁上干燥。在真空中去除溶剂，留下3.4g浅黄色的明显结晶的固体；mp31-35℃；质谱ES+m/z=209(m+1)。 [0243] 1-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)-1-丙酮肟（14）：向1-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)-1-丙酮（3.4g，16.3mmol）和吡啶（3.87g，49.0mmol）在乙醇（25mL）中的搅拌后的溶液加入盐酸羟胺（2.27g，32.7mmol），并将混合物加热回流4小时，然后使其冷却。通过浓缩去除大部分乙醇，并将残留物在水和二氯甲烷之间分配。将层分离并将水相用二氯甲烷提取2次。将合并的提取液用水洗涤两次，然后用饱和盐水洗涤，并在硫酸镁上干燥。通过浓缩去除溶剂，然后将残留物溶解在甲苯中并再次浓缩；将该过程再重复一次，并将残留物在真空下干燥，得到3.52g作为奶油色结晶固体的产物；mp74-80℃；质谱ES+m/z=224(m+1)。 [0244] 1-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)-1-丙胺（15）：在室温和氮气下，向氢化锂铝（0.78g，20.55mmol）在四氢呋喃（48mL）中的搅拌后的悬液逐滴加入1-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)-1-丙酮肟（1.5g，6.7mmol）在四氢呋喃（20mL）中的溶液。18小时后将混合物加热回流3小时，然后使其冷却。逐滴加入0.8mL水，然后是0.8mL15%的氢氧化钠水溶液，然后是2.4mL水。数分钟后将混合物过滤，将残留物用四氢呋喃洗涤两次。将合并的滤液和洗涤液在真空中浓缩，留下1.34g透明金色油状物，将其在硅胶柱（5x10cm）上快速层析，用8：1：1的Hxa/EtOAc/丙酮洗脱，得到0.83g作为透明金色油状物的产物；质谱ES+m/z=210(m+1)。 [0245] 2-氰基-N-(1-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)丙基)乙酰胺（16）：在氮气和冰浴温度下，向氰基乙酸（0.107g，1.25mmol）在二氯甲烷（5mL）与2滴二甲基甲酰胺的混合物中的搅拌后的溶液加入草酰氯（0.19g，1.49mmol）。2小时后，在0-5℃下，将所述溶液作为一个部分添加到1-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)-1-丙胺（0.25g，1.2mmol）和三乙胺（0.13g，1.3mmol）在1：1的四氢呋喃/二氯甲烷（4mL）中的溶液中，并使混合物缓慢升温至室温。4小时后，加入80mL水，并在半小时后加入更多（30mL）二氯甲烷。将层分离，并将水层用另外的二氯甲烷提取。将合并的提取液用1N碳酸氢钠水溶液、然后用饱和盐水洗涤，并在硫酸镁上干燥。在真空中去除溶剂，留下云雾状琥珀色浆料，将其溶解在1：1的EtOAc/Hxa中，并在压力下通过短硅胶柱过滤。将流出液在真空中浓缩，得到0.24g作为云雾状淡琥珀色浆料的产物，其纯度足以用于下一步骤。 [0246] (E)-3-(6-溴吡啶-2-基)-2-氰基-N-(1-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)丙基)-丙烯酰胺（17）：在氮气和室温下，向6-溴-2-吡啶甲醛（0.094g，0.51mmol）和2-氰基-N-(1-(4-(2-甲氧基乙氧基)-苯基)丙基)乙酰胺（0.07g，0.25mmol）在二甲基亚砜（10mL）中的搅拌后的溶液加入叔丁醇钾（0.014g，0.127mmol）。26小时后，将混合物与水振摇，然后用乙酸乙酯提取数次。将合并的提取液用水洗涤，然后在硫酸钠上干燥。在真空中去除溶剂，留下0.10g透明的琥珀色浆料，将其在硅胶柱（5x10cm）上快速层析，利用二氯甲烷/EtOAc进行梯度洗脱（10：0逐渐变化成12：1），得到0.040g作为透明浅黄色浆料的产物；质谱ES+m/z=444,466(m+1,m+23)。 [0247] 3-(6-溴-吡啶-2-基)-2-氰 基-3-(2,3-二羟基-4-巯 基-丁基硫 烷基)-N-(1-苯基-丁基)-丙酰胺（19）：在室温下，向二硫苏糖醇（2g，13mmol）在乙腈（13mL）中的搅拌后的溶液加入WP1130（18；0.05g，0.13mmol）在乙腈（6mL）中的溶液。20小时后，TLC[Hxa/EtOAc1：1]显示出单一产物并且没有起始原料。将混合物在乙腈中通过短硅胶柱进行过滤，并将滤液在减压下脱去溶剂。获得无色浆料。将所述浆料溶解在乙酸乙酯中，并在硅胶柱（35x70mm）上在乙酸乙酯中进行快速层析，得到透明黄色油状物（0.02g），其在静置后开始结晶。质谱ES+；m/z=560,562(m+23)和538,540(m+1)。 [0248] 3-(6-溴吡啶-2-基)-2-氰基-3-((2,3-二羟基丙基)硫代)-N-((S)-1-苯基丁基)丙酰胺（20）。向WP1130（19mg，0.05mmol）在乙腈（0.5mL）中的搅拌后的溶液加入硫代甘油（42μL，0.5mmol）。将得到的混合物在室温下搅拌17小时。将混合物在水和二氯甲烷之间分配。将分离的有机层用饱和盐水洗涤，在硫酸钠上干燥并浓缩成油状物。通过制备型TLC进行纯化，使用己烷/乙酸乙酯（6：4）洗脱，得到作为透明油状物的20（20mg，+ +82%）：MS(ES)m/z492.0(M+H)。 [0249] 1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)-1-丁酮（21）。向对羟基苯丁酮（200mg，1.21mmol）在无水丙酮（6mL）中的搅拌后的溶液加入2-(二乙基氨基)乙基氯化物盐酸盐（624mg，3.65mmol），然后添加碳酸钾（668mg，4.84mmol）。将得到的混合物加热回流48小时。将混合物用乙酸乙酯稀释，用水（2x）和饱和盐水洗涤，在硫酸钠上干燥并浓缩，得到油状物。用1：1的己烷/乙酸乙酯洗脱的速硅胶柱层析提供了作为浅黄色油状物的21+ + （315mg，98%）：MS(ES)m/z264.1(M+H)。 [0250] 1-(4-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基)-1-丁酮（22）。使用为制备21所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用2-(二甲基氨基)乙基氯化物盐酸盐代替2-(二乙基氨基)乙基氯化物盐酸盐。这产生粗品油状物，将其通过硅胶柱快速层析（从1：1的己烷/乙酸乙酯到乙酸乙酯的梯度洗脱）进行纯化，得到作为浅黄色油状物的22（580mg，+ + 81%）：MS(ES)m/z236.1(M+H)。 [0251] 1-(4-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基)-1-丁酮（23）。使用为制备21所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用1-(2-氯乙基)吡咯烷盐酸盐代替2-(二乙基氨基)乙基氯化物盐酸盐。这产生粗品油状物，将其通过硅胶柱快速层析进行纯化，用3：+ + 1的己烷/乙酸乙酯洗脱，得到作为透明油状物的23（455mg，87%）：MS(ES)m/z262.1(M+H)。 [0252] 1-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)-1-丁酮（24）。使用为制备21所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐代替2-(二乙基氨基)乙基氯化物盐酸盐。这产生粗品油状物，将其通过硅胶柱层析进行纯化，用1：1的己烷/乙酸+ +乙酯洗脱，得到作为透明油状物的24（550mg，定量）：MS(ES)m/z278.1(M+H)。 [0253] 1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)-1-丁胺（25）。向1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)-1-丁酮（21；186mg，0.7mmol）和乙酸铵（1.63g，21.2mmol）在甲醇（2mL）中的悬液加入氰基硼氢化钠（155mg，3.5mmol）。然后将得到的混合物在40℃加热72小时。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，用饱和NaHCO3水溶液（2x）和饱和盐水洗涤，在硫酸钠上干燥+ +并浓缩，得到作为黄色油状物的粗品25（110mg，59%）：MS(ES)m/z265.1(M+H)。该材料不需进一步纯化即用于下一步骤。 [0254] 1-(4-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基)-1-丁胺（26）。使用为制备25所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用1-(4-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基)1-丁酮（22）代替1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)-1-丁酮（21）。这产生作为黄色油状+ +物的粗品26（410mg，73%）：MS(ES)m/z237.1(M+H)。 [0255] 1-(4-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基)-1-丁胺（27）。使用为制备25所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用1-(4-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基)-1-丁酮（23）代替1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)-1-丁酮（21）。这产生作+ +为黄色油状物的粗品27（188mg，45%）：MS(ES)m/z263.2(M+H)。 [0256] 1-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)-1-丁胺（28）。使用为制备25所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用1-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)-1-丁酮（24）代替1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)-1-丁酮（21）。这产生作为浅黄色油状物的粗品+ + 28（390mg，70%：MS(ES)m/z279.2(M+H)。 [0257] 2-氰基-N-(1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)丁基)乙酰胺（29）。向氰基乙酸（37mg，0.43mmol）在DMF（2mL）中的冰冷却的溶液加入7-氮杂-1-羟基苯并三唑（HOAt；59mg，0.43mmol）、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU；165mg，0.43mmol）、二异丙基乙胺（DIPEA；167μL，0.958mmol）和1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)-1-丁胺（25；115mg，0.43mmol）。然后将得到的混合物在室温下搅拌18小时。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，用饱和NaHCO3水溶液（2x）和饱和盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，浓缩成粘稠的黄色油状物。通过硅胶柱快速层析进行纯化，用5：95的甲醇/+ + 二氯甲烷洗脱，得到作为黄色油状物的29（116mg，80%）：MS(ES)m/z332.2(M+H)。 [0258] 2-氰基-N-(1-(4-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基)丁基)乙酰胺（30）。使用为制备29所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用1-(4-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基)-1-丁胺（26）代替1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)-1-丁胺（25）。这产生粗产物，将其通过硅胶柱快速层析进行纯化，使用5：95的甲醇/二氯甲烷洗脱，得到+ + 作为粘稠的黄色油状物的30（320mg，61%）：MS(ES)m/z304.1(M+H)。 [0259] 2-氰基-N-(1-(4-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基)丁基)乙酰胺（31）。使用为制备29所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用1-(4-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基)-1-丁胺（27）代替1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)-1-丁胺（25）。这产生粗产物，将其通过硅胶柱快速层析进行纯化，使用5：95的甲醇/二氯甲烷洗脱，得到+ + 作为粘稠的黄色油状物的31（140mg，60%）：MS(ES)m/z330.2(M+H)。 [0260] 2-氰基-N-(1-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)丁基)乙酰胺（32）。使用为制备29所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用1-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)-1-丁胺（28）代替1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)-1-丁胺（25）。这产生粗产物，将其通过硅胶柱快速层析进行纯化，使用4：96的甲醇/二氯甲烷混合物洗脱，得到作+ + 为透明油状物的32（370mg，76%）：MS(ES)m/z346.2(M+H)。 [0261] (E)-3-(6-溴吡啶-2-基)-2-氰基-N-(1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)丁基)丙烯酰胺（33）。向2-氰基-N-(1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)丁基)乙酰胺（29；116mg，0.35mmol）在乙醇（2mL）中的溶液加入β-丙氨酸（499mg，5.6mmol）和水（2mL）。加入6-溴吡啶甲醛（260mg，1.4mmol），然后将得到的混合物在室温下搅拌18小时。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，用饱和NaHCO3水溶液（2x）和饱和盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，浓缩成粗品固体。通过硅胶柱快速层析进行纯化，用5：95的甲醇/二氯甲烷洗脱，得到+ + 作为粘稠的黄色油状物的33（140mg，80%）：MS(ES)m/z=499.1(M+H)。 [0262] (E)-2-氰基-N-(1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)丁基)-3-(6-氟吡啶-2-基)丙烯酰胺（34）。使用为制备33所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用6-氟吡啶甲醛代替6-溴吡啶甲醛。这产生粗产物，将其通过硅胶柱快速层析进行+ 纯化，使用4：96的甲醇/二氯甲烷洗脱，得到作为黄色油状物的34（105mg，61%）：MS(ES)+ m/z439.2(M+H)。 [0263] (E)-3-(6-溴吡啶-2-基)-2-氰基-N-(1-(4-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基)丁基)丙烯酰胺（35）。使用为制备33所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用2-氰基-N-(1-(4-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基)-丁基)乙酰胺（30）代替2-氰基-N-(1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)丁基)乙酰胺（29）。这产生粗产物，将其通过硅胶柱快速层析进行纯化，使用4：96的甲醇/二氯甲烷洗脱，得到作为黄色油状物的+ +35（120mg，76%）：MS(ES)m/z471.1(M+H)。 [0264] (E)-2-氰基-3-(6-氟吡啶-2-基)-N-(1-(4-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基)丁基)丙烯酰胺（36）。使用为制备33所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用6-氟吡啶甲醛代替6-溴吡啶甲醛，并使用2-氰基-N-(1-(4-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基)丁基)乙酰胺（31）代替2-氰基-N-(1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)丁基)乙酰胺（29）。这产生粗产物，将其通过硅胶柱快速层析进行纯化，使用4：96的+ + 甲醇/二氯甲烷洗脱，得到作为浅黄色油状物的36（65mg，35%）：MS(ES)m/z437.2(M+H)。 [0265] (E)-2-氰基-3-(6-氟吡啶-2-基)-N-(1-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)丁基)丙烯酰胺（37）。使用为制备33所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用6-氟吡啶甲醛代替6-溴吡啶甲醛，并使用2-氰基-N-(1-(4-(2-吗啉代乙氧基)苯基)丁基)乙酰胺（32）代替2-氰基-N-(1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)丁基)乙酰胺（29）。这产生粗产物，将其通过硅胶柱快速层析进行纯化，使用4：96的甲醇/二氯甲烷洗脱，得到+ + 作为浅黄色油状物的37（130mg，77%）：MS(ES)m/z453.2(M+H)。 [0266] (E)-2-氰基-N-(1-(4-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基)丁基)-3-(1H-咪唑-2-基)丙烯酰胺（38）。使用为制备33所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用1H-咪唑-2-甲醛代替6-溴吡啶甲醛，并使用2-氰基-N-(1-(4-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基)丁基)乙酰胺（30）代替2-氰基-N-(1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)丁基)乙酰胺（29）。这产生粗产物，将其通过硅胶柱快速层析进行纯化，使用8：92的+ + 甲醇/二氯甲烷洗脱，得到作为浅黄色油状物的38（80mg，63%）：MS(ES)m/z453.2(M+H)。 [0267] [0268] (S)-2-氰基-N-(1-苯基丁基)乙酰胺（39）。使用为制备29所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用(S)-1-苯基丁胺代替1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)-1-丁胺（25）。这产生粗产物，将其通过硅胶柱快速层析进行纯化，使用7：3的己烷+ +/乙酸乙酯洗脱，得到作为白色固体的39（375mg，58%）：MS(ES)m/z217.1.1(M+H)。 [0269] (S,E)-2-氰基-3-(6-氟吡啶-2-基)-N-(1-苯基丁基)丙烯酰胺（40）。使用为制备33所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用6-氟吡啶甲醛代替6-溴吡啶甲醛，并使用(S)-氰基-N-(1-苯基丁基)乙酰胺代替2-氰基-N-(1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)丁基)乙酰胺（29）。这产生粗产物，将其通过硅胶柱快速层析进行纯+化，使用8：2的己烷/乙酸乙酯洗脱，得到作为透明油状物的40（115mg，96%）：MS(ES)m/+ z324.1(M+H)。 [0270] (S,E)-2-氰基-3-(6-氯吡啶-2-基)-N-(1-苯基丁基)丙烯酰胺（41）。使用为制备33所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用6-氯吡啶甲醛代替6-溴吡啶甲醛，并使用(S)-2-氰基-N-(1-苯基丁基)乙酰胺代替2-氰基-N-(1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)丁基)乙酰胺（29）。这产生粗产物，将其通过硅胶柱快速层析进行+纯化，使用8：2的己烷/乙酸乙酯洗脱，得到作为透明油状物的41（105mg，95%）：MS(ES)+ m/z340.1(M+H)。 [0271] (S,E)-2-氰基-3-(1H-咪唑-2-基)-N-(1-苯基丁基)丙烯酰胺（42）。使用为制备33所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用1H-咪唑-2-甲醛代替6-溴吡啶甲醛，并使用(S)-2-氰基-N-(1-苯基丁基)乙酰胺代替2-氰基-N-(1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)丁基)乙酰胺（29）。这产生粗产物，将其通过硅胶柱快速层析进+行纯化，使用1：1的己烷/乙酸乙酯洗脱，得到作为透明油状物的42（92mg，94%）：MS(ES)+ m/z295.1(M+H)。 [0272] [0273] 1-(4-(2-(2-(2-碘乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)-1-丁酮（43）。使用为制备21所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用1,2-双-(2-碘乙氧基)乙烷代替2-(二乙基氨基)乙基氯化物盐酸盐。这产生粗产物，将其通过硅胶柱快速层析进行纯+ 化，使用4：1的己烷/乙酸乙酯洗脱，得到作为透明油状物的43（3.85g，52%）：MS(ES)m/+ z407.0(M+H)。 [0274] (2-(2-(2-(4-丁酰基苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)亚胺二羧酸1,3-双-叔丁酯（44）。将二叔丁基亚胺二羧酸（3.05g，14.07mmol）和叔丁醇钾（1.58g，14.07mmol）在DMF（50mL）中搅拌15分钟，然后加入1-(4-(2-(2-(2-碘乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)-1-丁酮（43；3.81g，9.38mmol）。将得到的混合物在氮气下搅拌18小时，然后倒入200mL乙酸乙酯中。将该溶液用水（2x）和饱和盐水洗涤，在硫酸钠上干燥并浓缩，得到液体，将其通过硅胶柱快速层析进行纯化，使用3：1的己烷/乙酸乙酯洗脱，得到作为透明油+ + 状物的44（2.27g，49%）：MS(ES)m/z496.2(M+H)。 [0275] (2-(2-(2-(4-(1-氨基丁基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)亚胺二羧酸1,3-双-叔丁酯（45）。使用为制备25所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用(2-(2-(2-(4-丁酰基苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)亚胺二羧酸1,3-双-叔丁 酯（44）代替1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)-1-丁酮（21）。这产生粗产物，将其通过硅胶柱快速层析进行纯化，用乙酸乙酯洗脱，得到作为透明油状物的45（730mg，73%）： + + MS(ES)m/z497.3(M+H)。 [0276] (2-(2-(2-(4-(1-(2-氰基乙酰胺基)丁基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)亚胺二羧酸1,3-双-叔丁酯（46）。使用为制备29所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用(2-(2-(2-(4-(1-氨基丁基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)亚胺二羧酸1,3-双-叔丁酯（45）代替1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)-1-丁胺（25）。这产生粗产物，将其通过硅胶柱快速层析进行纯化，用3：2的己烷/乙酸乙酯洗脱，得到作为透明+ + 油状物的46（95mg，84%）：MS(ES)m/z564.3(M+H)。 [0277] (E)-(2-(2-(2-(4-(1-(3-(6-溴吡啶-2-基)-2-氰基丙烯酰胺基)丁基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)亚胺二羧酸1,3-双-叔丁酯（47）。使用为制备33所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用(2-(2-(2-(4-(1-(2-氰基乙酰胺基)丁基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)亚胺二羧酸1,3-双-叔丁酯（46）代替2-氰 基-N-(1-(4-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)丁基)乙酰胺（29）。这产生粗产物，将其通过硅胶柱快速层析进行纯化，用7：3的己烷/乙酸乙酯洗脱，得到作为透明油状物的47+ + （105mg，85%）：MS(ES)m/z731.2(M+H)。 [0278] N-(2-(2-(2-(4-(1-((E)-3-(6-溴吡啶-2-基)-2-氰基丙烯酰胺基)丁基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺（48）。将(E)-(2-(2-(2-(4-(1-(3-(6-溴吡啶-2-基)-2-氰基丙烯酰胺基)丁基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)亚胺二羧酸1,3-双-叔丁酯（47；105mg， 0.14mmol）与三氟乙酸（0.3mL）的混合物在二氯甲烷（3mL）中搅拌1.5小时。将溶液浓缩并将残留物溶解在N,N-二甲基甲酰胺中。在冰浴温度下，向该溶液加入D-生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯（49mg，0.14mmol）和DIPEA（75μL，0.43mmol）。将得到混合物在该温度下搅拌2小时，然后在二氯甲烷与水之间分配。将有机相用水（2x）和饱和盐水洗涤，在硫酸钠上干燥并浓缩，得到油状物。通过硅胶柱快速层析进行纯化，用7：93的甲醇/二氯甲烷洗+ + 脱，提供了作为浅黄色油状物的48（55mg，51%）：MS(ES)m/z757.2(M+H)。 [0279] (2-(2-(2-(4-(1-(2-(二乙氧基磷酰基)乙酰胺基)丁基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)亚胺二羧酸1,3-双-叔丁酯（49）。向二乙基膦酰乙酸（129μL，0.805mmol）与(2-(2-(2-(4-(1-氨基丁基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)亚胺二羧酸1,3-双-叔丁酯（45；400mg，0.805mmol）在N,N-二甲基甲酰胺（10mL）中的搅拌后的溶液加入4-二甲基氨基吡啶（DMAP；197mg，1.61mmol）与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC-HCl；309mg，1.61mmol）的混合物。将得到的混合物在氮气和室温下搅拌3小时，然后倒入100mL乙酸乙酯中。将该溶液用1NHC1水溶液（2x）和饱和盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，并浓缩成油状物。通过硅胶柱快速层析进行纯化，用乙酸乙酯洗脱，得到作为透明油状物的+ +49（540mg，定量）：MS(ES)m/z675.3(M+H)。 [0280] (E)-(2-(2-(2-(4-(1-(3-(6-溴吡啶-2-基)丙烯酰胺基)丁基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)亚胺二羧酸1,3-双-叔丁酯（50）。在冰浴温度下，向NaH（52mg，60%，在矿物油中，1.31mmol）在四氢呋喃（1.0mL）中的悬液加入(2-(2-(2-(4-(1-(2-(二乙氧基磷酰基)乙酰胺基)丁基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)亚胺二羧酸1,3-双-叔丁酯（49；295mg，0.43mmol）在四氢呋喃（2mL）中的溶液。将得到的混合物在室温下搅拌30分钟，然后用含6-溴吡啶甲醛（81mg，0.43mmol）的四氢呋喃（2mL）逐滴进行处理。将混合物继续搅拌30分钟，然后小心地用水淬灭。将溶液用乙酸乙酯（3x）提取，并将合并的有机提取液用饱和盐水洗涤，在硫酸钠上干燥并浓缩成油状物。通过硅胶柱快速层析进行纯化，用7：3+ + 的己烷/乙酸乙酯洗脱，得到作为透明油状物的50（205mg，67%）：MS(ES)m/z706.2(M+H)。 [0281] N-(2-(2-(2-(4-(1-((E)-3-(6-溴吡啶-2-基)丙烯酰胺基)丁基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺（51）。使用为制备48所描述的相似的步骤来制备标题化合物，区别在于使用丙烯酰胺50代替氰基丙烯酰胺47。这产生粗产物，将其通过硅胶柱快速层析进行纯化，用7：93的+ +甲醇/二氯甲烷洗脱，得到作为透明油状物的51（50mg，等量）：MS(ES)m/z731.2(M+H)。 [0282] 评估化合物针对DUB的活性 [0283] 在一组CML、骨髓瘤和套细胞淋巴瘤细胞系中筛选具有DUB抑制性和凋亡活性的化合物，并与WP1130进行比较。在表1中，将所选化合物对细胞生长和存活的影响与WP1130进行比较，其中更敏感的化合物是与WP1130相比具有更高的抑制活性的化合物，而更不敏感的化合物是与WP1130相比具有更低的抑制活性的化合物。还在完整细胞（表2）和分离的DUB（Usp9x-UCH结构域）酶制备物中（表3）测试了所选化合物的DUB抑制。在这些测定中使用的方法的一般性描述可以在例如下列文献中找到：Kapuria等，“新的小分子脱泛素酶抑制剂通过Jak2泛素化阻断Jak2信号转导”（A novel small molecule deubiquitinase inhibitor blocks Jak2signaling through Jak2ubiquitination），Cell Signal,2011，在印；Kapuria等，“小分子WP1130对脱泛素酶的抑制触发聚集体形成和肿瘤细胞凋亡”（Deubiquitinase inhibition by small-molecule WP1130 triggers aggresome formation and tumor cell apoptosis），Cancer Res,2010.70(22):p.9265-76；Sun等，“Bcr-Ab1泛素化和Usp9x抑制阻断激酶信号转导并促进CML细胞凋亡”（Bcr-Ab1 ubiquitination and Usp9x inhibition block kinase signaling and promote CML cell apoptosis），Blood,2011.117(11):p.3151-62；Kapuria等，“蛋白质交联是具有抗肿瘤活性的泛素活化酶抑制剂的新作用机制”（Protein cross-linking as a novel mechanism of action of a ubiquitin-activating enzyme inhibitor with anti-tumor activity），Biochem Pharmacol,2011.82(4):p.341-9；以及Bartholomeusz等，“WP1130激活新的Bcr/Ab1解体途径来诱导慢性髓细胞性白血病细胞的凋亡”（Activation of a novel Bcr/Ab1 destruction pathway by WP1130 induces apoptosis of chronic myelogenous leukemia cells），Blood,2007.109(8):p.3470-8。 [0284] 表1 [0285] [0286] 表2 [0287] [0288] 表3 [0289] [0290] 化合物的抗病毒活性 [0291] 正如在表4中所示，还针对各种病毒对化合物进行了测试。在含有复制子的细胞系中，在WP1130处理24小时后通过qRT-PCR测定诺沃克病毒基因组滴度（Chang，Sosnovtsev等，2006）。所有其他实验如下所述执行：将细胞在37℃下用5μΜ化合物预处理30min。病毒感染在冰上执行1小时，随后将未结合的病毒从细胞上洗掉。将细胞在化合物存在下继续温育8-12小时，然后通过噬菌斑测定法测定病毒滴度（Wobus,Karst等，2004）。 [0292] 对于下列病毒来说，当通过噬菌斑测定法测定时，用WP1130预处理细胞（使用5μΜ预处理30min）导致病毒滴度降低2-2.5log：鼠类诺罗病毒，拉克罗斯病毒，脑心肌炎病毒和辛德毕斯病毒。此外，在复制子细胞系中，对于人类诺罗病毒诺沃克病毒来说，通过qRT-PCR也观察到病毒基因组滴度降低50%。这种效应不依赖于细胞类型，因为测试了多种细胞系（鼠类巨噬细胞RAW264.7，原代鼠类巨噬细胞，非洲绿猴肾上皮细胞Vero，人类神经元细胞Be2-c，人类肝细胞Huh-7细胞）。 [0293] 在RAW264.7细胞和Be2-c细胞中，使用化合物33，通过噬菌斑测定法分别对鼠类诺罗病毒和拉克罗斯病毒观察到了病毒滴度的类似降低（2-2.5log）。 [0294] 其他化合物仅仅在RAW264.7细胞中通过噬菌斑测定法针对鼠类诺罗病毒进行了测试。化合物35、40和41使病毒滴度降低2log。化合物38和42有效性较低，使病毒滴度降低0.5log。 [0295] 其他化合物仅仅在RAW264.7细胞中通过噬菌斑测定法针对鼠类诺罗病毒进行了测试。化合物35、41、40、34和36使病毒滴度降低2log。化合物37有效性较低，使病毒滴度降低1log，而38和42使病毒滴度降低0.5log。 [0296] 在噬菌斑测定中，生物素化的化合物48使鼠类诺罗病毒滴度降低1.5log，而生物素化的无效探针51不降低鼠类诺罗病毒的滴度。 [0297] 表4 [0298] [0299] 化合物的抗真菌活性 [0300] WP1130还在原代人类包皮成纤维细胞中阻断顶复门刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）的复制。将细胞用WP1130处理并用速殖子（RH株）（MOI1）感染24小时，然后进行免疫荧光和含寄生虫的寄生泡的计数。观察到仅含1个寄生虫的寄生泡数量增加～3倍，并且含有4个寄生虫的寄生泡数量减少～5倍。 [0301] 化合物的抗细菌感染活性 [0302] 用5μΜ WP1130处理RAW264.7巨噬细胞导致在感染8小时后单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）滴度降低3-10倍，正如通过随时间推移测定细胞内的菌落形成单位所确定的。将巨噬细胞以1的MOI暴露于细菌接种物30min。在WP-1130处理和感染之前用脂多糖和γ-干扰素活化的骨髓来源的原代巨噬细胞中，观察到类似效应。WP1130处理也使感染8小时后耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）在RAW264.7巨噬细胞中的存活率降低3-4倍。在HeLa人类宫颈上皮细胞中，在MRSA感染期间也观察到类似效应。对于MRSA来说，在RAW264.7细胞中，使用化合物33和40也观察到细菌存活率的类似降低。 |
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