[0001] 本发明涉及抑制由端粒酶引起的DNA延伸反应的方法。

[0002] 端粒(Telomere)是由位于真核生物的染色体两个末端部分的DNA和各种蛋白质组成的结构。在人的情况下，处于该端粒部分的DNA(以下简单称为“端粒DNA”)以5’-TTAGGG-3’(序列号：1)的6个碱基的重复序列的形式大约存在1万个碱基对，在3’末端突出100个碱基左右(overhang：悬端)而形成单链。

[0003] 根据迄今为止的研究可知，通常的体细胞中的端粒DNA每逢进行细胞分裂就会变短，如果到了5000个碱基对左右，则到达分裂寿命的极限，不能再进行分裂的细胞最终凋亡。

[0004] 但是，另一方面，已知在70～80％的癌细胞中，将变短的端粒DNA再次延伸的端粒酶的活性非常高，从而使该细胞不会达到分裂寿命而持续分裂。因此，近年来，由该端粒酶引起的端粒DNA延伸反应(以下简单称为“端粒酶反应”)据认为是在癌治疗中的重要标的，对该反应的抑制剂和抑制方法的研究也在积极的进行中。

[0005] 各种端粒酶反应的抑制方法被提出，其中，有通过稳定G-quadruplex结构的抑制方法。所谓G-quadruplex结构，是由富含鸟嘌呤碱基的DNA序列形成的四链DNA结构，端粒DNA序列(5’-TTAGGG-3’，序列号：1)的单链部分也是能够形成G-quadruplex结构的序列。

[0006] 由于端粒酶不能与G-quadruplex结构结合，所以，如果能够使G-quadruplex结构在端粒DNA中稳定地存在，就能够抑制端粒酶反应。因此，迄今为止，提出了通过利用各种化合物来稳定G-quadruplex结构的端粒酶反应抑制方法。

[0007] 在专利文献1中报告了由吡唑啉酮衍生物产生的端粒酶反应抑制效果。在专利文献2中报告了由通式：具有季氮原子的含氮芳香环-(NR3)p-CO-分配剂-(CO)m-(NR’3)q-X-芳香环或非芳香环构成的化合物产生的端粒酶反应抑制效果。另外，在专利文献3中报告了由下述(化1)结构组成的化合物产生的端粒酶反应抑制效果。

[0008] [化1]

[0009]

[0010] 在非专利文献1、非专利文献2、非专利文献3中分别报告了由端粒酶素(Telomestatin)、Phen-DC3、360A产生的端粒酶反应抑制效果。另外，还在非专利文献4中报告了由TMPyP4产生的端粒酶反应抑制效果。在这些以外，还报告了例如二萘嵌苯衍生物和喹啉及喹啉相关物质具有同样的抑制效果。

[0011] 专利文献1：日本特开2005-289874号公报

[0012] 专利文献2：日本特表2006-518726号公报

[0013] 专利文献3：日本特表2004-505082号公报

[0014] 非专利文献1：J.Am.Chem.Soc.(2002)124，2098-2099

[0015] 非专利文献2：J.Am.Chem.Soc.(2007)129，1856-1857

[0016] 非专利文献3：Oncogene(2005)24，2917-2928

[0017] 非专利文献4：J.Am.Chem.Soc.(1998)120，3261-3262

[0018] 在上述抑制端粒酶反应相关的化合物中，最重要的一点是必须不与双螺旋结构的DNA相互作用，而与G-quadruplex结构特异性地结合。

[0019] 这是由于大多数基因组DNA都是双螺旋结构，这些化合物与基因组DNA非特异性地相互作用就会造成细胞毒性。更具体而言，如果这些化合物对双螺旋结构的DNA也非特异性地结合的话，甚至会抑制在DNA复制中所必须的由聚合酶进行的DNA延伸反应。

[0020] 迄今为止，出于通过稳定G-quadruplex结构来抑制端粒酶反应的目的而开发的化合物都是电中性或阳离子性的。这是因为DNA本身是阴离子性，所以，从与G-quadruplex结合的观点来考虑，阴离子性化合物会引起静电排斥，认为在结合反应中是不利的。因此，以通过稳定G-quadruplex结构来抑制端粒酶反应作为目的时，没有考虑使用阴离子性化合物。

[0021] 在以上的背景下，本发明的发明人进行了深入研究，结果发现，阴离子性的酞菁和G-quadruplex结构特异性地相互作用，且具有很高的端粒酶反应抑制效果，从而完成了本发明。

[0022] 解决上述课题的本发明涉及一种端粒酶反应抑制方法，抑制由端粒酶引起的DNA延伸反应，其特征在于，以阴离子性酞菁作为端粒酶抑制剂，使之与作为端粒酶底物的DNA反应。

[0023] 具体而言，本发明涉及的端粒酶反应抑制方法，在含有端粒酶、作为端粒酶反应底物的DNA和dNTP的溶液(多数情况下是缓冲液)中添加阴离子性酞菁。

[0024] 上述阴离子性酞菁优选具有选自羧基、羧基的金属盐、磺基和磺基的金属盐中的至少一种官能团。

[0025] 上述阴离子性酞菁优选是配位有选自铜、锌、钴和镍中的至少一种金属的阴离子性酞菁或不具有配位金属的阴离子性酞菁中的任意一种。

[0026] 本发明的上述目的、其它目的、特征和优点在参照附图下，根据以下的优选实施方式的详细说明而明确。

[0027] 发明的效果

[0028] 根据本发明，能够提供一种利用化合物对G-quadruplex结构特异性地相互作用，而不与双螺旋结构的DNA非特异性结合，从而能够抑制端粒酶反应的方法。

[0029] 图1是用于说明本发明的实施方式(体外)的图。

[0030] 图2是用于说明本发明实施方式(体内(人细胞内))的图。

[0031] 图3是表示在本发明实施方式中所使用的阴离子性酞菁的例子的图。

[0032] 图4是表示比较例1中的电泳结果的图。

[0033] 图5是基于比较例1～2和实施例1～3的各电泳分析结果，表示PCR control峰的DNA浓度和TMPyP或各阴离子性酞菁在反应液中的浓度关系的图。

[0034] 图6是表示基于比较例1～2和实施例1～3的各电泳分析结果，在相当于阶梯状峰的反应产物中的合计DNA浓度和TMPyP或各阴离子性酞菁在反应液中的浓度关系的图。

[0035] 图7是表示形成反平行型G-quadruplex结构的CD测定结果的图。

[0036] 图8是表示在实施例4中，混合CuPC和G-quadruplex结构时在480～800nm的吸光光谱的图。

[0037] 图9是表示在实施例4中，混合CuPC和单链DNA(A)、或CuPC和双链DNA(B)时在480～800nm的吸光光谱的图。

[0038] 图10是表示在实施例5中，混合NiPC和G-quadruplex结构时在480～800nm的吸光光谱的图。

[0039] 图11是表示在实施例5中，混合NiPC和单链DNA(A)、或CuPC和双链DNA(B)时在480～800nm的吸光光谱的图。

[0040] 图12是表示在实施例6中，混合PC和G-quadruplex结构时在480～800nm的吸光光谱的图。

[0041] 图13是表示在实施例6中，混合PC和单链DNA(A)、或CuPC和双链DNA(B)时在480～800nm的吸光光谱的图。

[0042] 图14是表示在实施例7中，混合CoPC和G-quadruplex结构时在480～800nm的吸光光谱的图。

[0043] 图15是表示在实施例7中，混合CoPC和单链DNA(A)、或CuPC和双链DNA(B)时在480～800nm的吸光光谱的图。

[0044] 图16是表示在比较例3中，在不存在λDNA的情况下由TMPyP引起的端粒酶抑制效果的凝胶电泳结果。

[0045] 图17是表示在比较例3中，在存在λDNA的情况下由TMPyP引起的端粒酶抑制效果的凝胶电泳结果。

[0046] 图18是表示在实施例4中，在不存在λDNA的情况下由CuPC引起的端粒酶抑制效果的凝胶电泳结果。

[0047] 图19是表示在实施例4中，在存在λDNA的情况下由CuPC引起的端粒酶抑制效果的凝胶电泳结果。

[0048] 图20是表示在实施例5中，在不存在λDNA的情况下由NiPC引起的端粒酶抑制效果的凝胶电泳结果。

[0049] 图21是表示在实施例6中，在存在λDNA的情况下由NiPC引起端粒酶抑制效果的凝胶电泳结果。

[0050] 符号说明

[0051] 1…Lower Marker、2…Upper Marker、3…PCR control的峰、4…阶梯状峰具体实施方式

[0052] 以下，参考适当的附图来说明本发明的实施方式。

[0053] 首先，作为本发明的实施方式的一个例子，使用图1说明在体外的由阴离子性酞菁引起的抑制端粒酶反应的方法。

[0054] 首先，如图1(a)所示，在含有端粒酶、作为端粒酶底物的DNA和dNTP的溶液中发生端粒酶反应。由此，作为端粒酶底物的DNA在重复端粒DNA的同时向3’方向延伸。

[0055] 另一方面，如后述的实施例所验证的那样，如图1(b)所示，在含有端粒酶、作为端粒酶底物的DNA和dNTP的溶液中还含有阴离子性酞菁时，端粒酶反应就被抑制。这是本发明的核心。

[0056] 在这里，作为“作为端粒酶底物的DNA”，可以列举出TS primer、端粒DNA(序列号：1)。

[0057] 在本说明书中使用的术语“dNTP”，意指4种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)的混合物。但是，因为端粒DNA(序列号：1)不具有C(胞嘧啶)，所以，在“dNTP”中可以不含dCTP。其中，所谓dATP，是脱氧腺苷三磷酸，所谓dCTP，是脱氧胞苷三磷酸，所谓dGTP，是脱氧鸟苷三磷酸，所谓dTTP，是脱氧胸苷三磷酸。

[0058] 接着，作为本发明实施方式的一个例子，对于在体内(人细胞内)由阴离子性酞菁产生的抑制端粒酶反应的方法，用图2进行说明。如图2(a)所示，在体内，在细胞中所含的双链DNA末端具有的端粒部分由端粒DNA：5’-TTAGGG-3’(序列号：1)的重复序列构成。这样，如果存在这样的端粒部分、端粒酶和dNTP，就会发生端粒酶反应。

[0059] 但是，如图2(b)所示，如果存在阴离子性酞菁，则细胞内的端粒酶反应就被抑制。

[0060] 如图3所示，在本发明的实施方式中的阴离子性酞菁优选是配位有选自铜、锌、钴和镍中的至少一种金属的阴离子性酞菁、或者是没有配位金属的阴离子性酞菁中的任意一种。另外，如图3所示，在本发明的实施方式中的阴离子性酞菁优选具有选自羧基、羧基的金属盐、磺基和磺基的金属盐中的至少一种作为官能团。

[0061] 实施例

[0062] 在以下实施例中所使用的酞菁中，Copper(II)phthalocyanine-3，4′，4″，4″′-tetrasulfonic acid tetrasodium salt(酞菁铜(II)-3，4′，4″，4″′-四磺酸四钠盐，以下简记作CuPC)、Nickel(II)phthalocyanine tetrasulfonic acid tetrasodium salt(酞菁镍(II)四磺酸四钠盐，以下简记做NiPC)由Sigma Aldrich公司购入。Phthalocyanine tetrasulfonic acid(四磺酸酞菁，以下简记作PC)和Zinc(II)phthalocyanine tetrasulfonic acid(四磺酸酞菁锌(II)，以下简记作ZnPC)由FUNAKOSHI购入。TMPyP从同仁化学研究所(株)购入。Cobalt(II)phthalocyanine tetracarboxylic acid(四羧酸酞菁钴(II)，以下简记作CoPC)为发明人合成的。合成方法如下所述。

[0063] 在170～180℃的油浴中，将偏苯三酸6.4g、尿素20g、氯化钴六水合物4.75g和钼酸铵四水合物0.82g在100mL硝基苯中加热4.5小时，放冷后，以倾析法除去硝基苯层。将残留物以甲醇和水洗净之后进行真空干燥，得到8.66g固态物。将该固态物1.0g在50％氢氧化钾水溶液30g中，在70～75℃下搅拌2小时后，添加90mL的水，搅拌，并将其过滤。将此时得到的滤液以35～37％的盐酸调为强酸性从而析出沉淀物，将其过滤取出。将该沉淀物在100mL的1N的氢氧化钠水溶液中溶解，再次过滤。将此时得到的滤液再次以盐酸调为强酸性，过滤取出析出的沉淀物。将其用大量水洗净之后进行真空干燥，由此得到0.1g的CoPC粉末。以下实施例中所使用的CoPC全部是通过该合成得到的。

[0064] -由阴离子性酞菁产生的端粒酶活性抑制效果的研究-

[0065] 以下，对比较例1、2和实施例1、2、3进行说明。在这里，对于由现有已知的代表性的端粒酶抑制效果材料阳离子性卟啉(TMPyP)和由阴离子性酞菁产生的端粒酶抑制效果，使用Millipore Corporation生产的端粒酶活性测定试剂盒(TRAPEZE Telomeraze Detection KitS7700)进行比较研究。

[0066] TRAPEZE Telomeraze Detection Kit S7700(以下简记作S7700试剂盒)是包含10×TRAP Reaction buffer、50×dNTP Mix、TS primer、Primer Mix、control cell pellet的试剂盒。

[0067] 在这里，TRAP Reaction buffer是用于使用S7700试剂盒进行反应的缓冲液。

[0068] dNTP Mix是dATP、dCTP、dGTP、dTTP的混合液。

[0069] control cell pellet是包含端粒酶的细胞的细胞团，利用该细胞团能够制备包含端粒酶的溶液。

[0070] TS primer是由5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’构成的寡聚DNA，与人的端粒DNA序列同样地接受由端粒酶引起的结合，成为端粒酶反应的开始序列。

[0071] 本来如果能够直接定量从该TS primer开始的端粒酶反应的反应产物量即可。但是，因为该产物量非常少，所以不能以电泳等检出，因而必须用PCR扩增所得到的端粒酶反应产物。

[0072] 因此，在S7700试剂盒的Primer Mix中包含RP primer。该引物是具有与通过端粒酶反应所延长的序列互补的序列的寡聚DNA，因此，通过以上述TS primer和该RP primer进行PCR，能够使端粒酶反应产物扩增到能够以电泳等检出的量。

[0073] 在PCR中需要耐热性聚合酶，但在S7700试剂盒中不包含，所以，这次使用TITANIUM Taq polymerase(Clontech Laboratories公司生产)。

[0074] 如上所述，在使用S7700试剂盒进行的端粒酶活性测定中，端粒酶反应和PCR依次进行。

[0075] 在实际中，如在比较例1～2和实施例1～3中详细说明的那样，所需要的试剂全部在最初阶段混合，调控该反应液的温度，由此依次地进行端粒酶反应和PCR。

[0076] 此时，预期抑制端粒酶反应的原料(本次是TMPyP和阴离子性酞菁)也在最初阶段混合。然后，可以在最后进行的电泳结果中确认端粒酶反应产物是否被检出。

[0077] 但是，在这里必须注意的是，即使电泳的结果未检出端粒酶反应产物，预期抑制端粒酶反应的材料也未必在实际中抑制了端粒酶反应。

[0078] 即，端粒酶反应没有被抑制，但有可能抑制此后的PCR。

[0079] 例如，与双链DNA非特异性结合的材料等，抑制PCR的可能性高。因此，如S7700试剂盒的反应的那样，进行端粒酶反应和PCR时，预期抑制端粒酶反应的材料必须确认不抑制通常的PCR。

[0080] 在S7700试剂盒中，在Primer Mix中包含用于确认的模板DNA和引物组合，如果进行PCR，就可以由该组合得到36bp的PCR扩增产物。

[0081] 因此，在使用S7700试剂盒验证预期抑制端粒酶反应的材料的效果时，如果在最后的电泳结果中未检出端粒酶反应产物，就必须确认该36bp的PCR产物是否可以正常地扩增。

[0082] (比较例1)

[0083] 在比较例1中，如上所述，使用S7700试剂盒，对试剂盒中附带的端粒酶的活性进行了测定。测定程序如下。

[0084] 首先，按照试剂盒的使用步骤，由附带的control cell pellet制备端粒酶溶液。接着，混合2μL的10×TRAP Reaction buffer、0.4μL的50×dNTP Mix、0.4μL的TS primer、0.4μL的Primer Mix、0.4μL的TITANIUM Taq polymerase、14.8μL的milliQ水(精制水)、1.6μL的上述制备好的端粒酶溶液，配制了总体积为20μL的反应液。

[0085] 然后，通过在30℃的条件下放置该反应液30分钟而进行端粒酶反应后，以94℃30秒钟、59℃30秒钟、72℃1分钟的温度循环重复33个循环，进行PCR。对PCR后的反应液由Bioanalyzer 2100(Agilent公司生产)进行电泳分析。

[0086] 在图4中表示电泳分析结果。

[0087] 在这里，在图4中以参照符号“1”表示的Lower Marker和以参照符号“2”表示的Upper Marker所表示的峰，是用于分析电泳样品DNA的长度和浓度的电泳分析用内对照。因此与上述的端粒酶反应和PCR反应结果没有关系。

[0088] 另一方面，表示为PCR control的峰，是由上述Primer Mix中包含的模板DNA和引物的组合得到的36bp的PCR扩增产物。

[0089] 因此，是与上述端粒酶反应无关而得到的产物，是表示PCR反应是否良好进行的峰。其余的阶梯状峰是由端粒酶反应得到的各种长度的DNA片段被此后的PCR反应扩增得到的峰。因此，在本比较例1中，可以分清端粒酶反应和PCR反应两者进行的情况。

[0090] 利用Bioanalyzer 2100进行分析的结果为，相当于PCR control峰的反应产物中的DNA浓度为1.23ng/μL，另外，相当于阶梯状峰的反应产物中的合计DNA浓度为2.95ng/μL。

[0091] (比较例2)

[0092] 在比较例2中，和比较例1同样地使用S7700试剂盒，对试剂盒中所附带的端粒酶的活性进行了测定。但是，此时在反应液中添加了TMPyP。具体如下。

[0093] 混合2μL的10×TRAP Reaction buffer、0.4μL的50×dNTP Mix、0.4μL的TS primer、0.4μL的Primer Mix、0.4μL的TITANIUM Taqpolymerase、12.8μL的milliQ水(精制水)、1.6μL的在比较例1中制备好的端粒酶溶液、2μL的TMPyP水溶液，配制了总体积20μL的反应液(分别配制了TMPyP的终浓度为0.01μM、0.03μM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM的溶液)。

[0094] 此后，和比较例1同样地在30℃的条件下放置该反应液30分钟，此后，以94℃30秒钟、59℃30秒钟、72℃1分钟的温度循环重复33个循环。对于PCR后的溶液，由Bioanalyzer 2100进行电泳分析。

[0095] (实施例1)

[0096] 在实施例1中，和比较例1同样地使用S7700试剂盒，对试剂盒中的所附带的端粒酶的活性进行了测定。但是，此时在反应液中添加CuPC。具体如下。

[0097] 混合2μL的10×TRAP Reaction buffer、0.4μL的50×dNTP Mix、0.4μL的TS primer、0.4μL的Primer Mix、0.4μL的TITANIUM Taqpolymerase、12.8μL的milliQ水、1.6μL的在比较例1中制备好的端粒酶溶液、2μL的CuPC水溶液，配制了总体积20μL的反应液(分别配制了CuPC的终浓度为0.01μM、0.03μM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM的溶液)。

[0098] 此后，和比较例1同样地在30℃的条件下放置该反应液30分钟，此后，再以94℃30秒钟、59℃30秒钟、72℃1分钟的温度循环重复33个循环。对于PCR后的反应溶液，由Bioanalyzer 2100进行电泳分析。

[0099] (实施例2)

[0100] 在实施例2中，和比较例1同样地使用S7700试剂盒，对试剂盒中的所附带的端粒酶的活性进行测定。但是，此时在反应液中添加NiPC。具体如下。

[0101] 混合2μL的10×TRAP Reaction buffer、0.4μL的50×dNTP Mix、0.4μL的TS primer、0.4μL的Primer Mix、0.4μL的TITANIUM Taqpolymerase、12.8μL的milliQ水、1.6μL的在比较例1中制备好的端粒酶溶液、2μL的NiPC水溶液，配制了总体积20μL的反应液(分别配制了NiPC的终浓度为0.01μM、0.03μM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM的溶液)。

[0102] 此后，和比较例1同样地在30℃的条件下放置该反应液30分钟，此后，再以94℃30秒钟、59℃30秒钟、72℃1分钟的温度循环重复33个循环。对于PCR后的反应溶液，由Bioanalyzer 2100进行电泳分析。

[0103] (实施例3)

[0104] 在实施例3中，和比较例1同样地使用S7700试剂盒，对试剂盒中的所附带的端粒酶的活性进行测定。但是，此时在反应液中添加PC。具体如下。

[0105] 混合2μL的10×TRAP Reaction buffer、0.4μL的50×dNTP Mix、0.4μL的TS primer、0.4μL的Primer Mix、0.4μL的TITANIUM Taqpolymerase、12.8μL的milliQ水、1.6μL的在比较例1中制备好的端粒酶溶液、2μL的PC水溶液，配制了总体积20μL的反应液(分别配制了PC的最终浓度为0.01μM、0.03μM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM的溶液)。

[0106] 此后，和比较例1同样地在30℃的条件下放置该反应液30分钟，此后，再以94℃30秒钟、59℃30秒钟、72℃1分钟的温度循环重复33个循环。对于PCR后的反应溶液，由Bioanalyzer 2100进行电泳分析。

[0107] 根据以上的比较例1～2和实施例1～3的各电泳分析结果，在图5中表示PCR control峰的DNA浓度和TMPyP或各阴离子性酞菁在反应液中的浓度的关系。即，以PCR control峰的DNA浓度为纵轴，以TMPyP或各阴离子性酞菁在反应液中的浓度为横轴，对其关系作图(横坐标0处，是不含有各阴离子性酞菁或TMPyP的比较例1的结果)。

[0108] 从图5可知，DNA浓度依赖于TMPyP的浓度而显著减少，TMPyP浓度在3μM以上时的DNA浓度降至Bioanalyzer 2100检出限度以下。

[0109] 即，该结果是由于TMPyP抑制通常的PCR反应，可以认为这是因为TMPyP非特异性地结合在作为模板的双链DNA上所导致的。

[0110] 另一方面，各阴离子性酞菁与TMPyP相比较，DNA浓度的减少比较缓慢，即使在这些阴离子性酞菁的浓度为3μM时，也能检出1.1ng/μL以上的DNA。即，可知由这些阴离子性酞菁产生的与双链DNA的非特异结合相比于TMPyP非常少。

[0111] 接着，在图6中，以相当于阶梯状峰的反应产物中的合计DNA浓度为纵轴，以TMPyP或各阴离子性酞菁在反应液中的浓度为横轴，对其关系作图(在横轴为0处，是不包含TMPyP或各阴离子性酞菁的比较例1的结果)。

[0112] 如在图6中所示，在使用各阴离子性酞菁时，DNA浓度依赖于其浓度而减少，各阴离子性酞菁为0.1μM时减少至1.0ng/μL以下。另一方面，在使用TMPyP时，即使在添加了1.1μM的情况下，相当于阶梯状峰的反应产物中的总DNA浓度也为2.7ng/μL。

[0113] 即，这些结果表明，对端粒酶反应的抑制效果，相比于作为现有的候补抑制物质已知的阳离子性物质TMPyP，本次使用的阴离子性酞菁的效果明显大。

[0114] 综上所述，根据比较例1～2和实施例1～3的结果可知，相比于作为现有的候补端粒酶反应抑制物质已知的阳离子性物质TMPyP，阴离子性酞菁抑制端粒酶反应的效果明显大，而且对聚合酶反应的抑制小。

[0115] 再用以下比较例3和实施例4～5，比较由TMPyP和阴离子性酞菁产生的端粒酶抑制效果。在这些实验中，与上述比较例1～2和实施例1～3相同，使用了S7700试剂盒。但是，在上述比较例1～2和实施例1～3中，在端粒酶反应和PCR中所需要的试剂全部在最初阶段混合，通过控制温度而依次进行的端粒酶反应和PCR，与此相对，在以下的比较例
3和实施例4～5中，首先只混合在端粒酶反应中所需要的试剂，进行了端粒酶反应后，将其一部分反应液和在PCR中所需要的试剂混合，进行PCR。

[0116] 另外，分别在以下比较例3和实施例4～5中，在进行端粒酶反应时，进行添加和不添加λDNA的实验。添加λDNA的目的是通过添加λDNA来模拟再现如细胞的基因组DNA那样的大量双链DNA存在的条件，由此研究在近似体内的条件下，TMPyP和阴离子性酞菁是否能够发挥端粒酶抑制效果。

[0117] (比较例3)

[0118] 在比较例3中，使用S7700试剂盒对由TMPyP产生的端粒酶活性抑制效果进行研究。具体如下。

[0119] 混合1μL的10×TRAP Reaction buffer、0.2μL的50×dNTP Mix、0.2μL的TS primer、4μL的在比较例1中制备好的端粒酶溶液、2μL的TMPyP水溶液、2.6μL的milliQ水，配制了总体积10μL的反应液(分别配制了TMPyP的最终浓度为0M、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM的溶液)。然后，在30℃的条件下放置该反应液60分钟，进行端粒酶反应。

[0120] 接着，混合4μL的以milliQ水将该端粒酶反应后的溶液稀释20倍的溶液，0.2μL的50×dNTP Mix、0.2μL 的TS primer、0.2μL的 PrimerMix、0.1μL的 TaKaLa LA Taq Hot Start Version(TaKaRaBIO株式会社生产)、1μL的10×LA PCR buffer
2+
Ⅱ(Mg plus)(TaKaLa LA Taq HotStart Version的附属缓冲液)、4.3μL的milliQ水，配制总体积10μL的PCR溶液。然后，以95℃30秒钟、59℃30秒钟、72℃30秒钟的温度循环重复30个循环，在该温度条件下放置该PCR溶液，进行PCR。

[0121] 最后，将PCR后的溶液以10％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由GelStar Nucleic Acid Stain(TaKaRaBIO株式会社生产)染色。图16表示由以上操作所得到的凝胶的结果。从最左边的泳道依次是TMPyP的终浓度为0M、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM的结果。由此，随着TMPyP的终浓度增大，表示端粒酶反应产物的条带变浅，可知TMPyP抑制端粒酶反应。但是，在10μM的TMPyP条件下，表示PCRcontrol的条带也变浅，可知聚合酶反应也受到抑制。

[0122] 另一方面，也进行了在端粒酶反应液中添加了λDNA的实验。即，在制备上述端粒酶反应液时，取代2.6μL的milliQ水，混合了2.6μL的λDNA溶液(TaKaRaBIO株式会社生产)。其它的端粒酶反应温度/时间条件、PCR溶液配制条件、PCR温度/时间条件、电泳条件完全相同。在图17中表示该结果。

[0123] 由此可知，与图16有很大不同，在λDNA存在下，即使TMPyP的浓度增大，也不能完全抑制端粒酶反应。即，可知在类似基因组DNA的双链DNA大量存在的条件下，由TMPyP产生的端粒酶抑制效果显著变小

[0124] (实施例4)

[0125] 在实施例4中，使用CuPC代替TMPyP，进行了与比较例3同样的实验。在图18和图19中表示实验结果。首先，图18是在不添加λDNA的条件下的结果，从最左边的泳道依次是CuPC的终浓度为0M、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM的结果。由此可知，在该条件下，随着CuPC的浓度增大，端粒酶反应受到抑制。另外，与TMPyP的情况(图16)不同，即使在10μM的CuPC的情况下，PCR control的扩增也不受抑制。

[0126] 另一方面，图19是表示在λDNA存在下的结果的图。由此可知，与TMPyP的情况不同，即使在λDNA存在下，CuPC也能够高效抑制端粒酶反应。即，可知即使在类似基因组DNA那样存在大量双链DNA的条件下，CuPC也能够发挥其端粒酶抑制效果。

[0127] (实施例5)

[0128] 在实施例5中，使用NiPC代替TMPyP，进行了与比较例3同样的实验。在图20和图21中表示实验结果。首先，图20是在不添加λDNA的条件下的结果，从最左边的泳道依次是NiPC的终浓度为0M、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM的结果。由此可知，在该条件下，随着NiPC的浓度增大，端粒酶反应受到抑制。另外，与TMPyP的情况(图16)不同，即使在10μM NiPC的情况下，PCR control的扩增也不受抑制。

[0129] 另一方面，图21是表示在λDNA存在下的结果的图。由此可知，与TMPyP的情况不同，即使在λDNA存在下，NiPC也能够高效抑制端粒酶反应。即，可知即使是在类似基因组DNA那样存在大量双链DNA的条件下，NiPC也能够发挥其端粒酶反应抑制效果。

[0130] 从上述比较例3和实施例4～5的结果可知，作为阴离子性酞菁的CuPC和NiPC不同于现有的作为候补端粒酶反应抑制物质已知的阳离子性物质的TMPyP，即使在如基因组DNA那样大量存在双链DNA的条件下，也能够高效抑制端粒酶反应。

[0131] -对阴离子性酞菁和各种DNA之间的相互作用的研究-

[0132] 以下，在实施例6、7、8、9中，研究了阴离子性酞菁和各种DNA之间的相互作用。为此，首先由以下程序制备了包含G-quadruplex结构的溶液、包含单链DNA的溶液、包含双链DNA的溶液。

[0133]

[0134] 将含有由5’-gggttagggttagggttaggg-3’的序列(序列号：2)构成的单链DNA(该序列和人的端粒部分序列是同样的，因此，下文将该DNA称为人端粒寡聚DNA)的50mM HEPES、100mM NaCl、pH7的溶液(总量100μL)在90℃孵育5分钟后，以2℃/分钟的降温速度冷却到0℃，最后在0℃孵育2小时。

[0135] 在溶液中所含的人端粒寡聚DNA的浓度为0、0.5、2、5、10、25、50、100μM。对制备后的各溶液进行CD分析，结果如图7中所示，除了人端粒寡聚DNA为0μM的溶液外，所有溶液都可以确认在295nm附近有正峰，在265nm附近有负峰。这表示形成了反平行型G-quadruplex。

[0136] 在人端粒寡聚DNA浓度为100μM的溶液中的上述正峰和负峰的绝对值最大，其它溶液以50、25、10、5、2、0.5μM的顺序变小。这表示如果最初包含的人端粒寡聚DNA浓度大，则所得到的形成反平行型G-quadruplex的DNA浓度也大。下文将由人端粒寡聚DNA浓度为100、50、25、10、5、2、0.5μM的溶液制备得到的G-quadruplex分别称为G-quadruplexA、B、C、D、E、F、G。另一方面，将不包含人端粒寡聚DNA的溶液称为NC溶液。

[0137] <单链DNA溶液的制备>

[0138] 制备由5’-ttttttttttttttttttttt-3’的序列(序列号：3)构成的单链DNA以50μM的浓度包含于50mM HEPES、100mM NaCl、pH7的溶液(总100μL)，将其在90℃孵育
5分钟后，以2℃/分钟的降温速度冷却到0℃，最后在0℃孵育2小时。该结果得到的溶液中的DNA在孵育后也是单链DNA(下文将该溶液称为单链DNA溶液)。

[0139] <双链DNA溶液的制备>

[0140] 制备由5’-AGAAGAGAAAGA-3’的序列(序列号：4)构成的单链DNA和由5’-TCTTTCTCTTCT-3’的序列(序列号：5)构成的单链DNA分别以50μM的浓度包含于50mM HEPES、100mM NaCl、pH7的溶液(总量100μL)，将其在90℃孵育5分钟后，以2℃/分钟的降温速度冷却到0℃，最后在0℃孵育2小时。由于上述二种DNA存在相补的关系，所以，该孵育的结果使两种DNA在溶液中形成双链DNA(下文将该溶液称为双链DNA溶液)。

[0141] (实施例6)

[0142] 在实施例6中研究CuPC和各种DNA之间的相互作用。

[0143] 首先，制备了包含15μM的CuPC的50mM HEPES、100mM NaCl、pH7的溶液(总量20μL)。然后，分别混合该CuPC溶液和G-quadruplex溶液C、D、E、F及NC溶液，对该混合液测定480～800nm的吸光度。

[0144] 在图8中表示测定结果。由图8可知，除不含DNA的NC溶液的情况以外，大致在640～720nm的范围出现峰，另外，该峰的大小的顺序为G-quadruplex溶液C＞D＞E＞F。由以上的结果可知，CuPC和G-quadruplex结构之间具有相互作用。

[0145] 接着，同样地分别混合上述CuPC溶液和单链DNA溶液、以及上述CuPC溶液和双链DNA溶液，对该混合液测定480～800nm的吸光度。在图9(A)和图9(B)中分别表示在单链DNA溶液和双链DNA溶液的情况下的测定结果。

[0146] 在各自的图中，也一并表示使用NC溶液的结果。由图9(A)和图9(B)可知，单链DNA溶液和双链DNA溶液的情况都与包含50μM的高浓度DNA无关，得到与NC溶液的情况几乎相同的结果。因此，可知CuPC和单链DNA之间、以及CuPC和双链DNA之间没有相互作用。

[0147] (实施例7)

[0148] 在实施例7中研究NiPC和各种DNA之间的相互作用。

[0149] 首先，制备了包含15μM的NiPC的50mM HEPES、100mM NaCl、pH7的溶液(总量20μL)。然后，分别混合该NiPC溶液和G-quadruplex溶液D、E、F及NC溶液，对该混合液测定480～800nm的吸光度。

[0150] 在图10中表示测定结果。由图10可知，除不含DNA的NC溶液的情况以外，大致在640～720nm的范围出现峰，另外，该峰的大小的顺序为G-quadruplex溶液D＞E＞F＞G。由以上的结果可知，NiPC和G-quadruplex结构之间具有相互作用。

[0151] 接着，同样地分别混合上述NiPC溶液和单链DNA溶液、以及上述NiPC溶液和双链DNA溶液，对该混合液测定480～800nm的吸光度。在图11(A)和图11(B)中分别表示单链DNA溶液和双链DNA溶液的情况下的测定结果。在各自的图中，也一并表示使用NC溶液的结果。由图11(A)和图11(B)可知，单链DNA溶液和双链DNA溶液的情况都与包含50μM的高浓度DNA无关，得到与NC溶液的情况几乎相同的结果。因此，可知NiPC和单链DNA之间、以及NiPC和双链DNA之间没有相互作用。

[0152] (实施例8)

[0153] 在实施例8中研究PC和各种DNA之间的相互作用。

[0154] 首先，制备了包含15μM的PC的50mM HEPES、100mM NaCl、pH7的溶液(总量20μL)。然后，分别混合该PC溶液和G-quadruplex溶液D、E、F及NC溶液，对该混合液测定480～800nm的吸光度。

[0155] 在图12中表示测定结果。由图12可知，除不含DNA的NC溶液的情况以外，大致在660～740nm的范围出现两个峰，另外可知，该峰的大小的顺序为G-quadruplex溶液D＞E＞F＞G。由以上的结果可知，PC和G-quadruplex结构之间具有相互作用。

[0156] 接着，同样地分别混合上述PC溶液和单链DNA溶液、以及上述PC溶液和双链DNA溶液，对该混合液测定480～800nm的吸光度。在图13(A)和图13(B)中分别表示单链DNA溶液和双链DNA溶液的情况下的测定结果。在各自的图中，也一并表示使用NC溶液的结果。由图13(A)和图13(B)可知，单链DNA溶液和双链DNA溶液的情况都与包含的50μM的高浓度DNA无关，得到与NC溶液的情况几乎相同的结果。因此，可知PC和单链DNA之间、以及CuPC和双链DNA之间没有相互作用。

[0157] (实施例9)

[0158] 在实施例9中研究CoPC和各种DNA之间的相互作用。

[0159] 首先，制备了包含15μM的CoPC的50mM HEPES、100mM NaCl、pH7的溶液(总量20μL)。然后，分别混合该CoPC溶液和G-quadruplex溶液B、C、D、G及NC溶液，对该混合液测定480～800nm的吸光度。

[0160] 在图14中表示测定结果。由图14可知，除不含DNA的NC溶液的情况以外，大致在660～740nm的范围出现两个峰，另外可知，该峰的大小的顺序为G-quadruplex溶液B＞C＞D＞G。由以上的结果可知，CoPC和G-quadruplex结构之间具有相互作用。

[0161] 但是，在使用CoPC时可见的640～720nm范围的峰上升，小于使用CuPC、NiPC和PC时的结果。这认为这是由于合成的CoPC没有被充分精制的缘故。

[0162] 接着，同样地分别混合上述CoPC溶液和单链DNA溶液、以及上述CoPC溶液和双链DNA溶液，对该混合液测定480～800nm的吸光度。在图15(A)和图15(B)中分别表示单链DNA溶液和双链DNA溶液的情况下的测定结果。在各自的图中，也一并表示使用NC溶液的结果。由图15(A)和图15(B)可知，单链DNA溶液和双链DNA溶液的情况都与包含50μM的高浓度DNA无关，得到与NC溶液的情况几乎相同的结果。因此，可知在CoPC和单链之间及CuPC和双链之间没有相互作用。

[0163] 除了以上的阴离子性酞菁以外，使用ZnPC进行了同样的实验，结果，对与ZnPC而言，也显示和G-quadruplex结构特异性地相互作用。

[0164] 以上，如果对实施例6～9进行总结，则可知虽然所有的阴离子性酞菁都和G-quadruplex结构发生相互作用，但该作用是极其特异的，与单链DNA和双链DNA不发生相互作用。因此，阴离子性酞菁作为端粒酶抑制物质非常适合，和现有的方法相比，可以说本发明中的端粒酶抑制方法是有效的。

[0165] 根据上述说明，对于本领域技术人员而言，本发明的多项改良和其它实施方式是清楚的。因此，上述说明应该只是作为例示的解释，是出于向本领域技术人员演示实施本发明的最佳方式的目的而提供的。可以不脱离本发明的精神而实质性地变更其结构和/或功能的细节。

[0166] 产业上的可利用性

[0167] 根据本发明，提供一种端粒酶抑制方法。由于端粒酶反应已知为癌化的原因，所以，本发明的方法能够用于癌症治疗。