用于正烷烃重组生物合成的方法和组合物 |
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| 申请号 | CN201410718292.2 | 申请日 | 2010-07-09 | 公开(公告)号 | CN104630279A | 公开(公告)日 | 2015-05-20 |
| 申请人 | 焦耳无限科技公司; | 发明人 | N·B·雷帕斯; C·P·里德利; | ||||
| 摘要 | 本 发明 确定了修饰作为宿主的光合自养 生物 体以使该生物体有效地将二 氧 化 碳 和光转化为正烷 烃 的方法和组合物，特别是这样的生物体在商业生产正烷烃和相关分子上的用途。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种生产烃类的方法，包括： |
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| 说明书全文 | 用于正烷烃重组生物合成的方法和组合物[0002] 相关申请的交叉引用 [0003] 本申请要求在先的2009年7月9日提交的美国临时专利申请61/224,463号，2009年7月27日提交的美国临时专利申请61/228,937号和2010年4月13日提交的美国发明专利申请12/759,657号的优先权，其公开纳入本发明作为参考。 技术领域[0004] 本发明涉及赋予异养或光合自养宿主烷烃产生性能的方法，以使得修饰后的宿主可以被用于生物烷烃(bioalkane)的商业生产。 背景技术[0005] 许多现有的光合自养生物(即，植物、藻类和光合细菌)不适合工业的生物工艺，且因此没有显现出商业上的可行性。相比工业化异养生物如大肠杆菌(20分钟)，这样的生物通常具有较长的倍增时间(3-72小时)，反映了低的总生产率。虽然高效生物合成生产燃料的渴求已导致开发出产生脂肪酸的烷基酯的光合微生物，但仍然存在对使用光合生物产生烃如烷烃的方法的需求。 [0006] 发明概述 [0007] 本发明在特定实施方式中提供了包含选自AAR和ADM酶的编码序列、作为这些序列的密码子优化变体的核酸序列及相关核酸序列和片段所组成的组的核酸序列或由其组成的分离的多核苷酸。 [0008] AAR酶是指具有SYNPCC7942_1594蛋白(SEQ ID NO：6)或其同源物的氨基酸序列的酶，其中SYNPCC7942_1594同源物是其BLAST比对(i)覆盖>90％的SYNPCC7942_1594长度，(ii)覆盖>90％匹配蛋白质长度，和(iii)与SYNPCC7942_1594具有>50％的同一性(当最佳地使用本发明提供的参数优化比对时)，并保持SYNPCC7942_1594的功能活性(即将酰基-ACP(ACP＝酰基载体蛋白)转化为烷醛)的蛋白质。ADM酶是指具有SYNPCC7942_1593蛋白(SEQ ID NO：8)或其同源物的氨基酸序列的酶，其中SYNPCC7942_1593同源物定义为其氨基酸序列比对(i)覆盖>90％的SYNPCC7942_1593长度，(ii)覆盖>90％匹配蛋白长 度，和(iii)与SYNPCC7942_1593具有>50％的同一性(当最佳地使用本发明提供的参数比对时)，并保持SYNPCC7942_1593的功能活性(即将n-烷醛转化为(n-1)-烷烃)的蛋白 质。示例性的AAR和ADM酶分别列于表1和表2中。编码AAR或ADM酶的基因在本文中分 别被称为AAR基因(aar)或ADM基因(adm)。 [0009] BLASTp优选的参数为：期望值10：(默认)；过滤器：无；开放空位罚分(Cost to open a gap)：11(默认)；扩展空位罚分(Cost to extend a gap)：1(默认)；最大比对：100(默认)；字段大小：11(默认)；描述编号：100(默认)；罚分矩阵：BLOWSUM62。 [0010] 虽然申请人在本申请中提及烷醛脱羧单加氧酶，但申请人这样做并非意图局限于任何特定的反应机制，除非明确提出。例如，SYNPCC7942_1593或任何其他ADM基因编码的酶是否实现脱羰酶或脱羧反应不影响发明人的该发明的效用，除非本文中明确给出了相反的表示。 [0011] 本发明还提供了包含选自由表1和表2中所列序列及相关多肽序列、片段和融合体组成的组的多肽序列或由该多肽序列组成的分离的多肽。特异性结合本发明的分离的多肽的抗体也被包括在本发明中。 [0012] 本发明也提供了用于在缺乏AAR和ADM催化活性的宿主细胞中表达编码AAR和ADM的异源核酸序列(从而赋予该宿主细胞产生正烷烃(n-alkane)的能力)的方法，或用于在含有天然AAR和/或ADM活性的宿主细胞中表达编码AAR和ADM的核酸(从而增强宿 主细胞产生正烷烃的能力)的方法。 [0013] 此外，本发明提供了使用本发明描述的AAR和ADM基因、蛋白和宿主细胞生产感兴趣的碳基产物的方法。例如，在一个实施方式中，本发明提供了一种生产烃类的方法，包括：(i)在培养基中培养工程蓝细菌，其中所述的工程蓝细菌包含重组AAR酶和重组ADM酶；和(ii)使所述工程蓝细菌暴露于光和二氧化碳，其中所述暴露导致所述工程蓝细菌将所述二氧化碳转化为正烷烃，其中至少一种所述正烷烃选自由正十三烷、正十四烷、正十五烷、正十六烷和正十七烷组成的组，其中产生的所述正烷烃的量在0.1％到5％细胞干重之间，并且至少为由在相同条件下培养的、但缺乏所述重组AAD酶和ADM酶的而其它方面相同的蓝细菌所产生量的两倍。 [0014] 在相关的实施方式中，工程蓝细菌产生的正烷烃的量为至少0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％DCW，并且至少为由在相同条件下培养的、缺乏所述重组AAD酶和ADM酶的而其它方面相同的蓝细菌产生的量的两倍。 [0015] 在相关的实施方式中，至少一种所述重组酶与所述工程蓝细菌异源。在另一个实施方式中，所述蓝细菌在没有一种或两种重组酶的表达时不合成烷烃。在另一个实施方式中，至少一种所述重组AAR或ADM酶不是与所述工程蓝细菌异源的。 [0016] 在该方法的另一个相关实施方式中，所述工程蓝细菌还产生至少一种正烯烃或正烷醇。在再另一个实施方式中，工程蓝细菌产生至少一种选自由正十五烯、正十七烯和1-十八醇组成的组的正烯烃或正烷醇。在相关实施方式中，所述正烷烃主要包括正十七烷、正十五烷或其组合。在相关实施方式中，产生了比所有其他正烷烃产物之和更多的正十七烷和/或正十五烷。在再另一个相关实施方式中，工程蓝细菌产生了比工程蓝细菌产生的任何其他正烷烃或正烯烃更多的正十七烷和/或正十五烷。在再另一个相关实施方式中，所述工程蓝细菌产生的至少一种正十五烯选自由顺式-3-十七烯和顺式-4-十五 烯组成的组。在再另一个相关实施方式中，所述工程蓝细菌产生的至少一种正十七烯选自由顺式-4-十五烯、顺式-6-十七烯、顺式-8-十七烯、顺式-9-十七烯和顺式,顺 式-十七-二-烯组成的组。 [0017] 在再另一个相关实施方式中，本发明还提供了从所述工程蓝细菌或所述培养基中分离至少一种正烷烃、正烯烃或正烷醇的步骤。在再另一个相关实施方式中，工程蓝细菌在液体培养基中培养。在再另一个相关实施方式中，工程蓝细菌在光生物反应器中培养。 [0018] 在另一个相关实施方式中，AAR和/或ADM酶由质粒编码。在再另一个相关实施方式中，AAR和/或ADM酶由整合入所述工程蓝细菌基因组中的重组基因编码。在再另一个相关实施方式中，AAR和/或ADM酶由在所述工程蓝细菌上以多个拷贝存在的基因编码。在再另一个相关实施方式中，重组AAR和/或ADM酶由作为操纵子的部分的基因编码，其中所述基因的表达由单一启动子控制。在再另一个相关实施方式中，重组AAR和/或ADM酶由各自的启动子控制下独立表达的基因编码。在再另一个相关实施方式中，工程蓝细菌中重组AAR和/或ADM酶的表达受到选自由cI启动子、cpcB启动子、lacI-trc启动子、EM7启 动子、aphII启动子、nirA启动子和nir07启动子(本发明中称为“P(nir07)”)组成的组的启动子控制。在再另一个相关实施方式中，酶由作为操纵子的部分的基因编码，其中所述基因的表达由一个或多个诱导型启动子控制。在再另一个相关实施方式中，至少一个启动子是尿素抑制、硝酸盐诱导的启动子。在再另一个相关实施方式中，尿素抑制、硝酸盐诱导的启动子是nirA型启动子。在再另一个相关实施方式中，nirA型启动子是P(nir07)(SEQ ID NO：24)。 [0019] 在再另一个相关实施方式中，被工程化以表达重组AAR和/或ADM酶的蓝细菌种在不存在所述重组AAR和/或ADM酶时产生少于约0.01％DCW的正十七烷或正十五烷，0.01％DCW大致对应于用本文描述的气相色谱/火焰电离检测方法检测正十七烷和正十五烷的检测限。在另一个相关实施方式中，该方法的工程蓝细菌是嗜热的。在再另一个相关实施方式中，该方法的工程蓝细菌选自由工程化的聚球藻(Synechococcus)PCC7002和工程化的细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)BP-1组成的组。 [0020] 在再另一个相关实施方式中，重组AAR和/或ADM酶分别选自由表1和表2中所列酶的组。在再另一个相关实施方式中，重组AAR酶选自由SYNPCC7942_1594、tll1312、PMT9312_0533和cce_1430组成的组。在再另一个相关实施方式中，重组ADM酶选自由 SYNPCC7942_1593、tll1313、PMT9312_0532和cce_0778组成的组。 [0021] 在再另一个相关实施方式中，重组AAR和ADM酶分别具有SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12的氨基酸序列。在特定实施方式中，重组AAR和ADM酶分别由SEQ ID NO：9和11编码。在再另外的相关实施方式中，重组AAR和ADM酶分别由SEQ ID NO：26和28，或分别由SEQ ID NO：30和31编码，并分别具有SEQ ID NO：27和28的氨基酸序列。在特定实施方式中，重组AAR和ADM酶分别由SEQ ID NO：1和3编码，并分别具有SEQ ID NO：2和4的氨基酸序列。在再另外的实施方式中，重组AAR和ADM酶分别由SEQ ID NO：5和7编码，并分别具有SEQ ID NO：6和8的氨基酸序列。 [0022] 在再另一个相关实施方式中，该方法包括在抗生素的存在下培养工程蓝细菌，其中所述抗生素对于编码AAR和/或ADM酶的重组基因的存在进行选择。在特定实施方式中，抗生素是壮观霉素或卡那霉素。在相关实施方式中，培养基中壮观霉素的量在100到 700μg/ml之间，如可以加入100、200、300、400、500、600、或700μg/ml的壮观霉素到培养基中。在特定实施方式中，加入的壮观霉素的量约为600μg/ml，而工程蓝细菌产生的正烷烃的量为至少3％、4％或5％DCW。 [0023] 在另一个实施方式中，生产烃的方法包括在用于一种或两种酶的外源底物存在下培养表达重组AAR和/或ADM酶的工程蓝细菌。在相关实施方式中，底物选自由酰基-ACP、酰基-CoA和脂肪醛组成的组。在另一个相关实施方式中，外源脂肪醇或脂肪酯或其他间接底物可以被加入并被蓝细菌转化为酰基-ACP或酰基-CoA。 [0024] 在再另一个实施方式中，本发明提供了包含由本发明描述的任何重组生物合成方法产生的正烷烃的组合物。在再另一个实施方式中，本发明提供了包含由本发明描述的任何重组生物合成方法产生的正烯烃或正烷醇的组合物。 [0025] 在特定实施方式中，本发明提供了用于产生正烷烃的工程化宿主细胞，其中所述细胞包含一种或多种选自由酰基-CoA还原酶活性、酰基-ACP还原酶活性、烷醛脱羧单加氧酶活性和电子供体活性组成的组的重组蛋白活性。在相关实施方式中，宿主细胞包含重组酰基-ACP还原酶活性、重组烷醛脱羧单加氧酶活性和重组电子供体活性。在其他实施方式中，宿主细胞包含重组酰基-ACP还原酶活性和重组烷醛脱羧单加氧酶活性。在特定实施方式中，电子供体活性是铁氧化还原蛋白。在特定的相关实施方式中，宿主细胞能进行光合作用。在再其他的相关实施方式中，宿主细胞是蓝细菌。在再其他实施方式中，宿主细胞是革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌或酵母菌。 [0026] 在其他实施方式中，本发明提供了包含选自由以下序列组成的组的核酸序列或由该核酸序列组成的分离的或重组的多核苷酸：(a)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、14、30或31；(b)作为SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、14、30或31的简并变体的核酸序列；(c)与SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、14、30或31至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％相同的核酸序列；(d)编码具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、27或29的氨基酸序列的多肽的核酸序列；(e)编码与SEQ ID NO：2、 4、6、8、10、12、27或39至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少 99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％相同的多肽的核酸序列；和(f)与SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、14、30或31在严格条件下杂交的核酸序列。在相关实施方式中，该核酸序列编码具有酰基-ACP还原酶活性或烷醛脱羧单加氧酶活性的多肽。 [0027] 在再另一个实施方式中，本发明提供了具有烷醛脱羧单加氧酶活性的分离的可溶性多肽，其中在特定的相关实施方式中，多肽具有表2中所列蛋白质之一的氨基酸序列。在相关实施方式中，多肽具有与SEQ ID NO：4、8、12或29相同的或至少95％相同的氨基酸序列。 [0028] 在再另一个实施方式中，本发明提供了在体外从酰基-ACP合成正烷烃的方法，包括：使酰基-ACP与重组酰基-ACP还原酶接触，其中所述酰基-ACP还原酶将所述酰基-ACP转化为正烷醛；然后在电子供体存在下将所述正烷醛与重组的可溶性烷醛脱羧单加氧酶接触，其中所述烷醛脱羧单加氧酶将所述n-烷醛转化为(n-1)烷烃。在相关实施方式中，本发明提供了在体外从正烷醛合成正烷烃的方法，包括：在电子供体存在下将所述正烷醛与重组的可溶性烷醛脱羧单加氧酶接触，其中所述烷醛脱羧单加氧酶将所述n-烷醛转化为(n-1)烷烃。在特定的相关实施方式中，电子供体是铁氧化还原蛋白。 [0029] 在另一个实施方式中，本发明提供了包含重组AAR和ADM酶的工程蓝细菌细胞，其中所述细胞包含0.1％到5％之间、1％到5％之间或2％到5％之间细胞干重的正烷烃，其中所述正烷烃主要是正十五烷、正十七烷或其组合。 [0030] 在其他实施方式中，本发明提供了本发明公开的表达和/或转化载体之一。在其他相关实施方式中，本发明提供了使用本发明公开的表达和/或转化载体之一转化微生物，如蓝细菌的方法。 [0031] 在生产烃类的方法的再另一个实施方式中，AAR和ADM酶分别与SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。在相关实施方式中，工程蓝细菌产生正十五烷和正十七烷，其中正十五烷相对于正十五烷加正十七烷的质量百分比至少为20％。在再另一个相关实施方式中，工程蓝细菌产生正十五烷和正十七烷，其中正十五烷相对于正十五烷加正十七烷的质量百分比小于30％。在另一个相关实施方式中，工程蓝细菌产生正十五烷和正十七烷，其中正十五烷相对于正十五烷加正十七烷的质量百分比在20％和30％之间。 [0032] 在生产烃类的方法的再另一个实施方式中，AAR和ADM酶分别与SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。在相关实施方式中，工程蓝细菌产生正十五烷和正十七烷，其中正十五烷相对于正十五烷加正十七烷的质量百分比至少为50％。在再另一个相关实施方式中，正十五烷相对于正十五烷加正十七烷的质量百分比小于60％。在再另一个相关实施方式中，正十五烷相对于正十五烷加正十七烷的质量百分比在50％和60％之间。 [0033] 在生产烃类的方法的再另一个实施方式中，工程蓝细菌包含至少两种不同的重组ADM酶和至少两种不同的重组AAR酶。在相关实施方式中，所述工程蓝细菌包含至少一种编码分别与SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29至少95％相同的AAR和ADM酶的操纵子。在再另一个相关实施方式中，所述工程蓝细菌包含至少一种编码分别与SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12至少95％相同的AAR和ADM酶的操纵子。在再另一个相关实施方式中，所述AAR和ADM酶的表达受诱导型启动子，如P(nir07)启动子的控制。在再另一个相关实施方式中，所述重组ADM酶和AAR酶是染色体整合的。在再另一个相关实施方式中，所述工程蓝细菌在诱导物的存在下产生正烷烃，且其中至少95％的所述正烷烃为正十五烷和正十七烷，而且其中正十五烷相对于正十五烷加正十七烷的质量百分比为至少80％。 [0034] 在生产烃类的方法的再另一个实施方式中，工程蓝细菌包含分别与SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12至少95％相同的重组AAR和ADM酶。在相关实施方式中，重组AAR和ADM酶在诱导型启动子，如P(nir07)启动子的控制之下。在再另一个相关实施方式中，工程蓝细菌在诱导物的存在下产生至少0.5％DCW的正烷烃，其中所述正烷烃包括正十五烷和正十七烷，且其中正十五烷相对于正十五烷加正十七烷的质量百分比为至少50％。 [0035] 在再另一个实施方式中，本发明提供了一种调节工程蓝细菌中正十五烷和正十七烷的相对量的方法，包括控制所述工程蓝细菌中一种或多种重组AAR和/或ADM酶的表达，其中所述AAR和/或ADM酶与SEQ ID NO:10、12、27或29的AAR和ADM酶至少95％相同或者相同。 [0036] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种工程蓝细菌，其中所述工程蓝细菌包含编码AAR酶、ADM酶或这两种酶的一个或多个重组基因，其中至少一个所述重组基因在硝酸盐诱导启动子的控制之下。 [0037] 在再另一个实施方式中，本发明提供了重组基因，其中所述基因包含用于控制所述基因的表达的启动子，其中所述启动子包含与SEQ ID NO：24相同的连续核酸序列。 [0038] 在再另一个实施方式中，本发明提供了包含启动子的分离的DNA分子，其中所述启动子包含与SEQ ID NO：24相同的连续核酸序列。 [0039] 在再另一个实施方式中，本发明提供了选自由JCC1469、JCC1281、JCC1683、JCC1685、JCC1076、JCC1170、JCC1221、JCC879和JCC1084t组成的组的工程菌株。 [0041] 特别地，本发明涉及以下各项： [0042] 1.一种生产烃类的方法，包括： [0043] (i)在培养基中培养工程蓝细菌，其中所述的工程蓝细菌包含重组酰基-ACP还原酶和重组烷醛脱羧单加氧酶；和 [0044] (ii)使所述工程蓝细菌暴露于光和二氧化碳，其中所述的暴露导致所述工程蓝细菌将所述二氧化碳转化为正烷烃，其中至少一种所述正烷烃选自由正十三烷、正十四烷、正十五烷、正十六烷和正十七烷组成的组，且其中产生的所述正烷烃的量为至少0.1％细胞干重和至少为由相同条件下培养的、缺乏所述重组酰基-ACP还原酶和烷醛脱羧单加氧酶而其它方面相同的蓝细菌产生的量的两倍。 [0045] 2.如第1项的方法，其中至少一种所述重组酶与所述工程蓝细菌异源。 [0046] 3.如第1项的方法，其中所述工程蓝细菌还产生至少一种正烯烃或正烷醇。 [0047] 4.如第3项的方法，其中所述工程蓝细菌产生至少一种选自由正十五烯、正十七烯和1-十八醇组成的组的正烯烃或正烷醇。 [0048] 5.如第3项的方法，其中所述正烷烃主要包括正十七烷、正十五烷或其组合。 [0049] 6.如第3项的方法，还包括从所述工程蓝细菌或所述培养基中分离至少一种正烷烃、正烯烃或正烷醇。 [0050] 7.如第1项的方法，其中所述酶由质粒编码。 [0051] 8.如第1项的方法，其中所述酶由整合入所述工程蓝细菌的基因组中的重组基因编码。 [0052] 9.如第1项的方法，其中所述酶由以多个拷贝在所述工程蓝细菌中存在的基因编码。 [0053] 10.如第1项的方法，其中所述酶由作为操纵子的部分的基因编码，而且其中所述基因的表达由单一启动子控制。 [0054] 11.如第1-10项中任一项的方法，其中至少95％的所述正烷烃是正十五烷和正十七烷。 [0055] 12.如第1-10项中任一项的方法，其中所述酰基-ACP还原酶和烷醛脱羧单加氧酶分别与SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8至少95％相同。 [0056] 13.如第12项的方法，其中所述工程蓝细菌产生正十五烷和正十七烷，且其中正十五烷相对于正十五烷加正十七烷的质量百分比至少为20％。 [0057] 14.如第12项的方法，其中所述工程蓝细菌产生正十五烷和正十七烷，且其中正十五烷相对于正十五烷加正十七烷的质量百分比小于30％。 [0058] 15.如第12项的方法，其中所述工程蓝细菌产生正十五烷和正十七烷，且其中正十五烷相对于正十五烷加正十七烷的质量百分比在20％到30％之间。 [0059] 16.如第1-10项中任一项的方法，其中所述酰基-ACP还原酶和烷醛脱羧单加氧酶分别与SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12至少95％相同。 [0060] 17.如第16项的方法，其中所述工程蓝细菌产生正十五烷和正十七烷，且其中正十五烷相对于正十五烷加正十七烷的质量百分比至少为50％。 [0061] 18.如第16项的方法，其中所述工程蓝细菌产生正十五烷和正十七烷，且其中正十五烷相对于正十五烷加正十七烷的质量百分比小于60％。 [0062] 19.如第16项的方法，其中所述工程蓝细菌产生正十五烷和正十七烷，且其中正十五烷相对于正十五烷加正十七烷的质量百分比在50％到60％之间。 [0063] 20.如第1-10项中任一项的方法，其中所述酶由作为操纵子的部分的基因编码，而且其中所述基因的表达由一个或多个诱导型启动子控制。 [0064] 21.如第20项的方法，其中至少一个启动子是尿素抑制、硝酸盐诱导的启动子。 [0065] 22.如第21项的方法，其中所述启动子是nirA型启动子。 [0066] 23.如第22项的方法，其中所述nirA型启动子是P(nir07)。 [0067] 24.如第1-10项中任一项的方法，其中所述重组酰基-ACP还原酶和烷醛脱羧单加氧酶分别与SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29至少95％相同。 [0068] 25.如第1-10项中任一项的方法，其中所述工程蓝细菌包括至少两个编码不同的ADM和酰基-ACP还原酶的操纵子。 [0069] 26.如第25项的方法，其中至少一个操纵子编码分别与SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29至少95％相同的酰基-ACP还原酶和烷醛脱羧单加氧酶。 [0070] 27.如第25项的方法，其中至少一个操纵子编码分别与SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12至少95％相同的酰基-ACP还原酶和烷醛脱羧单加氧酶。 [0071] 28.如第8项的方法，其中所述酰基-ACP还原酶和烷醛脱羧单加氧酶分别与SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12至少95％相同。 [0072] 29.如第28项的方法，其中所述酰基-ACP还原酶和烷醛脱羧单加氧酶的表达由诱导型启动子控制。 [0073] 30.如第29项的方法，其中所述工程蓝细菌在诱导物的存在下产生至少0.5％的DCW正烷烃，和其中所述正烷烃包括正十五烷和正十七烷，而且其中正十五烷相对于正十五烷加正十七烷的质量百分比至少为50％。 [0074] 31.如第29项的方法，其中所述工程蓝细菌还包括编码分别与SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29至少95％相同的酰基-ACP还原酶和烷醛脱羧单加氧酶的第二操纵子。 [0075] 32.如第31项的方法，其中所述工程蓝细菌在诱导物的存在下产生正烷烃，和其中至少95％的所述正烷烃是正十五烷和正十七烷，而且其中正十五烷相对于正十五烷加正十七烷的质量百分比至少为80％。 [0076] 33.一种工程蓝细菌，其中所述工程蓝细菌包含一个或多个编码酰基-ACP还原酶、ADM酶或这两种酶的重组基因，其中所述酰基-ACP还原酶与SEQ ID NO：27至少95％相同且其中所述烷醛脱羧单加氧酶与SEQ ID NO：29至少95％相同。 [0077] 34.一种工程蓝细菌，其中所述工程蓝细菌包含一个或多个编码酰基-ACP还原酶、烷醛脱羧单加氧酶或这两种酶的重组基因，其中至少一种所述重组基因在硝酸盐诱导启动子的控制之下。 [0078] 35.一个重组基因，其中所述基因包含控制所述基因的表达的启动子，其中所述启动子包含与SEQ ID NO：24相同的连续核酸序列。 [0079] 36.包含启动子的分离的DNA分子，其中所述启动子包含与SEQ ID NO：24相同的连续核酸序列。 [0080] 附图简要说明 [0081] 图1描述了，A图面中，基于(1)AAR酶(如tll1312)和(2)ADM酶(如tll1313)顺序活性产生正烷烃的酶途径；B图面中，经由酰基-CoA的正烷醛生物合成。酰基-CoA通常为脂肪酸降解的中间体；C图面中，通过酰基-ACP的正烷醛生物合成。酰基-ACP通常是脂肪酸生物合成的中间体。注意三种不同类型的ACP还原酶：(i)β-酮酰基-ACP还原酶、(ii)烯酰基-ACP还原酶和(iii)酰基-ACP还原酶。酰基-ACP还原酶(一种新酶)生成 烷醛脱羧单加氧酶的底物。CoA：辅酶A，ACP：酰基载体蛋白；D图面中，替代的酰基-CoA介导的烷烃生物合成途径。见本文实施例1中的其它讨论。 [0082] 图2描述了JCC9a和JCC1076细胞团BHT(丁基羟基甲苯)-丙酮提取物的0到2700000计数的总离子色谱，以及正烷烃和正-1-烷醇正式标准。方法1指定的峰以常规字体显示，方法2指定的峰以斜体显示。 [0083] 图3描述了由方法1指定的JCC1076峰MS裂解谱(各图面的上部质谱)，相对于其各自的NIST库命中的发现绘图(各图面的下部质谱)。A，正十五烷；B，1-十四醇；C，正十七烷；D，1-十六醇。 [0084] 图4A描述了JCC1113和JCC1114细胞团BHT-丙酮提取物的0到7500000计数的总离子色谱，以及C13-C20的正烷烃和C14、C16和C18的正-1-烷醇正式标准。图4B，描述了JCC1113和JCC1114细胞团BHT-丙酮提取物的0到720000计数的总离子色谱，以及4A中 提及的正烷烃和正烷醇的正式标准。 [0085] 图5描述了由方法1指定的JCC1113峰的MS裂解谱(各图面的上部质谱)，相对于其各自的NIST库发现绘制(各图面的下部质谱)。A，正十三烷；B，正十四烷；C，正十五烷；D，正十六烷；E，正十七烷；F，1-十六醇。 [0086] 图6描述了JCC1170和JCC1169细胞团BHT-丙酮提取物的0到6100000计数的总离子色谱，相对于对照株JCC1113和JCC1114的总离子色谱。JCC1169中没有观察到烃产物。JCC1170中的未识别峰可能是顺式-11-十八烯醛。 [0087] 图7描述了由方法1指定的JCC1170峰的MS裂解谱(各图面的上部质谱)，相对于其各自的NIST库发现绘制(各图面的下部质谱)。A，1-十四醇；B，1-十六醇。 [0088] 图8A描述了JCC1221、JCC1220、JCC1160b、JCC1160a、JCC1160和JCC879细胞团BHT-丙酮提取物的0到75000000计数的总离子色谱，以及C13-C20的正烷烃和C14、C16和C18的正烷醇正式标准。18分钟左右的双峰分别对应十九-二-烯和1-十九烯(数据未显示)(由JCC138自然产生的正烯烃)；图8B描述了JCC1221和JCC879细胞团BHT-丙酮提取物 的0到2250000计数的总离子色谱，以及8A中提及的正烷烃和正烷醇的正式标准。 [0089] 图9描述了由方法1指定的JCC1221峰的MS裂解谱(各图面的上部质谱)，相对于其各自的NIST库发现绘制(各图面的下部质谱)。A，正十三烷；B，正十四烷；C，正十五烷；D，正十六烷；E，正十七烷；F，1-十八醇。 [0090] 图10描述了JCC1221中随壮观霉素浓度变化的细胞内正烷烃产量。 [0091] 图11描述了JCC1281细胞团BHT-丙酮提取物的0到1080000计数的总离子色谱，相比于对照株JCC138的总离子色谱，以及正式标准正烷烃的总离子色谱。 [0092] 图12描述了由方法1指定的JCC1281峰的MS裂解谱(各图面的上部质谱)，相对于其各自的NIST库发现绘制(各图面的下部质谱)。A，正十五烷；B，正十七烷。 [0093] 图13描述了由方法1指定的JCC3峰MS裂解谱(各图面的上部质谱)，相对于其各自的NIST库发现绘制(各图面的下部质谱)。A，正十五烷；B，正十六烷；C.正十七烷。 [0094] 图14描述了与对照株JCC1084相比，JCC1084t中增强的细胞内正烷烃产生。误差棒代表了3个独立观察的标准差。 [0095] 图15描述了JCC1113和JCC1221细胞团BHT-丙酮提取物的0到31500000计数的总离子色谱，以及正式标准正烷烃。 [0096] 详细说明 [0097] 除非本发明中另有限定，关于本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文需要，单数术语应该包含复数而复数术语应当包含单数。通常，本发明中描述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学及蛋白质和核酸化学作用和杂交学相关使用的术语和其技术是本领域众所周知并常用的。 [0098] 除非另有注明，本发明的方法和技术通常依据本领域公知的常规方法和按本说明书中引用和讨论的各种一般的和更具体的参考文献中描述的进行。参见， 如 Sambrook 等 ,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 第 二 版 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Ausubel 等 ,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992和2002增刊)； Harlow 和 Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)；Taylor 和 Drickamer,Introduction to Glycobiology,Oxford Univ.Press(2003)；Worthington Enzyme Manual,Worthington Biochemical Corp.,Freehold,N.J.；Handbook of Biochemistry:Section A Proteins,Vol I,CRC Press(1976)；Handbook of Biochemistry:Section A Proteins,Vol II,CRC Press(1976)；Essentials of Glycobiology,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)。 [0099] 本发明中涉及的所有出版物、专利和其他参考文献在此被整体纳入作为参考。 [0100] 下列术语，除非另有说明，应当被理解为具有下列含义： [0101] 术语“多核苷酸”或“核酸分子”是指至少10个碱基长度的核苷酸聚合形式。该术语包括DNA分子(如cDNA或基因组的或合成的DNA)和RNA分子(如mRNA或合成的RNA)，以及包含非天然核苷酸类似物、非原始核苷间键(intemucleoside bond)或两者的DNA或RNA类似物。核酸可以是任何拓扑构象。例如，核酸可以是单链的、双链的、三链的、四重体的、部分双链的、分枝的、发夹的、环形的或是扣锁构象的。 [0102] 除非另有说明，且作为通常为“SEQ ID NO：”的形式的本发明描述的所有序列的例子，“包含SEQ ID NO：1的核酸”是指其至少一部分具有(i)SEQ ID NO：1的序列，或(ii)与SEQ ID NO：1互补的序列的核酸。这两者间的选择由上下文决定。例如，如果该核酸被用作探针，这两者间的选择由探针与所希望的靶互补的需要决定。 [0103] “分离”的RNA、DNA或混合聚合物是基本上与天然宿主细胞中与该天然多核苷酸自然伴随的其他细胞成分(如与其自然相关的核糖体、聚合酶以及基因组序列)分离的RNA、DNA或混合聚合物。 [0104] 本发明中使用的，“分离的”有机分子(如烷烃、烯烃或烷醛)是基本上与其所来源的宿主细胞的细胞成分(如膜脂质、染色体、蛋白质)，或与宿主细胞在其中培养的培养基分离的有机分子。尽管特定的分离的生物分子可以被纯化至接近均质，但该术语不要求生物分子与所有其他化学物质分离。 [0105] 术语“重组的”是指(1)已从其自然发生的环境中移除，(2)不与自然发现的该基因中的多核苷酸的所有或部分相关联，(3)与其非自然关连的多核苷酸可操作地连接，或(4)不自然存在的生物分子，如基因或蛋白质。术语“重组的”可用于指克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物、或通过源源系统生物合成的多核苷酸类似物，以及用于指由这类核酸编码的蛋白质和/或mRNAs。 [0106] 如本发明中使用的，如果异源序列被置于与内源核酸序列相邻以使该内源核酸序列的表达被改变，则生物体基因组中的该内源核酸序列(或该序列编码的蛋白质产物)本发明中被认为是“重组的”。在该情况下，异源序列是非天然与内源核酸序列相邻的序列，无论该异源序列其本身是否是内源(源自相同的宿主细胞或其后代)或外源的(源自不同的宿主细胞或其后代)。举例来说，启动子序列可以置换(例如通过同源重组)宿主细胞基因组中基因的天然启动子，以使该基因具有改变的表达模式。因为其至少与一部分自然位于其侧面的序列分离，该基因现变为“重组的”。 [0107] 如果核酸包含任何对于基因组中的相应核酸非自然发生的修饰，则该核酸也被认为是“重组的”。例如，如果其包含人为导入(如通过人为干预)的插入、缺失或点突变，则内源编码序列被认为是“重组的”。“重组的核酸”也包括在异源位点整合入宿主细胞染色体中的核酸以及作为附加体存在的核酸构建体。 [0108] 本发明中使用的，短语参考核酸序列的“简并变体”包括可以依据标准遗传密码翻译以提供与从参考核酸序列翻译的相同的氨基酸序列的核酸序列。术语“简并寡核苷酸”或“简并引物”用于表示能够与靶核酸序列杂交的寡核苷酸，该靶核酸序列不必要在序列上相同但在一个或多个特定片段内相互同源。 [0109] 涉及核酸序列的术语“序列同一性百分数”或“相同”是指当以最大对应性比对时相同的两个序列中的残基。序列同一性比较的长度可以覆盖至少约9个核苷酸的延伸，通常至少约20个核苷酸，更经常至少约24个核苷酸，通常至少约28个核苷酸，更通常至少约32个核苷酸，且优选至少36个或更多的核苷酸。本领域中有多种已知的不同算法可用于测定核苷酸序列同一性。例如，可以使用Wisconsin Package版本10.0,Genetics Computer Group(GCG),Madison,Wis的程序FASTA、Gap或Beatfit来比较多核苷酸序列。 FASTA提供查询和检索序列间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分数。Pearson,Methods Enzymol.183:63-98(1990)(在此通过引用整体纳入本发明)。例如，核酸序列间的同一性百分数可以FASTA以其默认参数(6的字段大小和用于得分矩阵的NOPAM因子)，或使 用GCG版本6.1(纳入作为参考)中提供的Gap以其默认参数来确定。可选择地，可以使 用计算机程序BLAST来比较序列(Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Gish和States,Nature Genet.3:266-272(1993)；Madden等,Meth.Enzymol.266:131-141(1996)； Altschul 等 ,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)；Zhang 和 Madden,Genome Res.7:649-656(1997))，特 别 是 blastp 或 tblastn(Altschul 等 ,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997))。 [0110] 术语“基本同源性”或“基本相似性”当指核酸或其片段时，表示在以适合的核苷酸插入或缺失与另一核酸(或其互补链)最佳比对时，以上面讨论的任何序列同一性的公知算法如FASTA、BLAST或Gap计算的，在至少约76％、80％、85％，优选至少约90％，更优选至少约95％、96％、97％、98％或99％核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性。 [0111] 或者，当核酸或其片段与另一核酸、与另一核酸的链或与其互补链在严格杂交条件下杂交时，存在基本同源性或相似性。核酸杂交试验情况中的“严格杂交条件”和“严格清洗条件”取决于多种不同的物理参数。如本领域技术人员容易理解的，核酸杂交会受到如盐浓度、温度、溶剂、杂交种类的碱基组成、互补区域长度和杂交核酸之间核苷酸碱基的失配数目的这些条件的影响。具备本领域常识的人知道怎样改变这些参数以实现特定的杂交严格性。 [0112] 通常，“严格杂交”在低于特定条件组合下特异DNA杂交物的热熔点(Tm)约25℃下进行。“严格清洗”在低于特定条件组合下特异DNA杂交物的Tm约5℃的温度下进行。Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。见Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 二 版 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989),9.51页，如此纳入作为参考。出于本发明的目的，“严格条件”对于溶液相杂交定义为在6xSSC(其中20xSSC含有3.0M NaCl和0.3M柠檬酸钠)中，1％SDS，65℃下进行水相杂交(即，没有甲酰胺)8-12小时，随后进行两次在0.2xSSC中，0.1％SDS，65℃下的清洗20分钟。技术人员可以理解在65℃下的杂交会以取决于包括杂交序列长度和同一性百分数的多个因素的不同速率发生。 [0113] 本发明的核酸(也被称为多核苷酸)可以包括RNA、cDNA、基因组DNA和上述核酸的合成形式与混合聚合体的有义链和反义链。如本领域技术人员容易理解的，它们可以被化学和生物化学地修饰，或可以包含非天然的或衍生的核苷酸碱基。这样的修饰包括，例如，标记、甲基化、一个或多个天然存在的核苷酸被类似物替换、核苷酸间修饰(intemucleotide modification)如不带电连接(如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电的连接(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧部分(如多肽等)、嵌入剂(如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和修饰的连接(如，α端基异构核酸等)。也包括模拟多核苷酸通过氢键和其他化学相互作用结合指定序列的能力的合成分子。这样的分子是本领域已知的且包括，例如，在分子骨架中肽键替代磷酯键的分子。其他修饰可包括，例如其中核糖环包含桥接部分或其他结构如在“锁”核酸中发现的修饰的类似物。 [0114] 当用于核酸序列时，术语“突变的”意思是与参考核酸序列相比，核酸序列中的核苷酸可以被插入、缺失或改变。可以在基因座上进行单一改变(点突变)或在单个基因座上插入、缺失或改变多个核苷酸。此外，可以在核酸序列内的任意数目的基因座上进行一个或多个改变。核酸序列可以用任何本领域已知的方法突变，包括但不限于诱变技术如“易错PCR”(在DNA聚合酶的复制保真度低的条件下进行PCR以使得沿PCR产物的 全长获得高点突变率的过程，见Leung等,Technique,1:11-15(1989)以及Caldwell和 Joyce,PCR Methods Applic.2:28-33(1992))；和“寡核苷酸定点诱变”(能够在任何感兴趣的克隆DNA片段中产生点特异性突变的过程；见，如Reidhaar-Olson和Sauer,Science 241:53-57(1988))。 [0115] 本发明使用的术语“衰减”通常指功能缺失，包括对基因序列或控制基因序列转录的序列进行的突变、部分或全部缺失、插入、或其他变化，其降低或抑制基因产物的产生，或产生出非功能性的基因产物。在某些情况下功能缺失被描述为敲除突变。衰减也包括通过改变核酸序列的氨基酸序列变化、将基因置于较不活跃的启动子控制之下、下调、表达指向感兴趣的基因的干扰RNA、核酶或反义序列或通过任何其他本领域已知的技术。在一个实例中，特定酶对于反馈抑制或非产物或反应物的组合物引起的抑制(非途径特异性反馈)的敏感性较低，以使得酶活性不受化合物存在的影响。在其他情况下，已被改变为较低活性的酶可以被称为衰减的。 [0116] 缺失：从核酸分子中去除一个或多个核苷酸或从蛋白质中去除一个或多个氨基酸，从而两侧的区域连接在一起。 [0117] 敲除：表达水平或活性被降低至零的基因。在某些实例中，基因通过其编码序列的部分或全部的缺失被敲除。在其他实例中，基因通过向其开放阅读框中引入一个或多个核苷酸(其导致无义的或另外非功能性蛋白质产物的翻译)被敲除。 [0118] 本发明中使用的术语“载体”意图指能够转运其已连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其通常是指环形双链DNA环，另外的DNA片段可以接合到其中，但也包括线性双链分子如由聚合酶链式反应(PCR)扩增得到的或从用限制性内切酶处理环形质粒得到的线性双链分子。其他载体包括粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)。另外一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段可以被接合到病毒基因组中(下面更详细地讨论)。特定载体能够在其被引入的宿主细胞内自主复制(如，具有在宿主细胞内起作用的复制起点的载体)。其他载体在被引入宿主细胞中时可以被整合进宿主细胞的基因组中，并由此随宿主基因组一起复制。此外，特定的优选载体能够引导其可操作地连接的基因的表达。这样的载体本发明中被称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)[0119] “可运行地连接的”或“可操作地连接的”表达控制序列是指其中表达控制序列与感兴趣的基因连续的连接以控制感兴趣的基因，以及以反式方式或在一定距离起作用以控制感兴趣的基因的表达控制序列。 [0120] 本发明中使用的术语“表达控制序列”是指影响与之可操作连接的编码序列的表达所必须的多核苷酸序列。表达控制序列是控制核酸序列的转录、转录后事件和翻译的序列。表达控制序列包括适合的转录起始、终止、启动子和增强子序列；高效的RNA加工信号如剪接和多腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(如，核糖体结合位点)；提高蛋白质稳定性的序列；和当需要时，增加蛋白质分泌的序列。这样的控制序列的性质依宿主生物体的不同而不同；在原核生物中，这样的控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“控制序列”意图包括，最少其存在对于表达至关重要的所有组分，且也可以包括其存在有利的其他组分，例如前导序列和融合伴体序列。 [0121] 本发明中使用的术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)意指重组载体被引入的细胞。应当理解这样的术语不仅是指特定对象细胞，也指这样细胞的后代。由于突变或环境影响可能导致后续世代中发生特定的改变，这样的后代可能实际上不与母细胞相同，但仍然包含在本发明使用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以是培养中的分离的细胞或细胞系，或可以是定殖于活组织或生物体中的细胞。 [0122] 本发明中使用的术语“肽”是指短的多肽，如通常低于50个氨基酸长度和更通常低于30个氨基酸长度的多肽。本发明中使用的术语包括类似物和模拟结构和由此模拟生物功能的模拟物。 [0123] 术语“多肽”包括自然发生的和非自然发生的蛋白质及其片段、突变体、衍生物和类似物。多肽可以是单体的或聚合的。此外，多肽可以包括多个不同的结构域，各结构域有一种或多种不同的活性。 [0124] 术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是就其衍生的起源或来源来说(1)不与在其原始状态中伴随的天然相关的组分结合，(2)以自然中不存在的纯度存在，其中纯度可以相对于其他细胞物质的存在来判定(如，不含来自相同种的其他蛋白质)，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不是自然发生的(如其是自然发现的多肽的片段，或其包含自然中不存在的氨基酸类似物或衍生物或不同于标准肽键的连接)。因此，化学合成的或在不同于其天然来源细胞的细胞系统中合成的多肽将与其自然相关的组分“分离”。多肽或蛋白质也可以通过使用本领域公知的蛋白质纯化技术分离而使得基本没有天然相关的组分。如此定义的，“分离的”不必须是需要这样描述的蛋白质、多肽、肽或寡肽已从其原始环境中物理移除。 [0125] 本发明中使用的术语“多肽片段”是指与全长的多肽相比具有缺失，如氨基端和/或羧基端缺失的多肽。在优选的实施方式中，多肽片段是其中片段的氨基酸序列与自然发生序列中的对应位置相同的连续序列。片段通常为至少5、6、7、8、9或10个氨基酸长，优选至少12、14、16或18个氨基酸长，更优选至少20个氨基酸长，更优选至少25、30、35、40或45个氨基酸长，甚至更优选至少50或60个氨基酸长，甚至更优选至少70个氨基酸长。 [0126] “修饰的衍生物”是指初级结构序列基本同源，但包括例如体内或体外化学或生物化学修饰或整合了天然多肽中不存在的氨基酸的多肽或其片段。如本领域技术人员容易理解的，这样的修饰包括，例如乙酰化、羧化、磷酸化、糖基化、泛素化、标记(如用放射性核素)以及各种酶修饰。多种标记多肽的方法和多种用于这样目的的取代物或标记是本领域125 32 35 3 公知的，并包括放射性同位素如 I、P、S和 H、连接到标记的抗配体物(antiligand)(如抗体)上的配体、荧光团、化学发光剂、酶及可以作为标记配体的特异性结合对成员的抗配体物。标记的选择取决于需要的灵敏度、与引物偶联的难易、稳定性要求和可用的手段。 标记多肽的方法是本领域公知的，参见如Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992和2002增刊)(在此纳入作为参考)。 [0127] 术语“融合蛋白”是指包含与异源氨基酸序列偶联的多肽或片段的多肽。融合蛋白是有用的，因为它们可以被构建为包含来自两个或更多个不同蛋白质的两个或更多想要的功能元件。融合蛋白包含来自感兴趣的多肽的至少10个连续氨基酸，更优选至少20或30个氨基酸，甚至更优选至少40、50或60个氨基酸，还更优选至少75、100或125个氨基酸。包括本发明蛋白质整体的融合体有特别的用途。包括在本发明融合蛋白中的异源多肽至少6个氨基酸长，经常至少8个氨基酸长，并有利地至少15、20、和25个氨基酸长。包括更大的多肽(如IgG Fc区域)和甚至整个蛋白质(如含有绿色荧光蛋白(“GFP”)发色团 的蛋白质)的融合体有特别的用途。融合蛋白可以通过构建与编码不同蛋白质或肽的核酸序列同框的编码多肽或其片段的核酸并随后表达该融合蛋白来重组产生。可选地，融合蛋白可以通过将多肽或其片段与另一蛋白质交联来化学产生。 [0128] 本发明中使用的术语“抗体”是指其至少一部分由至少一个免疫球蛋白基因或其片段编码且能与希望的靶分子特异性结合的多肽。该术语包括天然存在的形式以及片段和衍生物。 [0129] 术语“抗体”范围内的片段包括由使用各种蛋白酶消化产生的片段，由化学切割和/或化学解离产生的片段以及重组产生的片段，只要该片段仍能特异性结合靶分子。在这些片段中有Fab、Fab’、Fv、F(ab’)2和单链Fv(scFv)片段。 [0130] 该术语范围内的衍生物包括进行过序列上的修饰但仍能够特异性结合靶分子的抗体(或其片段)，包括种间嵌合和人源化抗体、抗体融合体、杂聚抗体复合物和抗体融合体，如双价抗体(双特异性抗体)、单链双价抗体和胞内抗体(见，例如Intracellular Antibodies:Research and Disease Applications,(Marasco,作 者 ,Springer-Verlag New York,Inc.,1998)，其公开被整体纳入本文作为参考。 [0132] 术语“非肽类似物”是指具有与参考肽的特性相似的特性的化合物。非肽化合物可以被称为“肽模拟物”或“拟肽”。见，例如，Jones,Amino Acid和Peptide Synthesis,Oxford University Press(1992)；Jung,Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries:A Handbook,John Wiley(1997)；Bodanszky 等 ,Peptide Chemistry--A PracticalTextbook,Springer Verlag(1993)；Synthetic Peptides:A Users Guide,(Grant, 作者,W.H.Freeman和Co.,1992)；Evans等,J.Med.Chem.30:1229(1987)；Fauchere,J.Adv.Drug Res.15:29(1986)；Veber和Freidinger,Trends Neurosci.,8:392-396(1985)，及上述各文献中引用的参考文献，其纳入本发明作为参考。这样的化合物通常在计算机分子建模的辅助下开发。与本发明中有用的肽结构相似的肽模拟物可以用于产生等同的效果，且因此被设想为本发明的一部分。 [0133] “多肽突变体”或“突变蛋白”是指与天然或野生型蛋白质的氨基酸序列相比，其序列包含一个或多个氨基酸的插入、重复、缺失、重排或置换的多肽。突变蛋白可以是在自然发生的蛋白质的序列中具有一个或多个氨基酸点置换，其中一个位置上的单个氨基酸被改变成另一种氨基酸、一个或多个插入和/或缺失，其中一个或多个氨基酸分别被插入或缺失，和/或在氨基或羧基端任一端或在两端截短。与自然发生的蛋白质相比，突变蛋白可以具有相同，但优选具有不同的生物活性。 [0134] 突变蛋白与野生型对应物具有至少85％的整体序列同源性。甚至更优选是与野生型蛋白质具有至少90％的整体序列同源性的突变蛋白。 [0135] 在甚至更优选的实施方式中，突变蛋白显示至少95％的序列同一性，甚至更优选98％，甚至更优选99％以及甚至更优选99.9％的整体序列同一性。 [0136] 序列同一性可以通过任何普通的序列分析算法，如Gap或Bestfit来测定。 [0137] 氨基酸置换可以包括：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力或酶活性，和(5)赋予或改变这类类似物的其他物理化学或功能特性的置换。 [0138] 如本发明中使用的，二十种常见氨基酸和其缩写遵循常规用法。见Immunology-A Synthesis(Golub和Gren编辑,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.,第二版，1991)，其纳入本发明作为参考。二十种常见氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸如α-,α-双取代氨基酸、N-烷基氨基酸和其他非常见氨基酸也可以是本发明多肽的适合组分。非常见氨基酸的例子包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、N-甲基精氨酸以及其他相似氨基酸和亚氨基酸(如4-羟脯氨酸)。在本发明中使用的多肽符号中，按照标准的用法和规则，左手端对应氨基末端和右手端对应羧基末端。 [0139] 如果编码蛋白质的核酸序列具有与编码第二种蛋白质的核酸序列相似的序列，该蛋白质与第二种蛋白质具有“同源性”或者是与其“同源的”。可选地，如果两种蛋白质有“相似”的氨基酸序列，蛋白质与第二种蛋白质具有同源性。(因此，术语“同源蛋白质”定义为表示两种蛋白质具有相似的氨基酸序列。)如本发明中使用的，氨基酸序列两个区域间的同源性(特别是关于预测的结构相似性)被解释为暗示了功能上的相似。 [0140] 当对蛋白质或肽使用“同源的”时，公认的是不相同的残基位置通常因保守的氨基酸置换而不同。“保守的氨基酸置换”是其中氨基酸残基由另一种带具有相同化学性能(如电荷或疏水性)的侧链(R基)的氨基酸残基置换。通常，保守的氨基酸置换基本不会改变蛋白质的功能特性。在两个或多个氨基酸序列由于保守氨基酸置换而互不相同的情况下，序列同一性百分数或同源度可以上调以对于置换的保守性进行校正。进行这种调整的方法本领域技术人员公知的。见，如Pearson,1994,Methods Mol.Biol.24:307-31和 25:365-89(纳入本发明作为参考)。 [0141] 下列六组各包括互为保守置换的氨基酸：1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天门冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天门冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。 [0142] 多肽的序列同源性，也被称为序列同一性百分数，通常使用序列分析软件测 定。 见，如 Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group(GCG),University of Wisconsin Biotechnology Center,910University Avenue,Madison,Wis.53705。蛋白质分析软件使用赋于各种置换、缺失和包括保守氨基酸置换的其他修饰的同源性测量值来匹配相似序列。例如，GCG包含如“Gap”和“Bestfit”的程序，这些程序可以默认参数使用以确定密切相关的多肽，如来自不同生物种的同源多肽之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。见，如GCG版本6.1。 [0143] 当比较特定多肽序列和包含来自不同生物体的大量序列的数据库时，优选的算法是计算机程序BLAST(Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Gish和 States,Nature Genet.3:266-272(1993)；Madden等,Meth.Enzymol.266:131-141(1996)； Altschul 等 ,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)；Zhang 和 Madden,Genome Res.7:649-656(1997))，特 别 是 blastp 或 tblastn(Altschul 等 ,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997))。 [0144] BLASTp优选的参数为：期望值10：(默认)；过滤器：seg(默认)；开放空位罚分：11(默认)；扩展空位罚分：1(默认)；最大比对：100(默认)；字段大小：11(默认)；描述编号：100(默认)；罚分矩阵：BLOWSUM62。 [0145] 比较同源性的多肽序列的长度一般至少约16个氨基酸残基，经常至少约20个残基，更经常至少约24个残基，通常至少约28个残基，优选多于约35个残基。当检索包含来自大量不同生物体的序列的数据库时，优选比较氨基酸序列。使用氨基酸序列的数据库检索可以通过本领域已知的非blastp算法测定。例如，可以使用FASTA，GCG版本6.1中的程序来比较多肽序列。FASTA提供查询和检索序列间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分数。Pearson,MethodsEnzymol.183:63-98(1990)(纳入本发明作为参考)。例如，如GCG版本6.1(纳入本发明作为参考)中提供的，氨基酸序列间的序列同一性百分数可以使用FASTA以其默认参数(2的字段大小和PAM250得分矩阵)确定。 [0146] “特异性结合”是指两个分子优先于与环境中的其他分子结合而相互结合的能力。通常，“特异性结合”区别于反应中的偶然结合至少2倍、更通常至少10倍，经常至少100-7 倍。通常，如通过解离常数量化的，特异性结合反应的亲和力或亲合力约为10 M或更强(如-8 -9 10 M、10 M或甚至更强)。 [0147] “干细胞重百分数”是指如下获得的烃产生的测量：浓缩一定体积的培养物以团聚细胞。通过至少一个微量离心和吸出循环来清洗细胞并去湿。细胞团冻干过夜，再次称量含有干细胞团的管以在±0.1mg内计算出细胞团的质量。同时为确定干细胞重量处理细胞，所述培养物的第二样品被收获、清洗并去湿。得到的细胞团(对应于1-3mg细胞干重)随后通过在约1ml丙酮加作为抗氧化剂的二丁基羟基甲苯(BHT)和内标(如正二十七烷)中漩涡来提取。随后通过离心来团聚细胞碎片而取上清(提取物)做GC分析。为准确定量正 烷烃，使用火焰电离检测(FID)与MS总离子计数相对。使用GC-FID峰面积和正式正烷烃标准的已知浓度间的校准关系来计算生物提取物中的正烷烃浓度。既然知道提取物体积、得到的提取物中正烷烃物质的浓度和提取的细胞团的细胞干重，可以确定包含正烷烃的细胞干重百分数。 [0148] 本发明中使用的术语“区域”是指生物分子初级结构的物理连续部分。在蛋白质的情况下，区域被定义为该蛋白质氨基酸序列的连续部分。 [0149] 本发明中使用的术语“域”是指造成生物分子已知的或可能的功能的生物分子结构。域可以与其区域或部分同延；域也可以包括生物分子的不同的非连续区域。蛋白质域的例子包括，但不限于，Ig域、胞外域、跨膜结构域和胞质域。 [0150] 本发明中使用的术语“分子”指任何化合物，包括但不限于，小分子、肽、蛋白质、糖、核苷酸、核酸、脂质等，且这样的化合物可以是天然的或合成的。 [0151] “感兴趣的碳基产物”包括醇类，如乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、脂肪醇、脂肪酸酯、蜡酯；烃和烷烃，如丙烷、辛烷、柴油、喷气推进剂8(JP8)；聚合物如对苯二酸酯、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、多元醇、聚羟基烷酸酯(PHA)、聚-β-羟基丁酸酯(PHB)、丙烯酸酯、己二酸、ε-己内酯、异戊二烯、己内酰胺、橡胶；商品化学品，如乳酸二十二碳六烯酸(DHA)的、3-羟基丙酸酯、γ-戊内酯、赖氨酸酯、丝氨酸、天门冬氨酸酯、天门冬氨酸、山梨醇、抗坏血酸盐、抗坏血酸、异戊烯醇、羊毛甾醇、ω-3DHA、番茄红素、衣康酸酯、1,3-丁二烯、乙烯、丙烯、琥珀酸酯、柠檬酸酯、柠檬酸、谷氨酸酯、苹果酸酯、3-羟基丙酸(HPA)、乳酸、四氢呋喃、γ-丁内酯、吡咯烷酮、羟丁酸、谷氨酸、乙酰丙酸、丙烯酸、丙二酸；特种化学品，如类胡萝卜素、类异戊二烯、衣康酸；药物和药物中间体，如7-氨基脱乙酰氧基头孢菌烷酸(7-ADCA)/头孢菌素、红霉素、聚酮、抑制素、紫杉醇、多西紫杉醇、萜、肽、类固醇、ω-脂肪酸和其他这类感兴趣的合适产物。这样的产物在生物燃料、工业和特种化学品的情况中有用，作为用于其他产品如营养补充品、功能食品(neutraceutical)、聚合物、石蜡替代品、个人护理产品和药品的中间体。 [0152] 生物燃料：生物燃料是指源于生物来源的任何燃料。生物燃料可以指一种或多种烃、一种或多种醇、一种或多种脂肪酯或其混合物。 [0153] 烃：该术语通常指由碳(C)元素、氢(H)元素和可选的氧(O)元素组成的化合物。烃基本有三种类型，如芳香烃、饱和烃和不饱和烃如烯烃、炔烃和二烯烃。该术语也包括燃料、生物燃料、塑料、蜡、溶剂和油。烃包括生物燃料，以及塑料、蜡、溶剂和油。 [0154] 除非另外指明，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。下面描述了示例性的方法和材料，尽管类似或等同于本发明中描述的方法和材料的方法和材料也可以用于实施本发明且其对本领域技术人员显而易见。本发明中涉及的所有出版物和其他参考文献整体纳入本发明作为参考。在冲突的情况下，本发明的说明书(包括定义)优先。材料、方法和实施例仅是示例性的而不意图是限制性的。 [0155] 在全部说明书和权利要求中，单词“包括”或其变型如“包含”或“包括有”应被理解为指包含指定的成分或成分组，但不排除任何其他成分或成分组。 [0156] 核酸序列 [0157] 烷烃，也被称为石蜡，是仅由碳(C)元素和氢(H)元素组成的化合物(即，烃类)，其中这些原子毫无例外地被单键连接在一起(即，其为饱和化合物)而没有任何环状结构。正烷烃是线性的，即非支链的，烷烃。AAR和ADM酶一起起到从酰基-ACP分子合成正烷烃的作用。 [0158] 因此，本发明提供编码AAR和ADM酶及其变体的基因的分离核酸分子。示例性的编码AAR基因的全长核酸序列分别如SEQ ID NO：1、5和13所示，对应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2、6、和10所示。示例性的编码ADM基因的全长核酸序列分别如SEQ ID NO：3、7、和14所示，对应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、8、和12所示。本发明提供的另外的核酸包括分别编码表1和表2中AAR和ADM酶的任何基因。 [0159] 在一个实施方式中，本发明提供了具有包含编码在感兴趣的宿主细胞中表达的AAR和ADM及其同源物、变体和衍生物的基因或由该基因组成的核酸序列的分离的核酸分子。本发明也提供了包含本发明描述的AAR和ADM基因的密码子优化版本(如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11，其为在聚球藻PCC7002中表达马里纳斯原绿球藻(Prochlorococcus marinus)MIT 9312的AAR和ADM基因而优化)的序列或由该序列组成的核酸分子。在进一步的实施方式中，本发明提供了核酸分子及该分子的同源物、变体和衍生物，其包含作为与野生型基因至少具有76％同一性的AAR或ADM基因的变体序列或由这样的序列组成。核酸序列可以优选与野生型基因具有80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.9％或甚至更高的同一性。 [0160] 在另一个实施方式中，本发明的核酸分子编码具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的多肽。优选的，本发明的核酸分子编码与SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12具有至少50％、60、70％、80％、85％、90％或95％同一性的多肽序列，且同一性甚至可以更优选为96％、97％、98％、99％、99.9％或甚至更高。 [0161] 本发明也提供在严格条件下与上述核酸分子杂交的核酸分子，如上面定义和本领域公知的，严格杂交在低于在特定条件集下特定DNA杂交物的热熔点(Tm)约25℃下进行，其中Tm是50％靶序列与完美匹配的探针杂交的温度。严格清洗在低于特定条件集下特定DNA杂交物的Tm约5℃的温度下进行。 [0162] 也提供了包含任一个上述核酸序列的片段的核酸分子。这些片段优选包含至少20个连续的核苷酸。更优选核酸序列的片段包含至少25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或甚至更多的连续核苷酸。 [0163] 本发明的核酸序列片段显示出在多种系统和方法中的用途。例如，该片段可以用作多种杂交技术中的探针。取决于方法，鞎核酸序列可以是DNA或RNA。靶核酸序列可以在杂交前分级(如通过凝胶电泳)，或者可以原位对样品进行杂交。本领域技术人员会理解已知序列的核酸探针在染色体结构确定中(如，通过DNA印迹)或基因表达测量中(如，通过RNA印迹)具有用途。在这样的实验中，序列片段优选被可检测的标记，以使其与靶序列的特异性杂交可以被检测和任选地定量。本领域技术人员会理解本发明的核酸片段可以被用在多种本发明没有特别描述的印迹技术中。 [0164] 也应当理解，当固定在微阵列上时本发明公开的核酸序列片段也有作为探针的用途。通过将核酸沉积并固定到载体基板上制造微阵列的方法是本领域公知的。在 DNA Microarrays:A Practical Approach(Practical Approach Series),Schena( 编 者 ),Oxford University Press(1999)(ISBN:0199637768)；Nature Genet.21(1) (suppl):1-60(1999)；Microarray Biochip:Tools and Technology,Schena(编者),Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division(2000)(ISBN:1881299376) 中 综述，其公开整体纳入本发明作为参考。例如，使用包含核酸序列片段，如本发明公 开的核酸序列片段的基因表达分析具有用于细胞和分子生物学领域中的序列片段 的得到确认的用途。固定在微阵列上的序列片段的其他用途在Gerhold等,Trends Biochem.Sci.24:168-173(1999) 和 Zweiger,Trends Biotechnol.17:429-436(1999)； DNA Microarrays:A Practical Approach(Practical Approach Series),Schena( 编 者 ),Oxford University Press(1999)(ISBN:0199637768)；Nature Genet.21(1) (suppl):1-60(1999)；Microarray Biochip:Tools and Technology,Schena(编者),Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division(2000)(ISBN:1881299376)中描述，其中各文献的公开整体纳入本发明作为参考。 [0165] 如本领域公知的，可以以各种方式测定酶活性。例如OMP的焦磷酸解可以用分光 光度方式 追踪(Grubmeyer等,(1993)J.Biol.Chem.268:20299-20304)。 可 选地，酶活性可以使用色谱技术追踪，如高效液相色谱法(Chung和Sloan,(1986) J.Chromatogr.371:71-81)。作为另一种可选方式，活性可以通过确定酶活性 产生的产物水平而间接测量。这些水平可以使用包括本领域已知和描述的氯 仿/甲 醇水 性 提取 的 技术 测定 (Cf.M.Kates(1986)Techniques of Lipidology； Isolation,analysis and identification of Lipids.Elsevier Science Publishers,New York(ISBN:0444807322))。更现代的技术包括使用与质谱联合的气 相 色 谱 (Niessen,W.M.A.(2001).Current practice of gas chromatography--mass spectrometry.New York,N.Y:Marcel Dekker.(ISBN:0824704738))。包 括 液 相 色 质谱(LCMS)、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳、基质辅助激光解吸电离飞行时间质 谱(MALDI-TOF MS)、核磁共振(NMR)、近红外(NIR)光谱、粘度测定(Knothe,G(1997) Am.Chem.Soc.Symp.Series,666:172–208)、测定游离脂肪酸的滴定(Komers(1997)Fett/Lipid,99(2):52–54)、酶学方法、基于物理性质的方法、湿式化学方法等另外的用于识别重组蛋白质活性和产物的现代技术可以被用于分析本发明生物体产生的产物水平和特性。 如本领域技术人员所知，其他的方法和技术也可能适合于酶活性的测量。 [0166] 载体 [0167] 也提供了载体，包括表达载体，其如本发明中进一步描述的，包含上述的本发明的核酸分子。在第一实施方式中，载体包括上述分离的核酸分子。在替代的实施方式中，本发明的载体包括与一种或多种表达控制序列可操作地连接的上述核酸分子。因此本发明的载体可以用于通过宿主细胞表达促进正烷烃生产活性的AAR和/或ADM多肽。 [0168] 可用于在原核生物中表达核酸的载体是本领域公知的。 [0169] 分离的多肽 [0170] 依据本发明另一个方面，提供了由本发明核酸分子编码的分离的多肽(包括突变蛋白、等位变异体、片段、衍生物和类似物)。在一个实施方式中，分离的多肽包含对应于SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的多肽序列。在本发明的替代实施方式中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12至少85％相同的多肽序列。优选本发明分离的多肽与SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、98.1％、98.2％、 98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、 99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或甚至更高的同一性。 [0171] 依据本发明的其他实施方式，提供了包含上述多肽序列的片段的分离的多肽。这些片段优选含有至少20个连续氨基酸，更优选至少25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或甚至更多的连续氨基酸。 [0172] 本发明的多肽也包括上述多肽序列与异源多肽间的融合体。异源序列可以，例如，包括设计以帮助纯化(如组氨酸标签)和/或重组表达的蛋白质的可视化的序列。蛋白融合体的其他非限制性例子包括允许在噬菌体或细胞表面上展示编码的蛋白质的融合体，与本质荧光蛋白(如绿色荧光蛋白(GFP))的融合体和与IgG Fc区域的融合体。 [0173] 宿主细胞转化体 [0174] 本发明的另一方面提供了使用本发明的核酸分子或载体转化的宿主细胞及其后代。在本发明的某些实施方式中，这些细胞携带载体上的本发明的核酸序列，载体可以是但不必须是自由复制载体。在本发明的其他实施方式中，核酸已被整合入宿主细胞的基因组中。 [0175] 在优选的实施方式中，宿主细胞包含在宿主细胞中表达AAR或ADM的一个或多个AAR或ADM编码核酸。 [0176] 在替代的实施方式中，本发明的宿主细胞可以通过本发明的分离核酸的破坏、缺失或突变进行的重组来突变，以使得相对于缺少突变的宿主细胞，宿主细胞中AAR和/或ADM蛋白的活性被降低或消除。 [0177] 用于产生感兴趣的碳基产物的选择的或工程化的微生物 [0178] 微生物：包括古细菌(Archaea)、真细菌(Bacteria)和真核生物(Eucarya)三界中的原核和真核微生物种类，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或高级原生生物。术语“微生物细胞”和“微小生物”可与术语微生物互换使用。 [0179] 多种宿主微生物可以被转化来产生感兴趣的产物。光合自养生物体包括真核植物和藻类以及原核蓝细菌、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌和紫色非硫细菌。 [0180] 嗜极微生物也被认为是适合的生物体。这样的生物体能承受各种环境参数如温度、辐射、压力、重力、真空、干燥、盐度、pH、氧压和化学物质。其包括在80℃或高于80℃下生长的超嗜热生物如延胡索酸火叶菌(Pyrolobus fumarii)；在60-80℃之间生长的嗜热生物如灰蓝聚球藻(Synechococcus lividis)；在15-60℃之间生长的中温生物；和在15℃或低于15℃下生长的低温生物如嗜冷杆菌(Psychrobacter)和某些昆虫。耐辐 射生物体包括耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)。耐压生物体包括耐受130Mpa压力的耐压生物。耐重生物体包括嗜压微生物。耐超重力(如>1g)低重力(<1g)生 物也包括在内。耐真空生物体包括缓步动物、昆虫、微生物和种子。耐干燥和低湿休眠(anhydrobiotic)生物体包括嗜旱生物如卤虫(Artemia salina)；线虫、微生物、真菌和地衣。耐盐生物体包括嗜盐生物(如2-5M NaCl)盐杆菌科(Halobacteriacea)和盐生杜氏 藻(Dunaliella salina)。耐pH生物体包括嗜碱生物如盐碱杆菌属(Natronobacterium)、强固芽孢杆菌(Bacillus firmus)OF4、螺旋藻属的种(Spirulina spp.)(如pH>9)和 嗜酸生物如高温红藻(Cyanidium caldarium)、铁原种属(Ferroplasma)(如低pH)。不 能耐受O2的厌氧生物如詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)；耐受一定O2的 微氧生物如梭菌属(Clostridium)和需要O2的需氧生物也被包括在内。耐受纯CO2的 气体耐受生物体包括高温红藻和金属耐受生物体包括耐金属体如嗜酸性铁氧化原始菌 (Ferroplasma acidarmanus)(如铜、铁、砷、镉、锌)和青枯菌属(Ralstonia)CH34种(如锌、钴、镉、汞、铅)。Gross,Michael.Life on the Edge:Amazing Creatures Thriving in Extreme Environments.New YorK:Plenum(1998)和Seckbach,J."Search for Life in the Universe with Terrestrial Microbes Which Thrive Under Extreme Conditions."In Cristiano Batalli Cosmovici,Stuart Bowyer及Dan Wertheimer编辑,Astronomical and Biochemical Origins and the Search for Life in the Universe,p.511. Milan:Editrice Compositori(1997)。 [0181] 植物包括但不限于下列属：拟南芥属(Arabidopsis)、甜菜属(Beta)、大豆属(Glycine)、麻风树属(Jatropha)、芒属(Miscanthus)、黍属(Panicum)、虉草 属(Phalaris)、杨属(Populus)、甘蔗属(Saccharum)、柳属(Salix)、希蒙得木属 (Simmondsia)和玉蜀黍属(Zea)。 [0182] 藻类和蓝细菌包括但不限于下列属：刺菊石属(Acanthoceras)、Acanthococcus属、Acaryochloris属、曲壳藻属(Achnanthes)、细曲壳藻属(Achnanthidium)、星状藻属(Actinastrum)、Actinochloris 属、辐 环 藻 属 (Actinocyclus)、辐 射 鼓 藻 属(Actinotaenium)、双金藻属(Amphichrysis)、前沟藻属(Amphidinium)、尖粒藻属(Amphikrikos)、双 肋 藻 属(Amphipleura)、茧 形 藻 属 (Amphiprora)、分 须 藻 属(Amphithrix)、双眉藻属(Amphora)、鱼腥藻属(Anabaena)、项圈藻属(Anabaenopsis)、暗额藻属(Aneumastus)、纤维藻属(Ankistrodesmus)、锚藻属(Ankyra)、异菱藻属 (Anomoeoneis)、虚幻球藻属(Apatococcus)、束丝藻属(Aphanizomenon)、隐球藻属 (Aphanocapsa)、隐 毛藻 属(Aphanochaete)、隐杆 藻属(Aphanothece)、梨囊 藻 属(Apiocystis)、顶丝藻 属(Apistonema)、四棘鼓藻 属(Arthrodesmus)、节旋藻 属 (Artherospira)、Ascochloris 属、星 杆 藻 属 (Asterionella)、绿 星 球 藻 属 (Asterococcus)、奥 杜藻 属(Audouinella)、沟链 藻属(Aulacoseira)、杆状 藻 属(Bacillaria)、巴尔比亚藻属(Balbiania)、似竹鼓藻属(Bambusina)、红毛菜属(Bangia)、鞭毛虫属(Basichlamys)、串珠藻属(Batrachospermum)、骈胞藻属(Binuclearia)、角藻属(Bitrichia)、盘苔属(Blidingia)、拟气球藻属(Botrdiopsis)、气球藻属(Botrydium)、葡萄藻属(Botryococcus)、球葡萄藻属(Botryosphaerella)、咸胞藻属(Brachiomonas)、短纹 藻 属 (Brachysira)、短 毛 藻 属 (Brachytrichia)、Brebissonia属、毛 鞘 藻 属(Bulbochaete)、柱杆藻属(Bumilleria)、拟柱杆藻属(Bumilleriopsis)、美壁藻属 (Caloneis)、眉藻属(Calothrix)、马鞍藻属(Campylodiscus)、盒管藻属(Capsosiphon)、四鞭藻属(Carteria)、Catena属、Cavinula属、刺棘藻属(Centritractus)、Centronella属、角藻 属(Ceratium)、角 毛 藻 属(Chaetoceros)、Chaetochloris属、硬 毛 藻 属(Chaetochloris)、卡 盾藻 属(Chaetonella)、毛丝 藻属(Chaetonema)、盾毛 藻 属(Chaetopeltis)、胶毛藻属(Chaetophora)、毛球藻属(Chaetosphaeridium)、管孢藻属(Chamaesiphon)、轮藻属(Chara)、Characiochloris属、拟小椿藻属(Characiopsis)、小庄藻 属 (Characium)、轮 藻 目(Charales)、缘 胞 藻 属(Chilomonas)、厚 胞 藻 属(Chlainomonas)、盖 毛 藻 属 (Chlamydoblepharis)、Chlamydocapsa 属、衣 藻 属(Chlamydomonas)、Chlamydomonopsis属、衣粘藻属(Chlamydomyxa)、Chlamydonephris属、Chlorangiella属、拟绿囊藻属(Chlorangiopsis)、小球藻属(Chlorella)、绿囊藻属 (Chlorobotrys)、绿幅藻属(Chlorobrachis)、绿点藻属(Chlorochytrium)、绿球藻属(Chlorococcum)、绿胶藻属(Chlorogloea)、绿胶球藻属(Chlorogloeopsis)、绿梭藻属(Chlorogonium)、绿 带 藻 属(Chlorolobion)、拟 衣 藻 属(Chloromonas)、吊 兰 属(Chlorophysema)、绿藻门(Chlorophyta)、绿胶囊藻属(Chlorosaccus)、背包藻属 (Chlorosarcina)、Choricystis属、色植藻属(Chromophyton)、金光藻属(Chromulina)、拟色球藻属(Chroococcidiopsis)、色球藻属(Chroococcus)、色指藻属(Chroodactylon)、蓝隐藻属(Chroomonas)、色合藻属(Chroothece)、金变形藻属(Chrysamoeba)、金网藻属(Chrysapsis)、金星藻属(Chrysidiastrum)、金囊藻属(Chrysocapsa)、Chrysocapsella属、Chrysochaete属、金 色 藻 属 (Chrysochromulina)、金 粒 藻 属 (Chrysococcus)、Chrysocrinus属、Chrysolepidomonas 属、Chrysolykos属、Chrysonebula 属、金 藻 门(Chrysophyta)、金钟藻属(Chrysopyxis)、Chrysosaccus属、Chrysophaerella属、金环藻属(Chrysostephanosphaera)、刚毛藻属(Clodophora)、链孢藻属(Clastidium)、拟新月藻属(Closteriopsis)、新月藻 属(Closterium)、胶球藻 属(Coccomyxa)、卵形藻 属 (Cocconeis)、Coelastrella属、空星藻属(Coelastrum)、腔球藻属(Coelosphaerium)、帽球藻属(Coenochloris)、无胶集球藻属(Coenococcus)、聚囊藻属(Coenocystis)、柄裸藻属(Colacium)、鞘毛藻属(Coleochaete)、Collodictyon属、Compsogonopsis属、弯枝藻属(Compsopogon)、Conjugatophyta门、Conochaete属、Coronastrum属、鼓藻属(Cosmarium)、Cosmioneis属、胶球鼓藻属(Cosmocladium)、Crateriportula属、Craticula属、发毛针藻属(Crinalium)、十字藻属(Crucigenia)、Crucigeniella属、Cryptoaulax属、隐藻属(Cryptomonas)、隐藻门(Cryptophyta)、Ctenophora 属、蓝网藻 属(Cyanodictyon)、Cyanonephron属、蓝载藻属(Cyanophora)、蓝藻门(Cyanophyta)、蓝杆藻属(Cyanothece)、Cyanothomonas属、环胞藻属(Cyclonexis)、环冠藻属(Cyclostephanos)、小环藻属 (Cyclotella)、简藻属(Cylindrocapsa)、柱胞鼓藻属(Cylindrocystis)、柱孢藻属 (Cylindrospermum)、细柱藻属(Cylindrotheca)、波缘藻属(Cymatopleura)、桥弯藻属(Cymbella)、Cymbellonitzschia 属、胞 甲 藻 属 (Cystodinium)、蓝 纤 维 藻 属(Dactylococcopsis)、单板藻属(Debarya)、细齿藻属(Denticula)、Dermatochrysis属、瘤皮藻属(Dermocarpa)、小皮果蓝细菌属(Dermocarpella)、缢带藻属(Desmatractum)、角丝鼓藻属(Desmidium)、鼓藻属(Desmococcus)、带线藻属(Desmonema)、Desmosiphon属、长刺藻属(Diacanthos)、Diacronema属、等半藻属(Diadesmis)、等片藻属(Diatoma)、等隔藻属(Diatomella)、双 细 胞 藻 属 (Dicellula)、双 须 藻 属(Dichothrix)、叉 球 藻 属(Dichotomococcus)、Dicranochaete属、网 绿 藻 属(Dictyochloris)、球 网 藻 属(Dictyococcus)、胶网藻属(Dictyosphaerium)、Didymocystis属、Didymogenes属、双楔藻属(Didymocystis)、丝藻属(Dilabifilum)、双形藻属(Dimorphococcus)、锥囊藻属 (Dinobryon)、球甲藻属(Dinococcus)、双绿藻属(Diplochloris)、双壁藻属(Diploneis)、双十藻属(Diplostauron)、Distrionella属、基纹鼓藻属(Docidium)、竹枝藻属 (Draparnaldia)、杜氏藻属(Dunaliella)、异形藻属(Dysmorphococcus)、延胞藻属 (Ecballocystis)、纺锤藻属(Elakatothrix)、Ellerbeckia属、内丝藻属(Encyonema)、浒苔属(Enteromorpha)、内枝藻属(Entocladia)、茧形藻属(Entomoneis)、石囊藻属 (Entophysalis)、附金藻属(Epichrysis)、附钟藻属(Epipyxis)、窗纹藻属(Epithemia)、独球藻属(Eremosphaera)、拟凹顶藻属(Euastropsis)、凹顶鼓藻属(Euastrum)、立方藻属(Eucapsis)、真卵形藻属(Eucocconeis)、空球藻属(Eudorina)、裸藻属(Euglena)、裸藻门(Euglenophyta)、短缝藻属(Eunotia)、Eustigmatophyta门、双鞭藻属(Eutreptia)、曲解藻属(Fallacia)、侧生藻属(Fischerella)、脆杆藻属(Fragilaria)、Fragilariforma属、被刺藻属(Franceia)、肋缝藻属(Frustulia)、Curcilla属、双胞藻属(Geminella)、短水绵属(Genicularia)、灰胞藻属(Glaucocystis)、灰藻门属(Glaucophyta)、Glenodiniopsis属、薄甲藻属(Glenodinium)、粘球藻属(Gloeocapsa)、Gloeochaete属、Gloeochrysis属、圆球藻 属(Gloeococcus)、胶囊 藻属(Gloeocystis)、Gloeodendron属、胶胞藻 属 (Gloeomonas)、Gloeoplax属、粘杆藻属(Gloeothece)、胶丝藻属(Gloeotila)、胶刺藻属(Gloeotrichia)、Gloiodictyon 属、多 芒 藻 属 (Golenkinia)、拟 多 芒 藻 属 (Golenkiniopsis)、孢根藻属(Gomontia)、楔桥弯藻属(Gomphocymbella)、异极藻属 (Gomphonema)、束球藻属(Gomphosphaeria)、白氏膝接藻属(Gonatozygon)、Gongrosia属、链瘤藻属(Gongrosira)、角绿藻属(Goniochloris)、盘藻属(Gonium)、膝口藻属 (Gonyostomum)、粒 绿 藻 属(Granulochloris)、拟 粒 囊 藻 属 (Granulocystopsis)、Groenbladia属、裸甲 藻属(Gymnodinium)、缢丝鼓 藻属(Gymnozyga)、布纹藻 属 (Gyrosigma)、鞭毛藻属(Haematococcus)、哥胞藻属(Hafniomonas)、Hallassia属、双尖藻属(Hammatoidea)、Hannaea属、菱板藻属(Hantzschia)、软管藻属(Hapalosiphon)、 Haplotaenium属、定鞭藻门(Haptophyta)、海氏藻属(Haslea)、混沟甲藻属(Hemidinium)、Hemitoma属、茸壳 藻 属(Heribaudiella)、异毛 藻 属(Heteromastix)、异 丝 藻 属(Heterothrix)、Hibberdia属、胭脂藻属(Hildenbrandia)、隐鞭藻属(Hillea)、浩罗藻属(Holopedium)、须 藻 属(Homoeothrix)、Hormanthonema属、皮 襟 藻 属 (Hormotila)、Hyalobrachion 属、Hyalocardium 属、明 盘 藻 属 (Hyalodiscus)、透 明 梭 藻 属(Hyalogonium)、圆丝鼓藻属(Hyalotheca)、Hydrianum属、水胞藻属(Hydrococcus)、水鞘藻属(Hydrocoleum)、水条藻属(Hydrocoryne)、水网藻属(Hydrodictyon)、水链藻属 (Hydrosera)、水树藻属(Hydrurus)、蓝枝藻属(Hyella)、膜胞藻属(Hymenomonas)、细绿藻属(Isthmochloron)、拟 丝 藻 属(Johannesbaptistia)、肾 粒 藻 属 (Juranyiella)、Karayevia属、Kathablepharis属、下甲藻属(Katodinium)、金杯藻属(Kephyrion)、角球藻属(Keratococcus)、蹄形藻属(Kirchneriella)、克里藻属(Klebsormidium)、Kolbesia属、Koliella属、Komarekia属、Korshikoviella属、Kraskella属、顶棘藻属(Lagerheimia)、烧瓶藻属(Lagynion)、丽枝藻属(Lamprothamnium)、鱼子菜属(Lemanea)、鳞孔藻属 (Lepocinclis)、细 链 藻 属(Leptosira)、Lobococcus属、Lobocystis属、叶 衣 藻 属(Lobomonas)、Luticola属、鞘 丝 藻 属(Lyngbya)、Malleochloris 属、鱼 鳞 藻 属(Mallomonas)、Mantoniella属、射星藻属(Marssoniella)、Martyana属、鞭鞘藻 属 (Mastigocoleus)、Gastogloia属、直链藻属(Melosira)、平裂藻属(Merismopedia)、Mesostigma属、中带鼓藻属(Mesotaenium)、微星藻属(Micractinium)、小星藻属 (Micrasterias)、微 毛藻 属(Microchaete)、微鞘 藻属(Microcoleus)、微囊 藻 属(Microcystis)、软壳藻属(Microglena)、Micromonas属、微孢藻属(Microspora)、小丛藻属(Microthamnion)、柄球藻属(Mischococcus)、单鞭金藻属(Monochrysis)、蒜头藻属(Monodus)、Monomastix属、单壳缝藻属(Monoraphidium)、礁膜属(Monostroma)、转板藻属(Mougeotia)、拟转板藻属(Mougeotiopsis)、喙藻属(Myochloris)、Myromecia属、粘囊藻属(Myxosarcina)、瓶丝藻属(Naegeliella)、微绿球藻属(Nannochloris)、类球藻属 (Nautococcus)、舟 形 藻 属 (Navicula)、Neglectella 属、长 蓖 藻 属 (Neidium)、Nephroclamys属、肾形藻属(Nephrocytium)、Nephrodiella属、肾藻属(Nephroselmis)、梭形鼓藻属(Netrium)、丽藻属(Nitella)、拟丽藻属(Nitellopsis)、菱形藻属(Nitzschia)、节 球藻 属 (Nodularia)、念 珠 藻 属(Nostoc)、棕 鞭 藻 属(Ochromonas)、鞘 藻 属(Oedogonium)、Oligochaetophora属、棘接鼓藻属(Onychonema)、Oocardium属、卵囊藻属(Oocystis)、槌棒藻属(Opephora)、黄管藻属(Ophiocytium)、Orthoseira属、颤藻属(Oscillatoria)、Oxyneis属、厚 枝 藻 属 (Pachycladella)、四 集 藻 属 (Palmella)、Palmodictyon属、实球藻属(Pnadorina)、Pannus属、帕拉藻属(Paralia)、巴喧氏藻属(Pascherina)、Paulschulzia属、盘星藻属(Pediastrum)、柄钟藻属(Pedinella)、平藻属(Pedinomonas)、指藻属(Pedinopera)、海网藻属(Pelagodictyon)、柱形鼓藻属(Penium)、袋鞭藻属(Peranema)、拟多甲藻属(Peridiniopsis)、多甲藻属(Peridinium)、Peronia属、石藻属(Petroneis)、壳衣藻属(Phacotus)、扁裸藻属(Phacus)、Phaeaster属、褐皮藻属(Phaeodermatium)、褐藻门(Phaeophyta)、Phaeosphaera属、金枝藻属(Phaeothamnion)、席藻 属(Phormidium)、叶 楯藻 属(Phycopeltis)、叶 绿藻属 (Phyllariochloris)、Phyllocardium属、Phyllomitas属、羽纹藻属(Pinnularia)、Pitophora属、Placoneis属、游丝藻属(Planctonema)、浮球藻属(Planktosphaeria)、微曲壳藻属()Planothidium)、织线藻属(Plectonema)、杂球藻属(Pleodorina)、Pleurastrum属、厚皮藻属(Pleurocapsa)、侧枝藻属(Pleurocladia)、双盘藻属(Pleurodiscus)、斜纹藻属(Pleurosigma)、侧链藻属(Pleurosira)、宽带鼓藻属(Pleurotaenium)、Pocillomonas属、Podohedra属、多鞭藻属(Polyblepharides)、多胶毛藻属(Polychaetophora)、多角藻属(Polyedriella)、多突藻属(Polyedriopsis)、多角绿藻属(Polygoniochloris)、Polyepidomonas属、Polytaenia属、素衣藻属(Polytoma)、Polytomella属、紫球藻属(Porphyridium)、Posteriochromonas属、Prasinochloris属、绿枝藻属(Prasinocladus)、绿枝藻门(Prasinophyta)、溪菜属(Prasiola)、原绿藻门(Prochlorphyta)、原绿发藻属(Prochlorothrix)、原皮藻属 (Protoderma)、原管藻属(Protosiphon)、朴罗藻属(Provasoliella)、三毛金藻属 (Prymnesium)、Psammodictyon属、Psammothidium属、假鱼腥藻 属(Pseudanabaena)、Pseudenoclonium属、拟四鞭藻属(Psuedocarteria)、Pseudochate属、Pseudocharacium属、Pseudococcomyxa属、伪 胶 网 藻 属(Pseudodictyosphaerium)、假 金 杯 藻 属(Pseudokephyrion)、 伪 瘤 皮 藻 属 (Pseudoncobyrsa)、Pseudoquadrigula 属、 Pseudosphaerocystis 属、Pseudostaurastrum 属、Pseudostaurosira 属、 Pseudotetrastrum 属、翼 膜 藻 属 (Pteromonas)、Punctastruata 属、塔 衣 藻 属(Pyramichlamys)、塔胞藻属(Pyramimonas)、甲藻门(Pyrrophyta)、Quadrichloris属、四瓣藻属(Quadricoccus)、并联藻属(Quadrigula)、辐球藻属(Radiococcus)、辐丝藻属(Radiofilum)、尖头藻属(Raphidiopsis)、Raphidocelis属、针丝藻属(Raphidonema)、绿胞藻门(Raphidophyta)、Peimeria属、棒条藻属(Rhabdoderma)、杆胞藻属(Rhabdomonas)、根枝藻属(Rhizoclonium)、红胞藻属(Rhodomonas)、红藻门(Rhodophyta)、弯楔藻属 (Rhoicosphenia)、棒杆藻 属(Rhopalodia)、胶须藻属 (Rivularia)、浅罗氏藻 属 (Rosenvingiella)、Rossithidium属、弯 柱鼓 藻属(Roya)、栅藻属 (Scenedesmus)、Scherffelia属、Schizochlamydella 属、裂 壁 藻 属 (Schizochlamys)、裂 线 藻 属(Schizomeris)、裂须藻属(Schizothrix)、弓形藻属(Schroederia)、Scolioneis属、螺翼藻属(Scotiella)、Scotiellopsis属、斯氏藻属(Scourfieldia)、伪枝藻属(Scytonema)、月牙藻属(Selenastrum)、月绿藻属(Selenochloris)、鞍眉藻属(Sellaphora)、Semiorbis属、褐胞藻属(Siderocelis)、拟铁囊藻属(Diderocystopsis)、Dimonsenia属、管线藻属(Siphononema)、链 枝 藻 属(Sirocladium)、链 膝 藻 属 (Sirogonium)、骨 条 藻 属(Skeletonema)、群星藻属(Sorastrum)、Spermatozopsis属、Sphaerellocystis属、拟球藻属(Sphaerellopsis)、Sphaerodinium 属、环 藻 属 (Sphaeroplea)、瘤 接 鼓 藻 属(Sphaerozosma)、刺胞藻属(Spiniferomonas)、水绵属(Spirogyra)、螺带鼓 藻属 (Spirotaenia)、螺 旋 藻 属(Spirulina)、椎 葚 属(Spondylomorum)、顶 接 鼓 藻 属(Spondylosium)、Sporotetras属、泡沫藻属(Spumella)、角星鼓藻属(Staurastrum)、Stauerodesmus属、辐 节 藻 属(Stauroneis)、十 字 脆 杆 藻 亚 属 (Staurosira)、Staurosirella属、长 羽 藻 属 (Stenopterobia)、Stephanocostis 属、冠 盘 藻 属(Stephanodiscus)、冠 孔 藻 属 (Stephanoporos)、Stephanosphaera属、列 丝 藻 属(Stichococcus)、粘胶藻属(Stichogloea)、毛枝藻属(Stigeoclonium)、真枝藻属 (Stigonema)、柄球藻属(Stipitococcus)、斯特克藻属(Stokesiella)、陀裸藻属 (Strombomonas)、Stylochrysalis属、柄甲藻属(Stylodinium)、Styloyxis属、绿柄球藻属(Stylosphaeridium)、双菱藻属(Surirella)、Sykidion属、束藻属(Symploca)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、针杆藻属(Synedra)、聚赭胞藻属 (Synochromonas)、黄群藻属(Synura)、平板藻属(Tabellaria)、Tabularia属、泰林鼓藻属(Teilingia)、切 孢 藻属(Temnogametum)、裂 顶鼓 藻 属(Tetmemorus)、四球 藻 属(Tetrachlorella)、四环藻属(Tetracyclus)、四链藻属(Tetradesmus)、骈列藻属 (Tetraedriella)、四 角藻 属(Tetraedron)、四爿 藻属(Tetraselmis)、四孢 藻 属(Tetraspora)、四 星 藻 属(Tetrastrum)、海 链 藻 属(Thalassiosira)、丛 毛 藻 属(Thamniochaete)、胸 甲 藻 属(Thorakochloris)、红 索 藻 属(Thorea)、鸟 巢 藻 属(Tolypella)、单歧藻属(Tolypothrix)、囊裸藻属(Trachelomonas)、Trachydiscus属、共球藻属(Trebouxia)、桔色藻属(Trentepholia)、四刺藻属(Treubaria)、黄丝藻属 (Tribonema)、红海束毛藻属(Trichodesmium)、Trichodiscus属、小箍藻属(Trochiscia)、盘杆藻属(Tryblionella)、软丝藻属(Ulothrix)、辐尾藻属(Uroglena)、尾丝藻属 (Uronema)、尾 管 藻 属 (Urosolenia)、尾 孢 藻 属 (Urospora)、Uva属、周 泡 藻 属(Vacuolaria)、无隔藻属(Vaucheria)、团藻属(Volvox)、Volvulina属、韦斯藻属 (Westella)、网 甲 藻 属(Woloszynskia)、多 棘 鼓 藻 属(Xanthidium)、黄 藻 门(Xanthophyta)、异球藻属(Xenococcus)、双星藻属(Zygnema)、拟双星藻属(Zygnemopsis)和Zygonium属。这里的表1和表2也提供了可以被工程化以表达重组AAR和ADM酶的蓝 细菌的部分列表。另外的蓝细菌包括以下属的成员：管孢藻属、色球藻属、蓝细菌属、蓝菌属(Cyanobium)、蓝杆藻属、蓝纤维藻属、蓝杆菌属(Gloeobacter)、粘球藻属、粘杆藻属、微囊藻属、原绿球藻属(Prochlorococcus)、原绿藻属(Prochloron)、聚球藻属、集胞藻属、蓝囊胞藻属(Cyanocystis)、包皮藻属、直毛藻属(Stanieria)、异球藻属、拟色球藻属、粘囊藻属、节旋藻属、博氏藻属(Borzia)、发毛针藻属、Geitlerinemia属、瘦鞘丝藻属 (Leptolyngbya)、湖生蓝丝藻属(Limnothrix)、鞘丝藻属、微鞘藻属、颤藻属、浮游蓝丝藻属(Planktothrix)、原绿丝藻属(Prochiorothrix)、假鱼腥藻属、螺旋藻属、斯塔尔氏蓝细菌属(Starria)、束藻属、束毛藻属、灰线蓝细菌属(Tychonema)、鱼腥藻属、项圈藻属、束丝藻属、蓝螺菌属(Cyanospira)、拟柱胞藻属(Cylindrospermopsis)、柱孢藻属、节球藻属、念珠藻属、伪枝藻属(Scylonema)、眉藻属、胶须藻属、单歧藻属、绿胶球藻属、侧生藻属、吉特勒氏蓝细菌属(Geitieria)、Iyengariella属、拟珠藻属(Nostochopsis)、真枝藻属和嗜热聚球藻属(Thermosynechococcus)。 [0183] 绿色非硫细菌包括但不限于下列属：绿弯菌属(Chloroflexus)、绿线菌属(Chloronema)、颤绿菌属(Oscillochloris)、太阳发菌属(Heliothrix)、爬管菌属 (Herpetosiphon)、玫瑰弯菌属(Roseiflexus)和热微菌属(Thermomicrobium)。 [0184] 绿色硫细菌包括但不限于下列属：绿菌属(Chlorobium)、格状绿菌属(Clathrochloris)和突柄绿菌属(Prosthecochloris)。 [0185] 紫色硫细菌包括但不限于下列属：异着色菌属(Allochromatium)、着色菌属(Chromatium)、盐着色菌属(Halochromatium)、等着色菌属(Isochromatium)、海洋着色菌属(Marichromatium)、小红卵菌属(Rhodovulum)、热着色菌属(Thermochromatium)、荚硫菌属(Thiocapsa)、硫红球菌属(Thiorhodococcus)和囊硫菌属(Thiocystis)。 [0186] 紫色非硫细菌包括但不限于下列属：褐螺菌属(Phaeospirillum)、Rhodobaca属、红细菌属(Rhodobacter)、红微菌属(Rhodomicrobium)、红球形菌属(Rhodopila)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、海洋玫瑰菌属(Rhodothalassium)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红弧菌属(Rodovibrio)和玫瑰螺菌属(Roseospira)。 [0187] 需氧化能自氧菌包括但不限于硝化细菌如硝化杆菌科(Nitrobacteraceae)的种、硝硝化杆菌属(Nitrobacter)的种、硝化刺菌属(Nitrospina)的种、硝化球菌属 (Nitrococcus)的种、硝化螺旋菌属(Nitrospira)的种、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)的种、亚硝化球菌属(Nitrosococcus)的种、亚硝化螺旋菌属(Nitrosospira)的种、亚硝酸叶菌属(Nitrosolobus)的种、亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio)的种；无色硫细菌如卵硫菌属(Thiovulum)的种、硫杆菌属(Thiobacillus)的种、硫微螺菌属(Thiomicrospira)的种、硫球菌属(Thiosphaera)的种、嗜热丝菌属(Thermothrix)的种；专性化能自养 氢细菌如产氢杆菌属(Hydrogenobacter)的种，铁和锰氧化和/或沉积细菌如铁球菌属 (Siderococcus)的种，以及趋磁细菌如水螺菌属(Aquaspirillum)的种。 [0188] 古细菌包括但不限于产甲烷古细菌如甲烷杆菌属(Methanobacterium)的种、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)的种、甲烷嗜热菌属(Methanothermus)的种、 甲烷球菌属(Methanococcus)的种、甲烷微菌属(Methanomicrobium)的种、甲烷螺菌 属(Methanospirillum)的种、产甲烷菌属(Methanogenium)的种、甲烷八叠球菌属 (Methanosarcina)的种、甲烷叶菌属(Methanolobus)的种、甲烷丝菌属(Methanothrix)的种、甲烷类球菌属(Methanococcoides)的种、甲烷盘菌属(Methanoplanus)的种；极端嗜热硫代谢菌如热变形菌属(Thermoproteus)的种、热网菌属(Pyrodictium)的种、硫化叶菌属(Sulfolobus)的种、嗜酸菌属(Acidianus)的种，以及其他微生物如枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、链霉菌属(Streptomyces)的种、青枯菌属(Ralstonia)的种、红球菌属(Rhodococcus)的种、棒状杆菌属 (Corynebacteria)的种、短杆菌属(Brevibacteria)的种、分枝杆菌属(Mycobacteria)的种和产油酵母菌。 [0189] 依据本发明公开的方法生产正烷烃的优选生物体包括：拟南芥(Arabidopsis thaliana)、柳枝稷(Panicum virgatum)、奇岗(Miscanthusgiganteus)和玉米(Zea mays)(植物)；布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、盐生杜氏藻(Dunaliela salina)(藻类)；聚球藻PCC 7002、聚球藻PCC 7942、聚球藻PCC6803、细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)BP-1(蓝细菌)；Chlorobium tepidum(绿色硫细菌)；橙色绿屈挠菌(Chloroflexus auranticus)(绿色非硫细菌)；微温着色菌(Chromatiumtepidum)和酒色着色菌(Chromatium vinosum)(紫色硫细菌)；深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)和沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palusris)(紫色非硫细菌)。 [0190] 此外其他适合的生物体包括如Venter等.，美国专利公开号2007/0264688所描述的合成的细胞或由合成的基因组产生的细胞，以及Glass等，美国专利公开号 2007/0269862所述的细胞样系统或合成细胞。 [0191] 此外其他适合的生物体包括可以被工程化以固定二氧化碳的微生物，细菌如大肠杆菌、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)、枯草芽孢杆菌；酵母菌和真菌如杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、产黄青霉 (Penicillium chrysogenum)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)或运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。 [0192] 适合选择和工程化的生物体自养固定CO2到产物中。这包括光合作用和甲烷生成。乙酸生成，包括三种类型CO2固定：卡尔文循环、乙酰CoA途径和还原TCA途 径也被覆盖。使用二氧化碳作为细胞唯一碳来源(自养)的能力在几乎所有原核生 物主要群体中都有发现。群体间的CO2固定途径不同，而且四种目前已知自养途径没 有明确的分布模式。见，如Fuchs,G.1989.Alternative pathways of autotrophic CO2fixation,p.365-382.在H.G.Schlegel,和B.Bowien(编者),Autotrophic bacteria.Springer-Verlag,Berlin,Germany。还原磷酸戊糖循环(卡尔文-巴舍姆-本森循环)代 表了几乎所有需氧自养细菌，如蓝细菌中的CO2固定途径。 [0193] 为通过AAR和/或ADM酶的重组表达来产生正烷烃，优选的是工程蓝细菌如聚球藻或嗜热聚球藻种类。其他优选的生物体包括集胞藻、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、大肠杆菌或酿酒酵母。其他原核的、古细菌的和真核的宿主细胞也包括在本发明范围内。 [0194] 感兴趣的碳基产物：烃类和醇类 [0195] 在本发明的各种实施方式中，可以产生想要的特定链长的烃类和/或醇类，或其混合物。在特定方面中，如本发明实施例所示，宿主细胞产生至少一种以下感兴趣的碳基产物：1-十二醇、1-十四醇、1-十五醇、正十三烷、正十四烷、15:1正十五烷、正十五烷、16:1正十六烯、正十六烷、17:1正十七烯、正十七烷、16:1正十六烯-醇、正十六-1-醇和正十八烯-1-醇。在其他方面，碳链长度从C10到C20。因此，本发明提供了适用作燃料和化学品的不同链长的烷烃、烯烃和烷醇的产生。 [0196] 在优选的方面，该方法提供了培养宿主细胞以直接分泌产物，可以容易的回收而不需要提取生物质。这些感兴趣的碳基产物被直接分泌到培养基中。由于本发明能够生产多种确定链长的烃类和醇类，分泌的产物可以容易的回收或分离。因此本发明的产物可以直接使用或经最小的处理来使用。 [0197] 燃料组合物 [0198] 在各个实施方式中，本发明的方法产生的组合物被用作燃料。这样的燃料符合ASTM标准，如柴油燃料油D975-09b和在ASTM规格D1655-68中规定的Jet A、Jet A-1和Jet B的标准规格。燃料组合物可能需要混合几种产物以产生均匀的产品。混合过程相对简单，但确定需包括进混合物中的各组分的量困难的多。因此燃料组合物可以包括芳香和/或支链烃，如75％的饱和烃和25％的芳香烃，其中某些饱和烃是支链的而某些是环状的。 优选的，本发明的方法产生一系列烃，如C13-C17或C10-C15而改变始凝点。而且，组合物可以包含用于增强燃料或引擎性能的燃料添加剂。例如，燃料添加剂可以被用于改变凝固点/胶凝点、始凝点、润滑性、粘度、氧化稳定性、点火性能、辛烷值和闪点。燃料组合物也可以另外地包含抗氧化剂、静电消除剂、缓蚀剂、防冰剂、生物杀灭剂、金属钝化剂和热稳定改良剂。 [0199] 本发明除了许多环保优势如CO2转化和可再生资源外，本发明公开的燃料组合物其他优势包括低硫含量、低排放、没有或基本没有醇并具有高十六烷值。 [0200] 碳指纹 [0201] 生物学方法产生的碳基产物，如乙醇、脂肪酸、烷烃、类异戊二烯，代表了一种新的燃料商品如醇类、柴油和汽油。这样的生物燃料没有使用生物质而是使用CO2作为碳源来生产。这些新燃料可以在双重碳同位素指纹基础上与石化碳衍生的燃料相区分。这样的产物、14 衍生物及其混合物可以在 C(fM)和双重碳同位素指纹基础上与其石化衍生的对应物完全相区分，从而表明了新的物质组成。 [0202] 有三种天然存在的碳同位素：12C、13C和14C。这些同位素分别以0.989、0.011和12 12 13 14 10- 的分数存在于地面上总碳中。同位素 C和 C是稳定的，而 C在半衰期为5730年的 14 14 14 过程中自然衰变为 N、β粒子和反中微子。同位素 C主要由于最终由宇宙辐射引起的 N 14 的中子轰击而产生于大气中。由于其相对短的半衰期(地质学术语)，C在化石碳中的存 50 14 在水平极低。在1百万年未暴露于大气的过程后，10 份中只有1份仍保持是 C。 [0203] 在自然碳源中13C：12C比变化轻微但仍可检测。通常这些差异以与标准物质中13C：12 C比的偏离来表示。碳的国际标准是Pee Dee箭石(一种在南卡罗莱纳发现的石灰石形 13 13 12 式)，其中 C分数为0.0112372。对于碳源a，C：C比与Pee Dee箭石的偏离被表示为： 13 12 δa＝(Ra/Rs)–1，其中Ra＝自然来源中的 C: C比，而Rs＝Pee Dee箭石(标准品)中 13 12 的 C: C比。为了方便，δa被表示为每一千份中的份数，或‰。δa的负值表示相比于Pee 12 13 14 Dee箭石朝向 C而不是 C的偏离。表A显示了几种自然碳源的δa和 C分数。 [0204] 表A [0205] 天然碳源中的13C：12C变化 [0206] [0207] [0208] *DIC＝溶解的无机碳 [0209] 生物过程通常在碳同位素之间有区别。14C的自然丰度非常小，因此14C或相对14C13 12 的区别难以测量。然而 C和 C之间的生物差别是清楚记载的。对于生物产品p，我们可 13 12 以定义与上面类似的量：δp＝(Rp/Rs)–1，其中Rp＝生物产物中的 C: C比，而Rs＝Pee 13 12 13 12 Dee箭石(标准品)中的 C: C比。表B显示了对于某些生物产物测量的 C: C比的偏 离。 [0210] 表B [0211] 选择的生物产物中的13C：12C变化 [0212] [0213] [0214] *D＝生物过程利用12C对13C的差别(见正文) [0215] 表B引入了新的量D。这是生物过程利用12C对13C的差别。我们如下定义D：D＝(Rp/Ra)–1。该量与δa和δp非常相似，除了我们现在直接将生物产物与碳源比较而不是与标准品比较。使用D，我们可以组合碳源和生物过程的偏离效应，以获得与标准品相比生物产物的偏离。求解δp，我们获得：δp＝(D)(δa)+D+δa，而且，由于(D)(δa)相比其他项通常非常小，因此δp≈δa+D。 [0216] 对于具有带已知D的生产过程的生物产物，我们由此可以通过将δa和D求和来估算δp。我们假定D与碳源无关地发生作用。这已经对于从化石碳产生的蓝细菌脂质和生物质在表B中完成。如上面表A和表B所示，由化石碳(例如以烟气或其他排放物的形式)制备的蓝细菌产物与由其他来源的相当生物产物相比会有更高的δp，从而在物质组成的基础上将其与这些其他生物产物区分开来。此外，任何单独衍生于化石碳的产物会有可 14 -12 14 忽略不计的 C分数，而由地表碳产生的产物会有约10 的 C分数。 [0217] 因此，在特定方面，本发明提供了各种感兴趣的碳基产物，其特征为约63.5到约66的-δp(‰)-以及约37.5到约40的-D(‰)。 [0218] 抗体 [0219] 在另一方面，本发明提供了与本发明的分离的多肽和多肽片段或者与一个或多个本发明的分离的核酸编码的多肽特异性结合的分离的抗体，包括其片段和衍生物。本发明的抗体可以对这样的多肽或多肽片段的，存在于处于其天然构象中的多肽上或某些情况下存在于变性的多肽(如于SDS中溶解)上的，线性表位、非连续表位或构象表位是特异性的。本发明提供的有用的抗体片段中有Fab、Fab'、Fv、F(ab')2和单链Fv片段。 [0220] 这里通过“特异性地结合”或“特异性结合”指抗体优先于与其他分子种类(其与抗体和第一分子种类混合)的结合与第一分子种类结合的能力。当抗体能特异性结合该第一分子种类时，该抗体被称为特异性地“识别”该第一分子种类。 [0221] 如本领域公知的，抗体能够区分混合物中各种分子种类的程度部分取决于混合物中种类的构象关联性；通常，本发明的抗体会区别优先于与不相关多肽偶然结合至少2倍，更通常至少5倍，通常大于10倍、25倍、50倍、75倍，并经常大于100倍，且有时大于500倍或1000倍。 [0222] 通常，本发明的抗体(或抗体多聚体，如IgM五聚体的情况中)对本发明多肽或-6 -7 -7多肽片段的亲和力或亲合力为至少约1x10 M，通常至少约5x10 M，有利地至少约1x10 M，-8 -9 -10 1x10 M、5x10 M、1x10 M和甚至更强的亲和力和亲事力被证明是特别有用的。 [0223] 本发明的分离的抗体可以是自然发生的形式，如来自任何哺乳动物物种的IgG、IgM、IgD、IgE和IgA。例如，从包括啮齿类动物(通常是小鼠，但也包括大鼠、豚鼠和仓鼠)、兔类动物(通常是兔子，但也包括较大的哺乳动物如绵羊、山羊、牛和马)的物种中有利地得到抗体。动物通常依据标准免疫方案，使用本发明的多肽或多肽片段确定的免疫。 [0224] 当与载体(通常是如牛甲状腺球蛋白、钥孔血兰蛋白或牛血清白蛋白)偶联(方便地使用双功能接头)时，几乎所有本发明多肽的8个或更多连续氨基酸的片段可以被有效用作免疫原。免疫原性也可以通过本发明的多肽和多肽片段与其他部分的融合获 得。例如本发明的肽可以通过在分枝多聚赖氨酸核心基质上固相合成来产生，这些多重抗原肽(MAP)提供了高纯度、增强的亲合力、准确的化学定义和疫苗开发中改善的安全性。见，如Tam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5409-5413(1988)；Posnett等,J.Biol.Chem.263,1719-1725(1988)。 [0225] 用于免疫的方案本领域已经完善建立。这样的方案通常包括多次免疫，可使用或不使用如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂的佐剂。本发明的抗体可以是多克隆或单克隆的，使用多克隆抗体在本发明蛋白质的免疫组织化学检测中有特定的优势，而单克隆抗体在识别和区分本发明蛋白质的特定表位中有优势。免疫后，本发明的抗体可以使用任何本领域接受的方法产生。用于重组抗体(完整抗体、抗体片段或抗体衍生物)产生的宿主细胞可以是原核或真核的。如本领域公知的，原核宿主对于产生噬菌体展示的抗体特别有用。真核细胞，包括哺乳动物、昆虫、植物和真菌细胞对表达本发明的抗体、抗体片段和抗体衍生物也是有用的。本发明的抗体也可以通过无细胞翻译来制备。 [0226] 本发明的分离的抗体，包括其片段和衍生物，可以被有利地标记。因此，本发明的另一个方面提供了与一个或多个本发明的多肽或多肽片段特异性结合的标记的抗体。标记的选择部分取决于想要的用途。在某些情况下，本发明的抗体可以使用酶有利地标记。可选地，抗体可以使用胶体金或使用荧光团标记。为了使用标记的亲和素、抗生蛋白链菌素、captavidin或中性链亲和素进行二级检测，本发明的抗体可以有利地使用生物素进行标33 记。当本发明的抗体被用于，例如蛋白印迹应用时，其可以有利地使用放射性同位素，如 P、 32 35 3 125 P、S、H和 I进行标记。可以理解，上面描述的标记的使用不限于任何特定应用。 [0227] 下列实施例为示例性目的而并非要限制本发明的范围。 [0228] 实施例1 [0229] 正烷烃酶合成的途径。在如蓝细菌中的正烷烃产生的酶过程示于图1A，其基于(1)AAR酶(如tll1312，一种酰基-ACP还原酶)和(2)ADM酶(如tll1313，一种公 认的使用还原型铁氧化还原蛋白作为电子供体的烷醛脱羧单加氧酶)的顺序活性。AAR 活性与来自乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)中的蛋白如Acrl表现 的相对清楚表征的酰基-CoA还原酶活性明显不同(Reiser S和Somerville C(1997) J.Bacteriol.179:2969-2975)。膜ADM活性之前已经在昆虫微粒体制备品中被识别 (Reed JR等.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10000-10004；Reed JR等(1995)Musca domestica.Biochemistry34:16221-16227)。 [0230] 图1B和1C总结了参与正烷醛生物合成的酶的名称和活性。图1B描述了来自乙酸钙不动杆菌的蛋白如Acrl表现的相对清楚表征的酰基-CoA还原酶活性(EC 1.2.1.50)，图1C中，两种公知的参与脂肪酸生物合成的ACP相关还原酶，β-酮酰基-ACP还原酶 (EC1.1.1.100)和烯酰-ACP还原酶(EC1.3.1.9，1.3.1.10)，与被相信参与蓝细菌中正烷烃生物合成途径的酰基-ACP还原酶(AAR)(还没有指定EC编号)相反。AAR和酰基-CoA还 原酶(EC 1.2.1.50)之间的关键区别是ACP是酰基载体而辅酶A不是。已经证明来自乙酸钙不动杆菌的酰基-CoA还原酶Acrl仅能从酰基-CoA而不能从酰基-ACP生成烷醛，从而 为这种区分提供支持(Resier S和Somerville C(1997)J Bacteriol.179:2969-2975)。 [0231] ADM目前也缺少指定的EC编号。烷醛单加氧酶(EC1.14.14.3)，通常被称为荧光素酶，已知催化正烷醛转化为正链烷酸。该活性与本发明提出的ADM活性(n-烷醛到 (n-1)-烷烃)明显不同，尽管两者都使用正烷醛和分子氧作为底物。 [0232] 生产正烷烃的蓝细菌AAR和ADM同源物。在该实施例中，蓝细菌AAR和ADM基因的同源物(如分别为细长聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC 7942SYNPCC7942_1594和/或SYNPCC7942_1593蛋白质的同源物)使用BLAST检索来识别。这些蛋白质可以在多 种生物体(细菌、酵母、植物等)中表达，以达到从生物体中产生和分离正烷烃和其他想要的感兴趣的碳基产物的目的。非冗余BLAST蛋白质数据库的检索显示出其他蓝细菌中各种蛋白质的对应物。 [0233] 为确定在细长聚球藻PCC 7942SYNPCC7942_1594蛋白质的同源物之间的相似性程度，使用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)对“nr”非冗余蛋白质数据库查询341个氨基酸的蛋白质序列。其比对(i)覆盖>90％的SYNPCC7942_1594长度，(ii)覆盖 >90％的匹配蛋白质长度和(iii)与SYNPCC7942_1594有>50％的同一性的同源物被作匹配蛋白质(表1)。 [0234] 表1 [0235] SYNPCC7942_1594(AAR)的蛋白质同源物 [0236] [0237] [0238] [0239] [0240] [0241] [0242] 为在细长聚球藻PCC 7942SYNPCC7942_1953蛋白质的同源物间确定相似性程度，使用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)针对“nr”非冗余蛋白质数据库查询231个氨基酸的蛋白质序列。其比对(i)覆盖>90％的SYNPCC7942_1593长度，(ii)覆盖>90％的匹配蛋白质长度和(iii)与SYNPCC7942_1593有>50％的同一性的同源物被作为匹配蛋白质(表2)。 [0243] 表2 [0244] SYNPCC7942_1593(ADM)的蛋白质同源物 [0245] [0246] [0247] [0248] [0249] [0250] 表中以登录号提及的氨基酸序列，如2009年7月9日出现在NCBI数据库中的那些序列，通过引用纳入本发明。 [0251] 表1中的AAR酶，和/或表2中的ADM酶，或两者可以在感兴趣的宿主细胞中表达，其中宿主可以是异源宿主或原始宿主，即基因最初源于的种类。在一个实施方式中，本发明提供了通过工程化生物体以表达编码列于表1或表2中的一种酶的基因，赋予缺少天然AAR和/或ADM天然同源物的异源生物体正烷烃合成能力的方法。也提供了通过增加天然酶的表达，或通过异源AAR和/或ADM酶的重组表达来增强天然基因表达，在已经表达AAR和ADM酶之一或两者的生物体中调节正烷烃合成的方法。此外，本发明提供了通过改变特定参数，包括电子供体的特性和/或相容性、培养条件、表达AAR和/或ADM酶的启动子等调节烷烃合成水平的方法。 [0252] 如果宿主缺乏适合的电子供体或缺乏足够水平的适合电子供体来实现要求量的正烷烃产生，这样的电子供体可以被重组引入。对于由本发明描述的重组ADM蛋白催化的反应优化电子供体的指导方针概括如下： [0253] 1在蓝细菌中，电子由光系统I传送到铁氧化还原蛋白和从铁氧化还原蛋白传送到ADM酶。 [0254] 2在缺少光系统I的细菌中，电子可以通过铁氧化还原蛋白-NADP+还原酶(EC1.18.1.2)的作用由NADPH传送到铁氧化还原蛋白并从铁氧化还原蛋白传送到ADM酶。 [0255] 3在缺少光系统I的细菌中，电子可以通过铁氧化还原蛋白-NADP+还原酶(EC1.18.1.2)的作用由NADPH传送到黄素氧化还原蛋白并从黄素氧化还原蛋白传送到ADM酶。 [0256] 4在缺少光系统I的细菌中，电子可以通过阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)NADH脱氢酶的作用由NADH传送到铁氧化还原蛋白并从铁氧化还原蛋白传送到ADM酶。 [0258] 除了上面描述的正烷烃体内产生外，由列于表1和2中的基因编码的AAR和ADM蛋白质可以被纯化。当在体外与适当的电子供体(如，上面讨论的铁氧化还原蛋白)一起温育时，该蛋白质会体外催化从适合的起始材料(如酰基-ACP或正烷醛)酶促合成正烷烃。 [0259] 除了上述正烷烃合成途径外，本发明还提供了通过酰基-CoA还原酶(ACR)和ADM的连续活性的可选途径，即酰基-CoA→n-烷醛→(n-1)烷烃。通常，酰基-CoA是脂肪酸氧化代谢途径中的第一个中间体。因此，一旦输入细胞，外部加入的游离脂肪酸通过酰基-CoA合成酶转化为酰基-CoA(图1B)。酰基-CoA可以如下纯粹生物合成得到：通过胞 质酰基-ACP硫酯酶(EC 3.1.2.14；一个例子是缺少引导信号的大肠杆菌TesA)和内源的和/或异源的酰基-CoA合成酶活性，酰基-ACP→游离脂肪酸→酰基-CoA。因此，在一个实施方式中，本发明提供了通过由酰基-ACP硫酯酶、酰基-ACP合成酶、酰基-CoA还原酶和ADM的连续活性催化的以下途径生物合成正烷烃的方法：酰基-ACP→细胞内游离脂肪酸→酰基-CoA→n-烷醛→(n-1)烷烃(图1D)。例如来自乙酸钙不动杆菌的酰基-CoA还原酶 Acrl和来自聚球藻PCC7942的ADM(SYNPCC7942_1593)可以被用于转化大肠杆菌，其在外源游离脂肪酸的存在下培养。游离脂肪酸作为酰基-CoA被细胞摄入，其随后通过Acrl转化为n-烷醛，并由此由ADM转化为(n-1)烷烃。 [0260] 实施例2 [0261] 通过细长聚球藻PCC7942SYNPCC7942_1593(adm)和SYNPCC7942_1594(aar)的异源表达在大肠杆菌K12中产生正烷烃、正烯烃和脂肪醇。 [0262] 天然SYNPCC7942_1593-SYNPCC7942_1594操纵序列从细长聚球藻PCC7942基因组DNA PCR扩增，并通过NdeI和EcoRI将其克隆到pAQ1同源重组载体pJB5中。得到的质粒表示为pJB823。该构建体将SYNPCC7942_1593-SYNPCC7942_1594操纵子置于组成型aphII启动子的转录控制之下。pJB823的序列被提供为SEQ ID NO：15。带有pJB823的大肠杆TM 菌K12EPI400 (Epicentre)，JCC1076，的细胞内烃产物通过气相色谱-质谱(GC-MS)与带TM 有pJB5的EPI400 ，对照株JCC9a，的细胞内烃产物相比较。JCC9a和JCC1076的克隆培养物在37℃下在含有2％葡萄糖、100μg/ml羧苄青霉素、50μg/ml壮观霉素、50μg/ml链霉素和1x CopyCutter Induction Solution(Epicentre)的Luria Broth(LB)培养基中生长过夜。对各个菌株，通过离心收集15ml饱和培养物。细胞团通过三个循环的在Milli-Q水中再悬浮和微量离心彻底清洗，随后通过三个循环的微量离心和抽吸尽量除湿。随后细胞团在含有100μg/ml二丁基羟基甲苯(BHT；通用的抗氧化剂)和100μg/ml的花生酸乙酯(EA；提取效率的内部指示剂)的0.8ml丙酮中漩涡5分钟进行提取。细胞碎片通过离心团聚，700μl提取物被加入GC小瓶中。这些JCC9a和JCC1067丙酮样品与正式标准一起使用GC-MS进行分析。 [0263] 气相色谱是配备有5975C电子撞击质谱仪的Agilent 7890A GC。液体样品(1.0μl)被注射到带有配备10μl注射器的7683自动液体进样器的GC中。GC进口温度 为290℃并使用了无分流注射(split-less injection)。毛细管柱为Agilent HP-5MS(30m x 0.25mm x 0.25μm)。载气为氦气，流速1.0ml/min。GC炉温程序为50℃保持1分钟/每分钟10℃增加到290℃/保持9分钟。GC-MS界面温度为290℃。MS源温度为230℃，且四 级子温度为150℃。质量范围为25-600amu。MS裂解谱相对于NIST MS数据库，2008版进行匹配。 [0264] 出现在总离子GC-MS谱中的峰以两种方法之一进行化学赋值。第一种方法中，通过确保保留时间和裂解质谱两者分别与正式标准的保留时间和裂解质谱对应来完成赋值-这被称为“方法1”，且基本上是明确的。在没有正式标准时，仅可以获得试验性的化学赋值；这通过共同地整合所讨论的峰的下列数据完成：(i)裂解谱的结构，特别是关于分子离子的质量，以及关于其类似于烃特征性“包络”质谱(“envelope”mass spectrum)的程度，(ii)保留时间，特别是关于其与赋值的化合物，如稍微在其饱和正烷烃对应物之前的顺式不饱和正烯烃洗脱物，的定性相容性，和(iii)赋值的化合物与AAR-ADM操作和所讨论的宿主生物中的相关途径(如，如果不能足够快速地由ADM作用，则AAR产生的脂肪醛预期通过大肠杆菌中的宿主脱氢酶转化为对应的脂肪醇)化学相容的可能性。峰赋值的这一第二途径被称为“方法2”。在图2的总离子GC-MS谱中以及后续图中的所有这样的谱中，通过方法1化学赋值的峰以常规字体标记，而通过方法2赋值的峰以斜体字标记。 [0265] JCC9a和JCC1076丙酮细胞团提取物总离子谱(TIC)在图2中显示。也显示了C8-C20正烷烃正式标准(Sigma 04070)，以及1-十四醇(Sigma 185388)加1-十六醇(Sigma 258741)加1-十八醇(Sigma 258768)的TIC。在JCC1076中但未在对照株JCC9a中识别的 烃详细列举于表3中。这些烃是正十五烷(1)、1-十四醇(1)、正十七烯(2)、正十七烷(1)和1-十六醇(1)，其中括号中的数字表示了GC-MS峰赋值方法。方法1峰的MS裂解谱示于图3中，相对于其各自的库发现制图。 [0266] 表3 [0267] 在JCC1076而未在JCC9a的细胞团丙酮提取物中通过GC-MS检测到的烃，按保留时间增加的顺序。 [0268] [0269] “-”未检测到；“+”检测到 [0270] 这五种产物的形成与大肠杆菌中AAR-ADM途径中预期的不完全操作(即酰基-ACP→脂肪醛→脂肪醇)和预期的完全操作(即酰基-ACP→脂肪醛→烷烃/烯烃)相 符，其主要直链酰基-ACP包括12:0、14:0、16:0、18:0、16:1Δ9顺式和18:1Δ11顺式酰基基团(Heipieper HJ(2005)；Appl Environ Microbiol 71:3388)。假设正十七烯(2)源于 18:1Δ11顺式-ACP，其将对应于顺式-7-十七烯。事实上，正十七烯异构体被以在该保留时间的最高置信度MS裂解库发现确认，具有有分子量为238的预期分子离子；也如预期的，其稍微在正十七烷之前洗脱。 [0271] 实施例3 [0272] 通过细长聚球藻PCC7942SYNPCC7942_1593(adm)和SYNPCC7942_1594(aar)的异源表达在大肠杆菌B中产生正烷烃、正烯烃和脂肪醇。 [0273] 使用NdeI和EcoRI从pJB823中切除天然SYNPCC7942_1593-SYNPCC7942_1594操纵序列，并将其克隆到使用 NdeI和 MfeI 切割的商用表达载体 pCDFDuetTM-1(Novagen)中。得到的质粒被表示为pJB855(SEQ ID NO：16)，该构建体将SYNPCC7942_1593-SYNPCC7942_1594操纵子置于诱导型T7lacO启动子的转录控制之下。 [0274] 带有pJB855的大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)，JCC1113，的细胞内烃产物通过气相色谱-质谱(GC-MS)与带有pCDFDuetTM-1的大肠杆菌BL21(DE3)，对照株JCC114，的细胞内烃产物相比较。 [0275] JCC1114和JCC1113的起始克隆培养物在37℃下在补充有6mg/lFeSO4.7H2O、50μg/ml壮观霉素和2％葡萄糖作为碳源的M9最低培养基中生长过夜，这样的培养基被称为M9fs。各起始培养物被用于以在0.1的初始OD600接种32ml M9fs培养基。接种的培养物在37℃以300rpm生长，直至达到0.4的OD600，在该点加入IPTG至1mM的终浓度。在加入诱导物后，培养物在相同的条件下再生长17小时。对各个菌株，然后通过离心收集12ml饱和培养物。细胞团通过三个循环的在Milli-Q水中再悬浮和微量离心彻底清洗，随后通过三个循环的微量离心和抽吸尽可能除湿。随后细胞团在含有20μg/ml BHT和20μg/ml EA的0.7ml丙酮中漩涡5分钟进行提取。细胞碎片通过离心团聚，600μl上清液被移入GC小瓶中。如实施例2所述，这些JCC1114和JCC1113样品随后连同正式标准一起使用GC-MS分析。JCC1114和JCC1113丙酮细胞团提取物的TIC示于图4中；正烷烃和1-烷醇标准品 如实施例2中。在JCC1113中但未在对照株JCC1114中识别的烃类详细列举于表4中。 [0276] 表4 [0277] 在JCC1113但未在JCC1114细胞团的丙酮提取物中通过 GC-MS检测到的烃，按保留时间增加的顺序。 [0278] [0279] “-”未检测到；“+”检测到 [0280] 这些烃是正十三烷(1)、正十四烷(1)、正十五烯(2)、1-十二醇(2)、正十五烷(1)、正十六烯(2)、正十六烷(1)、1-十四醇(1)、正十七烯(2)、正十七烷(1)、1-十五醇(2)、1-十六烯醇(2)、1-十六醇(1)和1-十八烯醇(2)，其中括号中的数字表示GC-MS峰赋值方法。方法1峰的MS裂解谱示于图5中，相对于其各自的库发现绘图。主要产物是正十五烷和正十七烯。 [0281] 这十四种产物的形成与大肠杆菌中Aar-Adm途径中预期的不完全操作(即酰基-ACP→脂肪醛→脂肪醇)和预期的完全操作(即酰基-ACP→脂肪醛→烷烃/烯烃)相 符，其主要直链酰基-ACP包括12:0、14:0、16:0、18:0、16:1Δ9顺式和18:1Δ11顺式酰基基团(Heipieper HJ(2005).Adaptation of Escherichia coli to Ethanol on the Level of Membrane Fatty Acid Composition.Appl Environ Microbiol 71:3388)。假设正十五烯(2)源于16:1Δ9顺式-ACP，则其对应顺式-7-十五烯。事实上，正十五烯异构体以在该保留时间处的最高置信度MS裂解库发现确认，具有分子量210的预期分子离子；也如预期，其稍微在正十五烷之前洗脱。对于1-十二醇(2)，由于重叠的大得多的正十五烷(1)峰，可能不能对于该峰得到足够清晰的裂解谱。然而其存在与大肠杆菌中12:0-ACP的存在相符，且其保留时间正是对于运行的1-十四醇、1-十六醇和1-十八醇正式标准从1-烷醇碳数 目和观察到的保留时间之间的关系外推得到的。假设正十六烯(2)由于少见的不同于丙二酰-CoA的由丙酰-CoA酰基链起始而源于在大肠杆菌酰基-ACP群中预期的痕量水平的未 饱和17:1Δ9顺式酰基基团，则其对应于顺式-8-十六烯。事实上，正十六烯异构体被以在该保留时间处的最高置信度MS裂解库发现确认，具有分子量224的预期分子离子；也如预期的，其稍微在正十六烷之前洗脱。假设正十七烯(2)源于18:1Δ11顺式-ACP，其应对应于顺式-7-十七烯。事实上，正十七烯异构体被以在该保留时间处的最高置信度MS裂解库发现确认，具有分子量238的预期分子离子；也如预期的，其稍微在正十七烷之前洗脱。对于1-十五醇(2)，由于其低丰度，对于该峰可能不能得到足够清晰的裂解谱。然而其存在与由于少见的不同于丙二酰-CoA的丙酰-CoA的酰基链起始而预期在大肠杆菌酰基-ACP群 中的痕量水平15:0酰基基团的存在相符，且其保留时间正是对于运行的1-十四醇、1-十六醇和1-十八醇正式标准从1-烷醇碳数目和观察到的保留时间之间的关系插入的。此外，在JCC1170(表达Aer而不表达Adm的BL21(DE3)衍生种)的丙酮提取物中(见实施例4)， 1-十五醇被以在该保留时间处的最高置信度MS裂解库发现确认。对于1-十六烯醇(2)，由于其低丰度，对于该峰可能不能得到足够清晰的裂解谱；然而，假设其源于16:1Δ9顺式-ACP，其应对应于顺式-9-十六烯-1-醇。也如预期的，其稍微在1-十六醇之前洗脱。 最后，假设正十八烯醇(2)源于18:11Δ9顺式-ACP，其应对应于顺式-11-十八烯-1-醇。 事实上，正十八烯-1-醇异构体被以在该保留时间处的最高置信度MS裂解库发现确认，具有分子量250的预期分子离子；也如预期的，其稍微在1-十八醇之前洗脱。 [0282] 实施例4 [0283] 通过细长聚球藻SYNPCC7942_1594(aar)的异源表达而无SYNPCC7942_1593(adm)的共表达在大肠杆菌B中的脂肪醇产生。 [0284] 为测试烷烃生物合成需要AAR和ADM两者的假设以及单独表达AAR应该导致在大肠杆菌中仅产生脂肪醇(由于生成的脂肪醛的非特异性脱氢)的预测，创建了 仅包含SYNPCC7942_1593(ADM)和仅包含SYNPCC7942_1594(AAR)的表达构建体。因 此，SYNPCC7942_1593和SYNPCC7942_1594编码序列被单独地PCR扩增并通过NdeI和 TM MfeI克隆到商用表达载体pCDFDuet -1(Novagen)中。得到的质粒被表示为pJB881(仅 SYNPCC7942_1593)和pJB882(仅SYNPCC7942_1594)；在各构建体中，编码序列被置于诱导型T7lacO启动子的转录控制之下。 [0285] 带有pJB881的大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)，JCC1169，和带有pJB882的大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)，JCC1170，的细胞内烃产物通过气相色谱-质谱(GC-MS) TM 与带有pCDFDuet -1的大肠杆菌BL21(DE3)，阴性对照株JCC114，以及阳性对照 SYNPCC7942_1593-SYNPCC7942_1594株JCC1113(实施例3)的细胞内烃产物相比较。 JCC1169、JCC1170、JCC1114和JCC1113的克隆培养物如实施例3所述生长、提取和通过GC-MS分析，具有以下例外：JCC1170培养物在无IPTG的M9fs培养基中生长过夜，因为如果加入IPTG则该培养物不生长。据推测，这是由于甚至在没有诱导物时也发生的脂肪醇的毒性过度积累。 [0286] JCC1169、JCC1170、JCC1114和JCC1113丙酮细胞团提取物的TIC显示于图6中；正烷烃和1-烷醇标准品痕迹已被省略。在JCC1170中但未在对照株JCC1114中识别的烃 详细列举于表5中。 [0287] 表5 [0288] 在JCC1170而非JCC1114的细胞团丙酮提取物中通过GC-MS检测到的烃，按保留时间增加的顺序。 [0289] [0290] “-”未检测到；“+”检测到 [0291] 这些烃是1-十四醇(1)、1-十五醇(2)、1-十六烯醇(2)、1-十六醇(1)和1-十八烯醇(2)，其中括号中的数字表示了GC-MS峰的赋值方法。方法1峰的MS裂解谱示于图7中，相对于其各自的库发现绘图。如预期的，由于没有通过AAR生成脂肪醛底物，JCC1169中没有识别出烃，其痕迹与JCC1114的无法区分。 [0292] JCC1169中没有烷烃、烯烃和脂肪烷醇产生，JCC1170中仅有脂肪醇产生和JCC1113中烷烃、烯烃和脂肪烷醇的产生(如实施例3中讨论的)均与提出的大肠杆菌中 AAR和ADM的烷烃生物合成机制相符。因此，JCC1170中五种脂肪醇的形成与仅AAR为活性的，并对已知的直链酰基-ACP有活性(见实施例3)相符。对于1-十五醇(2)，其存在与由于少见的不同于丙二酰-CoA的丙酰-CoA酰基链起始的在大肠杆菌酰基-ACP群中预期的 痕量水平15:0酰基基团的存在相符，且其保留时间正是对于运行的1-十四醇、1-十六醇和 1-十八醇正式标准从1-烷醇碳数目和观察到的保留时间之间的关系插入的。最重要的， 1-十五醇(2)峰显示包络型裂解质谱，具有分子量182的预期分子离子。不同于JCC1113的情况，由于增加的丰度，现在可以从候选物1-十六烯醇的峰得到清晰的裂解谱。顶部的库发现是具有分子量222的预期分子离子的1-十六烯醇。假设其源于16:1Δ9顺式-十六烯基-ACP，异构体赋值应为顺式-9-十六烯-1-醇。也如预期的，其稍微在1-十六醇之前洗脱。假设正十八烯醇(2)源于18:11Δ9顺式-ACP，其应对应于顺式-11-十八烯-1-醇。 事实上，n-十八烯-1-醇异构体被以在该保留时间处的最高置信度MS裂解库发现确认，具有分子量250的预期分子离子；也如预期的，其稍微在1-十八醇之前洗脱。JCC1170中也有未识别的在1-十六烯醇尾部洗脱的侧峰，其裂解质谱不足够清晰来实现可能的识别。据假设这可能是大肠杆菌中仅有AAR活性时预期的主要C18醛产物，即顺式-11-十八烯醇。 [0293] 实施例5 [0294] 通过细长聚球藻PCC7942SYNPCC7942_1593(adm)和SYNPCC7942_1594(aar)的异源表达在聚球藻PCC7002中产生正烷烃、正烯烃和脂肪醇。 [0295] 为测试AAR和ADM的异源表达是否会引起蓝细菌宿主中想要的正烷烃的生物合成，在聚球藻PCC 7002(JCC138)中表达SYNPCC7942_1593-SYNPCC7942_1594操纵子。因此，质粒pJB823被转化入JCC138中，从而产生JCC1160株。该质粒的序列和注释以SEQ ID NO：15提供，并在实施例2中描述。在该构建体中，SYNPCC7942_1593-SYNPCC7942_1594操纵子被置于组成型aphII启动子的转录控制之下。500碱基对的上游和下游同源区域指引异源重组整合到JCC138的天然高拷贝pAQ1质粒中，而aadA基因允许通过其对壮观霉素的抗性来选择转化体。 [0296] 为测试潜在更强启动子的效应，也生成与pJB823直接类似的构建体，其以下列启动子来替代aphII启动子：来自λ噬菌体的cro启动子(PcI)、集胞藻PCC6803的cpcB启动子(PcpcB)、与启动子－lacI盒的上游拷贝一起的trc启动子(PlacI-trc)、合成EM7启动子(PEM7)。启动子通过pJB823载体中SYNPCC7942_1593-SYNPCC7942_1594操纵子上游启动子侧翼的NotI和NdeI位点交换。对应的最终质粒如下：pJB886(PcI)、pJB887(PcpcB)、pJB889(PlacI-trc)、pJB888(PEM7)和pJB823(PaphII)。除了在NotI和NdeI位点之间的区域，pJB886、pJB887、pJB889和pJB888的这些序列与pJB823的序列相同，其中它们依据所使用的启动子而不同。不同启动子区域的序列以SEQ ID NO:19(PcI)、SEQ ID NO:20(PcpcB)、SEQ ID NO:21(PlacI-trc)和SEQ ID NO:22(PEM7)提供。PaphII启动子的序列在SEQ ID NO:15中显示。 [0297] pJB886、pJB887、pJB889、pJB888、pJB823 以 及 pJB5( 完 全 缺 少SYNPCC7942_1593-SYNPCC7942_1594操纵序列的空pAQ1靶向载体)使用标准蓝细菌转 化方案自然地转化到JCC138中，从而分别产生藻株JCC1221(PcI)、JCC1220(PcpcB)、 JCC1160b(PlacI-trc)、JCC1160a(PEM7)、JCC1160(PaphII)和JCC879(pJB5)。简单的说，将 5-10μg质粒DNA加入1ml已经生长到约1.0的OD730的纯JCC138培养物中。细胞-DNA混 合物在黑暗中37℃下温和混合温育4小时，置于A+平板上，并在光孵育器(Percival)中温育24小时，在该点铺垫壮观霉素至50μg/ml的终浓度。壮观霉素抗性克隆在24小时光-2 -1 照条件(～100μmol光子m s )下进一步温育5-8天后出现。在一轮补充100μg/ml壮 观霉素的A+平板上的克隆纯化之后，六个转化株中各株的单克隆在试管中，在Multitron -2 -1 II(Infors)摇动光孵育器中在3％富CO2空气、～100μmol光子m s 的条件下，37℃下以 150rpm生长4-8天。用于液体培养物的生长培养基为具有200μg/ml壮观霉素的A+。 [0298] 为了比较JCC1221、JCC1220、JCC1160b、JCC1160a、JCC1160和JCC879的细胞内烃9 产物，通过离心从前面提及的试管培养物中收集每株24D730-ml值的细胞(～2.4x 10细胞)。细胞团通过3个循环的在Milli-Q水中再悬浮和微量离心彻底清洗，随后通过3个 循环的微量离心和抽吸尽可能除湿。随后细胞团在含有20μg/ml BHT和20μg/ml EA的 0.7ml丙酮中漩涡5分钟进行提取。细胞碎片通过离心团聚，600μl上清液被加入GC小瓶中。然后六种提取物连同正式标准，如实施例2所述使用GC-MS进行分析。 [0299] JCC1221、JCC1220、JCC1160b、JCC1160a、JCC1160和JCC879丙酮细胞团提取物的TIC示于图8中；正烷烃和1-烷醇标准如实施例2中。与多种启动子强度并与AAR-ADM途径的功能一致，存在多种的烃积累，积累的顺序为PcI>PcpcB>PlacI-trc>PEM7>PaphII(Figure 8A)。 [0300] 在JCC1160中，约0.2％细胞干重被发现为正烷烃和正-烷-1-醇(不包括正-十九-1-烯)。在这0.2％中，约四分之三对应于正烷烃，主要产物是正十七烷和正十五烷。这些烃在JCC879中没有检测到。数据概括于表6A中。 [0301] 表6A在JCC1160和JCC879丙酮提取物中检测到的烃 [0302] [0303] [0304] 总计0.181％ [0305] 正烷烃产物百分比76％ [0306] 最高累积者是JCC1221(PcI)。在JCC1221中但未在对照株JCC879中识别的烃详细列举于表6B、表6C和图8B中。这些烃是正十三烷(1)、正十四烷(1)、正十五烯(2)、正十五烷(1)、正十六烷(1)、正十七-二-烯(2)、正十七烯的三种异构体(2)、正十七烷(1)和1-十八醇(1)，其中括号中的数字表示GC-MS峰赋值方法。 [0307] 表6B JCC1221丙酮提取物中定量的正烷烃 [0308]化合物 JCC1221细胞干重的百分比 正十三烷 <0.001％ 正十四烷 0.0064％ 正十五烷 0.40％ 正十六烷 0.040％ 正十七烷 1.2％ [0309] 总计1.67％ [0310] 方法1峰的MS裂解谱示于图9中，相对于其各自的库发现绘图。JCC879中观察到的仅有的烷烃/烯烃是1-十九烯和更少量的十九-二-烯，其是已知的JCC138天然合成的烯烃(Winters K等(1969)Science 163:467-468)。JCC1221中观察到的主要产物是正十五烷(～25％)和正十七烷(～75％)，所有其他的都相对地处于痕量水平。 [0311] JCC1221中正十五烷和正十七烷以及九种其他痕量烃产物的形成与JCC138中ADM-AAR途径(即16:0十六烷基-ACP→正十六醛→正十五烷和18:0十八烷基-ACP→正 十八醛→正十七烷)的几乎完全运行相符。实际上已知该生物体中的主要酰基-ACP种类是C16:0和C18:0(Murata N等(1992)Plant Cell Physiol 33:933-941)。相对于大肠杆菌中的AAR-ADM表达(实施例3)产生了相对少得多的脂肪醇，如预期的，假定JCC138中存在能够再生ADM的二铁活性位点的蓝细菌铁氧化还原蛋白/铁氧化还原蛋白-NADPH还原酶系 统，从而防止了十六醛和十八醛(其随之被非特异性脱氢成相应1-烷醇)的积累。因此，在JCC1221中，只观察到非常小的1-十八醇(1)峰(图8)。 [0312] JCC1221中观察到的其他痕量烃据信是正十五烷和正十七烷的不饱和异构体(表6C)。假设所有这些烯烃都是在通过SYNPCC7942_1593Adm产生相应烷烃之后的去饱和事件生成的。这与大肠杆菌中的情况形成相反，大肠杆菌中当酰基链被连接到酰基载体蛋白上时，双键被引入增长中的酰基链中(实施例3)。JCC138已知具有多种位点特异性酰基-脂去饱和酶，其尽管名义上仅对酯化成甘油脂的脂肪酸有活性，但可以潜在地作用于通过AAR和ADM的作用非生理地产生的其他未反应烷烃。JCC138去饱和酶即DesA、DesB和DesC在C18酰基链的Δ9、Δ12和Δ15位和在C16酰基链的Δ9和Δ12位引入顺式双键(Murata N和Wada H(1995)Biochem J.308:1-8)。候选的正十五烯峰据信是顺式-4-十五烯(表6C)。 [0313] 也假设正十七烷也可以作为JCC138去饱和酶的底物，且其应当在类似于C18酰基部分的Δ9、Δ12和Δ15位的位置被去饱和，则有四种理论上可能的单不饱和异构体：顺式-3-十七烯、顺式-6-十七烯、顺式-8-十七烯和顺式-9-十七烯。这些异构体不包括名义上在大肠杆菌中观察到的单一正-十七烯种类，顺式-7-十七烯(实施例2)。据信最接近正十七烷峰的三个峰-由表6C和图8B中的标注1、2和3表示-包括这4种单不饱和 十七烷异构体中的至少3种。与此一致，正十七烯2和正十七烯 3的峰在其包络形裂解谱中具有质量238的预期分子离子。因此，对于具有质量236的预期分子离子的包络形裂解谱的推定的顺式,顺式-十七-二-烯峰有许多异构可能性。如预期的，所有推定的十七烯 种类稍微在正十七烷之前洗脱。 [0314] 表6C [0315] 在JCC1221而非JCC879细胞团的丙酮提取物中通过GC-MS检测到的烷烃和烯烃，按保留时间增加的顺序。“-”未检测到；“+”检测到。 [0316] [0317] 实施例6 [0318] 通过细长聚球藻PCC7942SYNPCC7942_1593(adm)和SYNPCC7942_1594(aar)的异源表达在聚球藻PCC7002中正烷烃的细胞内累积至高达5％细胞干重。 [0319] 为了更准确地定量产烷烃(alkanogen)的JCC1221(实施例5)中的细胞内正烷烃产物积累水平，相对于细胞干重(DCW)来定量正十五烷和正十七烷 以及相对痕量的正十四烷和正十六烷产物的水平。基于烷烃产生的程度可能 与SYNPCC7942_1593-SYNPCC7942_1594操纵子 表达水 平正相 关的假 设，JCC1221 的DCW标准化正烷烃水平被确定为随培养基中壮观霉素的浓度变化。原因是壮 观霉素选择压力越高，pAQ1的相对拷贝数越高，并有更多拷贝的aadA-连接的 SYNPCC7942_1593-SYNPCC7942_1594操纵子。 [0320] JCC1221的克隆起始培养物在Multitron II(Infors)的摇动光孵育器中在3％富-2 -1CO2空气，～100μmol光子m s 的条件下，在补充了100μg/ml壮观霉素的A+培养基中 37℃，150rpm下生长7天。在该点，该培养物被用于一式三份接种补充了100、200、300、400或600μg/ml壮观霉素的30ml JB2.1培养基(PCT/US2009/006516)烧瓶培养物。JB2.1培养基由18.0g/l氯化钠、5.0g/l的七水硫酸镁、4.0g/l硝酸钠、1.0g/l Tris、0.6g/l氯化钾，0.3g/l氯化钙(无水)、0.2g/l磷酸二氢钾、34.3mg/l硼酸、29.4mg/l EDTA(二水二钠盐)、14.1mg/l柠檬酸铁(III)水合物、4.3mg/l四水氯化锰、315.0μg/l氯化锌、30.0μg/l氧化钼(VI)、12.2μg/l六水氯化钴(II)、10.0μg/l维生素B12和3.0μg/l五水硫酸铜-2 -1 (II)。15份培养物在3％富CO2空气，～100μmol光子m s 的Multitron II(Infors)的 摇动光孵育器中，37℃，150rpm下生长10天。 [0321] 对各培养物，使用5-10ml做细胞干重测定。为此，限定体积的培养物-对应于约20mg DCW-被离心以团聚细胞。细胞被转移到事先称重过的eppendorf管中，然后通过2个循环的Milli-Q水中再悬浮和微量离心清洗细胞，再通过3个循环的微量离心和抽吸除湿。 湿细胞团在-80℃冷冻2小时并随后冻干过夜，在该点含有干细胞物质的管被再次称重以使细胞团的质量在±0.1mg内计算。此外，对各培养物，使用0.3-0.8ml进行细胞团丙酮提取以用于GC分析。为此，限定体积的培养物-对应于约1.4mg DCW-被微量离心以团聚细胞。然后通过2个循环的Milli-Q水中再悬浮和微量离心清洗细胞，再通过4个循环的微量离心和抽吸除湿。除湿的细胞团随后通过在含有50μg/ml BHT和160μg/ml正二十七烷内标(Sigma 51559)的1ml丙酮中漩涡1分钟进行提取。细胞碎片通过离心团聚，700μl上清液被移入GC小瓶中。 [0322] 十五份提取物中正十四烷、正十五烷、正十六烷和正十七烷的浓度通过气相色谱/火焰电离检测(GC/FID)定量。通过在已知的正十四烷、正十五烷、正十六烷和正十七烷正式标准品浓度和其对应的GC-FID峰面积之间确定的线性校准关系，生物样品中未知的正烷烃峰面积被转化为浓度。标准品从Sigma获得。GC-FID条件如下。使用配备有7683系列自动进样器的Agilent 7890A GC/FID。注入1μl的各样品到GC进口(分流5：1、压力：20psi、脉冲时间：0.3min、清洗时间：0.2min、清洗流量：15ml/min)，进口温度为280℃。柱为HP-5MS(Agilent,30m x 0.25mm x 0.25μm)，载气为氦气，流速1.0ml/min。GC炉温程序为50℃保持1分钟；每分钟10℃增加到280℃，保持10分钟。以丙酮中提取的DCW的百分数来计算正烷烃产量。 [0323] 与pAQ1选择压力和JCC1221中细胞内正烷烃产量水平间的比例关系一致，在相对于DCW的％正烷烃与壮观霉素浓度之间有粗略的正相关性(图10)。对于所有JCC1221培养物，正烷烃为～25％正十五烷和～75％正十七烷。最少的正烷烃产量在100μg/ml壮观霉素下为DCW的～1.8％，在600μg/ml壮观霉素的培养物之一中为5.0％。 [0324] 实施例7 [0325] 通过马里纳斯原绿球藻MIT 9312PMT9312_0532(adm)和PMT9312_0533(aar)的异源表达在聚球藻PCC7002中产生正烷烃 [0326] 由于这些蛋白与细长聚球藻PCC7942的其对应物SYNPCC7942_1593和SYNPCC7942_1594有相对低的氨基酸同源性(≤62％)，来自马里纳斯原绿球藻MIT 9312的该候选Adm/Aar对通过在JCC138中的异源表达进行的功能测试来选择。具体地说，252个氨基酸的蛋白质PMT9312_0532与232个氨基酸的蛋白质SYNPCC7942_1593显示出仅62％ 的氨基酸同一性，其中前者的氨基酸33-246与后者的氨基酸11-224对齐。347个氨基酸的蛋白质PMT9312_0533与342个氨基酸的蛋白质SYNPCC7942_1594显示出仅61％的氨基酸 同一性，其中前者的氨基酸1-337与后者的氨基酸1-339对齐。 [0327] PMT9312_0532-PMT9312_0533操纵子的密码子和限制性位点优化的形式由DNA2.0(Menlo Park,CA)合成，侧翼有NdeI和EcoRI位点。该操纵子通过NdeI和EcoRI被克隆到pAQ1同源重组载体pJB5中，使得PMT9312_0532-PMT9312_0533操纵子被置于aphII启动子的转录控制之下。pJB947载体的序列被提供为SEQ ID NO：17。 [0328] 如实施例5中所述，pJB947被转化到JCC138中，从而产生JCC1281株。该株的烃产物被与阴性对照株JCC879(对应于以空pJB5转化的JCC138(见实施例5))的烃产物相8 比较。通过离心收集各株8OD730-ml值的细胞(～8x10细胞)，如实施例5所述细胞已经 在补充了200μg/ml壮观霉素的A+培养基中生长。细胞团通过3个循环的Milli-Q水中 再悬浮和微量离心彻底清洗，随后通过3个循环的微量离心和抽吸尽可能除湿。随后细胞团在含有20μg/ml BHT和20μg/ml EA的0.7ml丙酮中漩涡5分钟进行提取。细胞碎片 通过离心团聚，600μl上清液被加入GC小瓶中。样品如实施例5所述通过GC-MS分析。 [0329] JCC1281和JCC879细胞团丙酮提取物的TIC示于图11中；正烷烃标准如实施例6中。在JCC1281中但未在对照株JCC879中识别的烃为正十五烷(1)和正十七烷(1)，其中括号中的数字表示GC-MS峰赋值方法。方法1峰的MS裂解谱示于图12中，相对于其各自的库发现绘图(如实施例5中注意到的，在JCC879中观察到的仅有的烷烃/烯烃是1-十九烯和更少量的十九-二-烯，其为已知由JCC138自然合成的烯烃)。JCC1281中产生的正 烷烃的量为至少0.1％细胞干重，并至少为JCC879产生量的2倍高。JCC1281中正十五烷： 正十七烷的比率(～40％：～60％)高于JCC1221中观察到的(～25％:～75％)，表 明与SYNPCC7942_1593(ADM)和/或SYNPCC7942_1594(AAR)相比，PMT9312_0532(ADM)和/或PMT9312_0533(AAR)显示出相对于C18底物，对C16底物具有更高的活性。 [0330] 实施例8 [0331] 通过天然tll1313(adm)-tll1312(aar)操纵子的过表达增加细长嗜热聚球藻BP-1中天然正烷烃的产生。 [0332] 编码细长嗜热聚球藻BP-1tll1312(AAR)和tll1313(ADM)的基因被整合入包含不同强度启动子的一种或多种质粒中(如，pJB5衍生物)。质粒被用于转化细长嗜热聚球藻BP-1。测量转化的细胞中基因的过表达，及转化的细胞以与实施例3中描述的类似的方式产生的正烷烃，特别是正十七烷的量。正烷烃和其他感兴趣的碳基产物也可以按需要从细胞或细胞培养物中分离。 [0333] 野生型细长嗜热聚球藻BP-1，被称为JCC3，自然产生正十七烷作为主要的细胞内烃产物，具有痕量的正十六烷和正十五烷。这些正烷烃使用方法1通过GC-MS识别；裂解谱示于图13中。简单的说，JCC3的集落在B-HEPES培养基中生长至4的最终OD730，在该点5OD730-ml值的细胞按实施例5所详细描述的收获、丙酮中提取和用GC-MS分析。 [0334] 为试图增加该正烷烃的产生，来自该生物体的天然tll1313-tll1312操纵子序列被PCR扩增并克隆到细长嗜热聚球藻BP-1染色体整合载体pJB825中。该构建体将tll1313-tll1312操纵子置于组成型cI启动子的转录控制之下。得到的质粒pJB825t的序列示于SEQ ID NO：18中。 [0335] 使用标准蓝细菌转化方案将pJB825和pJB825t自然转化到JCC3中，分别得到藻株JCC1084和JCC1084t。简单的说，25μg质粒DNA被加入0.5ml浓缩的JCC3培养物中-2 -1 (OD730～100)，JCC3培养物原先在3％富CO2空气、～100μmol光子m s 的Multitron II(Infors)摇动光孵育器中，在B-HEPES中45℃下生长至约1.0的OD730。细胞-DNA混合物在黑暗中37℃下温和混合温育4小时，用新鲜B-HEPES培养基补至7ml，随后在3％富CO2-2 -1 空气、～100μmol光子m s 的Multitron II(Infors)摇动光孵育器中，连续光照条件(～-2 -1 100μmol光子m s )下45℃、150rpm温育20小时。在该点，通过离心收集细胞，连续稀释物与融化的顶层琼脂混合并置于补充了60μg/ml卡那霉素的B-HEPES平板表面上。转化体-2 -1 集落在1％富CO2的光孵育器(Percival)中，～100μmol光子m s 的持续光照下温育约 7天内在琼脂顶层出现。JCC1084和JCC1084t的单一集落随后一式三份在B-HEPES/60μg/ml卡那霉素液体培养基中生长至～6的OD730，且其细胞内烃产物使用GC-FID定量。 [0336] 通过离心收集各株的各重复培养物的3.5OD730-ml值的细胞(～3.5x108细胞)。细胞团通过3个循环的Milli-Q水中再悬浮和微量离心彻底清洗，随后通过3个循环的微量离心和抽吸尽可能除湿。随后细胞团在含有20μg/ml BHT和20μg/ml正二十七烷的 0.7ml丙酮中漩涡1分钟进行提取。细胞碎片通过离心团聚，600μl上清液被加入GC小瓶中。两个提取物随后连同可信的C8-C20正烷烃正式标准(Sigma 04070)一起如实施例6所述通过与火焰电离检测(FID)偶联的GC进行分析。如实施例6所述获取正十五烷、正十六烷和正十七烷通过GC-FID的定量和细胞干重。 [0337] 与JCC1084t中相对于对照株JCC1084的tll1313-tll1312表达增加一致，相对于在JCC1084中的％DCW水平，JCC1084t中正十五烷、正十六烷和正十七烷分别高出～ 500％、～100％和～100％(图14)。这两个株中的总正烷烃浓度低于1％。JCC1084t中正烷烃浓度至少为0.62％并且是相对于JCC1084所产生的正烷烃的至少2倍。 [0338] 实施例9 [0339] JCC1113(大肠杆菌衍生种)和JCC1221(聚球藻PCC7002衍生种)细胞内烃产物的比较，这两个株都异源表达细长聚球藻SYNPCC7942_1593(adm)和SYNPCC7942_1594(aar)。 [0340] JCC1113和JCC1221细胞团丙酮提取物的GC-MS TIC连同C8-C20正烷烃正式标准(Sigma 04070)一起示于图15中。这两株分别源于大肠杆菌BL21(DE3)和聚球藻PCC7002，且如实施例3和5中详述的。JCC1113主要合成正十七烯和正十五烷，而JCC1221主要合成正十七烷和正十五烷。该图直观地强调了JCC1113产生的正十七烯异构体和JCC1221产生的正十七烷的不同保留时间。 [0341] 实施例10 [0342] 酵母中烃的产生 [0343] 本发明的方法可以在多种低等真核生物如酿酒酵母、里氏木霉(Trichoderma reesei)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和毕赤酵母中实施。工程化这样的生物体可以包括优化基因以有效转录和/或翻译编码的蛋白。例如，由于引入真菌宿主中的ADM和AAR基因是蓝细菌来源的，可能必需优化碱基对组成。这包括密码子优化以确保细胞的tRNA池是充分的。外来基因(ORF)可能包含对在真菌宿主中完整转录/翻译有害的基序，而因此可能需要替换为更适合的序列。各引入的蛋白质的表达可以在转录和翻译阶段中分别进行公知的RNA和蛋白印迹技术。 [0344] 使用的各种酵母表达载体，包括编码促进ADM或AAR途径的活性的基因、启动子、中止子、选择标记和靶向侧翼区域。这样的启动子、中止子、选择标记和侧翼区域本领域中很容易得到。在优选的实施方式中，各种情况下选择的启动子提供该特定ORF编码的蛋白质的优化表达以得到想要的酶促反应的充分催化。该步骤需要选择组成型或诱导型的启动子，并提供调节的转录水平。在另一个实施方式中，选择的中止子使得能够充分中止转录。在再另一个实施方式中，使用的选择/反向选择标记对各个ORF是独特的，使得能够随后选择包含要引入的ORF的特定组合的真菌菌株。在进一步的实施方式中，相关质粒构建体(编码启动子、ORF和中止子)定位的基因座由侧翼区域的选择确定。 [0345] 可以使用多种不同的基因转化工程菌株以产生感兴趣的碳基产物，这些基因被稳定整合以确保想要的活性在整个发酵过程中被保持。酶活性的各种组合如ADM、ADR途径可以被工程化进入真菌宿主而不想要的途径被弱化或敲除。 [0346] 实施例11 [0347] 组 成 型的 表 达 pAQ1上 的 异 源细 长 聚 球 藻SYNPCC7942_1593(adm) 加SYNPCC7942_1594(aar)或异 源马 里纳 斯原绿 球藻MIT9312PMT9312_0532(adm) 加PMT9312_0533(aar)的聚球藻PCC7002株的细胞内正十五烷：正十七烷比的定量 [0348] 在 实 施 例 5(“通 过 细 长 聚 球 藻 PCC7942SYNPCC7942_1593(adm) 和SYNPCC7942_1594(aar)的异源表达在聚球藻PCC7002中产生正烷烃、正烯烃和脂肪醇”)和实施例7(“通过马里纳斯原绿球藻MIT9312PMT9312_0532(adm)和PMT9312_0533(aar)的异源表达在聚球藻PCC7002中产生正烷烃”)中，表达细长聚球藻PCC7942和马里纳斯原绿球藻MIT 9312adm-aar操纵子的JCC138(聚球藻PCC7002)株的细胞内烃产物通过GC-MS分析。在本实施例中，应用GC-FID(气相色谱-火焰电离检测)以更准确地相对于细胞干重测量这些产物。对正十五烷和正十七烷间的比率特别感兴趣。在这方面，注意到细长聚球藻PCC7942自然合成正十七烷作为主要细胞内正烷烃，而马里纳斯原绿球藻MIT 9312自然合成正十五烷作为主要细胞内正烷烃。 [0349] 比较了下列四个菌株：(1)JCC138，对应于野生型聚球藻PCC7002，(2)JCC879，对应于实施例5中描述的使用pAQ1-靶向质粒pJB5转化的阴性对照株JCC138，(3)JCC1469，对应于实施例5中描述的使用编码组成型表达的细长聚球藻PCC7942adm-aar的pAQ1-靶向质粒pJB886转化的JCC138ΔSYNPCC7002_A1173::gent(JCC1218)，和(4)JCC1281，对应于实施例7中描述的使用编码组成型表达的马里纳斯原绿球藻MIT 9312adm-aar的 pAQ1-靶向质粒pJB947转化的JCC138。各株的克隆起始培养物在A+培养基(JCC138)、补充了100μg/ml壮观霉素的A+培养基(JCC879和JCC1281)或补充了100μg/ml壮观霉素 和50μg/ml庆大霉素的A+培养基(JCC1469)中，置于2％富CO2空气、～100μmol光子 -2 -1 m s 的Multitron II(Infors)摇动光孵育器中，37℃，150rpm下生长最多5天。在该点，各个起始培养物被用于接种一式两份的未补充抗生素(JCC138)或补充了400μg/ml壮观霉素(JCC879、JCC1469和JCC1281)的30ml JB2.1培养基烧瓶培养物。这八个培养物随 -2 -1 后在2％富CO2空气、～100μmol光子m s 的Multitron II(Infors)摇动光孵育器中， 37℃，150rpm下生长14天。 [0350] 对于各个培养物，通过离心在事先称重过的eppendorf管中收集25OD730-ml值的细胞。通过2个循环的Milli-Q水中再悬浮和微量离心清洗细胞，再通过2个循环的微量离心和抽吸除湿。湿细胞团在-80℃冷冻2小时并随后冻干过夜，在该点含有干细胞物质的管被再次称重以使细胞团的质量(～6mg)被在±0.1mg内计算。平行地，通过离心在eppendorf管中收集各培养物的4OD730-ml值的细胞，并通过3个循环的Milli-Q水中再悬浮和微量离心彻底清洗，随后通过3个循环的微量离心和抽吸尽可能除湿，除湿的细胞团块在含有23.6μg/ml BHT和24.4μg/ml正二十七烷(C27)内标的1ml丙酮(ABH)中漩涡 15秒进行提取。细胞碎片通过离心团聚，450μl上清液被提交用于GC-FID。丙酮提取的DCW被计算为25OD730-ml值细胞测量的DCW的4/25，或16％。与8个生物样品提取平行，6个空eppendorf管使用ABH以同样的方式提取。所有ABH提取物的提取/注射效率通过计 算样品的正二十七烷GC-FID峰面积和6个空管对照的平均正二十七烷GC-FID峰面积间的比率来评价-仅接受100％±3％的比率(表7)。 [0351] 8个提取物中正十三烷(C13)、正十四烷(C14)、正十五烷(C15)、正十六烷(C16)、正十七烷(C17)和正十八烷(C18)的浓度由(GC-FID)定量。通过已知的正十三烷、正十四烷、正十五烷、正十六烷、正十七烷和正十八烷正式标准品浓度和对应的GC-FID峰面积间确定的线性校准关系，生物样品中未知的正烷烃峰面积被转化为浓度。基于这些线性回归校准关系，计算出内插的生物样品中正烷烃浓度的95％置信区间(95％CI)；在所有情况下使用内插而不使用外推。95％的置信区间被报告为所讨论的内插浓度的百分数-表1中95％CI％。GC-FID条件如下。使用配备有7683系列自动进样器的Agilent 7890A GC/FID。注入 1μl的各样品到GC进口(分流8：1，压力)，进样口温度为290℃。柱为HP-5MS(Agilent,20m x 0.18mm x 0.18μm)，载气为氦气，流速1.0ml/min。GC炉温程序为80℃保持0.3分钟； 17.6℃/分钟增加到290℃；保持6分钟。以丙酮提取的DCW的百分数来表示正烷烃产量。 6个空管对照的正二十七烷GC-FID峰面积的变异系数为1％。 [0352] GC-FID数据概括于表7中。如预期的，对照株JCC138和JCC879不产生正烷烃，而JCC1496和JCC1281产生正烷烃，其中的～98％由正十五烷和正十七烷组成。相比于JCC1281(～0.7％)，JCC1469产生显著更多的作为DCW百分比的正烷烃(～1.9％)，这可能解释了JCC1469培养物相对低的最终OD730。对于表达细长聚球藻PCC7942adm-aar的一式两份的JCC121培养物，正十五烷相对于正十五烷加正十七烷的质量百分比为26.2％和 25.3％，然而在表达马里纳斯原绿球藻MIT 9312adm-aar的一式两份的JCC1221培养物中其为57.4％和57.2％(表7)。该结果定量地确认，当在蓝细菌宿主中体内表达时，这两种不同的adm-aar操纵子产生不同的正烷烃产物长度分布。 [0353] 表7 [0354] [0355] [0356] 表7 JCC138、JCC879、JCC1469和JCC1281细胞团丙酮提取物中GC-FID定量的正十五烷和正十七烷。任何样品中都没有检测到正十八烷；nd：未检测到，na：不适用。 [0357] 实施例12 [0358] 诱导表达染色体整合的异源马里纳斯原绿球藻MIT 9312PMT9312_0532(adm)加PMT9312_0533(aar) 的 聚 球 藻PCC7002 株 在 具 有 或 不 具 有 异 源 蓝 杆 藻ATCC51142Cce_0778(adm)加Cce_1430(aar)的情况下细胞内正十五烷：正十七烷比的定量。 [0359] 为确认染色体的Aar和Adm异源表达引起细胞内烷烃积累，实施例7中描述的马里纳斯原绿球藻MIT 9312adm-aar操纵子(编码PMT9312_0532加PMT9312_0533)被染色体整合在SYNPCC7002_A0358基因座。为此，构建了SYNPCC7002_A0358-靶向载体(pJB1279SEQ ID NO：23)，其包含750bp的上游和下游同源区域，设计用于以所述同源区域之间的多克隆位点(MCS)下游壮观霉素抗性盒来重组置换SYNPCC7002_A0358基因。不是使用组成型启动子来表达adm-aar操纵子，而是使用诱导型启动子。具体的说，尿素抑制、硝酸盐诱导的nirA型启动子，P(nir07)(SEQ ID NO：24)通过NotI和NdeI被插入MCS中，产生基本同源重组载体pJB1279。 [0360] 两个操纵子被克隆至pJB1279的P(nir07)下游以产生两个实验构建体，其中所述操纵子被置于P(nir07)的转录控制之下。第一个操纵子仅包含通过NdeI和EcoRI插入的之前提到的原绿球藻PMT9312_0532-PMT9312_0533操纵子，得到最终的质粒pJB286alk_p；该adm-aar操纵子序列恰如实施例7描述的。第二个操纵子包含(1)相同的原绿球藻 PMT9312_0532-PMT9312_0533adm-aar操纵子，随后是(2)通过EcoRI插入的(通过筛选选择正确的方向)分别源自蓝杆藻ATCC51142基因cce_0778(SEQ ID NO:31)和cce_1430(SEQ ID NO:30)的adm-aar操纵子，得到最终的质粒pJB1256。注意到蓝杆藻ATCC51142天然合成作为主要细胞内正烷烃产物为正十五烷。这一蓝杆藻adm-aar操纵子(SEQ ID NO：25)在合成前通过DNA2.0(Menlo Park,CA)进行密码子和限制性位点优化。操纵子表达的蛋白质氨基酸序列与蓝杆藻ATCC51142的AAR和ADM酶的氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：27和 SEQ ID NO：29)相同。因此，质粒pJB1256中的完整操纵子包含在单一P(nir07)启动子的转录控制之下的4个基因-原绿球藻PMT9312的ADM和AAR以及蓝杆藻ATCC51142的ADM 和AAR。 [0361] 恰如实施例5中所述的，pJB1279、pJB286alk_p和pJB1256被自然转化到JCC138中，分别产生壮观霉素抗性株JCC1683c、JCC1683和JCC1685。作为第一个实验，这三株中各株的克隆起始培养物，以及JCC138，在A+培养基(JCC138)或补充了100μg/ml壮观霉素的-2 -1A+培养基(JCC1683c、JCC1683和JCC1685)中，置于2％富CO2空气、～100μmol光子m s的Multitron II(Infors)摇动光孵育器中，37℃，150rpm下生长最多5天。在该点，各个起始培养物被用于接种未补充抗生素(JCC138)或补充了100μg/ml壮观霉素(JCC1683c、JCC1683和JCC1685)的30ml JB2.1培养基加3mM尿素的烧瓶培养物。这4个培养物随后 -2 -1 在2％富CO2空气、～100μmol光子m s 的Multitron II(Infors)摇动光孵育器中，37℃， 150rpm下生长14天。 [0362] 通过离心在事先称重过的eppendorf管中收集20OD730-ml值的细胞。通过2个循环的Milli-Q水中再悬浮和微量离心清洗细胞，再通过2个循环的微量离心和抽吸除湿。湿细胞团在-80℃冷冻2小时并随后冻干过夜，在该点含有干细胞物质的管被再次称重以使细胞团的质量(～6mg)可以在±0.1mg内计算。平行地，通过离心在eppendorf管中收 集3.5OD730-ml值的各培养物的细胞，通过3个循环的Milli-Q水中再悬浮和微量离心彻底清洗，随后通过3个循环的微量离心和抽吸尽可能除湿。除湿的细胞团在含有18.2μg/ml BHT和16.3μg/ml正二十七烷(C27)内标的1ml丙酮(ABH)中漩涡15秒进行提取。细胞碎 片通过离心团聚，500μl上清液被提交用于GC-FID。丙酮提取的DCW被计算为20OD730-ml值细胞测量的DCW的3.5/20，或17.5％。与4个生物样品的提取平行，8个空eppendorf管使用ABH以同样的方式提取。所有ABH提取物的提取/注射效率通过计算样品的正二十七烷GC-FID峰面积和6个空管对照的平均正二十七烷GC-FID峰面积间的比率来评价-仅接 受100％±11％的比率(表8)。 [0363] 如实施例11所述，四个提取物中正十三烷(C13)、正十四烷(C14)、正十五烷(C15)、正十六烷(C16)、正十七烷(C17)和正十八烷(C18)的浓度由(GC-FID)定量。GC-FID条件如下。使用配备有7683系列自动进样器的Agilent 7890A GC/FID。注射1μl的每种样品到GC进口(分流5：1，压力)，进口温度为290℃。柱为HP-5(Agilent,30m x 0.32mm x 0.25μm)，载气为氦气，流速1.0ml/min。GC炉温程序为50℃保持1分钟；每分钟10℃增加到290℃；保持9分钟。以丙酮提取的DCW的百分数计算正烷烃产量。8个空管对照的正 二十七烷GC-FID峰面积的变异系数为3.6％。 [0364] GC-FID数据概括于表8中。如预期的，对照株JCC138和JCC1683c不产生正烷烃，而JCC683和JCC1685产生正烷烃，其中的～97％由正十五烷和正十七烷组成。相比于JCC1683(～0.16％)，JCC1685产生显著更多的以DCW的百分数计的正烷烃(～0.42％)，这可能解释了JCC1685培养物相对低的最终OD730。对于表达马里纳斯原绿球藻MIT 9312adm-aar的JCC1683，正十五烷相对于正十五烷加正十七烷的质量百分比为53.2％，与表达pAQ1上的相同操纵子的JCC1281的量(57.3％，表7)数量上一致。相反，对于额外表达蓝杆藻ATCC51142adm-aar的JCC1685，正十五烷相对于正十五烷加正十七烷的质量百分比为83.7％。该结果证实了蓝细菌宿主中cce_0778和cce_1430的体内表达倾向于朝向 正十五烷的正烷烃产物长度分布-甚至比PMT9312_0532和PMT9312_0533的表达更具倾向性。由染色体整合株JCC1683和JCC1685产生的细胞内正烷烃的总量明显低于基于pAQ1 的转化体如JCC1469的细胞内正烷烃总量，据推测可能是由于较低拷贝的表达(即染色 体相比于高拷贝的pAQ1)和相比于组成型启动子P(aphII)(JCC1281)和P(cI)(JCC1469) P(nir07)的部分抑制的转录(由于培养基中尿素的初始存在)的组合。 [0365] 表8 [0366] [0367] 表8 JCC138、JCC1683c、JCC1683和JCC1685细胞团丙酮提取物中GC-FID定量的正十五烷和正十七烷。任何样品中都没有检测到正十八烷；nd：未检测到，na：不适用。 [0368] 为确认P(nir07)的尿素抑制性/硝酸盐诱导性，从生长在仅含有硝酸盐作为氮源的JB2.1培养基和补充了6mM尿素的JB2.1培养基中的培养物确定JCC1685细胞内正烷烃产物的分布，相对于硝酸盐，尿素被优先用作氮源，并以使得在培养物达到～4的OD730时被耗尽的浓度提供。JCC1683c在JB2.1中平行培养作为阴性对照。因此，JCC1683c和JCC1685的克隆起始培养物在补充了100μg/ml壮观霉素的A+培养基中，置于2％富CO2空-2 -1 气、～100μmol光子m s 的Multitron II(Infors)摇动光孵育器中，37℃，150rpm下生长最多5天。在该点，各个起始培养物被用于接种一式两份的补充了400μg/ml壮观霉素的 30ml JB2.1培养基烧瓶培养物。此外，JCC1685起始培养物被用于接种一式两份的补充了 400μg/ml壮观霉素的30mlJB2.1培养基加6mM尿素的烧瓶培养物。然后这六个培养物在-2 -1 2％富CO2空气、～100μmol光子m s 的Multitron II(Infors)摇动光孵育器中，37℃， 150rpm下生长14天。细胞内正烷烃作为DCW的百分比精确地按照实施例11的描述确定； 数据概括于表9中。与P(nir07)的尿素抑制性相符，相比于尿素存在时(～0.15％)的情况，正烷烃以JCC185DCW的百分数计在没有尿素时显著较高(～0.59％)。这可能解释了无尿素培养物相对低的最终OD730。 [0369] 表9 [0370] [0371] [0372] 表9 JCC1683c和JCC1685细胞团丙酮提取物中GC-FID定量的正十五烷和正十七烷，随生长培养基中的尿素豪华。任何样品中都没有检测到正十八烷；nd：未检测到，na：不适用。 [0375] SEQ ID NO:1 [0376] 细长嗜热聚球藻BP-1；tll1312(AAR) [0377] 核酸序列 [0378] [0379] SEQ ID NO:2 [0380] 细长嗜热聚球藻BP-1 tll1312(AAR) [0381] 氨基酸序列 [0382] [0383] SEQ ID NO:3 [0384] 细长嗜热聚球藻BP-1 tll1313(ADM) [0385] 核酸序列 [0386] SEQ ID NO:4 [0387] 细长嗜热聚球藻BP-1 tll1313(ADM) [0388] 氨基酸序列 [0389] [0390] SEQ ID NO:5 [0391] 细长聚球藻PCC 7942；SYNPCC7942_1594(AAR) [0392] 核酸序列 [0393] [0394] [0395] SEQ ID NO:6 [0396] 细长聚球藻PCC 7942；SYNPCC7942_1594(AAR) [0397] 氨基酸序列 [0398] [0399] SEQ ID NO:7 [0400] 细长聚球藻PCC 7942；SYNPCC7942_1593(ADM) [0401] 核酸序列 [0402] [0403] SEQ ID NO:8 [0404] 细长聚球藻PCC 7942；SYNPCC7942_1593(ADM) [0405] 氨基酸序列 [0406] [0407] SEQ ID NO:9 [0408] 马里纳斯原绿球藻MIT9312 PMT9312_0533(AAR) [0409] 优化的核酸序列 [0410] [0411] SEQ ID NO:10 [0412] 马里纳斯原绿球藻MIT9312 PMT9312_0533(AAR) [0413] 蛋白质序列 [0414] [0415] SEQ ID NO:11 [0416] 马里纳斯原绿球藻MIT9312 PMT9312_0532(ADM) [0417] 优化的核酸序列 [0418] [0419] SEQ ID NO:12 [0420] 马里纳斯原绿球藻MIT9312 PMT9312_0532(ADM) [0421] 蛋白质序列 [0422] [0423] SEQ ID NO:13 [0424] 马里纳斯原绿球藻MIT9312 PMT9312_0533(AAR) [0425] 核酸序列 [0426] [0427] SEQ ID NO:14 [0428] 马里纳斯原绿球藻MIT9312 PMT9312_0532(ADM) [0429] 核酸序列 [0430] [0431] SEQ ID NO:15 [0432] 质粒JB823 [0433] 第一下划线序列 pAQ1上游同源区域 [0434] 第一双下划线小写字母序列 启动子交换的NotI位点 [0435] 第一斜体序列 aphII启动子 [0436] 第二双下划线小写字母序列 启动子交换NdeI位点 [0437] 第一粗体序列 SYNPCC7942_1593(adm)编码序列 [0438] 第一小写字母序列 基因间序列 [0439] 第二粗体序列 SYNPCC7942_1594(aar)编码序列 [0440] 第二斜体序列 aadA编码序列；specR选择标记 [0441] 第二下划线序列 pAQ1下游同源区域 [0442] 第二小写序列 载体骨架 [0443] [0444] [0445] [0446] SEQ ID NO:16 [0447] 质粒pJB855 [0448] 第一粗体序列 SYNPCC7942_1593编码序列 [0449] 第二粗体序列 SYNPCC7942_1594编码序列 [0450] 斜体序列 aadA壮观霉素选择标记(反向互补) [0451] [0452] [0453] [0454] SEQ ID NO:17 [0455] 质粒pJB947 [0456] 第一下划线序列 pAQ1的上游同源序列 [0457] 第一斜体序列 aphII启动子 [0458] 第一粗体序列 PMT9312_0532(adm)编码序列 [0459] 第一小写字母序列 基因间序列 [0460] 第二粗体序列 PMT9312_0533(aar) [0461] 第二斜体序列 aadA编码序列；壮观霉素选择标记 [0462] 第二下划线序列 pAQ1下游同源序列 [0463] 第二小写字母序列 载体骨架 [0464] [0465] [0466] [0467] SEQ ID NO:18 [0468] 质粒pJB825t [0469] 第一下划线序列 TS1染色体整合位点上游同源区域 [0470] 第一斜体序列 带JCC138rbcL核糖体结合序列的cI启动子 [0471] 第一粗体序列 tll1313(adm)编码序列 [0472] 第一小写字母序列 天然基因间序列 [0473] 第二粗体序列 tll1312(aar)编码序列 [0474] 第二斜体序列 kanHTK编码序列；热稳定卡纳霉素选择标记 [0475] 第二下划线序列 TS1染色体整合位点下游同源区域 [0476] 第二小写字母序列 载体骨架 [0477] [0478] [0479] [0480] [0481] [0482] SEQ ID NO: 19 [0483] 用于pJB886中转录的cI启动子。用于启动子交换的末端NotI和NdeI位点大写。 [0484] [0485] SEQ ID NO:20 [0486] 用于pJB887中转录的cpcB启动子。 [0487] [0488] SEQ ID NO:21 [0489] 用于pJB889中转录的lacI-trc启动子。用于启动子交换的末端NotI和NdeI位点大写。 [0490] [0491] SEQ ID NO:22 [0492] 用于pJB888中转录的EM7启动子。用于启动子交换的末端NotI和NdeI位点大写。 [0493] [0494] SEQ ID NO:23 [0495] pJB1279的DNA序列。 [0496] 第一下划线序列 SYNPCC7002_A0358上游同源区域 [0497] 第一斜体序列 P(nir07)启动子；该启动子是基于来自聚球藻PCC 7942的 nirA 启 动 子 的 合 成 构 建 体 (Shin-Ichi Maeda 等 (1998)J.Bacteriol., 180:4080–4088. [0498] 第二斜体序列 aadA编码序列；壮观霉素选择标记 [0499] 第二下划线序列 SYNPCC7002_A0358下游同源区域 [0500] 小写字母序列 大肠杆菌载体骨架(pUCori,kan) [0501] [0502] [0503] [0504] SEQ ID NO:24 [0505] P(nir07)启动子；该启动子是来自基于聚球藻PCC 7942的nirA启动子的合成构建体(Shin-Ichi Maeda等(1998)。cis-Acting Sequence Required for NtcB-Dependent, Nitrite-Responsive Positive Regulation of the Nitrate Assimilation Operon in the PCC 7942 J. Bacteriol.180:4080–4088。 [0506] [0507] SEQ ID NO:25 [0508] 编码蓝杆藻ATCC 51142 adm和aar基因的合成操纵子的DNA序列 [0509] 第一下 划线 序列 用 于将 操纵子 亚克 隆到pJB286alk_p中 的 EcoRI位点 [0510] 斜体序列 包含核糖体结合序列的3’UTR序列 [0511] 第一粗体序列 cce_0778(adm)编码序列 [0512] 小写字母序列 基因间序列 [0513] 第二粗体序列 cce_1430(aar)编码序列 [0514] 第二下 划线 序列 用 于将 操纵子 亚克 隆到pJB286alk_p中 的 EcoRI位点 [0515] [0516] SEQ ID NO:26 [0517] 蓝杆藻ATCC 51142 aar优化核苷酸编码序列 [0518] [0519] SEQ ID NO:27 [0520] 蓝杆藻ATCC 51142 AAR氨基酸序列 [0521] [0522] SEQ ID NO:28 [0523] 蓝杆藻ATCC 51142 adm优化核苷酸编码序列 [0524] [0525] SEQ ID NO:29 [0526] 蓝杆藻ATCC 51142 ADM氨基酸序列 [0527] [0528] SEQ ID NO:30 [0529] cce_1430蓝杆藻ATCC 51142编码序列(aar) [0530] [0531] SEQ ID NO:31 [0532] cce_0778蓝杆藻ATCC 51142编码序列(adm) [0533] |
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