光学激活的受体 |
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| 申请号 | CN201480075461.3 | 申请日 | 2014-12-12 | 公开(公告)号 | CN106103487A | 公开(公告)日 | 2016-11-09 |
| 申请人 | 奥地利科技学院; 维也纳医科大学; | 发明人 | R·里德勒; E·赖卡特; C·笛福; A·I·普列托; H·亚诺夫亚克; M·格鲁施; K·谢尔希; | ||||
| 摘要 | 本 发明 属于 生物 技术领域。更具体地，本发明涉及嵌合融合蛋白，其包括光激活 蛋白质 结构域，例如，蓝藻光敏素(PHY)CPH1的新表征的光‑ 氧 ‑ 电压 ‑传感(LOV)结构域或光敏结构域，其中嵌合融合蛋白能够在用适当 波长 的 光激发 时二聚。所述融合蛋白还包括受体酪 氨 酸激酶(RTK)的细胞内部分。本发明还涉及编码所述嵌合融合蛋白的核酸分子；表达由所述核酸分子编码的嵌合融合蛋白的非人转基因动物；以及所述嵌合融合蛋白在例如筛选方法中的用途。 | ||||||
| 权利要求 | 1.嵌合融合蛋白，其包括具有与SEQ ID NO:12(NgPA1-LOV)具有至少76％序列同一性的氨基酸序列的LOV结构域，其中当LOV结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白能够同型二聚；并且其中嵌合融合蛋白还包括受体酪氨酸激酶(RTK)的细胞内部分。 |
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| 说明书全文 | 光学激活的受体发明领域 [0001] 本发明属于生物技术领域，特别是光遗传学领域。更具体地，本发明涉及嵌合融合蛋白，其包括光激活蛋白质结构域，例如，蓝藻光敏素(PHY)CPH1的新表征的光-氧-电压-传感(LOV)结构域或光敏结构域，其中嵌合融合蛋白能够在用适当波长的光激发时二聚。所述融合蛋白可以还包括细胞表面受体的细胞内部分。本发明还涉及编码所述嵌合融合蛋白的核酸分子；表达所述核酸分子编码的嵌合融合蛋白的非人转基因动物；以及所述嵌合融合蛋白在例如筛选方法中的用途。 背景技术[0002] 在新兴的光遗传学领域中，开发光激活的蛋白质，以便以空间和时间精确性、精确的强度控制来调节高等有机体的细胞，无需在物理上使刺激与应答元件连接，条件是基质足够透明。受天然存在的蛋白质或建立光敏化学实体的启发，在活的细胞中膜电流、G-蛋白信号传导、膜募集、基因表达和蛋白质功能现在可听从于光学控制(Fenno,Yizhar等人2011,Tucker 2012)。 [0003] 细胞通过细胞表面受体的激活和细胞内多组分信号传导路径应答于细胞外信号传导分子。受体酪氨酸激酶(RTK)是一大家族感知生长因子和激素的跨膜受体，是正常和异常生理机能的关键调节物(Lemmon和Schlessinger 2010)。RTK的激活紧密调节并限制于不同的亚细胞定位、细胞类型和发育阶段，同时调节异常与人的疾病显著关联(Robertson等人,2000,Shilo 2005,Casaletto和McClatchey 2012)。RTK信号传导的这些空间和时间上的复杂性要求有提供受体激活和下游效应精确控制的新的研究方法。与其中一些在细胞和组织中的空间和时间控制通过光激活蛋白质提供的离子通道和G蛋白偶联受体相反(Szobota和Isacoff 2010,Fenno等人2011)，RTK及其相关的信号传导路径目前不能加以光学控制。而且，尽管提出了在药理学化合物的评价中可以利用光学“远程”控制的非侵入性质(Prigge等人2010,Entcheva 2013)，这一提议迄今尚未在实验上实现，就疾病相关的信号传导路径的背景而言，是非常合意的。 [0004] 在RTK激活的第一步中，细胞外配体诱导受体同型二聚体或异二聚体或者使其稳定化。二聚通过变构相互作用激活激酶结构域，上述相互作用导致反式磷酸化，并将信号传播至细胞内多组分路径(Lemmon和Schlessinger 2010,Simi和Ibanez 2010)。使用二价抗体、交联突变和化学官能化，经显示二聚足以不依赖于配体地激活若干RTK(Spaargaren等人1991,Burke和Stern 1998,Muthuswamy等人1999,Welm等人2002)。尽管受体二聚在RTK和其他受体家族中是常见的分子激活机制(Cochran等人2001)，目前尚没有选择性的和空间-时间上精确的受体二聚控制方法。 [0005] Wend等人(2013)公开了涉及MAP-激酶路径的蛋白质激酶C-RAF或B-RAF的嵌合融合蛋白，以及蛋白质隐花色素相互作用碱性-螺旋-回环-螺旋1(CIBN)或蛋白质隐花色素2(CRY2)的N-端区域。蛋白质在用蓝光激发时二聚。 [0006] WO 2012/116621公开了光学控制的基因表达系统。 [0007] WO 2009/151948描述了与光敏素结构域融合的所关注的第一蛋白质和与光敏素结构域相互作用肽融合的所关注的第二蛋白质的组合。两种蛋白质均在用红光激发时二聚。 [0008] WO 2010/006049、WO 2008/089003、WO 2008/086470、WO 2007/024391和US 2010/0234273公开了光激活的离子通道。 [0009] WO 2013/003557和WO 2009/148946公开了光激活的G蛋白偶联受体视紫红质和其他家族的G蛋白偶联蛋白的融合蛋白。 [0010] WO 1999/036553公开了可以通过化学配体二聚的多聚嵌合蛋白。US 2009/0233364描述了可以使用亮氨酸拉链二聚的路径效应器。 [0011] GenBank条目NGA_0015702(Uniprot序列K8Z861)公开了来自Nannochloropsis gaditana的未表征假设蛋白质。Uniprot序列C5NSW6公开了来自Ochromonas danica的推定aureochrome1样蛋白质。 [0012] Huang等人(2013)描述了来自Nanochloropsis gaditana的全长aureochrome 1的克隆及其在酿酒酵母中的表达。 [0013] Strauss等人(2005)提出，集胞藻PCC6803的蓝藻光敏素(PHY)CPH1(SyCP1-PHY)在效应器结构域调节中发挥重要作用。 [0014] US 2013/0116165和 等人Photochem.Photobiol.Sci.9:1286-1300(2010)描述了光敏蛋白质燕麦(Avena sativa)LOV结构域(AsLOV)、AsLOV-cp和Vivid。 Pathak等人Biol.Cell 105:59-72(2013)和Müller&Weber,Mol.Biosyst.9:596-608(2013)讨论了一般的LOV结构域，特别是包括AsLOV-结构域的融合蛋白。Schmidt等人Nature Communications,DOI:10.1038/ncomms4019(August 2013)描述了AsLOV与Kv通道特异性肽毒素的融合，其可以用于调节细胞K+电流。AsLOV、AsLOV-cp和Vivid分别表现出与NgPA1-LOV 42％或更低的序列同一性，与OdPA1-LOV和VfAU1-LOV 43％或更低的序列同一性，以及与SyCP1-PHY 13％或更低的序列同一性。 [0015] WO 2013/074911公开了光反应性DNA结合蛋白质，其包括源自E.litoralis 222的LOV结构域(EL222-LOV)以及与转录激活结构域可操作连接的DNA结合结构域。EL222-LOV表现出与NgPA1-LOV、OdPA1-LOV和VfAU1-LOV 34％或更低的序列同一性，以及与SyCP1-PHY 10％或更低的序列同一性。 [0016] Stroh等人Stem Cells 29:78-88(2011)描述了使用光诱导型离子通道紫红质通道蛋白2(channelrhodopsin-2)进行的胚胎干细胞自动化光遗传刺激。这些跨膜离子通道蛋白质距离LOV结构域非常远，它们在用光激发时不会二聚，并且具有完全不同的作用机制。 [0017] WO 2013/133643公开了受体酪氨酸激酶和光敏蛋白质C-端的融合蛋白，例如CIB(隐花色素相互作用碱性-螺旋-回环-螺旋蛋白质)、CIBN(CIB的N-端结构域)、Phy(光敏素)、PIF(光敏素相互作用因子)、FKF1(黄素结合，Kelch重复，F-box 1)GIGANTEA、CRY(隐花色素)、PHR(phytolyase同源区)。尽管名称相似，蛋白质序列存在显著差异。下表显示了光敏蛋白质的序列同一性(％)。 [0018] [0019] 实验功能和性能方面也存在差异。WO 2013/133643中提及的光敏结构域无一可以用于RTK的同型二聚。CRY及其更短的形式PHR不产生受体双联体，但当它们同型低聚时产生受体多联体。同型低聚比同型二聚“较不可控”，因为同型二聚体具有确定的结构(双联体)，而低聚体可以具有许多不同的可能组成(多联体)。CIBN与CRY2异二聚，PIF1-6与PHYA或PHYB异二聚，FKF1与Gigantea异二聚。异二聚体技术上的劣势在于其表达需要两种基因，这在大多数设定中非常难以实现。此外，在对应于WO 2013/133643的出版物中(Kim等人Chem Biol.21:903-912(2014))，在“活细胞成像和光激活(Live Cell Imgaing and Photoactivation)”部分中陈述，所提及的光敏结构域要求的激活强度为1.30-64.94mW/cm2。最后，WO 2013/133643完全没有提及可以被红光激活的光敏结构域。 [0020] US 2006/0110827描述了SyCP1-PHY结构域及其突变体；其没有解决光诱导的二聚，而是不同的物理现象(荧光)。 [0021] 本领域对于能够在空间和时间上控制细胞中信号传导的工具存在需求。具体地，需要有新的光遗传工具，其使得能够有新的光可控应用。 发明内容[0022] 发明人推论，改造到RTK中的光激活的蛋白质-蛋白质相互作用可以模拟配体诱导的二聚，并最终导致受体激活。在一实施方式中，发明人选择属于大光-氧-电压-传感(LOV)结构域超家族的蓝光敏感蛋白质结构域作为用于RTK光激活二聚的候选物。光敏LOV结构域与作为辅基的黄素结合，并在细菌、真菌和植物中起到可逆光开关的作用。含有LOV结构域的光受体功能性地控制异源效应器结构域，例如丝氨酸/苏氨酸激酶(例如，在开花植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Kinoshita等人2001)或绿藻莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)(Huang等人2002)中)或者转录调节物(例如，在真菌粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(Heintzen等人2001)中或者在黄绿藻Vaucheria frigida中(Takahashi等人2007))。经提出，LOV结构域的二聚在效应器结构域调节中发挥重要作用，并且LOV结构域在其二聚界面和相互作用寿命方面表现出显著多样性(Zoltowski和Gardner 2011)。 [0023] 而且，发明人将该工作扩展至被红光(～660nm)激活并被远红光(～750nm)失活的其他融合蛋白。具体地，发明人识别出响应于红光经历同型二聚的蛋白质结构域(集胞藻PCC6803的蓝藻光敏素(PHY)CPH1(SyCP1-PHY)的光敏结构域)，并将该结构域并入到RTK融合蛋白中。红光比蓝光穿透动物组织更深；因此，其可以在外部应用。这种新的工具对于发育和疾病动物模型中的光遗传应用来说特别富有吸引力。远程控制特定蛋白质在体内激活和失活的能力对于理解生物过程提供了前所未有的深入理解。 [0024] 本发明的融合蛋白具有高度的光敏性。用NgPA1-LOV、OdPA1-LOV和VfAU1-LOV激活已经可以用0.25mW/cm2的蓝光实现，而用SyCP1-PHY激活甚至已经用5.8μW/cm2＝0.0058mW/cm2的红光实现。 [0025] 发明人改造了整体上遗传编码并且能够在空间和时间上控制人疾病细胞模型中信号传导的光激活受体酪氨酸激酶，并且在实验上实现了疾病相关的信号传导过程中药理学化合物的全光学评价。 [0026] 因此，公开了嵌合融合蛋白，其包括具有与SEQ ID NO:12(NgPA1-LOV)具有至少76％序列同一性的氨基酸序列的LOV结构域，其中当LOV结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白能够二聚。所述嵌合融合蛋白进一步的实施方式如下文所述，并在权利要求中定义。 [0027] 进一步公开了嵌合融合蛋白，其包括具有与SEQ ID NO:14(OdPA1-LOV)具有至少74％序列同一性的氨基酸序列的LOV结构域，其中当LOV结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白能够二聚。所述嵌合融合蛋白进一步的实施方式如下文所述，并在权利要求中定义。 [0028] 另外公开了嵌合融合蛋白，其包括与发色团功能性连接的、具有在全长上与SEQ ID NO:64(SyCP1-PHY)具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的光敏结构域，其中当光敏结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白能够二聚。 [0029] 本公开内容还涉及编码如本文所述并如权利要求所定义的嵌合融合蛋白的核酸分子。 [0030] 本公开内容还涉及非人转基因动物，其表达由所述核酸分子编码的嵌合融合蛋白。 [0031] 本发明进一步涉及筛选方法，其包括以下步骤： [0032] a)提供表达嵌合融合蛋白的细胞，上述嵌合融合蛋白包括： [0033] LOV结构域，其具有在选自SEQ ID NO:12(NgPA1-LOV)、SEQ ID NO:14(OdPA1-LOV)和SEQ ID NO:10(VfAU1-LOV)的氨基酸序列全长上具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，和 [0034] 细胞表面受体的细胞内部分； [0035] 其中当LOV结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白能够二聚，从而经由所述细胞表面受体的所述细胞内部分触发细胞应答； [0036] b)使所述细胞与候选活性剂接触； [0037] c)使所述细胞暴露于所述适当波长的光；和 [0038] d)确定所述候选活性剂是否能够影响步骤c)中触发的所述细胞应答。 [0039] 另外描述了筛选方法，其包括以下步骤： [0040] a)提供表达嵌合融合蛋白的细胞，上述嵌合融合蛋白包括： [0041] 与发色团功能性连接的、具有在全长上与SEQ ID NO:64(SyCP1-PHY)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的光敏结构域，和 [0042] 细胞表面受体的细胞内部分； [0043] 其中当光敏结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白能够二聚，从而经由所述细胞表面受体的所述细胞内部分触发细胞应答； [0044] b)使所述细胞与候选活性剂接触； [0045] c)使所述细胞暴露于所述适当波长的光；和 [0046] d)确定所述候选活性剂是否能够影响步骤c)中触发的所述细胞应答。 [0047] 下文和权利要求中提供了所述筛选方法的进一步细节和实施方式。 [0048] 此外，本公开内容提供了本文所述的嵌合融合蛋白的用途。例如，本文公开的嵌合融合蛋白可以用作研究工具，优选地用于表征孤儿受体。另外可选地，本文公开的嵌合融合蛋白可以用于筛选方法中，优选地，其中筛选方法使用光作为所述嵌合融合蛋白的激活物，并且用于所述筛选方法的读出。本文公开的嵌合融合蛋白还可以用于产生图式化细胞培养物，或者其可以用于控制所关注的生物产品的制造。 [0049] 进一步公开了本文公开的嵌合融合蛋白的非治疗用途，例如，用于控制细胞生长或者用于控制生长因子路径，优选地，其中所述嵌合融合蛋白在体外使用。本文公开的嵌合融合蛋白的另一非治疗用途在于干细胞的分化，其中干细胞不使用涉及修改人种系遗传同一性或者涉及使用人胚胎用于工业或商业目的的方法产生，优选地所述嵌合融合蛋白在体外使用。 [0050] 以上用途和非治疗用途同样不限于本文公开的嵌合融合蛋白本身。因此，本公开内容还公开了本文公开的核酸分子作为研究工具的用途，优选地用于表征孤儿受体。类似地，公开了本文公开的核酸分子在筛选方法中的用途，优选地，其中筛选方法使用光作为所述嵌合融合蛋白的激活物，并用于所述筛选方法的读出。 [0051] 最后，还公开了本文所述的非人转基因动物作为研究工具的用途，优选地用于表征孤儿受体，以及本文所述的非人转基因动物在筛选方法中的用途。 [0052] 在详述和所附权利要求中说明了进一步的细节和优选实施方式。 [0053] 优选实施方式详述 [0054] 光-氧-电压-传感(LOV)结构域是许多种高级植物、微藻类、真菌和细菌使用的环境条件传感器。作为常见的特征，所有LOV蛋白质均包括蓝光敏感性黄素单核苷酸发色团，其在发信号状态下经由相邻的半胱氨酸与蛋白质核心共价连接。例如，LOV结构域在蓝光敏感性蛋白质复合物中发现，调节许多种生物过程。 [0055] 公开了嵌合融合蛋白，其包括具有与SEQ ID NO:12(N.gaditana假想蛋白质NGA_0015702，Uniprot序列K8Z861的残基87-228(NgPA1-LOV))具有至少76％序列同一性的氨基酸序列的LOV结构域，其中当LOV结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白能够二聚。 [0056] 优选地，所述融合蛋白的LOV结构域具有在SEQ ID NO:12(NgPA1-LOV)的氨基酸序列的全长上具有至少78％，更优选80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，最优选100％序列同一性的氨基酸序列。 [0057] 进一步公开了嵌合融合蛋白，其包括具有与SEQ ID NO:14(O.danica aureochrome1样蛋白质，Uniprot序列C5NSW6的残基180-312(OdPA1-LOV))具有至少74％序列同一性的氨基酸序列的LOV结构域，其中当LOV结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白能够二聚。 [0058] 优选地，所述的另外的融合蛋白的LOV结构域具有在SEQ ID NO:14(OdPA1-LOV)的氨基酸序列的全长上具有至少75％，更优选至少76％，更优选78％，更优选80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，最优选100％序列同一性的氨基酸序列。 [0059] 另外公开了一种嵌合融合蛋白，其包括与发色团功能性连接的、具有在全长上与SEQ ID NO:64(SyCP1-PHY)具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的光敏PHY结构域，其中当光敏结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白能够二聚。优选地，光敏结构域具有在全长上与SEQ ID NO:64(SyCP1-PHY)的氨基酸序列具有至少78％，更优选80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少 98％，更优选至少99％，最优选100％序列同一性的氨基酸序列。 [0060] 如本文所用，如果所讨论的序列与所述SEQ ID NO:Y对比，并且其与对比序列之间在SEQ ID NO:Y全长上的序列同一性为至少X％，则称氨基酸序列在序列全长上“与SEQ ID NO:Y具有X％序列同一性”。氨基酸序列的对比可以使用可公开获取的计算机同源性程序进行，例如，“BLAST”程序“blastp”，其于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi在NCBI主页上提供，使用在此提供的默认设定。例如通过手工记数确定相同的残基，随后通过以在SEQ ID NO:Y所示长度上的相同数相除计算百分比同一性(PID)，给出“X％序列性同一性”。如果未特别指出特定长度，序列同一性在SEQ ID NO:Y的整个/全长上计算。计算成组多肽的序列同一性百分比的另外可选的方法是本领域已知的。在优选的实施方式中，导致与SEQ ID NO:Y的同一性至少X％的氨基酸序列变化例如(一个或多个)置换、(一个或多个)插入或(一个或多个)缺失是性质上不重要的。更具体地，不同于SEQ ID NO:Y的氨基酸序列优选地包括一个或多个半保守、更优选保守氨基酸置换或其组合。给定的氨基酸残基的半保守和保守置换在下表中提供。 [0061] [0062] [0063] 如果新的半胱氨酸保持是游离硫醇，将A、F、H、I、L、M、P、V、W或Y用C置换是半保守的。如果新侧基的离子顶端可以达到蛋白质表面，同时亚甲基作疏水接触，将M置换成E、R或K是半保守的。如果侧基位于蛋白质表面上，将P用K、R、E或D之一置换是半保守的。而且，将会理解到，空间有要求的位置上的甘氨酸不能被置换，并且P不应当引入到α-螺旋或β折叠结构中。对于LOV结构域的结构和活性来说至关重要并且因此不作为置换对象的残基可以通过本领域公知的方法识别，例如，丙氨酸扫描诱变。 [0064] 如本文所用，术语“嵌合融合蛋白”是要指融合蛋白是基因改造的融合蛋白，其反之在自然界中不存在。融合蛋白可以源自，并因此由至少两种不同的亲本蛋白质组成。但是，融合蛋白也可以源自两种以上的亲本蛋白质，例如，3、4、5或者甚至6种不同的亲本蛋白质。亲本蛋白质可以是彼此天然的，但是优选地，所述亲本蛋白质是彼此外来的，即，它们天然地在不同物种中出现。融合蛋白通过将一个亲本蛋白质的编码区(或者编码所述亲本蛋白质的结构域或截短形式的部分)在框内与另一亲本蛋白质的编码区(或者编码所述另一亲本蛋白质的结构域或截短形式的部分)融合产生。但是，也考虑融合蛋白包括以自然界中不存在的方式融合的相同蛋白质的两个或更多个结构域。 [0065] PHY结构域的发色团是线性四吡咯——具有不同取代基的在线性分子中连接在一起的四个吡咯。优选地，线性四吡咯是天然存在的线性四吡咯，例如，选自以下的线性四吡咯：藻青素、藻红素、藻尿胆素、藻紫胆素、phytochromobilin、胆绿素、胆红素、中胆绿素、中胆红素、胆色烷、后胆色素、尿胆素、粪胆素和尿胆素原。最优选地，发色团是藻青素。 [0066] 在用适当波长的光激发时，LOV结构域和由此融合蛋白将会二聚。LOV结构域通常可由蓝光激发，即，可由波长范围350-500nm、优选范围400-500nm、更优选范围大约420nm至大约490nm的光激发。但是，本公开内容还可以包括LOV结构域，其已突变以改变激发所述结构域必需的光的波长。但是，技术人员将会知晓激发LOV结构域适当的波长，或者将很容易通过常规方法确定激发LOV结构域使用何种光。 [0067] 本文公开的嵌合融合蛋白的LOV结构域是相当光敏性的。在优选的实施方式中，LOV结构域能够以5μW/mm2的光、优选4μW/mm2的光、更优选3μW/mm2的光、最优选2.5μW/mm2的光激活。可以进一步说明，本文公开的LOV结构域也能够以2.0μW/mm2、1.5μW/mm2、1.0μW/2 2 2 mm、0.5μW/mm和0.3μW/mm的光激活。 [0068] 类似地，在用适当波长的光激发光敏PHY结构域时，并由此融合蛋白将会二聚，优选同型二聚。与LOV结构域相反，PHY结构域可被红光激发，即，被波长范围600-690nm、优选610-680nm、更优选范围620-670nm、最优选范围630-660nm的光激发，例如，由波长大约 650nm的光激发。此外，光敏PHY结构域可以由波长范围700-750nm、优选710-740nm、更优选 720-730nm的光失活。光敏PHY结构域比LOV结构域的光敏性更高。出于该目的，光敏结构域能够以0.5μW/mm2的光、优选0.4μW/mm2的光、更优选0.3μW/mm2的光、最优选0.25μW/mm2的光例如以0.2μW/mm2、0.15μW/mm2、0.1μW/mm2、0.05μW/mm2和0.03μW/mm2的光激活。 [0069] 融合蛋白是否能够二聚可以使用本领域已知的适当测定来检验。测定的选择将取决于LOV结构域或PHY结构域的融合配偶体。在已知的在二聚时引发其效应器功能的效应器蛋白质的情形中，例如酪氨酸激酶受体，二聚能力可以通过确定下游信号传导分子的激活检验。这一点可以使用本领域已知的方法实现，例如确定信号传导分子的功能状态，例如，通过使用针对磷酸酪氨酸的抗体。另外可选地，也可以确定引发的信号传导的特异性最终效果本身，即细胞应答，例如，细胞周期分布的变化，细胞转录谱的变化，特定蛋白质在细胞中的定位和分布，细胞表型例如细胞形状的变化，细胞在表面上或在三维结构中分布的变化，细胞代谢活性的变化；通过确定细胞存活或死亡的百分含量，通过确定细胞的分化状态和/或通过确定细胞代谢物的组成变化。用于确定这些效应器功能的测定将在下文中进一步说明。另外可选地，还可以设计报道基因构建物，所述报道基因在嵌合融合蛋白二聚时得以表达。如果融合配偶体尚未表征，可以与模拟转染的对照细胞相比较确定表达本文所述的嵌合融合蛋白的细胞的表型变化，或者可以使用不依赖于融合配偶体的确定二聚的技术，例如，荧光共振能量转移(FRET)，或者本领域已知的任何其他适当方法。FRET是描述两种荧光发色团之间能量转移的机制。供体发色团可以在其激发态下将能量转移至受体发色团。该能量转移的效率与供体和受体之间的距离成反比，使得FRET对于小的距离极为敏感。因此，技术人员将很容易认识到确定嵌合融合蛋白是否能够二聚的合适方法。但是，表达法“在激发时能够二聚”也要指不排除先前激发的组成型二聚。 [0070] 在优选的实施方式中，嵌合融合蛋白还包括受体酪氨酸激酶(RTK)的细胞内部分。RTK是许多多肽生长因子、细胞因子和激素的高亲和力细胞表面受体。已经显示，RTK是正常细胞过程的关键调节物，并且在许多类型的癌症的发展和进展中发挥重要作用。每个RTK单体均具有由25-38个氨基酸残基组成的单个疏水性跨膜结构域、细胞内C-端区和细胞外N-端区。在更优选的实施方式中，嵌合融合蛋白可以还包括所述RTK的跨膜结构域，这使得融合蛋白可以并入到细胞膜中。技术人员可以很容易地从RTK的氨基酸序列确认跨膜结构域。 [0071] 细胞外N-端区主要含有配体结合位点，其结合细胞外配体，例如激素或生长因子。细胞内C-端区表现出水平最高的保守性，并包括负责信号传导活性的催化结构域。细胞外配体结合通常将会造成受体二聚或使其稳定化，并导致其特定底物例如MAP激酶信号传导路径成员的受体自磷酸化和/或酪氨酸磷酸化。 [0072] 关于包括LOV结构域的嵌合融合蛋白，酪氨酸激酶优选地是选自以下的RTK：EGF受体(例如EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3或ErbB4)、FGF受体、RET受体、胰岛素受体、PDGF受体、VEGF受体、HGF受体、Trk受体、Eph受体、AXL受体、LTK受体、TIE受体、ROR受体、DDR受体、KLG受体、RYK受体和MuSK受体，更优选地，选自EGF受体、FGF受体和RET受体，最优选地选自EGFR、FGFR1和RET。 [0073] 如果融合蛋白包括PHY结构域，酪氨酸激酶优选为选自以下的RTK：FGF受体、Trk受体、EGF受体(例如EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3或ErbB4)、RET受体、胰岛素受体、PDGF受体、VEGF受体、HGF受体、Eph受体、AXL受体、LTK受体、TIE受体、ROR受体、DDR受体、KLG受体、RYK受体和MuSK受体，更优选地选自FGF受体、Trk受体，更优选地选自FGFR1和TrkB。 [0074] 在最优选的实施方式中，融合蛋白是redOpto-mFGFR1(SEQ ID NO:66)或redOpto-rtrkB(SEQ ID NO:67)，特别如下文进一步说明。redOpto-mFGFR1和redOpto-rtrkB例示了一类高价值的光遗传学工具，因为与蓝光相比红光提供了显著提高的组织穿透性。例如，5mm厚的骨/颅骨透过～2％的蓝光(460nm)，但透过～10％的红光(640nm)(Wan,Parrish等人1981)。或者，1cm厚的肌肉组织透过～20％的蓝光，但透过～80％的红光(Marquez,Wang等人1998)。因此，受红光控制的RTK能够非侵入性地激活细胞中的MAPK信号传导路径。 [0075] 值得注意的是，含有PHY-和LOV结构域的组合的受体家族能够用双色激活进行试验。因此，包括不同的光敏结构域(LOV和PHY结构域)的嵌合融合蛋白可以在本文公开的所有用途和方法中组合。 [0076] 这些RTK的序列、细胞内部分和跨膜结构域均在公开的序列数据库中公开，并且是本领域公知的，并且很容易使用本领域的常规方法确定。因此，本文公开的嵌合融合蛋白使得可以触发任何不依赖于其配体在二聚时被激活的受体。因此，本文公开的嵌合融合蛋白是非常有价值的研究工具，例如，其使得可以对所谓的孤儿受体进行表征。因此，在另一优选的实施方式中，嵌合融合蛋白包括孤儿受体的细胞内部分。 [0077] 另外公开了在此公开的嵌合融合蛋白，其中嵌合融合蛋白是转录因子，其还包括DNA-结合结构域和转录调节结构域，二聚形式的该转录因子能够促进或抑制包括功能性连接的所述DNA-结合结构域的识别序列的目标基因的转录。DNA-结合结构域识别并附着于与其调节的基因相邻的DNA的特定序列。取决于转录调节结构域，转录因子可以是基因转录的激活物或抑制物。转录因子使用许多种机制调节基因表达。这些机制包括阻断或稳定RNA聚合物与DNA的结合、组蛋白的乙酰化或脱乙酰化，或者通过招募辅激活物或辅抑制物蛋白质至启动子或增强子区域。 [0078] 在优选的实施方式中，LOV结构域或PHY结构域位于其融合配偶体的C-端。在另一优选的实施方式中，LOV结构域或PHY结构域位于融合蛋白的C-端或N-端，更优选地，LOV结构域或PHY结构域位于融合蛋白的C-端。 [0079] 嵌合融合蛋白可以还包括荧光蛋白质，其使得可以确定嵌合融合蛋白是否在细胞中表达，以及其在所述细胞中的定位。本文使用的优选的荧光蛋白质为GFP、EGFP、mCherry或mVenus。但是，可以使用任何适合于本文公开的嵌合融合蛋白的荧光蛋白质。在FRET的背景下，可以使用荧光蛋白质确定嵌合融合蛋白质是否能够在用适当波长的光激发时二聚，如本文别处所述。 [0080] 在优选的实施方式中，当LOV结构域或PHY结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白同型二聚。但是，也考虑提供两种不相同的本文公开的融合蛋白，其在用适当波长的光激发时经由其(优选相同)LOV结构域或PHY结构域异二聚。 [0081] 还公开了编码本文公开并且在权利要求中定义的嵌合融合蛋白的核酸分子。 [0082] 本文所用的术语“核酸分子”是本领域已知的，可以指DNA、RNA、cDNA或其杂交体或者其任意修饰。本文所述的核酸分子包括的核酸残基可以是天然的核酸残基或人工产生的核酸残基，例如腺嘌呤(A)、尿嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、黄嘌呤(X)和次黄嘌呤(HX)。取决于多核苷酸各自的类型，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可互换地使用，因为DNA中的胸腺嘧啶(T)对应于转录的mRNA中的尿嘧啶(U)。本文所述并提供的核酸分子可以是单链或双链的，线性或环状的，天然的或合成的，并不受任何尺寸限制。核酸分子可以还包括功能连接的转录调节序列，例如启动子、转录和翻译起始和终止信号。在一具体实施方式中，核酸分子可以是载体的形式。如本文所用，术语“载体”具体是指基因工程中常用的质粒、粘粒、病毒、噬菌体、转座子和其他载体。在优选的实施方式中，载体适合于细胞的转化，如微生物细胞，例如真菌细胞、酵母细胞或原核细胞。载体可以适合于真核细胞的稳定转化，以表达本文公开的嵌合融合蛋白。更优选地，公开的载体是本领域通常知晓的表达载体。优选地，核酸分子或载体包括选择标记物，其使得可以选择用核酸分子或载体转化的细胞。核酸分子或载体还可以包括整合元件，这使得可以将核酸分子或载体整合到宿主细胞的基因组中，例如，通过使用同源重组。额外地或者另外可选地，核酸分子或载体还可以包括复制起源，其使得核酸分子在细胞中保持而无需整合到宿主细胞的基因组中。与核酸分子结合使用的其他有利或必需的工具及其连接方法是本领域通常知晓的。在一优选的实施方式中，核酸分子包括SEQ ID NO:54的核酸序列，更优选由其组成。在另一优选的实施方式中，核酸分子包括SEQ ID NO:55的核酸序列，更优选由其组成。在再另一优选的实施方式中，核酸分子包括SEQ ID NO:65(SyCP1-PHY)的核酸序列，更优选地，核酸分子包括SEQ ID NO:68(redOpto-mFGFR1)或SEQ ID NO:69(redOpto-rtrkB)的核酸序列。在最优选的实施方式中，核酸分子由SEQ ID NO:68(redOpto-mFGFR1)或SEQ ID NO:69(redOpto-rtrkB)的核酸序列组成。 [0083] 在该背景中，本公开内容还提供细胞，例如分离的细胞，或者分离的组织内的细胞，其表达本文公开的嵌合融合蛋白和/或其包括本文所述的核酸分子。宿主细胞可以是原核或真核细胞，其包括核酸分子或载体或细胞，其源自这样的细胞并含有本文公开的核酸分子或载体。在优选实施方式中，宿主细胞包括，即，以含有整合到基因组中的核酸分子的方式用核酸分子或载体修饰。宿主细胞可以是细菌、酵母、真菌或真核细胞，例如哺乳动物细胞或昆虫细胞。宿主细胞用本文公开的核酸分子或载体转化或基因工程改造可以通过本领域已知的标准方法进行。 [0084] 而且，公开了一种非人转基因动物，其表达本文公开和/或由本文公开的核酸分子编码表达的嵌合融合蛋白。“转基因非人动物”可以是人以外的任意动物。在优选的实施方式中，转基因非人动物是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选啮齿类动物，例如小鼠或大鼠；或者非人灵长类动物，即，不是人属成员的灵长类动物，例如猕猴、黑猩猩、狒狒、狨猴和绿长尾猴。术语“非人转基因动物”包括公知的模型生物有机体，其包括，但不限于，豚鼠(Cavia porcellus)、仓鼠、小鼠(Mus musculus)和大鼠(Rattus norvegicus)、刚毛锦花鼠(Sigmodon hispidus)、犬(Canis lupus familiaris)、猫(Felis cattus)、鸡(Gallus gallus domesticus)、斑胸草雀(Taeniopygia guttata)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、青鳉(Oryzias latipes)、河豚鱼(Takifugu rubripres)、七鳃鳗、斑马鱼(Danio rerio)、秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)、Arbacia punctulata、玻璃海鞘(Ciona intestinalis)、果蝇(Drosophila)例如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、夏威夷短尾鱿鱼(Euprymna scolopes)、水螅(Hydra)、皮氏枪乌贼(Loligo pealei)、Pristionchus pacificus、紫球海胆(Strongylocentrotus purpuratus)、Symsagittifera roscoffensis和赤拟谷盗(Tribolium castaneum)。转基因非人动物对于核酸分子可以是杂合的，但在优选的实施方式中，转基因非人动物对于核酸分子是纯合的。注意到，以下动物排除在外：其没有可能对人或动物产生实质上的益处，并且因此根据相关专利法或司法不是专利对象。 技术人员将去采取适当措施，例如，如动物福利国际指导中所主张，保证对人或动物实质上的益处将超过任何动物的痛苦。 [0085] 本文所述的嵌合融合蛋白特别可用于筛选方法。例如，它们使得可以对新的受体进行表征，消除对昂贵配体的需要，并允许在空间和时间上控制受体信号传导。 [0086] 因此，本公开内容还提供筛选方法，其包括以下步骤： [0087] a)提供表达嵌合融合蛋白的细胞，上述嵌合融合蛋白包括： [0088] 具有在选自SEQ ID NO:12(NgPA1-LOV)、SEQ ID NO:14(OdPA1-LOV)和SEQ ID NO:10(VfAU1-LOV)的氨基酸序列全长上具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的LOV结构域，和 [0089] 细胞表面受体的细胞内部分； [0090] 其中当LOV结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白能够二聚，从而经由所述细胞表面受体的所述细胞内部分触发细胞应答； [0091] b)使所述细胞与候选活性剂接触； [0092] c)使所述细胞暴露于所述适当波长的光；和 [0093] d)确定所述候选活性剂是否能够影响步骤c)中触发的所述细胞应答。 [0094] 类似地，提供筛选方法，其包括以下步骤： [0095] a)提供表达嵌合融合蛋白的细胞，上述嵌合融合蛋白包括： [0096] 与发色团功能性连接的、具有在全长上与SEQ ID NO:64(SyCP1-PHY)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的光敏结构域，和 [0097] 细胞表面受体的细胞内部分； [0098] 其中当光敏结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白能够二聚，从而经由所述细胞表面受体的所述细胞内部分触发细胞应答； [0099] b)使所述细胞与候选活性剂接触； [0100] c)使所述细胞暴露于所述适当波长的光；和 [0101] d)确定所述候选活性剂是否能够影响步骤c)中触发的所述细胞应答。 [0102] 上述筛选方法的嵌合融合蛋白可以进一步如前文所述加以定义。因此，在优选的实施方式中，嵌合融合蛋白包括具有在全长上与SEQ ID NO:12(NgPA1-LOV)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的LOV结构域。在更优选的实施方式中，LOV结构域具有在SEQ ID NO:12(NgPA1-LOV)的氨基酸序列的全长上具有至少73％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，最优选100％序列同一性的氨基酸序列。 [0103] 在另一优选实施方式中，嵌合融合蛋白包括具有在全长上与SEQ ID NO:14(OdPA1-LOV)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的LOV结构域。 [0104] 在更优选的实施方式中，LOV结构域具有在SEQ ID NO:14(OdPA1-LOV)的氨基酸序列的全长上具有至少73％，优选至少75％，更优选80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，最优选100％序列同一性的氨基酸序列。 [0105] 在再另一优选实施方式中，嵌合融合蛋白包括具有在全长上与SEQ ID NO:10(VfAU1-LOV)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的LOV结构域。在更优选的实施方式中，LOV结构域具有在氨基酸序列SEQ ID NO:10(VfAU1-LOV)的氨基酸序列的全长上具有至少73％，优选至少75％，更优选80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，最优选100％序列同一性的氨基酸序列。 [0106] 在另一优选的实施方式中，光敏结构域具有在全长上与SEQ ID NO:64(SyCP1-PHY)的氨基酸序列具有至少73％，优选至少75％，更优选80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，最优选100％序列同一性的氨基酸序列，和/或发色团是线性四吡咯，优选地选自藻青素、藻红素、藻尿胆素、藻紫胆素、phytochromobilin、胆绿素、胆红素、中胆绿素、中胆红素、胆色烷、后胆色素、尿胆素、粪胆素和尿胆素原，最优选地，其中发色团是藻青素。 [0107] 在优选的实施方式中，当LOV结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白同型二聚。但是，也设想到提供两种不相同的本文提供的融合蛋白质，其在用释当波长的光激发时经由其(优选相同的)LOV结构域异二聚。 [0108] 优选地，LOV结构域可被蓝光激发，即，波长范围350-500nm、优选范围400-500nm、更优选范围大约420nm至大约490nm的光。但是，本公开内容还可以包括以下LOV结构域，其已经过突变，以改变激发所述结构域必需的光的波长。而且，LOV结构域优选地能够以5μW/2 2 2 2 mm的光、优选4μW/mm的光、更优选3μW/mm的光、最优选2.5μW/mm的光激活。可以进一步表明，本文公开的LOV结构域也能够以2.0μW/mm2、1.5μW/mm2、1.0μW/mm2、0.5μW/mm2和0.3μW/mm2的光激活。 [0109] 如上所述，PHY结构域可被红光激发，即，被波长范围600-690nm、优选610-680nm、更优选范围620-670nm、最优选范围630-660nm的光激发，例如，被波长大约650nm的光激发。此外，光敏PHY结构域可以被波长范围700-750nm、优选710-740nm、更优选720-730nm的光失活。光敏PHY结构域能够以0.5μW/mm2的光、优选0.4μW/mm2的光、更优选0.3μW/mm2的光、最优选0.25μW/mm2的光例如以0.2μW/mm2、0.15μW/mm2、0.1μW/mm2、0.05μW/mm2和0.03μW/mm2的光激活。 [0110] 在优选的实施方式中，LOV结构域或PHY结构域位于其融合配偶体的C-端。在另一优选的实施方式中，LOV结构域或PHY结构域位于融合蛋白的C-端或N-端。在最优选的实施方式中，LOV结构域或PHY结构域位于嵌合融合蛋白的C-端。 [0111] 在筛选方法的优选的实施方式中，受体的所述细胞内部分是受体酪氨酸激酶(RTK)的细胞内部分，如上文所进一步说明。所述融合蛋白可以优选地包括所述RTK的跨膜结构域。如上文关于LOV结构域所述，合适的RTK的例子是EGF受体(例如EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3或ErbB4)、FGF受体、胰岛素受体、PDGF受体、VEGF受体、HGF受体、Trk受体、Eph受体、AXL受体、LTK受体、TIE受体、ROR受体、DDR受体、RET受体、KLG受体、RYK受体和MuSK受体。在优选的实施方式中，嵌合融合蛋白包括EGF受体、FGF受体活RET受体的细胞内部分。在更优选的实施方式中，嵌合融合蛋白包括EGFR、FGFR1或RET的细胞内部分。在最优选的实施方式中，嵌合融合蛋白包括SEQ ID NO:58(mFGFR1-VfAU1-LOV)、SEQ ID NO:59(p75-hEGFR-VfAU1-LOV)或SEQ ID NO:60(hRET-VfAU1-LOV)。仍在最优选的实施方式中，嵌合融合蛋白由SEQ ID NO:58(mFGFR1-VfAU1-LOV)、SEQ ID NO:59(p75-hEGFR-VfAU1-LOV)或SEQ ID NO:60(hRET-VfAU1-LOV)组成。 [0112] 如果融合蛋白包括PHY结构域，酪氨酸激酶优选是选自以下的RTK：FGF受体、Trk受体、EGF受体(例如EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3或ErbB4)、RET受体、胰岛素受体、PDGF受体、VEGF受体、HGF受体、Eph受体、AXL受体、LTK受体、TIE受体、ROR受体、DDR受体、KLG受体、RYK受体和MuSK受体，更优选地选自FGF受体、Trk受体，再更优选地选自FGFR1和TrkB。在最优选的实施方式中，融合蛋白在redOpto-mFGFR1(SEQ ID NO:66)的氨基酸序列的全长上具有至少70％、更优选至少73％、优选至少75％、更优选80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％，最优选100％序列同一性。在另一最优选的实施方式中，融合蛋白在redOpto-rtrkB(SEQ ID NO:67)的氨基酸序列的全长上具有至少70％、更优选至少73％、优选至少75％、更优选80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少 97％、更优选至少98％、更优选至少99％，最优选100％序列同一性。仍在最优选的实施方式中，融合蛋白由redOpto-mFGFR1(SEQ ID NO:66)组成。仍在另一最优选的实施方式中，融合蛋白由redOpto-rtrkB(SEQ ID NO:67)组成。 [0113] 另外可选地，嵌合融合蛋白还可以进一步包括孤儿受体的分子内部分，如上文进一步详细公开。 [0114] “候选活性剂”的非限定性例子为小分子、肽、多肽、肽模拟物、抗体分子以及基于糖、脂类和核酸的化合物。小分子可以源自天然来源，或者可以是合成开发的，例如，通过组合化学。但是，应理解到，候选活性剂的准确来源并不是决定性的。通常，小分子的分子量范围将是250-800Da，更优选范围300-750Da，例如350-700Da，或400-650Da。合成化合物文库和细菌、真菌、植物和动物提取物的天然化合物文库有市售。另外可选地，根据本领域公知的方法产生这些文库。 [0115] 步骤d)是确定所述候选活性剂是否能够影响步骤c)中触发的细胞应答的步骤。通常，在步骤d)中可以使用任何适当的方法或技术。更具体地，方法或技术的选择将取决于步骤c)中触发的细胞应答。但是，特别优选地，步骤d)使用光作为细胞应答变化的读出，即，可以使用光学传感器测定细胞应答，所述光学传感器可以适当地应用于测定荧光信号的强度和分布。 [0116] 例如，步骤d)可以包括确定细胞的基因转录谱。确定细胞的基因转录谱的方法是本领域已知的。在优选的实施方式中，基因响应于细胞应答而打开或关闭开关。在更优选的实施方式中，可以使用处于调节序列控制下的报道基因确定基因转录谱，所述调节序列在嵌合融合蛋白二聚时引发转录。这些报道基因测定的例子描述于以下材料和方法部分中，并包括商业的Cignal报道基因测定和Path Detect Elk1trans报道基因系统，其使用荧光素酶报道基因。另一个例子是使用其他酶例如半乳糖苷酶或酯酶的报道基因测定。另外可选地，可以对细胞进行RNA-或cDNA微阵列测定、使用细胞应答特异性和/或特征性的引物和探针的半定量PCR、定量PCR或实时PCR。出于该目的，材料和方法部分还说明了类似应用的蛋白质印迹。 [0117] 步骤d)还可以包括确定细胞周期分布。确定细胞周期分布的方法是本领域已知的。确定细胞周期分布的方法在方法和材料部分在标题“细胞周期分布”下加以详细说明。确定细胞周期分布的其他方法包括分析表达谱，如下文所述。 [0118] 步骤d)还可以包括确定蛋白质在细胞中的定位。例如，可以测量激活的受体蛋白质的内化或特征核蛋白质例如转录因子的定位。确定蛋白质在细胞中定位的方法是本领域已知的。这可以通过以下进行：(i)将这些蛋白质与荧光蛋白质融合，或者(ii)将这些蛋白质用荧光标记物标记。也可以使用由金或其他金属制成的颗粒代替荧光用于检测。融合蛋白或标记的蛋白质用范围广泛的显微技术定位，例如，荧光显微镜或电子显微镜。此外，可以使用荧光蛋白质和荧光分子，其以光学性质变化响应于pH变化并从而使得可以检测蛋白质所在的细胞区室。标记可以通过与抗体、酶(例如“SNAP-标签”)或化学反应性基团反应来实现。 [0119] 在再另一实施方式中，步骤d)可以包括确定蛋白质在细胞中的功能状态，例如，通过确定步骤c)中触发的细胞应答的特征性信号传导分子的磷酸化状态。确定蛋白质功能状态的方法是本领域已知的。蛋白质功能状态的确定可以通过从细胞提取特定或全部蛋白质、然后特异性地标记处于一种而非其他功能状态的蛋白质实现。标记可以使用功能性蛋白质状态的特异性抗体实现。在不同的方法中，功能状态可以通过分析蛋白质定位识别，如上文所述。在不同的方法中，蛋白质可以与一种或多种荧光蛋白质融合，例如，在FRET部分中，以光学特性变化响应于功能状态变化。在不同的方法中，可以检测蛋白质与其他蛋白质的缔合，并使用其作为功能状态的度量。 [0120] 类似地，步骤d)可以包括确定细胞的形状。确定细胞形状的方法是本领域已知的。这可以通过光或荧光显微镜来实现。对于后者来说，细胞可以适当地染色，或者它们可以表达荧光蛋白质，或者它们可以用适当的荧光分子或蛋白质标记。确定细胞形态学的测定在下文材料和方法部分中在标题“细胞形态学”下进一步说明。 [0121] 另外可选地，步骤d)还可以通过确定细胞在2D表面或者在3D结构中的分布或迁移行为进行。确定细胞分布或迁移行为的方法是本领域已知的。分布或迁移行为可以使用光或荧光显微镜确定。可以将细胞置于2D表面上或3D结构中。另外作为时间的函数，记录每个细胞的位置。从每个细胞的位置，可以提取描述细胞分布(例如，与最近邻居的距离、某区域内邻居的数量)或迁移行为(例如，细胞运动的速度或某段时间移动的距离)的参数。 [0122] 步骤d)的另一实施方式包括确定细胞的代谢活性，或者确定细胞代谢物的组成。确定细胞代谢活性的方法是本领域已知的。例如，代谢活性可以就细胞增殖而言确定，如下文材料和方法部分中在标题“细胞增殖”下所述。代谢活性也可以通过分析细胞化学组成确定，例如，使用质谱或色谱方法。代谢活性也可以通过使用被细胞加工并且其加工依赖于代谢活性的化学试剂确定(例如，四唑染料)。 [0123] 在再另一实施方式中，步骤d)包括确定细胞的存活或死亡。确定细胞存活或死亡的方法是本领域已知的，可以涉及到检测促细胞凋亡标记物(例如膜联蛋白V或胱天蛋白酶)，将染料并入到凋亡细胞中(例如碘化丙啶)，或者确定底物的利用率(例如，[3H]-胸苷并入)。确定细胞培养物或样品中活细胞和/或凋亡细胞百分含量的试剂盒是市售的。 [0124] 步骤d)可以另外可选地包括确定细胞的分化阶段。确定细胞分化阶段的方法是本领域已知的。确定细胞分化阶段可以涉及到确定分化阶段特异性细胞标记物，例如，通过流式细胞术、荧光显微镜或免疫组织化学。取决于分化类型，细胞还可以经历细胞形态学和/或表达谱的变化，如上所述。 [0125] 在再另一实施方式中，步骤d)可以包括确定细胞并入核苷酸类似物。确定细胞并入核苷酸类似物的方法是本领域已知的。核苷酸类似物可以是任何合适的能够监测细胞应答的核苷酸类似物。例如，核苷酸类似物可以是5-乙炔基-2’-脱氧尿苷或溴脱氧尿苷。这些类似物的测定可以使用市售的抗体实现，例如通过荧光标记，例如，通过用特征为叠氮基团的荧光分子标记。 [0126] 如上所述，本文公开的嵌合融合蛋白可以有利地并入到多种应用中。例如，本文公开的嵌合融合蛋白可以用作研究工具，优选地用于表征孤儿受体。 [0127] 如上所述，本文公开的嵌合融合蛋白可以用于筛选方法。因此，提供筛选方法，其可以使用光作为所述嵌合融合蛋白的激活物并用于所述筛选方法的读出。这消除了对加入昂贵的抗体的需要，因此使得有利地将筛选方法应用于自动化高通量筛选。 [0128] 此外，本文公开的嵌合融合蛋白可以用于控制细胞生长的非治疗应用，优选地其中所述嵌合融合蛋白在体外使用。例如，本文公开的嵌合融合蛋白可以非治疗性地用于控制生长因子路径，优选地其中所述嵌合融合蛋白在体外使用。 [0129] 本文公开的嵌合融合蛋白的另一应用在于产生图式化细胞培养物，或者甚至是图式化细胞组织。图式化细胞培养物的特征在于所述细胞培养物的某些细胞被刺激，而其他不被刺激。产生图式化细胞培养物要求高度的激活的空间控制，这在所有细胞使用相同培养基时通常难以实现。由于其光的可控激发，可以使用本文公开的嵌合融合蛋白产生图式化细胞培养物，同样如本文实施例中所述。 [0130] 除高度的空间控制以外，本文公开的嵌合融合蛋白还使得可以进行高度的时间控制。受体信号传导路径的高度时间控制是例如干细胞分化中所要求的，其中必需在特定的分化时间点对细胞应用特定的生长因子信号传导路径。因此，本文公开的嵌合融合蛋白可以有利地以非治疗性方式用于干细胞的分化，优选地其中所述嵌合融合蛋白在体外使用。可以得到这些干细胞而不使用涉及修改人种系遗传同一性或涉及出于工业或商业目的使用人胚胎的方法。 [0131] 受体激活高度的空间和时间控制使得本文公开的嵌合融合蛋白特别可用于控制所关注的生物产品的产生。 [0132] 上述(非治疗性)用途并不限于本文公开的嵌合融合蛋白本身。类似地，设想本文公开的核酸分子或者本文公开的非人转基因动物作为研究工具的用途，优选地用于表征孤儿受体。而且，本文公开的核酸分子可以用于筛选方法，优选地其中筛选方法使用光作为由核酸分子编码的所述嵌合融合蛋白的激活物并用于所述筛选方法的读出。最后，还设想本文公开的非人转基因动物用于筛选方法。 [0133] 方法进一步通过以下实施方式说明： [0134] 1.筛选方法，其包括以下步骤： [0135] a)提供表达嵌合融合蛋白的细胞，上述嵌合融合蛋白包括： [0136] 具有在选自SEQ ID NO:12(NgPA1-LOV)、SEQ ID NO:14(OdPA1-LOV)和SEQ ID NO:10(VfAU1-LOV)的氨基酸序列的全长具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的LOV结构域，和 [0137] 细胞表面受体的细胞内部分； [0138] 其中当LOV结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白能够二聚，从而经由所述细胞表面受体的细胞内部分触发细胞应答； [0139] b)使所述细胞与候选活性剂接触； [0140] c)使所述细胞暴露于所述适当波长的光；和 [0141] d)确定所述候选活性剂是否能够影响步骤c)中触发的所述细胞应答。 [0142] 2.实施方式1的方法，其中LOV结构域具有在SEQ ID NO:12(NgPA1-LOV)的氨基酸序列的全长上具有至少73％，优选至少75％，更优选80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少 99％，最优选100％序列同一性的氨基酸序列。 [0143] 3.实施方式1或2的方法，其中LOV结构域具有在SEQ ID NO:14(OdPA1-LOV)的氨基酸序列的全长上具有至少73％，优选至少75％，更优选80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少 99％，最优选100％序列同一性的氨基酸序列。 [0144] 4.实施方式1-3中任一项的方法，其中LOV结构域具有在SEQ ID NO:10(VfAU1-LOV)的氨基酸序列的全长上具有至少73％，优选至少75％，更优选80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，最优选100％序列同一性的氨基酸序列。 [0145] 5.实施方式1-4中任一项的方法，其中当LOV结构域用所述适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白同型二聚。 [0146] 6.实施方式1-5中任一项的方法，其中用于激活LOV结构域的光具有在350-500nm的范围中的波长。 [0147] 7.实施方式1-6中任一项的方法，其中LOV结构域位于嵌合融合蛋白的C-端。 [0148] 8.实施方式1-7中任一项的方法，LOV结构域能够以5μW/mm2的光、优选4μW/mm2的光、更优选3μW/mm2的光、最优选2.5μW/mm2的光，例如以2.0μW/mm2、1.5μW/mm2、1.0μW/mm2、0.5μW/mm2和0.3μW/mm2的光激活。 [0149] 9.实施方式1-8中任一项的方法，其中受体的所述细胞内部分是受体酪氨酸激酶(RTK)的细胞内部分。 [0150] 10.实施方式9的方法，其中所述融合蛋白还包括所述RTK的跨膜结构域。 [0151] 11.实施方式9或10的方法，其中酪氨酸激酶是选自以下的RTK：EGF受体(例如EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3或ErbB4)、FGF受体、RET受体、胰岛素受体、PDGF受体、VEGF受体、HGF受体、Trk受体、Eph受体、AXL受体、LTK受体、TIE受体、ROR受体、DDR受体、KLG受体、RYK受体和MuSK受体，优选地选自EGF受体、FGF受体、RET受体，更优选地选自EGFR、FGFR1和RET，最优选地，融合蛋白选自SEQ ID NO:58(mFGFR1-VfAU1-LOV)、SEQ ID NO:59(p75-hEGFR-VfAU1-LOV)和SEQ ID NO:60(hRET-VfAU1-LOV)组成。 [0152] 12.实施方式1-10中任一项的方法，其中嵌合融合蛋白还包括孤儿受体的细胞内部分。 [0153] 13.实施方式1-12中任一项的方法，其中步骤d)使用光作为细胞应答变化的读出。 [0154] 14.实施方式1-13中任一项的方法，其中步骤d)包括： [0155] (i)确定细胞周期分布，和/或 [0156] (ii)确定细胞的基因转录谱，和/或 [0157] (iii)确定细胞中蛋白质的定位，和/或 [0158] (iv)确定细胞中蛋白质的功能状态，和/或 [0159] (v)确定细胞的形状，和/或 [0160] (vi)确定表面上或3D结构中细胞的分布，和/或 [0161] (vii)确定表面上或3D结构中细胞的迁移行为，和/或 [0162] (viii)确定细胞的代谢活性，和/或 [0163] (ix)确定细胞的存活或死亡，和/或 [0164] (x)确定细胞的分化状态，和/或 [0165] (xi)确定细胞代谢物的组成，和/或 [0166] (xii)确定由细胞并入核苷酸类似物，优选地，其中核苷酸类似物是5-乙炔基-2’-脱氧尿苷或溴脱氧尿苷，更优选地，其中核苷酸类似物是荧光标记的，或者其中核苷酸类似物通过抗体检测，最优选地，其中荧光分子是荧光叠氮化物。 [0167] 15.实施方式1-14中任一项的方法，其中步骤d)包括确定细胞并入荧光核苷酸类似物，优选地其中荧光核苷酸类似物是5-乙炔基-2’-脱氧尿苷。 [0168] 16.嵌合融合蛋白，其包括具有与SEQ ID NO:12(NgPA1-LOV)具有至少76％序列同一性的氨基酸序列的LOV结构域，其中当LOV结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白能够二聚。 [0169] 17.实施方式16的嵌合融合蛋白，其中LOV结构域具有在SEQ ID NO:12(NgPA1-LOV)的氨基酸序列的全长上具有至少78％，更优选80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少 99％，最优选100％序列同一性的氨基酸序列。 [0170] 18.嵌合融合蛋白，其包括具有与SEQ ID NO:14(OdPA1-LOV)具有至少74％序列同一性的氨基酸序列的LOV结构域，其中当LOV结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白能够二聚。 [0171] 19.实施方式18的嵌合融合蛋白，其中LOV结构域具有在SEQ ID NO:14(OdPA1-LOV)的氨基酸序列的全长上具有至少75％，优选至少76％，更优选78％，更优选80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，最优选100％序列同一性的氨基酸序列。 [0172] 20.实施方式16-19中任一项的嵌合融合蛋白，其中当LOV结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白同型二聚。 [0173] 21.实施方式16-20中任一项的嵌合融合蛋白，其中LOV结构域能够以5μW/mm2的光、优选4μW/mm2的光、更优选3μW/mm2的光、最优选2.5μW/mm2的光激活，例如以2.0μW/mm2、2 2 2 2 1.5μW/mm、1.0μW/mm、0.5μW/mm和0.3μW/mm的光激活。 [0174] 22.实施方式16-21中任一项的嵌合融合蛋白，其中激活LOV结构域的光具有350-500nm范围中的波长。 [0175] 23.实施方式16-22中任一项的嵌合融合蛋白，其中LOV结构域位于嵌合融合蛋白的C-端。 [0176] 24.实施方式16-23中任一项的嵌合融合蛋白，其中嵌合融合蛋白还包括受体酪氨酸激酶(RTK)的细胞内部分。 [0177] 25.实施方式24的嵌合融合蛋白，其中所述融合蛋白还包括所述RTK的跨膜结构域。 [0178] 26.实施方式23或24的嵌合融合蛋白，其中酪氨酸激酶是选自以下的RTK：EGF受体(例如EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3或ErbB4)、FGF受体、RET受体、胰岛素受体、PDGF受体、VEGF受体、HGF受体、Trk受体、Eph受体、AXL受体、LTK受体、TIE受体、ROR受体、DDR受体、KLG受体、RYK受体和MuSK受体，更优选地选自EGF受体、FGF受体和RET受体，最优选地选自EGFR、FGFR1和RET。 [0179] 27.实施方式16-25中任一项的嵌合融合蛋白，其中嵌合融合蛋白还包括孤儿受体的细胞内部分。 [0180] 28.实施方式16-23中任一项的嵌合融合蛋白，其中嵌合融合蛋白是转录因子，其还包括DNA-结合结构域和转录调节结构域，二聚化形式的该转录因子能够促进或抑制包括功能性连接的所述DNA-结合结构域的识别序列的目标基因的转录。 [0181] 29.实施方式16-28中任一项的嵌合融合蛋白，其中嵌合融合蛋白包括荧光蛋白质，优选GFP、EGFP、mCherry或mVenus。 [0182] 30.核酸分子，其编码实施方式16-29中任一项所定义的嵌合融合蛋白。 [0183] 31.实施方式30的核酸分子，其包括核酸序列SEQ ID NO:54。 [0184] 32.实施方式30的核酸分子，其包括核酸序列SEQ ID NO:55。 [0185] 33.非人转基因动物，其表达由根据实施方式30-32中任一项的核酸分子编码的嵌合融合蛋白。 [0186] 34.根据实施方式16-29中任一项所述的嵌合融合蛋白作为研究工具的用途，优选地用于表征孤儿受体。 [0187] 35.根据实施方式16-29中任一项所述的嵌合融合蛋白在筛选方法中的用途，优选地其中筛选方法使用光作为所述嵌合融合蛋白的激活物，并作为所述筛选方法的读出。 [0188] 36.根据实施方式16-29中任一项所述的嵌合融合蛋白用于控制细胞生长的非治疗用途，优选地其中所述嵌合融合蛋白在体外使用。 [0189] 37.根据实施方式16-29中任一项所述的嵌合融合蛋白用于产生图式化细胞培养物的用途。 [0190] 38.根据实施方式16-29中任一项所述的嵌合融合蛋白用于控制生长因子路径的非治疗用途，优选地其中所述嵌合融合蛋白在体外使用。 [0191] 39.根据实施方式16-29中任一项所述的嵌合融合蛋白用于控制所关注的生物产品的产生的用途。 [0192] 40.根据实施方式16-29中任一项所述的嵌合融合蛋白在干细胞分化中的非治疗用途，其中干细胞不使用涉及修改人种系遗传同一性或者涉及使用人胚胎用于工业或商业目的的方法产生，优选地所述嵌合融合蛋白在体外使用。 [0193] 41.根据实施方式30-32中任一项所述的核酸分子作为研究工具的用途，优选地用于表征孤儿受体。 [0194] 42.根据实施方式29的核酸分子在筛选方法中的用途，优选地其中筛选方法使用光作为所述嵌合融合蛋白的激活物，并作为所述筛选方法的读出。 [0195] 43.根据实施方式30-32中任一项所述的非人转基因动物作为研究工具的用途，优选地用于表征孤儿受体。 [0196] 44.根据实施方式30-32中任一项所述的非人转基因动物在筛选方法中的用途。 [0197] 45.筛选方法，其包括以下步骤： [0198] a)提供表达嵌合融合蛋白的细胞，上述嵌合融合蛋白包括： [0199] 具有在全长上与SEQ ID NO:64(SyCP1-PHY)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的光敏结构域，其与发色团功能性连接，和 [0200] 细胞表面受体的细胞内部分； [0201] 其中当光敏结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白能够二聚，从而经由所述细胞表面受体的所述细胞内部分触发细胞应答； [0202] b)使所述细胞与候选活性剂接触； [0203] c)使所述细胞暴露于所述适当波长的光；和 [0204] d)确定所述候选活性剂是否能够影响步骤c)中触发的所述细胞应答。 [0205] 46.实施方式45的方法，其中光敏结构域具有在全长上与SEQ ID NO:64(SyCP1-PHY)的氨基酸序列具有至少73％，优选至少75％，更优选80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，最优选100％序列同一性的氨基酸序列。 [0206] 47.根据实施方式45或46的方法，其中发色团是线性四吡咯，优选地选自藻青素、藻红素、藻尿胆素、藻紫胆素、phytochromobilin、胆绿素、胆红素、中胆绿素、中胆红素、胆色烷、后胆色素、尿胆素、粪胆素和尿胆素原，优选地，其中发色团是藻青素。 [0207] 48.根据实施方式45-47中任一项的方法，其中当光敏结构域用所述适当波长的光激发时嵌合融合蛋白同型二聚。 [0208] 49.根据实施方式45-48中任一项的方法，其中激发光敏结构域的光具有600-690nm范围中的波长。 [0209] 50.根据实施方式45-49中任一项的方法，其中灭活光敏结构域的光具有700-750nm范围中的波长。 [0210] 51.根据实施方式45-50中任一项的方法，其中光敏结构域位于嵌合融合蛋白的C-端。 [0211] 52.根据实施方式45-51中任一项的方法，其中光敏结构域能够以0.5μW/mm2的光、2 2 2 2 优选0.4μW/mm的光、更优选0.3μW/mm的光、最优选0.25μW/mm的光例如以0.2μW/mm 、0.15μW/mm2、0.1μW/mm2、0.05μW/mm2和0.03μW/mm2的光激活。 [0212] 53.根据实施方式45-52中任一项的方法，其中受体的所述细胞内部分是受体酪氨酸激酶(RTK)的细胞内部分。 [0213] 54.根据实施方式53的方法，其中所述融合蛋白还包括所述RTK的跨膜结构域。 [0214] 55.根据实施方式53或54的方法，其中酪氨酸激酶是选自以下的RTK：FGF受体、Trk受体、EGF受体(例如EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3或ErbB4)、RET受体、胰岛素受体、PDGF受体、VEGF受体、HGF受体、Eph受体、AXL受体、LTK受体、TIE受体、ROR受体、DDR受体、KLG受体、RYK受体和MuSK受体，优选地选自FGF受体、Trk受体，更优选地选自FGFR1和TrkB，最优选地融合蛋白是redOpto-mFGFR1(SEQ ID NO:66)或redOpto-rtrkB(SEQ ID NO:67)。 [0215] 56.实施方式45-54中任一项的方法，其中嵌合融合蛋白还包括孤儿受体的细胞内部分。 [0216] 57.实施方式45-56中任一项的方法，其中步骤d)使用光作为细胞应答变化的读出。 [0217] 58.实施方式45-57中任一项的方法，其中步骤d)包括： [0218] (i)确定细胞周期分布，和/或 [0219] (ii)确定细胞的基因转录谱，和/或 [0220] (iii)确定细胞中蛋白质的定位，和/或 [0221] (iv)确定细胞中蛋白质的功能状态，和/或 [0222] (v)确定细胞的形状，和/或 [0223] (vi)确定表面上或3D结构中细胞的分布，和/或 [0224] (vii)确定表面上或3D结构中细胞的迁移行为，和/或 [0225] (viii)确定细胞的代谢活性，和/或 [0226] (ix)确定细胞的存活或死亡，和/或 [0227] (x)确定细胞的分化状态，和/或 [0228] (xi)确定细胞代谢物的组成，和/或 [0229] (xii)确定细胞并入核苷酸类似物，优选地，其中核苷酸类似物是5-乙炔基-2’-脱氧尿苷或溴脱氧尿苷，更优选地，其中核苷酸类似物是荧光标记的，或者其中核苷酸类似物通过抗体检测，最优选地，其中荧光分子是荧光叠氮化物。 [0230] 59.实施方式45-58中任一项的方法，其中步骤d)包括确定细胞的基因转录谱，更优选地使用报道基因测定，最优选地使用荧光素酶报道基因测定。 [0231] 60.实施方式45-58中任一项的方法，其中步骤d)包括确定细胞并入荧光核苷酸类似物，优选地其中荧光核苷酸类似物是5-乙炔基-2’-脱氧尿苷。 [0232] 61.嵌合融合蛋白，其包括与发色团功能性连接的具有在全长上与SEQ ID NO:64(SyCP1-PHY)具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的光敏结构域，其中当光敏结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白能够二聚。 [0233] 62.实施方式61的嵌合融合蛋白，其中光敏结构域具有在全长上与SEQ ID NO:64(SyCP1-PHY)的氨基酸序列具有至少78％，更优选80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，最优选100％序列同一性的氨基酸序列。 [0234] 63.实施方式61或62的嵌合融合蛋白，其中发色团是线性四吡咯，优选地选自藻青素、藻红素、藻尿胆素、藻紫胆素、phytochromobilin、胆绿素、胆红素、中胆绿素、中胆红素、胆色烷、后胆色素、尿胆素、粪胆素和尿胆素原，最优选地，其中发色团是藻青素。 [0235] 64.实施方式61-63中任一项的嵌合融合蛋白，其中当光敏结构域用适当波长的光激发时，嵌合融合蛋白同型二聚。 [0236] 65.实施方式61-64中任一项的嵌合融合蛋白，其中光敏结构域能够以0.5μW/mm2的光、优选0.4μW/mm2的光、更优选0.3μW/mm2的光、最优选0.25μW/mm2的光例如以0.2μW/2 2 2 2 2 mm、0.15μW/mm、0.1μW/mm、0.05μW/mm和0.03μW/mm的光激活。 [0237] 66.实施方式61-65中任一项的嵌合融合蛋白，其中用于激活光敏结构域的光具有600-690nm范围中的波长。 [0238] 67.实施方式61-66中任一项的嵌合融合蛋白，其中用于使光敏结构域失活的光具有700-750nm范围中的波长。 [0239] 68.实施方式61-67中任一项的嵌合融合蛋白，其中光敏结构域位于嵌合融合蛋白的C-端处。 [0240] 69.实施方式61-68中任一项的嵌合融合蛋白，其中嵌合融合蛋白还包括受体酪氨酸激酶(RTK)的细胞内部分。 [0241] 70.实施方式69的嵌合融合蛋白，其中所述融合蛋白还包括所述RTK的跨膜结构域。 [0242] 71.实施方式69或70的嵌合蛋白，其中酪氨酸激酶是选自以下的RTK：FGF受体、Trk受体、EGF受体(例如EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3或ErbB4)、RET受体、胰岛素受体、PDGF受体、VEGF受体、HGF受体、Eph受体、AXL受体、LTK受体、TIE受体、ROR受体、DDR受体、KLG受体、RYK受体和MuSK受体，更优选地选自FGF受体、Trk受体，再更优选地选自FGFR1和TrkB，最优选地融合蛋白为redOpto-mFGFR1(SEQ ID NO:66)或redOpto-rtrkB(SEQ ID NO:67)。 [0243] 72.实施方式61-70中任一项的嵌合融合蛋白，其中嵌合融合蛋白还包括孤儿受体的细胞内部分。 [0244] 73.实施方式61-68中任一项的嵌合融合蛋白，其中嵌合融合蛋白是转录因子，其还包括DNA-结合结构域和转录调节结构域，二聚化形式的该转录因子能够促进或抑制包括功能性连接的所述DNA-结合结构域的识别序列的目标基因的转录。 [0245] 74.实施方式61-73中任一项的嵌合融合蛋白，其中嵌合融合蛋白还包括荧光蛋白质，优选GFP、EGFP、mCherry或mVenus。 [0246] 75.核酸分子，其编码实施方式61-74中任一项的嵌合融合蛋白。 [0247] 76.实施方式75的核酸分子，其包括SEQ ID NO:65(SyCP1-PHY)的核酸序列。 [0248] 77.实施方式76的核酸分子，其包括SEQ ID NO:68(redOpto-mFGFR1)或SEQ ID NO:69(redOpto-rtrkB)的核酸序列。 [0249] 78.非人转基因动物，其表达由根据实施方式74-77中任一项所述的核酸分子编码的嵌合融合蛋白。 [0250] 79.根据实施方式61-74中任一项所述的嵌合融合蛋白作为研究工具的用途，优选地用于表征孤儿受体。 [0251] 80.根据实施方式61-74中任一项所述的嵌合融合蛋白在筛选方法中的用途，优选地其中筛选方法使用光作为所述嵌合融合蛋白的激活物，并用于所述筛选方法的读出。 [0252] 81.根据实施方式61-74中任一项所述的嵌合融合蛋白用于控制细胞生长的非治疗用途，优选地其中所述嵌合融合蛋白在体外使用。 [0253] 82.根据实施方式61-74中任一项所述的嵌合融合蛋白用于产生图式化细胞培养物的用途。 [0254] 83.根据实施方式61-74中任一项所述的嵌合融合蛋白用于控制生长因子路径的非治疗用途，优选地其中所述嵌合融合蛋白在体外使用。 [0255] 84.根据实施方式61-74中任一项所述的嵌合融合蛋白用于控制所关注的生物产品的产生的用途。 [0256] 85.根据实施方式61-74中任一项所述的嵌合融合蛋白在干细胞分化中的非治疗用途，其中干细胞不使用涉及修改人种系遗传同一性或者涉及使用人胚胎用于工业或商业目的的方法产生，优选地其中所述嵌合融合蛋白在体外使用。 [0257] 86.根据实施方式75-77中任一项所述的核酸分子作为研究工具的用途，优选地用于表征孤儿受体。 [0258] 87.根据实施方式74的核酸分子在筛选方法中的用途，优选地其中筛选方法使用光作为所述嵌合融合蛋白的激活物，并用于所述筛选方法的读出。 [0259] 88.根据实施方式75-77中任一项所述的非人转基因动物作为研究工具的用途，优选地用于表征孤儿受体。 [0260] 89.根据实施方式75-77中任一项所述的非人转基因动物在筛选方法中的用途。 附图说明[0262] 图1.LOV结构域的选择和哺乳动物细胞中的表达 [0263] (a)从其剪切LOV结构域(以星号突出显示)的光敏蛋白质的结构域结构(AtPH1和AtPH2：拟南芥向光素(phototropin)1和2，CrPH：C.rheinhardtii向光素，NcVV：粗糙脉孢菌(N.crassa)vivid，VfAU1：V.frigida aureochrome1)。在这些蛋白质中，LOV结构域调节许多种效应器结构域(STK：Ser/Thr激酶，DB：DNA-结合结构域)。为了测试表达以及对哺乳动物细胞中细胞活力的影响，将LOV结构域与荧光蛋白质mVenus(mV)融合。 [0264] (b和d)用mVenus-LOV结构域融合物转染的人胚胎肾293(HEK293)细胞(b)和中国仓鼠卵巢(CHO)K1细胞(d)的荧光强度测量。 [0265] (c和e)用mVenus-LOV结构域融合物转染的HEK293细胞(c)和CHO K1细胞(e)的活力。 [0266] 在b至e中，数据归一化至与小的强力折叠的FK506结合蛋白质(FKBP)融合的mV。 [0267] 图2.HEK293细胞中mFGFR1-LOV结构域融合蛋白的设计和功能 [0268] (a)例如mFGFR1的RTK由细胞外配体结构结构域(LBD)、单跨度跨膜结构域(TMD)和细胞内结构域(ICD)(激酶结构域(KD)和C-端尾部结构域(CTD))组成。在mFGFR1-LOV结构域融合蛋白中，仅保留ICD，以使蛋白对内源性配体不敏感。ICD使用豆蔻酰化结构域(MYR)与膜连接，并且LOV结构域在ICD C-端并入。 [0269] (b)对于表达mFGFR1-ICD和LOV结构域的嵌合蛋白的细胞，响应于蓝光的MAPK路径激活。imFGFR1(参见正文)由小分子二聚体AP20187激活。 [0270] (c)对于表达imFGFR1、Opto-mFGFR1(mFGFR1-VfAU1-LOV)或激酶死Opto-mFGFR1(Y271F，Y272F)的细胞，响应于蓝光、绿光和红光的MAPK路径激活。 [0271] 图3.HEK293细胞中响应于蓝光由Opto-mFGFR1的路径激活。激活表达为荧光素酶报道基因的诱导(照明的细胞的RLU除以保持在暗中的细胞的RLU)。光强度为～3μW/mm2。 [0272] 图4.Opto-mFGFR1和VfAU1-LOV的二聚化 [0273] (a)Opto-mFGFR1激活要求二聚化，因为引入R195E突变消除了imFGFR1和Opto-mFGFR1的MAPK路径激活。(b)VfAU1-LOV在哺乳动物细胞中二聚。将VfAU1-LOV并入活性要求二聚的转录因子(GA-VfAU1-LOV-P)产生光激活的转录响应。基因设计和阳性对照(pGAVPO)描述于标题“材料和方法”部分中。光强度为～3μW/mm2。 [0274] 图5.hEGFR、hRET和另外可选的LOV结构域的融合蛋白 [0275] (a)mFGFR1和NgPA1-LOV或OdPA1-LOV的嵌合蛋白以MAPK路径激活响应于蓝光。 [0276] (b)hEGFR1-ICD或hRET-ICD和VfAU1-LOV的嵌合蛋白以MAPK路径激活响应于蓝光。 [0277] (c)VfAU1-LOV激发态寿命降低之后，蓝光降低Opto-mFGFR1的激活。在a-c中，光强度为～3μW/mm2。 [0278] 图6.癌细胞行为的光学控制 [0279] (a)响应于蓝光的人恶性胸膜间皮瘤细胞(M38K，SPC212)中的Opto-mFGFR1和ERK1/2磷酸化。 [0280] (b)响应于蓝光的SPC212细胞中的AKT和PLCy1磷酸化。 [0281] (c)M38K细胞以增殖增加响应于蓝光。 [0282] (d)M38K细胞以S-相细胞百分含量增加响应于蓝光。 [0283] (e)M38K细胞以形态学延长响应于蓝光和FGF2。 [0284] (f)(e)的代表性图像。 [0285] (g)M38K细胞以皮层肌动蛋白降低和M38K细胞中出现富肌动蛋白的长丝状伪足响应于蓝光。 [0287] 图7.血上皮细胞行为的光学控制 [0288] (a)响应于蓝光的mFGFR1-VfAU1-LOV和ERK1/2磷酸化 [0289] (b)hBE细胞球状体以出芽响应于蓝光。对照细胞表达mCherry。 [0290] (c)(b)的代表性图像。在a-c中，光强度为～3μW/mm2。 [0291] 图8.图式化照明 [0292] (a)SPC212细胞中空间限定的ERK1/2磷酸化。标尺为2mm。 [0293] (b)hBE细胞中空间限定的ERK1/2磷酸化。标尺为5mm。 [0294] (c)HEK293细胞中空间限定的依赖于MAPK的基因转录。标尺为10mm。对于a-c，所有图像均为未经处理的原始图像。一个圆形区域以a和b标记。在a-c中，光强度为～3μW/mm2。 [0295] 图9.药理化合物在M38K细胞中的全光学评价。评价的化合物为PD166866(PD)、AZD6244/司美替尼(Selumetinib)(SEL)、BIBF1120(BIBF)、UO126(UO)、AP24534/帕纳替尼(Ponatinib)(PON)、MK2206(MK)和LY294002(LY)。光强度为～3μW/mm2。 [0296] 图10.mFGFR1-PHY结构域嵌合受体的设计和功能 [0297] (a)例如mFGFR1的RTK由细胞外受体结合结构域(LBD)、单跨度跨膜结构域(TMD)和细胞内部分结构域(ICD)(激酶结构域(KD)和C-端尾部结构域(CTD))组成。在mFGFR1-PHY结构域融合蛋白中，仅保留ICD，以使蛋白质对内源性配体不敏感。ICD使用豆蔻酰化结构域(MYR)与膜连接，PHY结构域在ICD C-端处并入。 [0298] (b)对于用mFGFR1-SyCP1-PHY、激酶死mFGFR1-SyCP1-PHY(Y271F，Y272F)或不能二聚化的mFGFR1-SyCP1-PHY(R195E)转染的HEK293细胞，响应于红光的MAPK路径激活。激活表达为荧光素酶报道基因的诱导。光强度为～0.05μW/mm2。 [0299] 图11.rtrkB的融合蛋白。rtrkB-ICD和SyCP1-PHY的嵌合蛋白以MAPK路径激活响应于红光。光强度为～0.05μW/mm2。 [0300] 图12.表达Opto-rtrkB的HEK293细胞中药理化合物的全光学评价。评价的化合物为UO126(UO)、AZD6244/司美替尼(SEL)、PD166866(PD)、伊马替尼(Imatinib)(IMA)和维罗非尼(Vemurafenib)/PLX4032(VEM)。对于化合物和对照(CON)，测量响应于红光的MARK路径激活，并表达为诱导。光强度为～0.05μW/mm2。 [0301] 序列说明 [0302] 全长光受体和LOV结构域的蛋白质序列。Uniprot和序列标识符在括弧中给出。 [0303] AtPH1(O48963；SEQ ID NO:1) [0304] MEPTEKPSTKPSSRTLPRDTRGSLEVFNPSTQLTRPDNPVFRPEPPAWQNLSDPRGTSPQPRPQQEPAPSNPVRSDQEIAVTTSWMALKDPSPETISKKTITAEKPQKSAVAAEQRAAEWGLVLKTDTKTGKPQGVGVRNSGGTENDPNGKKTTSQRNSQNSCRSSGEMSDGDVPGGRSGIPRVSEDLKDALSTFQQTFVVSDATKPDYPIMYASAGFFNMTGYTSKEVVGRNCRFLQGSGTDADELAKIRETLAAGNNYCGRILNYKKDGTSFWNLLTIAPIKDESGKVLKFIGMQVEVSKHTEGAKEKALRPNGLPESLIRYDARQKDMATNSVTELVEAVKRPRALSESTNLHPFMTKSESDELPKKPARRMSENVVPSGRRNSGGGRRNSMQRINEIPEKKSRKSSLSFMGIKKKSESLDESIDDGFIEYGEEDDEISDRDERPESVDDKVRQKEMRKGIDLATTLERIEKNFVITDPRLPDNPIIFASDSFLELTEYSREEILGRNCRFLQGPETDLTTVKKIRNAIDNQTEVTVQLINYTKSGKKFWNIFHLQPMRDQKGEVQYFIGVQLDGSKHVEPVRNVIEETAVKEGEDLVKKTAVNIDEAVRELPDANMTPEDLWANHSKVVHCKPHRKDSPPWIAIQKVLESGEPIGLKHFKPVKPLGSGDTGSVHLVELVGTDQLFAMKAMDKAVMLNRNKVHRARAEREILDLLDHPFLPALYASFQTKTHICLITDYYPGGELFMLLDRQPRKVLKEDAVRFYAAQVVVALEYLHCQGIIYRDLKPENVLIQGNGDISLSDFDLSCLTSCKPQLLIPSIDEKKKKKQQKSQQTPIFMAEPMRASNSFVGTEEYIAPEIISGAGHTSAVDWWALGILMYEMLYGYTPFRGKTRQKTFTNVLQKDLKFPASIPASLQVKQLIFRLLQRDPKKRLGCFEGANEVKQHSFFKGINWALIRCTNPPELETPIFSGEAENGEKVVDPELEDLQTNVF [0305] AtPH1-LOV2(SEQ ID NO:2) [0306] ESVDDKVRQKEMRKGIDLATTLERIEKNFVITDPRLPDNPIIFASDSFLELTEYSREEILGRNCRFLQGPETDLTTVKKIRNAIDNQTEVTVQLINYTKSGKKFWNIFHLQPMRDQKGEVQYFIGVQLDGSKHVEPVR[0307] AtPH2(P93025；SEQ ID NO:3) [0308] MERPRAPPSPLNDAESLSERRSLEIFNPSSGKETHGSTSSSSKPPLDGNNKGSSSKWMEFQDSAKITERTAEWGLSAVKPDSGDDGISFKLSSEVERSKNMSRRSSEESTSSESGAFPRVSQELKTALSTLQQTFVVSDATQPHCPIVYASSGFFTMTGYSSKEIVGRNCRFLQGPDTDKNEVAKIRDCVKNGKSYCGRLLNYKKDGTPFWNLLTVTPIKDDQGNTIKFIGMQVEVSKYTEGVNDKALRPNGLSKSLIRYDARQKEKALDSITEVVQTIRHRKSQVQESVSNDTMVKPDSSTTPTPGRQTRQSDEASKSFRTPGRVSTPTGSKLKSSNNRHEDLLRMEPEELMLSTEVIGQRDSWDLSDRERDIRQGIDLATTLERIEKNFVISDPRLPDNPIIFASDSFLELTEYSREEILGRNCRFLQGPETDQATVQKIRDAIRDQREITVQLINYTKSGKKFWNLFHLQPMRDQKGELQYFIGVQLDGSDHVEPLQNRLSERTEMQSSKLVKATATNVDEAVRELPDANTRPEDLWAAHSKPVYPLPHNKESTSWKAIKKIQASGETVGLHHFKPIKPLGSGDTGSVHLVELKGTGELYAMKAMEKTMMLNRNKAHRACIEREIISLLDHPFLPTLYASFQTSTHVCLITDFCPGGELFALLDRQPMKILTEDSARFYAAEVVIGLEYLHCLGIVYRDLKPENILLKKDGHIVLADFDLSFMTTCTPQLIIPAAPSKRRRSKSQPLPTFVAEPSTQSNSFVGTEEYIAPEIITGAGHTSAIDWWALGILLYEMLYGRTPFRGKNRQKTFANILHKDLTFPSSIPVSLVGRQLINTLLNRDPSSRLGSKGGANEIKQHAFFRGINWPLIRGMSPPPLDAPLSIIEKDPNAKDIKWEDDGVLVNSTDLDIDLF[0309] AtPH2-LOV2(SEQ ID NO:4) [0310] DSWDLSDRERDIRQGIDLATTLERIEKNFVISDPRLPDNPIIFASDSFLELTEYSREEILGRNCRFLQGPETDQATVQKIRDAIRDQREITVQLINYTKSGKKFWNLFHLQPMRDQKGELQYFIGVQLDGSDHVEPLQ[0311] CrPH(A8IXU7；SEQ ID NO:5) [0312] MAGVPAPASQLTKVLAGLRHTFVVADATLPDCPLVYASEGFYAMTGYGPDEVLGHNCRFLQGEGTDPKEVQKIRDAIKKGEACSVRLLNYRKDGTPFWNLLTVTPIKTPDGRVSKFVGVQVDVTSKTEGKALADNSGVPLLVKYDHRLRDNVARTIVDDVTIAVEKAEGVEPGQASAVAAAAPLGAKGPRGTAPKSFPRVALDLATTVERIQQNFCISDPTLPDCPIVFASDAFLELTGYSREEVLGRNCRFLQGAGTDRGTVDQIRAAIKEGSELTVRILNYTKAGKAFWNMFTLAPMRDQDGHARFFVGVQVDVTAQSTSPDKAPVWNKTPEEEVAKAKMGAEAASLISSALQGMAAPTTANPWAAISGVIMRRKPHKADDKAYQALLQLQERDGKMKLMHFRRVKQLGAGDVGLVDLVQLQGSELKFAMKTLDKFEMQERNKVARVLTESAILAAVDHPFLATLYCTIQTDTHLHFVMEYCDGGELYGLLNSQPKKRLKEEHVRFYASEVLTALQYLHLLGYVYRDLKPENILLHHTGHVLLTDFDLSYSKGSTTPRIEKIGGAGAAGGSAPKSPKKSSSKSGGSSSGSALQLENYLLLAEPSARANSFVGTEEYLAPEVINAAGHGPAAVDWWSLGILIFELLYGTTPFRGARRDETFENIIKSPLKFPSKPAVSEECRDLIEKLLVKDVGARLGSRTGANEIKSHPWFKGINWALLRHQQPPYVPRRASKAAGGSSTGGAAFDNY [0313] CrPH-LOV1(SEQ ID NO:6) [0314] AGLRHTFVVADATLPDCPLVYASEGFYAMTGYGPDEVLGHNCRFLQGEGTDPKEVQKIRDAIKKGEACSVRLLNYRKDGTPFWNLLTVTPIKTPDGRVSKFVGVQVDVTSKTEGKALA [0315] NcVV(Q9C3Y6；SEQ ID NO:7) [0316] MSHTVNSSTMNPWEVEAYQQYHYDPRTAPTANPLFFHTLYAPGGYDIMGYLIQIMNRPNPQVELGPVDTSCALILCDLKQKDTPIVYASEAFLYMTGYSNAEVLGRNCRFLQSPDGMVKPKSTRKYVDSNTINTMRKAIDRNAEVQVEVVNFKKNGQRFVNFLTMIPVRDETGEYRYSMGFQCETE [0317] NcVV-LOV(SEQ ID NO:8) [0318] HTLYAPGGYDIMGWLIQIMNRPNPQVELGPVDTSCALILCDLKQKDTPIVYASEAFLYMTGYSNAEVLGRNCRFLQSPDGMVKPKSTRKYVDSNTINTMRKAIDRNAEVQVEVVNFKKNGQRFVNFLTMIPVRDETGEYRYSMGFQCETE [0319] VfAU1(A8QW55；SEQ ID NO:9) [0320]MNGLTPPLMFCSRSDDPSSTSNINLDDVFADVFFNSNGELLDIDEIDDFGDNTCPKSSMSVDDDASSQVFQGHLFGNALSSIALSDSGDLSTGIYESQGNASRGKSLRTKSSGSlSSELTEAQKVERRERNREHAKRSRVRKKFLLESLQQSVNELNHENNCLKESIREHLGPRGDSLIAQCSPEADTLLTDNPSKANRILEDPDYSLVKALQMAQQNFVITDASLPDNPIVYASRGFLTLTGYSLDQILGRNCRFLQGPETDPRAVDKIRNAITKGVDTSVCLLNYRQDGTTFWNLFFVAGLRDSKGNIVNYVGVQSKVSEDYAKLLVNEQNIEYKGVRTSNMLRRK [0321] VfAU1-LOV(SEQ ID NO:10) [0322] PDYSLVKALQMAQQNFVITDASLPDNPIVYASRGFLTLTGYSLDQILGRNCRFLQGPETDPRAVDKIRNAITKGVDTSVCLLNYRQDGTTFWNLFFVAGLRDSKGNIVNYVGVQSKVSEDYAKLLVNEQNIEYKGVRTSNMLRRK[0323] NgPA1(K8Z861；SEQ ID NO:11) [0324] MTEEQKVERRERNREHAKRSRVRKKFLLESLQKSVNALQEENDKLRGAIRSHLKEGADDLLKTCEVEVDESILASDPCSATKILDDPDYTLVKALQTAQQNFVITDPTLPDNPIVYASGGFLSLTGYQMDQILGRNCRFLQGPDTDPAAVDKIRRAIEDGTDGSVCLLNYRADGSTFWNQFFIAALRGADGNIVNYVGVQCKVSEEYASEVLKKEATSSTVAEASSKR [0325] NgPA1-LOV(SEQ ID NO:12) [0326] PDYTLVKALQTAQQNFVITDPTLPDNPIVYASGGFLSLTGYQMDQILGRNCRFLQGPDTDPAAVDKIRRAIEDGTDGSVCLLNYRADGSTFWNQFFIAALRGADGNIVNYVGVQCKVSEEYASEVLKKEATSSTVAEASSKR[0327] OdPA1(C5NSW6；SEQ ID NO:13) [0328] MTSKQQLPPPPIFGVLGDEKQVARNGIISLVDIFDDFLFSGDRNQPSNTASSSSHAQESESVGKDEENDYDSNDDEGDSDDGKRRKRSRTLPRNMTEEQKIERRERNREHAKRSRVRKKFLLESLQHSVRALEEENEKLRNAIRENLQGEAEQLLTRCSCGGPSVIASDPNTATRTLDDPDYSLVKALQTAQQNFVISDPSIPDNPIVYASQGFLTLTGYALSEVLGRNCRFLQGPETDPKAVEKVRKGLERGEDTTVVLLNYRKDGSTFWNQLFIAALRDGEGNVVNYLGVQCKVSEDYAKAFLKNEENEK [0329] OdPA1-LOV(SEQ ID NO:14) [0330] PDYSLVKALQTAQQNFVISDPSIPDNPIVYASQGFLTLTGYALSEVLGRNCRFLQGPETDPKAVEKVRKGLERGEDTTVVLLNYRKDGSTFWNQLFIAALRDGEGNVVNYLGVQCKVSEDYAKAFLKNEENEK [0331] 基因构建中使用的寡核苷酸。限制性位点加下划线。 [0332] (1)imFGFR1_Xhol_Kozak_F(SEQ ID NO:15) [0333] CAGAGCTCGAGACCATGTGGAGCTGGAAGTGCCTCC [0334] (2)imFGFR1_BamHI_R(SEQ ID NO:16) [0335] CAGAAGGATCCTCAGCGGCGTTTGAGTCCGCC [0336] (3)imFGFR1_inverse_R(SEQ ID NO:17) [0337] TGAGACCGGTCTCGACGCGCCGTTTGAG [0338] (4)imFGFR1_inverse1_F(SEQ ID NO:18) [0339] CAAGACCGGTGGATCCGGAGTCGACTATC [0340] (5)imFGFR1_inverse2_F(SEQ ID NO:19) [0341] CAAGACCGGTAAACTGGAAGTCGAGGGAGTGC [0342] (6)FKBP_Agel_F(SEQ ID NO:20) [0343] GATCACCGGTAAACTGGAAGTCGAGGGAGTGC [0344] (7)FKBP_Xmal_R(SEQ ID NO:21) [0345] GATCCCCGGGACCGCCAGATTCCAGTTTTAGAAG [0346] (8)AtPH1-LOV2_Agel_F(SEQ ID NO:22) [0347] GATCACCGGTGAAAGCGTTGATGATAAGGTCAGACAGAAGG [0348] (9)AtPH1-LOV2_XmaI_R(SEQ ID NO:23) [0349] GATCCCCGGGCCGCACGGGCTCAACGTGCT [0350] (10)AtPH2-LOV2_AgeI_F(SEQ ID NO:24) [0351] GATCACCGGTGATTCTTGGGATCTGAGTGATAGGGAAAGG [0352] (11)AtPH2-LOV2_XmaI_R(SEQ ID NO:25) [0353] GATCCCCGGGCTGGAGTGGCTCGACATGATCTGAC [0354] (12)CrPH1-LOV1_AgeI_F(SEQ ID NO:26) [0355] GATCACCGGTGCAGGACTCAGACATACATTTGTGGTGG [0356] (13)CrPH1-LOV1_Xmal_R(SEQ ID NO:27) [0357] GATCCCCGGGGGCCAGGGCTTTCCCTTCAGTC [0358] (14)NcVV-LOV_Xmal_F(SEQ ID NO:28) [0359] GATCCCCGGGCACACTCTCTACGCCCCAGGCG [0360] (15)NcVV-LOV_XmaI_R(SEQ ID NO:29) [0361] GATCCCCGGGTTCGGTTTCGCACTGAAAACCCATGCT [0362] (16)VfAU1-LOV_Agel_F(SEQ ID NO:30) [0363] GATCACCGGTCCTGACTACAGTCTCGTGAAGG [0364] (17)VfAU1-LOV_Xmal_R(SEQ ID NO:31) [0365] GATCCCCGGGCTTTCTGCGCAGCATGTTACTGG [0366] (18)Opto-mFGFR1_YY271/2FF_F(SEQ ID NO:32) [0367] GAGACATTCATCATATCGACTTCTTCAAGAAAACCACCAACGGCC [0368] (19)Opto-mFGFR1_YY271/2FF_R(SEQ ID NO:33) [0369] GGCCGTTGGTGGTTTTCTTGAAGAAGTCGATATGATGAATGTCTC [0370] (20)Opto-mFGFR1_R195E_F(SEQ ID NO:34) [0371] TACAGGCCCGGGAGCCTCCTGGGCTGGAGTACTGCTATAA [0372] (21)Opto-mFGFR1_R195E_R(SEQ ID NO:35) [0373] TTATAGCAGTACTCCAGCCCAGGAGGCTCCCGGGCCTGTA [0374] (22)Opto-mFGFR1_I472V_F(SEQ ID NO:36) [0375] CTCCCAGACAACCCTGTCGTCTACGCCAGTAG [0376] (23)Opto-mFGFR1_I472V_R(SEQ ID NO:37) [0377] CTACTGGCGTAGACGACAGGGTTGTCTGGGAG [0378] (24)VfAU1-LOV_BgIII_F(SEQ ID NO:38) [0379] CTTTAGATCTCCTGACTACAGTCTCGTGAAGG [0380] (25)VfAU1-LOV_EcoRI_R(SEQ ID NO:39) [0381] CTTTGAATTCCTTTCTGCGCAGCATGTTACTG [0382] (26)mFGFR1_inverse_R(SEQ ID NO:40) [0383] GATCCACCGGTGACGTCGAGGCGCTGGCTGG [0384] (27)Opto-mFGFR1_inverse_F(SEQ ID NO:41) [0385] GATCCACCGGTGGACCTGACTACAGTCTCGTGAAG [0386] (28)imFGFR1_inverse_F(SEQ ID NO:42) [0387] GATCCACCGGTGGAAAACTGGAAGTCGAGGGAGTG [0388] (29)hEGFR_Agel_Ascl_F(SEQ ID NO:43) [0389] GATCACCGGTGGCGCGCCCGAAGGCGCCACATCGTTC [0390] (30)hEGFR_ICD_BspEI_R(SEQ ID NO:44) [0391] GATCTCCGGATGCTCCAATAAATTCACTGCTTTG [0392] (31)hRET_ICD_Agel_F(SEQ ID NO:45) [0393] GATCACCGGTCACTGCTACCACAAGTTTGCC [0394] (32)hRET_ICD_Agel_R(SEQ ID NO:46) [0395] GATCACCGGTGAATCTAGTAAATGCATG [0396] (33)LNGFR_ECD_NotI_F(SEQ ID NO:47) [0397] GATCGCGGCCGCACCATGGGGGCAGGTGCCACC [0398] (34)LNGFR_ECD_Ascl_R(SEQ ID NO:48) [0399] GATCGGCGCGCCC CCTCTTGAAGGCTATGTAGGCC [0400] (35)SyCP1-PHY_F_Xmal(SEQ ID NO:61) [0401] GATCCCCGGGGCAACTACTGTTCAACTGTCTGATCAATCTCTG [0402] (36)SyCP1-PHY_R_Xmal(SEQ ID NO:62) [0403] GATCCCCGGGTTCTTCAGCTTGGCGCAGAATCAGGTT [0404] (37)redOpto-mFGFR1_inverse_F(SEQ ID NO:70) [0405] GATCCACCGGTGGAGCAACTACTGTTCAACTGTCTG [0406] (38)rtrkB_ICD_BspEl_F(SEQ ID NO:71) [0407] GATCTCCGGAAAGTTTGGCATGAAAG [0408] (39)rtrkB_ICD_Agel_R(SEQ ID NO：72) [0409] CAGAAACCGGTGCCTAGGATGTCCAG [0410] 密码子优化的LOV结构域的DNA序列 [0411] AtPH1-LOV2(SEQ ID NO:49) [0412] GAAAGCGTTGATGATAAGGTCAGACAGAAGGAAATGAGAAAGGGAATCGATCTCGCAACAACACTCGAAAGAATAGAAAAGAACTTTGTGATTACTGACCCTAGGCTCCCCGATAATCCCATAATCTTCGCTTCAGACAGTTTCCTGGAGCTGACAGAGTATAGCCGGGAAGAGATCCTGGGTAGAAATTGCAGATTCCTGCAGGGACCCGAGACAGACCTGACCACCGTGAAGAAGATTCGCAATGCTATCGATAATCAAACCGAGGTTACCGTGCAACTGATAAACTACACTAAAAGCGGCAAGAAGTTCTGGAACATTTTCCACCTGCAGCCTATGCGGGACCAGAAGGGTGAGGTCCAATATTTCATCGGGGTGCAGCTGGATGGCAGCAAGCACGTTGAGCCCGTGCGG [0413] AtPH2-LOV2(SEQ ID NO:50) [0414] GATTCTTGGGATCTGAGTGATAGGGAAAGGGATATTAGACAGGGAATAGACCTCGCCACCACCCTGGAAAGAATTGAAAAGAATTTCGTGATCAGCGACCCTAGACTGCCCGACAATCCAATCATTTTCGCCTCTGACTCTTTTCTGGAGCTGACCGAATACTCACGCGAAGAAATCCTGGGAAGGAACTGTAGGTTCCTGCAAGGACCCGAAACCGACCAGGCCACTGTCCAGAAGATTCGCGATGCCATCCGGGACCAGCGGGAAATTACCGTTCAACTGATCAACTATACCAAATCTGGTAAGAAGTTTTGGAACCTGTTCCACCTCCAGCCTATGCGGGAGCAAAAGGGCGAACTGCAATATTTCATCGGGGTGCAGCTGGACGGGTCAGATCATGTCGAGCCACTCCAG [0415] CrPH-LOV1(SEQ ID NO:51) [0416] GCAGGACTGAGACATACATTTGTGGTGGCTGATGCAACACTCCCTGATTGCCCACTGGTCTATGCAAGTGAGGGCTTCTACGCAATGACCGGATATGGACGTGACGAAGTGCTGGGTCAGAACTGTAGGTTTCTGCAGGGTGAGGGAACTGAGCCCAAGGAAGTGCAGAAAATTCGCGACGCCATCAAGAAGGGTGAGGCTTGTAGTGTGCGCCTCCTGAACTATCGGAAGGACGGCACTCCCTTCTGGAACCTGCTGACAGTCACCCCAATTAAAACCCCTGATGGCCGCGTGTCCAAGTTTGTCGGCGTGCAGGTGGATGTTACCTCCAAGACTGAAGGGAAAGCCCTGGCC [0417] NcVV-LOV(SEQ ID NO:52) [0418] CACACTCTCTACGCCCCAGGCGGGTACGATATTATGGGCTGGCTGATCCAGATCATGAACAGGCCCAATCCCCAGGTCGAGCTGGGACCCGTGGATACTTCATGTGCACTGATACTGTGCGACCTGAAGCAGAAGGATACACCTATAGTTTACGCTTCAGAAGCCTTTCTGTACATGACAGGGTATTCTAACGCCGAGGTGCTGGGGAGGAACTGTAGGTTCCTCCAGAGTCCCGATGGTATGGTGAAACCTAAGAGTACTCGCAAATATGTGGATAGCAATACTATTAACACCATGAGGAAAGCCATCGACAGAAACGCAGAAGTTCAGGTGGAAGTGGTGAACTTTAAGAAGAACGGCCAGCGGTTCGTGAACTTTCTCACAATGATTCCAGTGCGGGACGAAACCGGGGAGTACCGGTACAGCATGGGTTTTCAGTGCGAAACCGAA[0419] VfAU1-LOV(SEQ ID NO:53) [0420] CCTGACTACAGTCTCGTGAAGGCTCTGCAAATGGCACAACAGAATTTTGTCATTACAGACGCCTCCCTCCCAGACAACCCTATCGTCTACGCCAGTAGAGGGTTTCTGACACTGACAGGCTATTCTCTCGACCAGATCCTGGGCAGGAACTGCAGGTTTCTGCAAGGGCCAGAAACAGACCCAAGAGCTGTGGATAAGATCAGGAATGCCATCACCAAAGGCGTTGATACCAGTGTCTGTCTGCTGAATTATAGACAGGATGGCACAACCTTCTGGAATCTCTTCTTCGTGGCTGGACTCAGAGATTCTAAGGGCAATATTGTCAACTACGTCGGAGTGCAGTCAAAGGTGAGCGAAGATTATGCCAAGCTGCTGGTCAACGAGCAGAACATTGAGTACAAAGGTGTGCGCACCAGTAACATGCTGCGCAGAAAG [0421] NgPA1-LOV(SEQ ID NO:54) [0422] CCAGATTATACACTCGTTAAAGCACTGCAAACTGCTCAGCAGAATTTTGTGATCACCGACCCTACTCTGCCAGACAACCCCATTGTCTATGCTTCAGGAGGATTTCTCAGTCTCACAGGTTACCAGATGGATCAGATCCTGGGAAGAAATTGCAGATTTCTGCAAGGACCTGATACTGACCCAGCTGCCGTGGACAAGATCAGAAGGGCTATCGAAGATGGTACAGACGGCAGTGTCTGTCTGCTGAACTACAGAGCAGATGGATCTACCTTTTGGAATCAATTCTTCATTGCTGCTCTCAGAGGCGCTGACGGAAATATCGTCAACTATGTCGGAGTGCAGTGTAAAGTGTCAGAGGAGTATGCTTCAGAAGTCCTCAAGAAGGAGGCTACTTCATCCACTGTGGCTGAAGCAAGTAGCAAAAGA [0423] OdPA1-LOV(SEQ ID NO:55) [0424] CCTGACTACAGTCTGGTTAAAGCACTCCAAACAGCACAGCAGAATTTCGTTATCTCTGACCCTAGCATTCCTGATAATCCCATTGTGTATGCTAGTCAGGGATTTCTGACACTCACCGGATACGCACTGAGCGAGGTTCTCGGACGGAACTGCCGGTTCCTCCAAGGACCAGAAACAGACCCTAAAGCCGTCGAGAAAGTGAGAAAGGGTCTGGAGAGAGGTGAAGATACCACCGTGGTGCTCCTGAATTATAGGAAAGATGGAAGCACCTTCTGGAACCAACTGTTCATTGCTGCCCTGCGGGATGGTGAGGGCAATGTGGTTAACTACCTCGGAGTTCAGTGCAAAGTCTCCGAGGACTACGCCAAAGCCTTTCTGAAGAATGAAGAGAACGAGAAA [0425] mFGFR1变体的蛋白质序列。 [0426] miFGFR1(SEQ ID NO:56) [0427] MGSSKSKPKDPSQRLDMKSGTKKSDFHSQMAVHKLAKSIPLRRQVTVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSEYELPEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATEKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSIPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPTQLANSGLKRRVETGKLEVEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDYPYDVPDYALD [0428] miFGFR1-ΔFKBP(SEQ ID NO:57) [0429] MGSSKSKPKDPSQRLDMKSGTKKSDFHSQMAVHKLAKSIPLRRQVTVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSEYELPEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATEKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSIPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPTQLANSGLKRRVETGGSGVDYPYDVPDYALD [0430] mFGFR1-VfAU1-LOV(SEQ ID NO:58) [0431] MGSSKSKPKDPSQRLDMKSGTKKSDFHSQMAVHKLAKSIPLRRQVTVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSEYELPEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATEKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFCVLLWEIFTLGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSIPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPTQLANSGLKRRVETGPDYSLVKALQMAQQNFVITDASLPDNPIVYASRGFLTLTGYSLDQILGRNCRFLQGPETDPRAVDKIRNAITKGVDTSVCLLNYRQDGTTFWNLFFVAGLRDSKGNIVNYVGVQSKVSEDYAKLLVNEQNIEYKGVRTSNMLRRKTGGSGVDYPYDVPDYALD[0432] p75-hEGFR-VfAU1-LOV(SEQ ID NO:59) [0433] MGAGATGRAMDGPRLLLLLLLGVSLGGAKEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDNLIPVYCSILAAVVVGLVAYIAFKRGRARRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGASGGPDYSLVKALQMAQQNFVITDASLPDNPIVYASRGFLTLTGYSLDQILGRNCRFLQGPETDPRAVDKIRNAITKGVDTSVCLLNYRQDGTTFWNLFFVAGLRDSKGNIVNYVGVQSKVSEDYAKLLVNEQNIEYKGVRTSNMLRRKPGGSGVDYPYDVPDYALD[0434] hRET-VfAU1-LOV(SEQ ID NO:60) [0435] MGSSKSKPKDPSQRLDVTGHCYHKFAHKPPISSAEMTFRRPAQAFPVSYSSSSARRPSLDSMENQVSVDAFKILEDPKWEFPRKNLVLGKTLGEGEFGKVVKATAFHLKGRAGYTTVAVKMLKENASPSELRDLLSEFNVLKQVNHPHVIKLYGACSQDGPLLLIVEYAKYGSLRGFLRESRKVGPGYLGSGGSRNSSSLDHPDERALTMGDLISFAWQISQGMQYLAEMKLVHRDLAARNILVAEGRKMKISDFGLSRDVYEEDSYVKRSQGRIPVKWMAIESLFDHIYTTQSDVWSFGVLLWEIVTLGGNPYPGIPPERLFNLLKTGHRMERPDNCSEEMYRLMLQCWKQEPDKRPVFADISKDLEKMMVKRRDYLDLAASTPSDSLIYDDGLSEEETPLVDCNNAPLPRALPSTWIENKLYGRISHAFTRFTGGPDYSLVKALQMAQQNFVITDASLPDNPIVYASRGFLTLTGYSLDQILGRNCRFLQGPETDPRAVDKIRNAITKGVDTSVCLLNYRQDGTTFWNLFFVAGLRDSKGNIVNYVGVQSKVSEDYAKLLVNEQNIEYKGVRTSNMLRRKPGGSGVDYPYDVPDYALD[0436] 百分比同一性表 [0437]VfAU1-LOV NgPA1-LOV OdPA1-LOV VfAU1-LOV 100％ 75％ 73％ NgPA1-LOV 75％ 100％ 73％ OdPA1-LOV 73％ 73％ 100％ [0438] 全长蛋白质和PHY结构域的蛋白质序列。在括号中给出Uniprot标示符。 [0439] SyCP1(Q55168)(SEQ ID NO:63): [0440] MATTVQLSDQSLRQLETLAIHTAHLIQPHGLVVVLQEPDLTISQISANCTGILGRSPEDLLGRTLGEVFDSFQIDPIQSRLTAGQISSLNPSKLWARVMGDDFVIFDGVFHRNSDGLLVCELEPAYTSDNLPFLGFYHMANAALNRLRQQANLRDFYDVIVEEVRRMTGFDRVMLYRFDENNHGDVIAEDKRDDMEPYLGLHYPESDIPQPARRLFIHNPIRVIPDVYGVAVPLTPAVNPSTNRAVDLTESILRSAYHCHLTYLKNMGVGASLTISLIKDGHLWGLIACHHQTPKVIPFELRKACEFFGRVVFSNISAQEDTETFDYRVQLAEHEAVLLDKMTTAADFVEGLTNHPDRLLGLTGSQGAAICFGEKLILVGETPDEKAVQYLLQWLENREVQDVFFTSSLSQIYPDAVNFKSVASGLLAIPIARHNFLLWFRPEVLQTVNWGGDPNHAYEATQEDGKIELHPRQSFDLWKEIVRLQSLPWQSVEIQSALALKKAIVNLILRQAEELAQLARNLERSNADLKKFAYIASHDLQEPLNQVSNYVQLLEMRYSEALDEDAKDFIDFAVTGVSLMQTLIDDILTYAKVDTQYAQLTFTDVQEVVDKALANLKQRIEESGAEIEVGSMPAVMADQIQLMQVFQNLIANGIKFAGDKSPKIKIWGDRQEDAWVFAVQDNGIGIDPQFFERIFVIFQRLHTRDEYKGTGMGLAICKKIIEGHQGQIWLESNPGEGSTFYFSIPIGN [0441] SyCP1-PHY(SEQ ID NO:64): [0442] ATTVQLSDQSLRQLETLAIHTAHLIQPHGLVVVLQEPDLTISQISANCTGILGRSPEDLLGRTLGEVFDSFQIDPIQSRLTAGQISSLNPSKLWARVMGDDFVIFDGVFHRNSDGLLVCELEPAYTSDNLPFLGFYHMANAALNRLRQQANLRDFYDVIVEEVRRMTGFDRVMLYRFDENNHGDVIAEDKRDDMEPYLGLHYPESDIPQPARRLFIHNPIRVIPDVYGVAVPLTPAVNPSTNRAVDLTESILRSAYHCHLTYLKNMGVGASLTISLIKDGHLWGLIACHHQTPKVIPFELRKACEFFGRVVFSNISAQEDTETFDYRVQLAEHEAVLLDKMTTAADFVEGLTNHPDRLLGLTGSQGAAICFGEKLILVGETPDEKAVQYLLQWLENREVQDVFFTSSLSQIYPDAVNFKSVASGLLAIPIARHNFLLWFRPEVLQTVNWGGDPNHAYEATQEDGKIELHPRQSFDLWKEIVRLQSLPWQSVEIQSALALKKAIVNLILRQAEE [0443] 密码子优化的PHY结构域的DNA序列。 [0444] SyCP1-PHY(SEQ ID NO:65): [0445] GCAACTACTGTTCAACTGTCTGATCAATCTCTGCGTCAACTGGAAACTCTGGCTATCCACACCGCGCATCTGATCCAGCCGCACGGTCTGGTAGTCGTCCTGCAAGAACCGGACCTGACCATCAGCCAGATCTCTGCGAACTGTACCGGTATCCTGGGCCGTAGCCCGGAAGATCTGCTGGGTCGTACTCTGGGCGAGGTATTCGATTCTTTTCAGATTGATCCGATCCAGTCTCGTCTGACCGCAGGTCAGATTTCCAGCCTGAACCCGTCCAAGCTGTGGGCGCGTGTTATGGGTGACGACTTTGTTATTTTCGACGGCGTATTTCATCGTAACTCTGATGGCCTGCTGGTTTGCGAGCTGGAGCCGGCCTACACTAGCGACAACCTGCCTTTCCTGGGTTTCTACCATATGGCAAACGCGGCACTGAACCGTCTGCGTCAGCAAGCTAACCTGCGCGACTTCTACGACGTTATCGTTGAGGAAGTGCGCCGCATGACGGGTTTCGACCGCGTCATGCTGTACCGTTTTGATGAAAACAACCACGGTGACGTAATCGCGGAGGATAAGCGTGACGACATGGAGCCGTATCTGGGTCTGCACTACCCGGAAAGCGACATTCCTCAGCCGGCACGTCGCCTGTTCATTCACAACCCGATCCGTGTTATTCCGGACGTTTACGGCGTTGCTGTTCCGCTGACTCCGGCCGTTAATCCGTCTACTAACCGTGCAGTTGACCTGACCGAATCCATCCTGCGTTCCGCATACCATTGCCACCTGACCTATCTGAAGAACATGGGCGTTGGTGCTAGCCTGACGATCTCTCTGATTAAAGATGGTCACCTGTGGGGTCTGATCGCTTGCCATCACCAGACCCCGAAAGTAATCCCTTTCGAACTGCGTAAAGCCTGCGAATTCTTCGGTCGTGTGGTGTTCTCTAATATCTCCGCGCAAGAAGACACCGAGACTTTTGACTACCGCGTACAGCTGGCGGAGCATGAAGCGGTTCTGCTGGACAAAATGACCACCGCGGCAGACTTCGTGGAGGGCCTGACTAACCACCCAGACCGTCTGCTGGGCCTGACCGGCAGCCAAGGCGCTGCGATTTGTTTCGGCGAGAAACTGATTCTGGTGGGCGAAACCCCAGACGAAAAGGCGGTGCAATACCTGCTGCAATGGCTGGAGAATCGCGAAGTGCAGGACGTTTTCTTCACTAGCTCTCTGTCTCAGATCTATCCGGATGCGGTTAACTTCAAAAGCGTGGCGTCCGGCCTGCTGGCTATCCCGATCGCCCGTCATAACTTTCTGCTGTGGTTCCGCCCGGAGGTTCTGCAGACCGTTAATTGGGGTGGTGATCCGAATCACGCATACGAAGCAACCCAAGAAGATGGTAAGATCGAACTGCATCCGCGTCAGTCCTTCGATCTGTGGAAAGAAATTGTTCGCCTGCAGAGCCTGCCGTGGCAGAGCGTTGAGATCCAGTCTGCCCTGGCTCTGAAGAAAGCAATCGTGAACCTGATTCTGCGCCAAGCTGAAGAA [0446] 全长融合蛋白的蛋白质序列。 [0447] redOpto-mFGFR1(SEQ ID NO:66) [0448] MGSSKSKPKDPSQRLDMKSGTKKSDFHSQMAVHKLAKSIPLRRQVTVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSEYELPEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATEKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSIPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPTQLANSGLKRRVETGATTVQLSDQSLRQLETLAIHTAHLIQPHGLVVVLQEPDLTISQISANCTGILGRSPEDLLGRTLGEVFDSFQIDPIQSRLTAGQISSLNPSKLWARVMGDDFVIFDGVFHRNSDGLLVCELEPAYTSDNLPFLGFYHMANAALNRLRQQANLRDFYDVIVEEVRRMTGFDRVMLYRFDENNHGDVIAEDKRDDMEPYLGLHYPESDIPQPARRLFIHNPIRVIPDVYGVAVPLTPAVNPSTNRAVDLTESILRSAYHCHLTYLKNMGVGASLTISLIKDGHLWGLIACHHQTPKVIPFELRKACEFFGRVVFSNISAQEDTETFDYRVQLAEHEAVLLDKMTTAADFVEGLTNHPDRLLGLTGSQGAAICFGEKLILVGETPDEKAVQYLLQWLENREVQDVFFTSSLSQIYPDAVNFKSVASGLLAIPIARHNFLLWFRPEVLQTVNWGGDPNHAYEATQEDGKIELHPRQSFDLWKEIVRLQSLPWQSVEIQSALALKKAIVNLILRQAEETGGSGVDYPYDVPDYALD [0449] redOpto-rtrkB(SEQ ID NO:67) [0450] MGSSKSKPKDPSQRLDVTGKLARHSKFGMKGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQYFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHTRKNIKNIHTLLQNLAKASPVYLDILGTGGATTVQLSDQSLRQLETLAIHTAHLIQPHGLVVVLQEPDLTISQISANCTGILGRSPEDLLGRTLGEVFDSFQIDPIQSRLTAGQISSLNPSKLWARVMGDDFVIFDGVFHRNSDGLLVCELEPAYTSDNLPFLGFYHMANAALNRLRQQANLRDFYDVIVEEVRRMTGFDRVMLYRFDENNHGDVIAEDKRDDMEPYLGLHYPESDIPQPARRLFIHNPIRVIPDVYGVAVPLTPAVNPSTNRAVDLTESILRSAYHCHLTYLKNMGVGASLTISLIKDGHLWGLIACHHQTPKVIPFELRKACEFFGRVVFSNISAQEDTETFDYRVQLAEHEAVLLDKMTTAADFVEGLTNHPDRLLGLTGSQGAAICFGEKLILVGETPDEKAVQYLLQWLENREVQDVFFTSSLSQIYPDAVNFKSVASGLLAIPIARHNFLLWFRPEVLQTVNWGGDPNHAYEATQEDGKIELHPRQSFDLWKEIVRLQSLPWQSVEIQSALALKKAIVNLILRQAEEPGGSGVDYPYDVPDYALD [0451] 全长融合蛋白的蛋白质序列。 [0452] redOpto-mFGFR1(SEQ ID NO:68) [0453]ATGGGGAGTAGCAAGAGCAAGCCTAAGGACCCCAGCCAGCGCCTCGACATGAAGAGCGGCACCAAGAAGAGCGACTTCCATAGCCAGATGGCTGTGCACAAGCTGGCCAAGAGCATCCCTCTGCGCAGACAGGTAACAGTGTCAGCTGACTCCAGTGCATCCATGAACTCTGGGGTTCTCCTGGTTCGGCCCTCACGGCTCTCCTCCAGCGGGACCCCCATGCTGGCTGGAGTCTCCGAATATGAGCTCCCTGAGGATCCCCGCTGGGAGCTGCCACGAGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCACTTGGCGAGGGCTGCTTCGGGCAGGTGGTGTTGGCTGAGGCCATCGGGCTGGATAAGGACAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGGCCGTGAAGATGTTGAAGTCCGACGCAACGGAGAAGGACCTGTCGGATCTGATCTCGGAGATGGAGATGATGAAAATGATTGGGAAGCACAAGAATATCATCAACCTTCTGGGAGCGTGCACACAGGATGGTCCTCTTTATGTCATTGTGGAGTACGCCTCCAAAGGCAATCTCCGGGAGTATCTACAGGCCCGGAGGCCTCCTGGGCTGGAGTACTGCTATAACCCCAGCCACAACCCCGAGGAACAGCTGTCTTCCAAAGATCTGGTATCCTGTGCCTATCAGGTGGCTCGGGGCATGGAGTATCTTGCCTCTAAGAAGTGTATACACCGAGACCTGGCTGCTAGGAACGTCCTGGTGACCGAGGATAACGTAATGAAGATCGCAGACTTTGGCTTAGCTCGAGACATTCATCATATCGACTACTACAAGAAAACCACCAACGGCCGGCTGCCTGTGAAGTGGATGGCCCCTGAGGCGTTGTTTGACCGGATCTACACACACCAGAGCGATGTGTGGTCTTTTGGAGTGCTCTTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGTGGCTCCCCATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGGTCATCGAATGGACAAGCCCAGTAACTGTACCAATGAGCTGTACATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCTCAGAGACCTACGTTCAAGCAGTTGGTGGAAGACCTGGACCGCATTGTGGCCTTGACCTCCAACCAGGAGTATCTGGACCTGTCCATACCGCTGGACCAGTACTCACCCAGCTTTCCCGACACACGGAGCTCCACCTGCTCCTCAGGGGAGGACTCTGTCTTCTCTCATGAGCCGTTACCTGAGGAGCCCTGTCTGCCTCGACACCCCACCCAGCTTGCCAACAGTGGACTCAAACGGCGCGTCGAGACCGGgGCAACTACTGTTCAACTGTCTGATCAATCTCTGCGTCAACTGGAAACTCTGGCTATCCACACCGCGCATCTGATCCAGCCGCACGGTCTGGTAGTCGTCCTGCAAGAACCGGACCTGACCATCAGCCAGATCTCTGCGAACTGTACCGGTATCCTGGGCCGTAGCCCGGAAGATCTGCTGGGTCGTACTCTGGGCGAGGTATTCGATTCTTTTCAGATTGATCCGATCCAGTCTCGTCTGACCGCAGGTCAGATTTCCAGCCTGAACCCGTCCAAGCTGTGGGCGCGTGTTATGGGTGACGACTTTGTTATTTTCGACGGCGTATTTCATCGTAACTCTGATGGCCTGCTGGTTTGCGAGCTGGAGCCGGCCTACACTAGCGACAACCTGCCTTTCCTGGGTTTCTACCATATGGCAAACGCGGCACTGAACCGTCTGCGTCAGCAAGCTAACCTGCGCGACTTCTACGACGTTATCGTTGAGGAAGTGCGCCGCATGACGGGTTTCGACCGCGTCATGCTGTACCGTTTTGATGAAAACAACCACGGTGACGTAATCGCGGAGGATAAGCGTGACGACATGGAGCCGTATCTGGGTCTGCACTACCCGGAAAGCGACATTCCTCAGCCGGCACGTCGCCTGTTCATTCACAACCCGATCCGTGTTATTCCGGACGTTTACGGCGTTGCTGTTCCGCTGACTCCGGCCGTTAATCCGTCTACTAACCGTGCAGTTGACCTGACCGAATCCATCCTGCGTTCCGCATACCATTGCCACCTGACCTATCTGAAGAACATGGGCGTTGGTGCTAGCCTGACGATCTCTCTGATTAAAGATGGTCACCTGTGGGGTCTGATCGCTTGCCATCACCAGACCCCGAAAGTAATCCCTTTCGAACTGCGTAAAGCCTGCGAATTCTTCGGTCGTGTGGTGTTCTCTAATATCTCCGCGCAAGAAGACACCGAGACTTTTGACTACCGCGTACAGCTGGCGGAGCATGAAGCGGTTCTGCTGGACAAAATGACCACCGCGGCAGACTTCGTGGAGGGCCTGACTAACCACCCAGACCGTCTGCTGGGCCTGACCGGCAGCCAAGGCGCTGCGATTTGTTTCGGCGAGAAACTGATTCTGGTGGGCGAAACCCCAGACGAAAAGGCGGTGCAATACCTGCTGCAATGGCTGGAGAATCGCGAAGTGCAGGACGTTTTCTTCACTAGCTCTCTGTCTCAGATCTATCCGGATGCGGTTAACTTCAAAAGCGTGGCGTCCGGCCTGCTGGCTATCCCGATCGCCCGTCATAACTTTCTGCTGTGGTTCCGCCCGGAGGTTCTGCAGACCGTTAATTGGGGTGGTGATCCGAATCACGCATACGAAGCAACCCAAGAAGATGGTAAGATCGAACTGCATCCGCGTCAGTCCTTCGATCTGTGGAAAGAAATTGTTCGCCTGCAGAGCCTGCCGTGGCAGAGCGTTGAGATCCAGTCTGCCCTGGCTCTGAAGAAAGCAATCGTGAACCTGATTCTGCGCCAAGCTGAAGAAcCCGGTGGATCCGGAGTCGACTATCCGTACGACGTACCAGACTACGCACTCGACTAA [0454] redOpto-rtrkB(SEQ ID NO:69) [0455]ATGGGGAGTAGCAAGAGCAAGCCTAAGGACCCCAGCCAGCGCCTCGACGTCACCGGAAAGTTGGCGAGACATTCCAAGTTTGGCATGAAAGGCCCAGCTTCCGTCATCAGCAACGACGATGACTCTGCCAGCCCTCTCCACCACATCTCCAACGGGAGCAACACTCCGTCTTCTTCGGAGGGCGGGCCCGATGCTGTCATCATTGGGATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAACCCCCAGTACTTCGGTATCACCAACAGCCAGCTCAAGCCGGACACATTTGTTCAGCACATCAAGAGACACAACATCGTTCTGAAGAGGGAGCTTGGAGAAGGAGCCTTTGGGAAAGTTTTCCTAGCGGAGTGCTATAACCTCTGCCCCGAGCAGGATAAGATCCTGGTGGCCGTGAAGACGCTGAAGGACGCCAGCGACAATGCTCGCAAGGACTTTCATCGCGAAGCCGAGCTGCTGACCAACCTCCAGCACGAGCACATTGTCAAGTTCTACGGTGTCTGTGTGGAGGGCGACCCACTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCACGGGGACCTCAACAAGTTCCTTAGGGCACACGGGCCAGATGCAGTGCTGATGGCAGAGGGTAACCCGCCCACCGAGCTGACGCAGTCGCAGATGCTGCACATCGCTCAGCAAATCGCAGCAGGCATGGTCTACCTGGCATCCCAACACTTCGTGCACCGAGACCTGGCCACCCGGAACTGCTTGGTAGGAGAGAACCTGCTGGTGAAAATTGGGGACTTCGGGATGTCCCGGGATGTATACAGCACCGACTACTACCGGGTTGGTGGCCACACAATGTTGCCCATCCGATGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCACCACCGAGAGTGACGTCTGGAGCCTGGGAGTTGTGTTGTGGGAGATCTTCACCTACGGCAAGCAGCCCTGGTATCAGCTATCAAACAACGAGGTGATAGAATGCATCACCCAGGGCAGAGTCCTTCAGCGGCCTCGCACGTGTCCCCAGGAGGTGTACGAGCTGATGCTGGGATGCTGGCAGCGGGAACCACACACAAGGAAGAACATCAAGAACATCCACACACTCCTTCAGAACTTGGCGAAGGCGTCGCCCGTCTACCTGGACATCCTAGGCACCGGTGGAGCAACTACTGTTCAACTGTCTGATCAATCTCTGCGTCAACTGGAAACTCTGGCTATCCACACCGCGCATCTGATCCAGCCGCACGGTCTGGTAGTCGTCCTGCAAGAACCGGACCTGACCATCAGCCAGATCTCTGCGAACTGTACCGGTATCCTGGGCCGTAGCCCGGAAGATCTGCTGGGTCGTACTCTGGGCGAGGTATTCGATTCTTTTCAGATTGATCCGATCCAGTCTCGTCTGACCGCAGGTCAGATTTCCAGCCTGAACCCGTCCAAGCTGTGGGCGCGTGTTATGGGTGACGACTTTGTTATTTTCGACGGCGTATTTCATCGTAACTCTGATGGCCTGCTGGTTTGCGAGCTGGAGCCGGCCTACACTAGCGACAACCTGCCTTTCCTGGGTTTCTACCATATGGCAAACGCGGCACTGAACCGTCTGCGTCAGCAAGCTAACCTGCGCGACTTCTACGACGTTATCGTTGAGGAAGTGCGCCGCATGACGGGTTTCGACCGCGTCATGCTGTACCGTTTTGATGAAAACAACCACGGTGACGTAATCGCGGAGGATAAGCGTGACGACATGGAGCCGTATCTGGGTCTGCACTACCCGGAAAGCGACATTCCTCAGCCGGCACGTCGCCTGTTCATTCACAACCCGATCCGTGTTATTCCGGACGTTTACGGCGTTGCTGTTCCGCTGACTCCGGCCGTTAATCCGTCTACTAACCGTGCAGTTGACCTGACCGAATCCATCCTGCGTTCCGCATACCATTGCCACCTGACCTATCTGAAGAACATGGGCGTTGGTGCTAGCCTGACGATCTCTCTGATTAAAGATGGTCACCTGTGGGGTCTGATCGCTTGCCATCACCAGACCCCGAAAGTAATCCCTTTCGAACTGCGTAAAGCCTGCGAATTCTTCGGTCGTGTGGTGTTCTCTAATATCTCCGCGCAAGAAGACACCGAGACTTTTGACTACCGCGTACAGCTGGCGGAGCATGAAGCGGTTCTGCTGGACAAAATGACCACCGCGGCAGACTTCGTGGAGGGCCTGACTAACCACCCAGACCGTCTGCTGGGCCTGACCGGCAGCCAAGGCGCTGCGATTTGTTTCGGCGAGAAACTGATTCTGGTGGGCGAAACCCCAGACGAAAAGGCGGTGCAATACCTGCTGCAATGGCTGGAGAATCGCGAAGTGCAGGACGTTTTCTTCACTAGCTCTCTGTCTCAGATCTATCCGGATGCGGTTAACTTCAAAAGCGTGGCGTCCGGCCTGCTGGCTATCCCGATCGCCCGTCATAACTTTCTGCTGTGGTTCCGCCCGGAGGTTCTGCAGACCGTTAATTGGGGTGGTGATCCGAATCACGCATACGAAGCAACCCAAGAAGATGGTAAGATCGAACTGCATCCGCGTCAGTCCTTCGATCTGTGGAAAGAAATTGTTCGCCTGCAGAGCCTGCCGTGGCAGAGCGTTGAGATCCAGTCTGCCCTGGCTCTGAAGAAAGCAATCGTGAACCTGATTCTGCGCCAAGCTGAAGAAcCCGGTGGATCCGGAGTCGACTATCCGTACGACGTACCAGACTACGCACTCGACTAA具体实施方式 [0456] 实施例 [0457] 材料和方法 [0458] mFGFR1受体构建物 [0459] pSH1/M-FGFR1-Fv-Fvls-E(D.M.Spencer，Baylor College of Medicine；(Welm，Freeman等人2002))获自Addgene(Cambridge，MA)。使用PCR和XhoI和BamHI限制性内切酶(寡核苷酸(1)和(2)，SEQ ID NO：15和16)，将位于豆蔻酰化结构域、两个FKBP结构域和血细胞凝集素表位侧面的mFGFR1的细胞内片段从pSH1/M-FGFR1-Fv-Fvls-E转移至pcDNA3.1(-)(Invitrogen/LifeTech，Vienna，Austria)。使用反向PCR，删除单一或两个FKBP结构域，以产生构建物miFGFR1和miFGFR1-ΔFKBP。在该反应中，使用寡核苷酸3和4或3和5(分别为SEQ ID NO：17、18和19)扩增产生线性DNA片段，其中两个或一个FKBP结构域被端AgeI限制位点置换。将线性产物用AgeI消化，连接，并直接转化到制造用的大肠杆菌(E.coli)细菌中。该反应还在miFGFR1-ΔFKBP中引入了AgeI限制位点，其用于LOV结构域插入(参见下文)。作为额外的对照，使用PCR和AgeI和XmaI限制性内切酶(寡核苷酸6和7；SEQ ID NO: 20和21)将一FKBP结构域再插入到miFGFR1-ΔFKBP中。在MAPK激活测定中miFGFR1和miFGFR1-ΔFKBP-FKBP产生类似的结果，并可互换使用。所有构建物均通过DNA测序验证。 [0460] LOV结构域和嵌合mFGFR1受体 [0461] 根据制造商推荐(Epoch Life Science,Inc.,Missouri City,Texas,USA)合成哺乳动物密码子优化的编码以下的LOV结构域的基因：拟南芥向光素1(AtPH1-LOV2，Uniprot序列O48963的残基449-586)、拟南芥向光素2(AtPH2-LOV2，Uniprot序列P93025的残基363-500)、莱茵衣藻(C.reinhardtii)向光素(CrPH-LOV1，Uniprot序列A8IXU7的残基16-133)、粗糙脉孢菌(N.crassa)vivid(NcVV-LOV，Uniprot序列Q9C3Y6的残基37-186，具有Y50W突变)、V.frigida aureochrome1(VfAU1-LOV，Uniprot序列A8QW55的残基204-348)、N.gaditana假定蛋白质NGA_0015702(NgPA1-LOV，Uniprot序列K8Z861的残基87-228)和O.danica aureochrome1样蛋白质(OdPA1-LOV，Uniprot序列C5NSW6的残基180-312)(另外参见SEQ ID NO:49-55)。使用数据库搜索与VfAU1具有相似性的蛋白质，从the National Center for Biotechnology Information非冗余蛋白质数据库中识别NgPA1-LOV和OdPA1-LOV。 [0462] 使用PCR和AgeI和XmaI限制性内切酶(寡核苷酸8-17，SEQ ID NO:22-31；NgPA1-LOV和OdPA1-LOV合成有限制位点，不使用PCR插入)将LOV结构域插入到miFGFR1-ΔFKBP中。所有构建物均通过DNA测序验证。 [0463] 修饰的Opto-mFGFR1受体 [0464] 使用定点诱变(QuickChangeII定点诱变试剂盒,Agilent,Vienna,Austria；寡核苷酸18-23)，将点置换(YY271FF、R192E和I472V；相对于Opto-mFGFR1的起始蛋氨酸编号)引入到Opto-mFGFR1或redOpto-mFGFR1中(SEQ ID NO: 32-37)。所有构建物均通过DNA测序验证。 [0465] 光激活的VfAU1-LOV转录因子 [0466] 质粒pGAVPO(Y.Yang,East China University of Science and Technology)含有Gal4DNA结合结构域、NcVV-LOV和反式激活结构域(Wang等人2012)(图4b)。pGAVPO的蓝光激活用MAPK路径测定中应用的荧光素酶报道基因质粒检测(参见上文；该质粒含有多个UAS序列)。VfAU1-LOV通过PCR和寡核苷酸24和25(分别为SEQ ID NO:38和39)扩增，并使用BglII和EcoRI限制性内切酶插入到pGAVPO中。构建物通过DNA测序验证。荧光素酶激活实验如上所述进行，不同之处在于mFGFR1质粒用50ng pGAVPO/孔代替。 [0467] Opto-hEGFR1和Opto-hRET [0468] 使用反向PCR，基于imFGFR1-ΔFKBP-FKBP和mFGFR1-VfAU1-LOV制备表达质粒，其中mFGFR1ICD用SgrAI-限制位点取代(寡核苷酸26-28，SEQ ID NO:40-42)。该单一限制位点使得可以插入其他RTK的ICD。使用PCR和AgeI和BspEI限制性内切酶(寡核苷酸29-32，SEQ ID NO:43-46)将hEGFR ICD和hRET ICD插入到该质粒中。EGFR构建物还通过使用PCR和NotI和AscI限制性内切酶(寡核苷酸33和34，SEQ ID NO:47和48)包括p75的LBD和TMD而修饰。所有构建物均通过DNA测序验证。 [0469] PHY结构域和嵌合mFGFR1受体 [0470] 根据供应商推荐(Epoch Life Science,Inc.,Missouri City,Texas,USA)合成哺乳动物密码子优化的编码集胞藻PCC6803CPH1的PHY结构域(SyCP1-PHY，Uniprot序列Q55168的2至514残基)的基因(SEQ ID NO:63-65)。使用PCR和XmaI限制性内切酶(寡核苷酸35和36；SEQ ID NO:61和62)将PHY结构域插入到imFGFR1-ΔFKBP中。构建物通过DNA测序验证，并称作redOpto-mFGFR1。 [0471] redOpto-rtrkB [0472] 使用反向PCR，基于redOpto-mFGFR1制备表达质粒，其中mFGFR1ICD用SgrAI-限制位点取代(寡核苷酸26和37，SEQ ID NO: 40和70)。该单一限制位点使得可以插入其他RTK的ICD。使用PCR和AgeI和BspEI限制性内切酶(寡核苷酸38和39，SEQ ID NO: 71和72)将rtrkB ICD插入到该质粒中。 [0473] 细胞光刺激的定制孵育器 [0474] 对于细胞的光刺激，将孵育器(PT2499,ExoTerra/HAGEN,Holm,Germany)装配有300发光二极管(JS-FS5050RGB-W30，具有JS-CON-004控制器,Komerci,Ebern,Germany；λmax～630nm(红)，λmax～530nm(绿)，λmax～470nm(蓝)，带宽～±5nm)。光强度用模拟调光器控制，并用数字功率表测量(PM120VA,Thorlabs,Munich,Germany)。最大输出的强度为2.3(红色)、2.6(绿色)和3.3(蓝光)W/m2。对于长时间(>8h)刺激，将铝盒装配有相同的发光二极管和控制器，并置于标准组织培养条件的孵育器中(参加下文)。 [0475] 细胞培养物和转染(HEK293和CHO-K1细胞) [0476] 在具有5％CO2气氛的加湿孵育器中将HEK293细胞和CHO-K1(American Type Culture Collection (ATCC),Manassas,VA)保持在补充有10％FBS、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的DMEM中。在胰蛋白酶化后，将5x104细胞接种在覆有聚-L-鸟氨酸(Sigma,Vienna,Austria)的96孔板的每个孔中(各构建物3-4孔)。使用透明板或黑色清底板。细胞使用Lipofectamine 2000(Invitrogen/LifeTech)转染。 [0477] 藻青素孵育 [0478] 在暗室中将藻青素(PCB；Livchem Logistics GmbH,Frankfurt a.M.,Germany)溶解至在DMSO中储液浓度10mM。将等份在-20℃下在暗处储存。实验之前，将细胞在37℃下在还原血清饥饿培养液中与50μM PCB一起孵育过夜。PCB也可以应用于活动物，因为其即使在高剂量下(0.17％饮食或10mg/kg)也无毒(McCarty(2007)。 [0479] LOV结构域表达和细胞增殖测量(HEK293和CHO-K1细胞) [0480] 制备基于pcDNA3.1(-)的表达质粒，其中BspEI-限制位点在荧光蛋白质mVenus(Nagai等人2002)和框内富甘氨酸和丝氨酸的接头之后。使用PCR将LOV结构域插入到该质粒中(参见上文)。所有构建物均通过DNA测序验证。在96孔板的每孔中将细胞用100ng表达质粒转染(每个构建物4孔)。转染之后16-18小时通过在酶标仪(BioTek Synergy H1,Bad Friedrichshall,Germany)中测量mVenus荧光对表达进行评价。用pcDNA3.1(-)或FKBP-mVenus融合蛋白转染作为对照。细胞毒性测量使用四唑染料遵照供应商方案(EZ4U细胞增殖和细胞毒性测定，Biomedica,Vienna,Austria)进行。在相同酶标仪中以620nm参照进行450nm处的吸光度测量，作为荧光测量。 [0481] MAPK信号传导的刺激和检测(HEK293细胞) [0482] MAPK路径的激活用由Elk1依赖于磷酸化的反式激活物和基于荧光素酶的反式报道基因组成的PathDetect Elk1反式报道系统(Agilent)测定。细胞使用Lipofectamine 2000用213.3ng总DNA/孔(受体、反式激活物和反式报道基因比例1:3:60或1:30:600)转染。 转染之后6小时，在37℃下将培养基用不依赖于CO2的还原血清饥饿培养基(Gibco/Life Technologies；补充有0.5％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素)置换 18小时。将细胞转移，在恒定照明下保持8小时，或者保护免于光。在相同过程之后是imFGFR1化学刺激，不同之处在于在转移至刺激孵育器之前加入10nM AP20187((Clackson等人)；ARIAD Pharmaceuticals,Cambridge,MA)。孵育之后，将板用PBS洗涤一次，并用标准的现成试剂检测荧光素酶。这些是与装有注射器的酶标仪(Tecan Infinite 200Pro,Maennedorf,Switzerland)组合的荧光素酶1000测定系统(Promega,Mannheim,Germany)，或者与没有装有注射器的酶标仪(BioTek Synergy H1)组合的ONE-Glo测定系统 (Promega)。这些测定系统提供等同的结果。 [0483] 检测其他的信号传导路径(HEK293细胞) [0484] 其他mFGFR1-相关的信号传导路径的激活用由以下组成的Cignal报道基因测定(Qiagen,Hilden,Germany)来测定：聚焦于诱导型路径的转录因子-响应性萤火虫荧光素酶构建物和组成型表达Renilla荧光素酶构建物的混合物。将细胞使用Lipofectaming 2000用100.3ng总DNA/孔(受体和报道基因比例1:300)转染，之后如上所述进行处理，用于检测MAPK信号传导。将细胞用Dual- 荧光素酶测定系统(Promega)处理，信号用酶标仪检测。 [0485] 产生稳定的Opto-mFGFR1细胞系和病毒构建物 [0486] 将两种恶性胸膜间皮瘤细胞系M38K和SPC212保持在补充有10％FBS的RPMI1640中。将端粒酶永生化的微脉管hBE细胞保持在补充有5％FBS的Clonetics EGM2MV内皮生长培养基(Lonza,Wakersville,MD)中。对于逆转录酶病毒的产生，将Opto-mFGFR1或mCherry作为对照使用EcoRI和NotI限制性内切酶亚克隆到pQCXIP(Clontech,Mountain View,CA)中。通过与辅助质粒pVSV-G和p-gag-pol-gpt共转染在HEK293细胞中产生病毒颗粒。使用上清液转导在6孔板中生长至50％汇合的M38K、SPC212或hBE细胞。将细胞用0.8μg/ml嘌呤霉素选择10天，通过免疫印迹验证转基因表达。 [0487] 刺激和蛋白质印迹(M38K、SPC212和hBE细胞) [0488] 对于免疫印迹，将5x105细胞接种在6孔板的每个孔中。24小时之后，将培养基用还原血清培养基置换(M38K，SPC212)。再过20小时之后，将细胞转移至刺激孵育器，并照明1、5或15分钟，或者屏蔽于光。然后迅即或者再过5、15或30分钟之后将细胞在暗处洗涤，并在冰上在50μl溶解缓冲液/孔中溶解。将溶解物超声，并离心(12000g，5min，4℃)。通过SDS-PAGE分离15μg蛋白质/条带，并将其电印迹到PVDF膜上。将印迹在4℃下在封闭溶液(TBST中3％BSA或5％脱脂奶)中与初级抗体(FGFR1，#9740；Erk1/2，#9102；pERK，#9101；PLCγ1#2822；pPLCγ1#2821；Akt#9272；pAkt#4058S，Cell Signaling Technology,Danvers,MA；稀释1: 1000；FGFRpY653/654，Thermo Scientific,Vienna,Austria,稀释1:1000；β-肌动蛋白，Sigma,稀释1:8000)一起孵育过夜。将二级抗体(HRP-偶联的α-兔或α-抗小鼠IgG,Dako,Glostrup,Denmark)在室温下稀释应用2小时。化学发光用WesternC试剂(Biorad,Hercules,CA)显色，信号在X-射线膜(GE Healthcare)上记录。 [0489] 空间限定的照明实验中的ERK磷酸化(SPC212和hBE细胞) [0490] 对于细胞单层中局部ERK磷酸化的检测，将SPC212或hBE细胞在6-cm皮氏培养皿(SPC212)或12孔板(hBE细胞)中生长至汇合。照明之前将SPC212在无血清的培养基中饥饿24小时。使用具有直径2(SPC212)或5(hBE细胞)mm的针孔的模板用于局部照明5分钟。之后将细胞用冷PBS洗涤，并用Histofix(Lactan,Graz,Austria)固定10分钟。在用PBS洗涤，并用Triton X100(PBST中0.25％)透化，并在PBST中1％BSA中封闭之后，将皿与pERK(#9101，Cell Signaling Technology，1:500用于SPC212，1:100用于hBE细胞)孵育1小时。信号使用UltraVision LP检测系统(Thermo Scientific)显色，3,30-二氨基联苯胺用作发色团。使用苏木精用于细胞核的对比染色。 [0491] 空间限定的照明实验中的活细胞发光(HEK293细胞) [0492] 将3x106细胞同时接种，并在10cm皿中转染。将细胞用Lipofectamine 2000和24μg总DNA/皿(受体、反式激活剂和反式报道基因比例1:3:60)转染。16小时之后，如对于检测MAPK信号传导所述对细胞进行处理和照明。活细胞加入PBS中0.15mg/ml D-荧光素(PEQlab,Erlangen,Germany)处理，然后在37℃下孵育10分钟。发光用PEQLab Fusion SL成像系统(PEQLab,Erlangen,Germany)检测。 [0493] 细胞增殖(M38K细胞) [0494] 将2x104M38K细胞接种在96孔板的每个孔中。24小时之后，将细胞刺激1小时，或者保持在暗处。如所示加入FGF2(Sigma,St.Louis,MO)。24小时之后，将细胞与10μM EdU一起孵育2小时。随后，遵照制造商的方案将新合成的DNA用Click-iT EdU(Life Technologies)染色，并用5μg/ml Hoechst染料对比染色。将细胞用Nikon Ti300倒置显微镜拍照。为了确定具有新合成的DNA的细胞的百分含量，对Hoechst阳性的核和EdU阳性的核进行记数。 [0495] 细胞周期(M38K细胞) [0496] 细胞周期分布通过流式细胞术分析。将5x105M38K细胞接种在25cm2组织培养瓶中。24小时之后，将细胞刺激1小时，或者保持在暗处。再过24小时之后，将细胞在乙醇(70％)中固定，并用50μg/ml RNAse A和50μg/ml碘化丙啶(PI)处理。流式细胞术在FACSCalibur(BD Biosciences,Schwechat,Austria)上进行，细胞周期分布用ModFit LT软件(Verity Software House,Topsham,ME)计算。 [0497] 细胞形态学(M38K细胞) [0498] 将105M38K细胞接种在6孔板的每个板中。24小时之后，将细胞刺激1小时，或者保持在暗处。如所示加入FGF2(Sigma)或PD166866(Pfizer Global Research and Development,New London,CT)。再过24小时之后，将细胞在Nikon Ti300显微镜上拍照。对于细胞形态学的定量，对相差图像随机选择的部分中所有的细胞周长进行示踪，并用ImageJ软件(National Institute of Health)计算纵横比(定义为拟合椭圆的长轴长度除以短轴长度)。大于50个单独的数值得出每个平均值。自动化分析产生可比较的结果。 [0499] 基因表达分析(M38K细胞) [0500] 将5x104M38K细胞接种到6孔板的每个孔中。24小时之后，将细胞以5min光/15分钟暗的周期照明48小时。对照细胞保持在暗处。将总RNA用TRIZOL(LifeTechnologies)提取，并用MMLV逆转录酶进行逆转录(Thermo Scientific)。在Abi Prism 7500序列检测系统上使用公开引物(参考Sakuma,2012；#2508)对与50ng RNA/样品对应的cDNA进行SYBR green qPCR。使用GAPDH用于归一化，表达水平的倍数变化计算为照明相对于非照明细胞的2-ddCt。 [0501] 肌动蛋白染色(M38K细胞) [0502] 将5x105M38K细胞在6孔板中接种在盖玻片上。24小时之后，将细胞以5min光/15分钟暗的周期照明48小时。对照细胞保持在暗处。将细胞固定(3.8％甲醛)，透化(PBS中0.5％ Triton X100)，用TRITC-鬼笔环肽染色(1:100，PBS中1％BSA，4℃下过夜)，并封固在含有DAPI的Vectashield封固培养基中。在Leica荧光显微镜上取显微图像。 [0503] 体外血管生成(萌芽)测定(hBE细胞) [0504] 对于球状体的产生，将悬滴状hBE细胞(25μl液滴中450细胞)在标准组织培养孵育器中悬浮在补充有10％FBS、L-谷氨酰胺、2.2g/l NaHCO3和20％甲基纤维素(Sigma)的M199培养基(Sigma)中过夜。次日，将球状体在含有10％FBS的PBS中洗涤，离心，再悬浮在Methocel/20％FBS中，与中和的大鼠尾部胶原混合(1:1)，并接种在非附着性24孔板中(Greiner Bio-one,Kremsmünster,Austria)。胶原凝固之后，加入VEGFA(30ng/ml)或PD166866(10μM)。将板每20分钟用光刺激5分钟，进行10小时，或者保持在暗处。刺激之后，向每孔中加入1ml 8％多聚甲醛，并将球状体在Nikon显微镜上成像。测量来自至少8球状体/组的累计萌芽长度(ImageJ)。 [0505] 药理化合物的全光学评价(M38K和HEK293细胞) [0506] 测试化合物获自以下来源，并以所示的最终浓度使用：PD166866(PD，5μM；Pfizer Global Research and Development,Groton CT)、BIBF1120(BIBF，0.5μM；Nintedanib，Vargatef,Selleck Chemicals,Houston,TX)、AP24534(PON，1μM；Ponatinib，Selleck Chemicals)、AZD6244(SEL，0.5μM；Selumetinib，Selleck Chemicals)、UO126(UO，10μM；LC Laboratories,Woburn,MA)、MK2206(MK，10μM；Selleck Chemicals)、LY294002(LY，20μM；LC Laboratories)、伊马替尼(IMA，0.5μM；Selleck Chemicals)、维罗非尼(VEM，0.5μM；Selleck Chemicals)。浓度根据公开报道调节，在使用的孵育时间内无细胞毒性。 [0507] 对于M38K细胞，如上所述评价细胞形态，但之后进行自动化图像分析。对相差图像(通常来自两个孔的三个图像)进行自动化分析。将图像转化成灰度级，调整大小，并划分成用于局部阈值矫正的部分(阈值定义为最大概率强度乘以恒定因子0.85；Igor Pro,Wavemetrics,Lake Oswego,OR)。对细胞进行识别，并在FIJI/ImageJ中测量(Max Planck Society/National Institutes of Health；大小限制：40-600像素^2，圆度限制：0.01-1.00)。偶尔，手动除去异常值。通常，200-1800独立数值得出图9的平均值。对于HEK293细胞，如上所述使用荧光素酶测量MAPK路径激活。 [0508] 实施例1 [0509] 由于最初不清楚哪个LOV结构域将适合用作哺乳动物RTK的激活，发明人编制了多样的候选LOV结构域的无偏性组(一种来自真菌；两种来自藻类，两种来自植物)(图1a和SEQ ID NO:1-14)。 [0510] 表1.LOV结构域的光物理和平衡结合参数 [0511] [0512] 1观察到寿命范围从20至800s的三次指数衰减。 [0513] 2与该研究的VfAU1-LOV比较，LOV结构域包括C-端和N-端延长。 [0514] 3当必要时，将公开的半寿期值(t1/2)转化成寿命(τ＝t1/2/ln(2))假定一级反应。 [0515] 对于这些结构域，之前报道了寡聚状态下依赖于光的变化(Katsura,2009；Kaiserli,2009；Kutta,2008；Zoltowski,2008；Toyooka,2011)。由于大多数这些结构域从未在哺乳动物细胞中研究，发明人首先探讨了在两种哺乳动物细胞系(中国仓鼠卵巢细胞和人胚胎肾293(HEK293)细胞)中这些候选LOV结构域是否可以异源性地从密码子优化的基因表达，以及表达是否导致细胞毒性。经发现LOV结构域由两种细胞系均有效产生(如通过测量荧光蛋白质标签评价)，并且没有可检出的细胞毒性(如通过四唑染料的细胞还原所评价)(图1)。而且，在这些细胞中没有观察到蛋白质聚集体(数据未示出)，进一步支持了适当的表达。 [0516] 成纤维细胞生长因子(FGF)受体1(FGFR1)是在进化上保守的RTK，以及在胚胎发育、成人神经发生和肿瘤形成中细胞行为的关键调节物(Deng等人1994，Zhao等人2007，Yang等人2013)。发明人构建了嵌合受体，其中LOV结构域与鼠成纤维细胞生长因子受体(mFGFR1)的细胞内结构域连接。省略mFGFR1的细胞外配体结合模块，以获得不响应于天然配体的蛋白质(图2a)。出于上述原因，表达融合蛋白的细胞应当以mFGFR1的特征性信号传导路径的激活响应于蓝光。发明人在可以用确定强度的蓝光照明哺乳动物细胞的定制孵育器中进行了细胞信号传导实验(参见材料和方法)。发明人首次考察了经由FGFR1被FGF激活的中央信号传导路径MAPK路径(Ma等人2009)。作为阳性对照，发明人使用了修饰的化学诱导型mFGFR1(imFGFR1；(Welm,Freeman等人2002))，其也缺乏配体结合模块，并通过小的化学配体AP20187与单一改造的FK506结合结构域(FKBP)结合来激活。这些实验显示，并入来自V.frigida的aureochrome1的LOV结构域的融合蛋白(VfAU1-LOV-mFGFR1)与imFGFR1类似地激活MAPK路径。特别地，观察到在不存在光的情况下没有增加的基础路径激活，并且通过光的路径激活与通过配体的路径激活具有可比较的量级(图2b)。所有其他融合蛋白表现出没有活性或组成型活性(图2b)。对照实验显示(i)蓝光对表达imFGFR1的细胞没有影响，(ii)丧失激酶活性之后蓝光对表达VfAU1-LOV-mFGFR1的细胞没有影响，和(iii)绿光或红光对表达VfAU1-LOV-mFGFR1的细胞没有影响(图2c)。总之，这些结果说明由哺乳动物RTK的催化结构域和海藻LOV结构域组成的嵌合受体VfAU1-LOV-mFGFR1，响应于蓝光激活经典的MAPK信号传导路径(图2)和与mFGFR1关联的其他路径(图3)。发明人将该受体称作“Opto-mFGFR1”。 [0517] 发明人接下来考察了二聚是否是Opto-mFGFR1激活的基础。单一电荷倒置突变(全长FGFR1中R557E；Opto-FGFR1或miFGFR1中R195E)防止在FGFR1中形成功能上必要的不对称激酶结构域二聚体(Bae等人2010)，并通过imFGFR1抑制MAPK激活(图4a)。发明人将该突变引入到Opto-mFGFR1中作为激活过程中二聚体形成的探针。在表达Opto-mFGFR1-R195E的细胞中，检测不到响应于蓝光的MAPK路径激活(图4a)，表明受体激活要求受体二聚。该结果与在哺乳动物细胞中VfAU1-LOV响应于蓝光二聚的观察结果一起，指向二聚构成Opto-mFGFR1激活的机制的基础。 [0518] 发明人进一步测试了类似于VfAU1-LOV的LOV结构域是否可以激活mFGFR1。使用数据库搜索，发明人在黄绿藻Nannochloropsis gaditana(N.gaditana假想蛋白质(NgPA1))中以及在金藻Ochromonas danica(O.danica推定aureochrome1(OdPA1))中识别出VfAU1样蛋白质。对于并入NgPA1和OdPA1的LOV结构域(NgPA1-LOV和OdPA1-LOV)的mFGFR1融合蛋白，发明人还观察到蓝光诱导的MAPK信号传导的激活，其幅度类似于原始的Opto-mFGFR1(图5a)。因此，多种aureochrome样蛋白质的LOV结构域能够进行mFGFR1激活。 [0519] 为了测试VfAU1-LOV是否能够激活其他RTK，发明人将其与人表皮生长因子受体(hEGFR)和人RET(hRET)的催化结构域组合。发明人遵照Opto-mFGFR1中确立的设计。与其已知的信号传导能力相符，在表达hEGFR和hRET融合蛋白的细胞中观察到强壮的通过光的MAPK路径激活(图5b)。这些融合蛋白称作“Opto-hEGFR”和“Opto-hRET”。 [0520] 在首个光激活的RTK的合理设计中，发明人将配体诱导的二聚用光激活的蛋白质-蛋白质相互作用取代。由于不存在优先的光控制的哺乳动物受体二聚，并且由于天然存在的光受体的结构多样性(Moglich等人2010,Zoltowski和Gardner 2011)，发明人最初遵照无偏性方法，并评价了5种源自四种不同的非动物物种的LOV结构域。VfAU1-LOV的成功识别支持了以下观点：大自然提供了丰富的光敏分子官能性，其可以在光激活的分子工具中收获(Chow等人2010)。并入VfAU1-LOV使Opto-mFGFR1具有若干有益的特征。作为感光元件，VfAU1-LOV并入黄素单核苷酸(FMN)——即使不是所有也在大多数动物细胞中丰富地存在的氧化还原酶的辅基。因此预计Opto-mFGFR1在许多细胞类型中不需要加入外源性辅助因子便发挥功能，这是体内光遗传实验中的关键特征，并且发明人在3种没有补充FMN的细胞类型中证明了功能。第二，Opto-mFGFR1被低强度的蓝光(例如，～3μW/mm2，图2)有效激活，这很容易在透明动物模型中以及经皮在啮齿类动物中实现(Janovjak等人2010，Ye等人2011)。 [0521] 最初评价的5种LOV结构域的比较使得可以提出并在实验上验证VfAU1-LOV的有助于其在Opto-mFGFR1中的功能的那些特性。首先，只有在VfAU1中，而不在其他4种光受体中的是位于效应器结构域的C-端的LOV结构域(图1)。而且，之前未表征的同样位于其全长光受体中效应器结构域C-端的LOV结构域可以在功能上取代VfAU1-LOV(OdPA1-LOV和NgPA1-LOV；图5a)。因此，保持天然存在的光受体中的结构域顺序似乎有益于改造的蛋白质的功能。反过来，发明人提出，全长光受体OdPA1和NgPA1通过与VfAU1类似的机制发挥功能，从而证实以下观点：光激活的蛋白质的改造使得可以对天然存在的蛋白质的功能和发现有认识(Janovjak,Szobota等人2010，Janovjak等人2011)。 [0522] 第二，尽管对于即使不是全部也是大多数所表征的LOV结构域来说观察到黑暗状态的二聚，其对于VfAU1-LOV在比其他结构域高一到两个数量级的浓度下发生(上文表1)。因此，并入在<100μM浓度下没有或几乎没有黑暗状态二聚的结构域似乎有益于改造的蛋白质的功能。 [0523] 第三，合理的是，假定VfAU1-LOV的光激发状态必需足够长久以使受体二聚并且受体二聚体稳定化。配体建立起功能性FGFR1二聚体30-100s(Powell等人2002)，这些数值短于VfAU1-LOV而不是一些其他结构域的光激发状态寿命(上文表1)。与该模型相符，通过突变将VfAU1-LOV的寿命降低～8倍降低了Opto-mFGFR1激活(图5c)。上述特性、结构域顺序、黑暗二聚和光激发状态寿命的组合似乎是通过LOV结构域激活mFGFR1所要求的。 [0524] 总之，这些结果说明，由LOV结构域(NgPA1-LOV、OdPA1-LOV和VfAU1-LOV)和哺乳动物RTK的催化结构域(mFGFR1、hEGFR和hRET)组成的融合蛋白响应于蓝光激活与RTK关联的细胞信号传导路径。 [0525] 实施例2 [0526] 癌症的发展和进程常常与RTK中的突变或RTK超量表达关联，许多癌细胞以增加的增殖、迁移和上皮间质转化(EMT)响应于生长因子(Metzner等人2011,Sakuma等人2012)。为了建立与FGF/FGFR信号传导相关的人癌症的细胞模型，发明人测试了来自不同肿瘤实体的细胞的FGF2——显著的FGFR配体的作用。发明人发现，源自恶性胸膜间皮瘤的M38K细胞(Kahlos等人1998)以细胞行为的特征性变化响应于FGF。为了考察Opto-FGFR1是否使得可以用光控制这些人肿瘤细胞的行为，发明人将Opto-mFGFR1病毒性递送至这些细胞中，并以稳定的Opto-mFGFR1表达繁殖细胞。用蓝光刺激导致Opto-mFGFR1和ERK1/2迅速磷酸化，其在光停止之后的数分钟内返回至刺激前的水平(图6a)。类似地，在源自恶性胸膜间皮瘤的第二种FGF2-响应性细胞系(SPC212；(Schmitter等人1992))中，观察到Opto-mFGFR1和ERK1/2以及AKT和磷脂酶Cy(PLCy)，受FGF调节的其他信号传导分子(Ma,Ponnusamy等人2009，Coutu人2011)的迅速磷酸化(图6a和b)。而且，光刺激触发增殖增加(评价为并入5-乙炔基-2'-脱氧尿苷的核的％)，细胞周期分布朝向S-相移动，EMT样形态学变化，以及EMT样基因表达的变化，其与FGF2-处理的细胞可比较(图6c-g)。通过用选择性FGFR1抑制剂PD166866预处理抑制光诱导的形态学变化(图6e和f)。此外，在与癌症无关的模型系统血内皮细胞中，用蓝光刺激也导致Opto-mFGFR1和ERK1/2的迅速磷酸化(图7a)。另外在该系统中，蓝光照明诱导形态学的变更(图7b和c)。 [0527] 对于Opto-mFGFR1，时间限制的光学刺激证明了在时间尺度上控制受体激活的能力，其与其他广泛使用的光遗传学工具(Kennedy等人2010)可比较并且比生理和发育相关的那些更加迅速(图6a和b，图7a)，而空间限制的光学刺激证明了局部化受体激活的能力(图8)。 [0528] 最近提出，光激活的蛋白质可以使得新的方法能够评价药理学活性剂(Prigge,Rosler等人2010，Entcheva 2013)。这些想法建立在使用光作为激活剂和细胞信号读出二者之上，从而使得可以简化并降低成本。该方法用多种分子的概念验证目前尚不可获得。发明人在实验上实现了小分子的“全光学”评价，其基于通过Opto-mFGFR1的疾病相关细胞信号传导的光学激活，并基于M38K细胞的形态学变化。发明人集中于FGFR1和其他激酶的抑制剂，预期可以使用M38K细胞作为模型系统识别出抑制剂，所述抑制剂对FGFR1、并且转而还对负责形态学变化的下游路径有特异性。发明人发现，通过用FGFR抑制剂PD166866、BIBF1120和帕纳替尼以及用MEK抑制剂UO126和司美替尼处理，可以取消形态学变化。PI3K抑制剂LY294002和Akt抑制剂MK2206没有效果。 [0529] 这些结果说明(i)在M38K细胞中形态学变化依赖于MAPK路径，而来自PI3K/Akt路径的信号是可分散的，(ii)全光学药理评价以识别干扰特定受体和路径的激活的抑制剂。 [0530] 与神经系统细胞相反，对于其来说光遗传学工具是细胞活性和神经回路的有价值的确立的驱动器，癌细胞行为的光学控制迄今尚未实现。发明人在恶性胸膜间皮瘤细胞模型中使用Opto-mFGFR1调节恶性肿瘤细胞的特征性行为，例如细胞增殖、细胞形态学和细胞迁移。单一组分Opto-mFGFR1的激活足以产生这些行为变化。由于RTK在发育和细胞命运决定中发挥关键作用，并且发明人预期光激活的RTK使得能够对这些过程进行新的研究，例如，以空间和时间激活图式。已经特异性地显示出FGFR1经由不同的路径控制间叶细胞和神经干细胞的自我更新和分化(Ma,Ponnusamy等人2009，Coutu,Francois等人2011)，所有这些均可以通过Opto-mFGFR1控制。 [0531] 尽管拥有巨大的潜力，光遗传学在生物技术中的应用稀少。对于离子通道，提出在影响膜电流的分子的更加迅速和无接触的评价中可以利用光控制的非侵入性质的优势(Prigge,Rosler等人2010，Entcheva 2013)。发明人建立了基于Opto-mFGFR1的和高通量兼容形式的“全光学”筛选方法。该方法使用光作为刺激并作为细胞信号传导的激活和检测的读出。在这些验证实验中，可以识别作为FGFR1抑制剂以及下游目标的抑制剂的化合物，并且可以识别作为M38K细胞行为变化基础的路径。该实验的设计匹配目标在于抑制信号转导路径和抑制路径预定组分的药理学情形，因为一些组分可能更容易靶向或者比其他的特异性更高。将化学激活剂用光代替产生操作上的简化并降低成本，同时保持激活的时间控制以及激活强度的调节。而且，改造的受体的光学激活对并入的受体类型有特异性，并且避免了由不存在受体家族或亚型的亚型特异性配体导致的潜在复杂性。但是，保持有平行化的可能性，因为使用光作为单一的通用输入激活许多种受体/信号传导路径。 [0532] 实施例3 [0533] 发明人首先识别出响应于红光而经历同型二聚的蛋白质结构域(集胞藻PCC6803的蓝藻光敏素(PHY)CPH1的光敏结构域(SyCP1-PHY))。然后，发明人制备了融合蛋白，其中SyCP1-PHY与鼠FGFR1(mFGFR1)或大鼠trkB(rtrkB)的细胞内催化结构域连接(图10和11)。省略mFGFR1/rtrkB的细胞外配体结合模块，以得到对天然配体不反应的融合蛋白。表达融合蛋白的细胞应当以mFGFR1/rtrkB的特征性信号传导路径的激活响应于红光。发明人在使得可以用确定的强度和颜色的光照明细胞和组织的定制孵育器中进行了细胞信号传导实验(材料和方法)。如在实施例1中，首先检查分裂素激活的蛋白质激酶(MAPK)路径。 [0534] 经发现，融合蛋白响应于低强度红光照明激活MAPK路径(图10和11)。对照实验显示，红光对于用没有二聚能力的激酶死mFGFR1-SyCP1-PHY或mFGFR1-SyCP1-PHY转染的细胞没有作用(图10)。结果说明，由哺乳动物RTK的催化结构域和蓝藻PHY结构域组成的嵌合受体mFGFR1-SyCP1-PHY和rtrkB-SyCP1-PHY响应于红光激活经典的MAPK路径。发明人将这些受体称作“redOpto-mFGFR1”和“redOpto-rtrkB”。 [0535] 实施例4 [0536] 最近提出，光激活的蛋白质可以使得能够进行评价药理学活性剂的新方法(Prigge,Rosler等人2010，Entcheva 2013)。这些想法建立在使用光作为激活剂和细胞信号读出二者之上，从而使得可以简化并降低成本。该方法用多种分子的概念验证目前尚不可获得。发明人在实验上实现了小分子的“全光学”评价，其基于通过redOpto-rtrkB的疾病相关细胞信号传导的光学激活，并基于HEK293细胞的荧光素酶信号。发明人集中于MAPK路径和其他激酶的抑制剂，预期可以识别出对MAPK路径有特异性的抑制剂(图12)。发明人发现，通过用MEK抑制剂UO126和司美替尼处理，可以取消响应于红光的PAPK路径诱导。FGFR抑制剂PD166866，CKIT抑制剂伊马替尼和BRAF抑制剂维罗非尼没有效果。 [0537] 这些结果进一步证明了全光学药理学评价识别干扰特异性受体和路径激活的抑制剂。 [0538] redOpto-mFGFR1和redOpto-rtrkB例示了一类价值很高的光遗传学工具，因为与蓝光相比红光提供了显著提高的组织穿透。例如，5mm厚的骨/颅骨透过～2％的蓝光(460nm)，但透过～10％的红光(640nm)(Wan,Parrish等人1981)。或者，1cm厚的肌肉组织透过～20％的蓝光，但透过～80％的红光(Marquez,Wang等人1998)。 [0539] 此外，含有PHY和LOV结构域的受体家族的组合使得能够用双色激活进行试验。 [0540] 参考文献列表 [0541] WO 2013/133643 [0542] WO 2013/074911 [0543] WO 2013/003557 [0544] WO 2012/116621 [0545] WO 2010/006049 [0546] WO 2009/151948 [0547] WO 2009/148946 [0548] WO 2008/089003 [0549] WO 2008/086470 [0550] WO 2007/024391 [0551] WO 1999/036553 [0552] US 2013/0116165 [0553] US 2010/0234273 [0554] US 2009/0233364 [0555] US 2006/0110827 [0556] Bae,J.H.,T.J.Boggon,F.Tome,V.Mandiyan,I.Lax和J.Schlessinger(2010)."Asymmetric receptor contact is required for tyrosine autophosphorylation of fibroblast growth factor receptor in living cells."Proc Natl Acad Sci U S A 107(7):2866‐2871. [0557] Burke,C.L.和D.F.Stern(1998)."Activation of Neu(ErbB‐2)mediated by disulfide bond‐induced dimerization reveals a receptor tyrosine kinase dimer interface."Mol Cell Biol 18(9):5371‐5379. [0558] Casaletto,J.B.和A.I.McClatchey(2012)."Spatial regulation of receptor tyrosine kinases in development and cancer."Nat Rev Cancer 12(6):387‐400.[0559] Chow,B.Y.和E.S.Boyden(2013)."Optogenetics and translational medicine."Sci Transl Med 5(177):177ps175. [0560] Chow,B.Y.,X.Han,A.S.Dobry,X.Qian,A.S.Chuong,M.Li,M.A.Henninger,G.M.Belfort,Y.Lin,P.E.Monahan和E.S.Boyden(2010)."High‐performance genetically targetable optical neural silencing by light‐driven proton pumps."Nature 463(7277):98‐102. [0561] Clackson,T.(1998)."Redesigning small molecule‐protein interfaces."Curr Opin Struct Biol 8(4):451‐458. [0562] Cochran,J.R.,D.Aivazian,T.O.Cameron和L.J.Stern(2001)."Receptor clustering and transmembrane signaling in T cells."Trends Biochem Sci 26(5):304‐310. [0563] Coutu,D.L.,M.Francois和J.Galipeau(2011)."Inhibition of cellular senescence by developmentally regulated FGF receptors in mesenchymal stem cells."Blood 117(25):6801‐6812. [0564] Deng,C.X.,A.Wynshaw‐Boris,M.M.Shen,C.Daugherty,D.M.Ornitz和P.Leder(1994)."Murine FGFR‐1is required for early postimplantation growth and axial organization."Genes Dev 8(24):3045‐3057. [0565] Entcheva,E.(2013)."Cardiac optogenetics."Am J Physiol Heart Circ Physiol 304(9):H1179‐1191. [0566] Fenno,L.,O.Yizhar和K.Deisseroth(2011)."The development and application of optogenetics."Annu Rev Neurosci 34:389‐412. [0567] Heintzen,C.,J.J.Loros和J.C.Dunlap(2001)."The PAS protein VIVID defines a clock‐associated feedback loop that represses light input,modulates gating,and regulates clock resetting."Cell 104(3):453‐464. [0568] Huang,K.,T.Merkle和C.F.Beck(2002)."Isolation and characterization of a Chlamydomonas gene that encodes a putative blue‐light photoreceptor of the phototropin family."Physiol Plant 115(4):613‐622. [0569] Huang,Y.,L.Wang,M.Zheng,L.Zheng,Y.Tong和Y.Li(2013).，，Overexpression of NgAUREO1,the gene coding for aureochrome 1from Nannochloropsis gaditana,into Saccharomyces cerevisiae leads to a 1.6-fold increase in lipid accumulation.“Biotechnol Lett.DOI 10.1007/s10529-013-1386-0. [0570] Janovjak,H.,G.Sandoz和E.Y.Isacoff(2011)."A modern ionotropic glutamate receptor with a K(+)selectivity signature sequence."Nat Commun 2: 232. [0571] Janovjak,H.,S.Szobota,C.Wyart,D.Trauner和E.Y.Isacoff(2010)."A light‐gated,potassiumselective glutamate receptor for the optical inhibition of neuronal firing."Nat Neurosci 13(8):1027‐1032. [0572] Kahlos,K.,S.Anttila,T.Asikainen,K.Kinnula,K.O.Raivio,K.Mattson,K.Linnainmaa和V.L.Kinnula(1998)."Manganese superoxide dismutase in healthy human pleural mesothelium and in malignant pleural mesothelioma."Am J Respir Cell Mol Biol 18(4):570‐580. [0573] Kennedy,M.J.,R.M.Hughes,L.A.Peteya,J.W.Schwartz,M.D.Ehlers和C.L.Tucker(2010)."Rapid blue‐light‐mediated induction of protein interactions in living cells."Nat Methods 7(12):973‐975. [0574] Kim,N.,Kim J.M.,Lee,M.Kim,C.Y.,Chang,K.和Heo,W.D.(2014)"Spatiotemporal Control of Fibroblast Growth Factor Receptor Signals by Blue Light."Chem Biol.21:903-912. [0575] Kinoshita,T.,M.Doi,N.Suetsugu,T.Kagawa,M.Wada和K.Shimazaki(2001)."Phot1and phot2mediate blue light regulation of stomatal opening."Nature 414(6864):656‐660. [0576] Lemmon,M.A.和J.Schlessinger(2010)."Cell signaling by receptor tyrosine kinases."Cell 141(7):1117‐1134. [0577] Ma,D.K.,K.Ponnusamy,M.R.Song,G.L.Ming和H.Song(2009)."Molecular genetic analysis of FGFR1signalling reveals distinct roles of MAPK and PLCgamma1activation for self‐renewal of adult neural stem cells."Mol Brain 2:16. [0578] Marquez,G.,L.V.Wang,S.Lin,J.A.Schwartz和S.L.Thomsen (1998).，，Anisotropy in the absorption and scattering spectra of chicken breast tissue.“Appl Opt 37(4):798-804. [0579] McCarty,M.F.(2007)."Clinical potential of Spirulina as a source of phycocyanobilin."J Med Food 10(4):566-570. [0580] Metzner,T.,A.Bedeir,G.Held,B.Peter‐Vorosmarty,S.Ghassemi,C.Heinzle,S.Spiegl‐Kreinecker,B.Marian,K.Holzmann,B.Grasl‐Kraupp,C.Pirker,M.Micksche,W.Berger,P.Heffeter和M.Grusch(2011)."Fibroblast growth factor receptors as therapeutic targets in human melanoma:synergism with BRAF inhibition."J Invest Dermatol 131(10):2087‐2095. [0581] Moglich,A.,X.Yang,R.A.Ayers和K.Moffat(2010)."Structure and function of plant photoreceptors."Annu Rev Plant Biol 61:21‐47. [0582] 等人(2010)Photochem.Photobiol.Sci.9:1286-1300. [0583] Müller&Weber(2013)Mol.Biosyst.9:596-608. [0584] Muthuswamy,S.K.,M.Gilman和J.S.Brugge(1999)."Controlled dimerization of ErbB receptors provides evidence for differential signaling by homo‐and heterodimers."Mol Cell Biol 19(10):6845‐6857. [0585] Nagai,T.,K.Ibata,E.S.Park,M.Kubota,K.Mikoshiba和A.Miyawaki(2002)."A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell‐biological applications."Nat Biotechnol 20(1):87‐90. [0586] Pathak等人(2013)Biol.Cell 105:59-72. [0587] Powell,A.K.,D.G.Fernig和J.E.Turnbull(2002)."Fibroblast growth factor receptors 1and 2interact differently with heparin/heparan sulfate.Implications for dynamic assembly of a ternary signaling complex."J Biol Chem 277(32):28554‐28563. [0588] Prigge,M.,A.Rosler和P.Hegemann(2010)."Fast,repetitive light‐activation of CaV3.2using channelrhodopsin 2."Channels(Austin)4(3):241‐247.[0589] Robertson,S.C.,J.A.Tynan和D.J.Donoghue(2000)."RTK mutations and human syndromes when good receptors turn bad."Trends Genet 16(6):265‐271. [0590] Sakuma,K.,M.Aoki和R.Kannagi(2012)."Transcription factors c‐Myc and CDX2mediate E‐selectin ligand expression in colon cancer cells undergoing EGF/bFGF‐induced epithelial‐mesenchymal transition."Proc Natl Acad Sci U S A 109(20):7776‐7781. [0591] Schmidt等人(August 2013)Nature Communications,DOI:10.1038/ncomms4019.[0592] Schmitter,D.,B.Lauber,B.Fagg和R.A.Stahel(1992)."Hematopoietic growth factors secreted by seven human pleural mesothelioma cell lines:interleukin‐6production as a common feature."Int J Cancer 51(2):296‐301. [0593] Shilo,B.Z.(2005)."Regulating the dynamics of EGF receptor signaling in space and time."Development 132(18):4017‐4027. [0594] Simi,A.和C.F.Ibanez(2010)."Assembly and activation of neurotrophic factor receptor complexes."Dev Neurobiol 70(5):323‐331. [0595] Spaargaren,M.,L.H.Defize,J.Boonstra和S.W.de Laat(1991)."Antibody‐induced dimerization activates the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase."J Biol Chem 266(3):1733‐1739. [0596] Strauss,H.M.,P.Schmieder和J.Hughes(2005)."Light-dependent dimerization in the N-terminal sensory module of cyanobacterial phytochrome 1."FEBS Lett 579(19):3970-3974. [0597] Szobota,S.和E.Y.Isacoff(2010)."Optical control of neuronal activity."Annu Rev Biophys 39:329‐348. [0598] Takahashi,F.,D.Yamagata,M.Ishikawa,Y.Fukamatsu,Y.Ogura,M.Kasahara,T.Kiyosue,M.Kikuyama,M.Wada和H.Kataoka(2007)."AUREOCHROME,a photoreceptor required for photomorphogenesis in stramenopiles."Proc Natl Acad Sci U S A 104(49):19625‐19630. [0599] Toyooka,T.,O.Hisatomi,F.Takahashi,H.Kataoka和M.Terazima (2011)."Photoreactions of aureochrome‐1."Biophysical J 100(11):2801‐2809. [0600] Tucker,C.L.(2012)."Manipulating cellular processes using optical control of protein‐protein interactions."Prog Brain Res 196:95‐117.[0601] Wan,S.,J.A.Parish,R.R.Anderson和M.Madden(1981).“Transmittance of nonionizing radiation in human tissues.”Photochem Photobiol B 34:679to 681.[0602] Wang,X.,X.Chen和Y.Yang(2012)."Spatiotemporal control of gene expression by a light switchable transgene system."Nat Methods 9(3):266‐269.[0603] Welm,B.E.,K.W.Freeman,M.Chen,A.Contreras,D.M.Spencer和J.M.Rosen(2002)."Inducible dimerization of FGFR1:development of a mouse model to analyze progressive transformation of the mammary gland."J Cell Biol 157(4): 703‐714. [0604] Wend,S.,H.J.Wagner,K.Müller,M.D.Zurbriggen,W.Weber和G.Radziwill(2013)，，Optogenetic Control of Protein Kinase Activity in Mammalian Cells.“ACS Synth Biol Dx.doi.org/10.1021/sb400090s. [0605] Yang,F.,Y.Zhang,S.J.Ressler,M.M.Ittmann,G.E.Ayala,T.D.Dang,F.Wang和D.R.Rowley(2013)."FGFR1is Essential for Prostate Cancer Progression and Metastasis."Cancer Res.73(12):3716-24. [0606] Ye,H.,M.Daoud‐El Baba,R.W.Peng和M.Fussenegger(2011)."A synthetic optogenetic transcription device enhances blood‐glucose homeostasis in mice."Science 332(6037):1565‐1568. [0607] Zhao,M.,D.Li,K.Shimazu,Y.X.Zhou,B.Lu和C.X.Deng(2007)."Fibroblast growth factor receptor‐1is required for long‐term potentiation,memory consolidation,and neurogenesis."Biol Psychiatry 62(5):381‐390. [0608] Zoltowski,B.D.和K.H.Gardner(2011)."Tripping the light fantastic:blue‐light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein‐protein interactions."Biochemistry 50(1):4‐16. |
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