细胞培养 |
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申请号 | CN201380040858.4 | 申请日 | 2013-07-29 | 公开(公告)号 | CN104703698B | 公开(公告)日 | 2017-09-22 |
申请人 | 新加坡国立大学; 国家科学研究中心; | 发明人 | 维尔日勒·尼古拉斯·罗伯特·维亚诺夫; 李秋实; | ||||
摘要 | 本公开内容涉及包含一个或更多个功能化表面的三维[3‑D]细胞培养膜的制造,所述功能化表面适于提供适用于分析细胞之增殖、分化或功能的细胞培养条件,所述细胞通常为真核细胞或原核细胞。 | ||||||
权利要求 | 1.一种三维细胞培养基材,其包含:包含适于细胞培养的固化聚合物的穿孔膜,其特征在于所述膜具有至少两个经改性细胞培养表面,其中第一表面包含至少一种细胞培养剂并且第二表面包含第二种不同的细胞培养剂,其中所述膜增强与所述膜缔合之细胞的增殖和/或分化或功能。 |
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说明书全文 | 细胞培养[0001] 介绍 [0002] 本公开内容涉及包含一个或更多个功能化表面的三维[3-D]细胞培养膜的制造,所述功能化表面适于提供适用于分析细胞之增殖、分化或功能的细胞培养条件,所述细胞通常为真核细胞或原核细胞。所述细胞培养膜适用于在现有细胞培养塑料器皿中安装并使用以用于培养细胞,并且还适用于高分辨率显微技术。细胞培养膜的多细胞阵列形式还提供了高效且成本有效的装置来可重复地提供培养物中的细胞,其可用于药物筛选方法。 背景技术[0003] 真核细胞(例如哺乳动物细胞)的培养已成为一种常规方法并且明确限定了使细胞能够增殖、分化和发挥功能的细胞培养条件。通常,哺乳动物细胞的细胞培养需要通常由塑料(典型为聚苯乙烯)制造的无菌容器,限定生长培养基以及在一些实例中的饲养细胞和血清。饲养细胞的作用在于提供刺激细胞增殖和/或维持细胞处于未分化状态并且可影响细胞功能的信号。哺乳动物细胞的培养具有多种应用并且存在使用细胞培养来进行实验和研究的多种体外测定和模型;例如细胞在组织工程中的用途;哺乳动物表达系统用于产生重组蛋白的用途以及哺乳动物细胞在初步药物筛选中的用途。 [0004] 在初步药物筛选中使用哺乳动物细胞以确定先导治疗剂(lead therapeutic)(例如,小分子激动剂或拮抗剂、单克隆抗体、肽治疗剂、核酸适配体、小抑制性RNA)是否具有效力,然后进行动物试验。需要提供改进的细胞培养系统,可在所述改进的细胞培养系统中培养哺乳动物细胞以提供技术上尽可能接近其天然状态的细胞群体,从而能够以可靠的方式分析细胞增殖、分化和功能。 [0005] 细胞培养系统在本领域是已知的并且技术人员已使用多年。例如,WO2010/005995公开了作为传染病分析平台的微图案(micro-patterned)共培养系统。WO2003/014334公开了体外细胞培养方法,其提供了使得前列腺上皮细胞能够形成与在体内发现的前列腺腺泡非常类似的3D前列腺样腺泡的培养方案。此外,WO00/34454中描述了包含微孔(microcellular)聚合物材料的细胞培养基材(substrate)。这些聚合物形成孔彼此相互连接的网状结构,从而提供细胞可附着至其并增殖的基材。 [0006] 细胞培养通常包括使细胞在封闭的细胞培养容器中于无菌条件下在单层培养物中生长。一种方法是使用2D蛋白质图案或3D微孔(micro-well)。2D蛋白质图案已成功并广泛地用于控制细胞行为。此外,使用硅蚀刻Si晶片[1、2]、玻璃[3]、聚二甲基硅氧烷[PDMS][4]、弹性印章(elastomeric stamp)[5]、水凝胶(如琼脂糖或PEG)[6、7]、胶原蛋白[8]或Parylen膜[9]和纤维[10]进行的微孔制造已被用于在受限环境中培养单细胞或有限数目的细胞。然而,该技术通常相当于使用微孔作为小型化培养皿而没有利用细胞在孔中的限制以及产生3D蛋白质涂覆的凹穴(nich)的可能性。这主要是因为这样的事实:至少对单细胞培养而言,化学涂层在孔的侧面、顶部和底部不可能不同,并因此仅可为细胞提供单一化学信号,很少观察到优于2D图案化表面的优点。此外,单细胞微孔技术不太适合于高分辨率成像,原因是其经受由细胞和用于形成微孔的材料之间的率变化(例如硅聚合物的折射率为约1.45)所造成的图像失真[11]。 [0007] 例如而非限制性地,使用原代肝细胞来举例说明本公开内容。我们的3D差异性表面涂层允许培养原代肝细胞作为具有可用于药物代谢分析的受控胆小管[BC]形态的细胞双联体(doublet)。我们的技术使得功能原代肝细胞能够在双联体水平培养至少96小时。此外,我们的技术提供可包括在任意标准细胞培养装置中的通用独立膜。本文公开的细胞培养系统可用于哺乳动物细胞以提供用于产生更接近地反映体内条件的细胞培养物的设备,从而提供应用于例如组织工程、重组蛋白生产和药物筛选的更可靠的细胞培养系统。 [0008] 发明陈述 [0009] 根据本发明的一个方面,提供了三维细胞培养基材,其包含:包含适于细胞培养之经固化聚合物的穿孔膜,其特征在于所述膜具有至少两个经改性细胞培养表面,其中第一表面包含至少一种细胞培养剂并且第二表面包含第二种不同的细胞培养剂,其中所述膜增强与所述膜相缔合之细胞的增殖和/或分化或功能。 [0010] 在本发明的一个优选实施方案中,所述膜包含多个穿孔,其中所述穿孔的直径为至少5μm至1000μm;优选直径为约20μm至300μm。 [0011] 纵横比(aspect ratio)通常被认为是外形(feature)的高度与特征性横向尺寸之间的比例关系。在本公开内容的上下文中,关于穿孔尺寸,纵横比通常不大于2。 [0012] 在本发明的一个优选实施方案中,所述穿孔的高度为10μm至50μm;优选高度为40μm。 [0013] 在本发明的一个优选实施方案中,所述可固化聚合物是可UV固化的。优选地,所述可固化聚合物是基于丙烯酸的聚合物。 [0014] 基于丙烯酸的聚合物在本领域是公知的并且包括例如聚(甲基丙烯酸甲酯)[PMMA]——Norland粘合剂系列的光学粘合剂[NOA系列;参见http://www.norlandprod.com)。另一些实例包括具有期望光学性能的可固化聚合物,其可获自My Polymer http://www.mypolymers.com,例如折射率不同的My 132、133、136、145、147。 [0015] 在本发明的一个优选实施方案中,所述细胞培养剂和/或所述膜通过包含交联剂而进行进一步改性,所述交联剂有助于所述细胞培养剂与所述膜交联,从而提供经改性细胞培养表面。 [0016] 提供经改性细胞培养表面将有助于施加至膜之细胞的生长和分化。根据本发明的细胞培养剂通常是蛋白质或糖蛋白。涉及维持细胞之增殖和/或分化的蛋白质是公知的。例如,典型的蛋白质因子包括细胞外基质蛋白,例如纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、钙粘附蛋白和成纤维细胞生长因子,并且(根据细胞类型)维持细胞增殖和/或分化所需的单核因子和细胞因子也包括在本发明的范围内。此外,公知的是,碳水化合物剂(例如凝集素)参与促进细胞分化并在类似和不同细胞类型之间形成细胞与细胞的接触。 [0017] 在本发明的一个优选实施方案中,所述膜的折射率为约1.30至约1.50;优选约1.33至约1.45。 [0018] 在本发明的一个优选实施方案中,所述细胞基材包含相互连接的细胞培养微孔的网络。 [0019] 在本发明的另一个优选实施方案中,所述网络含多个长形的细胞培养微孔,其适于提供至少所述第一经改性细胞培养表面和第二经改性细胞培养表面。 [0020] 优选地,所述长形微孔的长度为至少300μm。 [0021] 优选地,所述长形微孔为至少30μm宽。 [0022] 根据本发明的另一个方面,提供了用于微制造包含至少一个细胞培养微孔的细胞培养膜的方法,其中所述微孔调整为有至少两个功能化细胞培养表面,所述方法包括以下步骤: [0023] i)使支持物的表面与通过提供一个或更多个凸起的突出部分进行调整的基材相接触,其中所述突出部分中的一个或更多个接触所述支持物的表面; [0024] ii)将细胞培养兼容性聚合物溶液施加于所述基材,其中所述聚合物是可固化的; [0025] iii)固化所施加的聚合物以形成细胞培养膜; [0026] iv)从所述基材中移除所述膜并使第一膜表面与一种或更多种细胞培养剂相接触; [0027] v)重新定向所述膜以暴露第二膜表面;并且使所述第二膜表面与第二种不同的细胞培养剂相接触;以及任选地 [0028] vi)重复iv)和/或v)以进一步功能化所述细胞培养膜。 [0029] 根据本发明的基材可以是硅基的,例如聚二甲基硅氧烷[PDMS]或弹性印章。显而易见的是,根据本发明的方法产生了具有大表面积的三维细胞培养膜,其可具有多达三个功能化表面,所述表面可通过多种细胞培养剂进行改性来提供优越的细胞培养膜。细胞培养兼容性聚合物通常是可UV固化聚合物,但是本发明还涵盖替代固化[例如加热]。 [0030] 在本发明的一种优选方法中,步骤ii)至vi)通过包含化学交联剂而进一步改性,所述化学交联剂有助于所述细胞培养剂与所述细胞培养膜交联。 [0031] 优选地,所述化学交联剂是异双功能交联剂。 [0032] 交联剂的实例在本领域是已知的。例如,包括基于丙烯酸的交联剂,例如α-丙烯酰基-ω-羧基琥珀酰亚胺酯聚(乙二醇),也称为acryl-peg-N-羟基琥珀酰亚胺(www.nanocs.net)。 [0033] 在本发明的一种优选方法中,所述剂为α-丙烯酰基-ω-羧基琥珀酰亚胺酯聚(乙二醇)并且包括在根据本发明之方法的步骤ii)中。 [0034] 在本发明的一种优选方法中,所述细胞培养剂是蛋白质。 [0035] 在本发明的一种替代优选方法中,所述细胞培养剂是碳水化合物. [0036] 在本发明的另一种替代方法中,所述细胞培养剂是基于脂质的剂,例如糖脂。 [0037] 在本发明的一种替代优选方法中,所述剂是聚氨基酸涂层。 [0038] 聚氨基酸具有模拟蛋白质并且特别是细胞可在其上附着并生长之蛋白质的性质。聚氨基酸可以是均聚物或杂聚物。可用于细胞培养的聚氨基酸的实例包括聚-L鸟氨酸和聚-L-赖氨酸。蛋白质涂层在本领域是公知的。例如参见Culture of Animal Cells,Ian Freshney,Wiley-Liss 1994。 [0039] 在本发明的一种优选方法中,所述一种或更多种试剂是防污剂。 [0040] 防污剂在本领域是已知的并且防止细胞培养期间所产生的细胞碎片积聚。防污剂TM的实例为PEG甲基丙烯酸酯或普朗尼克酸(pluronic acid) 。 [0041] 根据本发明的又一个方面,提供了通过根据本发明的方法获得或能够获得的细胞培养膜。 [0042] 根据本发明的再一个方面,提供了包含根据本发明的细胞培养膜的细胞培养容器。 [0043] 根据本发明的另一个方面,提供了包含至少一种细胞类型和细胞培养基的根据本发明的细胞培养容器。 [0044] 在本发明的一个优选实施方案中,所述细胞培养基材悬浮于所述细胞培养基中并在其中得到支持。 [0045] 在本发明的另一个优选实施方案中,所述细胞培养基材包含一个或更多个细胞培养表面,其中所述细胞培养表面不接触细胞培养容器表面。 [0046] “细胞培养容器”定义为适于含有上述细胞培养基材的任意设备。通常,这样的容器的实例是培养皿、细胞培养瓶或烧瓶或多孔培养皿或孔插入物。多孔培养皿是规格为例如6、12、48、96和384孔的多孔微量滴定板,其通常用于与自动化加载和自动处理系统兼容。通常,高通量筛选使用试剂与指示剂化合物的均匀混合物,所述指示剂化合物经转化或经改性而导致信号产生。通过合适方法(例如荧光发射、光密度或放射性的检测)测量所述信号,然后整合来自包含细胞、基材/试剂和指示剂化合物的各孔的信号。 [0047] 在本发明的一个优选实施方案中,所述细胞是真核细胞,例如哺乳动物细胞。 [0048] 在本发明的一个替代优选实施方案中,所述哺乳动物细胞是啮齿动物细胞,例如大鼠、小鼠或仓鼠细胞。 [0049] 在本发明的一个替代优选实施方案中,所述哺乳动物细胞是灵长类动物细胞;优选地,所述灵长类动物细胞是人细胞。 [0050] 在本发明的一个优选实施方案中,所述哺乳动物细胞选自:表皮角质形成细胞、成纤维细胞(例如,皮肤、角膜、肠粘膜、口腔粘膜、膀胱、尿道、前列腺、肝脏)、上皮细胞(例如,角膜、皮肤、角膜;肠粘膜、口腔粘膜、膀胱、尿道、前列腺、肝脏)、神经胶质细胞(neuronal glial cell)或神经细胞、肝细胞或肝星状细胞、间充质细胞、肌细胞(心肌细胞或肌管细胞)、肾细胞、血细胞(例如,CD4+淋巴细胞、CD8+淋巴细胞)、胰β-细胞或内皮细胞。 [0051] 在本发明的一个优选实施方案中,所述细胞是肝细胞。 [0052] 在本发明的一个优选实施方案中,所述细胞是来源于癌组织的癌细胞。 [0053] 如本文所用的术语“癌症(cancer)”是指具有自主增长能力的细胞,即以快速增殖的细胞生长为特征的异常状态或病症。该术语意指包括所有类型的癌生长和致癌过程,转移组织或恶性转化细胞、组织或器官,而不考虑组织病理学类型或侵入阶段。术语“癌症”包括多种器官系统的恶性肿瘤(例如影响如肺、乳腺、甲状腺、淋巴、胃肠道和泌尿生殖道的那些)以及腺癌包括恶性肿瘤,例如最常见的结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。术语“癌(carcinoma)”是本领域公认的并且是指上皮组织或内分泌组织的恶性肿瘤,包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。示例性癌包括由宫颈、肺、前列腺、乳腺、头颈、结肠和卵巢的组织形成的那些。术语“癌”还包括癌肉瘤,例如其包括由癌性组织和肉瘤组织构成的恶性肿瘤。“腺癌”是指来源于腺组织或其中肿瘤细胞形成可辨识腺结构的癌。术语“肉瘤”是本领域公认的并且是指间充质衍生的恶性肿瘤。 [0054] 在本发明的一个替代优选实施方案中,所述细胞是干细胞。 [0055] 在本发明的一个优选实施方案中,所述干细胞选自:造血干细胞;神经干细胞;骨干细胞;肌肉干细胞;间充质干细胞;上皮干细胞(来源于器官例如皮肤、胃肠道粘膜、肾、膀胱、乳腺、子宫、前列腺和内分泌腺如垂体);内胚层干细胞(来源于器官如肝脏、胰腺、肺和血管);胚胎干细胞;胚胎生殖细胞;胚胎癌干细胞。 [0056] 在本发明的一个优选实施方案中,所述胚胎干细胞/胚胎生殖细胞是多能细胞而非全能细胞。 [0057] 在本发明的一个替代优选实施方案中,所述细胞培养容器包含饲养细胞;优选成纤维细胞饲养细胞。 [0058] 在本发明的一个优选实施方案中,所述细胞是原核细胞,例如细菌细胞。 [0060] 在本发明的一个优选实施方案中,所述核酸或表达载体适于表达报告多肽。 [0061] 细胞中启动子活性的分析可常规地通过将启动子与编码“报告”蛋白质或多肽的核酸融合来进行监测。实例在本领域是已知的并且包括酶例如β葡糖醛酸糖苷酶。报告分子(即蛋白质荧光团)在本领域也是公知的。绿色荧光蛋白GFP是从腔肠动物(例如太平洋海蛰、水母(Aequoria victoria))中分离的自发荧光蛋白。其作用是通过能量转移将另一种蛋白质(水母发光蛋白)的蓝色化学发光转换为绿色荧光。GFP可起蛋白标签的作用,因为其允许与各种各样的蛋白质的N末端和C末端融合,其中多数已示出保留了天然功能。最常见的是以增强型GFP的形式使用,其中密码子使用适于人密码。其他蛋白质荧光团包括黄色、红色和蓝色荧光蛋白。这些可商购自例如Clontech(www.clontech.com)。另一个实例是萤火虫萤光素酶。 [0062] 根据本发明的一个方面,提供了用于培养细胞的方法,其包括以下步骤: [0063] i)提供细胞培养容器,其包含: [0064] a)细胞; [0065] b)根据本发明的细胞培养基材; [0066] c)足以支持所述细胞生长的细胞培养基;以及 [0067] ii)提供促进所述细胞之增殖和/或分化和/或功能的细胞培养条件。 [0068] 在本发明的一种优选方法中,所述细胞是真核细胞;优选哺乳动物细胞。 [0069] 在本发明的一个优选实施方案中,所述哺乳动物细胞是啮齿动物细胞,例如大鼠细胞。 [0070] 在本发明的一种替代优选方法中,所述哺乳动物细胞是人。 [0071] 在本发明的一种优选方法中,所述细胞是肝细胞。 [0072] 在本发明的一种优选方法中,所述细胞培养基材悬浮于所述细胞培养基中并在其中得到支持。 [0073] 在本发明的另一种优选方法中,所述细胞培养基材包含一个或更多个细胞培养表面,其中所述细胞培养表面不接触细胞培养容器表面。 [0074] 根据本发明的另一个方面,提供了筛选试剂的方法,其中所述试剂影响细胞的增殖、分化或功能,所述方法包括以下步骤: [0075] i)提供细胞培养物,其包含至少一种细胞和根据本发明的细胞培养基材; [0076] ii)添加至少一种待测试的试剂;以及 [0077] iii)监测所述试剂对于所述细胞的增殖、分化或功能的活性。 [0078] 在本发明的一种优选方法中,所述细胞是肝细胞。 [0079] 在本发明的一种优选方法中,所述筛选方法包括以下步骤:整理以上(iii)中的活性数据;将所整理数据转换为可数据分析形式;以及任选地提供所分析数据的输出。 [0080] 许多方法是已知的,其成像并提取关于细胞表达中发生的时空变化的信息,例如荧光蛋白和基因表达的其他标志物,(参见Taylor等Am.Scientist 80:322-335,1992),其通过引用并入本文。此外,US5,989,835和US09,031,271(两者均通过引用并入)公开了用于测定细胞中荧光报告分子的分布或活性的光学系统,以筛选用于生物活性的大量试剂。以上专利中公开的系统还描述了用于处理、存储和显示所生成数据的计算机化方法。 [0081] 大量试剂的筛选需要制备细胞阵列用以处理细胞并施用试剂。测定装置例如包括标准多孔微滴定板(规格为例如6、12、48、96和384孔),其通常用于与自动化加载和自动处理系统兼容。通常,高通量筛选使用试剂与指示剂化合物的均匀混合物,所述指示剂化合物经转化或经改性而导致信号产生。通过合适的方法(例如检测荧光发射、光密度或放射性)测量所述信号,然后整合包含细胞、基材/试剂和指示剂化合物的各孔的信号。 [0083] 根据本发明的另一个方面,提供了测试试剂之肝毒性的方法,其包括以下步骤: [0084] i)提供细胞培养物,其包含至少一种肝细胞和根据本发明的细胞培养基材; [0085] ii)添加至少一种待测试的试剂;以及 [0086] iii)监测所述试剂对于所述肝细胞之增殖、分化或功能的活性,将所述活性作为所述试剂的毒性度量。 [0087] 在本发明的一个优选实施方案中,所述试剂是化学治疗剂。 [0088] 在本发明的一种替代方法中,所述试剂是病毒,例如病毒基因治疗载体。 [0089] 贯穿本说明书的描述和权利要求,词语“包括”和“包含”以及这些词语的变体,例如“含”和“含有”意指“包括但不限于”,并且不旨在(并且不)排除其他部分、添加物、组分、整体或步骤。“基本上由......组成”意指具有基本整体但是包括不实质影响基本整体之功能的整体。 [0090] 贯穿本说明书的描述和权利要求,除非上下文另有要求,否则单数涵盖复数。特别地,在使用不定冠词时,除非上下文另有要求,否则该说明应理解为考虑复数以及单数。 [0091] 除非相互矛盾,否则结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特性、整体、特征、化合物、化学部分或组都应理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方案或实施例。 [0093] 图1:微孔制造和涂覆方法,(A)微孔制造方法的示意性图示。使用经典的软光刻方法制造PDMS模版(步骤1)并放置在扁平的基材上。间隙用UV预聚物混合物(NOA 64)通过毛细作用来填充(步骤2)。在UV固化后,移除模版并在最终将涂覆孔侧面的蛋白质溶液中孵育NOA膜(步骤3至步骤4)。冲洗所述膜、干燥并翻转放置在涂覆有待定位在孔底部之蛋白质的载玻片上(步骤5至步骤7)。普朗尼克酸最终用于钝化孔的顶部(步骤8至步骤9)。(B)12mm玻璃底培养皿上微孔膜的图片(比例尺=1cm)。(C)微孔中肝细胞的DIC图像(比例尺=100μm)。(D)微孔的空间结构涂层的共聚焦图像。使用普朗尼克酸(P,绿色,Alexa 488)和纤连蛋白(F,红色,Alexa 561)。X/X指示涂层的侧面/底部顺序。其中X是F或P。(比例尺=5μm); [0094] 图2:A:具有各种不同涂层的圆孔的共聚焦成像(直径30μm,高度40μm)。绿色:BSA-GFP+PEG,红色:纤连蛋白-Alexa 568。B:接种密度在4×和10×放大率下的明场图像。根据所述方案以50万/ml接种肝细胞并轻轻搅拌; [0095] 图3:细胞存活测定。所有细胞存活的微孔随的分数作为时间的函数。所有条件用聚合物和三种涂层组合两者表示。在NOA孔中,存活概率几乎不依赖于涂层组合并且明显大于MyPoly133; [0096] 图4:不同涂层对肝细胞双联体形态和形状的影响。固定的样品,肌动蛋白为绿色(鬼笔环肽Alexa 488),核蓝(DAPI)并且MrP2为红色(抗体Alexa 568)。A:粘附在侧面和底部的肝细胞双联体呈现具有分支形态的胆小管(可能是由于由肌动蛋白应力纤维产生的内部张力)。如果仅底部细胞可粘附至基材,则胆小管绕行。B:如果细胞仅粘附至侧面,则胆小管主要垂直地形成,如右侧图上的z投影所示。该定向对于研究来自细胞质之蛋白质的积聚是非常有用的; [0097] 图5:细胞-ECM粘附的3D结构影响肝细胞双联体的定向和BC形态。在(A至C)中证明了在具有多种涂层(左列)的微孔中培养2天的肝细胞双联体的3D侧视图(右列,绿色,F-肌动蛋白;蓝色,核)和Z投影(中间列)。F/F(A,n=39)和P/F(B,n=48)中的双联体主要形成水平的胆小管。在F/P(C,n=44)中,BC大多数是垂直的。F/F(A,XY)中的BC显示像体内的管状形状;在P/F(B,XY)中,其扩张为球形。白色虚线是用于视觉引导的虚拟微孔边界。(比例尺=5μm)(D)与微孔底部相比,BC定向的定量分析。平行定向对应于零位偏角(null angle)。(**,t-检验,p<0.05); [0098] 图6:在F/F微孔中,细胞-ECM粘附的干扰或肌动球蛋白收缩性驱动BC成为球形。(A)可溶RGD(250uM,过夜)、(B)blebbistatin+/-(100μM,4小时)或(C)Y27632(10μM,4小时)的处理将使管状BC转化为球形BC(蓝色,核;绿色,F-肌动蛋白;比例尺=5μm)。(D)BC形态根据无量纲形态指数和垂直纵横比进行分类。与经可溶RGD(蓝色三角,n=39)、blebbistatin(绿色菱形,n=44)或Y27632(紫色三角,n=42)处理的细胞相比,对照F/F孔中的BC(黄色圆圈,n=35)明显显示出更高的折叠程度r以及更扁平的管状形状(低i)。药物处理导致F/F微孔中的BC形态与P/F涂层(红色正方形,n=37)微孔中的BC形态难以区分; [0099] 图7:与特定3D ECM结构相组合的物理约束通过肌动球蛋白收缩性引导BC延长。用F-肌动蛋白对典型BC形状进行的染色(i)以及在第二天微孔中具有不同形状的BC的概率图(ii)。BC中心(黑色圆圈)和BC的最远顶点(白色三角)相重叠。圆形F/F微孔(A,n=35)导致各向同性折叠的BC,而在F/F三角形微孔(B,n=29)中培养的双联体形成具有主要朝向三个顶点突出的分支的BC。BC主要沿着包含约6个肝细胞的F/P长形微孔(C,n=46)的长轴伸长。应注意相对没有沿短轴的BC突出。(比例尺=5μm); [0100] 图8:在具有F/P涂层的交叉长形微孔中形成的BC的肝索状网络。(A)在第2天含有约60个肝细胞的交叉长形微孔(各个交叉长度为300μm)内肝细胞的相衬图像。(B)在(A)的相同视图下CLF的荧光图像。(C)在交叉长形微孔中形成的胆小管网络的免疫染色图像。对F-肌动蛋白(绿色)和核(红色)进行染色。应注意相对没有横向BC。(D)(C)的表面渲染图像。示出了F-肌动蛋白(绿色)和pan-钙粘蛋白(红色)。(E)放大(D)的一个分支。(比例尺=30μm); [0101] 图9举例说明了微孔装置中肝细胞的生存力; [0102] 图10举例说明了微孔装置中胆小管的功能性; [0103] 图11举例说明了微孔装置中F-肌动蛋白和ZO-1的染色; [0104] 图12举例说明了微孔装置中胆小管的分泌;并且 [0105] 图13举例说明了包含不同表面涂层的微孔装置中胆小管的形态。 [0106] 材料和方法 [0107] 微孔制造 [0108] 使用标准软光刻方法在涂覆有SU8的硅晶片上制造弹性印章(聚二甲基硅氧烷PDMS)。印章形状的典型尺寸是高度和宽度均为20μm至40μm。 [0109] 1切出具有柱形状的PDMS块。不要留下围绕柱形状的任意平整表面以使得在下一步骤中能够进行高效毛细填充。 [0110] 2将PDMS块放置在培养皿上,使柱抵靠培养皿的表面。使用尖端来挑取聚合物并使少许滴落在PDMS的一侧上。聚合物将通过毛细管效应在柱之间流动。 [0111] 3打开UV灯并允许灯加热15分钟。在柱之间的空间被聚合物填充后,将更多的聚合物放置在PDMS印章周围。 [0112] 4如果使用NOA,则使UV光照射PDMS和聚合物20秒,或者如果使用Mypoly133则照射5分钟。用刀从固化聚合物片上剥去PDMS块。微孔在聚合物膜中形成。 [0113] 5在聚合物片层上添加一滴包含期望涂覆孔内侧之试剂的溶液A;通常也可使用1μg/ml纤连蛋白或0.2%普朗尼克TM、胶原蛋白、钙粘蛋白和碳水化合物以及多功能PEG。 [0114] 6抽真空10分钟以脱去滞留在微孔中的空气并且允许溶液A进入微孔中。 [0115] 7在室温下用溶液A孵育微孔1小时。 [0116] 8在室温下用溶液B孵育合适容器[例如,玻璃、二氧化硅、塑料]1小时,所述溶液B包含将涂覆孔底表面的试剂。通常,此处可使用与用于侧面的相同的试剂。此外,如果待在微孔底部进一步形成支撑脂质双层,则可使用干净的玻璃。 [0117] 9用水冲洗微孔和玻璃底培养皿3次。 [0119] 11切去聚合物片层的边缘。从培养皿剥离片层并将其翻转放置在玻璃底培养皿中,用扁平的PDMS轻轻按压聚合物片。 [0120] 12用0.2%普朗尼克酸TM使聚合物片层的顶部钝化30分钟。在此阶段也可使用1%PEG/甲基丙烯酸酯。然后在UV下暴露1分钟以确保与聚合物表面的未反应丙烯酸基团共价键和。 [0121] 13用水冲洗聚合物片层3次。 [0122] 14将聚合物片层保持在水中并对其抽真空10分钟。 [0123] 15用水冲洗聚合物片层3次。UV处理聚合物片层大于15分钟以杀菌。 [0124] 细胞接种 [0125] 1用细胞培养基更换微孔中的PBS。在37摄氏度下孵育。 [0126] 2对于各培养皿,接种50万肝细胞。通过前后摇动培养皿使肝细胞分布均匀。将培养皿轻轻放置到培养箱中。 [0127] 3在孵育15分钟后,再次摇动培养皿并将培养皿轻轻放置到培养箱中。 [0128] 4重复步骤3两次。 [0129] 5用PBS洗涤培养皿两次并添加细胞培养基。 [0130] 细胞培养 [0131] 在5%CO2和37摄氏度下培养细胞。每天更换细胞培养基。此处使用特定培养基,William’s E培养基来进行细胞培养。向William’s E培养基中补充0.1%BSA、2mM L-谷氨酰胺、100nM地塞米松、100单位/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、0.05μg/ul亚油酸和0.3μg/ml胰岛素。 [0132] 肝细胞分离、接种和培养 [0133] 如[33]所述,肝细胞通过两步原位胶原酶灌注法从雄性Wistar大鼠中分离。根据新加坡国立大学IACUC委员会批准的IACUC方案处理动物。产率为>108个细胞/大鼠,通过台盼蓝拒染测定(Trypan Blue exclusion assay)测试的肝细胞生存力为>90%。 [0134] 将新鲜分离的大鼠肝细胞(50万个)接种到35mm玻璃底培养皿内的微孔上并在2ml的William’s E培养基中进行培养,所述培养基补充有2mM L-谷氨酰胺、1mg/ml BSA、0.3μg/ml胰岛素、100nM地塞米松、50μg/ml亚油酸、100单位/ml青霉素和100mg/ml链霉素,以上均购自新加坡的Aldrich-Sigma。在5%CO2、37℃和95%湿度下孵育细胞。在孵育1小时后,移除包含未附着细胞的培养基。微孔用PBS冲洗并补充新鲜培养基。在1小时后,添加另外的50万个肝细胞并孵育1小时。未附着细胞通过PBS冲洗来移除并再次补充培养基。每天更换培养基。 [0135] 形成膜和率匹配 [0136] 首先,根据所述方案形成具有贯穿孔的膜。所述膜用来自Norland Adhesive的低粘度可UV固化树脂NOA 73或来自My polymer的另一种可UV固化抗蚀剂MyPoly 133DC(折射率与水的折射率相匹配)制造。对长期培养而言,优选使用NOA 73,原因是其在长期运行中不在培养基中释放溶剂。对短期培养和高分辨率成像而言,使用MYPoly 133。当预期与培养基匹配的折射率非常好时,可将MYPOLy 133与Mypoly134以适当比例混合以获得与DMEM培养基相匹配的折射率1.338。根据所用培养基折射率或波长来调节这两种聚合物的比例。一种替代方法是用MYpoly 134制备膜并用Sucrose或Sorbitol补充培养基直至实现匹配1.34的折射率。 [0137] 生存力测试和胆小管分泌功能测试 [0138] 每天用仅对死细胞染色的染料碘化丙啶(Sigma,81845FLUKA)来评价肝细胞生存力。在37℃将培养基中的5μM PI与肝细胞在微孔中孵育30分钟。在用PBS冲洗后,经染色细胞保留在培养基中并在宽视场EVOS显微镜下(Life Technology)观察。生存力比按照以下计算:具有死细胞的微孔数目除以所有微孔的数目。 [0139] 每天用仅可分泌到功能胆小管中的染料CLF(BD,451041)(其在胆小管中变得发荧光)来评价胆小管[BC]分泌。在37℃将培养基中的5μMCLF与肝细胞在微孔中孵育30分钟。在用PBS冲洗后,经染色细胞保持在培养基中并在宽视场EVOS显微镜下观察。功能胆小管比率按照以下计算:具有功能胆小管的微孔数目除以所有微孔的数目。 [0140] 免疫染色和图像获取 [0141] 为了对照,将在微孔中培养48小时的肝细胞在4%多聚甲醛(PFA)中固定30分钟。对于±Blebbistatin(Merck,203390)或Y27632(Sigma,Y0503)处理,在固定前4小时添加药物,同时将可溶RGD(Sigma,G5646)与肝细胞孵育过夜。在固定后,细胞用PBS冲洗并在TBST(含0.2%Triton-X的TBS)中透化30分钟。如手册指示的,用含1%BSA的TBST将透化细胞封闭4小时并在4℃下与pan-钙粘蛋白抗体(sigma,C1821)和抗ZO-1抗体(life technology, 61-7300)孵育过夜。在用TBST冲洗后,使细胞在黑暗中于室温下在第二抗体(Life Technology,A10040和A-31571)和鬼笔环肽-alexa 488(Life Technology,A12379)中孵育 1小时。再次用TBST冲洗并与DAPI(Sigma,D9564)进行短暂孵育后,使细胞在封片液(mounting medium)(DAKO,S3023)中封片。采用Nikon A1R共聚焦显微镜上的100X NA1.4油镜获得共聚焦显微图像的3D堆叠。 [0142] 图像分析 [0143] 将所选择切片的图像堆叠重构为最大强度投影或正交剖视图。基于F-肌动蛋白信号来应用人工分割,原因是与ZO-1相比,F-肌动蛋白提供了BC边界的更好界定(图11)。随后提取胆小管的若干特征,例如参数(厚度、水平旋转尺寸和面积)。 [0144] 对于三角形微孔和长形微孔中的胆小管形态分析,提取胆小管并将其转换为二进制图像。总之,所有的这些二进制胆小管根据微孔定向而对齐并重叠在一起。所得图像基于胆小管出现的概率进行彩色编码。颜色越暖,胆小管在特定位置出现的越频繁。 [0145] 统计学分析 [0146] 对来自至少3次独立实验的数据进行分析,并且值表示为平均值±平均值的标准误差。在图中独立地表示了各组中样品的数目。学生t-检验用于分析数据的统计学显著性。p值小于0.05的值被认是统计学显著的。 [0147] 实施例1 [0148] ECM蛋白质在芯片上的3D微图案 [0149] 为了将细胞-ECM粘附组织成3D,开发了使用标准软光刻方法产生微孔的新方法(图1),从而制造具有贯穿孔的薄膜(5μm至40μm)[24]。将PDMS模微模塑到织构化晶片上,在SU8中形成微孔。将印章放置在扁平的PDMS表面上并用可UV固化聚合物NOA 64填充腔隙。30秒暴露(在20mW/em2和400nm下运行的300W Newport UV灯)足以形成可随后用作粘附物(sticker)的固体膜[28]。随后将印章剥离。然后实现了3种不同的涂层构造:按照侧面/底部顺序标记为F/F、F/P、P/F,其中F代表纤连蛋白且P代表普朗尼克酸。使用10μg/ml纤连蛋白和0.2%普朗尼克酸溶液获得如下所列的不同涂层(图1)。 [0150] i-首先实现侧面的涂覆。将膜与适当的水溶液孵育1小时。使用真空脱气移除微孔中滞留的气泡。随后冲洗膜并轻轻风干。 [0152] iii-然后使用普朗尼克酸将膜顶部钝化1小时。其确保使肝细胞最少地粘附至膜顶部并且使细胞最大化地自发定位到孔中。然后在UV下对系统进行灭菌而无纤连蛋白的明显损失(通过用MDCK细胞进行的扩散测定(spreading assay)来测试,数据未示出)。 [0153] 使用碘化丙啶每天估计三种涂层构造各自的细胞生存力,持续4天。生存力指数按照以下计算:没有死细胞的微孔数目除以微孔总数目的比(图9)。4天后的存活率为约70%,而不依赖于涂层构造。 [0154] 然后,测试了4天中功能BC的维持(图10)。功能性指数按照以下计算:经胆酸-赖氨酰-荧光素(choly-lysyl-fluorescein,CLF)染色表现出功能BC的微孔数目除以微孔总数目的比。通常微孔总数目的50%至70%表现出功能BC。在3天后,对于任意的涂层构造,细胞都逐渐与基材分离。这最可能是因为涂覆在微孔上的纤连蛋白的酶促降解。然而,75%的残留双联体是功能性的。当BC达到其平衡形状(与第4天相比没有差异)并且当肝细胞附着仍未受到干扰时,在第2天进行所有实验。 [0155] 实施例2 [0156] 图2举例说明了使用的多种组合。所测试的多种另外的组合包括BSA、钙粘蛋白和胶原蛋白。尽管也是可能的,但是其不用于肝细胞培养。蛋白质涂覆主要是因为蛋白质吸附。使用来自NANOCS(nanocs.com)的异双功能PEG分子丙烯酸酯-PEG-NHS,目前正在研究进行直接化学接枝的可能性。在UV固化下丙烯酸酯部分与聚合物反应并且NHS部分是用于蛋白质官能化的标准官能团。 [0157] 实施例3 [0158] 将根据[22]从大鼠肝脏中新鲜获得的原代肝细胞以50万个/mL的密度接种在培养皿上。通过防污处理保护膜的顶部是帮助细胞落入孔中的关键部分。防污处理的失败将导致细胞附着至膜顶部并且不落入微孔中。接种后进行方案中所述的轻轻摇动步骤以确保最大的孔填充容量。在该方案后,90%的孔填充有至少一个细胞并且70%的孔填充有至少两个细胞。双联体比率的更好优化仍在研究中。 [0159] 接种细胞后24小时起,每天用碘化丙啶溶液(Sigma)测试细胞的生存力。在由MyPolymer制成的微孔中,接种24小时后,大于50%的填充孔中的细胞是活的,但是在接种48小时后存活率降至约20%。然而,对于NOA而言,无论使用何种涂层构造,在接种48小时后大于80%的填充孔中的细胞是活着的。即使在接种96小时后,由NOA聚合物制成的微孔中的生存力仍可维持在大于60%。 [0160] 实施例4 [0161] 肝细胞可在微孔内固定并用抗体染色。然后可进行与正常培养条件相比没有光学分辨率损失的单孔内的高分辨率成像。用经转染蛋白质进行的实时成像也是可能的。这为以非常容易的方式监测一系列单一双联体随时间的演变提供了机会。如图4所示,胆小管的形态和定向可通过改变孔的化学涂层来调整。该性质可用于控制胆小管上的张力以及其与药物测试的相关性。垂直小管的形成还使得能够对分子从细胞质向胆管中的输送进行高时空分辨率成像。这是控制跨越若干细胞之胆小管的形成的第一步。此外,垂直胆小管的形成使得其更便于收集胆汁分泌,这是药物测试的关键挑战。 [0162] 实施例5 [0163] 肌动球蛋白收缩性将3D细胞-ECM粘附与肝细胞双联体之间的BC形态结合起来。 [0164] 我们研究了肝细胞双联体3D粘附于ECM如何影响BC形态。我们选择了30μm圆形微孔以使肝细胞的双联体形成效率最大化,其平均直径为25μm。在第2天固定细胞,对F-肌动蛋白和ZO-1进行染色,并且通过共聚焦显微镜成像。因为F-肌动蛋白信号为BC轮廓提供了比ZO-1更清晰的界定(图11),所以我们在该工作中选择F-肌动蛋白作为标志物以证实和定量BC形态。三种ECM涂层构造诱导三种不同的BC形态(图5)。 [0165] 当微孔的侧面和底部被ECM涂覆时(F/F构造),双联体变为垂直堆叠(图5A、5D)。底部细胞粘附至微孔的底部和侧面两者,而顶部细胞仅粘附至侧面。BC表现出定位在细胞-细胞连接中心的扁平的(2μm至3μm)各向同性管状形态。这使人联想到在体内观察到的BC形态[23]。 [0166] 当微孔底部被ECM涂覆并且侧面无粘附时(P/F构造),双联体仍维持堆叠(图5B、5D)。仅垂直双联体的底部细胞粘附于微孔底部。BC展现出具有较少折叠和绒毛的大球形形态(5μm至15μm),这与在新鲜提取的双联体[26]或小的器官样结构[27]中观察到的BC类似。 具有任意形态的BC在微孔中维持功能,这通过CLF测试得到证实(图12)。 [0167] 当细胞仅粘附至微孔的侧面时(F/P构造),肝细胞并排定位(图5C、5D)。BC垂直形成,跨越大部分细胞-细胞接触区域,表现出扁平的形态(2μm至3μm厚)。我们的观察表明了细胞ECM粘附的空间结构可控制BC的中尺度形态。为了证实细胞-ECM粘附在获得扁平的管状BC中的重要性,我们在第1天用可溶RGD肽(250μM,过夜)处理F/F微孔中的肝细胞,所述RGD肽对抗整合素介导的细胞-ECM细胞同时保持化学信号不受干扰。实际上,在细胞与微孔分离时,其BC聚拢成形态上等于在P/F情况下所观察到的那些(图6A)。 [0168] 细胞-ECM相互作用复合体与肌动蛋白细胞骨架密切相关[28],并且显示出肌动球蛋白收缩性调节BC动力学[29]。因此,我们测试了对于通过细胞-ECM粘附的空间结构来差异性控制BC形态,是否需要肌动球蛋白收缩性。我们发现,在使用blebbistatin(100μM,4小时)或Y27632(10μM,4小时)通过多种途径抑制II型肌球蛋白活性后,F/F微孔中形成的折叠的BC聚拢。所得形态类似于在P/F构造中所获得的那些(图6B、6C)。 [0169] 不同条件下的BC形态通过两个无量纲参数来定量评估:折叠程度和垂直纵横比。折叠程度r=P2/(4πA)通过测量BC投影周长P与投影面积A的比率来评估。该形态指数r范围为由1(圆)往上(折叠的管状结构)。垂直纵横比i如下计算:BC最大高度除以XY平面上最大伸长的比率。较高的垂直纵横比代表BC较厚。 [0170] 当将折叠程度r相对垂直纵横比i作图时(图6D),F/F微孔中BC的扁平且管状形状由低的垂直纵横比和高的折叠程度来反映。相反地,假定P/F微孔、具有可溶RGD的F/F微孔、具有blebbistatin的F/F微孔或具有Y27632的F/F微孔中BC的垂直纵横比较高并且折叠程度较低,特征在于其膨胀的形状。在药物处理下,F/F微孔中的BC形态集合成明显与P/F构造或F/F构造的情况不同的簇。 [0171] 实施例6 [0172] 物理约束与特定3D ECM结构相结合控制胆小管伸长 [0173] 因为肌动球蛋白收缩性通过细胞-ECM粘附参与BC形态的远程调节,所以我们假设BC伸长受已知调节肌动球蛋白收缩性的物理约束[30]影响。采用具有不同形状的微孔来施加物理约束并调控肌动球蛋白收缩性。我们在经F/F涂覆的等边三角形微孔(边线45μm)中接种肝细胞,原因是在顶点附近通过局部肌动球蛋白聚集而产生了肌动球蛋白收缩性[31]。在接种两天后,肝细胞与其BC仍然采用指向三角形顶点方向的3叶苜蓿叶片形状堆叠(图7B(i))。然而,在P/F三角形微孔中没有形成BC,原因是观测到很少的双联体(数据未示出)。在微孔边缘对齐后重叠BC的二进制图像,我们计算了在三角形微孔内部细胞-细胞接触的给定点发现BC的概率(图7B(ii))。此外,还评价了BC的中心分布和最远点分布(图7B(ii))。揭示出BC的平均形状实际为三叶结构,其各分支朝向三角形微孔的顶点延伸。作为对照,我们评价了BC在圆形微孔中的概率图,其中BC延伸是各向同性的(图7A(i))。圆形微孔中最可能的BC形状是其叶端各向同性分布的圆形(图7A(ii))。因此,这些结果支持物理约束可经由肌动球蛋白收缩性来引导BC伸长。 [0174] 同样地,细胞-细胞相互作用可能影响肌动球蛋白收缩性,如细胞-ECM相互作用[32]。因此,预期细胞-细胞相互作用影响BC形态。为了检验这一假设,我们将多个肝细胞接种到长形的微孔(F/P)中以改变细胞-细胞接触状态。与其他涂层构造相比,F/P长形微孔最佳地确保细胞自发容纳到具有垂直界面的两个面对的排中(图13)。基于我们在类似涂层构造中对双联体的观察预期扁平的垂直BC具有横向分支(图5C)。然而,BC采用向仅具有较小横向分支的以长形微孔长轴方向延伸的长管状结构(图7C(i))。BC在这些长形微孔中的概率图沿微孔长轴聚集在中心(图7C(ii))。 [0175] 总之,我们的观测结果支持这样的假设:受物理约束、细胞-ECM相互作用或细胞-细胞间相互作用影响的肌动球蛋白收缩性可决定中尺度的BC形态。我们进而开发了具有细胞-细胞/ECM相互作用与物理约束之组合作用的支架生物力学微环境来控制BC形态。我们使用具有F/P涂层构造的交叉长形微孔(30μm宽以及300μm长)来模拟肝索。我们观察到跨越微孔整个长度的长功能性胆小管(300μm)(图8)。仅在F/P涂层构造(肝细胞弱粘附在基材底部上)中观察到这种形态,其中肌动球蛋白收缩性可能水平分布,因此使BC连接入长形结构中。所形成的管状网络具有与体内肝索类似的尺寸和形态。 [0176] 参考文献 [0177] 1.Tokimitsu,Y.,et al.,Single lymphocyte analysis with a microwell array chip.Cytometry.Part A:the journal of the International Society for Analytical Cytology,2007.71(d7423775-bdc6-2ff3-6660-0ba53b91d33e):p.1003-1013. 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